SK282326B6 - Hybridný proteín tvoriaci heterodimér, molekula DNA, expresný vektor, hostiteľská bunka, spôsob produkcie hybridného proteínu a farmaceutická zmes - Google Patents

Hybridný proteín tvoriaci heterodimér, molekula DNA, expresný vektor, hostiteľská bunka, spôsob produkcie hybridného proteínu a farmaceutická zmes Download PDF

Info

Publication number
SK282326B6
SK282326B6 SK1148-98A SK114898A SK282326B6 SK 282326 B6 SK282326 B6 SK 282326B6 SK 114898 A SK114898 A SK 114898A SK 282326 B6 SK282326 B6 SK 282326B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
cys
hybrid protein
leu
ser
thr
Prior art date
Application number
SK1148-98A
Other languages
English (en)
Other versions
SK114898A3 (en
Inventor
Robert K. Cambell
Bradford A. Jameson
Scott C. Chappel
Original Assignee
Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Research Systems Ars Holding N. V. filed Critical Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Publication of SK114898A3 publication Critical patent/SK114898A3/sk
Publication of SK282326B6 publication Critical patent/SK282326B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C209/00—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C209/04—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by substitution of functional groups by amino groups
    • C07C209/22—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by substitution of functional groups by amino groups by substitution of other functional groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Hybridný proteín zložený z dvoch koexprimovaných aminokyselinových sekvencií tvoriacich dimér, z ktorých každá obsahuje (a) aspoň jednu aminokyselinovú sekvenciu z nasledujúcich: homomérny receptor, reťazec heteromérneho receptora, ligand alebo ich fragmenty, ktoré si zachovali schopnosť väzby ligand-receptor a (b) subjednotku heterodimérneho proteínového hormónu alebo jeho fragmentu, ktorý si zachováva schopnosť formovať heterodimér s rovnakou podjednotkou, kde sekvencia (a) a (b) sú naviazané priamo alebo cez peptidový linker, a kde sekvencia (b) v každej z menovaných koexprimovaných sekvencií je schopná agregácie za vzniku dimérneho komplexu. Ďalej je opísaná molekula DNA, ktorá kóduje hybridný proteín, expresný vektor, ktorý obsahuje molekulu DNA, hostiteľská bunka, ktorá obsahuje expresný vektor, spôsob produkcie hybridného proteínu a farmaceutická zmes, ktorá obsahuje hybridný proteín a farmaceuticky prijateľný nosič a/alebo vehikulum.ŕ

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka hybridného proteínu obsahujúceho dve komprimované aminokyselinové sekvencie tvoriace dimér, molekuly DNK, ktorá kóduje hybridný proteín, expresného vektora, ktorý obsahuje molekulu DNA, hostiteľskej bunky, ktorá obsahuje expresný vektor, spôsobu produkcie hybridného proteínu a farmaceutickej zmesi.
Doterajší stav techniky
Interakcia proteín - proteín je potrebná pre normálne fyziologické funkcie buniek i viacbunkových organizmov. Celý rad proteínov začne mať nové alebo optimálne funkcie až po vytvorení komplexu s jedným alebo viacerými reťazcami proteínov. Je to ilustrované množstvom kombinácií ligand - receptor, ktoré napomáhajú k regulácii bunkovej aktivity. Niektoré ligandy, ako je Tumor necrosis factor α (TNFa), TNFfi alebo ľudský choriový gonadotropín (hCG), pôsobia ako komplexy niekoľkých podjednotiek. Niektoré z týchto komplexov obsahujú niekoľko kópií rovnakej podjednotky. TNFa TNFfi (ďalej označované spoločne ako TNF) sú homotriméry tvorené tromi rovnakými podjednotkami (1-4). Ostatné ligandy sú zložené z rôznych jednotiek. Napríklad hCG je heterodimér (5-7) . Ako niekoľkoreťazové komplexy môžu tiež pôsobiť alebo fungovať ako receptory. Napríklad receptor TNF prenáša signál až potom, ako je agregovaný do heterodiméru (8-9). Agregáciu dvoch alebo troch reťazcov receptora spôsobujú ligandy týchto receptorov, čím spúšťajú mechanizmus aktivácie receptora. Napríklad TNF mediovaná agregácia aktivuje TNF receptor (10-12).
Modulácia interakciou proteín - proteín sa zdá byť použiteľným mechanizmom terapeutického zásahu v prípade mnohých chorôb a patologických stavov. Rozpustné väzobné proteíny, ktoré sú schopné interagovať s ligandmi, môžu potencionálne izolovať ligand od receptora, čím znížia mieru aktivácie tejto konkrétnej receptorovej cesty. Alternatívne je možné izoláciou Ugandu predĺžiť jeho elimináciu alebo degradáciu, a tým predĺžiť jeho pobyt, prípadne zosilniť účinok a tým asi aj špecifickú aktivitu in vivo. V prípade TNF, rozpustné TNF receptory, sú primáme asociované s inhibíciou aktivity TNF (13-17).
Rozpustné väzobné proteíny môžu byť použiteľné na liečenie ľudských chorôb. Napríklad rozpustné TNF receptory sa ukázali ako účinné pre liečenie na zvieracom modeli artritídy (18, 19). Keďže TNF má tri väzobné miesta pre svoj receptor (10-12) a dimerizácia povrchového bunkového receptora je zodpovedná za jeho bioaktivitu (8, 9), je možné, že väzba jednej molekuly rozpustného receptora TNF poskytuje možnosť, že tento 1 : 3 komplex rozpustný receptor : TNF (trimér) je schopný sa stále viazať a aktivovať dvojicu bunkových povrchových TNF receptorov. Zdá sa, že k dosiahnutiu inhibičného efektu je potrebné obsadiť či blokovať dve z troch väzobných miest pre receptor na triméri TNF pomocou rozpustného väzobného proteínu. Je tiež možné pomocou väzobného proteínu blokovať správnu orientáciu TNF na povrchu bunky. Je treba syntetizovať proteíny, obsahujúce dva reťazce receptora (alebo ligand), ako dimémy hybridný proteín. Pozri Wallach a spol. U. S. patent 5,487,925.
Prvotná stratégia vyvinutá pre generovanie dimémych alebo multimémych hybridných proteínov, obsahujúcich väzobné domény z extracelulámych receptorov, bola zalo žená na fúzii týchto proteínov s konštantnými oblasťami ťažkého reťazca protilátok.
Táto stratégia viedla napríklad ku konštrukcii CD4 imunoadhezínov (20). Tieto hybridné molekuly sa skladajú z prvých dvoch (alebo všetkých štyroch) imunoglobulín-like domén CD4 naviazaných na konštantnú oblasť ľahkého i ťažkého reťazca protilátky. Takáto stratégia výroby hybridných molekúl bola adaptovaná na receptory pre TNF (10, 16, 21) a viedla k vzniku látky s vyššou in vitro aktivitou ako majú rozpustné väzobné proteíny.
Býva pravidlom, že vyššia in vitro účinnosť dimémeho fúzneho proteínu znamená aj vyššiu in vivo aktivitu. Štúdia, potvrdzujúca tento predpoklad, ukazuje aspoň 50-krát vyššiu účinnosť p75(TBP2)-Ig fúzneho proteínu v ochrane myší pred následnou intravenóznou injekciou LPS(16).
Napriek širokému využitiu imunoglobulínových fúznych proteínov, má táto metodika niekoľko nevýhod. Jednou z nich je prítomnosť Fc domén na molekule imunoglobulínu, lebo tie sa zúčastňujú mnohých efektorových mechanizmov imunitnej reakcie. Tieto ich funkcie sa potom môžu stať v príslušnom terapeutickom procese nežiaduce (22).
Ďalšia limitácia patrí do skupiny špeciálnych prípadov, keď je potrebné produkovať heteroméme fúzne proteíny, napríklad rozpustné analógy heteromémeho IL-6 alebo interferónového receptora typu 1.1 keď existuje veľa metód produkcie bifúnkčných protilátok (napríklad pomocou kontransfekcie alebo fúzie hybridómov) efektivita syntézy je značne znížená produkciou zmesi homodimérov a heterodimérov, ktorá takto vzniká (23). Tiež bolo zverejnených niekoľko prác opisujúcich použitie motívu leucínoveho zipu, ktorý umožňuje zostavenie heterodimérov (24-26). Zdá sa to byť sľubnou možnosťou na účely výskumu, ale vytvorené neprirodzené alebo intraceluláme sekvencie nie sú vhodné v klinickej praxi pre chronické aplikácie, vďaka svojej antigenicite. Limitujúca je aj účinnosť zostavovania a stabilita molekuly po zostavení.
Na druhej strane, v prípade TNF receptorov, niektoré modifikácie v p55 TNF receptora, ako sa zdá, umožňujú homodimerizáciu a signalizáciu v neprítomnosti ligandu (27, 28). Bolo zistené, že cytoplazmatická časť receptora, nazývaná „doména smrti“, môže slúžiť ako homodimerizačný motív (28, 30). Ako alternatíva k imunoglobulínovému hybridnému proteínu, fúzia extracelulámej domény TNF receptora s jeho cytoplazmatickou doménou smrti, by mohla pravdepodobne viesť k sekrečnému proteínu, ktorý môže dimerizovať v neprítomnosti TNF. Tieto fúzne proteíny sú zahrnuté a nárokované v Intemational Application WO 95/31544.
Tretím spôsobom výroby rozpustných TNF receptorov je chemické naviazanie monomémych proteínov pomocou polyefylénglykoiu (31).
