KR102226917B1 - 신규 유전자 변형 자연살해 세포주 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 유전자 변형 NK 세포주 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 분리된 NK 세포주에 CD7, CD28, 세포막 결합 IL-15, 및 TGFβ 수용체를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 세포자살 유전자가 형질도입된 유전자 변형 NK 세포주 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물 등 그의 용도를 제공한다.

Description

신규 유전자 변형 자연살해 세포주 및 그의 용도{A novel genetically modified natural killer cell line and use thereof}
본 출원은 2018년 3월 23일자로 출원된 대한민국 특허출원 제2018-0034079 호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 특허출원서에 기재된 사항은 본 문서에 참조로 삽입된다.
본 발명은 신규한 세포주 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 신규 유전자 변형 자연살해(genetically modified natural killer) 세포주 및 그의 용도에 관한 것이다.
자연살해세포(이하 'NK 세포'라 함)는 체내에 존재하는 비정상적인 자가세포, 즉 암세포를 살상할 수 있는 능력을 가지고 있다. NK 세포와 세포독성 T 세포 (이하 CTL)의 차이점은 항원 특이성의 유무이다. 항원 특이적 항원수용체를 이용하여 표적세포의 MHC와 항원 펩타이드를 특이적으로 인식하는 세포독성 T세포 (이하 CTL)는 단일한 표적에 대한 반응성이 존재하는 반면, NK 세포의 경우 암세포 표면의 NK 활성화 수용체(Killer cell activation receptor, KAR)와 비활성화 수용체(Killer cell inhibitory receptor, KIR)의 발현 및 표면 MHC I 항원의 부재 등 세포에서 발생하는 다양한 비정상적 변화를 인지하여 세포를 살상할 수 있기 때문에 비교적 넓은 범주의 암세포 살상에 효과가 있다(Min Cheng, 20131, Cellular & Molecular immunology). 특히 NK 세포는 이식편대숙주병을 일으키지 않으면서 백혈병 세포나 암세포를 제거하기 때문에 환자에 대한 투여부작용이 현저히 적다는 점에서 입양전입세포치료(adoptive cell therapy)에 적합한 세포로 각광받고 있다 (Glienke et al., Front. Pharmacol., 6: 21, 2015). 뿐만 아니라 NK 세포는 T 세포와는 달리 면역기억이 존재하지 않으므로 암세포에 의해 활성화 된 후 자체적으로 사멸된다. 따라서 체내에 면역기억을 형성하여 장기간 존재하는 T 세포를 기반으로 한 치료법에 비해 NK 세포를 이용한 항암치료는 그 부작용 가능성이 매우 적다.
그러나, 현재 NK 세포를 이용한 면역세포 치료방식의 경우, 환자의 자가유래 세포나 동종이계의 초도배양 NK 세포(primary NK cell)를 분리, 활성화 및 증폭시켜 치료제를 구축하고 있으나, 얻을 수 있는 세포자원과 증폭량이 한정적이고, 배양 보조세포(feeder cell) 및 다양한 사이토카인을 이용한 생산공정을 이용하여 과정이 복잡하고, 치료제가 가진 배치 간 변동(batch-to-batch variation)의 존재 가능성 등으로 그 한계가 있다. 또한 체외에서 제한된 시간 동안 세포를 증식할 수 있어 유전자 삽입/변형을 통한 효력 증강이 다소 제한적일 수 있다. 이러한 제한점을 극복하기 위한 방법으로는 단일 NK 세포주를 기반으로 한 세포치료제 개발이 유효한 방법일 수 있으며, 이를 통해 세포자원의 제한 극복, 공정의 단순성, 대량생산의 가능성, 치료제의 균질성을 확보할 수 있다. 추가적으로, NK 세포가 효과적인 치료제로 사용되기 위해서는 몇 가지 요소가 추가적으로 필요할 수 있으며, 이는 NK 세포주의 세포살상능 강화, 환자 투여시 추가적인 안전성 확보, 생산시 배양공정의 용이성 확보, 및 환자내 면역억제 환경에 의한 기능 소실 방지 등이 있을 수 있고, 세포주 기반 치료제는 치료유전자를 추가로 도입한 단일세포 기원 세포치료제의 구축이 초도배양 세포 대비 매우 용이하다.
그러나, 확립된 NK 세포주일지라도 최적의 세포살상능을 나타내는데 필요한 인자의 발현이 결여되어 있는 경우가 종종 있기 때문에, 확립된 NK 세포를 그대로 항암치료제의 유효물질로 사용하는 것은 쉽지 않은 일이다.
NK 세포는 암살상 효과를 나타내기 위해 NK 활성화 수용체(NK cell activation receptor, KAR), 세포부착분자(cell adhesion molecule), NK 공동활성화 수용체(NK costimulatory molecule) 등을 필요로 한다. 아울러, 세포주 기반 치료제의 경우 해당 세포주의 기원이 암세포이거나 불멸화하였으므로 환자 내 투입시 종양형성 등의 문제가 발생할 수 있고, 면역활성 기능이 높은 면역세포주의 경우 환자 내에서 예측하지 못한 과활성이 유발될 수 있으므로, 이에 대한 대비가 필요하다.
뿐만 아니라, 세포주 생산에 있어, 최소한의 배양보조세포 및 사이토카인 보충제를 이용하는 것이 공정을 단순하게 하며 생산 효율을 증가 시킬 수 있다.
마지막으로, 면역세포의 경우 환자 체내에 존재하는 다양한 면역억제 환경[조절 T 세포(regulatory T cell), 골수유래 억제세포(myeloid derived suppressor cells), 면역억제 사이토카인(immune suppressive cytokine)] 등에 의하여 그 활성 기능이 저해될 수 있다. 따라서, 분리되어 구축된 NK 세포주의 항암 세포살상능을 극대화하고 이의 증식을 향상시키며, 부작용을 최소화시킬 수 있는 유전자 변형 NK 세포주의 확립이 요구되고 있다.
이러한 유전자 변형 NK 세포주로는 Fc 수용체(CD16)를 발현하도록 형질전환된 NK-92 세포가 존재한다(US20060292156A1).
그러나, 상기 선행문헌의 유전자 변형 NK 세포주(NK-92-CD16)는 항체에 의한 NK세포의 암세포 살상능(ADCC)만이 증진되었을 뿐, 자체적인 암세포 살상능력은 증가되지 않았고, 세포 증식 및 부작용의 최소화와는 관련이 없다.
이에 본 발명의 목적은 NK 세포를 기반으로 세포살상능이 더욱 향상되면서도, 증식이 용이하고 면역과활성화로 인한 부작용을 최소화할 수 있는 유전자 변형 NK 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 변형 NK 세포주를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 특성을 갖는 분리된 NK 세포주에 NK 세포 보조활성화 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질도입되어 상기 NK 세포 보조활성화 인자가 발현되는, 유전자 변형 NK 세포주가 제공된다:
CD2, CD11a, CD25, CD45, CD54, DNAM-1, CD62L 및 CD56은 양성; 및
CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CD23, CD34, TCRαβ 및 TCRγδ는 음성.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 유전자 변형 NK 세포주를 유효성분으로 포함하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 분리된 NK 세포주에 NK 세포 보조활성화 인자, NK 세포 증식 인자, 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 세포자살 유전자가 형질도입된 유전자 변형 NK 세포주가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 유전자 변형 NK 세포주를 유효성분으로 포함하는 암 치료 및 예방용 약학적 조성물이 제공된다.
아울러 본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 유전자 변형 NK 세포주 및 자살유도제를 포함하는 암 치료용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 중 어느 하나의 유전자 변형 NK 세포주 및 선택적으로 자살유도제를 추가로 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 암에 걸린 개체의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 분리된 NK 세포주에 NK 세포 보조활성화 인자, 세포막 결합 IL-15, 및 TGFβ 수용체를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 세포자살 유전자가 형질도입되고, 암항원 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질도입되어 상기 암항원 특이적 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전자 변형 NK 세포주가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주는 종래 보고된 NK 세포주에 비해 세포능식능이 뛰어나 경제성이 매우 높고 모세포주에 비하여 암세포 살상능이 현저하게 개선되었으며, 키메라 항원 수용체를 이용한 암항원 특이적 항암치료를 위한 플랫폼으로도 사용 가능함이 실험적으로 입증되었는 바, 암치료를 위한 세포치료제로 매우 효율적으로 사용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 NK101 세포주의 계대에 따른 세포증식 정도를 나타내는 그래프이고, 도 1b는 NK101 세포가 CD3, CD20, 및 CD16 음성이며 CD56 양성인 NK세포임을 확인한 도트 그래프이다. 도 1c는 상기 NK101 세포의 배양시 확인되는 세포형태를 현미경을 이용하여 촬영한 사진이며, 도 1d는 Wright-Giemsa 염색법을 이용하여 NK101 세포의 형태를 촬영한 사진이고, 도 1e는 상기 NK101 세포가 NK세포의 주요 세포 사멸인자인 Perforin(녹색) 및 Granzyme(적색)을 발현함을 형광염색 기법을 통해 확인한 사진이며, 도 1f는 NK101와 MHC class I 음성 세포인 K562의 공배양을 통해 NK101의 암세포 사멸능을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a NK101와 NK-92의 IL-2 농도 의존적 세포 성장률 및 민감도를 MTS 분석을 이용하여 비교 분석한 그래프이고, 도 2b는 NK101 및 NK-92의 IL-2 수용체 소단위의 발현도의 차이를 유세포 분석을 이용해 확인한 히스토그램이며, 도 2c는 NK101 및 NK-92의 해동 시점부터 세포증식 및 생존율을 동일 배양조건에서 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 2d는 배양적응 후 증식정도 및 배가시간을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3a는 NK101 세포에서의 주요 계통 (lineage) 또는 조상 표지자 (progenitor marker) 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 3b는 NK101 세포에서의 활성화 수용체 및 비활성화 수용체 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 3c는 NK101 세포에서의 세포부착 인자 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 3d는 NK101 세포에서의 NK 세포 의존적 세포독성에 관여하는 CD107a, 퍼포린, 그랜자임, FasL 및 TRAIL 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 3e는 NK101 세포에서의 사이토카인 수용체 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 3f는 NK101 세포에서의 다양한 C-C 케모카인 수용체 및 C-X-C 케모카인 수용체 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 4a는 NK101, NK-92 및 초도배양 CD56+ 말초혈액 NK 세포의 CD56 발현을 확인한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 4b는 상기 세포들의 CD56 및 CD62L 발현을 확인한 유세포 분석 결과를 나타내는 2차원 등고선 그래프이다.
