NO312769B1 - Isolert DNA-sekvens, fremgangsmåte for fremstilling av et renset pattedyr-TNF-R-protein - Google Patents

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert DNA-sekvens, fremgangsmåte for fremstilling av et renset pattedyr-TNF-R-protein.

Tumornekrosefaktor-a (TNFa, også kjent som cachectin) og tumornekrosefaktor-p (TNFp, også kjent som lymfotoksin) er homologe, endogene, sekretoriske pattedyrproteiner som er i stand til å indusere mange forskjellige virkninger på et stort antall celletyper. De store likheter ved de strukturelle og funksjonelle kjennetegn til disse to cytokiner har resultert i deres felles betegnelse som "TNF". Komplementære cDNA-kloner som koder for TNFa (Pennica et al., Nature 312:724, 1984) og TNFp (Gray et al., Nature 312:721, 1984), er blitt isolert, noe som muliggjør ytterligere strukturell og biologisk karak-terisering av TNF.

TNF-proteiner initierer sin biologiske virkning på celler ved binding til bestemte TNF-reseptorproteiner (TNF-R) uttrykt på plasmamembranen til en TNF-responsiv celle. TNFa og TNFp ble først påvist å bindes til en felles reseptor på den humane livmorhals-carcinomcellelinje ME-180 (Aggarwal et al., Nature 318:665, 1985). Estimater av størrelsen til TNF-R bestemt ved affinitetsmerkingsundersøkelser, varierte fra 54 til 175 kDa (Creasey et al., Proe. Nati. Rcad. Sei. USA 84:3293, 1987; Stauber et al., J. Biol. Chem. 263:19098, 1988; Hohmann et al., J. Biol. Chem. 264:14927, 1989). Selv om slektskapet mellom disse TNF-R-er med forskjellig molekylvekt er uklar, rapporterte Hohmann et al. (J. Biol. Chem. 264:14927, 1989) at minst to forskjellige celleoverflatereseptorer for TNF fore-ligger på forskjellige celletyper. Disse reseptorene har en tilsynelatende molekylvekt på henholdsvis ca. 80 kDa og ca. 55-60 kDa. Ingen av publikasjonene ovenfor rapporterte imidlertid rensing av celleoverflate-TNF-reseptorer inntil homo-genitet .

I tillegg til celleoverf latereseptorer for TNF er det også blitt identifisert oppløselige proteiner fra humanurin som er i stand til å binde TNF (Peetre et al., Eur. J. Haematol. 41:414, 1988; Seckinger et al., J. Exp. Med.

167:1511, 1988; Seckinger et al., J. Biol. Chem. 264:11966, 1989; GB patentsøknad med publikasjonsnr. 2 218 101 A, Seckinger et al.; Engelmann et al., J. Biol. Chem. 264:11974, 1989). Det oppløselig TNF-bindende protein fra urin beskrevet i GB 2 218 101 A, har en partiell N-ende-aminosyresekvens Asp-Ser-Val-Cys-Pro-, som svarer til den partielle sekvens beskrevet senere av Engelmann et al. (1989). Slektskapet mellom de ovenfor nevnte, oppløselige, bindende proteiner fra urin ble ytterligere belyst etter at den opprinnelige stamsøknad (US patentsøknad nr. 403 241) til foreliggende søknad var innlevert, da Engelmann et al. rapporterte identifiseringen og rensingen av et andre distinkt, oppløselig TNF-bindende protein fra urin som hadde en N-endeaminosyresekvens Val-Ala-Phe-Thr-Pro- (J. Biol. Chem. 265:1531, 1990). De to urinproteinene beskrevet i GB 2 218 101 A og publikasjonene til Engelmann et al., ble påvist å være immunokjemisk beslektet med to tilsynelatende distinkte celleoverflateproteiner ved evnen til anti-serum mot de bindende proteiner når det gjelder å inhibere TNF-binding til visse celler.

Senere rapporterte to separate grupper den molekylære kloning og ekspresjon av en human 55 kDa TNF-R (Loetscher et al., Cell 61:351, 1990; Schall et al., Cell 61:361, 1990). TNF-R til begge gruppene har en N-endeaminosyresekvens som svarer til den partielle aminosyresekvens til det bindende protein fra urin beskrevet i GB 2 218 101 A, Engelmann et al.

(1989) og Engelmann et al. (1990).

For å belyse slektskapet mellom de mange formene av TNF-R og oppløselige, TNF-bindende proteiner fra urin, eller for å undersøke de strukturelle og biologiske kjennetegn til TNF-R-er og den rolle som spilles av TNF-R-er ved responsene til forskjellige cellepopulasjoner på TNF eller annen cytokin-stimulering, eller for å bruke TNF-R-er effektivt i terapi, diagnose eller analyse, trengs rensede preparater av TNF-R. Slike preparater er imidlertid bare oppnåelige i praktiske utbytter ved kloning og uttrykking av gener som koder for reseptorene, under anvendelse av teknologi med bruk av rekombinant DNA. Forsøk på å rense TNF-R-molekylet for anvendelse i biokjemisk analyse, eller på å klone og uttrykke pattedyrgener som koder for TNF-R, er imidlertid blitt vanskeliggjort av mangel på en egnet kilde for reseptorprotein eller mRNA. Før foreliggende oppfinnelse var ingen cellelinje kjent for å uttrykke høye nivåer av TNF-R konstitutivt og kontinuerlig, noe som utelukket rensing av reseptor for sekvensering eller konstruksjon av genetiske biblioteker for cDNA-kloning.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en isolert DNA-sekvens, kjennetegnet ved at den koder for et biologisk aktivt pattedyr-TNF-reseptor (TNF-R)-protein utvalgt fra: (a) aminosyrene 1-x i fig. 2, hvori x er utvalgt fra aminosyrene 163-235; og (b) aminosyrene 1-233 i fig. 4.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en isolert DNA-sekvens, kjennetegnet ved at den koder for et biologisk aktivt pattedyr-TNF-reseptor (TNF-R)-protein utvalgt fra: (a) DNA-sekvenser utvalgt fra det kodende område til det native pattedyr-TNF-R-gen i fig. 2-3 eller fig. 4-5;

i (b) DNA-sekvenser som har evnen til å hybridisere til sekvensene i (a) under

middels stringente betingelser, dvs. 50 °C i 2 x SSC: og

(c) DNA-sekvenser som er degenerert som følge av den genetiske kode til sekvensene i (a) - (b).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et renset pattedyr-TNF-R-protein, kjennetegnet ved at den omfatter sammenkobling av etterfølgende aminosyrerester ved dannelsen av peptidbindinger for å danne et TNF-R-polypeptid utvalgt fra aminosyrerestene 1-x i fig. 2, hvori x er utvalgt ifra aminosyrene 163-235; og aminosyrene 1-233 i fig. 4. ,

På grunn av TNF' s evne til spesifikt å binde TNF-reseptorer (TNF-R-er) vil rensede TNF-R-preparater være anvendbare ved diagnostiske analyser med hensyn på TNF, samt ved frembringelse av antistoffer mot TNF-reseptor for anvendelse i diagnose og terapi. I tillegg kan rensede TNF-reseptorprepar-ater brukes direkte i terapi for å binde eller renske ut TNF, hvorved det tilveiebringes et middel for regulering av immun-aktivitetene til dette cytokinet.

Disse og andre aspekter ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå klart av den følgende nærmere beskrivelse.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er en skjematisk fremstilling av det kodende område til forskjellige cDNA-er som koder for human- og murin-TNF-R-er. Ledersekvensen er skravert, og transmembranområdet er utfylt. Figurene 2-3 viser den partielle cDNA-sekvens og avledede aminosyresekvenser til human-TNF-R-klon 1. Nukleotider er nummerert fra begynnelsen av det utranslaterte 5'-området. Aminosyrer er nummerert fra begynnelsen av signalpeptidsekven-sen. Den putative signalpeptidsekvens er representert ved aminosyrene -22 til -1. N-ende-leucinet i det fullt ferdige TNF-R-protein er understreket i stilling 1. Det forutsagte transmembranområde fra aminosyrene 236 til 265 er også understreket. C-endene til forskjellige oppløselige TNF-R-er er merket med en pil (T ). Figurene 4-6 viser cDNA-sekvensen og avledet aminosyresekvens til murin TNF-R-klon 11. Den putative signalpeptidsekvens er representert ved aminosyrene -22 til -1. N-ende-valinet i det fullt ferdige TNF-R-protein er understreket i stilling 1. Det forutsagte transmembranområde fra aminosyrene 234 til 265 er også understreket.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Definisjoner

Slik de her er brukt, henviser uttrykkene "TNF-reseptor" og "TNF-R" til proteiner med aminosyresekvenser som er i det vesentlige like med de naturlig forekommende pattedyr-TNF-reseptoraminosyresekvenser og som er biologisk aktive som definert nedenunder, ved at de er i stand til å binde TNF-molekyler eller omsette et biologisk signal initiert av en TNF-molekylbinding til en celle, eller kryssreagere med anti-TNF-R-antistoffer frembrakt mot TNF-R fra naturlige (dvs. ikke-rekombinante) kilder. Den fullt ferdige, fullengde-human-TNF-R er et glycoprotein med en molekylvekt på ca. 80 kilodalton (kDa). Slik det er brukt i beskrivelsen og kravene, betyr uttrykket "fullt ferdig" et protein uttrykt i en form som mangler en ledersekvens som kan være til stede i fullengde-transkripter av et naturlig forekommende gen. Eksperimenter hvor det brukes COS-celler transfektert med en cDNA som koder for fullengde-human-TNF-R, viste at TNF-R bandt 125I-TNFa med en tilsynelatende Ka på ca. 5 x IO9 M_<1>, og at TNF-R bandt 125I-TNFp med en tilsynelatende Ka på ca. 2 x IO<9> M'<1>. Uttrykkene "TNF-reseptor" eller "TNF-R" omfatter, men er ikke begrenset til, analoger eller underenheter av naturlig forekommende proteiner med minst 20 aminosyrer og som oppviser minst noen biologisk aktivitet felles med TNF-R, f.eks. oppløselige TNF-R-konstruksjoner som mangler et transmembranområde (og utskil-les fra cellen), men som bibeholder evnen til å binde TNF. Forskjellige bioekvivalentprotein- og aminosyreanaloger er beskrevet nærmere nedenunder.

Nomenklaturen for TNF-R-analoger følger, slik den her er brukt, konvensj onen for navnsetting av proteinet ( f. eks.

TNF-R) med enten hu (for human) eller mu (for murin) foran og etterfulgt av en A (for å betegne en delesjon) og nummeret til C-endeaminosyren. F.eks. henviser huTNF-RA235 til human-TNF-R med Asp<235> som C-endeaminosyren (dvs. et polypeptid med rekke-følgen av aminosyrene 1-235 ifølge figur 2). I fravær av en human- eller murin-artbetegnelse henviser TNF-R generisk til pattedyr-TNF-R. I fravær av en bestemt betegnelse for dele-sjonsmutanter betyr likeledes uttrykket TNF-R alle former av TNF-R, inkludert mutanter og analoger som har TNF-R-biologisk aktivitet.

"Oppløselig TNF-R" eller "sTNF-R" henviser, slik de er brukt i sammenheng med foreliggende oppfinnelse, til proteiner eller i det vesentlige ekvivalente analoger som har en aminosyresekvens som svarer til hele eller en del av det ekstracellulære område til en naturlig forekommende TNF-R, f.eks. huTNF-RA235, huTNF-RAl85 og huTNF-RAl63, eller aminosyresekvenser som er i det vesentlige like med sekvensene til aminosyrene 1-163, aminosyrene 1-185 eller aminosyrene 1-235 i

figur 2, og som er biologisk aktive ved at de bindes til TNF-ligand. Ekvivalente, oppløselige TNF-R-er omfatter polypeptider som er forskjellige fra disse sekvensene ved én eller flere substitusjoner, delesjoner eller addisjoner, og som bibeholder evnen til å binde TNF eller inhibere TNF-signaltransduksjonsaktivitet via celleoverflatebundne TNF-reseptorproteiner, f.eks. huTNF-RAx, hvor x er valgt fra gruppen bestående av hvilken som helst av aminosyrene 163-235 i figur 2. Analoge delesjoner kan gjøres med muTNF-R. Inhibering av TNF-signaltransduksjonsaktivitet kan bestemmes ved å transfektere celler med rekombinante TNF-R-DNA-er, hvorved man får rekombinant reseptorekspresjon. Cellene bringes så i kontakt med TNF, og de resulterende, metabolske effekter undersøkes. Dersom det fås en effekt som kan tilskrives virkningen av ligan-den, så har den rekombinante reseptor signaltransduksjonsaktivitet. Eksempelvise fremgangsmåter av hvorvidt et polypeptid har signaltransduksjonsaktivitet, er beskrevet av Idzerda et al., J. Exp. Med. 171:861 (1990); Curtis et al., Proe. Nati. Rcad. Sei. USA 86:3045 (1989); Prywes et al., EMBO J. 5:2179

(1986) og Chou et al., J. Biol. Chem. 262:1842 (1987). Alternativt vil også primære celler eller cellelinjer som uttrykker en endogen TNF-reseptor og har en påvisbar biologisk respons på TNF, kunne benyttes.

