KR100408017B1

KR100408017B1 - 종양괴사인자와 인터루킨-4의 융합단백질

Info

Publication number: KR100408017B1
Application number: KR10-2000-0067843A
Authority: KR
Inventors: 김영상; 손정희; 백상기; 알프레드보트웰
Original assignee: 김영상; 최수영
Priority date: 2000-11-15
Filing date: 2000-11-15
Publication date: 2003-12-06
Also published as: KR20020037899A

Abstract

본 발명은 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)와 인터루킨-4(IL-4)를 융합시켜서, 막에 결합된 형태로 발현되는 융합단백질에 관한 것이다. 본 발명의 TNF와 IL-4의 융합단백질인 IL-4/TNF는 IL-4의 아미노산 서열과 TNF의 세포질내 도메인, 막투과 도메인 및 세포질외 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 의하면, 막-결합 형태로 발현된 융합단백질인 IL-4/TNF은 정상적인 IL-4와 동일한 기능을 수행하고, 장기간의 항종양반응을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 막-결합 형태라는 특징으로 인하여 사이토카인의 부작용을 감소시킬 수 있는 새로운 항암제의 개발에 이용될 수 있을 것이다.

Description

종양괴사인자와 인터루킨-4의 융합단백질{Fusion Protein of TNF and Interleukin 4}

본 발명은 종양괴사인자와 인터루킨-4의 융합단백질에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)와 인터루킨-4(IL-4)를 융합시켜서, 막에 결합된 형태로 발현되는 융합단백질에 관한 것이다.

악성종양의 치료를 목적으로 수행된 연구의 한 갈래는 종양세포를 유전적으로 변형시켜서 항암반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 이에 의한 지속적인 연구를 수행한 결과, GM-CSF, IL-2, IL-4, γ-IFN, IL-12 등의 사이토카인을 분비하도록 트랜스펙션된 세포가 쥐에서 항암 반응을 일으키는 백신으로서 이용할 수 있는 수준에 이르고 있으나, 트랜스펙션된 세포 및 분비된 사이토카인의 독성, 종양항원에 대한 특이성이 없이 주변 T-세포가 활성화, 분화 증폭되는 등의 문제점이 발견되었다. 즉, 사이토카인은 T 림프구 활성에 중요한 직접, 간접적인 신호를 제공하고, 종양세포에 작용하여 강한 항암반응을 일으키는 것으로 알려져 있지만, 일반세포에도 강한 독성을 나타내기 때문에, 실질적인 사용에 제한을 받고있는 실정이며, 종양세포를 죽이는 T-세포를 사용하는 면역적인 방법을 이용하여 종양을 파괴하는 것이 전신면역의 활성화에 도움이 된다고 여겨지고 있으나, IL-2 또는 IL-4에 의해 유도된 T-세포의 증폭이 항상 종양세포의 크기를 감소시키지만은 않아서, 종양세포를 파괴하지 않으면서 T-세포의 증폭이 일어날 수도 있기 때문에, 실제적으로 사용될 수 없었다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 종양세포에 의해 분비되는 사이토카인은 종양세포의 수용체에 결합하여 세포간 접촉을 통해 신호를 전달하여 효과적인 면역반응을 유도할 수 있을 것이라는 가정하에, 연구를 수행한 결과, 사이토카인이 막과 결합된 형태를 취하는 경우, 분비형의 사이토카인과 기능면에서 차이가 있음을 알게 되었다. 예를 들어, TNF의 막결합 형태는 수용성 TNF와는 다른 독특한 기능을 가지고 있고, TNF의 독성을 감소시켰으나, 여전히 강한 세포독성으로 정상세포에 영향을 미치고, T-세포의 과도한 활성화를 유발시키는 문제점을 해결할 수 없었다.

따라서, 세포독성이 적고, T-세포의 과도한 활성화를 유발시키지 않으면서도, 항종양반응을 유도할 수 있는 새로운 형태의 사이토카인을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 세포독성이 적고, T-세포의 과도한 활성화를 유발시키지 않으면서도, 항종양반응을 유도할 수 있는 신규한 형태의 사이토카인을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, TNF와 인터루킨-4(IL-4)를 융합시켜서, 막에 결합된 형태로 발현되는 융합단백질인 IL-4(IL-4/TNF)를 종양세포에서 발현시킨 경우, 종양세포에서 막-결합 형태로 발현되어, 종양의 형성을 억제할 뿐만 아니라, 장기간의 항종양 반응을 유도할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 TNF와 IL-4의 융합단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 유전자에 상응하는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

도 1은 각 IL-4의 처리에 따른 CT.4S 세포주의 DNA 합성량을 비교한 그래프이다.

