PL187400B1 - Białka hybrydowe tworzące heterodimery - Google Patents

Białka hybrydowe tworzące heterodimery

Info

Publication number
PL187400B1
PL187400B1 PL97328454A PL32845497A PL187400B1 PL 187400 B1 PL187400 B1 PL 187400B1 PL 97328454 A PL97328454 A PL 97328454A PL 32845497 A PL32845497 A PL 32845497A PL 187400 B1 PL187400 B1 PL 187400B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
receptor
sequence
subunits
amino acid
fragments
Prior art date
Application number
PL97328454A
Other languages
English (en)
Other versions
PL328454A1 (en
Inventor
Robert K. Campbell
Bradford A. Jameson
Scott C. Chappel
Original Assignee
Applied Research Systems
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Research Systems filed Critical Applied Research Systems
Publication of PL328454A1 publication Critical patent/PL328454A1/xx
Publication of PL187400B1 publication Critical patent/PL187400B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C209/00—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C209/04—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by substitution of functional groups by amino groups
    • C07C209/22—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by substitution of functional groups by amino groups by substitution of other functional groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1 Bialko hybrydowe zawierajace dwie wspóleksprymowane, sekwencje aminokwasowe tworzace dimer gdzie, kazdy dimer zawiera: a) przynajmniej jedna sekwencje aminokwasowa wybrana z grupy obejmujacej receptor zbudowany z takich samych podjed- nostek, lancuch aminokwasowy z receptora zbudowanego z róznych podjednostek, ligand lub fragmenty uprzednio wymienionych czasteczek, które zachowaly zdolnosc wiazania ligandu z receptorem 1 b) podjednostke zbudowanego z róznych podjednostek hormonu bialkowego lub jej fragment który zachowal zdolnosc pod- jednostki do tworzenia heterodimeru z innymi jego podjednostkami, gdzie sekwencje (a) i (b) wiaza sie ze soba bezposrednio lub za posrednictwem linkera peptydowego i w których sekwencja (b) w kazdej z dwóch wspomnianych wspóleksprymowanych sekwencji moze tworzyc, przez agregacje, dimer 2 Bialko hybrydowe wedlug zastrz 1, znamienne tym, ze wspomniana sekwencja (a) jest wybrana z grupy obejmujacej TBP1, TBP2 lub ich fragmenty zawierajace domene wiazaca ligand, zewnatrzkomórkowa domene receptora IFNa/ ß lub receptor IFN? , receptor gonadotropiny lub jego zewnatrzkomórkowe fragmenty, lekkie lancuchy przeciwcial lub ich fragmenty, warunkowo zwiazane z odpowiednim lancuchem ciezkim, ciezkie lancuchy przeciwcial lub ich fragmenty, domeny Fab przeciwcial i IL-6, IFN-ß, TPO lub ich fragmenty 3. Bialko hybrydowe wedlug zastrz 1, znamienne tym, ze wspomniana sekwencja (b) jest wybrana z grupy obejmujacej podjednostki hCG, FSH, LH, TSH lub inhibine badz fragmenty powyzszych. 19 Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca farmaceutycznie dopuszczalny nosnik znam ienna tym, ze zawiera bialko hy- brydowe zawierajace dwie wspoleksprymowane, sekwencje aminokwasowe tworzace dimer, gdzie kazdy dimer zawiera a) przynajmniej jedna sekwencje aminokwasowa wybrana z grupy obejmujacej receptor zbudowany z takich samych podjed- nostek, lancuch ammokwasowy z receptora zbudowanego z róznych podjednostek, ligand lub fragmenty uprzednio wymienionych czasteczek, które zachowaly zdolnosc wiazania ligandu z receptorem 1 b) podjednostke zbudowanego z roznych podjednostek hormonu bialkowego lub jej fragment który zachowal zdolnosc pod- jednostki do tworzenia heterodimeru z innymi jego podjednostkami, gdzie sekwencje (a) 1 (b) wiaza sie ze soba bezposrednio lub za posrednictwem linkera peptydowego i w których sekwencja (b) w kazdej z dwóch wspomnianych wspóleksprymowanych sekwencji moze tworzyc, przez agregacje dimer PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Zgłaszany wynalazek dotyczy białka hybrydowego zbudowanego z dwóch dimeryzujących sekwencji aminokwasowych, które są współeksprymowane, a każda z nich zawiera:
a) przynajmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z pośród sekwencji receptorów hormonów, łańcuch różnopodjednostkowego receptora, ligand i ich fragmenty; i
b) podjednostkę różnopodjednostkowego hormonu białkowego lub jej fragment; w którym (a) i (b) są połączone bezpośrednio lub poprzez linker peptydowy, a każda zbudowana z dwóch podjednostek (b) para jest odmienna i zdolna do tworzenia, poprzez agregację, dimerów.
Dla realizacji prawidłowych fizjologicznych procesów przez komórki i wielokomórkowe organizmy zasadnicze znaczenie mają oddziaływania białko-białko. W naturalnych warunkach liczne białka ujawniają nowe bądź właściwe im funkcje gdy połączą się z jednym lub większą liczbą łańcuchów białkowych. Przykładami są różnorodne połączenia ligand-receptor biorące udział w regulacji aktywności komórki. Określone ligandy, takie jak czynniki nekrotyczne a komórek nowotworowych (TNFa), ΤΝΈβ lub ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG) występują jako kompleksy wielopodjednostkowe. Niektóre z pośród tych kompleksów zbudowane są z wielu kopii takich samych podjednostek.
TNFa i TNFP (które będą łącznie nazywane TNF) są homomultimerami zbudowanymi z trzech identycznych podjednostek (1-4), inne ligandy zbudowane są z różnych podjednostek. Przykładowo, heterodimerem jest hCG (5-7). Również receptory mogą występować, bądź być aktywnymi w postaci kompleksów zbudowanych z wielu łańcuchów białkowych.
Przykładowo, receptor dla TNF może transdukować sygnał po agregacji do dimeru (8,9). Ligandy tych receptorów zapoczątkowują agregowanie dwóch lub trzech łańcuchów tym samym wpływają na mechanizm aktywacji receptora. Przykładowo TNF zależna agregacja aktywuje receptor dla TNF (10-12).
Modulacja oddziaływań białko-białko może być użytecznym sposobem leczenia szeregu chorób i patologii. Rozpuszczone białko wiążące, mogące oddziaływać z ligandem, potencjalnie może powodować oderwanie ligandu od receptora, a w konsekwencji ograniczyć poziom wzbudzenia szlaku transdukcji sygnału zależnego od określonego receptora. Alternatywnie, oddysocjowanie ligandu może opóźnić jego usuwanie lub degradację, a w konsekwencji wydłużać jego czas działania i prawdopodobnie czas występowania in vivo jego aktywności w przypadku TNF, rozpuszczalne receptory dla TNF pierwotnie były związane z hamowaniem aktywności TNF (13-17).
Rozpuszczalne białka wiążące mogą być użyteczne w terapii chorób człowieka. Przykładowo, na zwierzęcym modelu zapalenia stawów pokazano skuteczność działania rozpuszczalnego receptora dla TNF.
187 400
Ponieważ TNF posiada trzy miejsca wiązania specyficznego dla niego receptora (10-12) i dimeryzacja powierzchniowego receptora komórkowego wystarcza dla ukonstytuowania jego aktywności biologicznej (8,9) to prawdopodobnie związanie jednego rozpuszczalnego receptora dla TNF pozostawi możliwość, że ten 1:3 kompleks rozpuszczalny receptor:TNF (trimer) nadal może wiązać i aktywować parę powierzchniowych receptorów dla TNF. Aby osiągnąć efekt hamowania należy oczekiwać, że zasiedlone lub zablokowane, w trimerze TNF, przez rozpuszczalne białko wiązące, muszą być dwa pozostałe miejsca wiązania receptora. Alternatywnie, białko wiążące może umożliwiać odpowiednie zorientowanie TNF na powierzchni komórki.
Ogólnie rzecz biorąc powstała potrzeba syntezy białek niosących dwa łańcuchy receptora (lub ligandy) jako białka będącego hybrydowym dimerem. Zobacz Wallach i wsp., U.S. patent 5,478,925.
Początkowo dla wytwarzania dwu lub wielopodjednostkowych białek hybrydowych niosących domeny wiążące pozakomórkowych receptorów łączono te białka z rejonami stałymi ciężkich łańcuchów przeciwciał.
Przykładowo, takie postępowanie doprowadziło do skonstruowania immunoadhezyn CD4 (20). Są one cząsteczkami hybrydowymi zbudowanymi z pierwszych dwóch (lub wszystkich czterech) immunoglobulino podobnych domen CD4 połączonych ze stałym regionem ciężkich lub lekkich łańcuchów przeciwciał. Taki sposób tworzenia hybrydowych cząsteczek zaadaptowano dla receptora TNF (10, 16, 21) wytwarzając konstrukty o wyższej aktywności, in nitro, niz monomeryczne rozpuszczalne białka wiążące.
Jest powszechnie wiadomym, ze obserwowane in nitro właściwości dimeru białka fuzyjnego powinny przekładać się na jego wyższą aktywność w układzie in nino. Jedne badania potwierdzają taki pogląd ujawniając, że fuzyjne białko p75(TBP2)-Ig posiada ponad 50 krotnie wyższą aktywność chroniąc mysz przed skutkami donaczyniowego wstrzyknięcia LPS (16).
Jakkolwiek, mimo powszechnego stosowania fuzji białek z immunoglobulinami metoda ta powoduje szereg efektów ubocznych. Jeden z nich jest związany z występującą w immunoglobulinach domeną Fc zaangażowaną w realizację efektorowej funkcji systemu immunologicznego. Funkcja ta może być niepożądana w szczególnych zastosowaniach terapeutycznych (22).
Drugie ograniczenie wiąże się ze specjalnymi przypadkami w których pożądane jest wytwarzanie zbudowanych z różnych podjednostek białek fuzyjnych, przykładowo zbudowanego z różnych podjednostek analogu IL-6 lub receptorów interferonu typu I. Mimo iż istnieje szereg sposobów wytwarzania bifunkcjonalnych przeciwciał (np., przez kotransfekcję lub fuzję hybrydom), to wydajność syntezy jest w znacznym stopniu ograniczona przez powstawanie mieszaniny homo- i heterodimerów, co jest zjawiskiem typowym (23). Obecnie pojawiło się szereg doniesień o zastosowaniu motywu suwaka leucynowego dla sterowania składania heterodimerów (24-26). Technika ta wydaje się dobrze rokować z uwagi na jej zastosowania badawcze lecz sekwencje nie będące naturalnymi lub wytwarzanymi w komórce, z uwagi na ich antygenowość, mogą nie być użytecznymi dla wielokrotnego podawania w trakcie leczenia klinicznego. Ograniczeniem noże być również zarówno wydajność składania jak i stabilność produktów po ich złożeniu.
Z drugiej strony, w szczególnym przypadku receptorów TNF, stwierdzono, że pewne modyfikacje receptora p55 TNF ułatwiają jego homodimeryzację i przesyłanie sygnału przy braku ligandu (27,28). Stwierdzono, że cytoplazmatyczny obszar tego białka zawierający domenę „death” może funkcjonować jako motyw odpowiedzialny za homodimeryzację. (28, 30). Alternatywą dla tworzenia białek hybrydowych zawierających sekwencje immunoglobulin, jest fuzja zewnątrzkomórkowej domeny receptora TNF z jego cytoplazmatyczną domeną death czego oczywistym efektem powinno być otrzymanie białka sekrecyjnego, które mogłoby dimeryzować w nieobecności TNF. Takie białka fuzyjne przedstawiono i zastrzeżono w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym WO 95/31544.
Kolejną, trzecią, strategią rozwiniętą dla wytwarzania dimerów rozpuszczalnych receptorów TNF jest chemiczne usieciowanie białek przy pomocy glikolu polietylenowego (31).
187 400
Podsumowanie wynalazku.
Alternatywą, dla otrzymywania takich dimerów białkowych, oferującą pewne ważne korzyści jest sposób przedstawiony w wynalazku oparty na użyciu naturalnych heterodimerów białek strukturalnych odpowiadających krążących w układzie naczyniowym białkom o długim półokresie trwania nie będących immunoglobulinami (32-33).
Uznając hCG jako podstawowy znacznik ciąży opracowano liczne odczynniki dla oznaczeń ilościowych i badania tego białka w układach in vitro i in vivo. Dodatkowo hCG szeroko przebadano przy pomocy mutagenezy dzięki czemu wiadomo, że niewielka delecja w obrębie tego białka, taka jak usunięcie pięciu aminokwasów z dystalnej części C-końca podjednostki a może wydajnie pozbawić je aktywności biologicznej, podczas gdy jego zdolność do tworzenia heterodimerów pozostaje zachowana (34,35). Pokazano, że tolerowane są (niewielkie insercje, do 30 aminokwasów, na obszarze N- i C-końca podjednostki a (36), podczas gdy fuzja podjednostki a do C-końca podjednostki P także ma niewielki wpływ na tworzenie heterodimerów (37).
Donoszono również o analogach hCG w których immunoglobulinowa domena Fc została podłączona do C-końca podjednostki β hCG; jednak konstrukt ten nie był wydzielany i nie podjęto prób połączenia go z podjednostką (38).
Dlatego, podstawowym przedmiotem przedstawianego wynalazku jest białko hybrydowe zawierające dwie współekspiymowane, tworzące dimer sekwencje białkowe, które zawierają:
a) co najmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z tworzących homodimery receptorów, łańcuch receptora tworzącego heterodimer, ligand i fragmenty któregokolwiek z powyższych i
b) podjednostkę zbudowanego z heterodimerów hormonu białkowego lub jej fragment w którym (a) i (b) są połączone bezpośrednio lub przez linker peptydowy i w każdej parze dwie podjednostki (b) są odmienne i zdolne do agregowania czego efektem jest dimer.
Zgodnie z przedstawianym wynalazkiem linker może być podatny na trawienie enzymatyczne.
Korzystnie, aby sekwencja (a) była wybrana z: zewnątrz komórkowej domeny receptora 1 dla TNF (55 kDa, również nazywanego TBP1), zewnątrz komórkowej domeny receptora 2 dla TNF (75 kDa, nazywanego również TBP2) lub fragmentu którejkolwiek z nich zawierającego domenę wiążącą ligand, zewnątrz komórkowe domeny receptorów dla IL-6 (nazywane tez gp80 i gpl30), zewnątrz komórkową domenę receptora dla IFN a/p lub receptora dla IFN y, receptor dla gonadotropiny lub jej zewnątrz komórkowy fragment, lekkie łańcuchy przeciwciał lub ich fragmenty, fakultatywnie związane z odpowiednimi łańcuchami ciężkimi, ciężkie łańcuchy przeciwciał lub ich fragmenty fakultatywnie związane z odpowiednimi łańcuchami lekkimi, domeny Fab przeciwciał lub białka będące Ugandami takie jak cytokiny, czynniki wzrostowe lub hormony inne niż gonadotropiny, których szczególnym przykładem są IL-6, IFN-P, TPO lub fragmenty któregokolwiek z powyzszych.
Korzystnie aby sekwencja (b) była wybrana z pośród hCG, FSH, LH, TSH, podjednostka inhibiny lub fragmentu którejkolwiek z wymienionych.
Aby uczynić nieaktywnymi składniki białek hybrydowych z przedstawianego patentu zastosowane mogą być modyfikacje białek takie jak modyfikacje chemiczne lub enzymatyczne cięcia łańcucha białkowego łub chemiczne bądź enzymatyczne modyfikacje określonych aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Ograniczenie aktywności może być również osiągnięte przy pomocy technik rekombinowania DNA celem zmiany sekwencji kodującej białko hybrydowe w taki sposób, że ograniczona zostanie aktywność tylko jednego składnika lub tak, że białko stanie się bardziej podatne na określone chemiczne lub enzymatyczne modyfikacje.
Powyżej opisane białka hybrydowe będą mono-, bi- lub wielofunkcyjnymi w zalezności od tego jakie sekwencje aminokwasowe (a) zostaną połączone z (b). W kompleksach takich (a) może być dołączone do aminowego końca lub do końca karboksylowego (b) lub do obu.
Monoklonalne białka hybrydowe z powyższego wynalazku mogą, przykładowo, składać się z zewnątrz komórkowej domeny receptora dla gonadotropiny połączonego zjedna z odpowiednich, wiążących receptor podjednostek gonadotropiny. Zgodnie z takim zastosowaniem,
187 400 białko hybrydowe z tego wynalazku może być cząsteczką, w której przykładowo, dla wydłużenia jej półokresu trwania i aktywności w osoczu, zewnątrz komórkowa domena receptora FSH jest związana z FSH.
Preparat taki może być sporządzony dla indukcji dojrzewania pęcherzyka jajnikowego stosowanej w technikach rozrodczych takich jak indukcja owulacji lub zapłodnienie in vitro, celem drastycznego zwiększenia aktywności biologicznej hormonów kluczowej dla pomyślnego przebiegu procesu, równocześnie ograniczając wymaganą ilość hormonu oraz liczbę zastrzyków wymaganych dla wywołania owulacji.
Receptor FSH oraz wytwarzanie zewnątrz komórkowej domeny receptora dla ludzkiego FSH opisano odpowiednio w WO 92/16620 i WO 96/38575.
Zgodnie ze szczególnym zastosowaniem zewnątrz komórkowa domena receptora dla FSH (ECD) może być połączona w ramce z peptydem linkerowym, zawierającym sekwencję rozpoznawaną i ciętą przez trombinę (29), a równocześnie będącym sekwencją „kotwiczącą”. Linker peptydowy łączy zewnątrz komórkową domenę FSH z podjednostką FSH. To umożliwia usunięcie zewnątrz komórkowej domeny receptora FSH przez jego cięcie w obrębie sekwencji rozpoznawanej przez trombinę następujące gdy cząsteczka będzie oddziaływała z trombiną w układzie krążenia.