Podstata vynálezu
Alternatívou k takto získaným dimémym proteínom, majúcim niektoré dôležité výhody, je navrhovaný vynález a predstavuje použitie prirodzených heterodimémych štruktúr zodpovedajúcich cirkulujúcim proteínom neimunoglobulínového charakteru, s dlhým polčasom životnosti. Výhodným príkladom je hCG, dobre sekretovaný proteín s dostatočnou stabilitou a s dlhým polčasom životnosť (32-33). Vďaka hlavnej úlohe hCG, ako znaku gravidity, bolo vyvinutých mnoho reagencií pre jeho kvantitatívne i kvalitatívne testovanie in vitro a aj in vivo. Navyše, hCG bolo intenzívne študované pomocou mutagenézy, a vie sa, že malé delécie v proteíne, ako je odstránenie piatich zvyš kov na karboxy konci a subjednotky, môže efektívne eliminovať jeho biologickú aktivitu a pritom nenaruší jeho schopnosť tvoriť heterodiméry (34-35). Malé inzercie, až do 30 aminokyselín, sú na amino- i karboxy konci a subjednotky tolerované (36), zatiaľ čo fúzia a subjednotky s karboxy koncom β subjednotky má malý efekt na formovanie heterodiméru (37). Tiež bol opísaný analóg hCG, kde bola imunoglobulínová Fc doména fuzovaná s C-koncom β subjednotky hCG, ale tento produkt nie je sekretovaný a nebolo vynaložené žiadne úsilie kombinovať ho s a subjednotkou (38).
Hlavným predmetom navrhovaného vynálezu je hybridný proteín, obsahujúci dve koexprimované aminokyselinové sekvencie tvoriace dimér, z nich každá obsahuje:
a) aspoň jednu aminokyselinovú sekvenciu z nasledujúcich: homomémy receptor, reťazec heteromemého receptora, ligand a alebo ich fragmenty a
b) podjednotku heterodimémeho proteínového hormónu, alebo jeho fragmentu, kde (a) a (b) sú naviazané priamo alebo pomocou peptidového linkera a v každom páre sú dve (b) rozdielne podjednotky schopné agregovať do formy dimémeho komplexu.
Podľa navrhovaného vynálezu môže byť linker enzymaticky štiepiteľný.
Sekvencia (a) je vybraná z týchto variantov: extraceluláma doména TNF receptora 1 (55 kDa, nazývaná tiež TBP1), extraceluláma doména TNF receptora 2 (75 kDa, nazývaná tiež TBP2), ich fragmenty však stále obsahujú väzobnú doménu pre ligand, extraceluláma doména IL-6 receptorov (tiež nazývaná gp80 a gpl30), extraceluláma doména IFN α/β receptora alebo receptora pre IFNy, receptor pre gonadotropín alebo jeho extracelulámc fragmenty, ľahké reťazce protilátok, ich fragmenty možné i v asociácii so zodpovedajúcimi ťažkými reťazcami, ťažké reťazce protilátok, ich fragmenty možné i v asociácii so zodpovedajúcimi ľahkými reťazcami, Fab domény protilátok, proteíny s charakterom ligandu ako sú cytokiny, rastové faktory alebo hormóny iné ako gonadotropíny, konkrétnymi príkladmi môžu byť IL-6, IFN-β, TPO alebo ich fragmenty.
Sekvencia (b) je vo výhodnom variante vybraná z hCG, FSH, LH, TSH, inhibičná subjednotka alebo ich fragmenty.
Pre inaktiváciu hybridných proteínov je možné použiť modifikácie, ako je chemické alebo proteolytické štiepenie proteínovej kostry alebo chemická či enzymatická modifikácia niektorých aminokyselinových bočných reťazcov. Toto obmedzenie aktivity môže byť tiež uskutočnené prostredníctvom techník rekombinantnej DNK zmenou kódujúcej sekvencie hybridného proteínu takým spôsobom, aby bola zrušená aktivita komponentov alebo tak, aby vznikol proteín, ktorý bude neskôr ľahšie prístupný chemickej alebo enzymatickej modifikácii.
Uvedené hybridné proteíny budú monofunkčné, bifúnkčné alebo multifúnkčné molekuly, v závislosti od aminokyselinovej sekvencie (a), ktorá je kombinovaná s (b). V každej dvojici (a) môže byť pripojené buď na amino, alebo karboxy koniec (b), alebo oboje.
Monoklonálne hybridné proteíny podľa navrhovaného vynálezu môžu obsahovať napríklad extracelulámu doménu receptora pre gonadotropín pripojenú na jednu zo zodpovedajúcich subjednotiek gonadotropínu viažucej receptor. Podľa jedného konkrétneho variantu, hybridný proteín navrhovaný vynálezom, môže byť molekula, v ktorej je napríklad extraceluláma doména FSH receptora pripojená na FSH tak, aby zvýšila polčas životnosti v plazme a zosilnila biologickú aktivitu.
Tento variant môže byť použitý k indukcii folikulámej maturácie v rámci riadených reprodukčných metód, ako je indukcia ovulácie alebo oplodnenia in vitro a/alebo ako spôsob dramatického zosilnenia biologickej aktivity hormónov potrebných pre úspech tohto procesu tým, že redukuje požiadavky nielen na samotné hormóny, ale aj na počet injekcií vyvolávajúcich ovuláciu.
Receptor pre FSH a produkcia extracelulámej domény ľudského FSH receptora sú opísané vo WO 92/16620 a WO 96/38575.
Podľa konkrétneho variantu vynálezu, extraceluláma doména FSH receptora (ECD) môže byť fuzovaná s peptidovým linkerom, ktorý obsahuje rozlišovacie/štiepiace miesto pre trombín (29) a predstavuje „zakotvenú“ pažu. Peptidový linker pripája extracelulámu doménu FSH a FSH podjednotku. Umožní to odstránenie extracelulámej domény FSH receptora štiepením v mieste pre trombín vo chvíli, keď príde molekula do styku s trombínom, počas cirkulácie v systéme.
Podľa iného variantu, namiesto štiepiaceho miesta pre trombín, je použité štiepiace miesto pre enzým, vyskytujúci sa v najväčšom množstve vo vaječníku. Týmto spôsobom sa dosiahne, že cirkulujúca molekula ECD-FSH bola vystavená pôsobeniu enzýmu vo chvíli, keď vstupuje do vaječníka, kde sa nachádza enzým v najväčšej koncentrácii, čím je ECD odštiepené a FSH môže interagovať okamžite s membránovým receptorom.
V inom variante vynálezu, namiesto miesta rozlišovaného enzýmom, je medzi ECD a FSH vklonovaná flexibilná pántová oblasť tak, aby ECD nemohol byť enzymaticky odštiepený od hormónu. Takto po vstupe molekuly ECD-FSH do vaječníka nastane kompetícia ECD naviazaného pántovou oblasťou a ECD receptora pre FSH nachádzajúceho sa na membráne bunky.
V ďalšej výhodnej oblasti variantu vynálezu je hybridný proteín zložený z agregátu páru aminokyselinových sekvencii, z ktorých jedna obsahuje TBP1 (alebo fragmenty od aminokyseliny 20 do aminokyseliny 161 alebo do aminokyseliny 190) ako (a) a a podjednotku hCG ako (b), alebo ďalšie, ktoré obsahujú vždy TBP1 (alebo tie isté fragmenty, ktoré sú uvedené) ako (a) a β podjednotku hCG alebo jej fragmenty ako (b). Podľa tohto variantu je (b) zvolené v závislosti od presnej sekvencie (celá β podjednotka hCG alebo jej fragmenty či modifikácie) a výsledný hybridný proteín bude mať len jednu aktivitu (len ako TBP1) alebo kombináciu aktivít (TBP1 zároveň s hCG). Hybridný proteín opísaný v poslednom prípade môže byť použitý, napríklad v kombinovanej terapii Kaposiho sarkóme a metabolickej strate pri AIDS.
V ďalšom variante vynálezu je medzi dve podjednotky (a) a (b) vložená jedna alebo viac kovalentných väzieb, aby sa zvýšila stabilita výsledného hybridného proteínu. Môže to byť uskutočnené napríklad pridaním jednej alebo viaceiých neprirodzených medzireťazcových disulfidických väzieb. Vhodné miesta pre toto spojenie môžu byť vyvodené zo známej štruktúry heterodimémych hormónov. Napríklad, vhodné miesto v hCG na umiestnenie cysteínového zvyšku do a podjednotky v mieste Lys45 a do β podjednotky v mieste Glu21, čím je vodíkový mostík (nekovalentná väzba) nahradený disulfidickou väzbou (kovalentná väzba). Ďalším predmetom navrhovaného vynálezu sú PEGylované alebo ináč chemicky modifikované formy hybridných proteínov.
Navrhovaný vynález obsahuje tiež DNK molekulu obsahujúcu DNK sekvencie kódujúce uvedené hybridné proteíny, tak ako nukleotidové sekvencie, v zásade rovnako. „Nukleotidové sekvencie v zásade rovnaké“ obsahujú všet ky ostatné nukleotidové sekvencie, ktoré vďaka degenerácii genetického kódu kódujú rovnaké aminokyselinové sekvencie.
Pre produkciu hybridných proteínov podľa navrhovaného vynálezu je DNK sekvencia (a) získaná z existujúcich klonov, rovnako ako (b). DNK sekvencia kódujúcou požadovanú sekvenciu (a) je ligovaná s DNK sekvenciou kódujúca požadovanú sekvenciu (b). Dva z týchto fúznych produktov sú inzertované a ligované do vhodného plazmidu alebo každý samostatne do odlišného plazmidu. Keď je vytvorený, je expresný vektor alebo dva expresné vektory zavedené do vhodnej hostiteľskej bunky, ktorá potom exprimuje vektory a umožňuje tým vznik hybridných proteínov, podľa vynálezu, ako už bolo opísané. Výhodnou metódou na prípravu hybridov podľa vynálezu je PCR technológia, s použitím oligonukleotidov špecifických pre požadované sekvencie tak, aby boli okopírované z klónov kódujúcich sekvencie (a) a (b).