Uttrykket "isolert" eller "renset" betyr, slik det er brukt i sammenheng med denne beskrivelse og krav for å definere renheten til TNF-R-protein eller proteinpreparater, at proteinet eller proteinpreparatet er i det vesentlige fritt for andre proteiner av naturlig eller endogen opprinnelse, og inneholder mindre enn ca. 1 „vekt% proteinforurensninger som rest fra fremstillingsprosesser. Slike preparater kan imidlertid inneholde andre proteiner tilsatt som stabilisatorer, bærere, eksipienser eller samvirkende, terapeutiske midler. TNF-R isoleres dersom den er påvisbar som et signalproteinbånd i en polyacrylamidgel ved sølvfarging.

Uttrykket "i det vesentlige lik med" betyr, når det er brukt for å definere enten aminosyre- eller nukleinsyresek-venser, at en bestemt sekvens, f.eks. en mutantsekvens, vari-erer fra en referansesekvens med én eller flere substitusjoner, delesjoner eller addisjoner, idet nettoeffekten er å bibeholde biologisk aktivitet av TNF-R-proteinet som kan bli bestemt, f.eks. i én av TNF-R-bindingsanalysene angitt i eksempel 1 nedenunder. Alternativt er nukleinsyreunderenheter og analoger "i det vesentlige like med" de bestemte DNA-sekvensene som her er beskrevet dersom: (a) DNA-sekvensen er utledet fra det kodende område til et naturlig forekommende pattedyr-TNF-R-gen; (b) DNA-sekvensen er i stand til å hybridisere til DNA-sekvenser ifølge (a) under middels strenge betingelser (50°C, 2 x SSC) og som koder for biologisk aktive TNF-R-molekyler; eller DNA-sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske kode, til DNA-sekvenser definert under (a) eller (b), og som koder for biologisk aktive TNF-R-molekyler. "Rekombinant" betyr, slik det her er brukt, at et protein er avledet fra rekombinante (f.eks. mikrobielle eller pattedyr-) ekspresjonssystemer. "Mikrobiell" henviser til rekombinante proteiner laget i bakterie- eller sopp- (f.eks. gjær-) ekspresjonssystemer. Som et produkt definerer "rekombinant mikrobielt" et protein fremstilt i et mikrobielt ekspresjonssystem som er i det vesentlige fritt for naturlig forekommende, endogene stoffer. Protein uttrykt i de fleste bakteriekulturer, f.eks. E. coli, vil være fritt for glycan. Protein uttrykt i gjær, kan ha et glycosyleringsmønster som er forskjellig fra det som uttrykkes i pattedyrceller. "Biologisk aktivt" betyr, slik det er brukt i beskrivelsen og kravene som en karakteristikk for TNF-reseptorer, at et bestemt molekyl har tilstrekkelig aminosyresek-venslikhet med utførelsesformene ifølge foreliggende oppfinnelse som her er beskrevet, til å være i stand til å binde påvisbare mengder av TNF, overføre en TNF-stimulus til en celle, f.eks. som en komponent i en hybridreseptorkonstruk-sjon, eller kryssreagere med anti-TNF-R-antistoffer frembrakt mot TNF-R fra naturlige (dvs. ikke-rekombinante) kilder. Fortrinnsvis er biologisk aktive TNF-reseptorer innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse i stand til å binde mer enn 0,1 nmol TNF pr. nmol reseptor, og helst mer enn 0,5 nmol TNF pr. nmol reseptor i standard bindingsanalyser (se nedenunder).

"Isolert DNA-sekvens" henviser til en DNA-polymer i form av et separat fragment eller som en komponent i en større

DNA-konstruksjon, som er blitt avledet fra DNA isolert minst én gang i vesentlig ren form, dvs. fri for forurensende, endogene materialer og i en mengde eller konsentrasjon som mulig-gjør identifikasjon, manipulasjon og gjenvinning av sekvensen og dens komponentnukleotidsekvenser ved hjelp av standard bio-kjemiske metoder, f.eks. ved å bruke en kloningsvektor. Slike sekvenser tilveiebringes fortrinnsvis i form av en åpen leseramme uavbrutt av interne, ikke-translaterte sekvenser, eller introner, som er typisk til stede i eukaryote gener. Genom-DNA som inneholder de relevante sekvenser, vil også kunne brukes som en kilde for kodende sekvenser. Sekvenser av ikke-translatert DNA kan være til stede 5' eller 3' fra den åpne leseramme, når den samme ikke virker inn på manipulasjon eller ekspresjon av de kodende områder.

"Nukleotidsekvens" henviser til en heteropolymer av deoxyribonukleotider. DNA-sekvenser som koder for proteinene

tilveiebrakt ved hjelp av denne oppfinnelse, kan settes sammen fra cDNA-fragmenter og korte oligonukleotidlinkere, eller fra en serie av oligonukleotider, hvorved man får et syntetisk gen som er i stand til å bli uttrykt i en rekombinant transkrip-s j onsenhet-.

Isolering av cDNA- er som koder for TNF- R

Den kodende sekvens for TNF-R fås ved å, isolere en komplementær DNA- (cDNA-) sekvens som koder for TNF-R, fra et bibliotek med rekombinant cDNA eller genom-DNA. Et cDNA-bibliotek konstrueres fortrinnsvis ved å erholde polyadenylert mRNA fra en bestemt cellelinje som uttrykker en pattedyr-TNF-R, f .eks. humanfibroblastcellelinjen WI-26 VA4 (ATCC CCL 95.1) og bruke mRNA-en som et templat for syntetisering av dobbelttrådet cDNA. Den dobbelttrådete cDNA pakkes så i en rekombinant vektor som innføres i en passende E. coli-stamme og propageres. Murine eller andre pattedyrcellelinjer som uttrykker TNF-R, kan også brukes. TNF-R-sekvenser inneholdt i cDNA-biblioteket, kan lett identifiseres ved screening av biblioteket med en passende nukleinsyreprobe som er i stand til å hybridisere med TNF-R-cDNA. Alternativt kan DNA-er som koder for TNF-R-proteiner, settes sammen ved ligering av syntetiske oligonukleotidunderenheter som svarer til hele eller en del av sekvensen ifølge figurene 2-3 eller figurene 4-6, hvorved man får en komplett kodende sekvens.

Human-TNF-reseptor-cDNA-ene ifølge foreliggende oppfinnelse ble isolert ved hjelp av fremgangsmåten med direkte ekspresjonskloning. Et cDNA-bibliotek ble konstruert ved først å isolere cytoplasma-mRNA fra humanfibroblastcellelinjen WI-26 VA4. Polyadenylert RNA ble isolert og brukt til å fremstille dobbelttrådet cDNA. Rensede cDNA-fragmenter ble så ligert i pCAV/NOT-vektor-DNA som anvender regulatorsekvenser avledet fra pDC201 (et derivat av pMLSV, tidligere beskrevet av Cosman et al., Wature 312:768, 1984), SV40 og cytomegalovirus-DNA, beskrevet nærmere nedenunder i eksempel 2. pCAV/NOT er blitt deponert ved American Type Culture Collection under deponeringsnr. ATCC 68014. pCAV/NOT-vektorene som inneholder Wl26-VA4-cDNA-fragmentene, ble transformert i E. coli-stamme DH5a. Transformanter ble platet ut slik at det ble tilveiebrakt omtrent 8O0 kolonier pr. plate. De resulterende kolonier ble innhøstet, og hver ble brukt til å fremstille plasmid-DNA for transfeksjon i C0S-7-celler hovedsakelig som beskrevet av Cosman et al. (Wature 312:768, 1984) og Luthman et al. ( Nucl. Acid Res. 11:1295, 1983). Transformanter som uttrykker biologisk aktive celleoverflate-TNF-reseptorer, ble identifisert ved screening med hensyn på deres evne til å binde 12<5>I-TNF. Ved denne screeningfremgangsmåte ble transfekterte C0S-7-celler inkubert med medium inneholdende <125>I-TNF, cellene ble vasket for å fjerne ubundet, merket TNF og cellemonolagene brakt i kontakt med røntgenfilm for å påvise konsentrasjoner av TNF-binding, som beskrevet av Sims et al., Science 241:585 (1988). Transfektanter påvist på denne måte, fremkommer som mørke flekker mot en forholdsvis lys bakgrunn.

Ved å bruke denne fremgangsmåten ble omtrent 240.000 cDNA-er undersøkt i blandinger med omtrent 800 cDNA-er inntil analyse av én transfektantblanding indikerte positive flekker for TNF-binding. Et nedfryst forråd av bakterier fra denne positive blanding ble dyrket i kultur og platet ut for å tilveiebringe individuelle kolonier som ble undersøkt inntil det ble identifisert en enkelt klon (klon 11) som var i stand til å styre syntese av et overflateprotein med påvisbar TNF-bindingsaktivitet. Sekvensen til cDNA-klon 11 isolert ved hjelp av fremgangsmåten ovenfor, er vist i figurene 4-6.

Ytterligere cDNA-kloner kan isoleres fra cDNA-biblioteker fra andre pattedyrarter ved artskrysningshybridisering. For bruk ved hybridisering kan DNA som koder for TNF-R, merkes kovalent med et påvisbart stoff, slik som en fluorescerende gruppe, et radioaktivt atom eller en kjemiluminescerende gruppe ved hjelp av fremgangsmåter som er godt kjent for fagfolk innen teknikken. Slike prober vil også kunne brukes for in vi tro diagnose av bestemte tilstander.

Som tilfellet er med de fleste pattedyrgener, kodes pattedyr-TNF-reseptorer antagelig av multieksongener. Alternative mRNA-konstruksjoner som kan tilskrives forskjellige mRNA-sammenspleisinger etter transkripsjon, og som har til felles store områder med identitet eller likhet med cDNA-ene som her er krevet, betraktes som å være innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

Andre pattedyr-TNF-R-cDNA-er isoleres ved å bruke en passende human-TNF-R-DNA-sekvens som en probe for screening av et bestemt pattedyr-cDNA-bibliotek ved artskrysningshybridisering.

Proteiner og analoger

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolerte DNA-sekvenser som koder for rekombinante pattedyr-TNF-R-polypeptider. Isolerte TNF-R-polypeptider er i det vesentlige fri for andre forurensende materialer av naturlig eller endogen opprinnelse, og inneholder mindre enn ca. 1 vekt% proteinforurensingsrest fra fremtillingsprosesser. De naturlig forekommende human-TNF-R-molekyler utvinnes fra cellelysater som glycoproteiner med en tilsynelatende molekylvekt ved SDS-PAGE på ca. 80 kilodalton (kDa). TNF-R-polypeptidene ifølge denne oppfinnelsen er eventuelt uten tilknyttet glycosylering av naturlig forekommende mønster.

Pattedyr-TNF-R ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter eksempelvis primat-, human-, murin-, hund-, katt-, bovin-, ovin-, hest- og porcin-TNF-R. Pattedyr-TNF-R-er kan fås ved artskrysningshybridisering under anvendelse av en enkelttrådet cDNA avledet fra human-TNF-R-DNA-sekvensen som en hybridiser-ingsprobe for å isolere TNF-R-cDNA-er fra pattedyr-cDNA-biblioteker.

Derivater av TNF-R innenfor omfanget av^ oppfinnelsen omfatter også forskjellige strukturelle former av primærpro-teinet som bibeholder biologisk aktivitet. F.eks. på grunn av tilstedeværelsen av ioniserbare amino- og carboxylgrupper kan et TNF-R-protein være i form av syre- eller basesalter, eller kan være i nøytral form. Enkeltstående aminosyrerester kan også være modifisert ved oxydasjon eller reduksjon.

