KR102226918B1

KR102226918B1 - 신규 키메라 항원 수용체 암호화 유전자가 형질도입된 유전자 변형 nk 세포주 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102226918B1
Application number: KR1020190033489A
Authority: KR
Inventors: 성영철; 김세원; 강문철; 황인정
Original assignee: 주식회사 에스엘바이젠
Priority date: 2018-03-23
Filing date: 2019-03-25
Publication date: 2021-03-11
Also published as: WO2019182425A1; KR20190111844A; KR20190111843A; WO2019182422A1; KR102226917B1

Abstract

본 발명은 보다 효율적인 고형암의 면역치료를 위해, 암항원 특이적 단일클론 항체 또는 그의 기능적 단편, 세포막 통과 도메인, 및 T 세포 수용체의 CD3ζ 도메인을 포함하는 암항원 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 단백질을 발현하도록 숙주 면역세포를 형질전환시킨, 유전자 변형 면역세포 및 그의 용도를 제공한다.

Description

신규 키메라 항원 수용체 암호화 유전자가 형질도입된 유전자 변형 NK 세포주 및 그의 용도{Genetically engineered NK cell lines transduced with a polynucleotide encoding novel chimeric antigen receptor and use thereof}

본 출원은 2018년 3월 23일자로 출원된 대한민국 특허출원 제2018-0034079 호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 특허출원서에 기재된 사항은 본 문서에 참조로 삽입된다.

본 발명은 키메라 항원 수용체 암호화 유전자로 형질전환된 유전자 변형 면역세포주 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항암활성이 향상된 신규 키메라 항원 수용체 암호화 유전자가 형질도입된 유전자 변형 NK 세포주 및 그의 용도에 관한 것이다.

암 면역세포치료는 암환자 자신의 면역세포를 추출하여 증식시킨 뒤, 환자에게 다시 투여하여 암세포의 증식을 억제·제거하는 치료기술이다. 암 면역세포치료에는 다양한 종류의 면역세포 중 수지상세포(dendritic cells, 이하 DCs), 자연살해세포(natural killer cells, 이하 NKs) 및 세포 독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, 이하 CTLs)가 주로 사용되고 있다. 특히, CTLs의 경우, 면역기억(immunological memory) 기능, 항원 특이성 및 뛰어난 생체 내 증식 능을 가지고 있다는 장점이 있어, 수지상 세포와 자연살해 세포에 비하여 상대적으로 많은 연구가 이루어지고 있는 실정이다.

T 세포치료제는 현재까지 3세대까지 개발되고 있는데 제1세대 T 세포치료제는 혈액 또는 암 조직 내 존재하는 모든 T 세포(bulk T cells)를 증식시켜 환자에게 투여하였기 때문에 암세포에 대한 특이성이 낮아 효력을 기대할 수 없었고, 제2세대 T 세포치료제는 종양 항원 특이적 T 세포만(Ag-specific T cells)을 분리/대량 배양하여 암 환자에게 투여하는 방법으로 증진된 치료 효과를 보였으나, 배양기간이 길고 공정이 복잡하다는 문제가 대두되었으며, 제3세대 T 세포치료제는 1) 특정 암항원을 인식하는 TCR 유전자를 T 세포에 직접 도입하거나, 2) 특정 항원을 인식하는 단클론항체의 항원인식부위(scFv)에 T세포 활성화 도메인(T cell activation domain)을 결합시켜 T 세포에 도입함으로써, 항원 특이성을 높이고 제조기간을 단축하였을 뿐 아니라, 그 치료 효능 또한 매우 뛰어나 일부 백혈병 및 림프종에서 100%에 가까운 치료 효과를 유도하였다.

상기와 같은 제3세대 T 세포치료제는 이른바 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, 이하, 'CAR'라고 약칭함)를 발현하도록 유전자조작된 것을 특징으로 하고 있는데, 아직까지 임상시험을 통해 승인을 받은 치료제는 존재하지 않는다.

상기 CAR 도입 T 세포 기술을 기반으로 가장 앞서가고 있는 기업은 미국의 Novartis, Juno Therapeutics사 그리고 Kite Pharma사로 모두 B 세포 특이 항원인 CD19를 표적화하는 CAR 도입 T 세포를 개발하였으며, 저항성/재발성 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 비호지킨 림프종(NHL)에서 80 내지 90%에 육박하는 높은 치료율을 보여 표적지향성 면역세포치료제 분야의 선두주자로 자리매김하고 있다(Hartmann et al., EMBO Mol. Med. 9(9): 1183Δ1197, 2017).

그러나 상기 CD19 표적 CAR 도입 T 세포의 경우 혈액암의 일종인 ALL 및 NHL만을 적응증으로 하고 있어, 범용성이 떨어지고 B 세포 특이 항원을 표적으로 하고 있다는 점에서 고형암에는 적용될 수 없다는 단점을 가지고 있다.

본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 고형암의 치료에 효과적인 신규 키메라 항원 수용체 및 세포자살 유전자를 동시에 발현하도록 형질전환된 유전자 변형 NK 세포주, 상기 유전자 변형 NK 세포주를 이용한 암 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 하기의 특성을 갖는 분리된 NK 세포주에 EpCAM 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질도입되어 상기 EpCAM 특이적 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전자 변형 NK 세포주가 제공된다:

CD2, CD11a, CD25, CD45, CD54, DNAM-1, CD62L 및 CD56은 양성; 및

CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CD23, CD34, TCRαβ 및 TCRγδ는 음성.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 유전자 변형 NK 세포주를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 세포치료제가 제공된다.

아울러 본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 유전자 변형 NK 세포주 및 자살유도제를 포함하는 암 치료용 키트가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 유전자 변형 NK 세포주 및 선택적으로 자살유도제를 암의 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 암항원 특이적인 키메라 항원 수용체 단백질 및 세포자살 유전자를 동시에 발현하는 유전자 변형 면역세포 및 상기 유전자 변형 면역세포 및 자살유도제를 포함하는 암치료용 키트는 암 세포의 사멸에 매우 효율적이기 때문에, 새로운 면역세포치료제로 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 본 발명의 NK101 세포주의 계대에 따른 세포증식 정도를 나타내는 그래프이고, 도 1b는 NK101 세포가 CD3, CD20, 및 CD16 음성이며 CD56 양성인 NK세포임을 확인한 도트 그래프이다. 도 1c는 상기 NK101 세포의 배양시 확인되는 세포형태를 현미경을 이용하여 촬영한 사진이며, 도 1d는 Wright-Giemsa 염색법을 이용하여 NK101 세포의 형태를 촬영한 사진이고, 도 1e는 상기 NK101 세포가 NK세포의 주요 세포 사멸인자인 Perforin(녹색) 및 Granzyme(적색)을 발현함을 형광염색 기법을 통해 확인한 사진이며, 도 1f는 NK101와 MHC class I 음성 세포인 K562의 공배양을 통해 NK101의 암세포 사멸능을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a NK101와 NK-92의 IL-2 농도 의존적 세포 성장률 및 민감도를 MTS 분석을 이용하여 비교 분석한 그래프이고, 도 2b는 NK101 및 NK-92의 IL-2 수용체 소단위의 발현도의 차이를 유세포 분석을 이용해 확인한 히스토그램이며, 도 2c는 NK101 및 NK-92의 해동 시점부터 세포증식 및 생존율을 동일 배양조건에서 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 2d는 배양적응 후 증식정도 및 배가시간을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3a는 NK101 세포에서의 주요 계통 (lineage) 또는 조상 표지자 (progenitor marker) 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 3b는 NK101 세포에서의 활성화 수용체 및 비활성화 수용체 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 3c는 NK101 세포에서의 세포부착 인자 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 3d는 NK101 세포에서의 NK 세포 의존적 세포독성에 관여하는 CD107a, 퍼포린, 그랜자임, FasL 및 TRAIL 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 3e는 NK101 세포에서의 사이토카인 수용체 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 3f는 NK101 세포에서의 다양한 C-C 케모카인 수용체 및 C-X-C 케모카인 수용체 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 4a는 NK101, NK-92 및 초도배양 CD56⁺ 말초혈액 NK 세포의 CD56 발현을 확인한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 4b는 상기 세포들의 CD56 및 CD62L 발현을 확인한 유세포 분석 결과를 나타내는 2차원 등고선 그래프이다.
도 5a는 각각 표기된 사이토카인을 3일간 배양액에 처리한 후 NK101 세포의 증식률을 MTS 분석법으로 확인한 그래프(좌측) 및 NK 활성화 사이토카인인 IFN-γ의 생성을 ELISA로 확인한 그래프(우측)이고, 도 5b는 NK101 세포를 K562 또는 THP-1 암세포주와 24시간 공배양한 후 분비되는 사이토카인을 Multiplex 분석법으로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 다양한 암세포주와 NK101 세포를 다양한 세포비율로 24시간 공배양하여 암세포의 사멸도를 확인한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6b는 NK101 세포에 각각 표기된 표면항체에 대한 중화항체를 처리하고 급성골수성백혈병 세포주 THP-1과 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 세포사멸도를 측정한 그래프이며, 도 6c는 NK101 세포에 각각 표기된 표면항체에 대한 중화항체를 처리하고 만성골수성백혈병 세포주 K562와 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 세포사멸도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6d는 NK101 세포에 각각 표기된 표면항체에 대한 중화항체를 처리하고 급성림프구성백혈병 세포주 Jurkat과 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 세포사멸도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 6e는 NK101에 각각 DNAM-1, CD54 혹은 DNAM-1 및 CD54 중화항체를 처리한 후, 각 표지자의 동시 중화에 의한 상승적 저해작용(synergistic inhibition)을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 NK101 및 기존에 구축된 세포주 KHYG-1, 및 NK-92에서의 CD7, CD28 보조자극인자의 발현 양상을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 7b는 NK101 세포의 암세포 사멸 효과 증진을 위해 도입된 유전자 컨스트럭트의 개요도이며, 도 7c는 상기 도 7b에 도시된 유전자 컨스트럭트가 도입된 NK101 세포(SL-K01로 명명)에서의 CD7, CD28 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 7d는 SL-K01 세포에서의 CD::UPRT 발현을 역전사 PCR을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8a는 HDLM-2, IM-9, JEKO-1 및 K562 암세포를 NK101 또는 SL-K01 세포와 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 암세포 사멸빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 8b는 다양한 농도의 5-FC를 NK101 또는 SL-K01 세포에 48시간 처리한 뒤, 세포 성장률을 MTS 분석을 통하여 확인한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 8c는 IM-9 세포주와 NK101 또는 SL-K01 세포를 2:1, 1:1 또는 0.5:1 비율로 공배양 시, 5-FC 유무에 따른 IM-9 암세포 사멸 빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 SL-K01 세포의 추가적 암세포 사멸 효과 증진 및 면역억제인자 TGF-β에 대한 저항성 유도를 위해 도입된 유전자 컨스트럭트의 개요도이고, 도 9b는 SL-K01 및 상기 도 9a에 도시된 유전자 컨스트럭트가 도입된 SL-K01 세포(NK111로 명명) 표면에서의 IL-15 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 9c는 SL-K01 및 NK111 세포에서의 TGFβRIIΔcyto 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 10a는 SL-K01 및 NK111 세포의 배양 시, IL-2 유무에 따른 세포수 증식수준(population doubling level)을 나타낸 그래프이고, 도 10b는 NK101, SL-K01 및 NK111 세포에서의 NKG2D 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 10c는 IM-9 세포주와 SL-K01 또는 NK111 세포를 2:1, 1:1, 또는 0.5:1 비율로 공배양 시, 5-FC 유무에 따른 IM-9 암세포의 사멸빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 10d는 OVCAR-3 또는 THP-1 세포주를 SL-K01 및 NK111 세포와 공배양시, 다양한 농도의 TGFβ1을 처리한 후, 암세포 사멸능에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 항-EpCAM CAR 컨스트럭트인 anti-EpCAM scFv-CAR-NK 컨스트럭트의 구조를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 12a는 모세포주인 NK111(좌측) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 anti-EpCAM CAR 컨스트럭트가 형질도입된 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10, 우측)에서의 anti-EpCAM CAR 컨스트럭트의 발현 양상을 유세포 분석으로 측정한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 12b는 NK111 및 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10)에서 anti-EpCAM CAR 컨스트럭트에 의해 도입된 유전자의 발현을 환원조건 및 비환원조건의 전기영동 후 웨스턴블랏 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 13a은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10)의 장기간 계대배양시 세포성장을 나타내는 그래프이고, 도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10)의 장기계대시 도입 유전자의 발현양상을 유세포 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이며, 도 13c는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10)의 장기계대시 주요 NK 세포 표지자의 발현양상을 유세포 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이다.
도 14a는 본 발명에서 사용된 EpCAM 고발현 난소암 세포주인 RMG-1(좌측) 및 KOC-2S(우측)의 EpCAM 발현양상을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 145b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10), 대조군인 NK101 및 NK111을 RMG-1(좌측) 및 KOC-2S(우측)에 다양한 E:T 비율로 처리한 후 암세포 특이적 세포사멸능을 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 14c는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10), 및 대조군인 NK111를 암세포인 RMG-1 및 KOC-2S와 공배양시 배양액으로 분비되는 INF-γ(좌측) 및 그랜자임 B(우측)의 농도를 ELISA로 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 14d는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10)의 감마 방사선 조사시 시간의 경과에 따른 세포수(좌측) 및 세포 생존도(우측)를 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 14e는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10)의 방사선 조사 전후의 형질도입 유전자 및 주요 NK 세포 표지자의 발현양상을 비교분석한 유세포 분석 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이고, 도 14f는 본 발명의 일 실시예에 따른 방사선 조사 유전자 변형 NK 세포주를 EpCAM 고발현 암세포인 RMG-1(좌측) 및 EpCAM 미발현 암세포인 KOC-2S(우측)에 다양한 E:T 비율로 처리한 후, 암세포 특이적인 세포사 정도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10)의 생체내 항암활성을 확인하기 위한 동물실험 설계를 나타내는 투여스케쥴이고, 도 15b는 상기 도 15a의 투여 스케쥴대로 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10)를 정맥내 또는 복강내 투여시 시간의 경과에 따른 종양 성장정도를 나타낸 그래프이며, 도 15c는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10)를 단독으로 또는 세포자살 유도제인 5-FC와의 병용투여(i.p.)에 의한 효과를 확인하기 위한 동물실험 설계를 나타내는 투여스케쥴이고, 도 15d는 상기 도 15c의 투여 스케쥴 대로 유전자 변형 NK 세포주(SL-K10) 단독 또는 5-FC와의 병용 투여시(i.p.) 시간의 경과에 따른 종양 성장정도를 나타내는 그래프이이며, 도 15e는 상기 도 15d의 실험동물로부터 수득된 생체내 생물발광 이미지이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "CAR 컨스트럭트"는 "키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor) 컨스트럭트"의 약어로, 통상적으로 항원 인식부위로 scFv, sdAb와 같은 단일쇄 기반의 항체 유사체-세포막 통과 도메인-보조자극인자-세포내 신호전달 도메인으로 구성된 합성 단백질로서 T 세포 등 면역세포에 형질도입되어 암세포 특이적인 항원을 인식하여 CAR 컨스트럭트를 발현하는 면역세포의 이들 암세포에 대한 항암 활성을 향상시키는 것으로 잘 알려져 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "scFv"는 "single chain variable fragment"의 약어로서 실제 항체의 단편은 아니며, 항체의 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 약 25 a.a. 크기의 링커 펩타이드로 연결하여 제조한 일종의 융합단백질로서 고유의 항체 단편이 아님에도 불구하고 항원 결합능을 지닌 것으로 알려지고 있다(Glockshuber et al., Biochem. 29(6): 1362-1367, 1990).