Expresia ľubovoľných rekombinantných proteínov podľa vynálezu sa môže uskutočňovať v eukaryotických bunkách (napríklad kvasinky, hmyzie alebo cicavčie bunky), alebo v prokaryotických bunkách použitím zodpovedajúcich expresných vektorov. Na tento účel môže byť použitá ľubovoľná metóda používaná v praxi.
Napríklad, DNK molekuly kódujúce proteíny získané ľubovoľnou uvedenou metódou sú inzertované do vhodne konštruovaných expresných vektorov pomocou techniky v praxi bežne používanej (pozri Sambrook a spol., 1989). Dvojreťazcové cDNK sú napojené do plazmidového vektora homopolymémym napojením alebo reštrikčným zavedením obsahujúcim použitie syntetických DNK linkerov alebo ligačnou technikou tupých koncov: na ligáciu DNK je použitá DNK ligáza a nežiaduce napojenia sú blokované pomocou ošetrenia alkalickou fosfatázou.
Aby bol expresný vektor schopný exprimovať požadovaný proteín, musí tiež obsahovať špecifické nukleotidové sekvencie obsahujúce transkripčné a translačné regulačné informácie vzťahujúce sa k DNK kódujúcej požadovaný proteín, ktoré umožnia expresiu génu a produkciu proteínu. Ako prvý z nich musí predchádzať gén sekvencie promótora umožňujúci transkripciu génu, ktorá je rozlišovaná RNK polymerázou, na ktorú sa polymeráza viaže, a tým iniciuje transkripčný proces. Existuje veľa bežne používaných promótorov, ktoré pracujú s rôznou účinnosťou (silné a slabé promótory).
Pre eukaryotické hostiteľské bunky sa musia použiť transkripčné a translačné regulačné sekvencie, v závislosti od povahy hostiteľskej bunky. Môžu byť odvodené od vírusových sekvencii, ako je adenovírus, hovädzí papiloma vírus, Simian vírus a podobne, kde regulačný signál je asociovaný s konkrétnym génom s vysokou mierou expresie. Príkladom môže byť TK promótor Herpes vírusu, SV40 skorý promótor, kvasinkový gal4 génový promótor atď.
Transkripčné iniciačné regulačné signály môžu byť vybrané z tých, ktoré umožňujú represiu a aktiváciu tak, aby mohla byť modulovaná expresia génu. DNK molekula obsahujúca nukleotidové sekvencie kódujúce hybridný proteín podľa navrhovaného vynálezu je inzertovaná do vektora (ov) s vhodne umiestnenými transkripčnými a translačnými regulačnými signálmi, ktoré sú schopné integrovať požadovanú génovú sekvenciu do hostiteľskej bunky. Bunky stabilne transformované zavedenou DNK môžu byť selektované zavedením jedného alebo viacerých markérov umožňujúcich selekciu hostiteľských buniek obsahujúcich expresný vektor. Markéry môžu byť fototrofné na auxotropných hostiteľov, biocidnú rezistenciu, napríklad antibiotiká alebo ťažké kovy, ako je meď a podobne. Selekčný markér gén môže byť napojený priamo na exprimovanú DNK sekvenciu alebo môže byť zavedený do bunky kotransfekciou. Pre optimálnu syntézu proteínov podľa navrhovaného vynálezu môžu byť aj ďalšie zložky.
Dôležité faktory pre výber plazmidu alebo vírusového vektora sú: ľahkosť rozlíšenia a selekcia buniek obsahujúcich vektor od tých buniek, ktoré vektor neobsahuje, počet kópii vektora, ktoré sú potrebné pre konkrétneho hostiteľa, a či je možné, pokiaľ je to potrebné, prenášať vektor medzi hostiteľskými bunkami odlišných druhov.
Keď je vektor(y) alebo DNK sekvencia obsahujúca konštrukt(y) pripravená pre expresiu, DNK konštrukt(y) môžu byť vnesené do hostiteľskej bunky pomocou mnohých vhodných metód: transformáciou, transfekciou, konjugáciou, fuziou protoplastov, elektroporáciou, vápnikovo-fosfátovou precipitáciou, priamou mikroinjekciou a podobne.
Hostiteľské bunky môžu byť prokaryotické a aj eukaryotické. Výhodné sú eukaryotické bunky, napríklad cicavčie bunky, ako sú bunky ľudské, opičie, myšie alebo bunky z vaječníkov čínskeho škrečka (CHO), pretože sú schopné vykonať najväčšie množstvo postranslačných úprav na molekule proteínu, vrátane správneho sformovania, alebo glykozylácie na správnych miestach. Aj bunky kvasiniek sú schopné zabezpečiť posttranslačnú modifikáciu peptidov, vrátane glykozylácie. Je veľa rekombinantných DNK stratégií používajúcich sekvencie silných promótorov a vysoký počet kópií plazmidov, ktoré môžu byť použité na produkciu požadovaného proteínu v kvasinkách. Kvasinky rozlišujú vedúce sekvencie produktov klonovaných cicavčích génov a vedúce sekvencie sekretovaných peptidov (pre-peptidy).
Po zavedení vektora(on) rastú hostiteľské bunky na selekčnom médiu, ktoré selektuje rastúce bunky obsahujúce vektor. Expresia klonovanej génovej sekvencie vedie k produkcii požadovaných proteínov.
Purifikácia rekombinantných proteínov sa uskutočňuje podľa niektorej z metód vyvinutej na tento účel, napríklad konvenčnými spôsobmi, ako sú extrakcia, precipitácia, chromatografia, elektoforéza a podobne. Ďalšie purifikačné metódy, ktoré môžu byť použité k prečisteniu proteínu podľa navrhovaného vynálezu, sú afinitná chromatografia s použitím monoklonálnych protilátok viažucich cieľový proteín, a ktoré sú produkované a imobilizované na gólovom matrixe vnútri kolóny. Nečistý preparát obsahujúci požadovaný proteín je pretlačený cez kolónu. Proteín sa naviaže vnútri kolóny na špecifickú protilátku, zatiaľ čo nečistoty prejdú cez kolónu. Po premytí je proteín vymytý z gélu pomocou zmeny pH alebo iónovej sily.
Termín „hybridný proteín“, tak ako sa tu používa, opisuje proteín zložený z dvoch alebo viacerých proteínov alebo z ich fragmentov.
Termín „fúzny proteín“, tak ako sa tu používa, opisuje hybridný proteín zložený z dvoch alebo viacerých proteínov alebo z ich fragmentov, ktoré sú spolu kovalentne spojené.
Termín „agregácia“, tak ako sa tu používa, opisuje vytvorenie silných špecifických nekovalentných interakcií medzi dvoma polypeptidickými reťazcami tvoriacimi komplex, rovnaký ako ten medzi α a β podjednotkami heterodimémych hormónov (ako je FSH, LH, hCG alebo TSH).
Termín „ligand“ alebo „ligandový proteín“, tak ako sa tu používa, opisuje molekulu inú ako protilátku alebo imunoglobulín, schopnú naviazať sa na tú doménu receptora, ktorá viaže ligand, môžu to byť molekuly vyskytujúce sa prirodzene alebo molekuly chemicky modifikované, alebo chemicky syntetizované.
SK 282326 Β6
Termín „doména viažuca ligand“, tak ako sa tu používa, opisuje tú časť receptora, ktorá sa zúčastňuje väzby ligandu a je buď časťou, alebo prestavuje celú extracelulámu doménu.
Termín „receptor“, tak ako sa tu používa, opisuje membránový proteín, ktorý po naviazaní patričného Ugandu spustí sekundárnu bunkovú reakciu vedúcu k aktivácii alebo inhibícii intracelulámych procesov.
Ďalším aspektom opisovaným navrhovaným vynálezom je použitie hybridných proteínov ako liečiv. Liečivo je, pokiaľ je možné, vo forme farmaceutickej zmesi obsahujúcej proteín navrhovaný vynálezom zároveň s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi a/alebo plnidlami. Toto zloženie farmaceutickej zmesi je tiež ďalším aspektom vynálezu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na objasnenie niektorých aspektov vynálezu sú tu uvedené popisy k pripojeným obrázkom:
Obrázok l(a) a l(b) zobrazuje konštrukty TBP(20-161)-hCGa a TBP(20-161)-hCGp a zodpovedajúce sekvencie (SEQ ID NOS: 1-4).
Obrázok 2(a) a 2(b) zobrazuje konštrukty TBP(20-190)-hCGa a TBP(20-190)-hCGp a zodpovedajúce sekvencie (SEQ ID NOS:5-8).
Obrázok 4 je graf znázorňujúci dávkovo závislý protektívny účinok CHO buniek exprimujúcich TBP-hCG(20-190) oproti TNFa indukovanej cytotoxicite na BT-20 bunkách a rade kontrol.
Obrázok 5 je graf znázorňujúci dávkovo závislý protektívny účinok COS buniek exprimujúcich TBP-hCG(20-190) oproti TNFa indukovanej cytotoxicite na BT-20 bunkách a rade kontrol.
Obrázok 5 je graf znázorňujúci dávkovo závislý protektívny účinok afinitne prečistených CHO buniek exprimujúcich TBP hCG(20-161) oproti TNFa indukovanej cytotoxicite na BT-20 bunkách a rade kontrol.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Vynález bude ďalej opisovaný pomocou nasledujúcich príkladov, ktoré však nemôžu byť v žiadnom prípade považované za limitáciu navrhovaného vynálezu.