Den primære aminosyrestruktur kan modifiseres ved å danne kovalente eller aggregatkonjugater med andre kjemiske rester, slik som glycosylgrupper, lipider, fosfat- eller acetylgrupper og lignende, eller ved å skape aminosyresek-vensmutanter. Kovalente derivater fremstilles ved å binde bestemte funksjonelle grupper til TNF-R-aminosyresidekjeder eller i N- eller C-endene. Andre derivater av TNF-R innenfor omfanget av denne oppfinnelse omfatter kovalente eller aggregatkonjugater av TNF-R eller fragmenter derav med andre proteiner eller polypeptider, slik som ved syntese i rekombinant kultur som N-ende- eller C-endefusjoner. F.eks. kan det konjugerte peptid være en signalpolypeptidsekvens eller lederpolypeptid-sekvens i N-endeområdet til proteinet som samtranslasjonelt eller posttranslasjonelt styrer overføring av proteinet fra dets syntesested til dets funksjonssted innenfor eller utenfor cellemembranen eller -veggen (f.eks. gjær-a-faktor-lederen). TNF-R-proteinfusjoner kan omfatte peptider tilsatt for å lette rensing eller identifikasjon av TNF-R (f.eks. poly-His). Aminosyresekvensen til TNF-reseptor kan også være bundet til peptidet Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Blo/ Technology 6:1204, 1988). Sistnevnte sekvens er svært antigen og gir en epitop reversibelt bundet ved hjelp av et spesifikt, monoklonalt antistoff som muliggjør hurtig analyse og letter rensing av uttrykt, rekombinant protein. Denne sekvensen spaltes også spesifikt ved hjelp av bovin slimhinne-enterokinase i resten umiddelbart etter Asp-Lys-paringen. Fusjonsproteiner påsatt dette peptid, kan også være resistente mot intracellulær nedbrytning i E. coli.

TNF-R-derivater kan også brukes som immunogener, rea-genser i reseptorbaserte immunoanalyser, eller som bindings-midler for affinitetsrensingsfremgangsmåter av TNF eller andre bindingsligander. TNF-R-derivater kan også fås ved kryssbin-dingsmidler, slik som M-maleimidobenzoylsuccinimidester og N-hydroxysuccinimid, i cystein- og lysinrester. TNF-R-proteiner kan også bindes kovalent gjennom reaktive sidegrupper til forskjellige uoppløselige substrater, slik som cyanogenbromid-aktiverte, bisoxiranaktiverte, carbonyldiimidazolaktiverte eller tosylaktiverte agarosestrukturer, eller ved adsorpsjon til polyolefinoverflater (med eller uten glutaraldehydkryss-binding). Når den først er bundet til et substrat, kan TNF-R brukes til å binde anti-TNF-R-antistoffer eller TNF selektivt (for analyse- eller rensingsformål).

Foreliggende oppfinnelse omfatter også DNA-sekvenser som koder for TNF-R med eller uten tilknyttet glycosylering med naturlig forekommende mønster. TNF-R uttrykt i gjær- eller pattedyrekspresjonssystemer, for eksempel. COS-7-celler, kan i molekylvekt og glycosyleirngsmønster være lik med, eller litt forskjellig fra, de naturlig forekommende molekyler, avhengig av ekspresjonssystemet. Ekspresjon av TNF-R-DNA-er i bakterier, slik som E. coli, gir ikke-glycosylerte molekyler. Funksjonelle mutantantanaloger av pattedyr-TNF-R med inaktiverte N-glycosyleringsseter kan fremstilles ved olonukleotidsyntese og ligering, eller ved teknikker med stedspesifikk

i

mutagenese. Disse analogproteinene kan fremstilles i en homogen, redusert i carbohydratform i godt utbytte under anvendelse av gjærekspresjonssystemer. N-glycosyleringsseter i eukaryote proteiner er kjenntetegnet ved aminosyretripletten Asn-ArZ, hvor Ai er enhver aminosyre bortsett fra Pro, og Z er Ser eller Thr. I denne sekvensen gir asparagin en sidekjedeaminosyregruppe for kovalent festing av carbohydrat. Et slikt sete kan fjernes ved å substituere en annen aminosyre for Asn eller for resten Z, fjerne Asn eller Z, eller innføye en ikke-Z-aminosyre mellom Ai og Z, eller en annen aminosyre enn Asn mellom Asn og Ai.

TNF-R-derivater kan også fås ved mutasjoner av TNF-R eller dens underenheter. En TNF-R-mutant som her referert til, er en polypeptidhomolog til TNF-R, men som jhar en aminosyresekvens som er forskjellig fra naturlig forekommende TNF-R på grunn av en delesjon, innføyelse eller substitusjon.

Bioekvivalentanaloger av TNF-R-proteiner kan konstrueres ved f.eks. å lage forskjellige substitusjoner av rester eller sekvenser, eller fjerne ende- eller innerrester eller sekvenser som ikke trengs for biologisk aktivitet. F.eks. kan cysteinrester fjernes (f.eks. Cys<178>) eller erstattes med andre aminosyrer for å forhindre dannelse av unødvendige eller ukor-rekte, intramolekylære disulfidbroer etter renaturering. Andre fremgangsmåter for mutagenese omfatter modifikasjon av tilgrensende, tobasiske aminosyrerester for å øke ekspresjon i gjærsystemer hvor KEX2-proteaseaktivitet er til stede. Generelt bør substitusjoner lages konservativt; dvs. de mest foretrukne substituttaminosyrer er de som har fysiokjemiske kjennetegn som faller sammen med kjennetegnene til resten som skal erstattes. Når det brukes en delesjons- eller innføy-elsesstrategi, bør likeledes den potensielle effekt av dele-sjonen eller innføyelsen på biologisk aktivitet vurderes. I det vesentlige like polypeptidsekvenser, som definert ovenfor, omfatter generelt et likt antall aminosyresekvenser selv om ei-ende-avkortninger for det formål å konstruere oppløselige TNF-R-er vil inneholde færre aminosyresekvenser. For å bevare den biologiske aktivitet av TNF-R-er vil delesjoner og substitusjoner fortrinnsvis resultere i homologe eller konservativt substituerte sekvenser, noe som betyr at en bestemt rest erstattes med en biologisk lik rest. Som eksempler på konservative substitusjoner omfatter substitusjon av én alifatisk rest med en annen, slik som Ile, Val, Leu eller Ala for hverandre, eller substitusjoner av én polar rest for en annen, slik som mellom Lys og Arg, Glu og Asp, eller Gin og Asn. Andre slike konservative substitusjoner, f.eks. substitusjoner av hele områder med like hydrofobisitetskjennetegn, er godt kjent. Bestemte aminosyreforskjeller mellom human-, murin- og andre pattedyr-TNF-R-er antyder dessuten at ytterligere konservative substitusjoner kan gjøres uten å endre de vesentlige biologiske kjennetegn til TNF-R.

Underenheter av TNF-R kan konstrueres ved å fjerne ende- eller innerrester eller -sekvenser. Særlig foretrukne sekvenser omfatter de hvor transmembranområdet og det intra-cellulære område i TNF-R fjernes eller byttes ut med hydrofile rester for å lette utskillelse av reseptoren i cellekultur-mediet. Det resulterende protein henvises til som et oppløse-lig TNF-R-molekyl som bibeholder sin evne til å binde TNF. En særlig foretrukket oppløselig TNF-R-konstruksjon er TNF-R-A235 (sekvensen av aminosyrene 1-235 i figur 2) som omfatter hele det ekstracellulære område til TNF-R som avsluttes med Asp<235 >umiddelbart ved siden av transmembranområdet. Ytterligere aminosyrer kan fjernes fra transmembranområdet samtidig som TNF-bindingsaktivitet bibeholdes. F.eks. bibeholder huTNF-RA183 som omfatter sekvensen med aminosyrene 1-183 i figur 2, og TNF-RA163 som omfatter sekvensen med aminosyrene 1-163 i figur 2, evnen til å binde TNF-ligand som bestemt ved å bruke bindingsanalysene beskrevet nedenunder i eksempel 1. TNF-RA142 bibeholder imidlertid ikke evnen til å binde TNF-ligand. Dette tyder på at én av Cys15<7> og Cys<163> eller begge er påkrevet for dannelse av en intramolekylær disulfidbro for den korrekte folding av TNF-R. Cys<178> som ble fjernet uten noen tilsynelatende ugunstig effekt på evnen til den oppløselige TNF-R når det gjelder å binde TNF, synes ikke å være vesentlig for korrekt folding av TNF-R. Enhver fjerning C-terminalt til Cys163 ville således forventes å resultere i en biologisk aktiv, oppløselig TNF-R. Foreliggende oppfinnelse omfatter slike opp-løselige TNF-R-konstruksjoner som svarer til hele, eller en del av, det ekstracellulære område til TNF-R som avsluttes med hvilken som helst aminosyre etter Cys<163>. Andre C-endedele-sjoner, slik som TNF-FA157, kan lages alt etter behov ved å

t

kutte TNF-R-cDNA med passende restriksjonsenzymer, og, om nød-vendig, rekonstruere bestemte sekvenser med syntetiske oligonukleotidlinkere. De resulterende, oppløselige TNF-R-konstruksjoner innføyes så og uttrykkes i passende ekspresjonsvektorer og analyseres med hensyn på evnen til å binde TNF, som beskrevet i eksempel 1. Biologisk aktive, oppløselige TNF-R-er som skriver seg fra slike konstruksjoner, er også ment å være innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

Mutasjoner i nukleotidsekvenser konstruert for ekspresjon av analog-TNF-R, må selvsagt bevare leserammefasen til de kodende sekvensene og vil fortrinnsvis ikke skape komple-mentærområder som ville kunne hybridisere til å gi sekundær-mRNA-strukturer, slik som sløyfer eller hårnåler, som på ugunstig måte ville påvirke translasjon av reseptor-mRNA-en. Selv om et mutasjonssete kan være forutbestemt, er det ikke nødvendig at mutasjonens natur per se er forutbestemt. For å selektere med hensyn på optimale kjennetegn hos mutanter på et bestemt sted, kan f.eks. vilkårlig mutagenese utføres i mål-kodonet og de uttrykte TNF-R-mutanter undersøkes med hensyn på den ønskede aktivitet.

Ikke alle mutasjoner i nukleotidsekvensen som koder for TNF-R, vil være uttrykt i sluttproduktet; nukleotidsubsti-tusjoner kan f.eks. lages for å øke ekspresjon, hovedsakelig ved å unngå sekundærstruktursløyfer i den transkriberte mRNA (se EPA 75. ? A), eller for å tilveiebringe kodoner som translateres lettere av den utvalgte vert, f.eks. de velkjente E. coli-preferansekodoner for E. coli-ekspresjon.

Mutasjoner kan innføres på bestemte steder ved å syn-tetisere oligonukleotider som inneholder en mutantsekvens flankert av restriksjonsseter som muliggjør ligering til fragmenter av den naturlig forekommende sekvens. Etter ligering koder den resulterende, rekonstruerte sekvens for en analog med den ønskede aminosyreinnføyelse, -substitusjon eller

-delesjon.

Alternativt kan oligonukleotidrettede, stedspesifikke mutagenesefremgangsmåter anvendes for å tilveiebringe et endret gen som har bestemte kodoner endret i henhold til den påkrevde substitusjon, delesjon eller innføyelse. Eksempelvise metoder for fremstilling av endringene angitt ovenfor, er beskrevet av Walder et al. (Gene 42:133, 1986), Bauer et al.

( Gene 37:73, 1985), Craik ( BioTechniqu. es, januar 1985, 12-19), Smith et al. ( Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981), og i US patentskrifter nr. 4 518 584 og 4 737 462 beskrives egnede teknikker.

Både enverdige former og flerverdige former av TNF-R kan anvendes i preparatene og fremgangsmåtene ifølge denne oppfinnelse. Flerverdige former har flere TNF-R-bindingsseter for TNF-ligand. En toverdig, oppløselig TNF-R kan f.eks. bestå av to tandemgjentagelser av aminosyrene 1-235 i figur 2, atskilt av et linkerområde. Alternative, flerverdige former kan også konstrueres, f.eks. ved kjemisk kobling av TNF-R til hvilket som helst klinisk akseptabelt bærermolekyl, en polymer valgt fra gruppen bestående av Ficoll, polyethylenglycol eller dextran under anvendelse av konvensjonelle koblingsteknikker. Alternativt kan TNF-R kobles kjemisk til biotin, og biotin-TNF-R-konjugatet kan så få bindes til avidin, noe som resul-terer i fireverdige avidin/biotin/TNF-R-molekyler. TNF-R kan også kobles kovalent til dinitrofenol (DNP) eller trinitro-fenol (TNP), og det resulterende konjugat utfelles med anti-DNP eller anti-TNP-IgM, hvorved det dannes decamere konjugater med en valens på 10 for TNF-R-bindingsseter.