본 문서에서 사용되는 용어 "유전자 변형(genetically modified)"이라는 용어는 숙주세포, 또는 선행종(predecessors)/모종(parents) 중 하나로 도입된 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 숙주세포가 자신의 게놈 외에 포함하는 것을 의미한다. 아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 게놈 외부의 독립적 분자, 바람직하게는 복제할 수 있는 분자로서 유전적으로 변형된 숙주세포 내에 존재할 수 있거나, 또는 숙주 면역세포의 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "세포자살 유전자(cell suicide gene)"는 세포독성을 유발하거나 또는 세포사멸 기전을 촉발시킴으로써 해당 유전자가 발현되는 세포가 사멸하도록 유도하는 유전자를 의미한다. 특히 유전자 발현 자체로는 세포사멸이 촉발되지 않으나 특정 프로드러그(prodrug)를 처리시 세포자살 유전자에 의한 프로드러그의 대사산물이 세포독성 또는 세포사멸 기전을 촉발함으로써 세포를 사멸에 이르게 할 수 있다. 이러한 세포자살 유전자들에는 간시클로비르를 자살 유도신호로 사용하는 헤르페스 단순포진 바이러스 티미딘 인산화 유전자(HSV TK), 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오사이드(6-methoxypurine arabinonucleoside)를 자살 유도 신호로 사용하는 바리셀라 조스터 바이러스 티미딘 인산화효소(VZV TK), 5-플루오로시토신(5-FC)를 자살 유도신호로 사용하는 시토신 디아미네이즈 및 우라실 포스포리보실전이효소(UPRT), 이리노테칸(CPT-11)을 자살 유도신호로 사용하는 카르복실 에스터라제, 5(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤자마이드(CB1954)를 자살 유도신호로 사용하는 니트로리덕테이즈, 4-[(2-클로로에틸)(2-메실록시에틸)아미노]벤조일-엘-글루탐산(CMDA)을 자살 유도신호로 사용하는 카르복시펩티데이즈 G2, 분자간 이량화 유도제(dimerizer)를 자살 유도신호로 사용하는 유도성 카스페이즈 9(iCas9)이 보고된 바 있다.

발명의 상세한 설명:

본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 특성을 갖는 분리된 NK 세포주에 EpCAM 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질도입되어 상기 EpCAM 특이적 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전자 변형 NK 세포주가 제공된다:

CD2, CD11a, CD25, CD45, CD54, DNAM-1, CD62L 및 CD56은 양성; 및

CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CD23, CD34, TCRαβ 및 TCRγδ는 음성.

상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 분리된 NK 세포주는 수탁번호 KCTC 13305BP로 기탁된 NK101 세포주일 수 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 EpCAM 특이적 키메라 항원 수용체는 EpCAM에 특이적으로 결합하는 scFv, 변형 Ig Fc 도메인, CD28 막통과 도메인, DAP10, DAP12 및 T 세포 수용체의 CD3ζ 도메인으로 구성될 수 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 3으로 기재되는아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 변형 Ig Fc 도메인은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 상기 CD28 막통과 도메인은 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 DAP10은 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 상기 DAP12는 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 T 세포 수용체의 CD3ζ 도메인은 서열번호 13으로 구성되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 EpCAM 특이적 키메라 항원 수용체는 전체적으로 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 EpCAM 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성될 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "DAP10"은 면역 수용체 복합체를 형성하는 막통과 신호 어댑터로서, HCST(hematopoietic cell signal transducer) 유전자에 의해 암호화되는 조혈성 세포 신호 전달자를 의미하며, NK 세포의 활성화에 및 T 세포 반응에 의한 세포의 생존 및 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "DAP12"는 12 kDa 크기의 막통과 단백질로서 상기 DAP10와 높은 상동성을 가지고 있으며, NK 세포에서 중요한 신호전달 수용체로 인식되고 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주는 추가적으로 NK 세포 보조활성화 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질도입되어, 상기 NK 세포 활성화 인자를 발현할 수 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 NK 세포 보조활성화 인자는 Ly49, NCR(natural cytotoxicity receptor), CD7, CD16 및 CD28로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 NK 세포 보조활성화 인자는 CD7 및/또는 CD28일 수 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 적어도 하나 이상의 NK 세포 증식 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 형질도입될 수 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 NK 세포 증식 인자는 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 사이토카인 또는 상기 사이토카인의 변이체일 수 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 IL-15는 막결합 IL-15일 수 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 세포자살유전자가 추가로 형질도입될 수 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 세포자살유전자는 우라실 포스포리보실전이효소(UPRT) 유전자, 헤르페스 단순포진 바이러스 티미딘 인산화 유전자(HSV TK), 바리셀라 조스터 바이러스 티미딘 인산화효소(VZV TK) 유전자, 시토신 디아미네이즈 유전자, 카르복실 에스터레이즈 유전자, 니트로리덕테이즈 유전자, 카르복시펩티데이즈 G2 유전자, 또는 유도성 카스페이즈 9(iCas9)유전자일 수 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 형질도입될 수 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체는 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체II일 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 단일클론항체의 항원에 결합 부분(가변 영역)을 림프구 활성화 수용체로부터 유래된 세포 내 신호전달 부위를 융합하여 제조된 일종의 융합단백질을 지칭한다. 이들 키메라 항원 수용체가 인간 T 세포들에서 발현되었을 때 MHC(major histocompatibility complex) 제한의 한계성 없이 강력한 세포 작용 기작들을 유도할 수 있다. 이러한 접근법의 잠재성은 CAR를 발현하는 T 세포들이 췌장암 환자들에게 주사된 임상적 연구에서 보고되었다. 지속적인 효능과 현저한 객관적인 반응(objective responses)이 저항성을 보이는 환자들에서 관찰되었고, CAR 기술의 활용이 좀 더 광범위하게 암 치료에서 사용될 것으로 전망되고 있으며, 현재 1세대, 2세대를 거쳐 3세대 CAR 분자가 보고되고 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "유전자 변형된(genetically modified)"이라는 용어는 숙주세포, 또는 선행종(predecessors)/모종(parents) 중 하나로 도입된 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 숙주세포가 자신의 게놈 외에 포함하는 것을 의미한다. 아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 게놈 외부의 독립적 분자, 바람직하게는 복제할 수 있는 분자로서 유전적으로 변형된 숙주세포 내에 존재할 수 있거나, 또는 숙주 면역세포의 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 암항원 특이적 키메라 항원 수용체와 상기 세포자살 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 융합단백질의 형태로 발현이 되거나, 단일 유전자 컨스트럭트 내에 클로닝된 후, 숙주 면역세포를 형질감염하여 공발현되거나, 별도의 유전자 컨스트럭트 내에 각각 클로닝된 후, 숙주 면역세포를 공형질감염함으로써 공발현될 수 있다. 상기 단일 유전자 컨스트럭트 내로 암항원 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 세포자살 유전자 폴리뉴클레오타이드가 클로닝되는 경우 별도의 프로모터에 각각 작동 가능하게 연결되어 발현되거나, 두 폴리뉴클레오타이드 모두 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되되, 상기 암항원 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 상기 세포자살 유전자 폴리뉴클레오타이드가 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site, IRES)로 연결됨으로써 폴리시스트로닉하게(polycistronic) 발현되도록 할 수 있다.

본 문서에서 사용되는 "작동가능하게 연결된(operably linked to)"은 특정 폴리뉴클레오타이드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오타이드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미하고, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 다른 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 당해 특정 단백질이 다른 단백질과 융합단백질의 형태로 발현될 수 있다.

상기 유전자 컨스트럭트는 발현벡터에 클로닝되어 숙주 면역세포를 형질감염시킬 수 있는데, 이러한 벡터에는 프로모터를 포함한 내부에 클로닝된 유전자의 발현을 가능케하는 다양한 조절인자들을 포함할 수 있다. 상기 조절인자들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절인자들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절인자들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절인자들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 1995, 270: 25739-25745)에 기술되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절인자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(In-vitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pX(Pagano (1992) Science 255, 1144-1147), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris, Cell 75: 791-803, 2005)가 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 유전자 변형 NK 세포주를 유효성분으로 함유하는 암치료용 세포치료제가 제공된다.

상기 세포치료제는 일종의 약학적 조성물로서, 약학적 조성물의 제형에 필요한 약학적으로 허용 가능한 담체, 첨가제 또는 부형제는 상술한 바와 같다.

한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포치료제의 투여량은 세포의 수는 10⁷ 내지 10¹¹개일 수 있지만, 환자의 성별, 나이, 질병의 진행정도, 치료 목적에 따라 조절될 수 있다. 일반적으로, 이러한 양은 표적 세포, 예를 들어, 암항원 과발현 암 세포에서의 국소화를 수득하고, 상기 암세포를, 예를 들어, 포식작용 또는 용해에 의해 죽이는데 충분할 것이다.

상기 세포치료제는 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다.

아울러 상기 "약학적으로 허용 가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 본 발명에 일 실시예에 따른 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 세포치료제는 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 치료제는 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 두개강내, 비강, 척추관내로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.

상기 약학적 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다. 약학적으로 활성인 단백질 물질은 투여마다 1 ng - 10 ㎎/체중(㎏)의 양으로 존재할 수 있지만; 상기 예시 범위 이하 또는 이상의 투여도 특히 상기 요소들을 고려하여 고려된다. 투여법이 연속 주입이면, 1분당 체중 1 ㎏ 당 1 ㎍ - 10 ㎎ 단위의 범위 내에 있어야 한다.