Príklad 1
Materiál a metódy
Bunkové línie použité pre túto štúdiu boli získané z American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, keď nie je uvedené ináč. Bunková línia CHO-DUKX bola získaná od L. Chasina z Columbia University prostredníctvom D. Housemana z MIT (39). Bunky CHO-DUKX, ktorým chýba funkčný gén pre dihydrofolát reduktázu, boli kultivované v kompletnom α-plus Modified Eagles Médium (a (+)MEM) s 10 % fetálnym hovädzím sérom (FBS). Bunky COS-7 boli rutinne pasážované v Dulbecco's Modified Eagles médium (DMEM) doplneným 10 % FBS. Keď nie je uvedené ináč, bunky boli riedené tak, aby boli udržiavané v log fáze rastu, kultivačné média boli nakúpené od GIBCO (Grand Island, Island).
Zostavenie génových konštruktov kódujúcich hybridný proteín
Číselné označenie pre p55 TNF receptor je založené na klonovacích údajoch Wallacha (40), zatiaľ čo číselné ozna čenie pre hCG podjednotky je založené na číslovaní podľa Fiddesových údajov (41, 42). Označenie TBP alebo TNF viažuce proteín sa vzťahuje k časti extracelulámej domény TNF receptora schopnej viazať TNF. V tomto príklade sú DNK konštrukty označené ako TBP-hybridné proteíny, s partnerom a oblasťou TBP označenou v nomenklatúre konštruktu. Všetky TBP-hCG konštrukty obsahujú signálny peptid ľudského rastového hormónu (hCG) na mieste prirodzenej p55 signálnej sekvencie. Navyše, signálny peptid hCG bol umiestnený takým spôsobom, aby tesne predchádzal TBP zvyšok Asp20, o ktorom sa predpokladá, že je prvým zvyškom v hotovom sekretovanom proteíne. Táto modifikácia nie je dôležitá pre hlavný koncept použitia hCG ako partnera v hybridnom proteíne.
DNK kódujúce hybridný proteín boli konštruované použitím PCR metódy (43).
TBPl(20-161)-hCG
Pôvodný TBP-hCG konštrukt bol pripravený tak, aby obsahoval doménu viažucu ligand z extracelulámej oblasti p55 TNF receptora (od Asp20 do zvyšku Cyslól vrátane) fuzovaný pomocou krátkeho linkera na HCG α a β podjednotky (začínajúc zvyškom aCys7 alebo βΡΓο7). Tento konštrukt, označovaný tu ako TBPl(20-161)-hCG, je heterodimér dvoch modifikovaných hCG podjednotiek, TBP 1(20-161)hCGa a TBP1 (20-161) hCGp
Pre konštrukt TBPl(20-161)hCGa boli použité tieto oligodeoxynukleotidové priméry: Primér 1(αβ)
Primér 2(a)
Primér 3(a)
Primér 4(a)
TTT TCT CGA GAT GGC TAC AGG TAA GCG CCC (SEQ ID NO: 11) ACC TGG GGC AGC ACC GGC ACA GGA GAC ACA CTC GTT TTC (SEQ ID NO: 12) TGT GCC GGT GCT GCC CCA GGT TGC CCA GAA TGC ACG CTA CAG (SEQIDNO-.13)
TTT TGG ATC CTT AAG ATT TGT GAT AAT AAC AAG TAC (SEQ ID NO: 14)
Tieto a všetky ostatné použité priméry opísané v príkladoch boli syntetizované pomocou prístroja pre syntézu DNK Applied Biosystems Model 392 (ABI, Foster City, Califomia), použitím chémie fosforamiditov.
Keďže obidve TBP-hCG podjednotky konštruktu majú rovnaký 5' koniec (t. j. 5' koniec hCG/TBP konštruktu), primér 1 (αβ) môže byť použitý pre obidve TBP-hCG podjednotky konštruktu. Ďalšie priméry použité pre TBP 1(20-161 )-Τ<ΧΤβ konštrukt boli: Primér 2(β)
CCC TGG ACC AGC ACC AGC ACA GGA GAC ACA CTC TTC (SEQ ID NO: 15)
TGT GCT GGT GCT GGT CCA CGG TGC CGC CCC ATC AAT (SEQ ID NO: 16)
TTT TGG ATC CTT ATT GTG GGA GGA TGC GGG TG (SEQ ID NO:17)
Primér 3(β)
Primér 4(β)
Priméry 2(a) a 3 (a) sú reverzne komplementárne a pokrývajú obidva 3'konce kódujúcich oblastí pre p55 extracelulámu doménu a 5' koniec α podjednotky hCG. Podobne priméry 2 (β) a 3 (β) sú tiež reverzne komplementárne a pokrývajú obidva 3'konce kódujúcich oblastí pre p55 extracelulámu doménu a 5'koniec β podjednotky hCG.
Pre každý z dvoch konštruktov pre TBP-hCG a podjednotku boli uskutočnené dve PCR reakcie. V prvej boli použité priméry 1 (αβ) a 2 (α alebo β) a ako templát bol použitý plazmid kódujúci rozpustné p55 zvyšky 20-180 predchádzané hCG signálnym peptidom (plazmid pCMVhCGspcDNK.pA4). V druhej reakcii boli použité priméry 3(a alebo β) a 4(a alebo β), ako templát bol použitý plazmid buď pSVL-hCGa, alebo ρενΤ-ύΌΰβ (44). PCR bola vykonaná použitím Vent™ polymerázy z New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) podľa návodu doporučeného výrobcom, keď bolo pre každú reakciu s 25 cyklami použitých:
100 mg templátovej DNK mg každého priméru
U Vent™ polymerázy (New England Biolabs) denaturácia pri 99 °C počas 30 sekúnd renaturácia potom: 59 °C počas 30 sekúnd pre priméry
1(αβ)32(α) °C počas 30 sekúnd pre priméry (a) a 4 (a) °C počas 30 sekúnd pre priméry 1 («β)3 2(β) °C počas 30 sekúnd pre priméry 3(β) a4(p) predĺženie pri 75 °C na 75 sekúnd.
Veľkosť PCR produktov bola prekontrolovaná elektorforézou v 2 % agarózovom géli a značkovaná etidium bromidom. Fragmenty boli potom purifikované pomocou Wizard kolóny (Promega) spôsobom doporučeným výrobcom.
Konečná kódujúca sekvencia pre TBPl(20-161)-hCGa bola zostavená fúziou PCR použitím priméru 1(αβ) a priméru 4(a). Ako templát bol použitý vyčistený produkt z p55 a hCG α fragmentov, získaný prvou PCR reakciou. Prvé dva templáty, ktoré vďaka prekrytiu medzi primérmi 2 (a) a 3 (a) môžu byť denaturované a renaturované spoločne, prešli 10 cyklami PCR v neprítomnosti akýchkoľvek pridávaných primérov. Podmienky, za ktorých sa uskutočnila reakcia boli v podstate rovnaké ako pri predchádzajúcich reakciách, len renaturácia sa uskutočnila pri 67 °C a fáza predlžovania trvala 2 minúty. Po uskutočnení týchto 10 cyklov boli pridané priméry 1(αβ) a 4(a) a uskutočnilo sa ďalších 10 cyklov. Podmienky pre tieto konečné reakcie boli rovnaké ako pre reakcie skôr opisované, len teplota pri renaturácii bola 59 °C a fáza predlžovania trvala 75 sekúnd.
Analýza produktov tejto reakcie sa uskutočnila pomocou elektroforézy v 1 % agarózovom géli a potvrdila, že boli získané fragmenty okolo 1100 bp. Fragmenty boli prečistené cez Wizard kolónu a následne boli rozstrihnuté pomocou Xbal a BamHI a opäť prečistené v 0,7 % agarózovom géli s nízkou teplotou topenia. Vyčistené fragmenty boli subklonované do plazmidu pSVL (Pharmacia), ktorý bol najprv rozstrihnutý pomocou XBal a BamHI a prečistený v 0, 8 % agarózovom géli s nízkou teplotou topenia. Nasledovala ligácia pomocou T4 ligázy a zmes sa použila k transformácii AG1 E. coli, ktoré boli potom naočkované na doštičky obsahujúce LB/ampicilín a kultivované cez noc pri 37 °C. Plazmidová cDNK z ampicilínrezistentných kmeňov bola analyzovaná po rozstrihnutí s Xbal a BamHI na overenie prítomnosti inzertu (ktorý je vyštiepený enzýmami). Bolo objavených 6 klonov obsahujúcich inzert, jeden (kloň 7) bol vybraný na ďalšie testovanie a bol označený pSVLTBPhCGa (obsahoval TBPl(20-161)-hCGa. Pomocou sekvenovania inzertu dideoxyDNK metódou (použitá Seqenáza™, U. S. Biochemicals, Cleveland, Óhio) bola overená správna sekvencia konštruktu a tiež bolo zistené, že nenastali žiadne nežiaduce zmeny.
Výsledná kódujúca sekvencia ΤΒΡ1(20-161)-1ΐ€Οβ bola zostavená rovnakým spôsobom ako už bolo opísané pre TBP1 (20-161)-hCGa použitím fiúznej PCR a primérov 1 (αβ) a priméru 4(β). Ako templát bol použitý vyčistený produkt z p55 a hCG β fragmentov, získaný prvou PCR reakciou. Výsledný pSVL plazmid obsahujúci inkriminovaný inzert bol označený ρβνΕΤΒΡΡύΰΟβ.