Et rekombinant, kimært antistoffmolekyl kan også fremstilles med TNF-R-sekvenser substituert for de variable områder i hver av, eller i begge, immunoglobulinmolekyl-tung-og -lettkjeder, og med umodifiserte, konstante regionområder. F.eks. kan kimær-TNF-R/IgGi fremstilles fra to kimærgener - en TNF-R/human-K-lettkjede-kimær (TNF-R/CK) og en TNF-R/human-Yi-tungkjede-kimær (TNF-R/Cy.j). Etter transkripsjon og translasjon av de to kimærgenene settes de to genproduktene sammen i et enkelt kimærantistoffmolekyl med TNF-R fremvist toverdig. Slike flerverdige former av TNF-R kan ha forøkt bindings-affinitet for TNF-ligand. Ytterligere detaljer vedrørende kon-struksjonen av slike kimærantistoffmolekyler er beskrevet i WO 89/09622 og EP 315062.

Ekspresjon av rekombinant TNF- R

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer rekombinante ekspresjonsvektorer for å amplifisere eller uttrykke DNA som koder for TNF-R. Rekombinante ekspresjonsvektorer er repliker-bare DNA-konstruksjoner som har syntetiske eller cDNA-avledede DNA-fragmenter som koder for pattedyr-TNF-R eller bioekvivalentanaloger operativt bundet til egnede transkripsjons- eller translasjonsregulatorelementer avledet fra pattedyr-, mikrobe-, virus- eller insektgener. En transkripsjonen enhet omfatter generelt en sammensetning av (1) et genetisk element eller elementer med en regulatorrolle ved genekspresjon, f.eks. transkripsjonspromoterer eller -fremmere, (2) en strukturell eller kodende sekvens som transkriberes til mRNA og translateres til protein, og (3) passende transkripsjons- og translasjonsinitierings- og -termineringssekvenser, som beskrevet nærmere nedenunder. Slike regulatorelementer kan omfatte en operatorsekvens for å kontrollere transkripsjon, en sekvens som koder for egnede mRNA ribosomale bindingsseter. Evnen til å replikere i en vert, vanligvis bekreftet ved et replikasjonsopprinnelsessted, og et seleksjonsgen for å lette gjenkjennelse av transformanter, kan i tillegg være inkorpor-ert. DNA-områder er operativt bundet når de står i funksjonelt forhold til hverandre. F.eks. er DNA for et signalpeptid (sekretorisk leder) operativt bundet til DNA for et polypeptid dersom det uttrykkes som en forløper som deltar i utskillelsen av polypeptidet; en promoter er operativt bundet til en kodende sekvens dersom den kontrollerer transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindende sete er operativt bundet til en kodende sekvens dersom det står i en slik stilling at det muliggjør translasjon. Generelt betyr operativt bundet til-støtende og, i tilfellet med sekretoriske ledere, tilgrensende og i leseramme. Strukturelle elementer ment for bruk i gjærekspresjonssystemer, omfatter fortrinnsvis en ledersekvens som muliggjør ekstracellulær utskillelse av translatert protein av en vertcelle. Når rekombinant protein uttrykkes uten en leder-eller transportsekvens, kan det alternativt omfatte en N-ende-methioninrest. Denne resten kan eventuelt deretter spaltes fra det uttrykte, rekombinante protein, hvorved man får et slutt-produkt .

DNA-sekvenser som koder for pattedyr-TNF-reseptorer som skal uttrykkes i en mikroorganisme, vil fortrinnsvis ikke inneholde noen intrbner som for tidlig ville kunne avslutte transkripsjon av DNA til mRNA; for tidlig avslutning av transkripsjon kan imidlertid være ønskelig, f.eks. når den ville resultere i mutanter med fordelaktige C-ende-avkortninger, f.eks. delesjon av et transmembranområde, hvorved man får en oppløselig reseptor som ikke er bundet til cellemembranen. På grunn av kodedegenerasjon kan det være betydelig variasjon i nukleotidsekvenser som koder for den samme aminosyresekvehs. Andre utførelsesformer omfatter sekvenser som er i stand til å hybridisere til sekvensene til den tilveiebrakte cDNA under middels strenge betingelser (50°C, 2 x SSC) og andre sekvenser som hybridiserer eller degenererer til de som koder for biologisk aktive TNF-reseptorpolypeptider.

Rekombinant TNF-R-DNA uttrykkes eller amplifiseres i et rekombinant ekspresjonssystem som omfatter en i det vesentlige homogen monokultur av egnede vertmikroorganismer, f.eks. bakterier, slik som E. coli, eller gjær, slik som S. cerevisiae, som har en rekombinant transkripsjonsenhet integrert stabilt (ved transformasjon eller transfeksjon) i kromosom-DNA, eller som bærer den rekombinante transkripsjonsenhet som en komponent i et plasmid som er til stede. Celler som utgjør systemet, er generelt avkommet av en enkel stamtransformant. Rekombinante ekspresjonssystemer som her definert, vil uttrykke heterologt protein etter induksjon av regulatorelemen-tene bundet til DNA-sekvensen eller syntetisk gen som skal uttrykkes.

Transformerte vertceller er celler som er blitt transformert eller transfektert med TNF-R-vektorer konstruert under anvendelse av teknikker med rekombinant DNA. Transformerte vertceller uttrykker vanligvis TNF-R, men vertceller transformert for de formål å klone eller amplifisere TNF-R-DNA, trenger ikke å uttrykke TNF-R. Uttrykt TNF-R vil bli av-satt i cellemembranen eller utskilt i kultursupernatanten, avhengig av den valgte TNF-R-DNA. Egnede vertceller for ekspresjon av pattedyr-TNF-R omfatter prokaryoter, gjær eller høyere eukaryote celler under kontroll av de passende promoterer. Prokaryoter omfatter gramnegative eller grampositive organismer, f.eks. E. coli eller Bacillus-arter. Høyere eukaryote celler omfatter etablerte cellelinjer av pattedyr-opprinnelse som beskrevet nedenunder. Cellefrie transla-sjonssystemer ville også kunne anvendes for å fremstille pattedyr-TNF-R under anvendelse av RNA-er avledet fra DNA-kon-struksjonene ifølge foreliggende oppfinnelse. Passende klonings- og ekspresjonsvektorer for anvendelse med bakterie-, gjær- og pattedyrcelleverter er beskrevet av Pouwels et al.

( Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985).

Prokaryote ekspresjonsvektorer kan brukes for ekspresjon av TNF-R som ikke krever utstrakt proteolytisk og di-sulfidbearbeiding. Prokaryote ekspresjonsvektorer omfatter generelt én eller flere fenotypisk selekterbare markører, f.eks. et gen som koder for proteiner som gir antibiotisk resistens eller gir et autotroft behov, og et replikasjonsopprinnelsessted gjenkjent av verten for å sikre amplifikasjon i verten. Egnede, prokaryote verter for transformasjon omfatter E. colt, Bacillus subtilis, Salmonella typhlmurium og forskjellige arter innenfor slektene Pseudomonas, Streptomyces og Staphylococcus, selv om andre også kan anvendes etter valg.

Anvendbare ekspresjonsvektorer for bakteriell bruk kan omfatte en selekterbar markør og bakterielt replikasjonsopprinnelsessted avledet fra kommersielt tilgjengelige plasmider som omfatter genetiske elementer av den velkjente kloningsvektor pBR322 (ATCC 37017). Slike kommersielle vektorer omfatter f.eks. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Disse pBR322 "ryggrads"-deler kombineres med en passende promoter og struktursekvensen som skal uttrykkes. E. coil transformeres vanligvis under anvendelse av derivater av pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli-art (Bolivar et al., Gene 2:95, 1977). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyklin-resistens og gir således enkle midler for identifikasjon av

transformerte celler.

Vanlig brukte promoterer i rekombinante, mikrobielle ekspresjonsvektorer omfatter p-lactamasen (penicillinasen) og lactosepromotersystemet (Chang et al., Nature 275:615, 1978; og Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), tryptofan- (trp) promotersysternet (Goeddel et al., Nucl. Rcids Res. 8:4057, 1980; og EPA 36 776) og tac-promoter (Maniatis, Molecular Cloning: R Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 412, 1982). I et særlig anvendbart, bakterielt ekspresjonssystem anvendes fag A. PL-promoteren og den varmelabile repres-sor cI857ts. Plasmidvektorer tilgjengelige fra American Type Culture Collection som omfatter derivater av k PL-promoteren, omfatter plasmid pHUB2, som er til stede i E. coli-stamme JMB9 (ATCC 37092), og pPLc28, som er til stede i E. coli RR1 (ATCC 53082).

Rekombinante TNF-R-proteiner kan også uttrykkes i gjærverter, fortrinnsvis fra Sacciiaromyces-arter, slik som S. cerevisiae. Gjær av andre slekter, slik som Pichia eller Kluyverorayces, kan også anvendes. Gjærvektorer vil generelt inneholde et replikasjonsopprinnelsessted fra 2u-gjærplasmidet eller en autonomt replikerende sekvens (ARS), promoter, DNA som koder for TNF-R, sekvenser for polyadenylering og trans-kripsjonsterminering og et seleksjonsgen. Gjærvektorer vil fortrinnsvis omfatte et replikasjonsopprinnelsessted og selekterbar markør som muliggjør transformasjon av både gjær og E. coli, f.eks. ampicillinresistensgenet til E. coli, og S. cerevisiae TRP1- eller URA3-genet, gi en seleksjonsmarkør for en mutant stamme av gjær som mangler evne til å vokse i tryptofan, og en promoter avledet fra et sterkt uttrykt gjærgen for å indusere transkripsjon av en struktursekvens nedstrøms. Tilstedeværelsen av TRP1- eller URA3-skaden i gjærvertcelle-genomet gir så et effektivt miljø for påvisning av transformasjon ved dyrking i fravær av tryptofan eller uracil.

Egnede promotersekvenser i gjærvektorer omfatter pro-moterne for metallothionein, 3-fosfoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) eller andre glycolyt-iske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968 og Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), slik som enolase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, hexokinase, pyruvat-decarboxylase, fosfofructokinase, glucose-6-fosfat-isomerase, 3-fosfoglycerat-mutase, pyruvat-kinase, triosefosfat-isomerase, fosfoglucose-isomerase og glucokinase. Egnede vektorer og promoterer for anvendelse i gjærekspresjon er ytterligere beskrevet i R. Hitzeman et al., EP patentsøknad nr. 73 657.

Foretrukne gjærvektorer kan settes sammen under anvendelse av DNA-sekvenser fra pUC18 for seleksjon og replika-sjon i B. coli (Amp<r->gen og replikasjonsopprinnelsessted) og gjær-DNA-sekvenser som omfatter en glucoseundertrykkbar ADH2-promoter og en a-faktor-sekresjonsleder. ADH2-promoteren er blitt beskrevet av Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) og Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Gjær-a-faktor-lederen som styrer sekresjon av heterologe proteiner, kan innføyes mellom promoteren og strukturgenet som skal uttrykkes. Se f.eks. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982 og Bitter et al., Proe. Nati. Rcad. Sei. USA 81:5330, 1984. Ledersekvensen kan modifiseres slik at den nær sin 3'-ende inneholder ett eller flere anvendbare restriksjonsseter for å lette fusjon av ledersekvensen til fremmedgener.

Egnede gj ærtransf ormas jons fremgangsmåter er kjent for fagfolk innen teknikken; en eksempelvis teknikk er beskrevet av Hinnen et al., Proe. Watl. Rc ad. Sei. USR 75:1929, 1978, som selekterer for Trp<+->transformanter i et selektivt medium som består av 0,67% gjærnitrogenbase, 0,5% casaminosyrer, 2% glucose, 10 ug/ml adenin og 20 ug/ml uracil, eller URA+-transformanter i medium bestående av 0,67% YNB, med aminosyrer og baser som beskrevet av Sherman et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986.

Vertstammer transformert ved hjelp av vektorer som omfatter ADH2-promoteren, kan dyrkes for ekspresjon i et rikt medium bestående av 1% gjærekstrakt, 2% pepton og 1% eller 4% glucose supplert med 80 ug/ml adenin og 80 ug/ml uracil. Derepresjon av ADH2-promoteren oppstår etter uttømming av mediumglucose. Urene gjærsupernatanter innhøstes ved filtrering og holdes ved 4°C før ytterligere rensing.