도 5a는 각각 표기된 사이토카인을 3일간 배양액에 처리한 후 NK101 세포의 증식률을 MTS 분석법으로 확인한 그래프(좌측) 및 NK 활성화 사이토카인인 IFN-γ의 생성을 ELISA로 확인한 그래프(우측)이고, 도 5b는 NK101 세포를 K562 또는 THP-1 암세포주와 24시간 공배양한 후 분비되는 사이토카인을 Multiplex 분석법으로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 다양한 암세포주와 NK101 세포를 다양한 세포비율로 24시간 공배양하여 암세포의 사멸도를 확인한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6b는 NK101 세포에 각각 표기된 표면항체에 대한 중화항체를 처리하고 급성골수성백혈병 세포주 THP-1과 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 세포사멸도를 측정한 그래프이며, 도 6c는 NK101 세포에 각각 표기된 표면항체에 대한 중화항체를 처리하고 만성골수성백혈병 세포주 K562와 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 세포사멸도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6d는 NK101 세포에 각각 표기된 표면항체에 대한 중화항체를 처리하고 급성림프구성백혈병 세포주 Jurkat과 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 세포사멸도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 6e는 NK101에 각각 DNAM-1, CD54 혹은 DNAM-1 및 CD54 중화항체를 처리한 후, 각 표지자의 동시 중화에 의한 상승적 저해작용(synergistic inhibition)을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 NK101 및 기존에 구축된 세포주 KHYG-1, 및 NK-92에서의 CD7, CD28 보조자극인자의 발현 양상을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 7b는 NK101 세포의 암세포 사멸 효과 증진을 위해 도입된 유전자 컨스트럭트의 개요도이며, 도 7c는 상기 도 7b에 도시된 유전자 컨스트럭트가 도입된 NK101 세포(SL-K01로 명명)에서의 CD7, CD28 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 7d는 SL-K01 세포에서의 CD::UPRT 발현을 역전사 PCR을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8a는 HDLM-2, IM-9, JEKO-1 및 K562 암세포를 NK101 또는 SL-K01 세포와 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 암세포 사멸빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 8b는 다양한 농도의 5-FC를 NK101 또는 SL-K01 세포에 48시간 처리한 뒤, 세포 성장률을 MTS 분석을 통하여 확인한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 8c는 IM-9 세포주와 NK101 또는 SL-K01 세포를 2:1, 1:1 또는 0.5:1 비율로 공배양 시, 5-FC 유무에 따른 IM-9 암세포 사멸 빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 SL-K01 세포의 추가적 암세포 사멸 효과 증진 및 면역억제인자 TGF-β에 대한 저항성 유도를 위해 도입된 유전자 컨스트럭트의 개요도이고, 도 9b는 SL-K01 및 상기 도 9a에 도시된 유전자 컨스트럭트가 도입된 SL-K01 세포(NK111로 명명) 표면에서의 IL-15 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 9c는 SL-K01 및 NK111 세포에서의 TGFβRIIΔcyto 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 10a는 SL-K01 및 NK111 세포의 배양 시, IL-2 유무에 따른 세포수 증식수준(population doubling level)을 나타낸 그래프이고, 도 10b는 NK101, SL-K01 및 NK111 세포에서의 NKG2D 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 10c는 IM-9 세포주와 SL-K01 또는 NK111 세포를 2:1, 1:1, 또는 0.5:1 비율로 공배양 시, 5-FC 유무에 따른 IM-9 암세포의 사멸빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 10d는 OVCAR-3 또는 THP-1 세포주를 SL-K01 및 NK111 세포와 공배양시, 다양한 농도의 TGFβ1을 처리한 후, 암세포 사멸능에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 NK111 세포의 EpCAM 특이적 암세포 살상능을 증진시키기 위해 도입된 키메라 항원 수용체 유전자 컨스트럭트의 개요도이고, 도 11b는 NK111에 상기 도 11a에 도시된 유전자 컨스트럭트가 도입된 NK111-EpCAM-CAR 세포 표면에서 키메라 항원 수용체 발현 여부를 확인하기 위한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 11c는 인간 난소암 세포주인 RMG-1(좌측) 및 KOC-2S(우측)의 EpCAM 항원의 발현양상을 분석한 결과를 나타내는 히스토그램(상단) 및 상기 암세포와 NK101, NK111, 또는 NK111-EpCAM-CAR의 공배양시 암세포 사멸 정도를 나타낸 그래프이며, 도 11d는 상기 도 11c의 공배양 시료의 배양상등액을 수거하여 IFN-γ 및 그랜자임 B의 수준을 분석한 ELISA 결과를 나타내낸 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "CAR 컨스트럭트"는 "키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor) 컨스트럭트"의 약어로, 통상적으로 항원 인식부위로 리간드 또는 scFv, sdAb와 같은 단일쇄 기반의 항체 유사체-세포막 통과 도메인-보조자극인자-세포내 신호전달 도메인으로 구성된 합성 단백질로서 T 세포 등 면역세포에 형질도입되어 암세포 특이적인 항원을 인식하여 CAR 컨스트럭트를 발현하는 면역세포의 이들 암세포에 대한 항암 활성을 향상시키는 것으로 잘 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "scFv"는 "single chain variable fragment"의 약어로서 실제 항체의 단편은 아니며, 항체의 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 약 25 a.a. 크기의 링커 펩타이드로 연결하여 제조한 일종의 융합단백질로서 고유의 항체 단편이 아님에도 불구하고 항원 결합능을 지닌 것으로 알려지고 있다(Glockshuber et al., Biochem. 29(6): 1362-1367, 1990).
본 문서에서 사용되는 용어 "sdAb(single domain antibody)"는 나노바디(nanobody)라고 지칭되며, 항체의 단일 가변영역 단편으로 구성된 항체 단편이다. 주로 중쇄로부터 유래한 sdAb가 사용되나, 경쇄로부터 유래한 단일 가변영역 단편 역시 항원에 대하여 특이적 결합이 되는 것으로 보고되고 있다.
본 문서에서 사용되는 "항체 유사체(antibody mimetic)"는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 이종사량체의 4차구조를 형성하여 기능을 발휘하는 통상의 전장 항체와 달리, 항원 결합능을 유지하는 최소단위를 포함하는 단편(예컨대, Fab, F(ab')2, Fab' 또는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 링커로 연결한 인위적 단편인 단일쇄 가변 단편(single-chain variable fragment, scFv), 경쇄가 없이 중쇄만으로 구성되는 낙타과 또는 연골어류 유래의 항체 단편(VHH, VNAR 등) 또는 nanobody, monobody, 가변 림프구 수용체(VLR) 등 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체 유사단백질을 포함하는 개념이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "보조자극 도메인(costimulatory domain)"은 T/NK 활성화를 보조하는 면역관련 단백질인 보조자극 인자(costimulatory factor)의 막통과 도메인 및 세포질 도메인(cytoplasmic domain)을 의미한다. 이러한 보조자극 도메인은 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD7, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, NKG2D(natural-killer group 2, member D), DAP12(DNAX-activating protein 12), DAP10, DNAM-1, NTB-A, TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 CAR 컨스트럭트에서 항원인식부위가 암항원과 특이적으로 결합하였을 때, 면역세포의 활성화를 유도하는 신호를 생성시키는 도메인으로 T 세포 수용체(TCR)의 CD3ξ 도메인 등이 알려져 있다. 상기 CD3ξ 도메인 외에 CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, DAP10, DAP12 등을 사용하는 것도 가능하다.
본 문서에서 사용되는 용어 "유전자 변형(genetically modified)"이라는 용어는 숙주세포, 또는 선행종(predecessors)/모종(parents) 중 하나로 도입된 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 숙주세포가 자신의 게놈 외에 포함하는 것을 의미한다. 아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 게놈 외부의 독립적 분자, 바람직하게는 복제할 수 있는 분자로서 유전적으로 변형된 숙주세포 내에 존재할 수 있거나, 또는 숙주 면역세포의 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "세포자살 유전자(cell suicide gene)"는 세포독성을 유발하거나 또는 세포사멸 기전을 촉발시킴으로써 해당 유전자가 발현되는 세포가 사멸하도록 유도하는 유전자를 의미한다. 특히 유전자 발현 자체로는 세포사멸이 촉발되지 않으나 특정 전구약물(프로드러그, prodrug)을 처리시 세포자살 유전자에 의해 전구약물이 대사됨으로써 생성되는 대사산물이 세포독성 또는 세포사멸 기전을 촉발함으로써 세포를 사멸에 이르게 할 수 있다. 이러한 세포자살 유전자들에는 간시클로비르를 자살 유도신호로 사용하는 헤르페스 단순포진 바이러스 티미딘 인산화 유전자(HSV TK), 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오사이드(6-methoxypurine arabinonucleoside)를 자살 유도신호로 사용하는 바리셀라 조스터 바이러스 티미딘 인산화효소(VZV TK), 5-플루오로시토신(5-FC)를 자살 유도신호로 사용하는 시토신 디아미네이즈 및 우라실 포스포리보실전이효소(UPRT), 이리노테칸(CPT-11)을 자살 유도신호로 사용하는 카르복실 에스터라제, 5(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤자마이드(CB1954)를 자살 유도신호로 사용하는 니트로리덕테이즈, 4-[(2-클로로에틸)(2-메실록시에틸)아미노]벤조일-엘-글루탐산(CMDA)을 자살 유도신호로 사용하는 카르복시펩티데이즈 G2, 분자간 이량화 유도제(dimerizer)를 자살 유도신호로 사용하는 유도성 카스페이즈 9(iCas9)이 보고된 바 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 특성을 갖는 분리된 NK 세포주에 NK 세포 보조활성화 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질도입되어 상기 NK 세포 보조활성화 인자가 발현되는, 유전자 변형 NK 세포주가 제공된다:
CD2, CD11a, CD25, CD45, CD54, DNAM-1, CD62L 및 CD56은 양성; 및
CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CD23, CD34, TCRαβ 및 TCRγδ는 음성.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 분리된 NK 세포주는 수탁번호 KCTC 13305BP로 기탁된 NK101 세포주일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 NK 세포 보조활성화 인자는 Ly49, NCR(natural cytotoxicity receptor), CD7, CD16 및 CD28로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 NK 세포 보조활성화 인자는 CD7 및/또는 CD28일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 적어도 하나 이상의 NK 세포 증식 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 형질도입될 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 NK 세포 증식 인자는 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 사이토카인 또는 상기 사이토카인의 변이체일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 IL-15는 막결합 IL-15일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 세포자살 유전자가 추가로 형질도입될 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 세포자살 유전자는 우라실 포스포리보실전이효소(UPRT) 유전자, 헤르페스 단순포진 바이러스 티미딘 인산화 유전자(HSV TK), 바리셀라 조스터 바이러스 티미딘 인산화효소(VZV TK) 유전자, 시토신 디아미네이즈 유전자, 카르복실 에스터레이즈 유전자, 니트로리덕테이즈 유전자, 카르복시펩티데이즈 G2 유전자, 또는 유도성 카스페이즈 9(iCas9)유전자일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 형질도입될 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체는 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체II일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 암항원을 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 형질도입될 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 암항원은 CD19, CD22, PSA(prostate specific antigen), CEA(carcinoembryonic antigen), CA-125, mucin 1, AFP(alphafetoprotein), ETA(epithelial tumor antigen), 티로시네이즈, CD52, PD-L1(programmed death-ligand 1), CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), CD20, MAGE(melanoma-associated antigen), FAP(fibroblast activation protein), FLT3 (fms like tyrosine kinase 3), IL13Rα2 또는 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 암항원에 특이적으로 결합하는 리간드 또는 항체유사체-막통과 도메인-보조자극인자-세포내 신호전달 도메인을 포함하는 융합단백질일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 항체유사체는 scFv, sdAb, 나노바디, VHH, VNAR, VLR, 또는 모노바디일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 보조자극인자는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD7, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), DAP10, DNAM-1, NTB-A, TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 CD3ξ 도메인, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, DAP10, 또는 DAP12일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 필요에 따라 하나 또는 둘 이상의 유전자가 제거될 수 있다. 상기 유전자는 환자의 유전자형에 따라서 결정될 수 있는데, 환자에게 투여시 과도한 면역반응을 유도함으로써 부작용을 일으키거나 투여된 세포의 활성을 저해할 수 있는 유전자일 수 있다. 이러한 유전자의 제거에는 TALEN, 또는 CRISPR와 같은 게놈 편집 도구가 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 중 어느 하나의 유전자 변형 NK 세포주를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 중 어느 하나의 유전자 변형 NK 세포주 및 자살유도제를 포함하는 암 치료용 키트가 제공된다.