본 발명의 암 치료용 키트는 상기 유전자 변형 면역세포와 자살유도제를 포함하되 이들 두 구성성분이 혼합된 형태로 제공되지 않고 별도로 포장되어 제공되며, 이들 두 구성성분은 같은 시점에 같거나 다른 경로로 투여될 수 있으나, 의사의 처방에 따라 일정한 간격을 두고 투여된다는 점에서 일반적인 조성물과 구분된다. 본 발명의 키트는 먼저 상기 유전자 변형 면역세포를 투여한 후, 적절한 시점, 예컨대 유전자 변형 면역세포 투여와 같은 시점, 투여로부터 1일 후, 2일 후, 3일 후, 4일 후, 5일 후, 6일 후, 또는 1주일 후, 10일 후, 2주 후, 15일 후, 20일 후, 3주 후, 25일 후, 4주 후, 또는 30일 후에 투여될 수 있고, 첫 번째 투여 이후 이틀, 사흘, 나흘, 닷새, 엿새, 일주일간의 간격으로 두 차례 이상 복수로 투여될 수도 있다.

상기 자살유도제는 세포자살 유전자의 종류에 따라 달라지는데, 예컨대, 세포자살 유전자가 HSV TK 또는 VZV TK일 경우에는 각각 간시클로비르(gancyclovir) 또는 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오사이드(6-methoxypurine arabinonucleoside)일 수 있고, 시토신 디아미네이즈의 경우 5-플루오로시토신(5-FC)일 수 있으며, 카르복실 에스터라제의 경우 이리노테칸(CPT-11)일 수 있다. 아울러 니트로리덕테이즈의 경우에는 5(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤자마이드(CB1954)일 수 있고, 카르복시펩티데이즈 G2의 경우에는 4-[(2-클로로에틸)(2-메실록시에틸)아미노]벤조일-엘-글루탐산(CMDA)일 수 있으며, iCas9일 경우 iCas9 이량화제(dimerizer)일 수 있고, 상기 iCas9 이량화제는 AP20187 또는 AP1903일 수 있다.

상기 유전자 변형 NK 세포주와 상기 자살유도제는 동시에 투여될 수 있으나, 상술한 바와 같이, 최적의 효과를 위하여 적절한 투여간격으로 나누어 투여될 수 있으며, 상기 투여간격은 치료활성의 극대화를 위해 조절될 수 있다.

본 발명의 암 치료용 키트의 사용을 통해 치료 가능한 암은 혈액암 또는 고형암일 수 있는데, 상기 고형암은 간암, 폐암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 담낭암, 위암, 담도암, 대장암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 뇌종양, 악성 흑색종, 전립선암, 고환암, 설암, 또는 골수암일 수 있다.

이하, 본 발명을 첨부되는 도면을 이용하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명자들은 NK 림프암종 환자의 암조직으로부터 표 1에 기재된 특성을 갖는 새로운 NK 세포주를 분리하였으며, 이에 대한 다양한 특성을 조사한 결과, 도 1 내지 6에 나타난 바와 같이, IL-2 의존적 증식능을 나타내며, 암세포 사멸능과 면역조절능을 모두 갖는 다기능성 NK 세포주임을 확인할 수 있었다. 특히, 현재 임상시험이 진행중인 유일한 NK 세포주인 NK-92에 비해 증식능이 현저하게 높아서 경제적으로 생산가능한 세포임을 확인하여, 이를 'NK101' 세포주로 명명하고 이를 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 181번지에 소재하고 있는 한국생명공학연구원 내 한국유전자은행(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2017년 8월 7일자로 기탁하여, 2017년 8월 24일자로 KCTC 13305BP의 수탁번호를 부여받았다. 그러나, 상기 NK101 세포주는 유전자 발현 분석 결과, IL-2 수용체인 CD25는 고발현이고, CD56^dimCD62L⁺의 표현형을 갖는 것으로 확인되었으나, NK 세포의 항암 활성에 직접적인 영향을 주는 NK 세포 활성화 인자인 CD7 및 CD28은 발현하지 않음을 확인함으로써, 항암 활성 자체는 종래에 구축된 NK 세포주 보다 높지 않을 것으로 예상하게 되었다.

이에, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 NK101 세포의 항암활성을 강화하기 위해, NK101 세포에 기반한 유전자 변형 NK 세포주를 제조하고자 하였다. 도 7b는 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 SL-K01의 제조에 사용된 유전자 컨스트럭트 CD7-CD28-CD::UPRT의 구조를 개략적으로 나타낸 개요도이고 및 도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 NK111의 제조를 위해 사용된 유전자 컨스트럭트 mbIL-15-mTGFβ1IΔcyto의 구조를 개략적으로 나타낸 개요도이다.

본 발명에서는 앞서 언급한 요소를 보완하기 위하여, 본 발명자들에 의해 기확립된 NK101 세포(수탁번호 KCTC 13305BP)에 NK 세포의 보조활성화 수용체, 세포자살유전자, 세포막 고정(membrane bound) 사이토카인, 돌연변이 TGFβ 수용체를 도입하여 해당 NK 세포의 항암효과 증진, 및 사이토카인 보충제(cytokine supplement) 비의존적으로 NK 세포의 증식이 가능한 NK111 세포주를 구축하였다(도 9b 및 9c 참조).

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(SL-K01) 및 상기 SL-K01의 모세포주인 NK101, 그리고 종래구축된 NK 세포주인 KHYG-1 및 NK-92에서의 세포 표면 표지자의 발현 여부를 분석한 결과로서, 도 7a는 NK101, KHYG-1 및 NK-92에서 CD7 및 CD28의 발현여부를 분석한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 7c는 상기 도 7b에 도시된 유전자 컨스트럭트를 형질도입한 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 세포주 SL-K01 세포에서의 CD7 및 CD28 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이다. 상기 도 7에서 확인되는 바와 같이, 기존에 구축된 NK세포주 들 중 암세포 사멸능이 높다고 알려져 있는 KHYG-1 및 NK-92는 공통적으로 CD7을 발현하는 특징을 갖고, NK-92 세포는 CD7은 물론 CD28까지도 동시에 발현하는 특성을 가지고 있는 반면, NK101은 두 보조자극 인자의 발현이 전혀 되지 않음을 확인할 수 있었다. 이에, 본 발명자들은 NK101 세포에 CD7 및 CD28 도입을 통해 암세포 사멸능이 증진되는지의 여부를 평가하고자 하였다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 SL-K01 및 상기 SL-K01의 모세포주인 NK101의 다양한 암세포에 대한 세포사멸능을 분석한 결과로서, 도 8a는 HDLM-2, IM-9, JEKO-1 및 K562 암세포를 NK101 또는 SL-K01 세포와 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 암세포 사멸빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 8b는 다양한 농도의 5-FC를 NK101 또는 SL-K01 세포에 48시간 처리한 뒤, 세포 성장률을 MTS 분석을 통하여 확인한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 8c는 IM-9 세포주와 NK101 또는 SL-K01 세포를 2:1, 1:1, 또는 0.5:1 비율로 공배양 시, 5-FC 유무에 따른 IM-9 암세포 사멸 빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8a 내지 8c에서 확인되듯이, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 SL-K01은 NK101 대비 다양한 암세포주에서 우수한 살상능을 보여, CD7, CD28 도입을 통해 NK101 세포의 살상능이 증진되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 5-FC 처리를 통해 SL-K01 세포의 제거를 유도함으로써 안전성을 확보할 수 있을 뿐 아니라, 방관자 살상 효과까지 유도하여 주변의 암세포를 제거할 수 있음을 확인하였다.

도 9는 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주인 NK111 세포주의 구축과정을 나타내는 것으로서, 도 9a는 SL-K01 세포의 추가적 암세포 사멸 효과 증진 및 면역억제인자 TGF-β에 대한 저항성 유도를 위해 도입된 유전자 컨스트럭트의 개요도이고, 도 9b는 SL-K01 및 상기 도 9a에 도시된 유전자 컨스트럭트가 도입된 SL-K01 세포(NK111로 명명) 표면에서의 IL-15 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 9c는 SL-K01 및 NK111 세포에서의 TGFβRIIΔcyto 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이다. 도 8에서 확인된 바와 같이, CD7/CD28 도입은 NK101 세포의 살상능 증진에 중간 정도의 효과를 나타냈다. 이에 본 발명자들은 SL-K01 세포의 암세포 사멸능을 극대화하기 위해, 대표적 NK 세포 활성화 인자인 막결합(membrane bound) IL-15을 SL-K01 세포에 형질도입하고자 하였고, 면역억제인자 TGF-β에 대한 저항성 유도를 위해 세포질 도메인(cytoplasmic domain)이 결실된 TGFβRIIΔcyto을 과발현시켜 미끼 수용체(decoy receptor)로 작용하도록 하였다. 그 결과, 도 9b 및 9c에서 확인되는 바와 같이, 모세포주인 SL-K01에서는 발현이 되지 않던 IL-15 및 TGFβRII가 본 발명의 일 실시예에 따른 NK111 세포주에서는 발현이 됨이 확인되었다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주인 NK111의 항암활성 및 안전성을 비교분석한 결과로서, 도 10a는 SL-K01 및 NK111 세포의 배양 시, IL-2 유무에 따른 세포수 증식수준(population doubling level)을 나타낸 그래프이고, 도 10b는 NK101, SL-K01 및 NK111 세포에서의 NKG2D 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 10c는 IM-9 세포주와 SL-K01 또는 NK111 세포를 2:1, 1:1, 또는 0.54:1 비율로 공배양 시, 5-FC 유무에 따른 IM-9 암세포의 사멸빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 10d는 OVCAR-3 또는 THP-1 세포주를 SL-K01 및 NK111 세포와 공배양시, 다양한 농도의 TGFβ1을 처리한 후, 암세포 사멸능에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 도 10a에서 확인되듯이, 막결합 IL-15의 도입을 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 NK111는 IL-2 독립적으로 세포성장이 가능하게 되었으며, 이는 생산시 편의성을 높여준다. 또한, 도 10b에서 확인되는 바와 같이, IL-15 도입을 통해 NK 세포의 대표적 활성화 수용체인 NKG2D 발현이 상향조절됨으로써 암세포에 대한 살상능을 증진시킴을 확인할 수 있었다. 아울러, 도 10c에서 확인되는 바와 같이, 5-FC 처리에 의한 방관자 살상 효과(bystander killing effect)가 더해지면, 1:1 비율에서 암세포 사멸을 90% 정도로 유도할 수 있을 만큼 살상능이 증진되었다. 또한, 도 10d에서 확인되는 바와 같이, 종양미세환경에서 과다분비되는 면역억제인자인 TGFβ1에 대한 미끼 수용체인 TGFβRIIΔcyto 도입을 통해 TGFβ1에 대한 살상능 저하에도 영향을 받지 않게 되었는데, 이는 추후 생체내 활성 감소를 어느 정도 극복할 수 있음을 기대하게 하는 특성이다.

더 나아가, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주를 이용하여 항원 특이적 세포치료가 가능한 키메라 항원 수용체를 형질도입할 경우 해당 암항원을 고발현하는 암에 대하여 보다 효과적인 항암치료가 가능할 수 있을 것이라는 가정하에 난소암 등 다양한 고형암에서 과발현되는 것으로 알려진 EpCAM을 표적으로 한 키메라 항원 수용체 컨스트럭트를 고안한 후(도 11), 이를 제작하여 상기에서 제조한 NK111 세포주에 추가로 형질도입시킨 결과, 장기계대시에도 모세포(NK101)의 특성은 그대로 유지하면서도 형질도입된 유전자들을 정상적으로 발현시킬 뿐만 아니라(도 12a 내지 도 14b), EpCAM을 과발현하는 암세포에 대하여 시험관내 조건은 물론 생체내 조건에서 매우 효과적인 항암활성을 나타냄을 실험적으로 입증함으로써(도 15a 내지 15e) 본 발명을 완성하였다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 본 발명의 NK 세포주의 제조 과정