TBPl(20-190)-hCG
Druhá súprava TBP-hCG proteínov bola pripravená modifikáciou TBPl(20-161)-hCG konštruktov tak, aby vznikol analóg obsahujúci TBP v rozsahu od Asp20 do Thrl90, namiesto 20-161 oblasti v pôvodnom analógu. Dosiahlo sa to nahradením fragmentu medzi reštrikčnými miestami BglII a Xbal v plazmide pSVLTBPhCGa fragmentom obsahujúcim zmenu. Tieto fragmenty boli vytvorené fiiznou PCR. Priméry boli: Primér 1 TTT TAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG
GAC(SEQ IDNO:18)
Primér 2 TGT GGT GCC TGA GTC CTC AGT (SEQ IDNO:19)
Primér 3 ACT GAG GAC TCA GGC ACC ACA GCC GGT GCT GCC CCA GGT TG (SEQ ID NO:20)
Primér 4 TTT TTC TAG AGA AGC AGC AGC AGC CCA TG (SEQ IDNO:21)
Priméry 1 a 2 boli použité na vytvorenie sekvencie kódujúcej oblasť p55 zvyšku od 161 do 190. PCR reakcia sa uskutočnila v podstate rovnako ako už bolo opísané, použitím 1 ug každého priméru a pUC-p55 ako templátu. Podobne priméry 3 a 4 boli použité na vytvorenie linkéru medzi 3'-koncom oblasti kódujúcej TBP a 5'-koncom α podjednotky hCG, keď ako templát bol použitý plazmid pSVLTBPhCGa. Veľkosť produktov týchto PCR reakcií (mala byť okolo 296 bp a 121 bp) bola overená elektroforézou v 8 % polyakrylamidovom géli (PAGE) a potom vyčistená vo Wizard kolóne. Priméry 2 a 3 boli pripravené tak, že sa navzájom čiastočne prekrývajú, takže dva PCR produkty (z primérov 1 a 2, a z primérov 3 a 4) môžu byť renaturované počas fíiznej PCR s primérmi 1 a 4. Po fúznej reakcii bol požadovaný produkt okolo 400 bp skontrolovaný a prečistený na 1,5 % agarózovom géli pomocou Wizard kolóny. Táto DNK bola potom rozštiepená pomocou BglII a Xbal a ligovaná BglII/Xbal rozštiepeným pSVLTBPhCGa. Prítomnosť inzertu v plazmide izolovanom z transformovanej AG1 E. coli bola overená rozštiepením BglII a Xbal. Nový konštrukt bol označený pSVLTBP(20-190)hCGa.
Podobne plazmid pSVLTBPlK^ bol modifikovaný substitúciou BglII-XcmI fragmentu. Dosiahlo sa to subklonovaním jedného PCR produktu, skôr ako fuzneho PCR produktu. Priméry 1 a 2b (pozri nižšie) poli použité s pUC-p ako templáty. Primér 2b TTT TCC ACA GCC AGG GTG GCA TTG ATG GGG CGG CAC AGT GGA CCA GCA CCA GCT GTG GTG CCT GAG TCC TCA GTG (SEQINNO:22)
Výsledný PCR produkt (okolo 337 bp) bol prekontrolovaný a prečistený rovnako ako už bolo opísané, rozštiepený BglII a Xcml, potom ligovaný s BglII/Xbal rozštiepeným pSVLTBPhCGB. Prítomnosť inzertu v plazmide izolovanom z transformovaných AG E. coli bola overená rozštiepením BglII a Xcml. Nový konštrukt bol označený pSVLTBP(20-190)-Mľ^. Nový konštrukt bol prekontrolovaný sekvenovanim. Okrem produkcie týchto nových plazmidov založených na pSVL boli tieto konštrukty tiež subklonované do iných expresných vektorov tak, aby boli viac vhodné pre stabilnú expresiu v CHO, konkrétne to boli vektor Da, opísaný už skôr ako plazmid CLH3AXSV2DHFR (45). Uskutočnilo sa to konverziou miesta BamHI ohraničujúceho inzerty vo vektoroch odvo dených od pSVL na Xhol miesto a vyštiepením inzertu Xhol a klonovaním do Xhol naštiepeného Da.
Prechodná a stabilná expresia hybridných proteínov
Transfekcia COS-7 buniek (ATCC CRL 1651, ref. 46) pre dočasnú expresiu TBP-hCG hybridných proteínov bola uskutočnená elektroporáciou (47). Exponenciálne rastúce COS-7 bunky boli zozbierané pomocou trypsínu a ľahko centrifugované (800 rpm, 4 min.), premyté studeným fosfátovým fyziologickým roztokom (PBS), pH 7,3 - 7,4 a opäť centrifugované. Bunky boli resuspendované v koncentrácii 5 x 10?buniek na 400 μΐ v studenom PBS, zmiešané s 10 pg plazmidovej DNK vo vopred ochladenej 2 mm elektroporačnej kyvete. Pre kotransfekciu sa použilo 5 pg každého plazmidu. Kyveta s bunkami bola chladená na ľade ďalších 10 minút a potom sa podrobila elektroporácii použitím prístroja BTX Model 600, pri 125 V, 950 pF a R = 8. Potom boli bunky chladené na ľade 10 minút, prenesené do kónických skúmaviek obsahujúcich 9,5 ml kompletného média (Dulbecco's modified Eagle's médiom (DMEM) doplneným fetálnym hovädzím sérom (FBS) a 1 % L-glutamínom) pri izbovej teplote, pri ktorej sa ponechali 5 minút. Po jemnom zamiešaní v 15 ml skúmavke bol celý objem prenesený do dvoch P100 miskiek a kultivovaný v inkubátore pri 37 °C v 5 % CO2. Po 18 hodinách bolo médium vymenené a v niektorých prípadoch média obsahovali len 1 % alebo 0 % FBS. Po ďalších 72 hodinách boli upravené média odobraté, oddelené centrifugáciou od buniek a zmrazené na -70 °C.
Transfekcia CHO-DUKX (CHO) buniek pre dočasnú alebo trvalú expresiu bola uskutočnená pomocou kalcium fosfátovej precipitácie DNK. 24 hodín pred transfekciou boli exponenciálne rastúce CHO bunky prenesené na 100 mm kultivačné misky, v koncentrácii 7,5 x 105 buniek na misku. V deň transfekcic bolo 10 pg plazmidovej DNK prenesených do 0,5 ml transfekčného pufra (pozri nižšie), bolo pridaných 31 pl 2M CaCl2, roztok DNK-CaCl2 bol rozmiešaný na Vortexe a nechal sa pri izbovej teplote 45 minút. Potom sa médiá opatrne odobrali z misiek a sterilnou plastickou pipetou bol na bunky pridaný roztok DNK, bunky sa potom nechali pri izbovej teplote 20 minút. Po uplynutí tohto času bolo na misky pridaných 5 ml kompletného média a(+)MEM obsahujúceho 10 % FBS a misky boli inkubované 4 až 6 hodín pri 37 °C. Potom bolo médium opatrne odobraté a bunky boli vystavené glycerolovému šoku, inkubáciou v roztoku 15 % glycerolu v transfekčnom pufri pri 37 °C počas 3,5 minúty. Po odstránení roztoku glycerolu boli bunky 2 x premyté v PBS, resuspendované v 10 ml kompletného a(+)MEM s 10 % FTS, a vložené do inkubátora pri teplote 37 °C. Pre stabilnú transfekciu boli bunky po 48 hodinách rozriedené 1 : 10 a inkubované na selekčnom médiu (kompletný α-mínus MEM (bez nukleotidov), 10 % dialyzovanej FBS a 0,02 mM metotrexát). Netransfekované (nerezistentné) bunky sú väčšinou počas 3 až 4 týždňov eliminované a v miskách zostane len populácia transfektovaných k meto-trexátu rezistentných buniek.
Kvantifikácia expresie
Miera sekrécie hybridných proteínov transfektovaných bunkami bola stanovená pomocou komerčného kitu pre rozpustný p55 (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) podľa návodu uvádzaného výrobcom. Pomocou tejto metódy bol stanovený tiež hybridný proteín v upravených médiách, čo slúžilo ako základ pre výber dávok použitých v technológii.
Určenie formácie heterodiméru
Na overenie schopnosti íuznych podjednotiek TBP-hCG kombinovať a tvoriť heterodiméry, bola použitá sendvičová metóda použitia protilátok proti hCG. Pri tejto metóde je mikrotitračná doštička potiahnutá monoklonálnymi protilátkami proti hCG β podjednotke, ktoré slúžia na zachytenie vzorky. Primárna detekčná protilátka je polyklonálna kozia protilátka proti ľudskej a podjednotke TSH (#082422G - Biodesign Intemational, Kennebunkport, Maine), ktorá je potom detekovaná králičou anti kozou polyklonálnou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou (Cappel, Dumham, North Carolina).
V tomto pokuse bolo použitých niekoľko rozdielnych protilátok proti β podjednotke hCG, z ktorých žiadna nemala krížovú reakciu s voľnou α podjednotkou. Jedna z týchto protilátok (3/6) je používaná v komerčnom kite MAIAclone hCG assay (Biodata, Róma, Italy).
Mikrotitračné doštičky silne viažuce proteín (Costar #3590) boli potiahnuté zachytávajúcou protilátkou inkubáciou (2 hodiny pri 37 °C) 100 μΐ/jamka roztoku 5 ug/ml protilátky v značkujúcom pufri (PBS, pH 7,4 + 0,1 % Tween 20). Doštička bola blokovaná kompletným zaplnením jamky (~ 400 μΐ/jamka) blokujúcim roztokom (3 % hovädzí sérový albumín (BSA, frakcia V, A - 4503 Sigma) v PBS, pH 7, 4) a inkubáciou počas jednej hodiny pri 37 °C alebo cez noc pri 4 °C. Doštička je potom 2 x premytá premývacím roztokom a kontrolné i experimentálne vzorky sú rozpustené v rozpúšťadle (5 mg/ml BSA v PBS, pH 7,4) tak, aby výsledný objem bol 100 μΐ. Po inkubácii vzoriek a doštičiek počas dvoch hodín pri 37 °C boli doštičky opäť 2 x premyté premývacím roztokom. Potom bolo pridaných 100 μΐ/jamka primárnej detekčnej protilátky rozriedenej v pomere 1 : 5000 v rozpúšťadle. Sekundárna detekčná protilátka (HRP konjugovaná králičou anti kozou Ig) je pridaná rozriedená v pomere 1 : 5000 v rozpúšťadle (100 μΐ/jamka) a po inkubácii počas jednej hodiny pri 37 °C bola doštička trikrát premytá premývacím roztokom. Potom bolo pridaných 100 μΐ roztoku substrátu TMB (Kirkergaard and Perry Laboratories) a doštička bola inkubovaná 20 minút v tme pri izbovej teplote, enzymatická reakcia bola zastavená pridaním 50 μΐ/jamka 0,3 M H2SO4. Doštička bola analyzovaná pomocou zariadenia ELISA reader pri 450 nm.