상기 암 치료용 키트에 있어서, 상기 자살유도제는 상기 세포자살 유전자가 HSV TK 또는 VZV TK인 경우에는 각각 간시클로비르(gancyclovir) 또는 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오사이드(6-methoxypurine arabinonucleoside), 상기 세포자살 유전자가 우라실 포스포리보실 전이효소(UPRT) 또는 시토신 디아미네이즈인 경우 5-플루오로시토신(5-FC), 상기 세포자살 유전자가 카르복실 에스터라제인 경우 이리노테칸(CPT-11), 상기 세포자살 유전자가 니트로리덕테이즈인 경우에는 5(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤자마이드(CB1954), 상기 세포자살 유전자가 카르복시펩티데이즈 G2인 경우에는 4-[(2-클로로에틸)(2-메실록시에틸)아미노]벤조일-엘-글루탐산(CMDA), 상기 세포자살 유전자가 iCas9일 경우 iCas9 이량화제(dimerizer)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 중 어느 하나의 유전자 변형 NK 세포주 및 선택적으로 자살유도제를 추가로 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 분리된 NK 세포주에 NK 세포 보조활성화 인자, NK 세포 증식 인자, 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 세포자살 유전자가 형질도입된 유전자 변형 NK 세포주가 제공된다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 분리된 NK 세포주는 하기의 특성을 가질 수 있다:
CD2, CD11a, CD25, CD45, CD54, DNAM-1, CD62L, 및 CD56은 양성; 및
CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CD23, CD34, TCRαβ 및 TCRγδ는 음성.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 분리된 NK 세포주는 수탁번호 KCTC 13305BP로 기탁된 NK101 세포주일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 NK 세포 보조활성화 인자는 Ly49, NCR(natural cytotoxicity receptor), CD7, CD16 및 CD28로 구성되는 군으로부터 선택되는 일 수 있다. 바람직하게는, 상기 NK 세포 보조활성화 인자는 CD7 및/또는 CD28일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 NK 세포 증식 인자는 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 사이토카인 또는 상기 사이토카인의 변이체일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체는 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체II일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 세포자살 유전자는 우라실포스포리보실전이효소(UPRT) 유전자, 헤르페스 단순포진 바이러스 티미딘 인산화 유전자(HSV TK), 바리셀라 조스터 바이러스 티미딘 인산화효소(VZV TK) 유전자, 시토신 디아미네이즈 유전자, 카르복실 에스터레이즈 유전자, 니트로리덕테이즈 유전자, 카르복시펩티데이즈 G2 유전자, 또는 유도성 카스페이즈 9(iCas9)유전자일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 필요에 따라 하나 또는 둘 이상의 유전자가 제거될 수 있다. 상기 유전자는 환자의 유전자형에 따라서 결정될 수 있는데, 환자에게 투여시 과도한 면역반응을 유도함으로써 부작용을 일으키거나 투여된 세포의 활성을 저해할 수 있는 유전자일 수 있다. 이러한 유전자의 제거에는 TALEN, 또는 CRISPR와 같은 게놈 편집 도구가 사용될 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주는 암항원을 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 형질도입된 것일 수 있다.
이 때, 상기 암항원은 공지된 어떠한 암항원도 사용이 가능한데, 상기 암항원은 CD19, CD22, PSA(prostate specific antigen), CEA(carcinoembryonic antigen), CA-125, mucin 1, AFP(alphafetoprotein), ETA(epithelial tumor antigen), 티로시네이즈, CD52, PD-L1(programmed death-ligand 1), CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), CD20, MAGE(melanoma-associated antigen), FAP(fibroblast activation protein), FLT3 (fms like tyrosine kinase 3), IL13Rα2 또는 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)일 수 있다.
아울러, 상기 키메라 항원 수용체는 암항원에 특이적으로 결합하는 리간드 또는 항체유사체-막통과 도메인-보조자극인자-세포내 신호전달 도메인을 포함하는 융합단백질을 수 있고, 상기 항체유사체는 scFv, sdAb, 나노바디, VHH, VNAR, VLR, 또는 모노바디일 수 있으며, 상기 보조자극인자는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD7, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), DAP10, DNAM-1, NTB-A, TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체일 수 있고, 상기 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 CD3ξ 도메인, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, DAP10 또는 DAP12일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 NK 세포 보조활성화 인자, NK 세포 증식 인자, 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체 및 세포자살 유전자는 개별적으로 발현되거나, 하나의 유전자 컨스트럭트 내에서 동시에 발현되거나, 둘 이상의 유전자 컨스트럭트로 나뉘어 발현될 수 있다. 예컨대, 상기 도입 유전자들 중 일부는 링커로 연결된 융합단백질의 형태로 발현되거나 단백질 분해효소 인식부위로 연결되어 세포내에서 발현되는 단백질 분해효소에 의해 자동적으로 절단되어 성숙된 단백질로 발현이 되거나, IRES 등으로 연결되어 하나의 mRNA로 발현된 후, 번역시 개별적인 단백질로 발현되는 것도 가능하다. 이들 유전자 컨스트럭트들은 하나 또는 그 이상의 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 포유동물 세포 특히 NK 세포에서의 발현에 최적화된 발현벡터에 삽입되어 다양한 진핵세포 형질도입법으로 형질도입될 수 있다. 이러한 형질도입법에는 리포펙센, 인산칼슘 형질감염, 유전자총(gene gun), 전기천공법(electroporation) 등 다양한 방법이 사용될 수 있으며, 더욱 정교한 핵내 형질도입을 위해 TALEN, 또는 CRISPR와 같은 게놈 편집 도구가 사용될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "작동가능하게 연결된(operably linked to)"은 특정 폴리뉴클레오타이드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오타이드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미하고, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 다른 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 당해 특정 단백질이 다른 단백질과 융합단백질의 형태로 발현될 수 있다.
상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절 인자들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절인자들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절인자들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절인자들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV(로우스 육종 바이러스) 프로모터, 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신-경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 1995, 270: 25739-25745)에 기술되어 있다. 원핵세포내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절인자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(In-vitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pX(Pagano (1992) Science 255, 1144-1147), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris et al., Cell 75, 791-803, 1995) 또는 원핵 발현 벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham-Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 본 발명의 펩타이드를 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더 서열이다. 선택적으로, 이종 서열은 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 간단한 정제와 같은 목적하는 특성들을 부여하는 C-말단 또는 N-말단 태그(tag) 펩타이드를 포함하는 융합단백질(fusion protein)을 코딩할 수 있다. 이러한 태그로는 FLAG, GST(glutathione S transferase), HisX6 등이 존재하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따른 벡터가 적당한 숙주세포 또는 비인간 숙주개체에 형질도입되면, 상기 숙주세포 또는 숙주개체는 뉴클레오티드 서열의 고수준 발현에 적당한 조건하에서 유지된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 유전자 변형 NK 세포주를 유효성분으로 포함하는 암치료용 및 암 예방용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 암은 혈액암 또는 고형암일 수 있고, 상기 고형암은 간암, 폐암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 담낭암, 위암, 담도암, 대장암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 뇌종양, 악성 흑색종, 전립선암, 고환암, 설암, 림프종 또는 백혈병일 수 있으며, 상기 고형암은 전이성 암일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 유전자 변형 NK 세포주와 함께 항암효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 암 치료용 조성물은 상기 유전자 변형 NK 세포주와 공지의 유효성분이 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 혼합되어 제형화된 약학적 조성물을 의미하며, 함께 제형화되지 않을 경우에는 별도로 포장되어 동시에 또는 시간차를 두고 순차적으로 투여될 수도 있다. 후자의 경우에는 조성물이라기 보다는 키트라고 할 수 있을 것이다.
아울러, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 외에 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 세포치료제는 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물의 투여량은 세포수 기준으로 107 내지 1011 cells일 수 있지만, 상기 투여량은 환자의 성별, 나이, 질병의 진행정도, 치료 목적에 따라 조절될 수 있다. 일반적으로, 이러한 양은 표적 세포, 예를 들어, 암항원 과발현 암 세포에서의 국소화를 수득하고, 상기 암세포를, 예를 들어, 포식작용 또는 용해에 의해 죽이는데 충분할 것이다.
상기 세포치료제는 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다.
아울러 본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 치료제는 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 두개강내, 병변내, 비강, 척추관내로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
아울러 본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 유전자 변형 NK 세포주 및 자살유도제를 포함하는 암 치료용 키트가 제공된다.
상기 암 치료용 키트는 상기 유전자 변형 NK 세포주와 자살유도제를 포함하되 이들 두 구성성분이 혼합된 형태로 제공되지 않고 별도로 포장되어 제공되며, 이들 두 구성성분은 같은 시점에 같거나 다른 경로로 투여될 수 있으나, 의사의 처방에 따라 일정한 간격을 두고 투여된다는 점에서 일반적인 약학적 조성물과 구분된다. 본 발명의 키트는 먼저 상기 유전자 변형 NK 세포주를 투여한 후, 적절한 시점, 예컨대 유전자 변형 NK 세포주 투여와 같은 시점, 투여로부터 1일 후, 2일 후, 3일 후, 4일 후, 5일 후, 6일 후, 또는 1주일 후, 10일 후, 2주 후, 15일 후, 20일 후, 3주 후, 25일 후, 4주 후, 또는 30일 후에 투여될 수 있고, 첫 번째 투여 이후 이틀, 사흘, 나흘, 닷새, 엿새, 일주일간의 간격으로 두 차례 이상 복수로 투여될 수도 있다. 아울러, 상기 키트는 각각의 구성성분의 투여 경로가 같을 수도 있고 다를 수도 있다. 예컨대, 상기 유전자 변형 NK 세포주를 정맥주사로 투여한 후, 거의 같은 시간대 또는 소정의 간격을 투고 상기 자살유도제는 경구 투여되거나 복강내 주사 또는 정맥 주사로 투여될 수 있다. 상기 자살유도제의 투여 경로는 자살유도제의 특성에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 예컨대, 5-FC, 및 이리노케칸의 경우에는 복강내주사, 정맥주사 또는 경구투여 어느 것도 가능하다. 상기 유전자 변형 NK 세포주 및 자살유도제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 상술한 바와 같다.
상기 자살유도제는 세포자살 유전자의 종류에 따라 달라지는데, 예컨대, 세포자살 유전자가 HSV TK 또는 VZV TK일 경우에는 각각 간시클로비르(gancyclovir) 또는 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오사이드(6-methoxypurine arabinonucleoside)일 수 있으며, 우라실 포스포리보실 전이효소(UPRT) 또는 시토신 디아미네이즈의 경우 5-플루오로시토신(5-FC)일 수 있고, 카르복실 에스터라제의 경우 이리노테칸(CPT-11)일 수 있다. 아울러 니트로리덕테이즈의 경우에는 5(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤자마이드(CB1954)일 수 있고, 카르복시펩티데이즈 G2의 경우에는 4-[(2-클로로에틸)(2-메실록시에틸)아미노]벤조일-엘-글루탐산(CMDA)일 수 있으며, iCas9일 경우 iCas9 이량화제(dimerizer)일 수 있고, 상기 iCas9 이량화제는 AP20187 또는 AP1903일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 유전자 변형 NK 세포주 또는 선택적으로 자살유도제를 추가로 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 암에 걸린 개체의 치료방법이 제공된다.