NK 세포 유래 세포주를 제작하기 위하여 다음과 같은 과정을 거쳤다. 환자에서 유래한 림프절외(extranodal) NK 림프암종을 40 μm 스트레이너에 올려두고, 20% 우태아혈청(GE Healthcare, USA)와 1% 항생제(Gibco, USA)가 포함된 Cellgro^® 줄기세포 성장배지(SCGM; CellGenix, Germany, 이하 'NK media'라 함) 10 mL을 첨가한 후 5 mL 주사기의 피스톤의 전단력을 이용하여 단일세포로 떼어낸 후 현탁하였다. 단일세포 현탁액 중 NK 세포를 NK 분리키트(Milltenyi Biotec, Germany)를 이용하여 분리한 후 1000 U/mL의 인간 재조합 IL-2(recombinant human IL-2; rhIL-2; Prometheus Laboratories Inc., USA)가 첨가된 NK media에서 3주간 배양하였다. IL-2가 포함된 NK media를 주 2회 첨가하였으며, 분열 세포주를 30계대까지 지속 배양하여 안정적인 세포주가 형성되었음을 확인하였다(도 1a). 상기 세포주는 CD3, CD20, CD16는 발현하지 않으면서 CD56을 발현하므로, 해당 세포의 기원이 NK 세포임을 확인하였다(도 1b). 해당 세포주는 배양 시 군집(spheroid)을 형성하는 특징이 있다는 것을 현미경 상에서 확인할 수 있었으며(도 1c), Wright-Giemsa 염색법을 이용한 형태학적 분석에서 NK101 세포가 큰 과립성 림프구(large granular lymphocyte)의 특성을 가짐을 확인하였다(도 1d). NK 세포 특성인 세포 사멸인자 퍼포린(Perforin, green) 및 그랜자임 B(Granzyme B, red)의 형광염색을 통해 NK101이 퍼포린과 그랜자임 B를 발현함을 확인하였다(도 1e). NK 세포에 민감하게 반응하는 MHCⅠ 음성 세포인 K562와 공배양을 수행하였다. 카르복시플루오레세인 디아세테이트(CFDA; Invitrogen, USA)로 표지한 K562 세포를 3x10⁵ cells/mL 농도로 24-웰 플레이트(well-plate; Corning, USA)에 파종한 뒤 NK101 세포를 다양한 효과기 세포 대 표적 비율(E:T 비율 = 1:1, 2:1, 4:1, 10:1)로 1 mL 배지에 부유한 후 상기 암세포와 24시간 동안 함께 배양하였다. 배양 이후 모든 세포를 각 웰로부터 회수하여 원심 분리한 후, 세포 펠렛을 FACS 완충액으로 현탁시켰다. 다시 원심분리하여 형성된 세포 펠렛을 1 μL LIVE/DEAD^® Fixable Near-IR Dead Stain Kit(Invitrogen, USA)를 넣은 FACS 완충액 100 μL에 현탁시켜, 4℃에서 20분간 반응하였다. FACS 완충액으로 2번 세척한 뒤, 1X Annexin V binding buffer 100 μL에 Annexin V APC 5 μL(Biolegend, USA)를 희석한 용액에 세포 펠렛을 현탁시켜, 실온에서 20분간 반응하였다. 세포의 사멸 여부는 유세포 분석법을 이용하여 생존 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-음성), 초기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-음성), 후기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-양성), 괴사(necrotic) 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-양성)으로 구분하였다. 도 1의 결과를 통하여 NK101은 지속적인 계대가 가능한 불멸화 세포이고, 배양 시 군집을 형성하며, 표현형 및 기능이 기존에 알려진 NK 세포와 일치하는 특성을 가짐을 알 수 있었다. 해당세포의 세포주화 및 NK 세포의 특성을 확인함으로써 해당 세포주를 'NK101'으로 명명하였으며, 이를 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 181번지에 소재하고 있는 한국생명공학연구원 내 한국유전자은행(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2017년 8월 7일자로 기탁하여, 2017년 8월 24일자로 KCTC 13305BP의 수탁번호를 부여받았다. 상기 기탁기관은 부다페스트 조약상 국제기탁기관이다.

실시예 2 : NK101의 세포 분열능 분석

상기 실시예 1에서 제조된 NK101 세포주에 대한 배양 조건 확립 및 분열능 비교를 위하여, NK101 세포와 대조군 세포인 NK-92 세포에 20% 우태아 혈청이 포함된 SCGM 배양배지에 다양한 농도의 IL-2를 처리한 후 MTS 분석법을 통해 두 세포주의 세포생장을 비교하였다. 도 2a와 같이 NK101은 약 8pM의 IL-2 농도에서 생장이 시작되어 500 pM에서 생장이 정체되었으며(EC₅₀=23.3 pM), NK-92는 30 pM 농도의 IL-2 존재 시 세포 생장이 확인되며 2000 pM 농도에서 생장이 정체되어(EC₅₀=128.3 pM) 세포생장에 있어 NK101이 NK-92 대비 낮은 농도의 IL-2를 필요로 함을 알 수 있었다. 도 2b에서 확인한 IL-2 수용체 소단위체 발현을 유세포 분석으로 확인한 결과, NK101이 고친화 IL-2 수용체인 CD25를 NK-92 대비 높게 발현함을 확인하였다. 또한 NK101 및 NK-92의 동결 후 세포 생장률 및 생존율을 동일 배양조건에서 분석한 결과 NK101은 해동 후 2일(1 계대) 이후 세포생장이 회복되나, NK-92는 해동 후 10일(5 계대) 이후 일정한 세포생장에 도달함을 확인할 수 있었다(도 2c). 두 세포의 세포생장이 안정화된 후, 두 세포의 세포증식을 비교하였을 때 16일 계대 후 수득되는 NK101 세포의 총 세포주가 NK-92 세포의 수득 예상 세포수의 약 100배임을 확인할 수 있었다(도 2d). 이는, 본 발명의 NK101 세포의 생산성이 종래의 NK-92 세포에 비해 월등하여, 경제성의 측면에서 본 발명의 NK101 세포가 매우 유리함을 시사하는 것이다.

본 발명의 NK101 세포의 종합적인 특성은 하기 [표 1]로 정리하였다.

본 발명의 NK101 세포의 주요 특징

항목	NK101 세포
임상 데이터
연령/성별	56세 남성
인종	아시안
진단	절외 NK/T 림프종(extranodal NK/T lymphoma)
세포배양
성장 양상	현탁상태에서 다중세포 응집체
배가시간	18-32시간
최대 세포농도	1.2x10⁶cells/㎖
최소 세포농도	0.5x10⁵cells/㎖
사이토카인 의존성	IL-2 의존성(500 IU/㎖)
최적 분열	매 2-3일
면역학적 특성
T/NK 마커	CD2⁺, CD3^-, CD4^-, CD7^-, CD8^-, CD16^-, CD56⁺
B 세포 마커	CD10^-, CD19^-, CD20^-
골수단핵구성 마커	CD13^-, CD14^-, CD33⁺
NK 세포 활성화 수용체	NKp46⁺, NKp30⁺, NKG2D⁺
NK 세포 저해성 수용체	KIR2DL1^-, KIR2DL2^-, ILT2^-
자손/활성화 마커	CD34^-, FAS⁺
부착 마커	CD11a⁺, CD18⁺, CD54⁺
기능적 특성
NK 활성	호-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 분비능(면역활성능) 및 증식능
사이토카인 생산	IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-2 등 호-염증성 사이토카인 분비 및 IL-1 수용체 길항제 및 IL-10 등 항-염증성 사이토카인 미분비
사이토카인 수용체	CD25⁺, CD122⁺, CD132⁺, CD127^-
케모카인 수용체	CCR4⁺, CCR6⁺, CCR7⁺, CCR8⁺, CXCR3⁺, CXCR4⁺

실시예 3 : 표면 마커 분석

상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 NK101 세포주는 부유세포의 특성을 가지며, 해당 세포의 표면항원의 발현도를 유세포 분석으로 확인하였다. T/NK 세포 마커의 경우, 본 발명의 NK101 세포주는 NK 세포의 표면항원인 CD2, CD56을 발현하나 CD16은 발현하지 않으며, T 세포의 표면항원인 CD3, CD4, CD8, TCRαβ 및 TCRγδ과 B세포 표면항원인 CD20, 단핵구 표현항원 CD14를 발현하지 않는 NK 세포의 표현형을 가지고 있었다(도 3a). 또한, 본 발명의 NK101 세포주는 NK 세포의 활성화 수용체인 NKG2D, NKp30, NKp46, DNAM-1, 2B4를 발현하였고, 비활성화 수용체인 CD94, NKG2A는 발현하였으나, KIR2DL1/S1/S3/S5, KIR2DL2/DL3, 및 CD85j 등은 발현하지 않았다(도 3b). 또한 세포부착 분자인 CD2, CD11a, CD19, ICAM-1을 발현하며, CD7은 미발현하였다(도 3c). 추가적으로 본 발명의 NK101 세포주는 NK 세포의 세포독성 및 면역활성화에 관여하는 CD107a, 퍼포린, 그랜자임 B은 고발현되고, TRAIL 및 FASL은 낮은 수준이긴 하나 발현되며(도 3d), NK 세포의 사이토카인 수용체 중에서는 IL-2 고친화 수용체인 CD25, IL-2 수용체(CD122, CD132) 및 IL-15 수용체인 IL-15Ra를 발현함을 확인하였다(도 3e). NK 세포주의 이동성에 관련된 케모카인 수용체 중에서는 CCR4, CCR6, CCR7, CXCR3, 및 CXCR4를 발현하였으나, 그 외의 CCR 및 CXCR은 발현되지 않았다(도 3f). 결론적으로, 본 발명의 NK101 세포주는 활성화된 NK 세포의 표현형을 보이며, 특히 CD25가 고발현된다는 점에서 다른 NK 세포주와 구분되는데, CD25는 활성화된 NK 세포의 지표로 특히 분열능이 높은 NK 세포의 표지자로 알려 있어(Clausen, J. et al., Immunobiology, 207(2): 85-93, 2003), 본 발명의 NK101 세포주는 세포치료제의 대량생산에 매우 적합한 세포주임을 알 수 있다.

본 발명의 NK101 세포의 다양한 세포표지자의 발현여부는 하기 [표 2]로 정리하였다.

본 발명의 NK101 세포의 마커 특성

항원	발현여부	항원	발현여부
계통 마커		기능성 마커
CD1a	-	CD95 (FAS)	+++
CD2	+++	CD178 (FAS-L)	+
CD3	-	CD107a	+++
CD4	-	TRAIL (CD253)	+
CD5	-	퍼포린	+++
CD8	-	그랜자임 B	+++
CD10	-	IFNγ	+++
CD11a	+++	케모카인 수용체
CD11c	-	CCR1	+
CD13	+	CCR2	-
CD14	+	CCR3	-
CD16	-	CCR4	+++
CD18	+++	CCR5	+
CD19	-	CCR6	+++
CD23	-	CCR7	+++
CD33	+++	CCR8	++
CD45	+++	CCR9	+
CD56	+++	CXCR1	-
CD57	-	CXCR2	-
CD161	++	CXCR3	+++
활성화 수용체		CXCR4	+++
2B4	+++	CXCR5	-
NKp30	++	CXCR6	-
NKp46	+++	CXCR7	-
NKG2D	++	사이토카인 수용체
저해 수용체		CD25(IL-2Ra)	+++
CD85j(ILT2)	-	CD122(IL-2Rb)	++
CD94	+++	CD132(공통 γ 사슬)	+++
CD158(KIR2DL1/S1/S3/S5)	-	CD127(IL-7Ra)	-
CD158b(KIR2DL2/DL3)	-	기타 마커
CD159a	+++	TCRαβ	-
부착분자		TCRγδ	-
DNAM-1(CD226)	+++
ICAM-1(CD54)	+++
CD62L	++
-, 음성; +, < 10% 양성; ++, 10-69% 양성; +++, 70-100% 양성(%는 세포 집단 내 양성 세포의 비율을 나타냄)

실시예 4 : NK101의 CD56 및 D62L 발현양상 확인

NK101 세포의 특성을 분석하기 위하여 NK 세포의 표지마커인 CD56 및 CD62L의 발현양상을 NK-92와 초도배양 NK 세포와 비교하여 유세포 분석을 이용하여 확인하였다. 도 4a에서와 같이 NK101 세포는 NK-92 세포 대비 CD56 발현 정도가 낮은 CD56^dim NK 세포로 확인되었다. 또한 도 4b의 등고선 그래프와 같이 NK101 세포는 CD62L 마커를 고발현하는데, 이는 NK-92 세포에서는 미발현되고, 일부 초도배양 NK 세포에서 한정적으로 발현되는 마커이다. 일반적인 초도배양 NK 세포에서는 CD56의 발현에 따라 CD56^dim, CD56^bright으로 구분할 수 있고 이는 각각 세포독성 또는 사이토카인 생산이 더 우세한 특성을 가진 2개의 군집으로 구성된다고 여겨진다. CD56^bright NK 세포는 높은 세포 증식능, 사이토카인에 의한 활성화 시 IFN-γ를 분비, 낮은 암세포 사멸능을 보이며, CD56^dim NK 세포는 CD56^bright NK 세포와는 반대로 세포 증식능은 낮고, 표적세포의 인지에 의해서 IFN-γ를 분비하며, 높은 세포독성을 가지는 특성이 있다. 최근 검증된 CD56^dimCD62L⁺ NK 세포는(Juelke, K et al,, Blood, 116(8): 1299-1307, 2010; Luetke-Eversolh, M et al., Front. Immunol., 4: 499, 2013) CD56^bright, CD56^dim NK 세포의 특성을 모두 가지고 있는 다기능성의 NK 세포로 보고된다. NK101은 사이토카인 자극에 의해 증식 및 IFN-γ를 분비할 수 있고(도 5a), 표적세포 인지 시에도 다양한 종류의 사이토카인을 분비함이 확인되었다(도 5b). 결론적으로 NK101은 CD56^dimCD62L⁺ NK 세포의 표현형과 특성을 가지고 있으며, CD56^dimCD62L⁺ 특성 마커를 발현하는 초도배양 NK 세포 혹은 체외 증식(ex vivo expanded) 초도배양 NK 세포가 보고된 바가 있다 하더라도 NK101은 불멸화된 NK 세포주로서 이들과는 차별되며, 이는 기존 알려진 NK 세포주 중에서도 찾아볼 수 없는 고유 특성이라고 할 수 있다.