W innym zastosowaniu zamiast miejsca ciecia dla trombiny używane jest miejsce rozpoznawane przez jakikolwiek enzym powszechnie występujący w jajnikach. W ten sposób cząsteczka przemieszczająca się do jajników jako ECD-FSH będzie wystawiona na działanie enzymu, który w najwyższym stężeniu występuje w tej tkance, w konsekwencji nastąpi usunięcie ECD, a FSH będzie mógł oddziaływać z receptorem związanym z błoną komórkową.
W kolejnym zastosowaniu zamiast miejsca rozpoznawanego przez enzym, pomiędzy ECD a FSH wrekombinowany zostaje giętki obszar zawiasowy w wyniku czego ECD nie będzie enzymatycznie usuwane z hormonu. W ten sposób gdy cząsteczka ECD-FSH wniknie do jajnika dojdzie do kompetycji, pomiędzy ECD z przyłączonym zawiasem, a ECD, o receptor FSH zlokalizowany na błonie komórkowej.
W kolejnym korzystnym zastosowaniu wynalazku jest białko hybrydowe będące agregatem szeregu sekwencji aminokwasowych z których jedna zawiera jako (a) TBP1 (lub jego fragment od aa 20 do aa 161 lub do aa 190) i jako (b) podjednostkę a hCG, a inne zawierają zawsze TBP1 (lub jego wyżej opisane fragmenty) jako (a) i podjednostkę β hCG lub jej fragment jako (b). Zgodnie z tym zastosowaniem w zależności od szczególnej sekwencji wybranej jako (b) (cała podjednostką β hCG lub jej fragmenty lub modyfikacje powyższych), powstające białko hybrydowe będzie posiadało aktywność (tylko TBP1) lub kombinację aktywności (aktywność TRP1 wraz z aktywnością hCG). W tym, ostatnim przypadku użyte może być białko hybrydowe, przykładowo w kombinowanym leczeniu mięsaka Kaposiego i rozpadzie metabolizmu w AIDS.
W dalszych zastosowaniach wynalazku dla zwiększenia stabilności uzyskiwanych białek hybrydowych wprowadzone może być jedno lub więcej wiązań kowalencyjnych łączących dwie podjednostki (b). Może to być dokonane przykładowo przez dodanie jednego lub większej ilości wiążących łańcuchy peptydowe mostków dwusiarczkowych. Miejsca usieciowania mogą być wydedukowane w oparciu o wiedzę o strukturze różnopodjednostkowego hormonu. Przykładowo użytecznym może być zastąpienie przez cysteinę lizyny 45 w podjednostce a oraz glutaminy 21 w podjednostce β w wyniku czego wiązanie wodorowe (nie kowalencyjne) zostanie zastąpione przez wiązanie dwusiarczkowe (kowalencyjne). Kolejnym przedmiotem wynalazku są modyfikowane PEGiem, lub przez inne modyfikacje chemiczne, białka hybrydowe.
Kolejnym podmiotem wynalazku jest cząsteczka DNA zawierająca sekwencje kodującą powyższe białko hybrydowe jak również sama zasadnicza sekwencja nukleotydowa. „Sama zasadnicza sekwencja nukleotydowa” obejmuje wszystkie inne sekwencje nukleotydowe, które z uwagi na degenerację kodu genetycznego, również kodują daną sekwencję aminokwasową.
Dla wytworzenia białka hybrydowego, którego dotyczy wynalazek, z istniejących klonów, takich jak (b), uzyskano sekwencję nukleotydową (a) cząsteczki DNA. Sekwencja DNA dla pożądanej sekwencji (a) jest ligowana z sekwencją DNA kodującą pożądaną sekwencję (b).
187 400
Takie dwie połączone sekwencje są wrekombinowywane do użytecznego plazmidu lub każda z nich do innego plazmidu. Utworzony wektor lub dwa wektory ekspresyjne jest wprowadzany do dogodnych komórek gospodarza, w których zachodzi ekspresja wektor(a)ów dając białko hybrydowe o którym traktuje wynalazek, a które zostało określone powyżej.
Przedkładanym sposobem przygotowywania hybryd, o których traktuje wynalazek, jest technika PCR wykorzystująca, oligonukleotydy specyficzne dla pożądanej sekwencji do powielania z klonów sekwencji kodującej (a) i (b),.
Jak wspomniano, ekspresja zrekombinowanych białek będących przedmiotem wynalazku może być uzyskana, przy pomocy odpowiedniego wektora ekspresyjnego, w komórkach eukariontów (np. drożdży, owadów lub komórkach ssaków) lub komórkach prokariontów. Zastosowana może być każda ze znanych nauce metod.
Przykładowo, kodujące białka cząsteczki DNA otrzymane według którejkolwiek z wyżej opisanych metod są wbudowywane do odpowiednio skonstruowanego wektora ekspresyjnego zgodnie z technikami, dobrze znanymi biegłym w sztuce (patrz Sambrook i wsp., 1989). Dwuniciowy cDNA jest wbudowywany do wektorów plazmidowych dzięki dobudowaniu monotonnych jednoniciowych sekwencji lub poprzez sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne z wykorzystaniem syntetycznych linkerów zbudowanych z DNA lub techniki ligacji tępych końców. Do łączenia (ligacji) cząsteczek DNA używane są DNA ligazy przy czym celem zapobiegnięcia niepożądanemu łączeniu się cząsteczek są one odpowiednio traktowane alkaliczną fosfatazą.
Aby wektor ekspresyjny był w stanie eksprymować pożądane białko, powinien zawierać również specyficzne sekwencje nukleotydowe niosące informacje o regulacji transkrypcji i translacji połączone z DNA kodującym pożądane białko w taki sposób, ze pozwalają na ekspresję genu i wytwarzanie białka. Po pierwsze, aby gen był transkrybowany musi być poprzedzony przez promotor rozpoznawany przez polimerazę rNa z którym polimeraza się wiąże tym samym inicjując proces transkrypcji. Używane są liczne promotory działające z różną wydajnością (silne i słabe promotory).
Dla eukariontów, w zalezności od charakteru gospodarza używane mogą być różne sekwencje regulujące transkrypcję i translację. Mogą one pochodzić od wirusów takich jak adenowirusy, bydlęce wirusy brodawczaka, wirusy małp i im podobnych, w których sekwencje regulatorowe są związane z sekwencjami genów ulegających ekspresji z dużą wydajnością. Przykładami są promotor genu TK z wirusa opryszczki, promotor genów wczesnych z SV40, promotor drożdzowego genu gal4 itp..
Zastosowane mogą być sygnały inicjacji transkrypcji umożliwiające jej represję lub aktywację, tak, że może być modulowana ekspresja genu.
Cząsteczka DNA zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą białko hybrydowe będące przedmiotem wynalazku jest wrekombinowana do wektor(ów)a, posiadającego funkcjonalnie podłączone sygnały regulujące transkrypcję i translację, który jest w stanie włączyć sekwencję pożądanego genu do komórki gospodarza. Komórki trwale ztransformowane przez wprowadzenie DNA mogą być wyselekcjonowane przez równoczesne wprowadzenie jednego lub większej liczby markerów umożliwiających selekcję komórek gospodarza niosących wektor ekspresyjny. Marker może powodować powrót do prototrofizmu auksotroficznego gospodarza, oporność na biocydy np., antybiotyki lub metale ciężkie takie jak miedź lub temu podobne. Gen markera selekcyjnego może być również bezpośrednio połączony z DNA genu który ma być eksprymowany lub wprowadzony do tej samej komórki w wyniku kotransformacji. Dla optymalnej syntezy białek będących przedmiotem wynalazku konieczne mogą być również dodatkowe czynniki.
Czynniki ważne przy wyborze określonego wektora plazmidowego lub wirusowego obejmują: łatwość odróżnienia i wyselekcjonowania komórek biorcy, które zawierają wektor od tych, które go nie posiadają; liczba kopii wektora, która jest pożądana z uwagi na określonego gospodarza; czy jest pożądanym aby istniała możliwość przenoszenia wektora pomiędzy komórkami gospodarzy należących do różnych gatunków.
Gdy wektor(y) lub sekwencja DNA zawierająca konstrukt(y) zostaną przygotowane do ekspresji mogą zostać wprowadzone, przy pomocy jednego z licznych dogodnych sposobów
187 400 takich jak: transformacja, transfekcja, koniugacja, fuzja protoplastów, elektroporacja, wytrącanie fosforanem wapnie, bezpośrednie wstrzykiwanie itp., do odpowiednich komórek gospodarza.
Komórkami gospodarzy mogą być zarówno komórki pro- jak i eukariontów. Korzystne, aby gospodarzem był eukariont np. komórki ssacze takie jak ludzkie, małpie, mysie i komórki jajnikowe z chomika syryjskiego (CHO), gdyż realizują one posttranslacyjne modyfikacje białek obejmujące prawidłowe składanie lub glikozylację w prawidłowych miejscach. Również komórki drożdży mogą dokonywać posttranslacyjnych modyfikacji peptydu w tym glikozylacji. Istnieje szereg sposobów rekombinowania DNA, wykorzystujących sekwencje silnych promotorów i plazmidy wysokokopijne, które można wykorzystać dla wytwarzania w drożdżach pożądanego białka. Drożdże rozpoznają obecność w produktach klonowanych genów ssaczych sekwencji liderowych wydzielając poza komórkę peptydy posiadające takie sekwencje (np. pre-peptydy).
Po wprowadzeniu wektor(ów)a komórki gospodarza są hodowane na podłożu selekcyjnym, które selekcjonuje zdolne do wzrostu na nim komórki zawierające wektor. Wynikiem ekspresji sklonowan(ych)ej sekwencji genu jest produkcja pożądanych białek.
Oczyszczanie zrekombinowanych białek prowadzi się według jednej z szeregu przydatnych dla tego celu metod np. dowolnej z konwencjonalnych procedur obejmujących ekstrakcję, precypitację, chromatografię, elektroforezę lub im podobnych. Dalszą możliwą do zastosowania, przy oczyszczaniu, procedurą która może być użyta w zależności od wymagań białka będącego przedmiotem wynalazku jest chromatografia powinowactwa z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych wiążących się z oczyszczanym białkiem i tworzących z nim kompleksy, które osadzane są na złozu wypełniającym kolumnę chromatograficzną. Przez kolumnę sączone są zgrubnie oczyszczone preparaty zawierające zrekombinowane białko. Białko będzie wiązane do złoza poprzez specyficzne przeciwciało podczas gdy zanieczyszczenia będą się przesączały. Po płukaniach, białko jest wymywane ze złoża przez zmianę pH lub siły jonowej.
Określenie „białko hybrydowe” w tu użytym znaczeniu ogólnie określa białka zbudowane z dwóch lub większej liczby odmiennych białek lub ich fragmentów.
Określenie „białko fizyjce” w tu użytym znaczeniu określa białko hybrydowe zawierające dwa lub więcej białek lub ich fragmentów, kowalencyjnie połączonych ze sobą.
Określenie „agregacja” w tu użytym znaczeniu oznacza tworzenie silnych, niespecyficznych niekowalencyjnych oddziaływań pomiędzy dwoma, tworzącymi kompleks, łańcuchami polipeptydowymi, takich jak występujące pomiędzy podjednostkami a i β w róznopodjednostkowych hormonach (takich jak FSH, lH, hCG lub TSH).
Określenie „ligand” lub „ligand białkowy” w tu użytym znaczeniu określa cząsteczkę, inną niż antybiotyk lub immunoglobulina, która może być związana przez wiążącą ligand domenę receptora; takie cząsteczki mogą występować naturalnie lub mogą być modyfikowane chemicznie lub chemicznie zsyntetyzowane.
Określenie „domena wiążąca ligano” w tu użytym znaczeniu określa część receptora biorącą udział w wiązaniu ligandu i ogólnie jest częścią lub zasadniczo całą domeną pozakomórkową.
Określenie „receptor” w tu użytym znaczeniu określa białko błonowe, którego wiązanie z ligandem wyzwala wtórną odpowiedź komórki której efektem jest aktywacja lub hamowanie procesów wewnątrzkomórkowych.
W kolejnym zastosowaniu obecny wynalazek dostarcza sposobu użycia białka hybrydowego jako lekarstwa. Korzystnie gdy lekarstwo jest w postaci kompozycji farmaceutycznej zawierającej białko będącego przedmiotem wynalazku wraz z jednym lub większa ilością farmaceutycznie akceptowanych nośników i/lub dodatków. Taka farmaceutyczna kompozycja stanowi dalszy przedmiot wynalazku.
Krótki opis rysunków.
Wynalazek będzie lepiej zrozumiany dzięki odniesieniu się do załączonych rysunków wśród których:
187 400
Figura 1(a) i 1(b) przedstawiają odpowiednio konstrukty TBP(20-161)-hCGa i TBP(20161)-hCGp i ich sekwencje (SEQ ID NOS: 1-4). Sekwencja wiążąca pokazana na figurze 1(a) jest sekwencją Ala-Gly-Ala-Ala-Pro-Gly (SEQ ID NO: 9). Sekwencja wiążąca pokazana na figurze 1(b) jest sekwencją Ala-Gly-Ala-Gly (SEQ ID NO: 10).
Figura 2(a) i 2(b) przedstawiają odpowiednio konstrukty TBP (20-190)-hCGa i TPB(10190)-hCGp i ich sekwencje (SEQ ID NOS:5-8).
Figura 3 jest graficznym przedstawieniem, zależnego od dawki, efektu ochronnego wywołanego przez komórki CHO eksprymujące TBP-hCG(20-190) na komórki BT-20 poddane działaniu cytotoksycznemu indukowanemu przez TNFa wraz z różnymi kontrolami.
Figura 4 jest graficznym przedstawieniem zależnego od dawki efektu ochronnego wywołanego przez komórki COS eksprymujące TBP-hCG(20-190) na komórki BT-20 poddane działaniu cytotoksycznemu indukowanemu przez TNFa wraz z różnymi kontrolami.
Figura 5 jest graficznym przedstawieniem zaleznego od dawki efektu ochronnego wywołanego przez oczyszczone chromatografią powinowactwa komórki CHO eksprymujące TBP-hCG(20-161) na komórki BT-20 poddane działaniu cytotoksycznemu indukowanemu przez TNFa wraz z różnymi kontrolami.
Szczegółowy opis korzystnych zastosowań.
Obecnie wynalazek zostanie opisany przez ponizsze przykłady, które nie powinny być postrzegane jako w jakikolwiek sposób ograniczające obecny wynalazek.
Przykłady.
Materiały i Metody.
Linie komórkowe użyte w tych badaniach otrzymano, z wyjątkiem wyszczególnionych, z American Type Culture Collection (AYCC), Rockville, Maryland.
Linię komórkową CHO-DUKX otrzymano od L. Chasin z Columbia University za pośrednictwem D. Hauseman z MIT (39). Linia komórkowa CHO-DUKX pozbawiona funkcjonalnego genu reduktazy dihydrofolanu była rutynowo hodowana na kompletnym podłożu a Modified Eagles Medium a (+) MEM) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Komórki COS-7 standardowo hodowano na pożywce Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) uzupełnionej 10% FBS. Jeśli nie podano inaczej to komórki pasazowano tak aby utrzymać je w fazie wzrostu logarytmicznego, a odczynniki do hodowli otrzymano z GIBCO (Grand Island, New York).
Składanie konstruktów genetycznych kodujących białka hybrydowe.
Dla receptora p55 TNF szereg wskazówek wynikało z artykułu o klonowaniu Wallach (40), a dla podjednostek hCG z artykułu o klonowaniu Fiddes (41, 42). Wybór białka wiążącego TRP lub TNF zależy od zdolnej do wiązania TNF zewnątrz.komórkowej części receptora TNF. W tym Przykładzie DNA konstrukty będą nosiły nazwę białek hybrydowych TBP gdzie partner i region TBP określone są w nazwie konstruktu. Wszystkie konstrukty TBP-hCG zawierają peptyd sygnałowy z ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) w miejscu naturalnej sekwencji sygnałowej białka p55. Dodatkowo, peptyd sygnałowy z hGH został umieszczony tak, ze bezpośrednio poprzedza w TBP aminokwas Asp20, który przypuszczalnie jest pierwszym aminokwasem w dojrzałym, wydzielonym białku. Modyfikacja ta nie ma zasadniczego znaczenia dla podstawowej koncepcji użycia hCG jako składnika białka hybrydowego.
DNA kodujący białka hybrydowe skonstruowano stosując technikę PCR (43). a. TBP(20-161)-hCG
Pierwotny konstrukt TBP-hCG został sporządzony tak, by zawierał domenę wiążącą ligand z zewnątrzkomórkowego obszaru receptora p55 TNF (od Asp20 włącznie z aminokwasem Cys 161) przyłączoną za pośrednictwem krótkiego linkera do podjednostek a i β (począwszy odpowiednio od reszty aCys7 lub pPro7). Konstrukt ten, dalej nazywany TBP 1(20-161)hCG jest dimerem róznopodjednostkowym zbudowanym z dwóch zmodyfikowanych podjednostek hCG, TBP 1(20-161 )-hCGa i TBPl(20-161)-hCGp.
Starterami użytymi dla syntezy konstruktu TBPl(20-161)-hCGa były oligodeoksynukleotydy:
starter 1 (a/p) TTT TCT CGA GAT GGC TAC AGG TAA GCG CCC (SEQ ID NO: 1)
187 400 starter 2 (a) ACC TGG GGC AGC ACC GGC ACA GGA GAC ACA CTC GTT TTC
SEQ ID NO: 12) starter 3 (α) TGT GCC GGT GCT GCC CCA GGT TGC CCA GAA TGC ACG CTA
CAG (SEQ ID NO: 13) starter 4 (α) TTT TGG ATC CTT AAG ATT TGT GAT AAT AAC AAG TAC (SEQ
ID NO: 14)
Te oraz wszystkie inne startery opisane w powyższym przykładzie zsyntetyzowano przy pomocy syntetyzera DNA Applied Biosystems Model 392 (ABI, Foster City, California) stosując chemię fosforoamidytową.