본 문서에서 사용되는 "치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 암세포의 사멸 또는 적어도 암조직의 성장을 유의하게 억제하는 정도의 양을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 암치료용 약학적 조성물 또는 암치료용 키트의 사용을 통해 치료 가능한 암은 간암, 폐암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 담낭암, 위암, 담도암, 대장암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 뇌종양, 악성 흑색종, 전립선암, 고환암, 설암, 림프종 또는 백혈병일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 분리된 NK 세포주에 NK 세포 보조활성화 인자, 세포막 결합 IL-15, 및 TGFβ 수용체를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 세포자살 유전자가 형질도입되고, 암항원 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질도입되어 상기 암항원 특이적 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전자 변형 NK 세포주가 제공된다.
상기 암항원은 CD19, CD22, PSA(prostate specific antigen), CEA(carcinoembryonic antigen), CA-125, mucin 1, AFP(alphafetoprotein), ETA(epithelial tumor antigen), 티로시네이즈, CD52, PD-L1(programmed death-ligand 1), CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), CD20, MAGE(melanoma-associated antigen), FAP(fibroblast activation protein), FLT3 (fms like tyrosine kinase 3), IL13Rα2 또는 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)일 수 있다.
이하, 본 발명을 첨부되는 도면을 이용하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 NK 림프암종 환자의 암조직으로부터 표 1에 기재된 특성을 갖는 새로운 NK 세포주를 분리하였으며, 이에 대한 다양한 특성을 조사한 결과, 도 1 내지 6에 나타난 바와 같이, IL-2 의존적 증식능을 나타내며, 암세포 사멸능과 면역조절능을 모두 갖는 다기능성 NK 세포주임을 확인할 수 있었다. 특히, 현재 임상시험이 진행중인 유일한 NK 세포주인 NK-92에 비해 증식능이 현저하게 높아서 경제적으로 생산가능한 세포임을 확인하여, 이를 'NK101' 세포주로 명명하고 이를 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 181번지에 소재하고 있는 한국생명공학연구원 내 한국유전자은행(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2017년 8월 7일자로 기탁하여, 2017년 8월 24일자로 KCTC 13305BP의 수탁번호를 부여받았다. 그러나, 상기 NK101 세포주는 유전자 발현 분석 결과, IL-2 수용체인 CD25는 고발현이고, CD56dimCD62L+의 표현형을 갖는 것으로 확인되었으나, NK 세포의 항암 활성에 직접적인 영향을 주는 NK 세포 보조활성화 인자인 CD7 및 CD28은 발현하지 않음을 확인함으로써, 항암 활성 자체는 종래에 구축된 NK 세포주 보다 높지 않을 것으로 예상하게 되었다.
이에, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 NK101 세포의 항암활성을 강화하기 위해, NK101 세포에 기반한 유전자 변형 NK 세포주를 제조하고자 하였다. 도 7b는 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 SL-K01의 제조에 사용된 유전자 컨스트럭트 CD7-CD28-CD::UPRT의 구조를 개략적으로 나타낸 개요도이고 및 도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 NK111의 제조를 위해 사용된 유전자 컨스트럭트 mbIL-15-mTGFβIIΔcyto의 구조를 개략적으로 나타낸 개요도이다.
본 발명에서는 앞서 언급한 요소를 보완하기 위하여, 본 발명자들에 의해 기확립된 NK101 세포(수탁번호 KCTC 13305BP)에 NK 세포의 보조활성화 수용체, 세포자살 유전자, 세포막 고정(membrane bound) 사이토카인, 돌연변이 TGFβ 수용체를 도입하여 해당 NK 세포의 항암효과 증진, 및 사이토카인 보충제(cytokine supplement) 비의존적으로 증식이 가능한 NK111 세포주를 구축하였다(도 9b 및 9c 참조).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K01) 및 상기 SL-K01의 모세포주인 NK101, 그리고 종래 구축된 NK 세포주인 KHYG-1 및 NK-92에서의 세포 표면 표지자의 발현양상을 유세포 분석으로 분석한 결과로서, 도 7a는 NK101, KHYG-1 및 NK-92에서 CD7 및 CD28의 발현여부를 분석한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 7c는 상기 도 7b에 도시된 유전자 컨스트럭트를 형질도입한 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 세포주 SL-K01 세포에서의 CD7 및 CD28 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이다. 상기 도 7에서 확인되는 바와 같이, 기존에 구축된 NK세포주 들 중 암세포 사멸능이 높다고 알려져 있는 KHYG-1 및 NK-92는 공통적으로 CD7을 발현하는 특징을 갖고, NK-92 세포는 CD7은 물론 CD28까지도 동시에 발현하는 특성을 가지고 있는 반면, NK101은 두 보조자극 인자가 전혀 발현되지 않음을 확인할 수 있었다. 이에, 본 발명자들은 NK101 세포에 CD7 및 CD28 도입을 통해 암세포 사멸능이 증진되는지의 여부를 평가하고자 하였다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 SL-K01 및 상기 SL-K01의 모세포주인 NK101의 다양한 암세포에 대한 세포사멸능을 분석한 결과로서, 도 8a는 HDLM-2, IM-9, JEKO-1 및 K562 암세포를 NK101 또는 SL-K01 세포와 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 암세포 사멸빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 8b는 다양한 농도의 5-FC를 NK101 또는 SL-K01 세포에 48시간 처리한 뒤, 세포 성장률을 MTS 분석을 통하여 확인한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 8c는 IM-9 세포주와 NK101 또는 SL-K01 세포를 1:1, 2:1, 또는 4:1 비율로 공배양 시, 5-FC 유무에 따른 IM-9 암세포 사멸 빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8a 내지 8c에서 확인되듯이, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 SL-K01은 NK101 대비 다양한 암세포주에서 우수한 살상능을 보여, CD7, CD28 도입을 통해 NK101 세포의 살상능이 증진되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 5-FC 처리를 통해 SL-K01 세포의 제거를 유도함으로써 안전성을 확보할 수 있을 뿐 아니라, 방관자 살상 효과까지 유도하여 주변의 암세포를 제거할 수 있음을 확인하였다.
도 9는 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주인 NK111 세포주의 구축과정을 나타내는 것으로서, 도 9a는 SL-K01 세포의 추가적 암세포 사멸 효과 증진 및 면역억제인자 TGF-β에 대한 저항성 유도을 위해 도입된 유전자 컨스트럭트의 개요도이고, 도 9b는 SL-K01 및 상기 도 9a에 도시된 유전자 컨스트럭트가 도입된 SL-K01 세포('NK111'로 명명) 표면에서의 IL-15 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 9c는 SL-K01 및 NK111 세포에서의 TGFβRIIΔcyto 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이다. 도 8에서 확인된 바와 같이, CD7/CD28 도입은 NK101 세포의 살상능 증진에 중간 정도의 효과를 나타냈다. 이에 본 발명자들은 SL-K01 세포의 암세포 사멸능을 극대화하기 위해, 대표적 NK 세포 보조활성화 인자인 막결합(membrane bound) IL-15(mbIL-15)을 SL-K01 세포에 형질도입하고자 하였고, 면역억제인자 TGF-β에 대한 저항성 유도을 위해 세포질 도메인(cytoplasmic domain)이 결실된 TGFβRIIΔcyto을 과발현시켜 미끼 수용체(decoy receptor)로 작용하도록 하였다. 그 결과, 도 9b 및 9c에서 확인되는 바와 같이, 모세포주인 SL-K01에서는 발현이 되지 않던 IL-15 및 TGFβRII가 본 발명의 일 실시예에 따른 NK111 세포주에서는 발현이 됨이 확인되었다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주인 NK111의 항암활성 및 안전성을 비교분석한 결과로서, 도 10a는 SL-K01 및 NK111 세포의 배양 시, IL-2 유무에 따른 세포수 증식수준(population doubling level)을 나타낸 그래프이고, 도 10b는 NK101, SL-K01 및 NK111 세포에서의 NKG2D 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 10c는 IM-9 세포주와 SL-K01 또는 NK111 세포를 1:1, 2:1, 또는 4:1 비율로 공배양 시, 5-FC 유무에 따른 IM-9 암세포의 사멸빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 10d는 OVCAR-3 또는 THP-1 세포주를 SL-K01 및 NK111 세포와 공배양시, 다양한 농도의 TGFβ1을 처리한 후, 암세포 사멸능에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 도 10a에서 확인되듯이, 막결합 IL-15의 도입을 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 NK111는 IL-2 독립적으로 세포성장이 가능하게 되었으며, 이는 생산시 편의성을 높여준다. 또한, 도 10b에서 확인되는 바와 같이, IL-15 도입을 통해 NK 세포의 대표적 활성화 수용체인 NKG2D 발현이 상향조절됨으로써 암세포에 대한 살상능을 증진시킴을 확인할 수 있었다. 아울러, 도 10c에서 확인되는 바와 같이, 5-FC 처리에 의한 방관자 살상 효과(bystander killing effect)가 더해지면, 1:1 비율에서 암세포 사멸을 90% 정도로 유도할 수 있을 만큼 살상능이 증진되었다. 또한, 도 10d에서 확인되는 바와 같이, 종양미세환경에서 과다분비되는 면역억제인자인 TGFβ1에 대한 미끼 수용체인 TGFβRIIΔcyto 도입을 통해 TGFβ1에 대한 살상능 저하에도 영향을 받지 않게 되었는데, 이는 추후 생체내 활성 감소를 어느 정도 극복할 수 있음을 기대하게 하는 특성이다.