Forskjellige pattedyr- eller insektcellekultursys-temer anvendes også fordelaktig for å uttrykke rekombinant protein. Ekspresjon av rekombinante proteiner i pattedyrceller er særlig foretrukket ettersom slike proteiner generelt er korrekt foldet, passende modifisert og fullstendig funksjonelle. Eksempler på egnede pattedyrvertcellelinjer omfatter C0S-7-linjene av apenyreceller beskrevet av Gluzman (Cell 23:175, 1981), og andre cellelinjer som er i stand til å uttrykke en passende vektor, inkludert f.eks. L-celler, C127-, 3T3-, kinesisk hamsterovarie- (CH0-), HeLa- og BHK-cellelinjer. Pattedyrekspresjonsvektorer kan omfatte ikke-transkriberte elementer, slik som et replikasjonsopprinnelsessted, en egnet promoter og fremmer bundet til genet som skal uttrykkes, og andre 5'- eller 3'-flankerende, ikke-transkriberte sekvenser, og 5'- eller 3'-ikke-translaterte sekvenser, slik som nødvendige ribosombindingsseter, et polyadenyleringssete, spleisingsdonor- og -akseptorseter, og transkripsjonster-mineringssekvenser. Baculovirussystemer for fremstilling av heterologe proteiner i insektceller er omtalt av Luckow og

Summers, Bio/ Technology 6:47 (1988).

Transkripsjons- og translasjonskontrollsekvensene i ekspresjonsvektorer som skal brukes ved transformering av hvirveldyrceller, kan tilveiebringes ved hjelp av viruskilder. F.eks. avledes vanlig brukte promoterer og fremmere fra poly-oma, adenovirus 2, apevirus 40 (SV40) og humant cytomegalovirus. DNA-sekvenser avledet fra SV40-virusgenomet, f.eks. SV40-opprinnelsessted, "tidlig" og "sen" promoter, fremmer, spleisings- og polyadenyleringsseter, kan brukes for å tilveiebringe de øvrige genetiske elementene som er påkrevet for ekspresjon av en heterolog DNA-sekvens. De "tidlige" og "sene" promoterer er særlig anvendbare ettersom begge fås lett fra viruset som et fragment som også inneholder virusreplikasjonsopprinnelsesstedet fra SV40 (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også brukes forutsatt at den omtrentlig 250 bp store sekvensen strekker seg fra Hind 3-setet mot Bgll-setet lokalisert i virusreplikasjonsopprinnelsesstedet, er inkludert. Videre kan pattedyrgenom-TNF-R-promoter-, -kontroll- og/eller -signal-sekvenser anvendes, forutsatt at slike kontrollsékvenser er forenlige med den valgte vertcelle. Ytterligere detaljer ved-rørende bruken av en høyekspresjonspattedyrvektor for å fremstille en rekombinant pattedyr-TNF-reseptor, er gitt i eksemplene 2 og 7 nedenunder. Eksempelvise vektorer kan konstrueres som beskrevet av Okayama og Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983).

Et anvendbart system for stabil høynivåekspresjon av pattedyrreseptor-cDNA-er i C127 murine pattedyrepitelceller kan konstrueres i det vesentlige som beskrevet av Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986).

Ved foretrukne aspekter av foreliggende oppfinnelse integreres rekombinante ekspresjonsvektorer som omfatter TNF-R-cDNA-er, stabilt i en vertcelles DNA. Forhøyede nivåer av ekspresjonsprodukt oppnås ved å selektere med hensyn på cellelinjer med amplifiserte antall vektor-DNA. Cellelinjer med amplifiserte antall vektor-DNA velges f.eks. ved å transformere en vertcelle med en vektor som omfatter en DNA-sekvens som koder for et enzym som inhiberes av et kjent legemiddel. Vektoren kan også omfatte en DNA-sekvens som koder for et ønsket protein. Alternativt kan vertcellen samtransformeres med en andre vektor som omfatter DNA-sekvensen som koder for det ønskede protein. De transformerte eller samtransformerte vertceller dyrkes så ved økende konsentrasjoner av det kjente legemiddel, hvorved det selekteres med hensyn på legemiddelresistente celler. Slike legemiddelresistente celler overlever ved forøkte konsentrasjoner av det toksiske legemiddel ved overproduksjon av enzymet som inhiberes av legemidlet, ofte som et resultat av amplifikasjon av genet som koder for enzymet. Når legemiddelresistens forårsakes av en økning i kopiantallet av den vektor-DNA som koder for det inhiberbare enzym, er det en ledsagende samamplifikasjon av den vektor-DNA som koder for det ønskede protein (TNF-R) i vertcellens DNA.

I et foretrukket system for slik samamplifikasjon anvendes genet for dihydrofolatreduktase (DHFR) som kan inhiberes ved hj elp av legemidlet methotrexat (MTX). For å oppnå samamplifikasjon transformeres enten en vertcelle som mangler et aktivt gen som koder for DHFR, med en vektor som omfatter DNA-sekvens som koder for DHFR, og et ønsket protein, eller samtransformeres med en vektor som omfatter en DNA-sekvens som koder for DHFR, og en vektor som omfatter en DNA-sekvens som koder for det ønskede protein. De transformerte eller samtransformerte vertceller dyrkes i medier som inneholder økende nivåer av MTX, og de cellelinjene som overlever, velges ut.

I et særlig foretrukket samamplifikasjonssystem anvendes systemet for glutaminsyntetase (GS) som er ansvarlig for syntesen av glutamat og ammoniakk, under anvendelse av hydrolysen av ATP til ADP og fosfat for å drive frem reak-sjonen. GS underkastes inhibering med mange forskjellige in-hibitorer, f.eks. methioninsulfoximin (MSX). TNF-R kan således uttrykkes i høye konsentrasjoner ved samamplifiserende celler transformert med en vektor som omfatter DNA-sekvensen for GS, og et ønsket protein, eller samtransformeres med en vektor som omfatter en DNA-sekvens som koder for GS, og en vektor som omfatter en DNA-sekvens som koder for det ønskede protein, dyrking av vertcellene i medier som inneholder økende nivåer av MSX, og utvelgelse av overlevende celler. GS-samamplifika-sjonssystemet, passende, rekombinante ekspresjonsvektorer og

cellelinjer, er beskrevet i de følgende PCT-søknader:

WO 87/04462, WO 89/01036, WO 89/10404 og WO 86/05807.

Rekombinante proteiner uttrykkes fortrinnsvis ved samamplifikasjon av DHFR eller GS i en pattedyrvertcelle, slik som kinesisk hamsterovarie- (CH0-) celler, eller alternativt i en murin myelomcellelinje, slik som SP2/0-Agl4 eller NSO, eller en rottemyelomcellelinje, slik som YB2/3.0-Ag20, beskrevet i PCT-patentsøknader nr. WO 89/10404 og WO 86/05807.

En foretrukket eukaryot vektor for ekspresjon av TNF-R-DNA er beskrevet nedenunder i eksempel 2. Denne vektoren, henvist til som pCAV/NOT, ble avledet fra pattedyr-høyekspre-sjonsvektoren pDC201 og inneholder regulatorsekvensen fra SV40, adenovirus 2 og humant cytomegalovirus.

Rensing av rekombinant TNF- R

Rensede pattedyr-TNF-reseptorer eller analoger fremstilles ved å dyrke egnede vert/vektor-systemer slik at de uttrykker de rekombinante translasjonsproduktene av DNA-ene ifølge foreliggende oppfinnelse, som så renses fra kultur-medier eller celleekstrakter.

Supernatanter fra systemer som utskiller rekombinant protein i dyrkningsmedier, kan f.eks. først oppkonsentreres under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig proteinkonsen-trasjonsfilter, f.eks. en "Amicon" eller "Millipore Pellicon" ultrafiltreringsenhet. Etter konsentrasj onstrinnet kan konsen-tratet påføres en egnet rensematriks. F.eks. kan en egnet affinitetsmatriks omfatte et TNF- eller lectin- eller antistoffmolekyl bundet til en egnet bærer. Alternativt kan det anvendes en anionbytterharpiks, f. eks. en mat riks eller et substrat med pendante diethylaminoethylgrupper (DEAE-grupper). Matriksene kan være acrylamid, agarose, dextran, cellulose eller andre typer som er vanlig anvendt innen proteinrensing. Alternativt kan et kationbyttertrinn anvendes. Egnede kation-byttere omfatter forskjellige uoppløselige matrikser som omfatter sulfopropyl- eller carboxymethylgrupper. Sulfopropyl-grupper er foretrukket.

For å rense et TNF-R-preparat ytterligere kan det endelig anvendes ett eller flere trinn med reversfase-væskekromatografi med høy yteevne (RP-HPLC) under anvendelse av hydrofobe RP-HPLC-medier, f.eks. silicagel med pendante methyl- eller andre alifatiske grupper. Noen av, eller alle, de ovenfor nevnte rensetrinn, kan, i forskjellige kombina-sjoner, også anvendes til å gi et homogent, rekombinant protein.

Rekombinant protein fremstilt i bakteriekultur, isoleres vanligvis ved innledende ekstraksjon fra cellepellets, etterfulgt av ett eller flere konsentrasjons-, utsaltings-, vandig ionebytter- eller størrelsesutelukkelseskromatografi-trinn. Endelig kan væskekromatografi med høy yteevne (HPLC) anvendes for sluttrensetrinnet. Mikrobielle celler som anvendes ved ekspresjon av rekombinant pattedyr-TNF-R, kan brytes opp ved hvilken som helst vanlig metode, inkludert vekselvis nedfrysing og opptining, sonikering, mekanisk oppbrytning eller anvendelse av cellelysemidler.

Fermentas jon av gjær som uttrykker pattedyr-TNF-R som et utskilt protein, forenkler rensing i stor grad. Utskilt, rekombinant protein som fås fra en storskalafermentering, kan renses ved hjelp av metoder som er analoge med de som er beskrevet av Urdal et al. (J. Chromatogr. 296:171, 1984). Denne litteraturhenvisning beskriver to sekvensvise, reversfase-HPLC-trinn for rensing av rekombinant human-GM-CSF på en pre-parativ HPLC-kolonne.

Human-TNF-R syntetisert i rekombinant kultur, er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av ikke-human-cellekompon-enter, inkludert proteiner, i mengder og med en karakter som avhenger av rensetrinnene som er foretatt for å utvinne human-TNF-R fra kulturen. Disse komponentene vil vanligvis være av gjær-, prokaryot- eller ikke-human, høyere eukaryotopprinn-else, og er fortrinnsvis til stede i ufarlig forurensende mengder, i størrelsesorden mindre enn ca. 1 vekt%. Rekombinant cellekultur muliggjør videre fremstillingen av TNF-R som er fri for proteiner som normalt kan være forbundet med TNF-R slik det finnes i naturen i sin opprinnelsesart, f.eks. i celler, celleeksudater eller kroppsvæsker.

For terapeutisk anvendelse administreres renset, oppløselig TNF-R-protein til en pasient, fortrinnsvis et menneske, for behandling på en måte som er passende for indikasjonen. Oppløselige TNF-R-proteinpreparater kan således f.eks. administreres ved bolusinjeksjon, kontinuerlig inn-sprøyting, vedvarende frigjørelse fra implantater eller annen egnet teknikk. Et oppløselig, terapeutisk TNF-R-middel vil vanligvis ble administrert i form av et preparat som omfatter renset protein, sammen med fysiologisk akseptable bærere, eksipienser eller fortynningsmidler. Slike bærere vil være ikke-toksiske for mottakere ved de doseringer og konsentrasjoner som anvendes. Vanligvis medfører fremstillingen av slike preparater blanding av TNF-R med buffere, antioxydanter, slik som ascorbinsyre, polypeptider med lav molekylvekt (mindre enn ca.

10 rester), proteiner, aminosyrer, carbohydrater, inkludert

glucose, sucrose eller dextriner, chelateringsmidler, slik som EDTA, glutathion og andre stabiliseringsmidler og eksipienser. Nøytral, bufret saltoppløsning eller saltoppløsning blandet med ikke-spesifikt serumalbumin, er eksempler på passende fortynningsmidler. Produkt formuleres fortrinnsvis som et lyo-filisat under anvendelse av passende eksipiensoppløsninger ( f.eks. sucrose) som fortynningsmidler. Passende doseringer kan bestemmes ved forsøk. Mengden av hyppigheten av adminis-trering vil selvsagt avhenge av slike faktorer som typen og alvorligheten av indikasjonen som behandles, den.ønskede respons, pasientens tilstand osv.