Ponieważ oba konstrukty z podjednostką TBP-hCG posiadają takie same 5' końce (np. 5' koniec konstruktu hGh/TBP), do uzyskania obydwu konstruktów podjednostki TBP-hCG użyto startera 1 (αβ). Innymi starterami użytymi przy otrzymywaniu konstruktu TBP 1(20161)-hCGp były:
starter 2 (β) CCG TGG ACC AGC ACC AGC ACA GGA GAC ACA CTC GTT TTC (SEQ ID NO: 15) starter 3 (β) TGT GCT GGT GCT GGT CCA CGG TGC CGC CCC ATC AAT (SEQ
ID NO: 16) starter 4 (β) TTT TGG ATC CTT ATT GTG GGA GGA TCG GGG TG (SEQ ID NO: 17)
Startery 2 (α) i 3 (α) są odwrotne i komplementarne i odpowiadają zarówno 3' końcowi obszaru kodującego zewnątrzkomórkową domenę p55 jak i 5' koniec podjednostki hCG. Podobnie startery 2 (β) i 3 (β) są również starterami odwrotnymi i komplementarnymi i odpowiadają zarówno 3' końcowi rejonu kodującego zewnątrzkomórkową domenę p55 jak i 5' końcowi podjednostki β hCG.
Reakcję PCR prowadzono dla każdej z dwóch podjednostek konstruktów TBP-hCG. Najpierw użyto starterów 1 (αβ) i 2 (α lub β), a jako matrycę plazmidu kodującego rozpuszczalny p55 obejmujący obszar od aminokwasu 20 do 180 poprzedzony peptydem sygnałowym z hGH (plazmid pCMVhGHspcDNA.pA4). Reakcję PCR prowadzono przy pomocy Vent ™ polimerazy z New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) zgodnie z zaleceniami producenta, przeprowadzając 25 cykli w następujących warunkach:
100 pg matrycy DNA pg każdego startera
U Vent ™ polimerazy (New England Biolabs) denaturacja w 99°C przez 30 sekund hybrydyzację, dla starterów 1 (αβ) i 2 (α) w 59°C przez 30 sekund
59°C przez 30 sekund dla starterów 3 (a) i 4 (a)
57°C przez 30 sekund dla starterów l(aP) i 2 (P)
63°C przez 30 sekund dla starterów 3 (β) i 4 (P) wydłużanie łańcucha prowadzono w 75°C przez 75 sekund.
Obecność w próbce produktów PCR potwierdzano przez elektroforezę w 2% żelu agarozowym i wykrywanie cząsteczek o oczekiwanej wielkości w elektroforetogramach wybarwionych bromkiem etydyny. Następnie fragmenty oczyszczano sącząc je przez kolumnę Wizard (Promega), sączenie prowadzono zgodnie z zaleceniami producenta kolumny.
Ostateczną sekwencję kodującą TBP 1(20-161)-hCGo składano przez fuzję w reakcji PCR przy użyciu startera 1 (αβ) i startera 4 (α) używając jako matrycę do reakcji otrzymane w wyniku pierwszych reakcji PCR, oczyszczone, fragmenty p55 i hCG. Przez pierwsze 10 cykli reakcje prowadzone są bez żadnych dodatkowych starterów jedynie dwie matryce posiadające wspólne obszary dzięki wbudowaniu starterów 2 (a) i 3 (a) mogą być denaturowane i zhybrydyzowane ze sobą. Warunki prowadzenia takich cykli są zasadniczo takie same jak użyte wcześniej z wyjątkiem tego, że hybrydyzację prowadzono w 67°C a czas wydłużania łańcucha wynosił 2 minuty. Po wykonaniu 10 cykli dodawano startery 1 (α) i 4 (α) i prowadzono dalsze 10 cykli. Warunki dla końcowych reakcji były takie same jak użyte wcześniej z wyjątkiem temperatury hybrydyzacji, która wynosiła 59°C i czasu wydłużania łańcucha, który wynosił 75 sekund.
187 400
Analiza produktów reakcji poprzez elektroforezę w 1% żelu agarozowym potwierdziła uzyskanie fragmentów o oczekiwanej długości wynoszącej 1100 par zasad. Dla oczyszczenia fragmentu mieszaninę sączono przez kolumnę Wizard, a następnie oczyszczony fragment trawiono Xba I i BamH I i ponownie oczyszczano przez elektroforezę w 0,7% agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Oczyszczony fragment subklonowano do plazmidu pSVL (Pharmacia), które uprzednio strawiono Xba I i BamH I i oczyszczono przez elektroforezę w 0,7% żelu agarozowym z niskotopliwej agarozy. Następnie prowadzono ligację przy pomocy ligazy z bakteriofaga T4, otrzymaną mieszaninę użyto do transformacji komórek E.coli szczepu AGI, które wysiewano na szalki z pożywką LB zawierającą amplicylinę i hodowano przez noc w 37°C. Dla potwierdzenia obecności wrekombinowanego fragmentu DNA plazmidowy DNA wyizolowany z komórek opornych na amplicylinę analizowano przez trawienie Xho I i BamH I (wrekombinowany DNA wycinany jest z plazmidu w wyniku trawienia). Obecność wstawki stwierdzono w sześciu klonach z których jeden (klon 7), oznaczony jako pSVLTBPhCGa, wybrano do dalszych prac (zawierał TBP1 (20-161)-hCGa). Prawidłowość konstruktu, oraz brak w nim niepożądanych zmian potwierdzono oznaczając metodą dideoksy (stosując Seąuenase™, U.S. Biochemicals, Cleveland, Ohio), sekwencję wstawki z wektora.
Ostateczna sekwencja kodująca TBP 1(20-16l)-hCGp została złożona w sposób podobny do opisanego dla TBPl(20-161)-hCGa przy wykorzystaniu fuzji przez PCR i starterów 1 (αβ) i 4 (β) oraz jako matrycy oczyszczonych produktów otrzymanych w pierwszych reakcjach PCR dla fragmentów p55 i ΙιΟΟβ. Otrzymany plazmid pSVL niosący wstawkę będącą przedmiotem zainteresowania oznaczono jako pSVLTBPhCGp.
b. TBP(20-190)-hCG
Drugi zestaw białek przygotowano przez modyfikację konstruktów TBP(20-161)-hCG czego efektem było otrzymanie analoga zawierającego sekwencję TBP od Asp20 do Thrl90 zamiast sekwencji obszaru od 20 do 161 aminokwasu jaki znajdował się w konstrukcie wyjściowym. Dokonano tego przez zastąpienie fragmentu zawartego pomiędzy miejscami rozpoznawanymi w plazmidzie pSVLTBPhCGa przez Bgl II i Xba I przez zawierający odpowiednie zmiany fragment otrzymany w reakcji PCR. Fragment ten uzyskiwano przez fuzję przez PCR. Użytymi starterami były.
starter 1 TTT TAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC (SEQ ID NO:18) starter 2 TGT GGT GCC TGA GTC CTC AGT (SEQ ID NO: 19) starter 3 ACT GAG GAC TCA GGC ACC ACA GCC GGT GCT GCC CCA GGT TG (SEQ ID NO:20) starter 4 TTT TTC TAG AGA AGC AGC AGC CCA TG (SEQ ID NO:21)
Startery 1 i 2 użyto dla wytworzenia sekwencji kodującej dodatkowe od 161 do 190 aminokwasy z p55. Zasadniczo reakcje PCR prowadzono w uprzednio opisany sposób używając 1 pg każdego ze starterów i pUC-p55 jako matrycę. Podobnie dla otrzymania linkera łączącego 3' koniec sekwencji kodującej TBP z 5' końcem sekwencji kodującej a podjednostkę hCG użyto starterów 3 i 4 oraz plazmidu pSVLTBPhCGa jako matrycę. Uzyskanie produktów tych reakcji potwierdzono przez wykrycie cząsteczek o prawidłowej wielkości (odpowiednio około 296 i 121 par zasad) poprzez elektroforezę w 8% żelu poliakryloamidowym. Oczyszczono je przy pomocy kolumny Wizard. Starter 2 i 3 zaprojektowano w ten sposób, że zawierały one sekwencje na siebie zachodzące, tak, ze dwa produkty reakcji PCR (z użyciem starterów 1 i 2 i starterów 3 i 4 ) mogły hybrydyzować w czasie fuzji przez PCR ze starterami 1 i 4. Po reakcji fuzji potwierdzano obecność pożądaneg produktu, o wielkości 400 par zasad, przez elektroforezę w 1,5% żelu agarozowym, następnie oczyszczano go przy pomocy kolumny Wizard. Następnie DNA trawiono Bgl II i Xba I i ligowano ze strawionym Bgl II/Xba i pSVLTBPhCGa. Obecność wstawki w plazmidzie wyizolowanym ze stransformowanych komórek E. coli szczepu AGI potwierdzano przez trawienie Bgl II i Xba I. Nowy konstrukt oznaczono jako pSVLTBP(20-190)-hCGa.
Podobnie plazmid ρ8νυΓΒΡΗΟΟβ zmodyfikowano przez zastąpienie fragmentu otrzymywanego po trawieniu Bgl II i XCM I. Wykonano to przez subklonowanie pojedynczego produktu PCR. Użyto starterów 1 i 2b (patrz poniżej) oraz, jako matrycy, pUC-p55:
187 400 starter 2b TTT TCC ACA GCC AGG GTG GCA TTG ATG GGG CGG CAC CGT
GGA CCA GCA CCA GCT GTG GTG CCT GAG TCC TCA GTG (SEQ ID NO:22)
Otrzymanie produktu PCR (około 337 par zasad) potwierdzono, a sam produkt oczyszczono w sposób opisany poniżej, strawiono Bgl II i Xcm I i ligowano do strawionego Bgl II/Xba I pSVLTBPhCGe Obecność wstawki w plazmidach izolowanych ze stransformowanych komórek E.coli szczepu AG1 potwierdzano przez trawienie Bgl II i Xcm I. Nowy konstrukt oznaczano jako pSVLTBP(20-190)-hCGe.
Następnie uzyskanie nowego konstruktu potwierdzano przez sekwencjonowanie DNA.
Dodatkowo, poza otrzymywaniem nowych plazmidów opartych na plazmidzie pSVL, konstrukty wrekombinowywano również do innych wektorów ekspresyjnych celem uzyskania układów bardziej przydatnych dla stabilnej ekspresji w komórkach CHO, szczególnie do wektora Da wcześniej opisanego jako plazmid CLH3AXSV2DHFR (45). Związane to było z przekształceniem miejsca rozpoznawanego przez BamHI, które ograniczało wstawkę w wektorze pochodnym pSVL w miejsce rozpoznawane przez Xho I, a następnie wycięcie wstawki przy pomocy Xho I i sklonowanie jej w strawionym Xho I Da.
2. Przejściowa i stała ekspresja białek hybrydowych.
Celem uzyskania przejściowej ekspresji białek hybrydowych TBP-hCG przeprowadzono przy pomocy elektroporacji (47) transfekcję komórek COS-7 (ATCC CRL 1651, ref. 46). Komórki COS-7 znajdujące się w stadium wzrostu logarytmicznego zebrane przez trypsynizację i delikatne wirowanie (800 obr. na min. przez 4 min.), płukano zimnym buforem fosforanowym (PBS), pH 7,3-7,4, a następnie ponownie osadzano przez wirowanie. Komórki zawieszano tak, aby ich końcowe stężenie wynosiło 5x106 komórek w 400 pl zimnego PBS i mieszano z 10 pg DNA plazmidu w schłodzonej kuwecie do elektroporacji o szerokości szczeliny wynoszącej 2 mm. Dla kotransformacji używano 5 pg każdego z plazmidów. Kuwetę i komórki schładzano przez dalsze 10 min. w lodzie, a następnie przeprowadzano elektroporację przy pomocy aparatu BTX Model 600 w następujących warunkach: napięcie 125 V, pojemność przebicia 950 pF i R=8. Następnie komórki ponownie schładzano w lodzie, przenoszono do 15 ml probówki stożkowej zawierającej 9,5 ml pożywki kompletnej (zmodyfikowana pożywka Dulbecco Eagle (DMEM) uzupełniona 10% bydlęcą surowicą płodową (FBS) i 1% L-glutaminianem) o temperaturze pokojowej i pozostawiano w temperaturze pokojowej przez 5 min.. Po delikatnym wymieszaniu w 15 ml probówkach zawartość wysiewano na szalki P100 i umieszczano w cieplarce w temperaturze 37°C przy 5% stężeniu CO2. Po 18 godzinach pożywkę zmieniano, w niektórych przypadkach jako nowe stosowano podłoże zawierając e tylko 1% lub 0% BBS. P o nsistępnyeh22 oodzinach zbierano ożżywkę iddukyyjną. przez odwirowanie i usunięcie komórek, i przechowywano ją zamrożoną w -70°C.
Transfekcję komórek CHO-DUKX (CHO) dla uzyskania przejściowej lub stałej ekspresji przeprowadzono przez wytrącenie DNA fosforanem wapnia. Dwadzieścia cztery godziny przed transfekcją, eksponencjalnie rosnące komórki CHO umieszczano w 100 mm szalce hodowlanej tak aby ich ilość wynosiła 7,5x105 komórek na szalkę. W dniu transformacji do 0,5 ml buforu do transfekcji (patrz niżej) dodawano 10 pg plazmidowego DNA, 31 pl 2 M CaC-B, roztwór DNA-CaCl2 intensywnie mieszano i pozostawiono na 45 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie pożywkę ściągano z szalki i przy pomocy jałowej plastikowej pipety do komórek dodawano DNA, komórki pozostawiano w temperaturze pokojowej na dalsze 20 minut. Pod upływie tego czasu na szalkę nanoszono 5 ml pełnej pożywki a(+) MEM zawierającej 10% FBS i inkuUowapo ją przez 4-6 godz. w temp. 37°C. Następnie pożywkę wysysano z szalki, a znajdujące się na niej komórki poddawano szokowi glicerolowemu mkubująy przez 3,5 min. w temp. 37°C w buforze do transfekcji zawierającym 15% glicerol. Po usunięciu roztworu glicerolu komórki dwukrotnie płukano PBS dokarmiano 10 ml pełnej pożywki a(+)MEM z 10% FBS i odstawiano do cieplarki o temperaturze 37°C. Dla trwałej transfekcji po 48 godzinach komórki rozcieńczano w stosunku 1:10 i dokarmiano pożywką selekcyjną (pożywka pełna a- minus MEM (nie zawierająca nuklekdydów), 10% dializowany FBS i 0,02 pM metotreksat). Zazwyczaj nie stransfekowane (wrażliwe) komórki ulegały eliminacji po upływie 3-4 tygodni pozostawiając populację komórek stransfekowanych, opornych na metotreksat.
187 400
3. Ocena wydajności ekspresji.
Wydzielanie białek hybrydowych przez stransfekowane komórki szacowano przy pomocy komercyjnie dostępnego zestawu dla rozpuszczalnego p55 (R&D Systems; Mineapolis, Minnesota), który stosowano zgodnie z zaleceniami producenta. Zestaw stwarzał również możliwość oszacowania ilości białka hybrydowego w podłożach induktywnym i hodowlanym dzięki czemu istniała podstawa dla ustalania dawek stosowanych w oznaczeniach biologicznych.
4. Ocena powstawania heterodimeru.
Dla oceny zdolności fuzyjnych podjednostek TBP-hCG do łączenia się i tworzenia heterodimerów przeprowadzono kanapkowy test immunologiczny przy pomocy przeciwciał przeciw podjednostkom hCG. W oznaczeniu tym dla zaadsorbowania analizowanego czynnika zastosowano płytki immunologiczne opłaszczone monoklonalnym przeciwciałem przeciw β podjednostce hCG. Pierwszym, wykrywającym przeciwciałem jest poliklonalne przeciwciało rozwinięte w kozach przeciw a podjednostce ludzkiego TSH (#082422G - Biodesign International; Kennenbunkport, Maine), które następnie wykrywano rozwiniętym w króliku poliklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw przeciwciałom kozy, skoniugowanym z peroksydazą z chrzanu (Cappel; Durham, North Carolina).
W poniższej pracy użyto szereg różnych przeciwciał przeciw podjednostce β hCG, z których wszystkie nie wykazały wykrywalnej reaktywności krzyżowej z wolnymi podjednostkami a. Jedno z tych przeciwciał (3/6) jest stosowane w komercyjnie dostępnym zestawie do oznaczania hCG - MAIAclone (Biodata, Rzym, Włochy).
Wysokowiążące białko płytki immunologiczne (Costar #3590) opłaszczona przeciwciałem wiążącym (przez 2 godziny w 37°C) dodając do każdej studzienki 10 μΐ roztworu przeciwciała, o stężeniu 5 μg/nll, w buforze opłaszczającym (PBS, pH 7,4, 0,1 mM Ca+j. Po przepłukaniu buforem do płukania (PBS, pH 7,4 + 0,1% Tween 20) płytkę blokowano przez całkowite wypełnienie studzienek (-400 μΐ/studzienkę) roztworem blokującym (3% albumina z surowicy bydlęcej (BSA); frakcja V - A-4503 Sigma) w PBS pH 7,4) i inkubację przez godzinę w 37°Ć lub przez noc w 4°C. Następnie płytkę dwukrotnie płukano roztworem do płukania, a próbki kontrolną i doświadczalną rozcieńczone w rozpuszczalniku (5 mg/ml BSA w PBS, pH 7,4) dodawano w ilości 100 μΐ. Po inkubacji próbek i płytki przez dwie godziny w 37°C, płytkę dwukrotnie płukano roztworem do płukania. Pierwsze, wykrywające przeciwciało rozcieńczano 1:5000 rozpuszczalnikiem, dodawano do studzienek (100 μΐ/studzienkę) i inkubowano przez godzinę w 37°C. Drugie wykrywające przeciwciało (skoniugowane z HRP rozwinięte w króliku przeciwciało skierowane przeciw kozim Ig) rozcieńczone rozpuszczalnikiem 1:5000 dodawano (100 μΐ/studzienkę) do studzienek i po godzinnej inkubacji w 37°C płytkę płukano trzykrotnie roztworem do płukania. Dodawano sto μΐ roztworu substratu TMB (Kirkegaard i Perry Laboratories), inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie hamowano reakcję enzymatyczną przez dodanie 50 μΐ/studzienkę 0,3 M H2SO4. Następnie płytkę analizowano przy pomocy czytnika do płytek immunologicznych przy długości fali świetlnej 450 nm.