도 2는 각각의 MethA 세포를 주입한 마우스의 종양발생 정도를 시간에 따라 측정한 그래프이다.

도 3은 야생형 MethA 세포에 의한 마우스의 생존곡선이다.

본 발명의 TNF와 IL-4의 융합단백질인 IL-4/TNF는 IL-4의 아미노산 서열과 TNF의 세포질내 도메인, 막투과 도메인 및 세포질외 도메인의 아미노산 서열을 포함한다.

IL-4는 다중기능의 림포카인으로서, CTL의 생산에도 관여하는 것으로 알려져 있고, 종양성장(tumor growth)에 영향을 주는 사이토카인 중의 하나로 알려져 있다. IL-4를 상당량 분비하는 종양세포는 종양을 형성시킬 수 없고, 전신면역을 유도할 수 있음이 보고된 바 있는데, IL-4에 의한 종양억제는 대식세포와 호산구(eosinophil) 침윤의 결과로서, 이때 숙주의 T 세포 역시 항원-비특이적인 세포와 함께 IL-4에 의한 종양거부(tumor rejection)의 유도 및 효과기에 관여한다는 것이 알려져 있다.

본 발명자들은 이러한 IL-4를 종양세포에서 막-결합 형태로 발현시키기 위하여, IL-4, CD4 및 TNF의 cDNA를 주형으로 하고, 각각의 유전자 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과, IL-4의 유전자, CD4의 유전자 및 TNF의 유전자를 수득하였다. 그런 다음, 융합단백질의 대조군으로서 IL-4와 CD4의 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 IL-4/CD4 발현벡터를 제작하고, IL-4와 TNF의 세포질내 도메인, 막투과 도메인 및 세포질외 도메인을 코딩하는 유전자를 발현벡터에 클로닝하여, 막-결합 IL-4를 발현시키는 IL-4/TNF 발현벡터를 제작하였다. 전기 제작된 각각의 발현벡터들을 종양세포에 트랜스펙션시킨 후, 트랜스펙션된 종양세포를 배양하며, IL-4가 정상적으로 발현되는지 알아본 결과, 트랜스펙션된 종양세포에서 IL-4가 정상적으로 발현되고, 발현된 막-결합 IL-4는 분비형 IL-4와 유사한 기능을 수행할 뿐만 아니라, 막-결합 IL-4가 발현된 종양세포는 장기간의 항종양 반응을 유도할 수 있음을 알게 되었다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 자명할 것이다.

실시예 1: IL-4 발현벡터의 제작

마우스 IL-4의 cDNA를 주형으로 하고, 프라이머 1: 5'-cgcgaattcatgggtctcaacccc-3'(서열번호 1) 및 프라이머 2: 5'-gcgcggatcctacgagtaatc-3'(서열번호 2)를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행한 결과, IL-4를 코딩하는 유전자 절편을 수득하였다. 또한, 마우스 CD4의 cDNA를 주형으로 하고, 프라이머 3: 5'-gcgccatggaagacgctggtgctggggaag-3'(서열번호 3) 및 프라이머 4: 5'-cgcgaattctcagatgagattatggctctt-3'(서열번호 4)를 사용하여 PCR을 수행한 결과, CD4를 코딩하는 전체유전자를 수득하였다. 전기 수득한 IL-4를 코딩하는 유전자 절편의 3'과 CD4를 코딩하는 전체 유전자의 5'을 PW의 아미노산을 코딩하는 유전자로 연결하고, IL-4의 유전자 절편의 5'에 분비신호서열(signal peptide)을 코딩하는 유전자를 결합시켜서, IL-4/CD4 발현벡터를 제작하였다.