Oppløselige TNF-R-proteiner administreres for det formål å inhibere TNF-avhengige responser. Mange forskjellige sykdommer eller tilstander antas å være forårsaket av TNF, slik som cachexi og septisk sjokk. I tillegg kan også andre nøkkelcytokiner (IL-1, IL-2 og andre kolonistimulerende faktorer) indusere betydelig vertproduksjon av TNF. Oppløselige TNF-R-preparater kan derfor anvendes f.eks. til å behandle cachexi eller septisk sjokk, eller til å behandle bivirkninger forbundet med cytokinterapi. Ettersom de primære rollene som IL-1 og 11-2 spiller i produksjonen av TNF, vil kombina-sjonsterapi under anvendelse av både Il-l-reseptorer og IL-2-reseptorer kunne være foretrukket ved behandlingen av TNF-assosierte, kliniske indikasjoner.

De følgende eksempler er gitt som illustrasjon.

Eksempler

Eksempel 1

Bindinqsanalvser

A. Radioaktiv merking av TNFa og TNFB. Rekombinant human-TNFa, i form av et fusjonsprotein som inneholder et hydrofilt octapeptid i N-enden, ble uttrykt i gjær som et utskilt protein og renset ved affinitetskromatografi (Hopp et al., Bio/ Technology 6:1204, 1988). Renset, rekombinant human-TNFp ble levert fra R & D Systems (Minneapolis, MN). Begge proteinene ble merket radioaktivt ved å bruke det kommersielt tilgjengelige fastfasemiddel "I0D0-GEN" (Pierce). Ved denne fremgangsmåten ble 5 ug "I0D0-GEN" utplatet i bunnen av et 10 x 75 mm glassrør, og det ble inkubert i 20 minutter ved 4°C med 75 pl 0,1 M natriumfosfat, pH 7,4, og 20 pl (2 mCi) Na 12<5>I. Denne oppløsningen ble så overført til et andre glassrør inneholdende 5 ug TNFa (eller TNFp) i 45 pl PBS i 20 minutter ved 4°C. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved gelfiltrering på en "Sephadex G—25" (Sigma) med 2 ml lagvolum ekvilibrert i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium inneholdende 2,5 % (vekt/volum) bovint serumalbumin (BSA), 0,2%

(vekt/volum) natriumazid og 20 mM Hepes, pH 7,4 (bindingsmedium). Den endelige mengde av 12<5>I-TNF ble fortynnet til en forrådsoppløsning med 1 x 10"<7> M i bindingsmedium og lagret i opptil én måned ved 4°C uten påvisbart tap av reseptorbind-ingsaktivitet. Den spesifikke aktivitet er rutinemessig 1 x 10<6 >cpm/mmol TNF.

B. Binding til intakte celler. Bindingsanalyser med intakte celler ble utført ved hjelp av to metoder. Ved den første metoden ble celler først dyrket enten i suspensjon

(f.eks. U 937) eller ved adherens på vevkulturplater (f.eks. WI26-VA4, COS-celler som uttrykker den rekombinante TNF-reseptor). Adherente celler ble deretter fjernet ved behandling med 5 mM EDTA i 10 minutter ved 37°C. Bindingsanalyser ble så ut-ført ved hjelp av en fthalatoljeseparasjonsmetode (Dower et al., J. Immunol. 132:751, 1984), hovedsakelig som beskrevet av Park et al. ( J. Biol. Chem. 261:4177, 1986). Ikke-spesifikk binding av <125>I-TNF ble målt i nærvær av et 200 ganger eller mer molart overskudd av umerket TNF. Natriumazid (0,2%) ble inkludert i en bindingsanalyse for å inhibere internalisering av <125>I-TNF av celler. I den andre metoden ble COS-celler transfektert med det TNF-R-holdige plasmid og som uttrykker TNF-reseptorer på overflaten, testet med hensyn på evne til å binde <125>I-TNF ved platebindingsanalysen beskrevet av Sims et al. ( Science 241:585, 1988).

C. FastfaseMndingsanalyser. Evnen til TNF-R når det gjelder å bli adsorbert stabilt til nitrocellulose fra deter-gentekstrakter av humanceller som fortsatt har TNF-bindingsaktivitet i behold, ga et middel for påvisning av TNF-R. Celleekstrakter ble fremstilt ved å blande en cellepellet med et 2 x volum av PBS inneholdende 1% "Triton X-100" og en blanding av proteaseinhibitorer (2 mM fenylmethylsulfonylfluorid, 10 uM pepstatin, 10 uM leupeptin, 2 mM o-fenanthrolin og 2 mM EGTA) ved kraftig vorteksbehandling. Blandingen ble inkubert på is i 30 minutter, hvoretter den ble sentrifugert ved 12.000 x g i

15 minutter ved 8°C for å fjerne kjerner og andre rester.

To mikroliter aliquoter av celleekstrakter ble plassert på tørre BA85/21-nitrocellulosemembraner (Schleicher og Schuell, Keene, NH) og fikk tørke. Membranene ble inkubert i vevkul-turskåler i 30 minutter i tris-bufret (0,05 M) saltoppløsning (0,15 M), pH 7,5, inneholdende 3% vekt/volum BSA for å blokkere ikke-spesifikke bindingsseter. Membranen ble så dekket med 5 x IO"11 M <125>I-TNF i PBS + 3% BSA og inkubert i 2 timer ved 4°C med risting. Mot slutten av denne tiden ble membranene vasket tre ganger i PBS, tørket og plassert på "Kodak X-Omat AR"-film i 18 timer ved -70°C.

Eksempel 2

Isolering av human- TNF- R- cDNA ved direkte ekspresjon av aktivt protein i C0S- 7- celler

Forskjellige humancellelinjer ble screenet med hensyn på ekspresjon av TNF-R basert på deres evne til å binde 125I-merket TNF. Humanfibroblastcellelinjen WI-26 VA4 ble funnet å uttrykke et rimelig antall reseptorer pr. celle. Ekvilibrium-undersøkelser viste at cellelinjen viste tofasisk binding av <125>I-TNF med omtrent 4.000 høyaffinitetsseter (Ka = 1 x IO<10> N<T1>) og 1.500 lavaf f initetsseter (Ka = 1 x IO<8> M"<1>) pr. > celle.

Et usortert cDNA-bibliotek ble konstruert ved hjelp av reverstranskripsjon av polyadenylert mRNA isolert fra total-RNA ekstrahert fra humanfibroblast WI-26 VA4-celler dyrket i nærvær av kermesbærmitogen under anvendelse av stan-dardteknikker (Gubler et al., Gene 25:263, 1983; Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, 1987). Cellene ble innhøstet ved å lysere cellene i en guani-dinhydrokloridoppløsning, og total-RNA ble isolert som tidligere beskrevet (March et al., Wature 315:641, 1985).

Poly A<+->RNA ble isolert ved oligo-dT-cellulosekroma-tografi og dobbelttrådet cDNA fremstilt ved hjelp av en lignende metode som den til Gubler og Hoffman ( Gene 25:263, 1983). I korte trekk ble poly A<*->RNA-en omdannet til en RNA-cDNA-hybrid ved hjelp av reverstranskriptase under anvendelse av oligo-dT som en primer. RNA-cDNA-hybriden ble så omdannet til dobbelttrådet cDNA under anvendelse av RNAse H i kombina-sjon med DNA-polymerase I. Den resulterende, dobbelttrådete cDNA ble gjort buttendet med T4-DNA-polymerase. Til den buttendede cDNA tilsettes EcoRI-linker-adaptere (med indre Wotl-seter) som ble fosforylert bare på én ende ("Invitrogen" ). Den linkertilpassede cDNA ble behandlet med T4-polynukleotidkinase for å fosforylere det 5' overhengende område i linkeradapteren, og uligerte linkere ble fjernet ved å kjøre cDNA-en over en "Sepharose CL4B"-kolonne. Den linkertilpassede cDNA ble ligert til en ekvimolar konsentrasjon av EcoRl-kutt og de defosforylerte armer av bakteriofag Agt10 (Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, red., IRL Press, s. 49-78). Den ligerte DNA ble pakket i fag-partikler under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig sett for å frembringe et bibliotek av rekombinanter (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, US). Rekombinanter ble ytterligere amplifisert ved utplating av fag på et bakterieteppe av E. coli-stamme c600 (hfl").

Fag-DNA ble renset fra det resulterende XgtlO-cDNA-bibliotek og cDNA-innføyelsene fjernet ved nedbrytning med restriksjonsenzymet Noti. Etter elektroforese av nedbryt-ningsproduktet gjennom en agarosegel ble cDNA-er større enn 2.000 bp, isolert.

De resulterende cDNA-er ble ligert i den eukaryote ekspresjonsvektor pCAV/NOT som ble utformet for å uttrykke cDNA-sekvenser innføyet i dens multiple kloningssete når den var transfektert i pattedyrceller. pCAV/NOT ble satt sammen fra pDC201 (et derivat av pMLSV, tidligere beskrevet av Cosman et al., Nature 312:768, 1984), SV40 og cytomegalovirus-DNA, og omfatter i rekkefølge med transkripsjonsretningen fra replikasjonsopprinnelsesstedet: (1) SV40-sekvenser fra koordinatene

5171-270 inkludert replikasjonsopprinnelsesstedet, fremmer-sekvenser og "tidlige" og "sene" promoterer; (2) cytomegalo-virussekvenser inkludert promoter- og fremmerområdene (nukleo-tidene 671 til +63 fra sekvensen publisert fra Boechart et al.

(Cell 41:521, 1985)); (3) adenovirus-2-sekvenser som inneholder det første ekson og en del av intronet mellom det første og det andre ekson i den tredelte leder, det andre ekson og en del av det tredje ekson i den tredelte leder og et multippelkloningssete (MCS) inneholdende setene for Xhol, Kpnl, Smal, Noti og Bgll; (4) SV40-sekvenser fra koordinatene 4127-4100 og 2770-2533 som omfatter polyadenylerings- og ter-mineringssignalene for "tidlig"-transkripsjon; (5) sekvenser avledet fra pBR322 og virusassosierte sekvenser VAI og VAI I fra pDC201, idet adenovirussekvensene 10532-11156 inneholder VAI- og VAII-genene, etterfulgt av pBR322-sekvenser fra 4363-2486 og 1094-375 inneholdende ampicillinresistensgenet og replikasjonsopprinnelsesstedet.

Det resulterende WI-26-VA4-cDNA-bibliotek i pCAV/NOT ble brukt til å transformere E. coli-stamme DH5a, og rekombinanter ble platet ut, hvorved man fikk omtrent 800 kolonier pr. plate og tilstrekkelig med plater til å tilveiebringe omtrent i alt 50.000 kolonier pr. undersøkelse. Kolonier ble skrapt fra hver plate, slått sammen og plasmid-DNA fremstilt fra hver blanding. Den blandede DNA ble så brukt til å transfektere et subsammenflytende lag av ape-COS-7-celler under anvendelse av DEAE-dextran etterfulgt av klorkinbehandling, som beskrevet av Luthman et al. (Nucl. Rcids Res. 11:1295, 1983) og McCutchan et al. (J. Nati. Cancer Inst. 41:351, 1986). Cellene ble så dyrket i kultur i tre dager for å mulig-gjøre forbigående ekspresjon av de innføyde sekvenser. Etter tre dager ble cellekultursupernatanter kastet, og cellemonolagene i hver plate ble analysert med hensyn på TNF-binding på følgende måte. 3 ml bindingsmedium inneholdende 1,2 x 10"<11> M

<125>I-merket "FLAG"-TNF ble tilsatt til hver plate, og platene ble inkubert ved 4°C i 120 minutter. Dette mediet ble så kastet, og hver plate ble vasket én gang med kaldt bindingsmedium (ikke inneholdende noe merket TNF) og to ganger med kald PBS. Kantene på hver plate ble så brutt av, hvorved det ble tilbake en flat skive som ble brakt i kontakt med røntgenfilm i 72 timer ved -70°C under anvendelse av en forsterkingsskjerm. TNF-bindingsaktivitet ble visualisert på de eksponerte filmer som en mørk flekk mot en forholdsvis enhetlig bakgrunn.

Etter at omtrent 240.000 rekombinanter fra biblioteket var blitt screenet på denne måte, ble én transfektantblanding observert å gi TNF-bindingsflekker som var klart synlige mot bakgrunnseksponeringen.

Et nedfryst forråd av bakterier fra den positive blanding ble så brukt til å oppnå plater med omtrent 150 kolonier. Replikaer av disse platene ble gjort på nitrocellulose-filtre, og platene ble så skrapt og plasmid-DNA fremstilt og transfektert som beskrevet ovenfor for å identifisere en posi-tiv plate. Bakterier fra individuelle kolonier fra nitrocel-lulosereplikaene av denne platen ble dyrket i 0,2 ml kulturer som ble brukt til å erholde plasmid-DNA, som ble transfektert i C0S-7-celler som beskrevet ovenfor. På denne måte ble det isolert en enkelt klon, klon 1, som var i stand til å indusere ekspresjon av human-TNF-R i COS-celler. Ekspresjonsvektoren pCAV/NOT som inneholder TNF-R-cDNA-klon 1, er blitt deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA (deponeringsnr. 68088) under navnet

pCAV/NOT-TNF-R.