5. Częściowe oczyszczanie.
Dla zwiększenia aktywności omawianych białek hybrydowych, częściowo oczyszczono przez chromatografię immunopowinowactwa białka hybrydowe TBP-hCG.
Użytym przeciwciałem było komercyjnie dostępne przeciwciało monoklonalne z R&D Systems (MAB #225). Kolumna zawierała aktywowaną CNBr sepharozę, do której, zgodnie z zaleceniami producenta (Pharmacia) podłączono przeciwciała.
Pożywkę indukcyjną zbierano z butelek hodowlanych typu T-175, każda linia komórkowa hodowana była w niezależnej butelce, uzyskując dzienny zbiór 50 ml pożywki SFMII z butelki, przy czym dla każdej linii dziennie uzyskiwano pięć takich zbiorów. Dla usunięcia resztek komórek zebrane płyny wirowano (1000 obr. na min.). W uzyskanym materiale oznaczano ilość TBP przy pomocy komercyjnie dostępnego oznaczenia immunologicznego i zatężano (jednostki Centricon, Amicon; Beverly, Massachusetts) tak, że końcowe stężenie TBP wynosiło około 50 ng/ml.
187 400
Dziesięć ml zatężonego TBP-hCG (próbka #18873) doprowadzano NaCl do końcowego jego stężenia około 1 M i ustalano przewodnictwo roztworu na około 85 mS/cm. Tak uzyskany roztwór sączono przez 0,5 ml kolumnę immunopowinowactwa z przeciwciałami antyTBP. Zbierano przesącz i ponownie nanoszono go na kolumnę. Następnie kolumnę płukano 1 M NaCl w PBS. Związany TBP(20-161)-hCG zbierano po wypłukaniu go z kolumny 50 mM kwasem cytrynowym (pH 2,5). Eluat (około 7 ml) zatęzano przez sączenie przez Amicon Centricon-10, postępując zgodnie z zaleceniami producenta (Amicon), do objętości około 200 Lii. Po dodaniu około 800 fil PBS, tak aby końcowa objętość próbki wynosiła 1 ml, przechowywano ją w 4°C do chwili wykonania oznaczeń biologicznych.
6. Ocena aktywności anty-TNF.
Opisano szereg oznaczeń in nitro indukowanej przez TNF cytotoksyczności oceniając ilość analogów rozpuszczalnych receptorów TNF. Używaliśmy oznaczenia wykorzystującego ludzką linię komórkową raka piersi, komórki BT-20 (ATCC HTB 19). Wcześniej opisano użycie tych komórek jako podstawę dla biologicznego oznaczenia TNF (48). Komórki te hodowano w 37°C na podłożu RPMI 1640 uzupełnionym 10% inaktywowaną termicznie FBS. Komórki hodowano do momentu gdy w 80-90% pokrywały powierzchnię naczynia hodowlanego co oznaczało pasażowanie ich co 3-4 dni przy czym nowe hodowle zakładano dodając komórki do gęstości odpowiadającej 3xl06 komórek na butelkę T175 cm2.
Oznaczenie przy pomocy komórek BT-20 wykorzystuje wtrąty obecne w tych komórkach i barwienie fioletem krystalicznym jako sposób wykrywania żywych komórek poddanych działaniu TNF. Komórki martwe nie są zdolne pobrać i utrzymać barwnik.
Krótko, sposób oznaczania aktywności anty-TNF jest następujący. Do pożywki wprowadzane są zrekombinowany ludzki TNFa (R&D Systems) i próbka doświadczalna (RPMI 1640 z 5% inaktywowaną termicznie FBS), po czym są one dodane do 96 studzienkowej płytki hodowlanej. Następnie do tych samych studzienek dodaje się komórki w ilości 1x10 3 komórek/studzienkę. Ilość dodawanego TNFa określana jest wcześniej przez miareczkowanie i odpowiada dawce przy której około 50% komórek powinno zostać zabitych.
Po dodaniu próbek komórki są hodowane przez 48 godz. w 39°C, po czym przy pomocy barwienia fioletem krystalicznym i odczytu w czytniku (przy 570 nm) określa się udział w hodowli komórek żywych.
Wyniki
1. Badanie konstruktów.
Projekty badania białek hybrydowych zostały krótko przedstawione poniżej. Dla celów porównawczych prowadzono równolegle badania dwóch białek kontrolnych, jednopodjednostkowego rozpuszczalnego p55 (r-hTBP-1) i dimeru białka fuzyjnego TBP-immunoglobulina (TBP-IgG3) (przygotowanego zasadniczo tak jak to opisano w (10)).
Konstrukt TBP N^^i^^icc TBk C-koniec Partner w fuzji
r-hTBP-1 mieszimy z 9 i 20 180 brak
TBP-Ig mieszzrnnz 9 i 2 19 stały region ciężkiego łańcucha IgG3
TBP(20-161 )-hCG 20 161 hCGa i hCGfi (heterodimer)
TBP(20-190)-hCG 20 190 hCGa i FCGp.i (heterodime))
Sekwencje cząsteczek DNA kodujących TBP(20-190)-hCG i TBP(20-161)-hCG przedstawiono odpowiednio na fig. 1 i 2.
2. Przegląd białek TBP-hCG.
W przypadku wszystkich badanych konstruktów stwierdzono, że są wytwarzane i wydzielane przez komórki ssaków do podłoża hodowlanego. Ilustrujące to dane pokazano w tabeli 1 i 2.
3. Składanie w heterodimer białek fuzyjnych TBP-hCG(a/B).
Łączenie się TBP-hCGa i TBP-hCGP potwierdzono stosując oznaczenie kanapkowe dla heterodimeru hCG. Powstawanie wykrywalnego heterodimeru uzyskiwano jedynie przy kombinowanej transfekcji fuzyjnymi podjednostkami a i β (tabela 3).
187 400
4. Hybrydowe białko TBP-hCG wykazuje wzrost aktywności względem monomeru TBP.
W oznaczeniu biologicznym na komórkach BT-20 białka hybrydowe otrzymywane zarówno w komórkach COS-7 jak i CHO okazały się być potężnymi inhibitorami TNFa. Wyniki badań niektórych próbek zebrano w tabeli 4.
Kontrole negatywne (pożywka indukująca ze ślepej transfekcji) zawierały lx stężone próbki pożywki. Jak przedstawiono na fig. 3-5 (punkty na osi y) wynikiem dodania TNF (2,5 ng/ml) jest wyraźne zmniejszenie ilości żywych komórek (co oznaczono przy OD 570). W każdym przypadku maksymalny efekt działania aktywnych próbek przejawiał się przywróceniem żywotności komórek do poziomu obserwowanego przy braku TNF (np. kontrola oznaczona „same komórki”).
Również kontrole pozytywne, r-hTBP i TBP-IgG3 wykazywały działanie ochronne wyraźnie zależne od wielkości dawki i wynoszące odpowiednio przy ED50 około 100 ng/ml dla r-hTBP-1 (fig. 3-5) i około 1,5 ng/ml dla TBP-IgG3 (fig. 3).
Konstrukty TBP-hCG z lx stężonego podłoża (CHO lub COS) lub oczyszczone metodami immunologicznymi wykazywały właściwości ochronne zależne od dawki wynoszące przy ED50 od 2-11 ng/ml (fig. 3-5).
W tabeli 5 przedstawiono wyniki uzyskane dla przeprowadzonych in vitro oznaczeń biologicznych. Dane wykazują, że białka hybrydowe hamują cytotoksyczne działanie TNF i działają one zasadniczo silniej niz monomer TBP. Kontrola negatywna była pozbawiona aktywności ochronnej.
Poza możliwością wzmacniania działania TBP przez dimeryzację jest również możliwym, że aktywności białek hybrydowych nie są związane z ich zdolnością do dimeryzacji z TBP lecz raczej do sterycznego hamowania aktywności partnera, z którym tworzą hybrydę, zaburzającym wiązanie przez receptor TNF zlokalizowany na powierzchni komórki rozpuszczalnego TBP/TNF.
Wszystkie cytowane tu materiały źródłowe, włącznie z artykułami w czasopismach lub streszczeniami publikowanymi lub zgłoszonymi amerykańskimi lub zagranicznymi zgłoszeniami patentowymi, wydanymi lub zgłoszonymi amerykańskimi lub zaganicznymi patentami łub innymi materiałami źródłowymi są w całości włączone przez cytowania, obejmując wszystkie dane, tabele fig., i tekst zawarty w cytowanych materiałach źródłowych. Dodatkowo przez cytowanie włączona jest pełna zawartość materiałów źródłowych zawartych w cytowanych tu materiałach źródłowych.
Odniesienie się do znanych etapów metod, etapów metod tradycyjnych, znanych metod lub metod tradycyjnych w żaden sposób nie stanowi przyznania, że jakikolwiek z aspektów, opisu lub ucieleśnienia obecnego wynalazku jest zawarty, nauczany lub sugerowany przez stosowne działy nauki.
Tabele
Tabela 1: przejściowa ekspresja w COS7(TBP ELISA)
Białko hybrydowe Stężenie (pg/ml)
TBP1 66
TBP-hCGa(20-161) 5,1
TBP-hCGP(20-161) 0,5
TBP-hCG(20-161) 2,7
Kontrola <0,25
Konstrukt eksprymowano przy pomocy pSYL (Pharmacia)
187 400
Tabela 2. przejściowa ekspresja w COS-7 (TBP ELISA)
Białko hybrydowe Stężenie (ng/ml)
TBP1 131
TBP-hCGa(20-190) 81
TBP-hCGP(20-190) 9
TBP-hCG(20-190) 62
Kontrola <1
Konstrukt eksprymowano przy pomocy wektora pD niosącego promotor metalotioneiny
Tabela 3 przejściowa ekspresja w COS-7 oznaczenie dla heterodimeru hCG)
Białko hybrydowe Stężenie (ng/mł)
TBP1 <0,2
TBP-hCGa(20-190) <0,2
TBP-ŁCGP(20-190) <0,2
TBP-hCG(20-190) 38
Kontrola <0,2
Tabela 4’ Próbki badane z uwagi na aktywność anty-TNF
Konstrukt Rodzaj komórki Charakter próbki
r-hTBP-1 CHO Oczyszczona
TBP-IgG3 CHO lx pożywka mdukcyjna
TBP(20-161)-hCG CHO Oczyszczona immunologicznie (antyTBP)
TBP(20-190)-hCG CHO lx pożywka indukcyjna
TBP(20-190)-hCG COS lx pożywka indukcyjna
Tabela 5 Wstępna ocena białek hybrydowych w oznaczeniu cytotoksyczności TNF
Konstrukt Partner w fuzji Aktywność anty -TNF (dla ED50) w oznaczeniu dla komórek BT-20**
r-hTBP-1 Brak 100 ng/ml
TBP-igG3 Region zmienny ciężkiego łańcucha IgG3 1,5 ng/ml
TBP(20-161)-hCG hCG I hCG (heterodimer) 2 ng/ml
TBP(20-190)-hCG hCG I hCG (heterodimer) 8-11 ng/lml
** Oznaczenie dawki I oszacowanie ED50 wykonano stosując TBP ELISA
187 400
Referencje.
1. Smith, R.A. et al, J.Biol. Chem 262:6951-6954, 1987.
2. Eck, M.J. et al., J. Biol. Chem. 264:17595-17605, 1989.
3. Jones, E.Y. et al., Nature 338:225-228, 1989.
4. Eck, M.J. et al., Annu. Rev. Biochem. 50:465-495, 1981.
5. Pierce, J.G. et al., Annu. Rev. Biochem. 50:465-495, 1981.
6. Laphom, A. J. et al., Naturę 369:455-461, 1994
7. Wu, H., et al., Structure 2:545-550,1994.
8. Engelmann, H., et all., J. Biol. Chem. 265:14497-14504, 1990.
9. Adam, D. et all., J. Biol. Chem. 270:17482-17487, 1995.
10. Loetscher, H.R., et al., J. Biol. Chem. 266:18324-18329, 1991
11. Banner, D.W., et al., Cell 73:431-445, 1993.
12. Pennica, D., etal., Biochemistry 32:3131-3138, 1993.
13. Engelmann, H. etal., J. Biol. Chem. 265:1531-1536, 1990.
14. Van Zee, K.J. et all., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4845-4849, 1992.
15. Aderka, D. et al., J. Exp. Med. 175:323-329, 1992.
16. Mohler,K.M.,etal., J. Immunol. 151:1548-1561, 1993.
17. Bertini, R., et al., Eur. Cytokine Netw., 1993.
18. Piguet, P.F., et al., Immunologu 77:510-514, 1993.
19. Williams, R.O., et al., Immunology 84:433-439, 1995.
20. Capon, D.J., et al., Nature 337: 525-531, 1989.
21. Askhenazi, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:10535-10539, 1991.
22. Suitters, A.J., et al., J. Exp. Med. 179:849-856, 1994.
23. Nolan, O., etal., Biochim. Biophys. Acta 1040:1-11, 1990.
24. Rodriguez, M.L., et al., J. Immunol. 151:6954-6961, 1993.
25. Chang, H.-C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11408-11412, 1994.
26. Wu, Z., etal., J. Biol. Chem. 270:16039-16044, 1995.
27. Bazzoni, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5376-5380, 1995.
28. Boldin, M.P., et al., J. Biol. Chem. 270:387-391, 1995.
29. Vu, T.-K.H., et al., Cell, 64:1057-1068, 1991.
30. Song, H.Y., et al., J. Biol. Chem. 269:22492-22495, 1994.
31. Russell, D.A., et al., J. Infectious Diseases 171:1528-1538, 1995
32. Rao C.V., et al., Am. J. Obstet. Gynecol, 146, 65-68, 1983.
33. Damewood, M.D., et al., Fertil. Steril. 52:398-400, 1989.
34. Chen, F , et al., Mpl. Endocrinol. 6:914-919, 1992.
35. Bielińska, M., et al., J. Cell Biol. 111:330a, 1990.
36. Furuhashi, M., et al., Mol. Endocrinol. 9:54-63, 1995.
37. Sugahara, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2041-2045, 1995.
38. Johnson, G.A., et al., Biol. Reprod. 52:68-73, 1995.
39. Urlaub, G. i Chasin, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980.
40. Nophar, Y., et al., EMBO J. 9:3269-3278, 1990.
41. Fiddes, J.C., et al., Nature 281:351-356, 1979.
42. Fiddes, J.C., et al., Nature 286:684-687, 1980.
43. Elion, E.A., w Current Protocols in Molecular Biology, wyd. Ausuble, FM. et al., John Wiley & Sons, 1993.
44. Campbell, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:760-764, 1991.
45. Cole E.S., et al., Biotechnology, 11, 1014-1024, 1993.
46. Gluzman, Y., Cell 23:175-182, 1981.
47. Chu, G. et al., Nuc. Acid Res. 15:1311-1326, 1987.
48. Yen, J., etal., J. Immunotherapy 10:174-181, 1991.
187 400
Wyszczególnienie sekwencji (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(1) ZGŁASZAJĄCY (A) NAZWISKO: Applied Research Systems ARS Holding N.V.
(B) ULICA: 14 John B. Gorsiraweg (C) MIASTO: Curacao (E) PAŃSTWO: Antyle Holenderskie (F) KOD POCZTOWY (ZIP):
(A) NAZWISKO: CAMPBELL, Robert C.
(b) ULICA: 25 Meadowbrook Drive 20 (c) MIASTO: Wrentham (E) STAN: Massachusetts (F) PAŃSTWO: USA (A) NAZWISKO: JAMESON, Bradford A.
(B) ULICA: 76 Robbins Street (C) MIASTO: Milton (E) STAN: Massachusetts (D) PAŃSTWO: USA (A) NAZWISKO: CHAPPEL, Scott C.
(B) ULICA: 125 Canton Avenue 5 (C) MIASTO: Milton (E) STAN: Massachusetts (G) PAŃSTWO: USA (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: BIAŁKA HYBRYDOWE (iii) LICZBA SEKWENCJI: 22 (iv) ADRES DLA KORESPONDENCJI:
(A) ADRES: BROWDY AND NEIMARK (B) ULICA: 419 Seventh Street N.W., Ste. 300 (C) MIASTO: Waszyngton (Washington) (D) STAN:D.C.
(E) PAŃSTWO: USA (F) KOD: 22207 (v) POSTAĆ CZYTELNA DLA KOMPUTERA:
(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release Release #1.0, Versja #1.30 (vi) DATA WCZEŚNIEJSZEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 60/011,936 (B) DATA WYPEŁNIENIA: 20 luty 1996 (C) KLASYFIKACJA:
(viii) INFORMACJE O PEŁNOMOCNIKU/AGENCJI:
(A) NAZWISKO: Browdy, Roger L.
(B) NUMER REJESTRACYJNY : 25, 618 (C) REFERENCJE/NUMER REJESTRU SPRAWY: Campbell=2A PCT (ix) INFOIRMACJE O TELEKO MUN IKACJI:
(A) TELEFON: (202) 628-5197 (B) TELEFAX: (202) 737-3528 (2) Informacje dla SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1049 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy
187 400 (C) LICZBA NICI jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI cDNA (ix) WŁAŚCIWOŚCI.· ( A) NAZWA/KLLCZ. CDS (B) LOKALIZACJA. 278.. 1047 (xi) OPIS SEKWENCJI SEQ ID NO 1.