Čiastočné prečistenie
Pre lepšiu kvantifikáciu aktivity týchto hybridných proteínov boli TBP-hCG hybridné proteíny čiastočne prečistené imunoafinitnou chromatografiou. Použitá protilátka bola monoklonálna protilátka komerčne dostupná od R&D Systems (MAB #225). V kolóne bola ako nosič použitá CNBr aktivovaná sefaróza s naviazanou protilátkou podľa návodu uvedenom výrobcom (Pharmacia).
Upravené média boli odobraté z T-175 kultivačných fľaštičiek od všetkých línií každý deň po 50 ml, celkom päťkrát po sebe. Odobraté média boli centrifugované (1000 rpm), aby boli odstránené zvyšky buniek. Zvyšok bol analyzovaný na TBP komerčnou imunotechnikou a zahustený (Centricon unit od Amicon, Beverly, Massechusetts) tak, aby výsledná koncentrácia bola približne 50 ng/ml.
ml koncentrovaného TBP-hCG (vzorka #18873) bolo prenesených do približne 1 M NaCl pridaním NaCl a nastavením vodivosti roztoku na 85 mS/cm Tento roztok bol nanesený na 0,5 ml anti-TBP imunoafinitnú kolónu. Roztok bol odobratý a pustený cez kolónu ešte raz. Potom bola kolóna premytá 1 M NaCl v PBS. Naviazaný TBP (20-161)-hcG bol vymývaný z kolóny 50 mM kyselinou citrónovou (pH 2,5). Vymytý roztok (asi 7 ml) bol zahuste
SK 282326 Β6 ný pomocou Amicon Centricon-10, podľa inštrukcii výrobcu (Amicon), na objem približne 200 μΐ. Vzorka bola doplnená približne na 800 μΐ tak, aby výsledný objem bol 1 ml a až do testovania bol skladovaný pri 4 °C.
Stanovenie anti-TNF aktivity
Bolo opísaných mnoho TNF indukovaných cytotoxických techník pre testovanie analógov rozpustných TNF receptorov. My sme použili techniku využívajúcu ľudskú bunkovú líniu karcinómu prsníka BT-20 (ATCC HTB 19). Použitie týchto buniek ako základu detekčnej techniky pre TNF bolo už opísané (48). Tieto bunky boli kultivované pri 37 °C v RPMI 1640 médiu doplnenom 10 % tepelne inaktivovaným FBS. Bunky rástli do maximálne 80 až 90 % hustoty, čo obsahovalo riedenie každé 3 až 4 dni s východiskovou koncentráciou okolo 3 x 106 buniek na TI 75 cm2 fľašu.
Technika využívajúca BT-20 obsahuje vitálne značenie buniek kryštalickou violetou, ľahko detekčnú metódu pre určenie životnosti buniek po inkubácii s TNF. Mŕtve bunky nie sú schopné vylúčiť farbivo a teda zostávajú zafarbené.
Postup použitý pre túto techniku určovania anti-TNF aktivity je nasledujúci. Rekombinantný ľudský TNFa (R&D Systems) a experimentálne vzorky boli rozriedené do média (RPMI 1640 s 5 % tepelne inaktivovaným FBS) na 96-jamkovej kultivačnej doštičke. Bunky boli pridané do jamiek v koncentrácii 1 x 105 buniek/jamka. Množstvo pridaného TNF bolo stanovené už skôr pomocou titračných štúdii a predstavovalo množstvo, ktoré bežne prežíva približne 50 % buniek. Po pridaní vzorky boli bunky kultivované 48 hodín pri 37 °C a po ukončení tejto kultivácie bol počet prežívajúcich buniek stanovený pomocou značkovania kyštalickou violetou a meraním na ELISA readeri (570 nm).
Záver
Študované konštrukty
Štruktúra študovaných hybridných proteínov je zhrnutá ďalej, na porovnanie boli použité dva kontrolné proteíny, monomémy rozpustný p55 (r-hTBP-1) a dimémy fuzny TBPimunoglobulín proteín (TBP-IgG3) (pripravený rovnako ako je uvedené v (10).
Konštrukt TBP N-koniec TBP C-koniec fúzny partner
r-hTBP-1 zmes 9 a 20 180 žiadny
TBP-IgGj zmes 9 a 20 190 konštantná oblasť Igj ťažkého reťazca
TBP(20-160)-hCG 20 161 hCGff a hCG/J (heterodimér)
TBP(20-190)-hCG 20 190 hCGff a hCG/3 (heterodimér)
Sekvencie DNK kódujúce TBP(20-161)-hCG a TBP(20-190)-hCG sú uvedené na obrázku 1 a 2.
Sekrécie TBP-hCG proteínov
Všetky testované konštrukty boli produkované a sekrétované do média transfekovanými cicavčími bunkami. Výsledky sú uvedené v tabuľke 1 a 2.
TBP-hCG(a/p) fúzne proteíny tvoria heterodiméiy
Kombinácie TBP-hCGa a TBP-hCGP boli potvrdené použitou sendvičovou technikou pre hCG heterodimér. Len kombinovaná transfekcia a a β podjednotky vedie k detekcii heterodiméru (tabuľka 3).
TBP-hCG heterodimér má vyššiu aktivitu ako TBP monomér
Hybridné proteíny produkované buď COS-7, alebo CHO sú silnými inhibítormi TNFa v BH-20 technike. Výsledky testov niektorých vzoriek sú zhrnuté v tabuľke 4.
Negatívne kontroly (upravené médiá zo simulovaných transfekcií) boli použité ako 1 vzorka média.
Obrázky 3 až 5 ukazujú (body na osi y), že pridanie TNF (2,5 ng/ml) vedie k zreteľnému zníženiu preživajúcich buniek v kultúre (ako bolo merané pri OD 570). Vo všetkých prípadoch mali aktívne vzorky maximálny ochranný účinok na prežívanie buniek až na úroveň, ktorá bola pri vzorkách bez TNF (t. j. kontroly označenej „samej bunky“).
Pozitívne kontroly, r-hTBP-1 a TBP-IgG3, mali obidve protektívny účinok s jasnou závislosťou od dávky a ED50 okolo 100 ng/ml pre r-hTBP-1 (obrázky 3 až 5) a asi 1,5 ng/ml pre TBP-IgG3 (obrázok 3).
TBP-hCG konštrukty z 1 x média (CHO alebo COS) alebo po imunopurifikácii majú ochranný účinok závislý od dávky s ED30 okolo 2-11 ng/ml (obrázky 3 - 5).
Závery in vitro techník sú uvedené v tabuľke 5. Výsledky ukazujú, že hybridné proteíny inhibujú cytotoxicitu TNF a že sú podstatne účinnejšie ako TBP monomér. V negatívnej kontrole sa neprejavila žiadna protektívna aktivita.
Navyše, nielen že dimerizácia TBP môže zvyšovať jeho účinnosť, je tiež možné, že aktivita hybridných proteínov sa nevzťahuje k dimerickým interakciám s TBP, ale skôr k stérickej inhibicii partnerom hybridu inteferujúcim s rozpustným TBP/TNF viažucim sa na TNF receptory na bunkovom povrchu.
Všetky referencie tu citované, vrátane článkov z časopisov alebo abstraktov, publikované alebo vzťahujúce sa k U.S alebo cudzím patentovým aplikáciám, uznané U.S alebo zahraničné patenty, alebo akékoľvek iné referencie sú tu zahrnuté ako referencie vrátane všetkých výsledkov, tabuliek, obrázkov a textu uvedeného v citovanom literárnom odkaze. Navyše je tu uvedený celý zoznam literárnych odkazov.
Odkazy vzťahujúce sa k známym metodickým postupom, konvenčným metodickým postupom alebo konvenčným metodikám v žiadnom prípade neznamenajú, že ľubovoľný aspekt, opis, konkrétny variant zahrnutý v navrhovanom vynáleze je známy v súčasnom stave techniky.
Predchádzajúci opis konkrétneho variantu nebude plne opisovať celkovú myšlienku vynálezu, pretože je možné pomocou vedomostí podľa súčasného stavu techniky (vrátane zoznamu citácii tu uvedenom) modifikovať a/alebo adaptovať postup pre množstvo aplikácií a konkrétnych variantov, bez zložitého skúmania a bez prekročenia hraníc daných celkovou koncepciou navrhovaného vynálezu. Tieto adaptácie a modifikácie zapadajú do zmyslu vymedzeného možnosťami a variantmi založenými alebo odvodenými od tu uvedených. Je samozrejmé, že frazeológia a terminológia tu používaná je len na účely opisu a nie je limitáciou, táto terminológia a frazeológia predkladanej špecifikácie nemôže byť interpretovaná odborníkmi odvodením a návodmi tu uvádzanými v kombinácii so znalosťami súčasného stavu techniky.