아울러, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 NK111 세포가 항원-특이적 항암활성을 달성할 수 있는 암항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)의 전달용 플랫폼으로 작용할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 암항원인 EpCAM을 표적으로 하는 CAR 컨스트럭트를 제조하여(도 11a), NK111 세포에 형질도입한 SL-K10 세포주를 제조하였는데, 상기 SL-K10 세포주는 EpCAM 특이적 CAR를 정상적으로 발현하였고(도 11b), EpCAM을 과발현하는 RMG-1 세포를 대상으로 시험관내 조건에서 댜양한 효과기:표적(E:T) 비율로 공배양시 암세포 사멸능을 분석한 결과 EpCAM을 발현하지 않는 대조군 암세포인 KOC-2S와 달리 항암 활성이 현저하게 증가되었을 뿐만 아니라(도 11c), 이러한 뛰어난 항암활성의 증가는 항암 염증성 사이토카인인 INF-γ 및 그랜자임 B의 발현증가에 기인하는 것임을 확인할 수 있었다(도 11d). 이러한 결과는, 본 발명의 일 실시예에 따른 NK111 세포가 혈액암은 물론 고형암의 치료에 사용될 수 있는 차세대 CAR 발현 세포치료제의 플랫폼으로 매우 효율적으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 본 발명의 NK 세포주의 제조 과정
NK 세포 유래 세포주를 제작하기 위하여 다음과 같은 과정을 거쳤다. 환자에서 유래한 림프절외(extranodal) NK 림프암종을 40 μm 스트레이너에 올려두고, 20% 우태아혈청(GE Healthcare, USA)와 1% 항생제(Gibco, USA)가 포함된 Cellgro® 줄기세포 성장배지(SCGM; CellGenix, Germany, 이하 'NK media'라 함) 10 mL을 첨가한 후 5 mL 주사기의 피스톤의 전단력을 이용하여 단일세포로 떼어낸 후 현탁하였다. 단일세포 현탁액 중 NK 세포를 NK 분리키트(Milltenyi Biotec, Germany)를 이용하여 분리한 후 1000 U/mL의 인간 재조합 IL-2(recombinant human IL-2; rhIL-2; Prometheus Laboratories Inc., USA)가 첨가된 NK media에서 3주간 배양하였다. IL-2가 포함된 NK media를 주 2회 첨가하였으며, 분열 세포주를 30계대까지 지속 배양하여 안정적인 세포주가 형성되었음을 확인하였다(도 1a). 상기 세포주는 CD3, CD20, CD16는 발현하지 않으면서 CD56을 발현하므로, 해당 세포의 기원이 NK 세포임을 확인하였다(도 1b). 해당 세포주는 배양 시 군집(spheroid)을 형성하는 특징이 있다는 것을 현미경 상에서 확인할 수 있었으며(도 1c), Wright-Giemsa 염색법을 이용한 형태학적 분석에서 NK101 세포가 큰 과립성 림프구(large granular lymphocyte)의 특성을 가짐을 확인하였다(도 1d). NK 세포 특성인 세포 사멸인자 퍼포린(Perforin, green) 및 그랜자임 B(Granzyme B, red)의 형광염색을 통해 NK101이 퍼포린과 그랜자임 B를 발현함을 확인하였다(도 1e). NK 세포에 민감하게 반응하는 MHCⅠ 음성 세포인 K562와 공배양을 수행하였다. 카르복시플루오레세인 디아세테이트(CFDA; Invitrogen, USA)로 표지한 K562 세포를 3x105 cells/mL 농도로 24-웰 플레이트(well-plate; Corning, USA)에 파종한 뒤 NK101 세포를 다양한 효과기 세포 대 표적 비율(E:T 비율 = 1:1, 2:1, 4:1, 10:1)로 1 mL 배지에 부유한 후 상기 암세포와 24시간 동안 함께 배양하였다. 배양 이후 모든 세포를 각 웰로부터 회수하여 원심 분리한 후, 세포 펠렛을 FACS 완충액으로 현탁시켰다. 다시 원심분리하여 형성된 세포 펠렛을 1 μL LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Stain Kit(Invitrogen, USA)를 넣은 FACS 완충액 100 μL에 현탁시켜, 4℃에서 20분간 반응하였다. FACS 완충액으로 2번 세척한 뒤, 1X Annexin V binding buffer 100 μL에 Annexin V APC 5 μL(Biolegend, USA)를 희석한 용액에 세포 펠렛을 현탁시켜, 실온에서 20분간 반응하였다. 세포의 사멸 여부는 유세포 분석법을 이용하여 생존 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-음성), 초기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-음성), 후기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-양성), 괴사(necrotic) 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-양성)으로 구분하였다. 도 1의 결과를 통하여 NK101은 지속적인 계대가 가능한 불멸화 세포이고, 배양 시 군집을 형성하며, 표현형 및 기능이 기존에 알려진 NK 세포와 일치하는 특성을 가짐을 알 수 있었다. 해당세포의 세포주화 및 NK 세포의 특성을 확인함으로써 해당 세포주를 'NK101'으로 명명하였으며, 이를 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 181번지에 소재하고 있는 한국생명공학연구원 내 한국유전자은행(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2017년 8월 7일자로 기탁하여, 2017년 8월 24일자로 KCTC 13305BP의 수탁번호를 부여받았다. 상기 기탁기관은 부다페스트 조약상 국제기탁기관이다.
실시예 2 : NK101의 세포 분열능 분석
상기 실시예 1에서 제조된 NK101 세포주에 대한 배양 조건 확립 및 분열능 비교를 위하여, NK101 세포와 대조군 세포인 NK-92 세포에 20% 우태아 혈청이 포함된 SCGM 배양배지에 다양한 농도의 IL-2를 처리한 후 MTS 분석법을 통해 두 세포주의 세포생장을 비교하였다. 도 2a와 같이 NK101은 약 8pM의 IL-2 농도에서 생장이 시작되어 500 pM에서 생장이 정체되었으며(EC50=23.3 pM), NK-92는 30 pM 농도의 IL-2 존재 시 세포 생장이 확인되며 2000 pM 농도에서 생장이 정체되어(EC50=128.3 pM) 세포생장에 있어 NK101이 NK-92 대비 낮은 농도의 IL-2를 필요로 함을 알 수 있었다. 도 2b에서 확인한 IL-2 수용체 소단위체 발현을 유세포 분석으로 확인한 결과, NK101이 고친화 IL-2 수용체인 CD25를 NK-92 대비 높게 발현함을 확인하였다. 또한 NK101 및 NK-92의 동결 후 세포 생장률 및 생존율을 동일 배양조건에서 분석한 결과 NK101은 해동 후 2일(1 계대) 이후 세포생장이 회복되나, NK-92는 해동 후 10일(5 계대) 이후 일정한 세포생장에 도달함을 확인할 수 있었다(도 2c). 두 세포의 세포생장이 안정화된 후, 두 세포의 세포증식을 비교하였을 때 16일 계대 후 수득되는 NK101 세포의 총 세포주가 NK-92 세포의 수득 예상 세포수의 약 100배임을 확인할 수 있었다(도 2d). 이는, 본 발명의 NK101 세포의 생산성이 종래의 NK-92 세포에 비해 월등하여, 경제성의 측면에서 본 발명의 NK101 세포가 매우 유리함을 시사하는 것이다.
본 발명의 NK101 세포의 종합적인 특성은 하기 [표 1]로 정리하였다.
본 발명의 NK101 세포의 주요 특징
항목 NK101 세포
임상 데이터
연령/성별 56세 남성
인종 아시안
진단 절외 NK/T 림프종(extranodal NK/T lymphoma)
세포배양
성장 양상 현탁상태에서 다중세포 응집체
배가시간 18-32시간
최대 세포농도 1.2x106 cells/㎖
최소 세포농도 0.5x105 cells/㎖
사이토카인 의존성 IL-2 의존성(500 IU/㎖)
최적 분열 매 2-3일
면역학적 특성
T/NK 마커 CD2+, CD3-, CD4-, CD7-, CD8-, CD16-, CD56+
B 세포 마커 CD10-, CD19-, CD20-
골수단핵구성 마커 CD13-, CD14-, CD33+
NK 세포 활성화 수용체 NKp46+, NKp30+, NKG2D+
NK 세포 저해성 수용체 KIR2DL1-, KIR2DL2-, ILT2-
자손/활성화 마커 CD34-, FAS+
부착 마커 CD11a+, CD18+, CD54+
기능적 특성
NK 활성 호-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 분비능(면역활성능) 및 증식능
사이토카인 생산 IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-2 등 호-염증성 사이토카인 분비 및 IL-1 수용체 길항제 및 IL-10 등 항-염증성 사이토카인 미분비
사이토카인 수용체 CD25+, CD122+, CD132+, CD127-
케모카인 수용체 CCR4+, CCR6+, CCR7+, CCR8+, CXCR3+, CXCR4+
실시예 3 : 표면 마커 분석 상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 NK101 세포주는 부유세포의 특성을 가지며, 해당 세포의 표면항원의 발현도를 유세포 분석으로 확인하였다. T/NK 세포 마커의 경우, 본 발명의 NK101 세포주는 NK 세포의 표면항원인 CD2, CD56을 발현하나 CD16은 발현하지 않으며, T 세포의 표면항원인 CD3, CD4, CD8, TCRαβ 및 TCRγδ과 B세포 표면항원인 CD20, 단핵구 표현항원 CD14를 발현하지 않는 NK 세포의 표현형을 가지고 있었다(도 3a). 또한, 본 발명의 NK101 세포주는 NK 세포의 활성화 수용체인 NKG2D, NKp30, NKp46, DNAM-1, 2B4를 발현하였고, 비활성화 수용체인 CD94, NKG2A는 발현하였으나, KIR2DL1/S1/S3/S5, KIR2DL2/DL3, 및 CD85j 등은 발현하지 않았다(도 3b). 또한 세포부착 분자인 CD2, CD11a, CD19, ICAM-1을 발현하며, CD7은 미발현하였다(도 3c). 추가적으로 본 발명의 NK101 세포주는 NK 세포의 세포독성 및 면역활성화에 관여하는 CD107a, 퍼포린, 그랜자임 B은 고발현되고, TRAIL 및 FASL은 낮은 수준이긴 하나 발현되며(도 3d), NK 세포의 사이토카인 수용체 중에서는 IL-2 고친화 수용체인 CD25, IL-2 수용체(CD122, CD132) 및 IL-15 수용체인 IL-15Ra를 발현함을 확인하였다(도 3e). NK 세포주의 이동성에 관련된 케모카인 수용체 중에서는 CCR4, CCR6, CCR7, CXCR3, 및 CXCR4를 발현하였으나, 그 외의 CCR 및 CXCR은 발현되지 않았다(도 3f). 결론적으로, 본 발명의 NK101 세포주는 활성화된 NK 세포의 표현형을 보이며, 특히 CD25가 고발현된다는 점에서 다른 NK 세포주와 구분되는데, CD25는 활성화된 NK 세포의 지표로 특히 분열능이 높은 NK 세포의 표지자로 알려 있어(Clausen, J. et al., Immunobiology, 207(2): 85-93, 2003), 본 발명의 NK101 세포주는 세포치료제의 대량생산에 매우 적합한 세포주임을 알 수 있다.
본 발명의 NK101 세포의 다양한 세포표지자의 발현여부는 하기 [표 2]로 정리하였다.