Eksempel 3

Konstruksjon av cDNA- er som koder for oppløselig huTNF- RA235

En cDNA som koder for en oppløselig huTNF-RA235 (med sekvensen til aminosyrene 1-235 i figur 2), ble konstruert ved å skjære ut et 80 bp stort fragment fra pCAV/NOT-TNF-R med restriksjonsenzymene Noti og Pvu2. Noti kutter i det multiple kloningssete til pCAV/NOT-TNF-R, og Pvu2 kutter innenfor det TNF-R-kodende område 20 nukleotider 5' i forhold til transmembranområdet. For å rekonstruere 3'-enden til TNF-R-sekvensene ble to oligonukleotider syntetisert og føyd sammen for å skape den følgende oligonukleotidlinker:

Denne oligonukleotidlinker har terminale Pvu2- og Bgl2-restriksjonsseter, regenerer 20 nukleotider i TNF-R, etterfulgt av et termineringskodon (understreket) og et BamHl-restriksjonssete (for å lette isoleringen av hele den oppløselige TNF-R ved Notl/BamHl-nedbrytning). Dette oligonukleotidet ble så ligert med 840 bp Notl/Pvu2-TNF-R-innføyelsen i Bgl2/Notl-kuttet pCAV/NOT, hvorved man fikk psolhuTNF-RA235/CAVNOT som ble transfektert i C0S-7-celler som beskrevet ovenfor. Denne ekspresjonsvektor induserte ekspresjon av oppløselig human-TNF-R som var i stand til å binde TNF.

Eksempel 4

Konstruksjon av cDNA- er som koder for oppløselig huTNF- RA! 85

En cDNA som koder for en oppløselig huTNF-RAl85 (med sekvensen til aminosyrene 1-185 i figur 2), ble konstruert ved å skjære ut et 640 bp stort fragment fra pCAV/NOT-TNF-R med restriksjonsenzymene Noti og Bgl2. Noti kutter i det multiple kloningssetet til pCAV/N0-TNF-R, og Bgl2 kutter innenfor det TNF-R-kodende område ved nukleotid 637, som er 237 nukleotider 5' fra transmembranområdet. De følgende oligonukleotidlinkere ble syntetisert:

De ovenfor nevnte oligonukleotidlinkere rekonstruerer 3'-enden til reseptormolekylet opp til nukleotid 708, etterfulgt av et termineringskodon (understreket). Disse oligonukleotidene ble ligert med den 640 bp store Notl-TNF-R-innføyelse i Noti-kuttet pCAV/NOT, hvorved man fikk ekspresjonsvektoren psolTNFRAl85/CAVNOT som ble transfektert i C0S-7-celler som beskrevet ovenfor. Denne ekspresjonsvektoren induserte ekspresjon av oppløselig human-TNF-R som var i stand til å binde

TNF.

Eksempel 5

Konstruksjon av cDNA- er som koder for oppløselig huTNF- RAl63

En cDNA som koder for en oppløselig huTNF-RAl63 (med sekvensen til aminosyrene 1-163 i figur 2), ble konstruert ved å skjære ut et 640 bp stort fragment fra pCAV/NOT-TNF-R med restriksjonsenzymene Noti og Bgl2, som beskrevet i eksempel 4. De følgende oligonukleotidlinkere ble syntetisert:

Denne ovenfor nevnte oligonukleotidlinker rekonstruerer 3'-enden til reseptormolekylet opp til nukleotid 642 (aminosyre 163), etterfulgt av et termineringskodon (understreket). Dette oligonukleotidet ble så ligert med den 640 bp store Not1-TNF-R-innføyelse i Noti-kuttet pCAV/NOT, hvorved man fikk ekspresjonsvektoren psolTNFRAl63/CAVNOT som ble transfektert i C0S-7-celler som beskrevet ovenfor. Denne ekspresjonsvektoren induserte ekspresjon av oppløselig human-TNF-R som var i stand til å binde TNF i bindingsanalysen beskrevet i eksempel 1.

Eksempel 6

Konstruksjon av cDNA- er som koder for oppløselig huTNF- RA! 42

En cDNA som koder for en oppløselig huTNF-RAl42 (med sekvensen til aminosyrene 1-142 i figur 2), ble konstruert ved å skjære ut et 550 bp stort fragment fra pCAV/NOT-TNF-R med restriksjonsenzymene Noti og AlwNl. AlwNl kutter innenfor det TNF-R-kodende område ved nukleotid 549. Den følgende oligonukleotidlinker ble syntetisert:

Denne ovenfor nevnte oligonukleotidlinker rekonstruerer 3'-enden til reseptormolekylet opp til nukleotid 579 (aminosyre 142), etterfulgt av et termineringskodon (understreket). Dette oligonukleotidet ble så ligert med den 550 bp store Notl/AlwNl-TNF-R-innføyelse i Notl/Bgl2-kuttet pCAV/NOT, hvorved man fikk ekspresjonsvektoren psolTNFRAl42/CAVNOT som ble transfektert i C0S-7-celler som beskrevet ovenfor. Denne ekspresjonsvektoren induserte ikke ekspresjon av oppløselig human-TNF-R som var i stand til å binde TNF. Det antas at denne bestemte konstruksjon ikke uttrykte biologisk aktiv TNF-R ettersom én eller flere essensielle cysteinrester (f.eks. Cys<157> eller Cys<163>) påkrevet for intramolekylær binding (for dannelse av den korrekte tertiærstruktur i TNF-R-molekylet) var fjernet.

Eksempel 7

Ekspresjon av oppløselige TNF- reseptorer i CHO- celler

Oppløselig TNF-reseptor ble uttrykt i kinesisk hamsterovarie- (CH0-) celler under anvendelse av glutamin-syn-tetase- (GS-) genamplifikasjonssystemet, i det vesentlige som beskrevet i PCT-patentsøknader nr. W087/04462 og W089/01036. I korte trekk transfekteres CHO-celler med en ekspresjonsvektor som inneholder gener for både TNF-R og GS. CHO-celler selekteres med hensyn på GS-genekspresjon basert på evnen til den transfekterte DNA når det gjelder å gi resistens til lave nivåer av methioninsulfoximin (MSX). GS-sekvensamplifikasjoner i slike celler selekteres under anvendelse av forhøyede MSX-konsentrasjoner. På denne måte amplifiseres også tilgrensende TNF-R-sekvenser, og forøkt TNF-R-ekspresjon oppnås.

Vektoren som ble brukt i GS-ekspresjonssystemet, var psolTNFR/P6/PSVLGS, som ble konstruert på følgende måte. Først ble vektoren pSVLGS.l (beskrevet i PCT-patentsøknader nr. W087/04462 og W089/01036, og tilgjengelig fra Celltech, Ltd., Berkshire, Storbritannia) kuttet med BamHl-restriksjonsenzymet og defosforylert med alkalisk fosfatase fra kalvetarm (CIAP) for å forhindre at vektoren religerer til seg selv. Det BamHl-kuttede pSVLGS. 1-fragment ble så ligert til et 2,4 kb BamHl-Bgl2-fragment i pEE6hCMV (beskrevet i PCT-søknad nr. W089/01036, også tilgjengelig fra Celltech) som ble kuttet med Bgl2, BamHl og Fspl for å unngå to fragmenter med lik størr-else, hvorved man fikk en 11,2 kb stor vektor betegnet p6/PSVLGS.l. pSVLGS.l inneholder det glutaminsyntetase-selekterbare markørgen under kontroll av SV40-"sen"-promoteren. BamHl-Bgl2-fragmentet i pEE6hCMV inneholder den humane, viktigste, umiddelbart "tidlige" cytomegaloviruspro-moter (hCMV), en polylinker og det SV40 "tidlige" polyadenyl-eringssignal. De kodende sekvenser for oppløselig TNF-R ble addert til p6/PSVLGS.l ved å skjære ut et Noti-BamHl-fragment fra ekspresjonsvektoren psolTNFR/CAVNOT (laget i henhold til eksempel 3 ovenfor), buttendedannelse med Klenow og ligering med Smal-kuttet, defosforylert p6/PSVLGS.l, hvorved de solTNF-R-kodende sekvenser ble plassert under kontroll av hCMV-promoteren. Dette resulterte i en enkelt plasmidvektor hvor SV40/GS- og hCMB/solTNF-R-transkripsjonsenhetene transkriberes i motsatte retninger. Denne vektoren ble betegnet psolTNFR/P6/PSVLGS.

psolTNFR/P6/PSVLGS ble brukt til å transfektere CHO-Kl-celler (tilgjengelige fra ATCC, Rockville, MD, under depon-

eringsnr. CCL 61) på følgende måte. Et monolag av CH0-K1-celler ble dyrket til sammenflytning i "Minimum Essential Medium (MEM) 10X" (Gibco: 330-1581AJ) uten glutamin og supplert med 10% dialysert, bovint fosterserum (Gibco: 220-6300AJ), 1 mM natriumpyruvat (Sigma), MEM ikke-essensielle aminosyrer (Gibco: 320-1140AG), 500 uM asparagin og glutamat (Sigma), og nukleosider (30 uM adenosin, guanosin, cytidin og uridin, og 10 uM thymidin) (Sigma).

Omtrent 1 x IO<6> celler pr. 10 cm petriskål ble transfektert med 10 ug psolTNFR/P6/PSVLGS ved hjelp av standard kalsiumfosfatutfelling, hovedsakelig som beskrevet av Graham & van der Eb, Virology 52:456 (1983). Celler ble underkastet glycerolsjokk (15% glycerol i serumfritt dyrkningsmedium i omtrent 1,5 minutt) omtrent 4 timer etter transfeksjon, i det vesentlige som beskrevet av Frost & Williams, Virology 91:39

(1978), og så vasket med serumfritt medium. Én dag senere fikk transfekterte celler friskt, selektivt medium inneholdende MSX ved en sluttkonsentrasjon på 25 uM. Kolonier av MSX-resistente, overlevende celler ble synlige innen 3-4 uker. Overlevende kolonier ble overført til 24-brønners plater og fikk vokse til sammenflytning i selektivt medium. Kondisjonert medium fra sammenflytende brønner ble så analysert med hensyn på oppløselig TNF-R-aktivitet under anvendelse av bindingsanalysen beskrevet i eksempel 1 ovenfor. Disse analysene indikerte at koloniene uttrykte biologisk aktivt, oppløselig

TNF-R.

For å selektere med hensyn på GS-genamplifikasjon transfekteres flere MSX-resistente cellelinjer med psolTNFR/P6/PSVLGS og dyrkes i forskjellige konsentrasjoner av MSX. For hver cellelinje plates omtrent 1 x IO<6> celler ut i gradvis økende konsentrasjoner av 100 uM, 250 uM, 500 uM og

1 mM MSX, og det inkuberes i 10-14 dager. Etter 12 dager kommer kolonier som er resistente mot de høyere nivåer av MSX, til syne. De overlevende kolonier analyseres med hensyn på TNF-R-aktivitet under anvendelse av bindingsanalysen beskrevet ovenfor i eksempel 1. Hver av disse høyresistente cellelinjer inneholder celler som skriver seg fra multiple, uavhengige amplifikasjoner. Fra disse cellelinjene isoleres én eller flere av de mest resistente celler. De amplifiserte celler med de høye produksjonshastigheter klones så ved begrensende for-tynningskloning. Massecellekulturer av trans f ekt ant ene utskiller aktivt, oppløselig TNF-R.

Eksempel 8

Ekspresjon av oppløselig human- TNF- R i q- jær

Oppløselig human-TNF-R ble uttrykt i gjær med ekspresjonsvektoren pIXY432 som var avledet fra gjærekspresjonsvektoren pIXY120 og plasmid pYEP352. pIXY120 er identisk med pYaHuGM (ATCC 53157), bortsett fra at den ikke inneholder noen cDNA-innføyelse og omfatter et polylinker-/multippel-kloningssete med et Ncol-restriksjonssete.

Et DNA-fragment som koder for TNF-reseptor og er egnet for kloning i gjærekspresjonsvektoren pIXY120, ble først frembrakt ved polymerasekjedereaksjons- (PCR-) amplifikasjon av den ekstracellulære del av fullengdereseptoren fra pCAV/NOT-TNF-R (ATCC 68088). Følgende primere ble brukt ved denne PCR-amplifikasjon.