Tabuľky
Tabuľka 1: COS-7 dočasná expresia (TBP ELISA)
Hybridný protein Koncentrácia (pg/ml)
TBP1 66
TBP-hCGa(20-161) 5,1
TBP-hCG/3(2O-161) 0,5
TBP-hCG (20-161) 2,7
Kontrola <0,25
Konštrukt bol exprimovaný pomocou pSVL (Pharmacia)
Tabuľka 2: COS-7 dočasná expresia (TBP ELISA)
Hybridný protein Koncentrácia (ng/ml)
TBP1 131
TBP-hCGa(20-190) 81
TBP-hCGP(20-19Q) 9
TBP-hCG (20-190) 62
Kontrola <1
Konštrukt bol exprimovaný pomocou myšieho vektora obsahujúceho metalotioneinový promótor -pDa
Tabuľka 3: COS-7 dočasná expresia (hCG heterodimérová technika)
Hybridný protein Koncentrácia (ng/ml)
TBP1 <0,2
TBP-hCGC(20-190) <0,2
TBP-hCG^(20-190) <0,2
TBP-hCG (20-190) 38
Kontrola <0,2
Konštrukt bol exprimovaný pomocou myšieho vektora obsahujúceho metalotioneinový promótor -pDa
Tabulka 4: COS-7 dočasná expresia (hCG heterodimérová technika]
KonStrukt Zdroj buniek Typ vzorky
r-hTBP-1 CHO Vyčistený
TBP-IgGs CHO 1 x upravené médium
TBP(20-161)-hCG CHO Imunopuri f i kované (anti-TBP)
TBP(20-190)-hCG CHO 1 x upravené médium
TBP(20-190)-hCG COS 1 x upravené médium
Tabulka 5: COS-7 dočasná expresia
( hCG heterodimérová technika)
Konštrukt Fúzny partner Ant-TNF aktivita (EDso) v BT20 technike**
r-hTBP-1 žiadny 100 ng/ml
TBP-IgGj Konštantná oblasť ťažkého reťazca IG3 1,5 ng/ml
ΓΒΡ(20-161)-hCG hCGa a hQGfi (heterodimér) 2 ng/ml
TBP(20-190)-hCG hCGa a hCGp (heterodimér) ň - 11 ng/ml
** Množstvo materiálu pre dávkovanie a určenie ED5o bolo uskutočnené pomocou TBP ELISA
ZOZNAM CITÁCIÍ
L Smith, R. A. et al., J. Biol. Chem. 262:6951 - 6954, 1987.
2. Eck, M. J. et al., J. Biol. Chem. 264:17595 -17605,
1989.
3. Jones, E. Y. et al., Náture 338:225 - 228,1989.
4. Eck, M. J. et al., J. Biol. Chem. 267:2119 - 2122,1992.
5. Pierce, J. G. et al., Annu. Rev. Biochem, 50:465 - 495,
1981.
6. Lapthom, A. J. et al., Náture 369:455 - 461,1994.
7. Wu, H., et al., Structure 2:545 - 550,1994.
8. Engelmann, H., et al., J. Biol. Chem. 265:14497 - 14504,
1990.
9. Adam, D. et al., J. Biol. Chem. 270:17482 - 17487, 1995.
10. Loetscher,H. R., et al., J. Biol. Chem. 266:18324 -18329,1991.
11. Banner, D.W., et al., Celí 73:431 - 445,1993.
12. Pennica, D., et al., Biochemistry 32:3131 - 3138, 1993.
13. Engelmann, H., et al., J. Biol. Chem. 265:1531 - 1536, 1990.
14. Van Zee, K. J., et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89: 4845 - 4849,1992.
15. Aderka, D., et al., J. Exp. Med. 175:323 - 329,1992.
16. Mohler, K. M., et al., J.Immunol. 151:1548 - 1561,
1993.
17. Bertini, R., et al., Eur. Cytokine Netw., 1993.
18. Piguet, P. F., et al., Immunology 77:510 - 514, 1992.
19. Williams, R. O., et al., Immunology 84:433 - 439, 1995.
20. Capon, D.J., et al., Náture 337:525 - 531,1989.
21. Ashkenazi, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:10535 -10539,1991.
22. Suitters, A. J., et al., J. Exp. Med. 179:849 - 856,1994.
23. Nolan, O., et al., Biochim. Biophys. Acta 1040:1 - 11, 1990.
. Rodrigues, M. L., et al., J. Immunol .151: 6954 - 6961,
1993.
25. Chang, H. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11408-11412,1994.
26. Wu, Z., et al., J. Biol. Chem. 270:16039 - 16044,1995.
27. Bazzoni, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5376- 5380,1995.
28. Boldin, M. P., et al., J. Biol. Chem. 270:387 - 391, 1995.
29. Vu, T.-K. H., et al., Celí, 64:1057 - 1068,1991.
30. Song, H. Y., et al., J. Biol. Chem. 269:22492 - 22495,
1994.
31. Russell, D. A., et al., J. Infectious Diseases 171:1528 -1538,1995.
32. Rao, C. V., et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 146:65 - 68, 1983.
33. Damewood, M. D., et al., Fertil. Steril. 52, 398 - 400, 1989.
34. Chen, F., et al., Mol. Endocrinol. 6:914 - 919, 1992.
35. Bielinska, M., etal., J. Celí Biol. 111:330a, 1990.
36. Furuhashi, M., et al., Mol. Endocrinol. 9:54 - 63,1995.
37. Sugahara, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2041 -2045, 1995.
38. Johnson, G. A., et al., Biol. Reprod. 52:68 - 73, 1995.
39. Urlaub, G. and Chasin L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220,1980.
40. Nophar, Y., et al., EMBO J. 9:3269 - 3278,1990.
41. Fiddes, J. C., etal., Náture 281:351 -356, 1979.
42. Fiddes, J. C., et al., Náture 286:684 - 687,1980.
43. Elion, E. A., in Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausuble, FM. Et al., John Wiley & Sons, 1993.
44. Campbell, R., Prac. Natl. Acad. Sci. USA 88:760 - 764,
1991.
45. Cóle, E. S., et.al., Biotechnology, 11, 1014 - 1024, 1993.
46. Gluzman, Y., Celí 23:175 - 182,1981.
47. Chu, G., et al., Nucl. Acid. Res. 15:1311 - 1326, 1987.
48. Yen, J., et al., J. Immunotherapy 10:174 - 181,1991.
Výpis sekvencii (1) CELKOVÉ INFORMÁCIE:
(i) APLIKANT:
(A) MENO: Applied Research Systems,ARS Holding N. V.
(B) ULICA: 14 John B.Gorsiraweg (C) MESTO: Curacao (D) KRAJINA: Netherlands Antilles (E) POŠTOVÝ KÓD (ZIP):
(A) MENO: CAMPELL, Róbert C.
(B) ULICA: 25 Meadowbrook Drive (C) MESTO: Wrentham (D) ŠTÁT: Massachusetts (E) KRAJINA: United States of America (A) MENO: JAMESON, Bradford A.
(B) ULICA: 76 Robins Street (C) MESTO: Milton (D) ŠTÁT: Massachusetts (E) KRAJINA: United States of America (A) MENO: CHAPPEL, Scot C.
(B) ULICA: 125 Canton Avenue (C) MESTO: Milton (D) ŠTÁT: Massachusetts (E) KRAJINA: United States of America (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: hybridné proteiny (iii) POČET SEKVENCII: 22 (iv) KOREŠPODENČNÁ ADRESA:
(A) ADRESA: BROWDY AND NEIMARK (B) ULICA: 419 Seventh Street N.W., Ste 300 (C) MESTO: Washington (C) ŠTÁT:D.C.
(E) ZEM: USA (F) ZIP: 22207 (v) POČÍTAČOVÁ FORMA (A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTVÉR: Patentln Release#l,0, Verzia#l,30 (vi) APLIKAČNÉ ÚDAJE (A) ČÍSLO APLIKÁCIE: 60/011,936 (B) DÁTUM PODANIA: 2O.februára 1996 (C) KLASIFIKÁCIA:
(vii) ZÁSTUPCA/AGENT (A) MENO: Browdy, Roger L.