한편, 마우스 IL-4의 cDNA를 주형으로 하고, 프라이머 5: 5'-cgcgaattcatatccacggatgc-3'(서열번호 5) 및 프라이머 2: 5'-gcgcggatcctacgagtaatc-3'(서열번호 2)를 사용하여 PCR을 수행한 결과, IL-4를 코딩하는 370bp의 다른 유전자 절편을 수득하였다. 또한, 마우스 TNF의 cDNA를 주형으로 하고, 프라이머 6: 5'-gcggatccatgagcacagaa-3'(서열번호 6) 및 프라이머 7: 5'-cgcgaattcctccggccatagaact-3'(서열번호 7)을 사용하여 PCR을 수행한 결과, 세포질내 도메인, 막투과 도메인 및 세포질외 도메인으로 구성된 TNF의 일부를 코딩하는 240bp의 유전자를 수득하였다. 전기 수득한 IL-4를 코딩하는 다른 유전자 절편의 5'과 TNF를 코딩하는 유전자의 3'을 GGI의 아미노산을 코딩하는 유전자로 연결하고, 연결된 IL-4/TNF 유전자 절편(서열번호 8)을 발현벡터 pNeoSRαⅡ 발현벡터에 클로닝하여, 막-결합 형태의 IL-4의 아미노산 서열(서열번호 9)을 가지는 단백질을 발현시키는 발현벡터를 제작하였다.

또한, 마우스 IL-4의 cDNA를 주형으로 하고, 프라이머 1 및 프라이머 2를 사용하여 PCR을 수행한 결과로 수득한 IL-4를 코딩하는 유전자 절편의 5'에 분비신호서열을 코딩하는 유전자를 결합시켜서, 분비형 IL-4(IL-4s) 발현벡터를 제작하였다.

실시예 2: IL-4의 발현

메틸콜란트렌(methylcholanthrene)으로 유도된 섬유아세포주 MethA(BALB/c origin)를 10% FBS와 항생제가 포함된 RPMI-1640 배양액에서 배양하였다(참조: Kaye et al., J. Exp. Med., 158:836-856, 1983; Matis LA et al., J. Immunol.,130:1527-1535, 1983; Baron JL et al., J. Exp. Med., 177:57-68, 1993). 배양된 MethA 세포(2 X 10⁷cells)를 수확하여 HBSS 완충용액(137mM NaCl, 5mM KCl, 0.7mM H₃PO₄, 6mM 덱스트로스, 20mM HEPES, pH 7.0)으로 두 번 세척하고, 다시 HBSS 완충용액에 현탁시킨 후, 실시예 1에서 제작한 각각의 발현벡터 20㎍과 혼합시켰다. 이를 얼음에서 10분간 방치시키고, 320V, 960㎌의 전기자극을 가한 후, 10% FBS와 항생제가 포함된 RPMI-1640 배양액에서 48시간 동안 배양시켰다. 이어, 1g/L의 G418이 함유된 배양액이 담겨진 96웰 플레이트에 옮겨서, 약물 저항성 콜로니의 발생을 관찰하였다.

각각의 발현벡터가 정상적으로 발현되는지 확인하였다. 먼저, MethA 세포를 염색완충용액(0.02% sodium azide 및 2% FBS가 포함된 1X PBS)에 희석된 11B11 mAb와 30분동안 4℃에서 방치시키고, 세척한 다음, 2차 항체(FITC-goat anti-rat IgG antibody, Cappel, Durham, U.S.A.)로 4℃에서 30분동안 반응시킨 후, 염색된 세포를 FACScan 플로우 사이토메터(FACScan flow cytometer, Becton Dickinson, U.S.A.)로 분석하여, IL-4/TNF 발현벡터의 발현을 확인하였다. 11B11 mAb 대신에 항-CD4 mAb(GK1.5)를 사용한 것을 제외하고는, 동일한 방법을 사용하여 IL-4/CD4 발현벡터의 발현을 확인하였다. 또한, IL-4s의 발현을 확인하기 위하여, IL-4 의존적 세포주인 CT.4S 세포주를 배양할 때, IL-4s 발현벡터로 형질전환된 MethA 세포의 배양액을 첨가하여, IL-4s의 발현을 분석하였다. 그 결과, 모두 정상적으로 발현됨을 알 수 있었다.