TCCACATGGC TACAGGTARG CGCCCCTAAA ATCCCTTTGG GCACAATGTG TCCTGAGGGG
AGAGGCAGCG ACCTGTAGAT GGGACGGGGG CACTAACCCT CAGGTTTGGG GCT.TCTCAAT
CICACTATCG CCATGTAAGC CCAGTATTTG GCCAATCTCA GAAAGCTCCG CCTCCCTGGA
GGGATGGAGA GAGAAAAACA AACAGCTCCT GGAGCAGGGA GAGTGCTGGC CTCTTGGTCT
CCGGCTCCCT CTGTTGCCCT CTGGTTTCTC CCCAGGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC Ser Arg Thr Ser Leu Leu
5
CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT GCC
Leu Ala Ehe Gly 10 Leu Leu Cys Leu Pro 15 Trp Leu Gin Glu Gly 20 Ser Ala
GAT AGT GTG TGT CCC CAA GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT TCC
Asp Ser Val 25 cys Pro Gin Gly Lys 30 Tyr Ile His Pro Gin 35 Asn Asn Ser
ATT TGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT
Ile Cys 40 Cys Thr Lys Cys His 45 Lys Gly Thr Tyr Leu 50 Tyr Asn Aso Cys
CGA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GaC TGC AGG GAG TGT GAG AGC GGC TCC
Ero 5*5 Gly Pro Gly Gin Asp eo Thr Asp Cys Arg Glu es Cys Glu Ser Gly Ser 70
TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC AAA
Phe Thr Ala Ser Glu 75 Asn His Leu Arg His 80 Cys Leu Ser Cys Ser 85 Lys
TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC
Cy3 Arg Ly3 Glu 90 Met Gly Gin val Glu 95 Ile Ser Ser Cys Thr 100 val Asp
CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT TGG
Arg Asp Thr 105 Val Cys Gly Cys Arg 110 Lys Asn Gin Tyr Arg 115 His Tyr Trp
AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC ACC CTC TGC CTC AAT GGG
Ser Glu 120 Asn Leu Phe Gin Cys L2S Phe Asn Cys Ser Leu 130 Cys Leu Asn Gly
ACC GTG CAC CTC TCC TGC CAG GAG AAA CAG AAC ACC GTG TGC ACC TGC
Thr 13 5 Val His Leu Ser Cys 140 Gin Glu Lys Gin Asn 145 Thr Val cys Ttir Cys 150
CA-T GCA GCT TTC TTT CTA AGA GAA AAC GAG TGT GTC' TCC TGT GCC GGT
Eis Ala Gly Phe Phe 155 Leu Arg Glu Asn Glu 160 Cys Val Ser Cys Ala 165 Gly
GCT GCC GCA GGT TGC CCA GAA TGC ACG CTA CAG GAA. AAC CCA TTC TTC
Ala Ala Pro Gly 170 Cys Pro Glu Cys Thr 175 Leu Gin Glu Asn PrO 180 Ehe Pha
120
130
240
2-95
343
391
439
487
53-5
58-3
631
679
727
775
823
187 400
TCC Ser CAG Gln CCG Pro 135 GGT Gly gc:c All CCA Pro ATT. He CTT CAG TGC Leu Gin Cys 190 ATG Mięt GGC Gly TCC Cys 195 TGC Cys -rrc Phe TCT Ser S 71
AGA GCA TAT CCC ACT CCA CTA AGG TCC AAG aac ACG ATG TTG GTC C?aA 919
Arg Ala Tyz Pro TTr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gis
200 205- 210,
AAG AAC GTC ACC TCA GAG TCC' ACT TGC TGT GTA GCT AAC TCA TAT AAC 967
Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn
215 220 225 230
AGG GTC ACA GTC ATG GGG ©5T TTC AAA GTG GAG paac CCAC ACG' GGG TGC 1015
Arg Val Thr V-al Ket Gly Gly Phe. Lys Val Glu- Asn Hi 3 Tłrr Gl-y Cys
235 24 0 245
CAC TTG AGT- ACT TGT TAT TAT cac AAA TCT TA -G3 1049
His Cys Ser Thr - Cys TS/r Tyr His Lys Ser
250 25 5
(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI SEQ ID NO 2
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI
(A) DŁUGOŚĆ 256 aminokwasów
(B) Rodzaj dinn nukw ss (D) Topologia Liniowa
(ii RODZAJ CZĄS fECZKL bi.iiko
(x-i) OPIS SEKWENCJI- .SEQ ID NO 2.
Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu. CSys Leu Pro Tr,
1 5 10 15
Leu Gin Glu. Gly Ser AlLa Asn Ser Val Cys Pro Gln Gly Lvs t-L Ile
20 * 25 30
His Pro Gin Asn- Asn Ser Tle <Cy Cys Thr Lys Cys His Lys Gly/ Thr
35 40 45
Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg
50 ' 55 6.0
Glu Cys Glu See Gly Ser- Phe tul Ala Ser du Asn His Leu Al, Gii
65 70 77 88
Cys Leu Ser Ccs See Lys 'Cys ALg Lys Glu Met Gly Gln Val GH Gil
85 90 95
Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val cy-s Gly Cys Arg Lys JAn
100 105 110
Gln Tyr Arg His Osr Trp Ser Glu. -Asn Leu Phe Gln 'CyG pe.G Asn Ccs
115 110 125
Ser Leu Cys Leu -Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Hu Lys Gln
130 131 140
Asn Thr Val Ccs Thr Lcs His Ala Gl-y Ple Phe Leu Arg Glu Asn GL u
145 150 115 110
Cys Val Ser G ys Al a dy Ala Ali aro Ala Cys o GO Gls SyP Tłu L eu
165 17C 175
187 400
Gln Glu Asn PoO 180 Phe Phe Ser Gin. Pro 185 Gly AU. a Pro He Leu 110 Gin Cys
Mat Gly (Cys 195 Cys Phe Ser Arg Al a 20S Gyr Pro Tir Pro Leu 205 Arg Ser Lys
Lys Thr 210 Met Lau Val Gin Lys 215 Asn Val Thr Ser Glu 220 Ser Thr Cys Cys
Val 225 Ala Lys Ser Tyr Asn 220 Arg 7< Thr Val Met 235 Gly Gly Phe Lys Val 240
Glu Asn His Chr Gly- 24-5 Cys His Cys Ser Thr 250 CT/s Tyr Cyo ,His Lys 25 5 Ser
(2) WORMACJA DLA SEKWENCJI SEQ ID NO (i) CHAŁAKTER.YS 1YKA SEKWENCJ.
(Λ) DLUGOSC 1202 par zasad (B) RODZAJ kwas nuklcinow (C) LICZBA NICI jedna (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI CDNT (i\) WŁAŚCIWOŚCI (Λ>Ν AADA | KLUCZ CDS (B) LOKAI. iZACJA. 279 1199 im) OPIS SEKWENCJI SEQS3QO3
TCTGTGATGG CTACTGGCAT GCGGCCCTAA AA.TCCCTTCT lgcacagtct TACGCGCCTG 60
GAGAGGTAGC GTCTCGTTGA TGGGACGGGG GGAATCTATT AGAGGGTGAG CCCGGGTTTC S20
TGCGAGCACT GCTATGCTAG CCCAGTCACC GGGTTTTTGT AGAAAGTGTC GCTTTCGGCT S18
AGGGATGGAG AGAGAAAAAC AAACAGCTCC TGGGAlTTGG AGAGTGCTTG GCTlTTCCTC SłO
TCCGGCTCCC TCTGTTGCCC TGTGGTTTCT C CTTCAGG STC ATG AAC ACC ATT 233
Ser Arg Cho Ser Leu 260
TCT Leu CCG Leu GTC TTC Ala Pne 26 5 GGC Gly CTT Leu CTC TCG Leu Cys SCG Lsu 270' ACC ACG ATT Lsu CTA STA AGG LGu AGT' SSr 341.
Aro Acoi Gln Alu 275
GTT GAC AGT GTG TGT CCC CTTA GGA AAA. STA· AAC CT.C CCT LtaT. -AT? -AT 339
Ala Tsp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lls Tyr Sie His Paso GGLn A\n Asn
280 285 290
CTG ATT TGC TGT ATT AAA! TCG? CTT -AA AGG. ACC STEC TTC TAC -ATT ffiA2 447
Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys -iii Lls Gly Thr STro Leu syr Las -As
295 300 305
TGC CCT GGC CTG GGG CAG GAT ACG aga kg: AGG GAG TGT? GAG AGC Gl-C 485
Cys Pro Gly Pro Gly Glu Thr Aau -ys TAO Glu. Cys Glu Ser Gły
310 315 320 325
TTC TCC ATT GTC TCA GAA AAC CAC CTC -AGA CAC TGC CTC AGC TCC TCC 533,
Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Ar ot His Cys Leu Ser Cy3 Ser
330 335 340
AAA TGT TGA TAG GAA ATG GGT dAG GTG -GTG ATC -CTC TCT TCC AC1A GTG 5531
Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Gln He Ser Ser Cys Thr Val
345 350 355
187 400
GAC Asp CGG Arg GAC Asp 360 ACC Thr GTG val ΤίΤ GGC CGC AGG MAS CArC CCG CCA CGG C3A5 ΤΆΤ 623
Cys Gly . Cys 365 Arg Lys CAin GGn Tvr 3371 Arg His Tyr
TGG AGT GAA AAC CCT ctc CAG TGC CTC AAT TGC AAC CCC TGC CTC WAT 677
Crp Ser Glu Asr_ Leu Phe Gin Cys Phe Asn Cyy Ser Leu Cys Łeu Asn
375 330 335
GGG ACC GTG CAC CTC TCC TGC CAG GAG ΜΆ CAG CAC ACC GTG TGC ACC 725
Gly Thr Val Cis Leu Ser Cys Gin Glu Lys Gin ?A;n Thr Val CcS TChT
390 395 440 445
TGC CAT GCA GGT CTC CTC CTA irGA GAA AAC <GG TCG CTC TCC CCT GCT 7-73
Cys His Ala G ly Phe Phe Leu Arg Hu Asn GlU Ccs Vv1 Ssi Cys ALa
410 415 440
GGT GCT GGT' CCA CGG TGC CGC CCC ATC WAT GGC CAC ctg GCT GTC? GAG 821
Giy Ala Gly Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala TCr Lee Ma Vv1 du
425 43 0 44S
AAG GAG GGC TGC CCC GTG TGC ATC ACC CTC JUC ACC CCC ATC TGT GCC 869
Lys Glu Gly Cys Pro Val Cyst Ile Chr Val- Asn Thr Ciir Ile: C/y; Ala
440 4-15 455
GGC TAC TGC ccc ΑΤ-Τ ATG ACC CGC GTG CTG ACA! GTC CTC CCC GCC 91.7
Gry Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu dl. Gly C’al Leu Pro CAla
455 460 465
CCG CCT CAG GTG GTG TGC iAAA^· TAC CGC GAA5 GTG CGC CTC CAG TCC ATC 965
Lau Pro GGn Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp val Aao- ’ Che Glu Ser Ile
470 4 75 440 445
CGG CTC CCC GGC TGC CCG cgc GGC GCG AAC CCC GGC (3TC TCC TAC GCC5 1101:3
Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser CT^r AA a
490 495 550
GTG GCT CTC Ad TCT CAA TCT GCA CCC TGC CGC CCC CGC ACC ACT GAC 1<051
Val Ala Lau Ser Cys Gln Cys Ala Leu <Cs Mg aaj C«r Chr Thr Aap
505 510 551
TGC GGG GGG 'CCC CCAG GAC CAC CCC TCG ACC tcg: CAA CGA CCC CGC CTC 1-10 9
Cys Gly Gly P ro Lys Asp His Pro Leu Thr Ccs CAp Asp Pro aaj Pcih:
520 525 553
CAG GAC TCC CCT TTC TCA AJAG GCC CCT CCC CCC CAC CCTi CCCA AGC CCA 1157
Gln Asp Sar Ser ser Ser Lys Ala Pro Pro Pu Cer Leu Pro Ser Pro
535 540 545
TCC CGA CTC CCC Gd CCC TCG GAC ACC CCG ATC crc CCA CAA TAA 1202
Ser Arg Lee, Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin
550 55-5 550
(2) INFORMACJE; DŁA SEQ ID NO.4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJE (A) DŁUGOŚĆ 307 aninokwarow (B) RODZAJ aminokwasową (D) TOPOLOGIA liniowa, (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI, białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ED NO.4 ;
Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp 15 10 15
187 400
Leu Gil Glu Gly 20 Ser CAo Asp Ξιγ val 25 Cys Arv Ulu Gly Lys 30 T—o Ile
His Pro Gin Asn Asn ser Ile Cys cys Thr L/s Cya Hi s Lys cis Thr
35 14 45
Tyr Leu Tyy- &sn GAp Cys Pro Gry Pito Gly Glu Asp Thr Asp Cys Arg
50 55- 50
Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe TJrr ASl Ser en. AS U His Łeu Arg His
65 70 75 30
Cys Leu Ser CCz*s Sm Lys Cys, Arg Lys Glu Met Gly Gin. IVal Glu ILe
85 90 95
Ser Ser CCs Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cis Arg Lys Asn
10 0' 103 L10
Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu. AlE, uss Phe Gln Cys Phe Asn Cys
115 112 125
Ser Leu Cys Leu. Asn Gly Thr val Hii Leu Cel Cys Gln Siu Lys Gln
130 13 5 140
Asn Thr Val, Cys TJhr Cys5 His Ha Gly Phe Pinie Leu Arg Glu Asr Glu
145 150 L5 5 ISO
Cys Val Ser Cys Ala Giy Ala Gly Pro Arg Cys Arg Pro Tl<e A3H Ala
165 HO 3 75
Thr Leu Al. a Val GVu Lys Glu. Gly Cys Ho Val spo I le THr dl Aan
18 0 105 ISO
Thr Thr Ile Cys AC a Gly Tyr Cys soc spl Met Thr Arg Val Leu Gln
195 220 205
Gly Val Leu Prć> Alu Lau Pro Gin val Wal Cys As u Tyr Arg Asp Val
210 215 220
Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu.· Pro Gly Cys Pro Alg Gly Vetl Asn Pro
225 23Q 2 35 240
Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gin <Cys Ala Leu Cys Arg
245 220 255
Arg, Ser Th έ- Tbr Asp Cys Gl y C1s Pro Lys Asp H1i Pro Len Tir Cys
260 26 5 270
Asp Asp ργο Arg Phi Glu Asp Sm 5eS leu Ser Lyy- Ala Pro Pro Prr
275 230 23'S
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Seo Asp Thr Pro Ilu
290 285 300
Leu Pro Gln
305 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ : ί 147 par zasad (B) RODZAJ kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI jedna (d) TOPOLOGIA liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI. cDNA
187 400 (s) WŁAŚCWOTCI, (A) NAZWA KLUCZ CDS (B) LOKALIZACJA. 278 1132 (xi) OPIS SEKWENCJI. SEQ ID NO:5 :
TCGCCCTGCC TCCClCTCCC CGCCCCTGTCC ACCCCCTTTG ^^.CAJGCCC CaGTCJTCCT» 66)
AGAGGCACCG CCCTCTTlAT ICCCllGCCC CC^GCCCCCTl CGGTTTGGGC CCTTTTCCAT 1-2 0
GTCClTCTGC CCATCTCCGC CCATTTTTGG CCCCTCCTCA CCtCAGCCCTT GTCCCTGGCC ISO
GGGATGGAGA CCGCCCTCCC ACCGGCTCCT ICCCCGGGGA CACTCCTGGC (T^CTGGiCTCTr 22 0,
gcggCtccct GTCTTGCCCT GGGGTTCTCC CGCCGGC CCC GGG CCG CCC TGC TCC 2$>5
Ser Arg Thr Ser Leu Leu 310
CTl GCT TTT CGC CTG CTC TGC CTG CCC TG Gm* TCT GAG GGC CCC GCC 3.43
Leu Cla Phe Gly Leu Leu Cys; L en P ra Tro Leu Gln Glu Gly Ss^ CTl
315 310 325
.CCT CGT GTG TGT CCC CCC GGC TCA TCT TCC ccc CCT CCT. ACC ACC CGT 339.