실시예 5 : NK101의 시험관내 암세포 사멸능 및 세포독성 메커니즘 규명

상기 실시예 1에서 제조되어 표현형이 확인된 NK101 세포주의 암세포 사멸능을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, CFDA로 표지한 인간-유래 암세포주인 THP-1, KG-1, HL-60(급성골수성백혈병), HCT116(대장암), U373(뇌암), A2780(난소암), A549(폐 선암종), 및 SK-BR3(유방암) 세포를 각각 24-웰 플레이트에 3x10⁵ cells/mL 농도로 1 mL 씩 파종하였다. 이후 NK101 세포 및 대조군을 다양한 효과기 세포 대 표적 세표 비율(E:T 비율=1:1, 2:1, 및 4:1)로 1 mL 배지에 부유한 후 상기 암세포와 24시간 동안 함께 배양하였다. 배양 이후 모든 세포를 수집한 뒤 각 웰로부터 세포를 회수하여 원심분리한 후, 세포 펠렛을 FACS 완충액으로 현탁시켰다. 다시 원심분리하여 형성된 세포 펠렛을 1 μL LIVE/DEAD^® Fixable Near-IR Dead Stain Kit를 희석한 100 μL의 FACS 완충액에 현탁시켜, 4℃에서 20분간 반응하였다. FACS 완충액으로 2번 세척한 뒤, 1X Annexin V binding buffer 100 μL에 Annexin V APC 5 μL (Biolegend, USA)를 희석한 용액에 세포 펠렛을 현탁시켜, 실온에서 20분간 반응하였다. 세포의 사멸 여부는 유세포 분석법을 이용하여 생존 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-음성), 초기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-음성), 후기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-양성), 괴사(necrotic) 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-양성)으로 구분하였다. 도 6a에서 확인되는 바와 같이 NK101 세포 투여군의 경우 다양한 인간 암세포주에 대하여 세포 살상능을 보임을 확인할 수 있었다. NK101 세포의 세포 살상능의 주요 표지 인자를 확인하기 위하여 NK 세포에 고발현되는 CD25, CD62L, DNAM-1, CD54(ICAM-1)에 대한 중화항체를 처리한 후 THP-1(도 6b), K562(도 6c), Jurkat(도 6d)와 4:1의 효과기 세포 대 표적세포 비율로 공배양한 뒤 세포사멸을 분석하였다. 그 결과 THP-1에서는 DNAM-1 및 CD54, K562에서는 CD54, Jurkat에서는 CD25, CD62L, CD54 등의 중화항체 처리에 의해 NK101의 세포 사멸능이 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 도 6e에서 THP-1과 NK101의 공배양 시 DNAM-1 및 CD54의 중화항체를 동시 처리할 경우 상승성으로(synergestic) 세포사멸능이 감소함을 확인할 수 있었다. 해당 결과를 토대로 NK101에 의한 세포살상능에 DNAM-1, CD25, CD62L 및 CD54 등의 표지인자가 주로 관여함을 알 수 있다.

실시예 6: 기능강화 NK 세포주 제조

KHYG-1 및 NK-92는 기존에 구축된 NK세포주 들 중, 암세포 사멸능이 높다고 알려져있고 이들은 공통적으로 CD7, CD28을 발현하는 특징을 갖는 반면, NK101은 두 보조자극인자의 발현이 전혀 되지 않음에 착안하여, 본 발명자들은 상기 NK101에 CD7, 및 CD28를 암호화하는 유전자를 형질도입할 경우 암세포 사멸능이 증진되는지의 여부를 평가하고자 하였다.

6-1: NK 세포 활성화 인자 및 세포자살 유전자 도입 컨스트럭트의 제조

본 발명자들은 기능강화 NK 세포주를 제작하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조된 NK101 세포에 CD7(서열번호 15)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 16) 및 CD28 면역세포 보조자극인자(서열번호 17)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 18)가 2A 펩타이드(19)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 20)로 연결되고, 추가적으로 CD::UPRT(서열번호 21)을 암호화하는 핵산분자(서열번호 22)가 IRES(서열번호 23)로 연결된 유전자 컨스트럭트를 제조하여 렌티바이러스 제조용 트랜스퍼 벡터 pWPT에 클로닝하여 pWPT-CD7-CD28-CD::UPRT를 제조하였다(도 7b).

6-2: 렌티바이러스 제조

렌티바이러스 생산을 위하여 48시간 또는 72시간 배양한 Lenti-X 세포에 상기 실시예 6-1에서 제조된 트랜스퍼 플라스미드 12 μg와 패키징 플라스미드 psPAX2 12 μg 및 외피 플라스미드 pMD2.G 2.4 μg을 리포펙타민(Lipofectamine; Invitrogen, USA)과 혼합하여 Lenti-X 293T 세포(Clontech, USA)에 형질도입하였다. 37℃에서 6시간 배양 후, 배지를 제거하고 신선한 성장배지를 첨가하였다. 세포를 추가로 48시간 배양 후, 배지 내에 생선된 렌티바이러스를 수거하여 5분간 원심분리(4℃, 4000 rpm)하고 상층액을 취한 후 0.45 μm 필터(Millipore, USA)를 이용하여 세포 찌꺼기들을 제거하였다. 렌티바이러스를 농축하기 위하여 여과된 렌티바이러스 상층액에 Lenti-X concentrator (Clontech, USA) 시약을 넣은 후 4℃에서 밤새 보관하였다. 최종단계로, 렌티바이러스-concentrator 혼합액을 4000 rpm에서 60분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 펠렛 형태로 회수된 렌티바이러스를 1~2 mL의 배양액으로 희석하고 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.

6-3: NK 세포 활성화 인자 및 세포자살 유전자 도입 세포주 제작

상기 실시예 6-2에서 제조된 CD7-CD28-CD::UPRT 렌티바이러스를 프로타민 설페이트(Sigma, USA)를 이용하여 NK101 세포에 형질감염한 후 37℃에서 4시간 배양한다. 총 2번의 감염과정을 수행한 후, 감염 72시간 후 면역세포 공동자극인자인 CD7과 CD28의 발현을 유세포 분석으로 확인하고, 1주일 뒤 형광활성 세포분리기(Fluorescence activated cell sorter, BD FACSMelody, BD, USA)를 이용하여 도입유전자를 발현하는 NK101 세포만을 선택적으로 분리하였다. 분리 증식한 NK101-CD7-CD28-CD::UPRT 세포주에서 막표면 단백질인 CD7과 CD28의 발현은 유세포 분석으로 확인하였다(도 7c). 본 발명자들은 CD7-CD28-CD::UPRT를 발현하는 유전자 변형 NK101 세포주를 'SL-K01'으로 명명하였다.

6-4: 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)

세포 내 발현 단백질인 CD::UPRT는 RNA를 분리하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 발현을 확인하였다(도 7d). 전체 RNA는 RNA 추출 키트(iNtRON, South Korea)을 이용하여 분리하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응은 QuantiTect Reverse Transcription Kit(QIAGEN, Germany)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 합성된 cDNA를 Taq 폴리머라제와 프라이머 등과 혼합한 후 중횹효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 CD::UPRT 유전자 존재여부를 확인하였다. 그 결과 도 7d에서 확인되는 바와 같이, 형질도입된 CD::UPRT 유전자는 정상적으로 발현이 됨을 확인할 수 있었다.

실시예 7: NK 세포 공동활성 인자 및 세포자살 유전자에 의한 NK 세포 활성화 증가 확인

7-1: CD7 및 CD28 도입에 의한 NK 세포 살상능 검증

상기 실시예 6에서 제조한 SL-K01 세포의 세포 살상능을 분석하기 위하여 HDLM-2(인간 호지킨 림프종, Hodgkin's lymphoma), IM9(인간 림프아세포종), Jeko-1(인간 외투세포 림프종) 및 K562(만성골수성백혈병)와 공배양을 수행하였다. Celltracker violet dye(CTV; Invitrogen, USA)로 표지한 타깃 종양 세포주를 3x105/mL의 농도로 준비한 후, 24-웰 플레이트에 1 mL씩 분주하였다. 타깃 종양 세포주에 대비하여 NK101 및 SL-K01 세포를 원하는 비율로 배양액에 현탁한 후 상기 타깃 종양 세포주가 들어있는 24-웰 플레이트에 1 mL씩 분주하여 37℃에서 24시간동안 공배양하였다. 이 결과, 모든 타깃 세포주에서 세포 살상능이 증가함을 확인할 수 있었다(도 8a).

7-2: 세포자살 유전자 전구물질 투여에 따른 NK 세포 사멸 확인

상기 실시예 6에서 제조한 SL-K01 세포에 도입된 세포자살 유전자인 CD::UPRT의 효과를 분석하기 위하여, 20% FBS 조성의 SCGM 배지에 세포수가 2x10⁴cells/90 μL/well이 되도록 준비하여 96-웰 플레이트(Corning, USA)에 각각 분주하고, 농도별(각각 0, 0.1, 1, 10, 100, 1000 μg/mL)로 희석한 전구물질 5-Fluorocytosine(5-FC; Sigma, USA) 또는 양성대조군(1% Triton-X)을 웰에 10 μL씩 접종하여, 5% CO₂, 37℃ 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 이어서 MTS 용액(Promega, USA)을 96-웰 플레이트에 웰당 20 μL씩 넣어주고 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 다음, SpectraMax 190 Microplate Reader(Molecular Device, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 CD::UPRT를 발현하는 세포에서 5-FC 농도 의존적 세포 사멸을 확인할 수 있었다(도 8b). CTV로 표지한 IM9 세포에 SL-K01 세포와 100 μg/mL 5-FC를 함께 처리하여 48시간 배양 후 유세포 분석법으로 세포 사멸 효과를 확인하였다. 도 8c에 나타난 결과에서 확인된 바와 같이, 5-FC를 처리한 실험군에서 세포사멸이 더욱 증가하였다. 결론적으로, 전구물질을 투여하였을 때, 세포자살 유전자가 도입된 NK 세포뿐 아니라, 표적 암세포까지 사멸하는 방관자 효과(bystander effect)에 의해 치료 효과를 극대화시킬 수 있다.

실시예 8: mbIL-15과 TGFβRIIΔcyto 도입

본 발명자들은 상기 실시예 6에서 제조된 SL-K01 세포의 세포 살상능을 더욱 증진시키기 위하여 막 결합 IL-15(mbIL-15, 서열번호 24)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 25)와 TGFβRII의 세포질 도메인을 제거한 TGFβRIIΔcyto(서열번호 26)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 27)가 2A 펩타이드(서열번호 19)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 20)로 연결된 유전자 컨스트럭트를 제조하여 렌티바이러스 제조용 트랜스퍼 벡터 pWPT에 클로닝하여 pWPT-mbIL-15-TGFβRIIΔcyto를 제조하였다(도 9a). 실시예 6에서 명시한 것과 동일한 방법으로 mbIL-15-TGFβRII 렌티바이러스를 제조한 후 SL-K01 세포에 감염하였으며, 형광활성 세포분리기를 이용하여 도입유전자를 발현하는 SL-K01 세포만을 선택적으로 분리하였다. 분리증식한 SL-K01-mbIL-15-TGFβRII 세포주에서 막표면 단백질인 IL-15과 TGFβRII의 발현은 유세포 분석법으로 확인하였다(도 9b). mbIL-15-TGFβRII를 발현하는 SL-K01 세포주를 'NK111'으로 명명하였다.