실시예 3: IL-4 활성도의 측정

전기 실시예 2에서 정상발현된 각 IL-4 들의 활성도를 측정하기 위하여, IL-4 의존적 세포주인 CT.4S 세포주를 이용하였다(참조: Hu-Li J et al., J. Immunol., 142:800-807, 1989). 즉, 대조군으로서, 배양된 CT.4S 세포주와 야생형 MathA을 혼합하고, 실험군으로 배양된 CT.4S 세포주와 200Gy의 방사선이 조사되어 기능이 정지한 IL-4/CD4 MethA 세포주 및 IL-4/TNF MethA 세포주를 각각 혼합하며, 배양된 CT.4S 세포주와 IL-4s의 상등액을 혼합하였다. 그런 다음, 37℃에서 48시간동안 방치하고, 0.5μCi의 삼중수소-티미딘(³H-thymidine)으로 16시간 동안 처리한 후, 세포의 cpm값을 측정하여 CT.4S 세포주의 DNA 합성량을 측정하였다(참조: 도 1). 도 1은 각 IL-4의 처리에 따른 CT.4S 세포주의 DNA 합성량을 비교한 그래프이다. 도 1에서 보듯이, IL-4s와 IL-4/TNF의 CT.4S 세포주의 DNA 합성에 미치는 영향은 유사한 정도를 나타내었으나, IL-4/CD4는 대조군 보다는 DNA 합성이 향상되었으나, IL-4s와 IL-4/TNF보다는 CT.4S 세포주의 DNA 합성에 미치는 영향이 비교적 적음을 알 수 있었다.

실시예 4: IL-4의 종양 유발 및 항종양 반응

생체내 환경에서 전기 각각의 IL-4를 발현시키는 MethA 세포가 종양 활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 8주된 자성 BALB/c 마우스의 피하에 야생형 MethA 세포, IL-4s MethA 세포, IL-4/CD4 MethA 세포 및 IL-4/TNF MethA 세포를 각각 주입하고, 종양의 발생을 측정하였다(참조: 도 2). 도 2는 각각의 MethA 세포를 주입한 마우스의 종양발생 정도를 시간에 따라 측정한 그래프이다. 도 2에서, (■)은 야생형 MethA 세포를 나타내고, (▲)은 IL-4s MethA 세포를 나타내며, (●)은 IL-4/CD4 MethA 세포를 나타내고, (▼)은 IL-4/TNF MethA 세포를 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 야생형 MethA 세포와 IL-4/CD4 MethA 세포는 유사한 정도의 종양 발생률을 나타내었으나, IL-4s MethA 세포 및 IL-4/TNF MethA 세포는 종양을 발생시키지 않음을 알 수 있었다.

IL-4/TNF MethA 세포가 종양을 억제할 수 있는지 알아보기 위하여, 5 X 10⁶개의 IL-4/TNF MethA 세포를 마우스의 복막에 주사하고 75일 후, 5 X 10⁶개의 야생형 MethA 세포를 다시 복막에 주사하였다. 이의 대조군으로서, 정상 마우스에 동일한 량의 야생형 MethA 세포를 복막에 주사하고, 이들의 생존률을 측정하여 생존곡선을 작성하였다(참조: 도 3). 도 3은 야생형 MethA 세포에 의한 마우스의 생존곡선이다. 도 3에서, (■)은 야생형 MethA 세포를 나타내고, (●)은 IL-4/CD4 MethA 세포를 나타낸다. 도 3에서 보듯이, IL-4/TNF MethA 세포는 야생형 MethA 세포에 의한 종양의 형성을 억제하여, 장기간의 항종양반응을 유도함을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)와 인터루킨-4(IL-4)를 융합시켜서, 막에 결합된 형태로 발현되는 융합단백질을 제공한다. 본 발명의 TNF와 IL-4의 융합단백질인 IL-4/TNF는 IL-4의 아미노산 서열과 TNF의 세포질내 도메인, 막투과 도메인 및 세포질외 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 의하면, 막-결합 형태로 발현된 융합단백질인 IL-4/TNF은 정상적인 IL-4와 동일한 기능을 수행하고, 장기간의 항종양반응을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 막-결합 형태라는 특징으로 인하여 사이토카인의 부작용을 감소시킬 수 있는 새로운 항암제의 개발에 이용될 수 있을 것이다.

Claims

인터루킨-4(IL-4)를 세포막에 결합된 형태로 발현시키기 위한, 막 결합기능을 나타내는 종양괴사인자(TNF)의 세포질내 도메인, 막투과 도메인 및 세포질외 도메인을 암호화하는 염기서열과 IL-4를 암호화하는 염기서열을 포함하고, 서열번호 8로 나타내어지는, TNF와 IL-4의 융합단백질(IL-4/TNF)을 암호화하는 염기서열.
제 1항의 염기서열로 부터 번역되는 서열번호 9로 나타내어지는 종양괴사인자와 인터루킨-4의 융합단백질(IL-4/TNF)의 아미노산 서열.