Csp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lva T y-y I le. His Pro Gln SCsr Acn Cei^
330 33 5 340 345
CTT TGC· TGT ACC CCG TGC CAC jCAJC GGA ACC TAC TTC TAC jct CCC CTC 4 3'3
Ile Cys Cys Thr Lys Cys His L yjs G ly Thr Tyr Leu Tyr iCJl Cep Ccs
350 335 360
CCT CGC CCG GGG CCG GCT AC CC G AC TGC AGG GGGTG TGT GAG ACC CCC. ctc 447
Pro Gly Pro Gly Gin Csp· Thr Asp Cys Aicj Glu Cys Glu Ser Gly Cse
365 370 375
TTC CCC CCT TCC CCC CCC CAC CTC AGA CAC TGC TTT GCC CCC TTC CCC· S 35
Phe Thr Cla Ser Glu Csn His Leu Arg H15 Cys Leu Ser cts 5ee Gyy
380 335 390
TCC ccc CCG GCC CTG GGT CACC GTG GAG ATC TCT TTT Tgv ACA Gl3 CCC 5S3
Cys Crg Lys Glu Met Gly Gin Val G lu Ile Ser Ser Cys Thr val Ces
395· 400 405
CGC CCC CCC GTG TGT CCC TGC AGG AAG GCCC (TAG TCC CdG CAT TAT CTG 631
Crg Csp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys A sn <Gln Tyr Arg Kis Trr 6Ar,
4L0 415 410 425
CCT CCC CCC CTT TTC CCG TGC TTC AAT TGC JTiTT CTC TGC CTC jT.T GGC ,679
Ser Clu> Csn, Leu Phe Gln Cys Phe Aon Cys Tbr Leu Cys Lee Asm Gly
430 435 440
ccc GTG CCC CTC TCC TGT CJCC GAG GCCC CSC· AAC CCT GTC tgg: ACC CSC 72 7
Thr Val His Leu Ser Cys Gin G lu. Lys G In Ast! Thr Val Cyy Cto CCs
4 45 450 455
CCT CCC CCT TTT CTC AGA GAC AAC GAG TGT GTC TCC TTT ACC iCC 775
His Cla Gly Phe Phe Leu Arg. Glu Ajsu G lu (Cys Val Ser Cyy Ser Acs
46 0 465 470
TGT CCG CCC TGC CTG GAG TGC ACG AAG TTG TCC CTC CCT cm ATTT fflCG 823‘
Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Tar Lyy Ceu Ser Leu poO li 66 Ul: Gin
475 440 485
CCT GTT CCC GGC CCT CCC GAC TCA GGC ACC ACA GCC GGT GCT GCC CiCA 071
Csn Val Lys Gly Thr Glu Aso Ser G Gl T hr Thr Cla Gly Ala CC! «2· Pro
490 495 500 505
187 400
919
GST TGC CCA CCS TGC ACC (CTA CAG GiCG AC-.C CCA TTT GTT TCC Ger CCC Gln 520 CCC Gra
Gly Cys Pro Glu Cis 510 .Thr Leu Gin Glu Acs 515 Pro PPs SPh
GGT GCC CCS TCA GTT CAG TGC ATG GGC TC-C TGC τ ATT AGA «St STC
Gly Ala Prr Sie· Leu GGa Cys Met Gly CCS Cys PP.h Sse Arg- sCa Tts
525 5-ło 5X3
CCC ACT CCA GTA AGG TCC AAG 7CGCG 'TG ATG TTG GGC CCAj SAAG 2G.C GTT
Pro Thr Brr Geu Arg Ser Lys Łys Thr Mat Leu Val Gin Łys Asn Gal
510 ’ 545 550
ACC TCA GAG TCG ACT TGC TCT GTA GCT GCG CCS. -TG- -cc AGG GTC ACA
Thr Ser Gil Ser Thr cCy- Cys Val Ala Lys Ser TlO Asn Arg lal Thr
525 560 565
GTC ATT GGG GGT TTC jccg GTG GAG jCGC CCC CCS GCG TGC CAC TGC S.GT
Val Mec Gly Gly Phe Iąs Vil Gilu SC3n Thr Ala cci His Cryi Ssr
570 575 5B0 585
ACT TGT TTT TAG CCC AAA TCT TGAGGGATCCC TCG-lG
Thr Cys Tyr Tyr His Lyr Ser
590
1015
1063
1111
1147 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI SEO ID NO 6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ 285 aminokwasów (β) RODZAJ: aminokwasowa (C) TOPOLOGIA liniowa (ii) RODZAJ5 CZĄSTECZKI, białko (xi) OPIS SEKWENCJI SEQ1DNO 6
Str Arg Thr Ser Leu. Leu Lee Ala Ph$ Gly Leu. Leu cys Łeu PlPj Tigp
1 5 10 15
Leu Gln du G ly Sar C.li Asp Ser Val Cys Pro Gln_ Gly Ly1 Gts lll
20 25 33
His Pro GGa Asn Asn. Ser He Scs CSs Thr A/S Ctys His Ιψι SGa STr
35 40 40
Tyr Leu Tyr Asn Asp- Cys gro- Gly Pro Gly Gln Csp Thr Csp Cis Arg
50 55 60
Glu Cys 'G_lu •Ser Gly 1 er Phe SCn· G?l <>τ· Glu Csn His Seu Rcg -Sis
65 70 75 8B
Cys Leu Ser Cys Sejf Łys cci Acg· Łyi Glu Met Sly· Gln Vil GlU Sil
BS 90 35
Ser Ser Cyi Thr va! ll g Acg Asg The Psi Cys Cly CyG 1sC s-O
100 110
Glu Tyr Acg His Tyr Trp Sto eer Asc Leu Phe dn Cyi n-C san css
115 120
Thr Leu Cys Leu Asn Gly Thr Vll His Leu Ser Cis Gln Glu Lys Gln
1Ξ0 135 140
Asn Tar Val Cys ThT Cys His Ala. Gly Phe Phe Arg Glu Α3Γ1 Glu
14 5 ISO 155 110
Cys Val Ser Cys Ser Asn C-ys Łys. Ty s Se r -Leu. Glu Cys Tho Lys L£U
165 170 175
187 400
Sao Leu Pro Gln He Glu Asn Val Lys Gly ΤΙι— Glu Asp Ser Gly Thr
180 185 190
Thr Ala dl· Ala Ala Pro Gly 0/5 Pro Glu Cys Thr Leu Gln Gln Asn
135 200 205
Pro Phe Phe See Gln Pr-j Giv Ala Pro Ile Leu Gln Cy.s MAt Gly CCl
210 215 220
cis Phe Sfi^r H-g Ala Tyr 'Pro T-hr Pro Leu Arrg Cer Lys Lys Thr Met
225 2 30 235 240
Łeu Val &Π Pyy Asn· Val Thr Ser Glu Cer Thr Cys Cys Val Ala i.yy
245 25 0 255
Ser Tyr Asn Arg dl TJco Val Met Gly Gly Phe Lye Val Glu Asn Kii
260- 265 270
Thr S-lą Cys His Cys Se r Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
275 280 285'
(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO 7:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ 1301 parzadsad (B) RODZAJ kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI jedna (D) TOPOLOGIA. liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI cDNA (ix) WŁAŚCIWOŚCI:
(A) NAZWA/KLUCZ. CDS (B) LOKALIZACJA 279 4287 (xi) OPIS SEKWENCJI. SEQ ID NO 7
CCSilSSTGG SClCliiTll CGCCCCCAAA ACCSSCCCir SCSKSlTSCr CCSCCSAiGP 60
GASASGCASC GACCTGTAGA TGGGACGGGG CGACTACCCP CAlEGTTSEP GGCTTOTtASl 12 2
CCCiAiTACC ECCAGSTAAC CCCGTTTT^rT GCCSlGTCCP GGAAGGCCCP iiCCCsCiSr 1B8
lSGilCGGli lSlSSAAAlK AACSACCCCP SSASCCESGP GlSCiCCiCr CCCCTSGCCP 220
CCCiCSTCCC CCCiTTGCCS SCGiTCCKCy CCC. ϋΐ AG y TKl T^GG 2,331
Ser Arg Tho Ser Leu 290
ctc - Cd Ger ccy· gc r ero Gly Leu 2S5 CCT TGC Cd CCC Pd PSA GAG d AST 341
Leu. -Leu Ala Phe Leu -Cys Leu. Pro Tto Lee dn Glu Gly Ser
300 305
GCC GAT ATI CCC CCA GOS ha. TJST ATC CSC CCT OAL WAT WAT 335
Ala Asp Ser lal Cys Pro dn Gly Lys Tyr Ile PTs Pro Gln Act PAm
310 315 320
CCS ATT scr SCP SKCC JAW! TCC CAC AAA GGA ACC PTA TTG τΑσ fUT sic. 437
Ser lle cci rys Thr Lys CSy His Lys Gly -dr Td· Leu yyj- Asn ?Ap
325 330 335
CCA Gcr CGP Gir Cli GAT ACG GAC TGC AGG SASę TGT GAG AGC GGC 43 5
Cys Pro ggu Prc Gly Sln /Ap Thr Asp cys Il-g Glu Cys Glu Ser Gly
340 35 5 350
187 400
rcc ttc ACC GCT TCTC C-GiA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGA TGC TCC 553
Ser 355 Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu. Arg His Cys Leu Ser Ays Sar 330
360 355
AAA TGC CGA AAG GA- ATG dT CAG CTG GAG ATC TAT TCT TGA AAA ση 553
Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cvs Thr VaU
375 380 385
GAC CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG GA-G GACC CAG TAA CGG CAT TAT 662
Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Gys A^cj Lys Asn dn Tyr Arg His Tyr
390 3 35. 4100
TGG AGT GAl AAC CTT TTC CAG GGC TTC GAT TGC AGA ATA TGC ATC AAT 677
Trp Ser Glu Asn. Leu PPr dl Ga- PPu Am Ccs Ser Leu Cys Leu Asn
405 411 415
GH ACC yτy CAC CTC TCC TCC CCA5 GAG MAC CAG AAC ACC GTG TGC ACA 722
Gly Thr VaU His Leu Ser C'- dn du Gys Glu. Asn Thr Val Ays Thr
420 422 430
TGC AAT GCA GGT TTC TTT CCTC AGA GU- GACC GUS tgt GTC TAC TGT AGT 777
Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Al— GJ.U GAn du Cys VaU Ser Cys Ser
435 440 4 4 4 «40
AAC TGT AAG AAA AGC CTG GAG TGC ACG AAA ir-G TGA ATA CCC AAG ATT 822
Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln ile
455 460 446
GAG AAT GTT AAG GGC ACT GAG GAC TłAC GGC ACC ACA GAT mr GCT κτ 86 9
Glu Asn VaU Lys Gly TTur Glu Asp Ser Gly Thr Thr Ala Gly Ala Gly
470 «47 400
CCA CGG TC^C' CGC CCC circc GACT GCC ACC CAT GCT GTG - AlG UAU gga 911
Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Tłuc Leu Ala VaU Glu Lys GUu Gly
485 490 495
TGC CCC yry TGC ATC ACC GTC- GAC ACC ACC ATC TCT GCC GGA TAC TGC 96 5
cys Pro Val cys Ile Thr- Val dn TłhL TTr- Ile Cys Ala Gly Tyr Cys
500 550 510'
ccc ACC ATG ACC CGC GTG CTG CAG GCG3 GTC CTC? CCG GCC ATG CCT CAG 1113
Pro ThL Met Thr Arg Val 3Liu Glui Gly Val Leu Pro Ala Leu. Pro GUn
515 522 552 533
GTC GTC TGC AAC TAC CGC GAT GTG CISC TTC GAG TCA ATC CGG CTA CCT 1061
Val VaU Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser ile Arg Leu Pro
535 544 5515
GGC TGC CCG CGC GGC GTG AAC CCC GTC GTC TCC TAA GCC GTC GCT CTA ΧΧΟθ
Gly Cys Pro Arg dy Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val A-Ua Leu
55C 555 660
AGC TCT AAA TUT GCA CTC TGC CGC CGC AGC ACC ACT GAC TCC Gd HT 1157
Ser Cys Gln Cys All Leu Cys Arg Arg Ser Tłrr Thr Asp Cys Gly Gly
565 570 575
CCC AAG GAC CAC CCC TTG ACC TGT GAT GAC CCC CGC TTC CAG GAC TCC 1205
Pro Lys Asp His Prr Leu Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe dn Asp Ser
580 558 5 9Ό
TCT TCC TCA AU GGA CCT CCC CCC AGC CTT ACA AGC CCA TCA CGA ATA 1253
Ser Ser Ser Lys All Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu
595 600 605 63.0
CCG GGG CCC TCG GAC ACC CCG ATC CTC CCA CAA T AAGGATCACT GAAG cm
Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro ile Leu Pro Gln
615 662
187 400 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO- 8 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ. 336 aminokwasów (B= RODZAJ: aminokwasową (D) TOPOLOGIA, liniowa (ii) RODZAJCZASTECZKI. białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO. 8
Ser 1 Arg Thr Ser Leu 5 Leu Leu Ala Phe Gly 10 Leu Leu Cys Leu Pro 15 Tir?
Leu Gln Glu Gly 20 Ser Ala OAp Ser Val 25 CCs Pro Gln Gly Lys 30 Tyr Ile
His Pro Gln 35 Asn Asn Ser I ll Cys 40 Cys Thr Lys Cys His 45 Lys Gly Thr
Tyr Leu 50 Tyr Asn Asp Cys Ppo 55 Gly Pro Gly ^in Asp 60 CTir A3p cys CAoJ
Glu 65 Cys Glu Ser Gly Ser 70 Phe Thr- Al a Ser Glu 75 Asn His Leu Arg His 80
Cys Leu Ser Cys Ser 35 Lys Cys Pr— Lys GiU 50 Met Gly Gln Val Glu 95 Ile
Ser Ser Cys Thr 100 Val A-sp Arg Asp Th.r 105 Val Cys Gly ζψε Arg 110 Lys Asn
Gln Tyr Arg 11S His Tyr Trp Ser Glu 120 Asn Leu Phe Gln cCy 125 Phe CGH cys
Ser Leu 13 0 Cys L eu Asn Gly Thr 135 Val Kir Leu Ser Cys 140 Gln Glu Lys Gln
Asn 145 Thr Val Cys Tir Cy3 150 His Ala Gly Phe Phe 15-S Leu Arg Glu TA^n Alu 1(50
Cys Val Ser CC/s Ser 165 Asnt Cys Lys Lys Ser 170 Leu Glu Cys Thr Lys- 175 Leu
Cys Leu Pro Gln 180 Ile Glu Asn. Val Lys 185 Gly Thr Glu Asp Ser 190 ei^y Thr
Thr Ala Gly 195 Ala Gly Pro Arg Cys 200 Arg Pro He Asn Ala 2D5 Thr Leu Ala
Val Glu 210' Lys Glu Gly Cys Pro 215 Val Cys Ile Thr Val 220 Asn Thr Thr lle
Cys 22 5 Ala Gly 'Trr Cys Pro 230 Thr Met Thr Arg Val 235 Leu. Gln Gly val Leu 240
Pro Ala Leu Pro Gln 245 Val Val ayc Asn. Tyr 2S0 Arg Asp Val Arg Phe 255 gOu
Ser He Arg Leu 26 0 Pro Gly Cys Pro Ary 265 Gly Val ASIC Pro Val 270 val Siar
Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ale Leu Cys Arg Arg Ser Thr
275 280 235
187 400
Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp Pro
290 295 300
Arg Phe Gin Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
305 310 315 320
Ser Pro Ser Arg Leu Pro Lly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin
325 330 335
(2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 9:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ NO ID: 9: Ala Gly Ala Ala Pro Gly 1 5 (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 10:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) LICZBA NICŁ jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ NO ID: 10: Ala Gly Ala Gly 1 (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 11:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ NO ID: 11: TTTTCTCGAG ATGGCTACAG GTAAGCGCCC
187 400 (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 12:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCU : SEQ NOID:
ACCTGGGGCA GCACCGGCAC AGGAGACACA CTCGTTTTC (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 13:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) RODZAJ CZĄSTECZKIs cDNA (xi) OPK SEKWENCJI : SEQ NO ID: 13:
TGTGCCGGTG CTGCCCCAGG TTGCCCAGAA TGCACGCTAC AG (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 14:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) RODZAJ CZĄSTECZK:i cDNA (xi) ONS SEKWENCJI : SEQ NO ID : 14:
TTTTGGATCC TTAAGATTTG TGATAATAAC AAGTAC (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 15:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA
187 400 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ NO ID: 15: CCGTGGACCA GCACCAGCAC AGGAGACACA CTCGTTTTC (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 16:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ NO ID: 16: TGTGCTGGTG CTGGTCCACG GTGCCGCCCC ATCAAT (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 17:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ NO ID: 17: TTTTGGATCC TTATTGTGGG AGGATCGGGG TG (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 18:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI : SEQ NO ID : 18:
TTTTAGATCT CTTCTTGCAC AGTGGAC (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 19:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowy
187 400 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ NO ID: 19:
TGTGGTGCCT GAGTCCTCAG T (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 20:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ NO ID: 20:
ACTGAGGACT CAGGCACCAC AGCCGGTGCT GCCCCAGGTT G (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 21:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ NO ID: 21:
TTTTTCTAGA GAAGCAGCAG CAGCCCATG (2) INFORMACJA DLA DEQ NO ID: 22:
(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 75 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowy (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ NO ID: 22:
TTTTCCACAG CCAGGGTGGC ATTGATGGGG CGGCACCGTG GACCAGCACC AGCTGTGGTGCCTGAGTCCT CAGTG
187 400
Λ.Ι sekwencja sygnałowa dla hGH intron w genie hGH πsm ati jct aca a »AXKCccwAAKccnTccccAcwa^cTccTiiA^cacACcacca;nCTttAiscGAcag^«caA«gTOiigT7Nfi>>-'”~ ►w«t Ali Tłu
CAATgTCACCAT<tKaTCTAA-HtaTOTTNxcAATCTCA>^uAccrix^TcgcTHACSJTCcAa4MAAAAACAAACAccwc?ciABCAs^ACACNcNC-'XTCTTZT~i ccccTCcecKGtcirrcTHTTTCTCCCCACuc jco eaa acu jec cąa ctc cie act m sec era erę aac era ccc iaa C łs*f Arj Thr S»r l»u Uu Uu Ali Phi Gly Liu Lau Cy* l»u Pro Trp Liu +20 Asp z dojrzałego TBP1
Hi 2i2 222 iii 1£2 OT«iBwwiacc**eałmau:AKa:cncuA*iJtttKc*WKCiciACCMci«ac*uzA łem Głu Gly Sir Al » A»p Sw V»l cy* Pr» Gin Cty ly» Tyr II· HI* ProGln Aw Am Ser U* Cy» Cy» Ihr ly» Cy» KI· ly» Gly
ACC TAC IN TAC AAT CAC ICT CCA C« CCC CCC ttó OT ACC CAC TCC Mi HC TCT SM KC CCC TCC TK ACC Ki. CM MC CAC ł Thr Tyr Iw Tyr Am A»pCy» froOty fto Gly Gin Aip Thr Alp Cy* Afł Glu Cy» Glu iw Gly Sw PM Thr AU Sw Glu A*n Hi* Liu
ACA CM ISC CTC ACC TCC TCC AAA NC CCA AM «Α ATS CCT CAC STS US AIC TC7 Id TK ACA CW CAC CCS CAC «X CTC TCT CCC NT ►ArpHI» Cy» l*v S*r Cy* 5w ly* Cy* Arj ly* Glu rtt Gly GlnV»l Olu II» Sw Sw Cy» Thr V«l A»pArjA»p Thr V»l Cy* Gly Cy»
ACC AAU AAC CAG TAC CGA CAT TAI TH ACT UAA AAC CTT ΓΚ CAC NC TTC AAI NC ACC CTC NC CTC AAT CCC ACC CN CAC CTC TTC NT ^Are ly* Am Gin Tyr ArpHl» T/r Trp Sw Glu Am Uu R>» Gin Cyt PUAmCy» Sw UuCy» Uu AmGIy Thr V*l HI» Uu Sw C/« IWwr
CAC CAC AAA CAC AAC ICC CTC NC AK NC CAJ CCA CCT TTC TTT CIA ACA CAA AAC CAC NT CTC TCC NI CCC BOT »CT fK CCA CCT ► Gin Glu LyłGInAłnThr V*l Cy* Thr Cy* HI* Al* Gly Pb* Phi UuAijGiuAmGluCy* V*l Sw Cy» Al* Gly Ali Ali Pro Gly +7 Cys z hCG alpha
TCC CCA CAA TCC ACC CTA CAC CU AAC CCA TTC TTC TTC CAC CCC CCT CCC CCA ATA CTT CAG ICC AIS CSC KC TCC TTC TCT ASA 5CA CAT ^Cy* IłoGluCy* Thr Iw Gin Olu Am ft« Phi Phi Sw Gin friGlyAH Pro 11« UuOleCygltat GlyCy» Cy» Λ» Sw Arj Al* Tyr
CCC ACT CCA CTA AH TCC AAC AAC ACC ATC TN CTC CAA AAC AAC CTC ACI TCA CAC TCC ACT NC TCT CTA CCT AAA TCA TA7 AAC ACC CTT > Pr o Thr Pro LwArj Sw ly» Ly* Thr Mol UuV»l Gin ly» A»nV*l Thr Sw Glu Sir Thr Cy*Cy* V*l Al* ly* Sir Tyr A»nArjV»l
ACA CTA ATC CCC CCT TTC AAA CTC SAS AAC CAC JUS CCC TCC CAC NC WT ATT Wt TAI TAJ CAC AAA NT TAA «
Thr V«l Mit Gly Gly Phi ly» Vil Glu A*n Uli Thr Alt Cy« HI» Cy* Sir Thr Cy* Tyr Tyr KI * lyi S« ··· J
Fig l(a)
Konstrukt TBP(20-161)-hCGoę będący fuzją dwóch genów
BwnHf
187 400
5Υ40 późn\
__ , sekwencja ά tutona hGU
ΛΠ01
CTCOAi ATS 2Si ££*· 2 gT*AC^S»X~ Α1» Th?