본 발명의 NK101 세포의 마커 특성
항원 발현여부 항원 발현여부
계통 마커 기능성 마커
CD1a - CD95 (FAS) +++
CD2 +++ CD178 (FAS-L) +
CD3 - CD107a +++
CD4 - TRAIL (CD253) +
CD5 - 퍼포린 +++
CD8 - 그랜자임 B +++
CD10 - IFNγ +++
CD11a +++ 케모카인 수용체
CD11c - CCR1 +
CD13 + CCR2 -
CD14 + CCR3 -
CD16 - CCR4 +++
CD18 +++ CCR5 +
CD19 - CCR6 +++
CD23 - CCR7 +++
CD33 +++ CCR8 ++
CD45 +++ CCR9 +
CD56 +++ CXCR1 -
CD57 - CXCR2 -
CD161 ++ CXCR3 +++
활성화 수용체 CXCR4 +++
2B4 +++ CXCR5 -
NKp30 ++ CXCR6 -
NKp46 +++ CXCR7 -
NKG2D ++ 사이토카인 수용체
저해 수용체 CD25(IL-2Ra) +++
CD85j(ILT2) - CD122(IL-2Rb) ++
CD94 +++ CD132(공통 γ 사슬) +++
CD158(KIR2DL1/S1/S3/S5) - CD127(IL-7Ra) -
CD158b(KIR2DL2/DL3) - 기타 마커
CD159a +++ TCRαβ -
부착분자 TCRγδ -
DNAM-1(CD226) +++
ICAM-1(CD54) +++
CD62L ++
-, 음성; +, < 10% 양성; ++, 10-69% 양성; +++, 70-100% 양성(%는 세포 집단 내 양성 세포의 비율을 나타냄)
실시예 4 : NK101의 CD56 및 D62L 발현양상 확인 NK101 세포의 특성을 분석하기 위하여 NK 세포의 표지마커인 CD56 및 CD62L의 발현양상을 NK-92와 초도배양 NK 세포와 비교하여 유세포 분석을 이용하여 확인하였다. 도 4a에서와 같이 NK101 세포는 NK-92 세포 대비 CD56 발현 정도가 낮은 CD56dim NK 세포로 확인되었다. 또한 도 4b의 등고선 그래프와 같이 NK101 세포는 CD62L 마커를 고발현하는데, 이는 NK-92 세포에서는 미발현되고, 일부 초도배양 NK 세포에서 한정적으로 발현되는 마커이다. 일반적인 초도배양 NK 세포에서는 CD56의 발현에 따라 CD56dim, CD56bright으로 구분할 수 있고 이는 각각 세포독성 또는 사이토카인 생산이 더 우세한 특성을 가진 2개의 군집으로 구성된다고 여겨진다. CD56bright NK 세포는 높은 세포 증식능, 사이토카인에 의한 활성화 시 IFN-γ를 분비, 낮은 암세포 사멸능을 보이며, CD56dim NK 세포는 CD56bright NK 세포와는 반대로 세포 증식능은 낮고, 표적세포의 인지에 의해서 IFN-γ를 분비하며, 높은 세포독성을 가지는 특성이 있다. 최근 검증된 CD56dimCD62L+ NK 세포는(Juelke, K et al,, Blood, 116(8): 1299-1307, 2010; Luetke-Eversolh, M et al., Front. Immunol., 4: 499, 2013) CD56bright, CD56dim NK 세포의 특성을 모두 가지고 있는 다기능성의 NK 세포로 보고된다. NK101은 사이토카인 자극에 의해 증식 및 IFN-γ를 분비할 수 있고(도 5a), 표적세포 인지 시에도 다양한 종류의 사이토카인을 분비함이 확인되었다(도 5b). 결론적으로 NK101은 CD56dimCD62L+ NK 세포의 표현형과 특성을 가지고 있으며, CD56dimCD62L+ 특성 마커를 발현하는 초도배양 NK 세포 혹은 체외 증식(ex vivo expanded) 초도배양 NK 세포가 보고된 바가 있다 하더라도 NK101은 불멸화된 NK 세포주로서 이들과는 차별되며, 이는 기존 알려진 NK 세포주 중에서도 찾아볼 수 없는 고유 특성이라고 할 수 있다.
실시예 5 : NK101의 시험관내 암세포 사멸능 및 세포독성 메커니즘 규명
상기 실시예 1에서 제조되어 표현형이 확인된 NK101 세포주의 암세포 사멸능을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, CFDA로 표지한 인간-유래 암세포주인 THP-1, KG-1, HL-60(급성골수성백혈병), HCT116(대장암), U373(뇌암), A2780(난소암), A549(폐 선암종), 및 SK-BR3(유방암) 세포를 각각 24-웰 플레이트에 3x105 cells/mL 농도로 1 mL 씩 파종하였다. 이후 NK101 세포 및 대조군을 다양한 효과기 세포 대 표적 세표 비율(E:T 비율=1:1, 2:1, 및 4:1)로 1 mL 배지에 부유한 후 상기 암세포와 24시간 동안 함께 배양하였다. 배양 이후 모든 세포를 수집한 뒤 각 웰로부터 세포를 회수하여 원심분리한 후, 세포 펠렛을 FACS 완충액으로 현탁시켰다. 다시 원심분리하여 형성된 세포 펠렛을 1 μL LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Stain Kit를 희석한 100 μL의 FACS 완충액에 현탁시켜, 4℃에서 20분간 반응하였다. FACS 완충액으로 2번 세척한 뒤, 1X Annexin V binding buffer 100 μL에 Annexin V APC 5 μL (Biolegend, USA)를 희석한 용액에 세포 펠렛을 현탁시켜, 실온에서 20분간 반응하였다. 세포의 사멸 여부는 유세포 분석법을 이용하여 생존 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-음성), 초기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-음성), 후기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-양성), 괴사(necrotic) 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-양성)으로 구분하였다. 도 6a에서 확인되는 바와 같이 NK101 세포 투여군의 경우 다양한 인간 암세포주에 대하여 세포 살상능을 보임을 확인할 수 있었다. NK101 세포의 세포 살상능의 주요 표지 인자를 확인하기 위하여 NK 세포에 고발현되는 CD25, CD62L, DNAM-1, CD54(ICAM-1)에 대한 중화항체를 처리한 후 THP-1(도 6b), K562(도 6c), Jurkat(도 6d)와 4:1의 효과기 세포 대 표적세포 비율로 공배양한 뒤 세포사멸을 분석하였다. 그 결과 THP-1에서는 DNAM-1 및 CD54, K562에서는 CD54, Jurkat에서는 CD25, CD62L, CD54 등의 중화항체 처리에 의해 NK101의 세포 사멸능이 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 도 6e에서 THP-1과 NK101의 공배양 시 DNAM-1 및 CD54의 중화항체를 동시 처리할 경우 상승성으로(synergestic) 세포사멸능이 감소함을 확인할 수 있었다. 해당 결과를 토대로 NK101에 의한 세포살상능에 DNAM-1, CD25, CD62L 및 CD54 등의 표지인자가 주로 관여함을 알 수 있다.
실시예 6: 기능강화 NK 세포주 제조
KHYG-1 및 NK-92는 기존에 구축된 NK세포주 들 중, 암세포 사멸능이 높다고 알려져있고 이들은 공통적으로 CD7, CD28을 발현하는 특징을 갖는 반면, NK101은 두 보조자극인자의 발현이 전혀 되지 않음에 착안하여, 본 발명자들은 상기 NK101에 CD7, 및 CD28를 암호화하는 유전자를 형질도입할 경우 암세포 사멸능이 증진되는지의 여부를 평가하고자 하였다.
6-1: NK 세포 활성화 인자 및 세포자살 유전자 도입 컨스트럭트의 제조
본 발명자들은 기능강화 NK 세포주를 제작하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조된 NK101 세포에 CD7(서열번호 15)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 16) 및 CD28 면역세포 보조자극인자(서열번호 17)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 18)가 2A 펩타이드(19)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 20)로 연결되고, 추가적으로 CD::UPRT(서열번호 21)을 암호화하는 핵산분자(서열번호 22)가 IRES(서열번호 23)로 연결된 유전자 컨스트럭트를 제조하여 렌티바이러스 제조용 트랜스퍼 벡터 pWPT에 클로닝하여 pWPT-CD7-CD28-CD::UPRT를 제조하였다(도 7b).
6-2: 렌티바이러스 제조
렌티바이러스 생산을 위하여 48시간 또는 72시간 배양한 Lenti-X 세포에 상기 실시예 6-1에서 제조된 트랜스퍼 플라스미드 12 μg와 패키징 플라스미드 psPAX2 12 μg 및 외피 플라스미드 pMD2.G 2.4 μg을 리포펙타민(Lipofectamine; Invitrogen, USA)과 혼합하여 Lenti-X 293T 세포(Clontech, USA)에 형질도입하였다. 37℃에서 6시간 배양 후, 배지를 제거하고 신선한 성장배지를 첨가하였다. 세포를 추가로 48시간 배양 후, 배지 내에 생선된 렌티바이러스를 수거하여 5분간 원심분리(4℃, 4000 rpm)하고 상층액을 취한 후 0.45 μm 필터(Millipore, USA)를 이용하여 세포 찌꺼기들을 제거하였다. 렌티바이러스를 농축하기 위하여 여과된 렌티바이러스 상층액에 Lenti-X concentrator (Clontech, USA) 시약을 넣은 후 4℃에서 밤새 보관하였다. 최종단계로, 렌티바이러스-concentrator 혼합액을 4000 rpm에서 60분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 펠렛 형태로 회수된 렌티바이러스를 1~2 mL의 배양액으로 희석하고 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
6-3: NK 세포 활성화 인자 및 세포자살 유전자 도입 세포주 제작
상기 실시예 6-2에서 제조된 CD7-CD28-CD::UPRT 렌티바이러스를 프로타민 설페이트(Sigma, USA)를 이용하여 NK101 세포에 형질감염한 후 37℃에서 4시간 배양한다. 총 2번의 감염과정을 수행한 후, 감염 72시간 후 면역세포 공동자극인자인 CD7과 CD28의 발현을 유세포 분석으로 확인하고, 1주일 뒤 형광활성 세포분리기(Fluorescence activated cell sorter, BD FACSMelody, BD, USA)를 이용하여 도입유전자를 발현하는 NK101 세포만을 선택적으로 분리하였다. 분리 증식한 NK101-CD7-CD28-CD::UPRT 세포주에서 막표면 단백질인 CD7과 CD28의 발현은 유세포 분석으로 확인하였다(도 7c). 본 발명자들은 CD7-CD28-CD::UPRT를 발현하는 유전자 변형 NK101 세포주를 'SL-K01'으로 명명하였다.
6-4: 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)
세포 내 발현 단백질인 CD::UPRT는 RNA를 분리하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 발현을 확인하였다(도 7d). 전체 RNA는 RNA 추출 키트(iNtRON, South Korea)을 이용하여 분리하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응은 QuantiTect Reverse Transcription Kit(QIAGEN, Germany)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 합성된 cDNA를 Taq 폴리머라제와 프라이머 등과 혼합한 후 중횹효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 CD::UPRT 유전자 존재여부를 확인하였다. 그 결과 도 7d에서 확인되는 바와 같이, 형질도입된 CD::UPRT 유전자는 정상적으로 발현이 됨을 확인할 수 있었다.
실시예 7: NK 세포 공동활성 인자 및 세포자살 유전자에 의한 NK 세포 활성화 증가 확인
7-1: CD7 및 CD28 도입에 의한 NK 세포 살상능 검증
상기 실시예 6에서 제조한 SL-K01 세포의 세포 살상능을 분석하기 위하여 HDLM-2(인간 호지킨 림프종, Hodgkin's lymphoma), IM9(인간 림프아세포종), Jeko-1(인간 외투세포 림프종) 및 K562(만성골수성백혈병)와 공배양을 수행하였다. Celltracker violet dye(CTV; Invitrogen, USA)로 표지한 타깃 종양 세포주를 3x105/mL의 농도로 준비한 후, 24-웰 플레이트에 1 mL씩 분주하였다. 타깃 종양 세포주에 대비하여 NK101 및 SL-K01 세포를 원하는 비율로 배양액에 현탁한 후 상기 타깃 종양 세포주가 들어있는 24-웰 플레이트에 1 mL씩 분주하여 37℃에서 24시간동안 공배양하였다. 이 결과, 모든 타깃 세포주에서 세포 살상능이 증가함을 확인할 수 있었다(도 8a).