실시예 9: mbIL-15 도입에 의한 세포 분열능 확인 및 TGFβRIIΔcyto 도입에 따른 내인성 TGFβ에 의한 면역저항성 억제 확인

9-1: IL-2 의존성 증식 분석

상기 실시예 8에서 제조된 NK111 세포의 IL-2 비의존적 NK 세포 분열능을 확인하기 위하여, SL-K01 세포 및 NK111 세포를 2x10⁵ cells/mL 농도로 250 U/mL IL-2 유무 조건에서 48시간 주기로 배양한 후 세포를 회수하여 트립판 블루 염색법(Trypan Blue)으로 생존 세포 수를 측정하였다. 도 10a에서 확인할 수 있듯이, SL-K01 세포는 IL-2 결핍조건에서는 세포증식이 이루어지지 않으나, IL-2 처리 조건에서는 세포 성장을 확인할 수 있었다. mbIL-15을 도입한 NK111 세포는 IL-2 처리 조건에서 SL-K01과 유사하게 증식함을 관찰하였다. IL-2 결핍조건에서도 일정한 PDL을 유지하며 증식하는 것을 관찰하였다(도 10a). 해당 결과는 NK111 기반 세포주 치료제의 경우 배양보조제인 IL-2의 결핍 조건만으로도 높은 생산성을 가질 수 있음을 시사한다. 아울러, NK101, SL-K01, NK111 세포주에서 자연 살상 세포 활성화 수용체 중 하나인 CD314(NKG2D)의 발현이 유세포 분석에 의해 확인되었다(도 10b).

9-2: 암세포 사멸능 분석

mbIL-15 도입에 따른 NK111 세포의 세포 사멸능 확인을 위하여 IM9(인간 림프아세포)와 공배양을 수행하였다. CTV로 표지한 IM9 세포에 SL-K01 세포 및 NK111 세포와 함께 5-FC를 처리하여 48시간 배양 후 유세포 분석법으로 세포 사멸 효과를 확인하였다. mbIL-15이 도입된 NK111 세포는 표적세포에 대한 암세포 사멸능이 증가하였으며, 5-FC를 처리한 실험군에서는 세포사멸이 현저히 증가하였다(도 10c).

9-3: TGFβ1에 의한 세포사멸 저해 영향 분석

아울러, 본 발명자들은 환자의 체내에 다량 존재하는 면역억제 인자로 잘 알려진 TGFβ1 면역억제 효과가 NK111 세포에 도입된 TGFβRIIΔcyto에 의하여 저해되는지의 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. CTV로 표지한 OVCAR-3(인간 난소암), THP-1(급성골수성백혈병) 세포와 효과기 세포인 SL-K01 및 NK111 세포를 3x10⁵cells/mL의 농도로 준비하여 24-웰 플레이트에 1 mL씩 분주한 뒤(E:T=1:1), 각각 0, 0.3, 1, 3, 및 10 μg/mL의 TGFβ1를 처리하여, 5% CO₂, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 결과, 도 10d에서 확인할 수 있듯이, SL-K01 세포는 TGFβ1의 농도가 높아짐에 따라 암세포 사멸능이 감소하였으나, NK111 세포의 경우 TGFβ1에 의한 활성 억제 효과가 없거나 미미한 수준으로 분석되었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 SL-K01 세포는 모세포주인 NK101의 주된 특징은 그대로 유지하면서도 모세포주인 NK101과 비교하여 암세포사멸능이 현저히 증가하였고, 상기 SL-K01의 성능을 더 강화시킨 NK111 세포는 암세포 살상능이 SL-K01 세포에 비해 현저하게 증가하였을 뿐만 아니라, TGFβ로 인한 세포살상능의 저해를 회피할 수 있어서 체내 투여시 매우 효율적인 암 치료제로 사용이 가능할 것으로 기대가 된다.

실시예 10: anti-EpCAM scFV-CAR 유전자 컨스트럭트의 제조

본 발명자들은 키메라 항원 수용체(이하, 'CAR'라 약칭함)를 발현하는 NK111 세포주를 제조하기에 앞서, 항-EpCAM 단일클론항체의 가변영역과 NK 세포 활성화 인자를 연결시킨 키메라 항원 수용체 발현 렌티바이러스 벡터를 제조하였다.

구체적으로 항-EpCAM 단일클론항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄가변영역을 링커로 연결시킨 단일쇄 가변단편(scFv, 서열번호 3)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 4)를 클로닝한 후, 상기 폴리뉴클레오타이드와 인간 IgD의 변형 힌지(hinge), IgG4의 CH2 및 CH3 부위로 구성되는 변형 FC 단백질(서열번호 5)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 6), 인간 CD28 막통과도메인(서열번호 7)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 8), DAP10 단백질(서열번호 9)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 10), DAP12 단백질(서열번호 11)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 12) 및 인간 CD3ζ 세포질 도메인(서열번호 13)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 14)가 순차적으로 연결된 유전자 컨스트럭트를 상기 항-EpCAM 단일쇄 가변단편(scFv)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 연결하였으며, 이를 'anti-EpCAM scFv-CAR 유전자 컨스트럭트(서열번호 2)'로 명명하였다(도 11). 이어, 상기 제작된 anti-EpCAM scFv-CAR 유전자 컨스트럭트를 렌티바이러스 제조용 트랜스퍼 벡터 pWPT에 삽입시켜 pWPT/anti-EpCAM scFv-CAR 벡터를 제조하였다.

실시예 11: anti-EpCAM-CAR 렌티바이러스의 제조

렌티바이러스 생산을 위하여, 상기 실시예 10에서 제조된 12 ㎍의 pWPT/anti-EpCAM scFv-CAR와 패키징 플라스미드 psPAX2 12 μg 및 외피 플라스미드 pMD2.G 2.4 μg을 리포펙타민(Lipofectamine; Invitrogen, USA)과 혼합하여 Lenti-X 293T 세포(Clontech, USA)에 형질도입하였다. 37℃에서 6시간 배양 후, 배지를 제거하고 신선한 성장배지를 첨가하였다. 세포를 추가로 48시간 배양 후, 배지 내에 생선된 렌티바이러스를 수거하여 5분간 원심분리(4℃, 4000 rpm)하고 상층액을 취한 후 0.45 μm 필터(Millipore, USA)를 이용하여 세포 찌꺼기들을 제거하였다. 렌티바이러스를 농축하기 위하여 여과된 렌티바이러스 상층액에 Lenti-X concentrator(Clontech, USA) 시약을 넣은 후 4℃에서 밤새 보관하였다. 최종단계로, 렌티바이러스-concentrator 혼합액을 4000 rpm에서 60분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 펠렛 형태로 회수된 렌티바이러스를 1~2 mL의 배양액으로 희석하고 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.

실시예 12: anti-EpCAM scFV-CAR 발현 NK111 세포주의 제조

상기 EpCAM 표적 키메라 항원 수용체를 발현하는 NK111 세포주를 제작하기 위하여, 상기 실시예 11에서 제조된 anti-EpCAM scFv-CAR 렌티바이러스 및 프로타민 설페이트(protamine sulfate)를 이용하여 37℃에서 4시간동안 반응시켜 상기 실시예 8에서 제조된 NK111 세포에 감염시켰다. 총 2번의 감염과정을 수행한 후, 감염 72시간 후 키메라 항원 수용체의 발현을 유세포 분석법으로 확인하고, 1주일 뒤 형광활성세포분류기(fluorescence activated cell sorter)를 이용하여 항-EpCAM 키메라 항원 수용체를 발현하는 NK111 세포만을 선택적으로 분리하였다. 분리 후 증식한 세포주에서 키메라 항원 수용체의 발현을 유세포 분석법을 통해 세포 표면에서의 키메라 항원 수용체 발현을 측정하였다(도 12a).

그 결과 도 12a에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따라 제조된 anti-EpCAM scFv-CAR가 NK111 세포 표면에서 과발현되고 있음을 확인할 수 있다.상기 과정에서 제조된 본 발명의 항-EpCAM 키메라 항원 수용체의 세포 내 발현을 검증하기 위하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. anti-EpCAM scFv-CAR 발현 NK 세포주의 용해물로부터 정량한 단백질 50 ㎍을 환원조건 또는 비환원조건으로 8% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 분리하였다. 전기영동한 겔을 미리 적셔둔 다공성 패드(porous pad)와 3MM 페이퍼(Whatman laboratory Products, Maidstone, UK) 위에 올려놓고 그 위에 PVDF 막(PVDF Western Blottng Membrane, Roche)과 3MM 페이퍼(Whatman), 다공성 패드를 공기 방울이 생기지 않게 잘 덮고 전이 카세트(transfer cassette)로 압착하였다. 이것을 전극 전이 키트(electrode transfer kit)에 넣고 전이완충액(2.5mM Tris, 6.9mM 글리신, 20% 메탄올)에 완전히 잠기게 한 후 전기영동하였다. 단백질이 완전하게 전기영동된 막을 차단용액(blocking solution)[TBS-T(1% Tween 20) 내 5% 탈지분유]에 넣고 1시간 동안 진탕 배양하였다. TBS-T(0.1% Tween 20)로 차단용액을 30분 동안 세척한 후, 일차 항체인 항 CD3ξ 단일클론항체를 TBS-T(0.1% Tween 20)에 1/1,000로 희석하여 넣고 4℃에서 16시간 동안 진탕 배양하였다. TBS-T(0.1% Tween 20)로 막을 10분 동안 3회에 걸쳐 헹구어준 후, 이차 항체(Anti-mouse Ig(H+L), horseradish peroxidase linked conjugate; cat# 170-6516, Biorad, USA)를 1/3,000으로 희석하여 넣고 실온에서 2시간 동안 진탕 배양하였다. TBS-T(0.1% Tween 20)로 막을 20분 동안 3회 헹구어 준 후, 막에 웨스턴 검출용액(western detection solution)을 도포한 후 암실에서 필름에 감광시켜 현상하였다(도 12b).

결과 도 12b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따라 제조된 anti-EpCAM scFv-CAR가 NK111 세포주에서 발현 되고 있음을 확인할 수 있다. 이에, 본 발명자들은 상기 anti-EpCAM scFv-CAR를 발현하는 유전자 변형 NK 세포주를 "SL-K10"으로 명명하였다.

실시예 13: SL-K10 세포의 다양한 특성 분석

13-1: SL-K10의 증식능 분석

상기 실시예 12에서 제조된 SL-K10 세포의 IL-2 비의존적인 NK 세포 분열능을 확인하기 위하여, SL-K10 세포를 IL-2가 결핍된 NK media에서 48~72 시간 주기로 배양한 후 세포를 회수하여 트립판 블루 염색법(Trypan Blue)으로 생존 세포 수를 측정하였다. 도 13에서 확인할 수 있듯이, SL-K10 세포는 IL-2 결핍조건에서도 일정한 군집배가율(PDL)을 유지하며 증식하는 것을 관찰하였다.

13-2: 장기계대 안정성 시험

본 발명자들은 상기에서 구축된 SL-K10 연구용 세포은행(RCB)으로부터 임상시험용 세포은행(MCB) 및 최종 제품생산용 세포은행(WBC) 생산 시점까지 고려하여 장기계대배양시 안정성 분석을 수행하였다.

이를 위해 SL-K10 세포주를 NK media에서 50일 가량 장기 계대 배양하였다. 계대는 초기 해동 직후 2일을 제외하고는 3일 주기로 하였고, 15계대 뒤, 유세포 분석을 이용하여 도입유전자 및 NK 특성과 관련된 표지인자에 대한 유세포 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 13b에서 확인되는 바와 같이, 도입 유전자인 CD7, CD28, TGFβRII, mbIL-15, 및 EpCAM-CAR가 SL-K10 세포 표면에서 발현되며, 도입유전자의 발현이 장기계대 시에도 유지됨을 확인할 수 있었다.

뿐만 아니라, 도 13c에서 확인되는 바와 같이, 모든 NK 활성 관련 표지자 모두 장기 계대 시에도 안정적으로 발현됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 SL-K10 세포주는 세포치료제의 생산에 매우 적합한 세포주임을 알 수 있다.

실시예 14: SL-K10 세포의 항암 활성 분석

14-1: 시험관내 항암활성 분석

본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 SL-K10 세포주가 암세포 사멸에 있어서 효과가 있는 지를 in vitro 상에서 확인하기 위하여, 암세포와 SL-K10 세포를 함께 배양하여 세포사멸이 일어난 세포와 죽은 세포를 분석하였다. 암세포로는 EpCAM이 고발현되는 RMG-1 및 EpCAM이 발현되지 않는 KOC-2S 난소암 세포를 선정하였다. RMG-1 및 KOC-2S 세포의 EpCAM 발현 양상은 유세포 분석을 이용하여 검증하였다(도 14a).