inlr.<n fiGI)
ACA^TCtcr'CCtGlCS“nIAIiA<Kę’K:ACCmAe»r'»«KC/*xKCACtA»Kęt^
5ęrręT««27»s2Tęę^2IS^£8£SH232ii£2H22SźiiiI£iIS£i££2£i52iS2S225ćiiŁSći25£J£ZI5iiS2^S£53Siii;
^lettiKteTaKrCTCcctCTatTccccrttKTTrctcccgACcc tcc ces Aca tcc era etc eta cer ttt ccc era ccc tcc era ^5»l Arg Thr Sa f tac Ł»u Lau Ala PM Οί γ l.«u Lau Cya Lau —20 Asp x dojrenlego T f'ftt ccc ęoe ctt cła. oau oac *ct ecę cai mt ęrc tcc ccc cu ca aaa tss «« oz ect o* jat aat tcc jct tcc ter tcc Ηχο Trp Lau Gf n C| u Of y Sar Ala A»p fiar 7»l Cy» Pr a Clii Gly L,» Tyl Hi HI a Pr» CJn Aan Aa» Sar tle Cy» Cr» Th» aag ίκ ac asa aa. acc uc ne etc αλτ o: tcc ca xc vs ccc cag ac aci »c tsc acs ac w as >jk ccc ttc tcc ac: cy» Cyt Kia tya Gly Thr Tyr Lau Tyr Aan Aip Cy» Pic Of, ił» Cl, We Aap TM Alp Cy* Arg Cłu Cyo Cłu 6ar CU, 8«» Hi» Thi cct tes ca aac cac crc tuss esc γκ et: acc Ttc ta βλ ία ka asc &aa acc «t cc m ac sic tci tcc tsc sa atc x J Ala Sar Glu A»n Hi» Lau Arg Ula Cy» Lau Sar Cy» 8»x ly» Cy* Arg Lya Glu AW Ol, Gln Val Glu I lu Sar Sar Cya tfcr v»l Aap eto ew acc ero rei esc tcc teo λαο aas cao sze c« ar :sc r« act «λ aa: ctr ttc gis tcc jt: aaj tcc ic crc »: c:
► Arg Aap Thr V»1 Cy* Gly Cy» Ar j Lr» Aut Gl« Ty» Arg U;» Tyl Trp Sar Glu A»« Lau Hia 5»η Cył“Hw Aan Cy* Sar Lau Cy» Lau
AW W. ACC CTC cw CTC TCC TCC ΟΛ «5 AM OLG AAC ACC STi TGC MC TCC OC CCA K7 TIC 7ΓΓ CTA SSA «Α AA.' 3i ZSZ JX ^Aan Wy Thr V», KI* Lau Sar Cy» Gln Ola Ly* Gis Aan Thi V*t Cy« Thr Cya Hl« Α!» Gly Hta Rta Lau Arg Gfu A»» Glu C>* '»»1 h»L«r +7 rr„ , t,cc tcc Tit cer cer «στ car ccx ccc rx esc ccc acc jat kc ac; eto cci m esc aac ols s-te tcc ::c ctc tsz ne sec etc
Sar Cy* At» 01 y Ala Gly IV» Arg Cya Ar g Pr a I ta A*n Ala Tłu Lau Ala V»l Olu Ly« Glu Gly Cy» f»a V*l Cy» Hi Thr ’.‘ai
Ate acc acc Atc ter ęcc coc v.c xx ccc acc itc acc ccc 5is cis CA5 wo «ϊϊ cet ccc ccc crc cc: oc crc er: ?k mc tac ► ami-W Tłu Ile Cy» Al« c»y Tyi Cy» F>* Thr Uat Tłu Al j V»l Lau Gin Gly Vll lau Pra ΑΙ» Lau Pro Gln V»l V»! Cy» A»n T,>
CCC CLI CT3 zx TTC «Α5 TCC ATS CK CTC CCS «X t« «5 CM βίϊ ΚΓβ AAC ccc «e CTC CCC TAC ccc etc CCT et: AK tir oz ? Arg A»p v*l Arg Pb» Glu 3» I ta Arg Lau Ha Gły Cy« Pr» Arg Gly V*l Aan ftp Mil Val Sar Tyr Al i V»l Ala Lau Sar Cy* Cle τκ o» crc tcc ccc Atc acc ta cac tcc ks sur ccc tec e,c cne ccc τι» acc ki sac esc ccc esc tk ets cm tcc ter ► Cy» Al* Leu Cy» Ar g Ar g Sar Thi Thl A»p Cy» Gly Gly ft s Ly* Aip Hlr Pr u L»u Thr Cya Aip A«p W » Arg Phe W* A*p Sot &i tcc tca jas ccc cci ccc ccc Acc ctt cc*, ak cca tcc C2A. crc c:c caa ccc te: sac ac: ccc at: en cca caa taa
Zer !.< Ly»AI« Pr* f»a Pro. Sof Iw P, a Sar Pra Sar Arg Lau ft o Cły pra Car A»p Thl Helia L»u A a Gir. ’· gam KI
Fig. l(b).
Konstrukt TBP(2O-161)-hC<^0 będący fuzją dwóch genów
187 400
Xhal sekwencja sygnałowa hGH hGH Intren tccag ατρ 22T i£i ί ŁTJ^sysccccTXj<AATcrc::r^x^cAtHjLrcTCrr:t77CAz.':.;rL':xc.:Hl'3»j:cxcc'?-CT‘ŁCAT3c<2A<3.3C-'>>Li.;TXACCTTzx^TT~cc'>~ —cct ► «•t Ai e nr ^*2I±i£IŁi£££22Stiń££££i££i523^£SiIS£is^£SH££I^S£ŁsI25i55śł25iSłSi£iiiii£^i25x£I££IS=i£i^S£iiiiS22i32££Z£IZliZ2l·’ csc4L;ccęfęrtfcTce:g?CTcęT'n^;ęcccxcj!ę tcc ce« xc« tcc cia ctc ct« «ct ttt «ac cjj cic tpc era ΞΞ2 Σ22 ΞΞΞ ^3·* A«< TH* l*r l»«M Ł*u l*u Al· PHt «Ly 1·« l«u Cj* Ł«u łx« T*p i«u +20Asp z dojrzałego TBP1
CAA Ol· ββ£ ljf oec CAC ACT CTC TCT CCC CAA CAA AA*. TAT ATC CAC CCT CAK AAT AAT TCC ATT TCC TCT ACC AAC TCC CAC AAA
CI* Cłu «1/ 3« X Mil Aup *·* 7«X Cy« P*e Cle Cly ly· Ty* ΓΙ« Λ1» Pr* «la Am Am A·* XI* Cy» Cy* Th* Lya Cya MA* lyi Cly
ACC TAC TTC TAC KAT CAC TCT CCA CCC CCC CCC CAC CAT ACC CAC TCC ACC CAC TCT CAC ACC CCC TCC TTC ACC CCT TCA CAA AAC CAC i.w
Ihr Tyr A«u TTC Alf» A*p Cy» Pr» Cly Pr· Cly Cln K»p Tht Aap Cy» Axp «Lu CT» Clu >·* Cly a«* rb« Th* Al· »·* Clu Amx Ul*
ΛώΑ CAC TCC CTC ACC TCC TCC AAA TCC CCA AAC CAA ATC CCT CAC CTC CAC ATC TCT TCT TCC ACA CTC CAC CCC CAC ACC CTC TCT ccc CCC
Λΐ-f MA> Cy» Iau ł»r Cyt 3«· Ły· Cy· A*p Ły* Cłu M»« «Αχ «la V·! Cłu 11· a·* »·* Cy» Th* Tul Ary A*p A*P TH* V<1 Cy» «ly Cy.
«X AAC AAC CAC TAC CCC CK? TAT TCC ACT CAA AAC CTT TTC CAC TCC TTC AAT TCC ACC CTC TCC CTC AAT CCC ACC CTC CAC CTC TCC TCC
► Ax< Ly· A*a Cln Cyt A*f HA· Tyr Tsp 3«c Cle A*n Ł*u W>« Cla Cy· PH« Am Cya 1·* l<u Cy» l*u A»a Cly Thr V«1 łfla Ł*u s·* cy*
CAC CAC AAA CAC AAC ACC CTC TCC ACC TCC CAT CCA CCT TTC TTT CTA ACA CAA AAC CAC TCT CTC TCC TCT ACT AAC TCT AAC AAA ACC CTT
Cl* Clu ly» Cl* Αία Thr v*i Cyt Th* Cy» Ml* Ai* Cly Ph« Ph» t*u A*f Clu Ala Clu cya V*1 3·* Cya J«t A*a Cya Ły» ly· 3<x leu
Unk«r +7 Cys z hCG alfa
CAC TCC ACC AAO TTC TCC CTA CCC CAC ATT CAC AAT CTT AAC CTC ACT CAC CAC TCA CCC ACC ACA acc <M 9CT 9GC CCA 99T T=c c:a
t Clu Cyt Th* Ły· Ł«u Cy* l«v Pc· Cla II» Clu A»a V*1 ly· Cly Th* Clu Α·ρ a·* cly Th* Th* Al* Cly Al· Al· Pt· cl y Cy* Pt®
CAA TCC ACC CTA CAC CAA AAC CCA TTC TTC TCC CAC CCC CCT CCC CCA ATA CTT CAC TCC ATC CCC ICC TCC TTC TCT ACA CCA TAT CCC ACT
► Clu Cya TA* 14U Cln 91u A*a Ir» »h* IM ł*s 41» p*« Cly Al* Pt· 11* Ł*'» Cln Cya M·* Cly Cy· Cy* Pi*· >·* A*» Al· Tyr Pr· Th*
CCA CTA ACC TCC AAC AAC ACC ATC TTC CTC CAA AAC AAC CTC ACC TCA CAC TCC ACT TCC TCT CTA CCT AAA TCA TAT AAC ACC CTC ACA CTA
► »r· Ł«u Ar 5 itr lyt ly* TA* K«-t l*u V*1 «Ια ly· Ara V«1 Thr *·« Clu 3·« Th* CT» Cya V·! Al* ly· 3<c Tyc A* o A*p V*1 Tht V*1
ATC CC« CCT TTC AAA CTC CAC AAC CAC ACC CCC TCC CAC TCC ACT ACT TCT TAC TAT CAC AAA 7CT TAK CGATCCCTCCAC
h*c ety cly Ph· ly* ν·1 clu Xju mi* ta* ai* Cy· «X» Cy* a«s Th* cy» Tyt Tyr HA* lyt l«c ’ *' BamHl Xhol
Fig. 2(a)
Konstrukt 1^(20-190)-^0^ będący fuzją dwóch genów
187 400 sygnał dla puliadenylacji SV40E ’
BarnHt
SV40E promotor
Hlndlll Sael
TBPlSOhCGp
3' miejsce składania hcUVSA
5’ miejsce składania
Xbal
Sac!
Kpnl
Pvul
Da- TBP190hCGbeta 11043bp
SV40E intron sygnał dla połiadenyłacji
M‘kn eiicja s' gnalow a hG Π cicoc *to acz aca a >M«I All TM
EcoRl Hlndltl intron hGH ^ZTZTWCCUUTsręzcęTcASlwSBTscATBiWTTTAeTssBCWiWAJ etŁZ.iw.ti.;Łu.ii.Ł;gtcjLCTCcccTCTccTitr:cgSicac rcc caa Aca rcc cza etc ęsa a er tzz osę era c?c tac ct« ► J«r Arg thr Sir l»u liu Ln Al* PA· Slf Ł«u 1·« cyi Ua +20Asp a dojrzałego TBP1 ccc ran c-z CAA ara oac aot acc Bt kct <ts tct ccs cm ra aaa os ATT Oc cct BA «u jat zw str lec tct acc
J:« TCP Ια βία Glu Sly lic Ali lip su 7*1 Cyi 7ro cla sly Lył ryz II» KU Jr· SU Auł Am !o Hi cyi ryj Ur
JAS TCC CAC JCA CŁA ACC ZAC TTC tac UT CC TZT cb eae CCS CSC CIC aa id· BC TCC CCS bs te BS ICC CSC ZCC TTC ICC ► ly» Cyi Kir ly» Sly Thr tyr la Tyr Ali Kip Cyi 710 Cły Kra OŁy sin JUp zkx Kip Cyi Arg Cla Cyi Sin lu Gly J«r Ul TŁr
SCI TB CU AAC BX CTC ACK. ΟΣ TCC etc KK TSC ICC ΛΑΑ TCC CB KAC BA ATS GGT OS βϊβ SAS WC TCZ TCT tOC KB CTC BC
Ali Alt SLa Kia Hi* Ł«u Kry KU Cyi tii J«t cyi J*I lyi Cyi Ara ly* siu Kit 617 SU. 7*1 du TU J«r 7« Cyi Zhr 7*1 Aiy
CW BC 1K TO łfl CSC TCC ACC MC we ca TAC C« CC TAT T« AST BA AM ΤΠ TZt US TCC TTC AST ISC ACC CTC ICC CTT ► hrp Alp Thr 7*1 Cyi Sly Cy· Ary Ly· Ki* SU Tyr Arg XI» tyr Trp ł*c Siu Ara lia PAa SI* Cyi TA· Aia Cyi J*f Ua Cyi Aa
MZ ccc ACC CTC- CAC CTC TCC TCC CAO BS AM CAC AAC ACC SIC T«C ACC TM CW CB 3ST .TK TtT CA 1» Cl AAC Bi TCT GTC ► hu Sly Thr 7*1 KU »« ι·χ Cyl Gla Cla Ly» Cla lu The 7*1 Cy* Thr Cyi XU AU Sly PA· TA· La Ary SI» hm Olu Cy· 7*1
TCC KI ACT AAC TCT A*S AM ASC CM BS TCC ACO AM TM WC CZA CCC CAS ATT BS Ml CTT AAC WC ACT «1 SAC TCA SU ACC t Sa cy· ta hm Cy» ly» lyi Mr tn tli Cy» TAE ly» Ca ey· Uo fet da 11« 61» Ma VU Cy· Sly Thr «lu Aap «*1 Sly TAr
UnAar +7 Pro z sekwencji beta ab. ser β«τ ser βστ co* ces isc cscKcAieAMcccAcecToscteiseAd -as Kł sec we ccc sts tsc azc mc ctc aw >Thr All Gly Al* ely Pro Arg cyi Ib) la Hi ta JO« Bc lei Al* 7lł Sla ly» Siu Sly Cyt Pro V«1 cyi 11» lhi «»1 Am
ACC ACC ATC TCt SCC WC TAC TCC CCC ACC ATC ACC CSC TM CTC CAG CSC CTC CIG <15 «CC CM CCT CUS GTS GTG TGC AAC TAI CSC
X TAp TŁr U* cyi Al* sly Tyr cyi 719 Tir Ku thr Arg 7»1 Im «la eiy 7.1 la łzo Ki* Ira Izo «U V*1 »*1 cy» Ai» tyz hrj cat srs cw rrc as Tcc łic cos cic cct c« t« ot esc c« ars aac ccc cm cre tre tac scc cis gcz cm asc tc7 caa tct
EKip T*1 Asg TM Glu li: II· Ary Ια Μ» Sly Cy· łza Arg fly 7*1 Am Tro V*1 v*l J»r Tyr AU V*1 Al* lu s«r Cyi 4U Cy·
GB CTC TSC CW CCC AW ACC ACT WC TW SS3 W7 CCC AAC SAC CAC WS Π9 ICC ΤβΤ βΖ «C CCC CSC ITT CAI BC TCC TCT MC
Al* Ua cyi Arg Ary S«r Thr Thr Arp ęyi Sly Sly Pr» Łyi Alp KU fea 1« TAr Cyi Jup 7x» Arg Λ.· Cla Aip 7<r Sit a.z
TB MC CCC cci CCC CCC ACC CTT CCA ASC CB TCC CCA CTC CCC CCS CCC TCC CAC ACC CCC AK CTC CCA BA TAA GBTCCCTCSAG b lit Łyi Al* Pro Pło ieu 1<1 la 7r· lir >ti Sit Arg la Fce Sly 7Se lir.Aip TAr Pm Tli La pta SU -'· BwnM Md
Fig. 2(b)
Konstrukt TBP(20-190)-hCGe będący fuzją dwóch genów
187 400
Fig.3 Komórki CHO eksprymujące TBP-hCG(20-190 hamują indukowany przez TNF efekt cytotoksyczny komórek BT-20
odpowiednik TBP w ng/ml (R&D system ELISA) ran Azjd ¢0
187 400
Fig. 4 TBP-hCG(20-190) ek' 'rymów,any przez komórkę COS hamuje i ukpwaną przez TNF cytotoksyezność komórek BT-20
odpowiednik TBP w ng/ml (R&D system ELISA)
187 400
Fig;. 5 Eksprymowayy przez komórkę CHO, oczyszczone przez chromatografię powinowactwa TBP-hCG(20-161) hamuje indukowaną przez TNF cytotoksycznoś) komórek BT-20.