7-2: 세포자살 유전자 전구물질 투여에 따른 NK 세포 사멸 확인
상기 실시예 6에서 제조한 SL-K01 세포에 도입된 세포자살 유전자인 CD::UPRT의 효과를 분석하기 위하여, 20% FBS 조성의 SCGM 배지에 세포수가 2x104 cells/90 μL/well이 되도록 준비하여 96-웰 플레이트(Corning, USA)에 각각 분주하고, 농도별(각각 0, 0.1, 1, 10, 100, 1000 μg/mL)로 희석한 전구물질 5-Fluorocytosine(5-FC; Sigma, USA) 또는 양성대조군(1% Triton-X)을 웰에 10 μL씩 접종하여, 5% CO2, 37℃ 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 이어서 MTS 용액(Promega, USA)을 96-웰 플레이트에 웰당 20 μL씩 넣어주고 5% CO2, 37℃ 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 다음, SpectraMax 190 Microplate Reader(Molecular Device, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 CD::UPRT를 발현하는 세포에서 5-FC 농도 의존적 세포 사멸을 확인할 수 있었다(도 8b). CTV로 표지한 IM9 세포에 SL-K01 세포와 100 μg/mL 5-FC를 함께 처리하여 48시간 배양 후 유세포 분석법으로 세포 사멸 효과를 확인하였다. 도 8c에 나타난 결과에서 확인된 바와 같이, 5-FC를 처리한 실험군에서 세포사멸이 더욱 증가하였다. 결론적으로, 전구물질을 투여하였을 때, 세포자살 유전자가 도입된 NK 세포뿐 아니라, 표적 암세포까지 사멸하는 방관자 효과(bystander effect)에 의해 치료 효과를 극대화시킬 수 있다.
실시예 8: mbIL-15과 TGFβRIIΔcyto 도입
본 발명자들은 상기 실시예 6에서 제조된 SL-K01 세포의 세포 살상능을 더욱 증진시키기 위하여 막 결합 IL-15(mbIL-15, 서열번호 24)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 25)와 TGFβRII의 세포질 도메인을 제거한 TGFβRIIΔcyto(서열번호 26)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 27)가 2A 펩타이드(서열번호 19)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 20)로 연결된 유전자 컨스트럭트를 제조하여 렌티바이러스 제조용 트랜스퍼 벡터 pWPT에 클로닝하여 pWPT-mbIL-15-TGFβRIIΔcyto를 제조하였다(도 9a). 실시예 6에서 명시한 것과 동일한 방법으로 mbIL-15-TGFβRII 렌티바이러스를 제조한 후 SL-K01 세포에 감염하였으며, 형광활성 세포분리기를 이용하여 도입유전자를 발현하는 SL-K01 세포만을 선택적으로 분리하였다. 분리증식한 SL-K01-mbIL-15-TGFβRII 세포주에서 막표면 단백질인 IL-15과 TGFβRII의 발현은 유세포 분석법으로 확인하였다(도 9b). mbIL-15-TGFβRII를 발현하는 SL-K01 세포주를 'NK111'으로 명명하였다.
실시예 9: mbIL-15 도입에 의한 세포 분열능 확인 및 TGFβRIIΔcyto 도입에 따른 내인성 TGFβ에 의한 면역저항성 억제 확인
9-1: IL-2 의존성 증식 분석
상기 실시예 8에서 제조된 NK111 세포의 IL-2 비의존적 NK 세포 분열능을 확인하기 위하여, SL-K01 세포 및 NK111 세포를 2x105 cells/mL 농도로 250 U/mL IL-2 유무 조건에서 48시간 주기로 배양한 후 세포를 회수하여 트립판 블루 염색법(Trypan Blue)으로 생존 세포 수를 측정하였다. 도 10a에서 확인할 수 있듯이, SL-K01 세포는 IL-2 결핍조건에서는 세포증식이 이루어지지 않으나, IL-2 처리 조건에서는 세포 성장을 확인할 수 있었다. mbIL-15을 도입한 NK111 세포는 IL-2 처리 조건에서 SL-K01과 유사하게 증식함을 관찰하였다. IL-2 결핍조건에서도 일정한 PDL을 유지하며 증식하는 것을 관찰하였다(도 10a). 해당 결과는 NK111 기반 세포주 치료제의 경우 배양보조제인 IL-2의 결핍 조건만으로도 높은 생산성을 가질 수 있음을 시사한다. 아울러, NK101, SL-K01, NK111 세포주에서 자연 살상 세포 활성화 수용체 중 하나인 CD314(NKG2D)의 발현이 유세포 분석에 의해 확인되었다(도 10b).
9-2: 암세포 사멸능 분석
mbIL-15 도입에 따른 NK111 세포의 세포 사멸능 확인을 위하여 IM9(인간 림프아세포)와 공배양을 수행하였다. CTV로 표지한 IM9 세포에 SL-K01 세포 및 NK111 세포와 함께 5-FC를 처리하여 48시간 배양 후 유세포 분석법으로 세포 사멸 효과를 확인하였다. mbIL-15이 도입된 NK111 세포는 표적세포에 대한 암세포 사멸능이 증가하였으며, 5-FC를 처리한 실험군에서는 세포사멸이 현저히 증가하였다(도 10c).
9-3: TGFβ1에 의한 세포사멸 저해 영향 분석
아울러, 본 발명자들은 환자의 체내에 다량 존재하는 면역억제 인자로 잘 알려진 TGFβ1 면역억제 효과가 NK111 세포에 도입된 TGFβRIIΔcyto에 의하여 저해되는지의 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. CTV로 표지한 OVCAR-3(인간 난소암), THP-1(급성골수성백혈병) 세포와 효과기 세포인 SL-K01 및 NK111 세포를 3x105 cells/mL의 농도로 준비하여 24-웰 플레이트에 1 mL씩 분주한 뒤(E:T=1:1), 각각 0, 0.3, 1, 3, 및 10 μg/mL의 TGFβ1를 처리하여, 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 결과, 도 10d에서 확인할 수 있듯이, SL-K01 세포는 TGFβ1의 농도가 높아짐에 따라 암세포 사멸능이 감소하였으나, NK111 세포의 경우 TGFβ1에 의한 활성 억제 효과가 없거나 미미한 수준으로 분석되었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 SL-K01 세포는 모세포주인 NK101의 주된 특징은 그대로 유지하면서도 모세포주인 NK101과 비교하여 암세포사멸능이 현저히 증가하였고, 상기 SL-K01의 성능을 더 강화시킨 NK111 세포는 암세포 살상능이 SL-K01 세포에 비해 현저하게 증가하였을 뿐만 아니라, TGFβ로 인한 세포살상능의 저해를 회피할 수 있어서 체내 투여시 매우 효율적인 암 치료제로 사용이 가능할 것으로 기대가 된다.
실시예 10: EpCAM 표적 키메라 항원 수용체 도입 NK 세포주 제조
본 발명자들은 상기 실시예 8에서 제조된 NK111에 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 형질도입할 경우 항원 특이적인 암세포 사멸능이 증진되는지를 조사하였다. 이를 위해 구체적으로 본 발명자들은 EpCAM 표적화 키메라항원 수용체 유전자 컨스트럭트를 제조한 후 이를 NK111에 형질도입하여 NK111-EpCAM-CAR 세포를 제조하고 그 기능을 평가하였다.
10-1: anti-EpCAM scFv-CAR 유전자 컨스트럭트의 제조
본 발명자들은 종양표적 NK 세포주를 제작하기 위하여 상기 실시예 8에서 제조된 NK111 세포에 EpCAM을 표적화하는 scFv와 변형 인간 면역글로불린(modified human IgG) Fc 도메인, CD28 막통과 도메인, DAP10 세포내 활성화 도메인, DAP12 세포내 활성화 도메인, 및 CD3z로 구성된 anti-EpCAM scFv-CAR 단백질(서열번호 14)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 15)를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제조하여 렌티바이러스 제조용 트랜스퍼 벡터 pWPT에 클로닝함으로써 pWPT-EpCAM scFv-CAR를 제조하였다(도 11a).
10-2: 렌티바이러스 제조
이어, 본 발명자들은 렌티바이러스 생산을 위하여 48시간 또는 72시간 배양한 Lenti-X 세포에 상기 실시예 10-1에서 제조된 트랜스퍼 벡터 pWPT-EpCAM scFv-CAR 12 μg와 패키징 플라스미드 psPAX2 12 μg 및 외피 플라스미드 pMD2.G 2.4 μg을 리포펙타민(Lipofectamine Invitrogen, USA)과 혼합하여 Lenti-X 293T 세포(Clontech, USA)에 형질도입하였다. 37℃에서 6시간 배양 후, 배지를 제거하고 신선한 성장배지를 첨가하였다. 세포를 추가로 48시간 배양 후, 배지 내에 생성된 렌티바이러스를 수거하여 5분간 원심분리(4℃, 4000 rpm)하고 상층액을 취한 후 0.45 μm 필터(Millipore, USA)를 이용하여 세포 찌꺼기들을 제거하였다. 렌티바이러스를 농축하기 위하여 여과된 렌티바이러스 상층액에 Lenti-X concentrator (Clontech, USA) 시약을 넣은 후 4℃에서 밤새 보관하였다. 최종단계로, 렌티바이러스-concentrator 혼합액을 4000 rpm에서 60분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 펠렛 형태로 회수된 렌티바이러스를 1~2 mL의 배양액으로 희석하고 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
10-3: NK111-EpCAM-CAR 세포주 제작
본 발명자들은 상기 실시예 10-2에서 제조된 anti-EpCAM scFv-CAR 렌티바이러스를 프로타민 설페이트(Sigma, USA)를 이용하여 NK111 세포에 감염시킨 후 37℃에서 4시간 배양하였다. 총 2번의 감염과정을 수행한 후, 감염 72시간 후 키메라 항원 수용체 발현을 유세포 분석으로 확인하고, 1주일 뒤 형광활성 세포분리기(Fluorescence activated cell sorter, BD FACSMelody, BD, USA)를 이용하여 도입유전자를 발현하는 NK111 세포만을 선택적으로 분리하였다. 분리 증식한 NK111-EpCAM-CAR세포주에서 EpCAM-CAR의 발현도를 유세포 분석으로 확인하였다(도 11b).