구체적으로, 암세포 특이적인 세포사멸을 확인하기 위하여 CFDA (caroxyfluorescein diacetate)를 표시한 암세포 주를 24 well plate에 300,000 cells/ ml 농도로 파종하였다. 이후 SL-K10 세포 및 대조군 NK101 및 NK111 세포를 다양한 효과기 세포 대 표적 세표 비율(E:T 비율 : 1:1, 2:1, 4:1)로 1 ml 배지에 부유한 후 상기 암세포와 24시간 동안 함께 배양하였다. 배양 이후 모든 세포를 모은 뒤 각 웰로부터 세포를 회수하여 원심분리한 후, 세포 펠렛을 FACS 완충액으로 현탁시켰다. 다시 원심분리하여 형성된 세포 펠렛을 1 ㎕ LIVE/DEAD^® Fixable Near-IR Dead Stain Kit(Life Technologies)를 희석한 100 ㎕의 FACS 완충액에 현탁시켜, 4℃에서 20분간 반응하였다. FACS 완충액으로 2번 세척한 뒤, 1X Annexin V binding buffer 100 ㎕에 Annexin V APC 5 ㎕(Biolegend, USA)를 희석한 용액에 세포 펠렛을 현탁시켜, 실온에서 20분간 반응하였다. 세포의 사멸 여부는 유세포 분석법을 이용하여 생존 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-음성), 초기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-음성), 후기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-양성), 괴사(necrotic) 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-양성)으로 구분하였다(도 14b).

그 결과, 도 14b에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따른 SL-K10 세포주는 EpCAM 과발현 세포인 RMG-1에 대해서 대조군 NK101 및 NK111에 비해 현저히 높은 세포 살상능을 보이는 반면, EpCAM 미발현 세포인 KOC-2S 세포에 대해서는 NK101 및 NK111와 동등한 세포 살상능을 보임을 확인하였다. 뿐만 아니라, 상기 실험에서 수득한 공배양 상등액을 이용하여 ELISA 법으로 NK 세포의 세포독성 및 면역활성화에 관여하는 그랜자임 B 및 IFN-γ 분비량을 측정한 결과, 도 14c에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 SL-K10 세포주는 EpCAM 과발현 세포인 RMG-1에 대해서 대조군인 NK111 세포에 비해 현저히 높은 그랜자임 B 및 IFN-γ 분비량을 보이는 반면, EpCAM 미발현 세포인 KOC-2S 세포에 대해서는 NK111 세포와 유사한 그랜자임 B 및 IFN-γ 분비량을 보임을 확인하였다.

이는 SL-K10 세포의 암세포 EpCAM 발현 특이적 살상 효과 및 사이토카인 분비능을 증명하는 결과이다.

14-2: 방사선 조사에 따른 세포 특성 변화 여부 분석

본 발명의 일 실시예에 따른 SL-K10 세포주는 NK 림프종 유래 세포주인 NK101에 렌티바이러스를 이용한 유전자 도입을 수행한 세포이므로, 치료제로 이용되기 위해서는 방사선 조사를 통해 세포 성장을 억제하여 종양원성을 제거함과 동시에 동등한 정도의 항암 활성을 유지하여야 한다. 이를 검증하기 위하여, 본 발명자들은 SL-K10 세포주에 5 Gy 또는 10 Gy의 감마 방사선을 조사한 뒤, 세포의 성장 억제, 도입유전자 및 NK 특성과 관련된 표지인자의 발현양상 및 암세포 살상능을 평가하였다.

그 결과, 도 14d에서 확인되는 바와 같이, 방사선을 조사하지 않은 SL-K10 세포는 지속적으로 증식하는 반면, 5 Gy 또는 10 Gy 방사선을 조사한 SL-K10 세포는 세포성장이 저해되어 약 96 시간 이후 대부분의 NK 세포가 사멸됨을 확인하였다. 단, 10 Gy의 방사선이 조사되었을 때, 세포 생존률이 7일째 0%에 도달함을 확인하였다.

또한, 도 14e에서 확인되는 바와 같이, 도입유전자인 EpCAM-CAR 및 NK 활성 관련 표지자인 CD56, NKG2D, NKp30, 및 2B4 모두 10 Gy 방사선 조사 후에도 안정적으로 유지됨을 확인할 수 있었다.

뿐만 아니라, 도 14f에서 확인되는 바와 같이, 10 Gy의 방사선을 조사한 SL-K10 세포주는 EpCAM 과발현 세포인 RMG-1에 대해서 대조군 NK101 및 NK111에 비해 현저히 높은 세포 살상능을 보이는 반면, EpCAM 미발현 세포인 KOC-2S 세포에 대해서는 NK101 및 NK111와 동등한 세포 살상능을 보여, 방사선 조사 후에도 방사전 조사 전과 동등한 살상능을 가짐을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 SL-K10 세포주는 방사선 조사를 통해 체내 증식에 대한 우려 없이, 체내의 암세포를 제거하는 용도로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

14-3: 생체내 항암활성 분석

본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 SL-K10 세포주가 실제 생체내 조건에서도 유의한 항암활성을 나타내는지 확인하기 위해, 이종이식(xenograft) 종양 모델 마우스를 이용하여 SL-K10 세포주의 항암 활성을 분석하였다.

구체적으로, EpCAM 및 루시퍼레이즈를 발현하는 인간 난소암세포주인 RMG-1-luc-EGFP 5x10⁶cell을 7주령의 면역력 제거 실험쥐(NSG)에 복강접종하고 7일 경과 후, 대조군(성장 배지), 및 10 Gy의 방사선을 조사한 SL-K10 세포 5x10⁶cell을 정맥내 또는 복강내 2일 간격으로 네 차례 투여한 후 암세포에서 방사되는 루시퍼레이즈에 의한 생물발광 정도를 투여시점부터 1주일 간격으로 네 차례 측정함으로써 본 발명의 일 실시예에 따른 SL-K10 세포주의 in vivo 항암 활성을 조사하였다(도 15a).

그 결과, 도 15b에서 확인되는 바와 같이, 정맥투여 및 복강투여 모두에서도 매우 우수한 생체내 항암활성이 확인되었다. 특히, 복강투여시 암세포가 거의 자라지 않았음을 알 수 있었다.

아울러, 본 발명자들은 다중투여에 따른 효과 및5-FC와의 병용투여에 따른 항암 활성능 증진 여부를 확인하기 위해, 상기 도 15b에서 더 좋은 효과가 확인된 복강내 투여 경로를 채택하여 투여량을 증가하여 반복 투여 및 5-FC 병용 처리 시의 항암활성을 비교분석하였다.

구체적으로 EpCAM 및 루시퍼레이즈를 발현하는 인간 난소암세포주인 RMG-1-luc-EGFP 5x10⁶cell을 7주령의 면역력 제거 실험쥐(NSG)에 복강접종하고 7일 경과 후, 10 Gy의 방사선을 조사한 SL-K10 및 대조군 NK111 세포주를 3x10⁷ cells의 투여량으로 3일 또는 4일 간격으로 총 8회 투여한 후 4주간 SL-K10 세포 투여시점부터 7일, 14일, 21일 및 28일째에 암세포에서 방사되는 생체내 생물발광 정도를 측정함으로써, 암세포의 성장 정도를 분석하였다. 또한, 5-FC 병용 처리군의 경우, 500 mg/kg의 5-FC를 SL-K10 세포 투여시점부터 28일째까지 매일 복강투여 하였다(도 15c). 상기 생체내 생물발광 이미지는 마취된 실험동물을 냉각된 전하쌍 장치 카메라를 장착한 IVIS 이미지시스템(Caliper Life Sciences, USA)의 광차단 챔버에 둔 후, 암세포로부터 방출된 광자를 포집하여 1분동안 통합하였고, 광자수를 가리키는 가상색 이미지를 Living Image software v. 2.50(Caliper Life Science, USA)를 이용하여 수득한 마우스의 이미지 위에 중첩시킴으로써 수득하였다.

그 결과, 도 15d 및 도 15e에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따른 SL-K10 세포는 3x10⁷ cells의 투여량으로 반복 투여시 동일량을 투여한 NK111 대조군 대비 암세포의 생장이 현저하게 억제됨을 알 수 있었다. 또한, 5-FC 병용 투여시 SL-K10 단독투여군 대비 월등히 뛰어난 암세포 성장 억제능을 보여, SL-K10 투여 시점 대비 암세포가 전혀 자라지 않았음을 확인하였다.

이는 세포자살 유전자 발현, 키메라 항원 수용체 도입 면역세포와 전구물질 병용투여를 통해 암세포 사멸 유도의 시너지를 실험적으로 입증한 최초의 사례이다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 anti-EpCAM CAR 발현 유전자 변형 NK111 세포주는 유전자 조작에도 불구하고 장기간 계대시 모세포주의 특성이 그대로 유지되면서도 시험관내 조건은 물론 생체내 조건에서 EpCAM 고발현 종양에 대한 매우 효과적인 항암활성을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주는 종래 CAR 컨스트럭트를 이용한 항암치료의 한계를 돌파하여 고형암에 대한 면역치료제로 매우 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 예상된다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1: 주사제의 제조