Claims (19)

1. Białko hybrydowe zawierające dwie współeksprymowane, sekwencje aminokwasowe tworzące dimer gdzie, każdy dimer zawiera:
a) przynajmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej receptor zbudowany z takich samych podjednostek, łańcuch aminokwasowy z receptora zbudowanego z różnych podjednostek, ligand lub fragmenty uprzednio wymienionych cząsteczek, które zachowały zdolność wiązania ligandu z receptorem i
b) podjednostkę zbudowanego z różnych podjednostek hormonu białkowego lub jej fragment który zachował zdolność podjednostki do tworzenia heterodimeru z innymi jego podjednostkami;
gdzie sekwencje (a) i (b) wiążą się ze sobą bezpośrednio lub za pośrednictwem linkera peptydowego i w których sekwencja (b) w każdej z dwóch wspomnianych współeksprymowanych sekwencji może tworzyć, przez agregację, dimer.
2. Białko hybrydowe według zastrz. 1, znamienne tym, ze wspomniana sekwencja (a) jest wybrana z grupy obejmującej TBP1, TBP2 lub ich fragmenty zawierające domenę wiązącą ligand; zewnątrzkomórkową domenę receptora IFNa/β lub receptor IFNy; receptor gonadotropiny lub jego zewnątrzkomórkowe fragmenty; lekkie łańcuchy przeciwciał lub ich fragmenty, warunkowo związane z odpowiednim łańcuchem ciężkim; ciężkie łańcuchy przeciwciał lub ich fragmenty; domeny Fab przeciwciał i IL-6, IFN-β, TPO lub ich fragmenty.
3. Białko hybrydowe według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomniana sekwencja (b) jest wybrana z grupy obejmującej podjednostki hCG, FSH, LH, TSH lub inhibinę bądź fragmenty powyższych.
4. Białko hybrydowe według zastrz. 1, znamienne tym, że sekwencja (a) jest przyłączona do aminowego końca sekwencji (b).
5. Białko hybrydowe według zastrz. 1, znamienne tym, ze sekwencja (a) jest przyłączona do karboksylowego końca sekwencji (b).
6. Białko hybrydowe według zastrz. 1, znamienne tym, ze obydwie współeksprymowane sekwencje aminokwasowe zawierają, jako sekwencję (a), sekwencję TBP1 lub jej fragmenty obejmujące aminokwasy od 20 do 161 lub od 20 do 190 i jako sekwencję (b) odpowiednio α lub β podjednostki hCG lub ich fragmenty.
7. Białko hybrydowe według zastrz. 1, znamienne tym, że obydwie współeksprymowane sekwencje aminokwasowe zawierają jako sekwencję (a) zewnątrzkomorkową domenę receptora gonadotropiny i odpowiednio podjednostki α i β gonadotropiny jako sekwencję (b).
8. Białko hybrydowe według zastrz. 7, znamienne tym, że sekwencja (a) jest zewnątrzkomórkową domeną receptora FSH, a sekwencja (b) podjednostką FSH.
9. Białko hybrydowe według zastrz. 7, znamienne tym, że sekwencje (a) i (b) są połączone ze sobą linkerem peptydowym łączącym sekwencje (a) i (b) wiązaniem peptydowym.
10. Białko hybrydowe według zastrz. 9, znamienne tym, że linker peptydowy ma miejsce cięcia przez enzym proteolityczny.
11. Białko peptydowe według zastrz. 10, znamienne tym, że miejsce cięcia przez enzym jest miejscem cięcia przez trombinę.
12. Białko hybrydowe według zastrz. 10, znamienne tym, ze miejsce cięcia jest rozpoznawane i cięte przez enzym występujący w jajnikach.
13. Białko hybrydowe według, zastrz. 9, znamienne tym, ze linker peptydowy jest miej scem j ego zginania.
14. Białko hybrydowe według zastrz. 1, znamienne tym, ze zawiera co najmniej jedno wiązanie kowalencyjne tworzone pomiędzy aminokwasami dwóch podjednostek (b) będących podjednostką a hCG lub β hCG, lub ich fragmentami.
187 400
15. Cząsteczka DNA będąca sekwencją kodująca białko hybrydowe zawierające dwie współeksprymowane, sekwencje aminokwasowe tworzące dimer, gdzie każdy dimer zawiera:
a) przynajmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej receptor zbudowany z takich samych podjednostek, łańcuch aminokwasowy z receptora zbudowanego z różnych podjednostek, ligand lub fragmenty uprzednio wymienionych cząsteczek, które zachowały zdolność wiązania ligandu z receptorem i
b) podjednostkę zbudowanego z różnych podjednostek hormonu białkowego lub jej fragment który zachował zdolność podjednostki do tworzenia heterodimeru z innymi jego podjednostkami, gdzie sekwencje (a) i (b) wiązą się ze sobą bezpośrednio lub za pośrednictwem linkera peptydowego i w których sekwencja (b) w każdej z dwóch wspomnianych współeksprymowanych sekwencji może tworzyć, przez agregację dimer.
16. Wektor niosący cząsteczkę DNA będącą sekwencją kodującą białko hybrydowe zawierające dwie współeksprymowane, sekwencje aminokwasowe tworzące dimer, gdzie każdy dimer zawiera:
a) przynajmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej receptor zbudowany z takich samych podjednostek, łańcuch aminokwasowy z receptora zbudowanego z różnych podjednostek, ligand lub fragmenty uprzednio wymienionych cząsteczek, które zachowały zdolność wiązania ligandu z receptorem i
b) podjednostkę zbudowanego z różnych podjednostek hormonu białkowego lub jej fragment który zachował zdolność podjednostki do tworzenia heterodimeru z innymi jego podjednostkami, gdzie sekwencje (a) i (b) wiążą się ze sobą bezpośrednio lub za pośrednictwem linkera peptydowego i w których sekwencja (b) w każdej z dwóch wspomnianych współeksprymowanych sekwencji może tworzyć przez agregację dimer, dla ekspresji w komórce gospodarza eukariotycznego.
17. Komórki gospodarza eukariotycznego niosące wektor niosący cząsteczkę DNA będącą sekwencją kodującą białko hybrydowe zawierające dwie współeksprymowane, sekwencje aminokwasowe tworzące dimer, gdzie każdy dimer zawiera:
a) przynajmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej receptor zbudowany z takich samych podjednostek, łańcuch ammokwasowy z receptora zbudowanego z różnych podjednostek, ligand lub fragmenty uprzednio wymienionych cząsteczek, które zachowały zdolność wiązania ligandu z receptorem i
b) podjednostkę zbudowanego z różnych podjednostek hormonu białkowego lub jej fragment który zachował zdolność podjednostki do tworzenia heterodimeru z innymi jego podjednostkami, gdzie sekwencje (a) i (b) wiążą się ze sobą bezpośrednio lub za pośrednictwem linkera peptydowego i w których sekwencja (b) w każdej z dwóch wspomnianych współeksprymowanych sekwencji może tworzyć przez agregację dimer dla ekspresji w komórce gospodarza eukariotycznego, zdolne do wyrażania tego białka hybrydowego.
18. Sposób wytwarzania białka hybrydowego obejmujący typowe hodowanie komórek gospodarza eukariotycznego niosącego wektor niosący cząsteczkę DNA będąca sekwencją kodująca białko hybrydowe zawierające dwie współeksprymowane, sekwencje aminokwasowe tworzące dimer, gdzie każdy dimer zawiera:
a) przynajmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej receptor zbudowany z takich samych podjednostek, łańcuch aminokwasowy z receptora zbudowanego z różnych podjednostek, ligand lub fragmenty uprzednio wymienionych cząsteczek, które zachowały zdolność wiązania ligandu z receptorem i
b) podjednostkę zbudowanego z różnych podjednostek hormonu białkowego lub jej fragment który zachował zdolność podjednostki do tworzenia heterodimeru z innymi jego podjednostkami, gdzie sekwencje (a) i (b) wiążą się ze sobą bezpośrednio lub za pośrednictwem linkera peptydowego i w których sekwencja (b) w każdej z dwóch wspomnianych współeksprymowa4
187 400 nych sekwencji może tworzyć, przez agregację dimer, i odzyskiwania wytworzonego w nich białka hybrydowego.
19. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik znamienna tym, że zawiera białko hybrydowe zawierające dwie współeksprymowane, sekwencje aminokwasowe tworzące dimer, gdzie każdy dimer zawiera:
a) przynajmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej receptor zbudowany z takich samych podjednostek, łańcuch aminokwasowy z receptora zbudowanego z różnych podjednostek, ligand lub fragmenty uprzednio wymienionych cząsteczek, które zachowały zdolność wiązania ligandu z receptorem i
b) podjednostkę zbudowanego z różnych podjednostek hormonu białkowego lub jej fragment który zachował zdolność podjednostki do tworzenia heterodimeru z innymi jego podjednostkami, gdzie sekwencje (a) i (b) wiązą się ze sobą bezpośrednio lub za pośrednictwem linkera peptydowego i w których sekwencja (b) w każdej z dwóch wspomnianych współeksprymowanych sekwencji może tworzyć, przez agregację dimer.
PL97328454A 1996-02-20 1997-02-20 Białka hybrydowe tworzące heterodimery PL187400B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1193696P 1996-02-20 1996-02-20
PCT/US1997/002315 WO1997030161A1 (en) 1996-02-20 1997-02-20 Hybrid proteins which form heterodimers

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL328454A1 PL328454A1 (en) 1999-02-01
PL187400B1 true PL187400B1 (pl) 2004-06-30

Family

ID=21752599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97328454A PL187400B1 (pl) 1996-02-20 1997-02-20 Białka hybrydowe tworzące heterodimery

Country Status (25)

Country Link
US (5) US6193972B1 (pl)
EP (1) EP0894141B1 (pl)
JP (2) JP4140927B2 (pl)
KR (1) KR100369985B1 (pl)
CN (1) CN1261579C (pl)
AT (1) ATE295887T1 (pl)
AU (1) AU706504B2 (pl)
BG (1) BG64510B1 (pl)
BR (1) BR9707589A (pl)
CA (1) CA2245877C (pl)
CZ (1) CZ291212B6 (pl)
DE (1) DE69733309T2 (pl)
DK (1) DK0894141T3 (pl)
EA (1) EA002474B1 (pl)
EE (1) EE04025B1 (pl)
ES (1) ES2241040T3 (pl)
HU (1) HUP9900619A3 (pl)
IL (1) IL125864A (pl)
NO (1) NO321777B1 (pl)
NZ (1) NZ331539A (pl)
PL (1) PL187400B1 (pl)
PT (1) PT894141E (pl)
SK (1) SK282326B6 (pl)
UA (1) UA52646C2 (pl)
WO (1) WO1997030161A1 (pl)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUP9900619A3 (en) * 1996-02-20 2001-11-28 Applied Research Systems Hybrid proteins which form heterodimers
US6635740B1 (en) * 1997-03-27 2003-10-21 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Ligand/lytic peptide compositions and methods of use
CA2301846A1 (en) 1997-09-04 1999-03-11 Gryphon Sciences Modular protein libraries and methods of preparation
EA006605B1 (ru) * 2000-02-22 2006-02-24 Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО чХГ
US20030228600A1 (en) * 2000-07-14 2003-12-11 Eppendorf 5 Prime, Inc. DNA isolation method and kit
IL147414A0 (en) * 2001-12-31 2002-08-14 Yeda Res & Dev Ifnar2 mutants, their production and use
US20030157091A1 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 Dyax Corporation Multi-functional proteins
DE10247755B4 (de) * 2002-10-14 2006-01-19 Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine
BRPI0507174A (pt) * 2004-01-28 2008-04-01 Syntonix Pharmaceuticals Inc proteìnas de fusão hormÈnio-fc (fsh-fc) heterodiméricas estimuladoras de folìculo para o tratamento da infertilidade
WO2006067210A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Laboratoires Serono S.A. Bcma polypeptides and uses thereof
US7691611B2 (en) 2005-06-03 2010-04-06 Ares Trading S.A. Production of recombinant IL-18 binding protein
EP2200634B1 (en) * 2007-09-21 2015-02-11 The Regents of The University of California Targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
CN101960014B (zh) * 2008-02-01 2013-10-16 克罗莫塞尔公司 细胞系以及制备和使用其的方法
CN102002495B (zh) * 2009-08-31 2012-07-18 成都蓉生药业有限责任公司 用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达框、表达载体及制备方法
CN107840894A (zh) * 2011-03-25 2018-03-27 格兰马克药品股份有限公司 异二聚体免疫球蛋白
CA2901226C (en) 2013-02-18 2020-11-17 Vegenics Pty Limited Vascular endothelial growth factor binding proteins
JP7439372B2 (ja) * 2018-06-21 2024-02-28 シャタック ラボ，インコーポレイテッド ヘテロ二量体タンパク質及びその使用
KR20220012256A (ko) * 2019-05-24 2022-02-03 프로비바 테라퓨틱스 (홍콩) 리미티드 Il-2 조성물 및 이의 사용 방법

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0325224B1 (en) * 1988-01-22 1996-07-31 ZymoGenetics, Inc. Methods of producing secreted receptor analogs
US6225449B1 (en) * 1991-10-04 2001-05-01 Washington University Hormone analogs with multiple CTP extensions
US5705478A (en) * 1989-02-21 1998-01-06 Washington University Covalently linked β subunits of the glycoprotein hormones as antagonists
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
IL99120A0 (en) * 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5932448A (en) * 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
NZ251820A (en) 1992-03-30 1996-07-26 Immunex Corp Fusion proteins with tnf-r (tumour necrosis factor-receptor) peptide linked to another tnf-r or an il-1r (interleukin-1-receptor) peptide
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
IL111125A0 (en) * 1994-05-11 1994-12-29 Yeda Res & Dev Soluble oligomeric tnf/ngf super family ligand receptors and their use
HUP9900619A3 (en) * 1996-02-20 2001-11-28 Applied Research Systems Hybrid proteins which form heterodimers
US6194177B1 (en) * 1996-02-20 2001-02-27 Applied Research Systems Ars Holding N.V. DNA encoding a hybrid heterodimeric protein

Also Published As

Publication number Publication date
US6663867B2 (en) 2003-12-16
HUP9900619A2 (hu) 1999-06-28
EP0894141B1 (en) 2005-05-18
US20100075402A1 (en) 2010-03-25
NZ331539A (en) 2000-01-28
DK0894141T3 (da) 2005-08-22
WO1997030161A1 (en) 1997-08-21
BR9707589A (pt) 2000-01-04
SK114898A3 (en) 1999-07-12
JP4140927B2 (ja) 2008-08-27
EE9800256A (et) 1999-02-15
KR100369985B1 (ko) 2004-03-26
BG64510B1 (bg) 2005-05-31
DE69733309D1 (de) 2005-06-23
EE04025B1 (et) 2003-04-15
SK282326B6 (sk) 2002-01-07
JP2000504586A (ja) 2000-04-18
KR19990082482A (ko) 1999-11-25
DE69733309T2 (de) 2006-01-19
PL328454A1 (en) 1999-02-01
JP2008019258A (ja) 2008-01-31
CA2245877A1 (en) 1997-08-21
ATE295887T1 (de) 2005-06-15
IL125864A (en) 2007-07-04
HUP9900619A3 (en) 2001-11-28
CZ291212B6 (cs) 2003-01-15
US20090240039A1 (en) 2009-09-24
US7291339B2 (en) 2007-11-06
AU2125297A (en) 1997-09-02
PT894141E (pt) 2005-09-30
AU706504B2 (en) 1999-06-17
EA199800744A1 (ru) 1999-02-25
US20040230034A1 (en) 2004-11-18
NO983799L (no) 1998-10-19
NO321777B1 (no) 2006-07-03
CN1212017A (zh) 1999-03-24
ES2241040T3 (es) 2005-10-16
US6193972B1 (en) 2001-02-27
EA002474B1 (ru) 2002-06-27
US20010014333A1 (en) 2001-08-16
CN1261579C (zh) 2006-06-28
UA52646C2 (uk) 2003-01-15
CZ264498A3 (cs) 1998-12-16
EP0894141A1 (en) 1999-02-03
IL125864A0 (en) 1999-04-11
NO983799D0 (no) 1998-08-19
CA2245877C (en) 2013-09-03
BG102705A (en) 1999-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL187400B1 (pl) Białka hybrydowe tworzące heterodimery
JP3520272B2 (ja) リンパ球機能関連抗原３のｃｄ２結合ドメイン
JP2865300B2 (ja) ヒトｂ細胞刺激因子２レセプター蛋白質
JP4426315B2 (ja) Ｏｘ４０ｒ結合剤
AU736707B2 (en) Trimerising module
TWI250988B (en) Thrombopoietic compounds
TW565570B (en) Human IL-13 receptor beta
US6194177B1 (en) DNA encoding a hybrid heterodimeric protein
WO1996011955A1 (en) Antigen-binding fusion proteins
EP1375515A2 (en) Polypeptide, cDNA encoding the same, and use thereof
EP2516458A1 (en) Tetravalent cd47-antibody constant region fusion protein for use in therapy
JP2000516470A (ja) 可溶性一価および多価ｍｈｃクラスｉｉ融合タンパク質およびそれらの使用
JPH11510062A (ja) 多機能性造血受容体アゴニスト
EP1541689B1 (en) Hybrid proteins which form heterodimers
EP1022336A1 (en) POLYPEPTIDE, cDNA ENCODING THE SAME, AND USE OF THEM
IL183048A (en) Trail polypeptide receptor and DNA encoded by it

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20090220