10-4 : 암세포주 공배양 및 암세포 사멸 활성 물질 분석
본 발명자들은 상기 실시예 10-3에서 제조된 NK111-EpCAM-CAR 세포주의 표적 특이적 암세포 사멸능을 검증하기 위하여, NK111 및 NK111-EpCAM-CAR 세포주를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, CTV(celltracker violet dye)로 표지한 인간 유래 난소암 세포주 중 EpCAM 양성 RMG-1 세포 및 EpCAM 음성인 KOC-2S를 24-웰 배양접시에 3x105 cells/ml 농도로 1 ml씩 파종하였다. 이후 NK111 및 NK111-EpCAM-CAR 세포주를 다양한 효과기 세포 대 표적 세표 비율(E:T 비율=1:1, 2:1, 4:1)로 1 ml 배지에 부유한 후 상기 암세포와 24시간 동안 함께 배양하였다. 배양 이후 모든 세포를 모은 뒤 각 웰로부터 세포를 회수하여 원심분리한 후, 세포 펠렛를 FACS 완충액으로 현탁시켰다. 다시 원심분리하여 형성된 세포 펠렛을 1 ㎕ LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Stain Kit(Life Technologies)를 희석한 100 ㎕의 FACS 완충액에 현탁시켜, 4℃에서 20분간 반응하였다. FACS 완충액으로 2번 세척한 뒤, 1X Annexin V binding buffer 100 ㎕에 Annexin V APC 5㎕(Biolegend, USA)를 희석한 용액에 세포 펠렛을 현탁시켜, 실온에서 20분간 반응하였다. 세포의 사멸 여부는 유세포 분석법을 이용하여 생존 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-음성), 초기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-음성), 후기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-양성), 괴사(necrotic) 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-양성)으로 구분하였다. 이 결과, 도 11c에서 확인되듯이, NK111-EpCAM-CAR 세포는 EpCAM 발현 세포인 RMG-1에서 대조군인 NK111에 비해 현저히 높은 세포살상능을 보이는 반면, EpCAM 음성 세포주에 대해서는 동등한 세포 살상능을 보임을 확인하였다. 또한 상기 실험에서 수득한 공배양 상층액을 이용하여 ELISA 실험을 수행한 결과, EpCAM 고발현 RMG-1 세포와 공배양시 EpCAM-CAR를 발현하는 NK111에서 인터페론 감마 및 그랜자임 B 등 암세포 살상과 관여된 활성물질의 분비가 높음을 확인하였다. 상술한 실험을 통하여 본 발명의 일 실시예에 따른 NK111이 키메라항원 수용체를 통한 항원 특이적 암세포 살상능 증진에 적합한 세포 플랫폼임을 확인할 수 있다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1: 주사제의 제조
유전자 재조합 NK111 세포 1x108 내지 5x1012 cells
pH 조절제 적량
안정화제 적량
주사용 멸균 증류수 100% 까지
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> SLBIGEN Inc. <120> A novel genetically modified natural killer cell line and use thereof <130> PD19-5784 <150> KR 10-2018-0034079 <151> 2019-03-23 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD7 <400> 1 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Ala Gly Pro Pro Arg Leu Leu 20 25 30 Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Arg Gly Leu Pro Gly Ala Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Glu Val Gln Gln Ser Pro His Cys Thr Thr Val Pro Val 50 55 60 Gly Ala Ser Val Asn Ile Thr Cys Ser Thr Ser Gly Gly Leu Arg Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Leu Arg Gln Leu Gly Pro Gln Pro Gln Asp Ile Ile Tyr Tyr 85 90 95 Glu Asp Gly Val Val Pro Thr Thr Asp Arg Arg Phe Arg Gly Arg Ile 100 105 110 Asp Phe Ser Gly Ser Gln Asp Asn Leu Thr Ile Thr Met His Arg Leu 115 120 125 Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Gln Ala Ile Thr Glu Val 130 135 140 Asn Val Tyr Gly Ser Gly Thr Leu Val Leu Val Thr Glu Glu Gln Ser 145 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Lys Arg 195 200 205 Phe Ser Gly Arg Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser 210 215 220 Leu Glu Ser Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Ser 225 230 235 240 Tyr Pro Trp Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro 245 250 255 Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ser His Thr 260 265 270 Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu 275 280 285 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 290 295 300 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 305 310 315 320 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 325 330 335 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 340 345 350 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 355 360 365 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 370 375 380 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 385 390 395 400 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 405 410 415 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 420 425 430 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 435 440 445 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 450 455 460 Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 465 470 475 480 Ser Leu Gly Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala 485 490 495 Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Ala 500 505 510 Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn 515 520 525 Met Pro Gly Arg Gly Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala 530 535 540 Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr 545 550 555 560 Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr 565 570 575 Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 580 585 590 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 595 600 605 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 610 615 620 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 625 630 635 640 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 645 650 655 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 660 665 670 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 675 680 685 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 690 695 <210> 15 <211> 2085 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding anti-EpCAM scFv-CAR protein <400> 15 atgggctgga gctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcgt gcactcccag 60 atccagctgg tgcagtccgg acccgagctg aagaagcctg gagagaccgt gaagatctcc 120 tgcaagacct ccggctacac cttcaccgac tactccatgc actgggtgaa ccaggctcct 180 ggcaagggcc tgaagtggat gggctggatc aacaccgaga caggcgagcc cacctacacc 240 gacgacttca agggaaggtt cgccttctcc ctggagacct ccgcctccac agcctacctc 300 cagatcaaca acctgaagaa cgaggacaca gccacctact tctgcgctag gacagccgtg 360 tactggggac agggcacaac cctgaccgtg tcctccggct ccacctccgg ctccggcaag 420 cctggctccg gcgagggctc cgacatccag atgacccagt cccccagcag cctgtccgcc 480 tccctgggcg agagggtgtc cctgacctgt agggcctccc aggagatctc cggctccctg 540 tcctggctgc aacagaagcc cgacggcacc atcaagaggc tgatctacgc tgcctccacc 600 ctgaactccg gcgtgcccaa gaggttctcc ggcaggaggt ccggctccga ctactccctg 660 accatctcca gcctggagag cgaggacttc gtggactact actgcctcca gtacagcagc 720 tacccctgga gcttcggagg aggcaccaag ctggagatca aggagcccaa atctcctgac 780 aaaactcaca catgcccacc gtgcccatcc catacacagc ctctgggagt ttttcttttt 840 ccaccaaaac caaaggatca gctgatgatt tcccgcacac ctgaagtgac atgcgttgtg 900 gttgatgttt cccaagaaga tcctgaggtt cagtttaact ggtacgtgga tggcgtggag 960 gttcacaatg ccaagaccaa gcctcgcgaa gagcagttta atagcaccta ccgcgttgtg 1020 tccgttctta ccgtgctgca ccaggattgg cttaatggca aggagtacaa gtgcaaggtg 1080 tcaaacaagg gcctgccttc atccattgag aagaccatca gcaaggccaa gggacagcca 1140 agagaaccac aggtttatac cctgccacca tcccaagaag agatgacaaa gaatcaagtt 1200 agccttacct gccttgtgaa gggcttttac cctagcgata ttgccgttga gtgggaatcc 1260 aatggccagc cagaaaataa ctacaagacc acacctcctg ttctggatag cgatggctcc 1320 ttctttctgt attcccgcct taccgtggat aagagccgct ggcaggaagg aaatgttttc 1380 agctgctccg ttctgcatga ggctcttcat aaccactaca cccagaagag cctgtccctc 1440 agtcttggca agttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg 1500 ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtggcacgcc cacgccgcag ccccgcccaa 1560 gaagatggca aagtctacat caacatgcca ggcaggggcg gccggctggt ccctcggggg 1620 cgaggggctg cggaggcagc gacccggaaa cagcgtatca ctgagaccga gtcgccttat 1680 caggagctcc agggtcagag gtcggatgtc tacagcgacc tcaacacaca gaggccgtat 1740 tacaaaagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1800 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1860 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1920 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1980 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggcctcag tacagccacc 2040 aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 2085

Claims (40)

  1. 하기 특성을 갖는 분리된 NK 세포주에 NK 세포 보조활성화 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 하나 이상의 NK 세포 증식 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질도입되어 상기 NK 세포 보조활성화 인자 및 NK 세포 증식인자가 발현되는, 유전자 변형 NK 세포주:
    CD2, CD11a, CD25, CD45, CD54, DNAM-1, CD62L, 및 CD56은 양성; 및
    CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD20, CD23, CD34, TCRαβ및 TCRγδ는 음성이고,
    상기 CD56의 표현형은 CD56dim이며, 배가시간은 18 내지 32시간이고, 배양시 군집(spheroid)를 형성함.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 NK 세포 보조활성화 인자는 Ly49, NCR(natural cytotoxicity receptor), CD7, CD16 및 CD28로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 유전자 변형 NK 세포주.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 NK 세포 보조활성화 인자는 CD7 및/또는 CD28인, 유전자 변형 NK 세포주.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 NK 세포 증식 인자는 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 사이토카인 또는 상기 사이토카인의 변이체인, 유전자 변형 NK 세포주.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 IL-15는 막결합 IL-15인, 유전자 변형 NK 세포주.
  7. 제1항에 있어서,
    세포자살 유전자가 추가로 형질도입된, 유전자 변형 NK 세포주.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 세포자살 유전자는 우라실 포스포리보실전이효소(UPRT) 유전자, 헤르페스 단순포진 바이러스 티미딘 인산화 유전자(HSV TK), 바리셀라 조스터 바이러스 티미딘 인산화효소(VZV TK) 유전자, 시토신 디아미네이즈 유전자, 카르복실 에스터레이즈 유전자, 니트로리덕테이즈 유전자, 카르복시펩티데이즈 G2 유전자, 또는 유도성 카스페이즈 9(iCas9)유전자인, 유전자 변형 NK 세포주.
  9. 제1항에 있어서,
    세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 형질도입되어 상기 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체가 발현되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체는 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체II인, 유전자 변형 NK 세포주.
  11. 제1항에 있어서,
    암항원을 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 형질도입되어 상기 키메라 항원 수용체가 발현되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 암항원은 CD19, CD22, PSA(prostate specific antigen), CEA(carcinoembryonic antigen), CA-125, mucin 1, AFP(alphafetoprotein), ETA(epithelial tumor antigen), 티로시네이즈, CD52, PD-L1(programmed death-ligand 1), CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), CD20, MAGE(melanoma-associated antigen), FAP(fibroblast activation protein), FLT3 (fms like tyrosine kinase 3), IL13Rα2 또는 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)인, 유전자 변형 NK 세포주.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는 암항원에 특이적으로 결합하는 리간드 또는 항체유사체-막통과 도메인-보조자극인자-세포내 신호전달 도메인을 포함하는 융합단백질인, 유전자 변형 NK 세포주.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 항체유사체는 scFv, sdAb, 나노바디, VHH, VNAR, VLR, 또는 모노바디인, 유전자 변형 NK 세포주.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 보조자극인자는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD7, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, NKG2D(natural-killer group 2, member D), DAP12(DNAX-activating protein 12), DAP10, DNAM-1, NTB-A, TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체인, 유전자 변형 NK 세포주.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 CD3ξ 도메인, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, DAP10, 또는 DAP12인, 유전자 변형 NK 세포주.
  17. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항의 유전자 변형 NK 세포주를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 및 암 예방용 약학적 조성물.
  18. 제7항 또는 제8항의 유전자 변형 NK 세포주 및 자살유도제를 포함하는 암 치료용 키트.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 자살유도제는 상기 세포자살 유전자가 HSV TK 또는 VZV TK인 경우에는 각각 간시클로비르(gancyclovir) 또는 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오사이드(6-methoxypurine arabinonucleoside), 상기 세포자살 유전자가 우라실 포스포리보실 전이효소(UPRT) 또는 시토신 디아미네이즈인 경우 5-플루오로시토신(5-FC), 상기 세포자살 유전자가 카르복실 에스터라제인 경우 이리노테칸(CPT-11), 상기 세포자살 유전자가 니트로리덕테이즈인 경우에는 5(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤자마이드(CB1954), 상기 세포자살 유전자가 카르복시펩티데이즈 G2인 경우에는 4-[(2-클로로에틸)(2-메실록시에틸)아미노]벤조일-엘-글루탐산(CMDA), 상기 세포자살 유전자가 iCas9일 경우 iCas9 이량화제(dimerizer)인, 암 치료용 키트.
  20. 치료적으로 유효한 양의 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항의 유전자 변형 NK 세포주 및 선택적으로 자살유도제를 추가로 암에 걸린 인간을 제외한 포유동물 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법.
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