5 '-ende-oligonukleotidprimeren brukt ved amplif ikas j onen, inkluderte et Asp718-restriksjonssete i 5'-enden, etterfulgt av nukleotider som koder for 3'-enden i gjær-a-faktor-ledersekvensen (Pro-Leu-Asp-Lys-Arg), og de som koder for de 8 aminosyrene i "FLAG"-peptidet (AspTyrLysAspAspAspAspLys), ble fusjonert til sekvens som koder for 5'-enden i den fullt ferdige reseptor. "FLAG"-peptidet (Hopp et al., Bio/ Technology 6:1204, 1988) er en svært antigen sekvens som reversibelt bindes til det monoklonale antistoff Ml (ATCC HB 9259). Oligonukleotidet brukt til å generere 3'-enden i det PCR-avledede fragment, er ant isens-tråden i DNA-kodende sekvenser som av-slutter den åpne leseramme i reseptoren etter nukleotid 704 i det fullt ferdige, kodende område (etter Asp-resten som kommer forut for transmembranområdet) ved å innføre et TAA-stoppkodon (understreket). Stoppkodonet etterfølges så av et BamHl-restriksjonssete. DNA-sekvensene som koder for TNF-R, amplifiseres så ved hjelp av PCR, i det vesentlige som beskrevet av Innis et al., red., PCR Protocols: R Guide to Methods and Applications (Academic Press, 1990).

Det PCR-avledede DNA-fragment som koder for oppløselig human-TNF-R, ble subklonet i gjærekspresjonsvektoren pIXY120 ved å nedbryte det PCR-avledede DNA-fragment med BamHl- og Asp718-restriksjonsenzymer, nedbryte pIXY120 med BamHl og Asp718, og ligere PCR-fragmentet i kuttvektoren in vitro med T4-DNA-ligase. Den resulterende konstruksjon (pIXY424) fusjonerte den åpne leseramme i den "FLAG"-oppløse-lige TNF-reseptor i ramme til den komplette a-faktor-ledersekvens og plasserte ekspresjon i gjær under beskyttelse av den regulerte gjæralkoholdehydrogenase- (ADH2-) promoter. Identitet til nukleotidsekvensen i den oppløselige TNF-reseptor båret i pIXY424 sammenlignet med de i cDNA-klon 1, ble veri-fisert ved hjelp av DNA-sekvensering under anvendelse av dideoxynukleotid-kjedetermineringsmetoden. pIXY424 ble så transformert i E. coli-stamme RR1.

Oppløselig human-TNF-reseptor ble også uttrykt og

utskilt i gjær i en andre vektor. Denne andre vektor ble frembrakt ved å utvinne pIXY424-plasmidet fra E. coli og nedbryte med EcoRl- og BamHl-restriksjonsenzymer for å isolere fragmentet som spenner over området som koder for ADH2-promoteren, a-faktor-lederen, den "FLAG"-oppløselige TNF-reseptor og stoppkodonet. Dette fragmentet ble ligert in vitro i EcoRl- og BamHl-kuttet plasmid pYEP352 (Hill et al., Yeast 2:163

(1986)), hvorved man fikk ekspresjonsplasmidet pIXY432 som ble transformert i E. coli-stamme RR1.

For å fastsette sekresjon av den oppløselige human-

TNF-reseptor fra gjær ble pIXY424 renset og innført i en

diploid gjærstamme av S. cerevisiae (XV2181) ved elektroporering og seleksjon for tilegnelse av det plasmidbårne gjær-TRPl<+->gen på medier som mangler tryptofan. For å fastsette sekresjon av reseptoren styrt av pIXY432, ble plasmidet innført i gjær-stammen PB 149-6b ved elektroporering etterfulgt av seleksjon med hensyn på det plasmidbårne URA3<+->gen med vekst på medier som mangler uracil. Over natten-kulturer ble dyrket ved 30°C i de passende seleksjonsmedier. PB149-6b/pIXY434-transformantene ble fortynnet i YEP-1% glucosemedier og dyrket ved 30°C i 38-40 timer. Supernatanter ble fremstilt ved fjerning av celler ved sentrifugering og filtrering av supernatantene gjennom 0,45 pm filtre.

Nivået av utskilt reseptor i supernatantene ble bestemt ved immuno-"dotblot". I korte trekk ble 1 pl av supernatanter og fortynninger av supernatantene flekket på nitro-cellulosefiltre og fikk tørke. Etter blokkering av ikke-spesifikk proteinbinding med en 3% BSA-oppløsning ble filtrene inkubert med fortynnet Ml-anti-"FLAG"-antistoff, overskudd av antistoff ble fjernet ved vasking, og så ble fortynninger av pepperrotperoxydasekonjugerte anti-mus-IgG-antistoffer inkubert med filtrene. Etter fjerning av overskudd av sekun-dærantistoffer ble peroxydasesubstrater tilsatt, og fargefrem-kalling fikk forløpe i omtrent 10 minutter før fjerning av substratoppløsningen.

Det anti-"FLAG"-reaktive materiale funnet i supernatantene, viste at betydelige nivåer av reseptor ble utskilt ved begge ekspresjonssystemene. Sammenligninger viste at pIXY432-systemet utskilte omtrent 8-16 ganger mer oppløselig human-TNF-reseptor enn pIXY424-systemet. Supernatantene ble analysert med hensyn på oppløselig TNF-R-aktivitet, som beskrevet i eksempel 1, ved deres evne til å binde <125>I-TNFa og blokkere TNFa-binding. pIXY432-supernatantene ble funnet å inneholde betydelige nivåer av aktivt, oppløselig TNF-R.

Eksempel 9

Isolering av murin- TNF- R- cDNA- er

Murin-TNF-R-cDNA-er ble isolert fra et cDNA-bibliotek laget av murine 7B9-celler, en antigenavhengig hjelper-T-cellelinje avledet fra C57BL/6-raus, ved artskrysningshybridisering med en human-TNF-R-probe. cDNA-biblioteket ble konstruert i A.ZAP (Stratagene, San Diego), i det vesentlige som beskrevet ovenfor i eksempel 2, ved å isolere polyadenylert RNA fra 7B9-cellene.

En dobbelttrådet human-TNF-R-cDNA-probe ble fremstilt ved å skjære ut et omtrent 3,5 kb Notl-fragment i human-TNF-R-klon 1 og <32>P-merke cDNA-en under anvendelse av vilkårlige primere (Boehringer-Mannheim).

Det murine cDNA-bibliotek ble amplifisert én gang, og i alt ble 900.000 plakker screenet, hovedsakelig som beskrevet i eksempel 2, med human-TNF-R-cDNA-proben. Omtrent 21 positive plakker ble renset, og "Bluescript"-plasmidene inneholdende EcoRl-tilknyttede innføyelser, ble skåret ut (Stratagene, San Diego). Nukleinsyresekvensering av en del av murin TNF-R-klon 11 indikerte at den kodende sekvens for den murine TNF-R var omtrent 88% homolog med den tilsvarende nukleotidsekvens i human-TNF-R. En partiell nukleotidsekvens i murin-TNF-R-cDNA-klon 11 er angitt i figurene 4-5.

Eksempel 10

Fremstilling av monoklonale antistoffer mot TNF- R

Preparater av renset, rekombinant TNF-R, f.eks. human-TNF-R, eller transfekterte COS-celler som uttrykker høye nivåer av TNF-R, anvendes til å generere monoklonale antistoffer mot TNF-R under anvendelse av konvensjonelle teknikker, f.eks. de som er beskrevet i US patentskrift nr. 4 411 993. Slike antistoffer vil sannsynligvis være anvendbare når det gjelder å virke inn på TNF-binding til TNF-reseptorer, f.eks. ved bedring av toksiske eller andre uønskede virkninger av TNF, eller som komponenter i diagnostiske eller forsknings-analyser med hensyn på TNF eller oppløselig TNF-reseptor.

For å immunisere mus emulgeres TNF-R-immunogen i komplett Freunds adjuvans og injiseres subkutant i Balb/c-mus i mengder i området 10-100 pg. 10 til 12 dager senere forsterkes de immuniserte dyrene med ytterligere immunogen emulgert i ukomplett Freunds adjuvans og forsterkes deretter periodevis etter en ukentlig til to-ukentlig immuniseringsplan. Serum-prøver tas periodevis ved retroorbital blodtapping eller hale-tippfjerning for testing ved hjelp av "dot-blot"-analyse (antistoff-sandwich) eller ELISA (enzymbundet immunosorbent-analyse). Andre analysefremgangsmåter er også egnet. Etter påvisning av en passende antistoff titer gis positive dyr en intravenøs injeksjon av antigen i saltoppløsning. Tre til fire dager senere avlives dyrene, splenocytter innhøstes, og de fusjoneres til den murine myelomcellelinje NS1. Hybridom-cellelinjene generert ved hjelp av denne fremgangsmåten, plates ut i multiple mikrotiterplater i et HAT selektivt medium (hypoxanthin, aminopterin og thymidin) for å inhibere proliferasjon av ikke-fusjonerte celler, myelomhybrider og milteellehybrider.

Hybridomkloner frembrakt på denne måte, , kan under-søkes ved hjelp av ELISA med hensyn på reaktivitet med TNF-R, f.eks. ved tilpasninger av teknikkene beskrevet av Engvall et al., Immnnochem. 8:871 (1971) og i US patentskrift nr. 4 703 004. Positive kloner injiseres så i peritonealhulene til syngene Balb/c-mus for å fremstille en væskeansamling i buk-hulen som inneholder høye konsentrasjoner (>1 mg/ml) av anti-TNF-R monoklonalt antistoff. Det resulterende, monoklonale antistoff kan renses ved ammoniumsulfatutfelling etterfulgt av gelutelukkelseskromatografi, og/eller affinitetskromatografi basert på binding av antistoff til protein A fra Staphylococcus aureus.

Claims (11)

1. Isolert DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for et biologisk aktivt pattedyr-TNF-reseptor (TNF-R)-protein utvalgt fra: (a) aminosyrene 1-x i fig. 2, hvori x er utvalgt fra aminosyrene 163-235; og (b) aminosyrene 1-233 i fig. 4, og substituerte, deleterte eller modifiserte analoger derav med tilsvarende biologisk aktivitet

2. Isolert DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for et biologisk aktivt pattedyr-TNF-reseptor (TNF-R)-protein utvalgt fra: (a) DNA-sekvenser utvalgt fra det kodende område til det native pattedyr-TNF-R-gen i fig. 2-3 eller fig. 4-5; (b) DNA-sekvenser som har evnen til å hybridisere til sekvensene i (a) under middels stringente betingelser, dvs. 50 °C i 2 x SSC: og (c) DNA-sekvenser som er degenerert som følge av den genetiske kode til sekvensene i (a) - (b).

3. Isolert sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den koder for et oppløselig humant TNF-R-protein omfattende sekvensen av aminosyrene 1-235 i fig. 2.

4. Isolert DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den koder for et oppløselig humant TNF-R-protein omfattende sekvensen av aminosyrene 1-185 i fig. 2.

5. Isolert DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den koder for et oppløselig humant TNF-R-protein omfattende sekvensen av aminosyrene 1-163 i fig. 2.

6. Rekombinant ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter en DNA-sekvens ifølge ethvert av kravene 1-6.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av et renset pattedyr-TNF-R-protein, utvalgt fra aminosyrerestene 1-x i fig. 2, hvori x er utvalgt fra aminosyrene 163-235; og aminosyrene 1-233 i fig. 4, karakterisert ved at den omfatter ekspresjon av en egnet ekspresjonsvektor inneholdende DNA-sekvenser ifølge krav 1 og/eller 2 i en egnet vertscelle, hvoretter proteiner isoleres.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, hvori TNF-R-sekvensen omfatter sekvensen av aminosyrerestene 1-235 i fig. 2, karakterisert ved at tilsvarende fremgangsmåte anvendes.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, hvori TNF-R-sekvensen omfatter sekvensen av aminosyrerestene 1-185 i fig. 2, karakterisert ved at tilsvarende fremgangsmåte anvendes.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 7, hvori TNF-R-sekvensen omfatter sekvensen av aminosyrerestene 1-163 i fig. 2, karakterisert ved at tilsvarende fremgangsmåte anvendes.

11. Antistoffer som er immunreaktive med et TNF-reseptorerprotein fra pattedyr, ved bindingsanalyser in vitro, karakterisert ved at TNF-reseptorerproteinet fremstilles ved hjelp av fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 7-10.