유전자 재조합 SL-K10 세포 1x10⁸ 내지 5x10¹² cells

pH 조절제 적량

안정화제 적량

주사용 멸균 증류수 100% 까지

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> SLBIGEN Inc. <120> Genetically engineered NK cell lines transduced with a polynucleotide encoding novel chimeric antigen receptor and use thereof <130> PD19-5785 <150> KR 10-2018-0034079 <151> 2019-03-23 <160> 27 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EpCAM scFv-CAR protein <400> 1 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 115 120 125 Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly 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ccgtgctgca ccaggattgg cttaatggca aggagtacaa gtgcaaggtg 1080 tcaaacaagg gcctgccttc atccattgag aagaccatca gcaaggccaa gggacagcca 1140 agagaaccac aggtttatac cctgccacca tcccaagaag agatgacaaa gaatcaagtt 1200 agccttacct gccttgtgaa gggcttttac cctagcgata ttgccgttga gtgggaatcc 1260 aatggccagc cagaaaataa ctacaagacc acacctcctg ttctggatag cgatggctcc 1320 ttctttctgt attcccgcct taccgtggat aagagccgct ggcaggaagg aaatgttttc 1380 agctgctccg ttctgcatga ggctcttcat aaccactaca cccagaagag cctgtccctc 1440 agtcttggca agttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg 1500 ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtggcacgcc cacgccgcag ccccgcccaa 1560 gaagatggca aagtctacat caacatgcca ggcaggggcg gccggctggt ccctcggggg 1620 cgaggggctg cggaggcagc gacccggaaa cagcgtatca ctgagaccga gtcgccttat 1680 caggagctcc agggtcagag gtcggatgtc tacagcgacc tcaacacaca gaggccgtat 1740 tacaaaagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1800 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1860 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1920 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1980 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggcctcag tacagccacc 2040 aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 2085 <210> 3 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EpCAM scFv <400> 3 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 115 120 125 Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser 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agcctacctc 300 cagatcaaca acctgaagaa cgaggacaca gccacctact tctgcgctag gacagccgtg 360 tactggggac agggcacaac cctgaccgtg tcctccggct ccacctccgg ctccggcaag 420 cctggctccg gcgagggctc cgacatccag atgacccagt cccccagcag cctgtccgcc 480 tccctgggcg agagggtgtc cctgacctgt agggcctccc aggagatctc cggctccctg 540 tcctggctgc aacagaagcc cgacggcacc atcaagaggc tgatctacgc tgcctccacc 600 ctgaactccg gcgtgcccaa gaggttctcc ggcaggaggt ccggctccga ctactccctg 660 accatctcca gcctggagag cgaggacttc gtggactact actgcctcca gtacagcagc 720 tacccctgga gcttcggagg aggcaccaag ctggagatca ag 762 <210> 5 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified immunoglobuin Fc domain <400> 5 Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ser 1 5 10 15 His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 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Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CD28 <400> 18 atggacgcca tgaagagagg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60 agccccagcc acgccctgag gctgctgctg gccctgaacc tgttccctag catccaggtg 120 acagggaata agattctggt gaaacagtcc ccaatgctgg tcgcatacga caacgccgtg 180 aatctgtctt gcaagtacag ttataacctg ttctcacgag agtttcgggc cagcctgcac 240 aaaggcctgg attctgcagt cgaagtgtgc gtggtctacg ggaattattc ccagcagctg 300 caggtgtact ctaagacagg cttcaactgt gacggaaaac tgggcaatga gagcgtcact 360 ttttacctgc agaacctgta tgtgaatcag accgacatct atttctgtaa gatcgaagtg 420 atgtaccccc ctccatatct ggataacgaa aaatccaatg ggacaatcat tcacgtgaag 480 ggaaaacatc tgtgcccaag tcccctgttc cctggaccat caaagccttt ttgggtcctg 540 gtggtcgtgg gaggggtgct ggcctgttac tctctgctgg tcactgtggc tttcatcatc 600 ttctgggtgc ggagcaagag gtcccgcctg ctgcacagtg actatatgaa catgacccca 660 cggagacccg gccctacacg aaaacattac cagccctatg ccccccctag agatttcgcc 720 gcttacagga gc 732 <210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A self-cleaving peptide <400> 19 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 20 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding 2A self-cleaving peptide <400> 20 ggctccggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60 gggccc 66 <210> 21 <211> 372 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD::UPRT <400> 21 Met Val Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Trp Asp Gln Lys Gly Met Asp 1 5 10 15 Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro 20 25 30 Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg 35 40 45 Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu 50 55 60 Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly 85 90 95 Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Val Gly Glu Asn Val 100 105 110 Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu 115 120 125 Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Ile Met Lys Gln Phe 130 135 140 Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Trp Phe Glu Asp Ile Gly Glu Ser Ser 145 150 155 160 Glu Pro Phe Lys Asn Val Tyr Leu Leu Pro Gln Thr Asn Gln Leu Leu 165 170 175 Gly Leu Tyr Thr Ile Ile Arg Asn Lys Asn Thr Thr Arg Pro Asp Phe 180 185 190 Ile Phe Tyr Ser Asp Arg Ile Ile Arg Leu Leu Val Glu Glu Gly Leu 195 200 205 Asn His Leu Pro Val Gln Lys Gln Ile Val Glu Thr Asp Thr Asn Glu 210 215 220 Asn Phe Glu Gly Val Ser Phe Met Gly Lys Ile Cys Gly Val Ser Ile 225 230 235 240 Val Arg Ala Gly Glu Ser Met Glu Gln Gly Leu Arg Asp Cys Cys Arg 245 250 255 Ser Val Arg Ile Gly Lys Ile Leu Ile Gln Arg Asp Glu Glu Thr Ala 260 265 270 Leu Pro Lys Leu Phe Tyr Glu Lys Leu Pro Glu Asp Ile Ser Glu Arg 275 280 285 Tyr Val Phe Leu Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Gly Ser Ala Ile 290 295 300 Met Ala Thr Glu Val Leu Ile Lys Arg Gly Val Lys Pro Glu Arg Ile 305 310 315 320 Tyr Phe Leu Asn Leu Ile Cys Ser Lys Glu Gly Ile Glu Lys Tyr His 325 330 335 Ala Ala Phe Pro Glu Val Arg Ile Val Thr Gly Ala Leu Asp Arg Gly 340 345 350 Leu Asp Glu Asn Lys Tyr Leu Val Pro Gly Leu Gly Asp Phe Gly Asp 355 360 365 Arg Tyr Tyr Cys 370 <210> 22 <211> 1118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CD::UPRT <400> 22 atggtgaccg gcggcatggc cagcaagtgg gaccagaagg gcatggacat cgcctacgag 60 gaggccgctc tgggctacaa ggagggcggc gtgcccatcg gcggatgcct gatcaacaac 120 aaggacggca gcgtgctggg cagaggccac aacatgagat tccagaaggg cagcgccacc 180 ctgcacggcg agatcagcac cctggagaac tgcggcagac tggagggcaa ggtgtacaag 240 gacacaaccc tgtacaccac actgagcccc tgcgacatgt gcaccggcgc catcatcatg 300 tacggcatcc ccagatgcgt ggtgggcgag aacgtgaact tcaagagcaa gggcgagaag 360 tacctgcaga ccagaggcca cgaggtggtc gtcgtggacg acgagagatg caagaagatc 420 atgaagcagt tcatcgacga gagaccccag gactggttcg aggacatcgg cgagagcagc 480 gagcccttca agaacgtgta cctgctgccc cagaccaacc agctgctggg cctgtacacc 540 atcatcagaa acaagaacac caccagaccc gacttcatct tctacagcga cagaatcatc 600 agactgctgg tggaggaggg cctgaaccac ctgcccgtgc agaagcagat cgtggagacc 660 gacaccaacg agaacttcga gggcgtgagc ttcatgggca aaatctgcgg cgtgagcatc 720 gtgagagccg gcgagagcat ggagcagggc ctgagagact gctgcagaag cgtgagaatc 780 ggcaagatcc tgatccagag agacgaggag accgccctgc ccaagctgtt ctacgagaag 840 ctgcccgagg acatcagcga gagatacgtg ttcctgctgg accccatgct ggccaccggc 900 ggcagcgcca tcatggccac cgaggtgctg atcaagagag gcgtgaagcc cgagagaatc 960 tacttcctga acctgatctg cagcaaggag ggcatcgaga agtaccacgc tgccttcccc 1020 gaggtgagaa tcgtgaccgg cgccctggac agaggcctgg acgagaacaa gtacctggtg 1080 cccggcctgg gcgacttcgg cgacagatac tactgcgt 1118 <210> 23 <211> 575 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal ribosome entry site (IRES) <400> 23 cccctctccc ccccctaacg ttactggccg aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt 60 tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc 120 tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca 180 aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac 240 gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg 300 ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt 360 gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca agcgtattca acaaggggct 420 gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat ctggggcctc ggtgcacatg 480 ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt 540 ggttttcctt tgaaaaacac gatgataata tggcc 575 <210> 24 <211> 204 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane bound IL-15 (mIL-15) <400> 24 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 20 25 30 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 35 40 45 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 50 55 60 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 65 70 75 80 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 100 105 110 Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val 115 120 125 Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 130 135 140 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 145 150 155 160 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 165 170 175 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 180 185 190 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 195 200 <210> 25 <211> 612 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding membrane bound IL-15 (mIL-15) <400> 25 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccgaactggg tgaatgtaat aagtgatttg aaaaaaattg aagatcttat tcaatctatg 120 catattgatg ctactttata tacggaaagt gatgttcacc ccagttgcaa agtaacagca 180 atgaagtgct ttctcttgga gttacaagtt atttcacttg agtccggaga tgcaagtatt 240 catgatacag tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat 300 gtaacagaat ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt 360 ttgcagagtt ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca cttctaccac gacgccagcg 420 ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 480 gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 540 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 600 accctttact gc 612 <210> 26 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TGFbeta recptor II cytoplamic domain deleted <400> 26 Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 20 25 30 Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 35 40 45 Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 50 55 60 Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 65 70 75 80 Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 85 90 95 Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 130 135 140 Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu 145 150 155 160 Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu 165 170 175 Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val 180 185 190 <210> 27 <211> 573 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding TGFbeta recptor II cytoplamic domain deleted <400> 27 atgggtcggg ggctgctcag gggcctgtgg ccgctgcaca tcgtcctgtg gacgcgtatc 60 gccagcacga tcccaccgca cgttcagaag tcggttaata acgacatgat agtcactgac 120 aacaacggtg cagtcaagtt tccacaactg tgtaaatttt gtgatgtgag attttccacc 180 tgtgacaacc agaaatcctg catgagcaac tgcagcatca cctccatctg tgagaagcca 240 caggaagtct gtgtggctgt atggagaaag aatgacgaga acataacact agagacagtt 300 tgccatgacc ccaagctccc ctaccatgac tttattctgg aagatgctgc ttctccaaag 360 tgcattatga aggaaaaaaa aaagcctggt gagactttct tcatgtgttc ctgtagctct 420 gatgagtgca atgacaacat catcttctca gaagaatata acaccagcaa tcctgacttg 480 ttgctagtca tatttcaagt gacaggcatc agcctcctgc caccactggg agttgccata 540 tctgtcatca tcatcttcta ctgctaccgc gtt 573

Claims

하기 특성을 갖는 분리된 NK 세포주에 EpCAM 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질도입되어 상기 EpCAM 특이적 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전자 변형 NK 세포주:
CD2, CD11a, CD25, CD45, CD54, DNAM-1, CD62L 및 CD56은 양성; 및
CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD20, CD23, CD34, TCRαβ 및 TCRγδ는 음성이고,
상기 CD56의 표현형은 CD56^dim이며, 배가시간은 18 내지 32시간이고, 배양시 군집(spheroid)를 형성함.
제1항에 있어서,
상기 EpCAM 특이적 키메라 항원 수용체는 EpCAM에 특이적으로 결합하는 scFv, 변형 Ig Fc 도메인, CD28 막통과 도메인, DAP10, DAP12 및 T 세포 수용체의 CD3ζ 도메인으로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
제2항에 있어서,
상기 scFv는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
제2항에 있어서,
상기 변형 Ig Fc 도메인은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
제2항에 있어서,
상기 CD28 막통과 도메인은 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
제2항에 있어서,
상기 DAP10은 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
제2항에 있어서,
상기 DAP12는 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
제2항에 있어서,
상기 T 세포 수용체의 CD3ζ 도메인은 서열번호 13으로 구성되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
제1항에 있어서,
상기 EpCAM 특이적 키메라 항원 수용체는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
제1항에 있어서,
NK 세포 보조활성화 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가적으로 형질도입되어 상기 NK 세포 보조활성화 인자가 발현되는, 유전자 변형 NK 세포주.
제10항에 있어서,
상기 NK 세포 보조활성화 인자는 Ly49, NCR(natural cytotoxicity receptor), CD7, CD16 및 CD28로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 유전자 변형 NK 세포주.
제11항에 있어서,
상기 NK 세포 보조활성화 인자는 CD7 및/또는 CD28인, 유전자 변형 NK 세포주.
제10항에 있어서,
적어도 하나 이상의 NK 세포 증식 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 형질도입된, 유전자 변형 NK 세포주.
제13항에 있어서,
상기 NK 세포 증식 인자는 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 사이토카인 또는 상기 사이토카인의 변이체인, 유전자 변형 NK 세포주.
제14항에 있어서,
상기 IL-15는 막결합 IL-15인, 유전자 변형 NK 세포주.
제10항에 있어서,
세포자살 유전자가 추가로 형질도입되는, 유전자 변형 NK 세포주.
제16항에 있어서,
상기 세포자살 유전자는 우라실 포스포리보실전이효소(UPRT) 유전자, 헤르페스 단순포진 바이러스 티미딘 인산화 유전자(HSV TK), 바리셀라 조스터 바이러스 티미딘 인산화효소(VZV TK) 유전자, 시토신 디아미네이즈 유전자, 카르복실 에스터레이즈 유전자, 니트로리덕테이즈 유전자, 카르복시펩티데이즈 G2 유전자, 또는 유도성 카스페이즈 9(iCas9)유전자인, 유전자 변형 NK 세포주.
제10항에 있어서,
세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 형질도입되는, 유전자 변형 NK 세포주.
제18항에 있어서,
상기 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체는 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체II인, 유전자 변형 NK 세포주.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 치료적으로 유효한 양의 상기 유전자 변형 NK 세포주를 유효성분으로 함유하는 암치료용 세포치료제.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 유전자 변형 NK 세포주 및 자살유도제를 포함하는 암 치료용 키트.
제21항에 있어서,
상기 자살유도제는 상기 세포자살 유전자가 HSV TK 또는 VZV TK일 경우에는 각각 간시클로비르(gancyclovir) 또는 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오사이드(6-methoxypurine arabinonucleoside)이고, 상기 세포자살 유전자가 시토신 디아미네이즈인 경우 5-플루오로시토신(5-FC)이며, 상기 세포자살 유전자가 카르복실 에스터라제인 경우 이리노테칸(CPT-11)이고, 상기 세포자살 유전자가 니트로리덕테이즈인 경우 5(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤자마이드(CB1954)이며, 상기 세포자살 유전자가 카르복시펩티데이즈 G2인 경우 4-[(2-클로로에틸)(2-메실록시에틸)아미노]벤조일-엘-글루탐산(CMDA)이고, 상기 세포자살 유전자가 iCas9인 경우 iCas9 이량화제(dimerizer)인, 암 치료용 키트.
치료적으로 유효한 양의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 유전자 변형 NK 세포주 및 선택적으로 자살유도제를 암의 치료를 필요로 하는 인간을 제외한 포유동물 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료 방법.
제23항에 있어서,
상기 자살유도제는 상기 세포자살 유전자가 HSV TK 또는 VZV TK일 경우에는 각각 간시클로비르(gancyclovir) 또는 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오사이드(6-methoxypurine arabinonucleoside)이고, 상기 세포자살 유전자가 시토신 디아미네이즈인 경우 5-플루오로시토신(5-FC)이며, 상기 세포자살 유전자가 카르복실 에스터라제인 경우 이리노테칸(CPT-11)이고, 상기 세포자살 유전자가 니트로리덕테이즈인 경우 5(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤자마이드(CB1954)이며, 상기 세포자살 유전자가 카르복시펩티데이즈 G2인 경우 4-[(2-클로로에틸)(2-메실록시에틸)아미노]벤조일-엘-글루탐산(CMDA)이고, 상기 세포자살 유전자가 iCas9인 경우 iCas9 이량화제(dimerizer)인, 암 치료 방법.
제23항에 있어서,
상기 암은 혈액암 또는 고형암인, 암 치료 방법.
제25항에 있어서,
상기 고형암은 간암, 폐암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 담낭암, 위암, 담도암, 대장암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 뇌종양, 악성 흑색종, 전립선암, 고환암, 또는 설암인, 암 치료 방법.