(B) REGISTRAČNÉ ČÍSLO: 25,618 (B) REFERENCLA/ČÍSLO ZLOŽKY:
CAMPBELL=2A PCT (viii) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE (A) TELEFÓN: (202) 628-5197 (B) TELEFAX: (202) 737-3528 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1049 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) RYSY:
(E) MENO/KĽÚČ: CDS (E) UMIESTNENIE: 278..1047 (iv) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1:
TCCACATGGC TACÄGGTAAG CGCCCCTAAA ATCCCTTTGG GCACAATGTG TCCTGAGGGG60
AGAGGCAGCG ÄCCTCTAGAT CGGACGGGGG CACTAACCCT CACGTTTGGG CCTTCTCAAT120
CTCACTATCG CCATGTAÄGC CCAGTATTTG GCCAATCTCA GAAAGCTCCT CCTCCCTGGA180
GGGATGGAGA GAGAAAAACA AACAGCTCCT GGAGCAGGGA GAGTGCTGGC CTCTTGCTCT240
CCGGCTCeCT CTGTTGCCCT CTGGTTTCTC CCCAGGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC295
Sa r Ari 1 g Th r Se. r Lei i Leu 5
CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC ATG GCC 343
Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala
10 15 20
GAT AGT GTG TGT CCC CAA GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT TCC 391
Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser
25 30 35
ATT TGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT 439
íle Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys
40 45 50
CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG ACC GGC TCC 467
Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser
55 60 65 70
TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC AAA 535
Phe Thr ALa Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys
75 í )0 85
TGC CGA AAC GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC 583
Cys Arg lys Glu Net Gly Gin Val Glu íle Ser Ser Cys Thr Val Asp
90 95 100
CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT TGG 631
Arg Asp Thr Val Cya Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp
105 110 115
AGT SAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC AGC CTC TGC CTC AAT GGG 679
Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cye Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly
120 225 130
ACC GTG CAC CTC TCC TGC CAG GAG AAA CAG AAC ACC GTG TGC ACC TGC 727
Thr Val His Leu Ser Cys Gin Glu Lya Gin Asn Thr Val Cys Thr Cys
135 140 145
CAT CCA GGT TTC TTT CTA AGA GAA AAC GAG TGT GTC TCC TGT GCC GGT 775
His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ala Gly
155 160 165
GCT GCC CCA GGT TGC CCA GAA TGC ACG CTA CAG GAA AAC CCA TTC TTC 823
Ala Ala Pro Gly Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gin Glu Asn Pro Phe Phe
170 175 180
TCC CAG CCG GGT GCC CCA ATA CTT CAG TGC ATG GGC TGC TGC TTC TTC 871
Ser Gin Tro Gly Ala Pro íle Leu Gin Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser
185 190 195
AGA GCA TAT CCC ACT CCA CTA AGG TCC AAG AAG ACG ATG TTG GTC CAA 919
Arg AU Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser lys Lys Thr Met Leu Val Gin
200 205 210
AAG AAC GTC ACC TCA GAG TCC ACT TGC TGT CTA GCT AAA TCA TAT AAC 967
Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn
215 220 225 230
AGG GTC ACA GTC ATG GGG GGT TTC AAA GTG GAC AAC CAC ACG CGG TGC 1015
Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Cly Cys
235 240 245
CAC TGC AGT ACT TGT TAT TAT CAC AAA TCT TA AC 1049
His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr Hla Lys Ser
(2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO:2:
(v) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 256 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (vi) TYP MOLEKULY: proteín (vii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:2:
Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro 15 1015
Leu Gin Glu Gly Sre Ala Asp Sex Val Cys Pro Gin Gly Lys Tye íle
2530
His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys Cya Thr Lys Cys His Lys Gly Thr
4045
Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg
5560
Glu Cys Glu Sex Gly Sex Phe Thr Ale Ser Glu Asn His Leu ArgHis ¢5 70 75BO
Cys Leu Ser Cys Ser lys Cys Arg Lys Glu Met gly Gin Val Gluíle
9095
Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn
100 105110
Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Aan Leu Phe Gin Cys Phe Asn Cys 115 120125
Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gin Glu Lys Gin
130 135140
Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu AsnGlu
145 1S0 1S5160
Cys Val Ser Cys Ala Gly Ala Ala Pre Gly Cya Pre Glu Cys ThrL«U
165 170175
Gin Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gin Pro Gly Ala Pro íle Leu Gin Cys
100 185190
Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys
195 200205
Lys Thr Met Leu Val Gin Lya Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cya 210 215220
Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe LysVal
225 230 235240
G1U Asn His Thr Gly Cys Hla Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His LysSer
245 250255 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO:3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1202 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) RYSY:
(G) MENO/KĽÚČ : CDS (H) UMIESTNENIE: 279..1199 (iv) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:3:
CTCGMATGS CTACAGGTAA GCGCCCCTAA AATCCCTTTG GGCACAATGT GCCTGAGGG6C
GÄGAGGTAGC GACCTGTASA TGGGhCGGGG SCACTAACCC TGAGGTTTGG «GCTTCTGAA120
TGTCAGTArc GCCATGTAAG CCCAGTÄTTT 3GCCAATOTC AGAAAGCTCC TGGTCCCTGG130
AGGGATGGAG AGAGAAAAAC AAACAGCTCC TGGACCAGGC ÄGAGTGCTGG CCTCTTGCTC240
TCCGGCŤCCC TCTGTTGCCC TGTGGTTrCT CCCCAGGC TCC CGC ACG TCC CTG293
Ser Arg Thr Ser Leu
260
CTC CTC CCT m CGC ctg ctc TGC CTG ccc TGG CTT CAA GAG GGC AGT341
Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu GlySer
265 270275
GCC GAT AGT GTG TGT CCC CAA GGA ΑΛΑ TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT389
Ala Asp ser Val cys Pro Gin GLy Lya Tyr íle Hla Era Gin AanAen
280 285290
TCG ATT TCC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TtC TTG TAC AAT GAC437
Sex íle Cys Cya Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyi AanAsp
295 30030$
TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACC GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC GGC485
Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu SerGly
310 315 320325
TCT TTC ACC CCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC533
Ser Phe Thr Ala Ser Glu Aan Hla Leu Arg His Cys Leu Ser CysSer
330 335340
AAA TGC CGA AAG GAA ATC GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG581
Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu íle Ser set Cys ThrVal
345 350355
GAC CCG GAC ACC GTG TGT GGC TCC AGG AAG AAC CAG TAC CSG CÄT TAT629
Asp Arg Asp Thr Vil Cys Gly Cys Arg Lya Aan Gin Tyr Arg HiaTyr
360 36$370
TGG AGT GAA AACCTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC AGC CTC TGC CTC AAT677
Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin cys Phe Aan Cys Ser Leu Cya Leu Asn
375 38039$
GGG ACC GTG CAC CTC TCC TCC CAG GAG AAA CAG AAC ACC GTG TGC ACC725
Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gin Glu Lys Gin Aan Thr Val CysThr
390 395 400405
TGC CAT GGA GGT TTC TTT CTA AGA GAA AAC GAS TCT CTC TCC TGT GCT173
Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Clu Asn Glu Cys Val ser CysAla
410 415(20
Trn GGT GCT GGT CCA CGG TGC CGC CCC ATC AAT GCC ACC CTG GCT GTG GAG 621
Gly Ala Gly Pro Arg Cys Arg 425 Pro íle Asn Ala 430 Thr Leu Ala Val Glu 435
AAG GAG GGC TGC CCC GTG TGC ATC ACC GTC AAC ACC ACC ATC TGT GCC 869
Lys Glu Gly Cys Pro Vla Cya íle thr Val Asn Thr Thr íle cya Ala
440 445 450
GGC TAC TGC CCC ACC ATG ACC CGC GTG CTG CAG GGG GTC CTC CCC GCC 917
Gly Tyr Cys Pre Thr Met Thr Arg Val Leu Gin Gly Val Leu Pro Ala
455 460 465
CTG CCT CAG GTG OTG TGC AAC TAC CGC GAT CTG CGC TTC GAG TCC ATC 965
Leu Pro Gin Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp val Arg Phe Glu Ser íle
470 475 460 485
CGG CTC CCT GGC TGC CCG CGC GGC GTG AAC ccc GTG GTC tcc TAC GCT 1013
Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Ain Pro Vil Val Ser Tyr Ala
490 495 500
GTG GCT CTC ASC TGT CAA TGT CCA CTC TGC CGC CGC AGC ACC ACT GAC 1061
Val Ala Leu Sex Cys Gin Cya Ala Leu Cys Arg Arg 8ex Thr Thr Asp
505 510 515
TGC GGG GGT CCC AAG GAC CAC ccc TTG ACC TGT GAT GAC CCC CGC TTC 1109
Cya Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Aap Aap Pro Arg Phe
520 525 530
CAG GAC TCC TCT TCC TCA AAG GCC CCT ccc ccc AGC CTT CCA AGC CCA 1157
Gin Asp Sftl Ser Ser Sex Lya Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
535 540 545
TCC CGA CTC CCG GGG ccc TCG GAC ACC CCG ATC CTC CCA CAA TAA 1202
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Aap Thr Pro íle Leu Pro Gin
550 555 560
(2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO:4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 307 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (B) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:4:
Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu , Ala Phe i Gly Leu : Leu ( rys J Leu I Pro Trp
1 5 10 15
Leu Gin Glu Gly Ser , Ala . Asp , 5er ' Val < cys Pro i Sln t 31y Lys Tyr íle
20 25 30
Tyr Leu Tyr Asn . Asp Cys Pro Gly Pro i Gly i Gin Asp Thr Asp Cys Arg
SO 55 60
Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala ser Glu Asn His Leu Arg His
65 70 75 80
Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu íle
85 90 95
Ser Ser Cys Thr Val Aap Arg Asp Thr Val Cya Gly Cys Arg Lys Asn
100 105 110
Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Gys Phe Asn Cys
115 120 125
Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr val His Leu Ser Cys Gin Glu Lys Gin
130 135 140
Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu
145 150 155 160
Cys Val Ser Cys Ala Gly Ala Gly Pro Arg Cys Arg Pro íle Asn Ala
165 170 175
Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val cys íle Thr val Asn
180 185 190
Thr Thr íle Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val leu Gin
195 200 205
Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gin Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val
210 215 220
Arg Phe Glu Ser íle Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro
225 230 235 240
Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gin Cya Ala Leu Cys Arg
245 250 255
Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys
260 265 270
Asp Asp Pro Arg Phe Gin Asp Ser Ser Ser Ser Lya Ala Pro Pro Pro
275 280 295
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro íle
2.90 295 300
Leu Pro Gin
305 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO:5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1147 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) RYSY:
(I) MENO/KĽÚČ: CDS (J) UMIESTNENIE: 278..1132 (iv) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:5:
TCGAGATGGC TACAGGTAAG CSCCCCTAAA ATCCCTTTGG GCACAATGTG TCCTGAGGGG AGAGGCAGCG ACCTGTAGAT GGGACGGGGG CACTAACCCT CAGGTTTGGG GCTTTTGAAT GTGAGTATGG CCATGTAAGC CCAGTATTTS CCCAATCTCA GAAAGCTCCT CGTCCCTGGA GGGATGGAGA GAGAÄAAACA AACAGCTCCT GGAGCAGGGA CACTCCTGGC CTCTTGCTCT GCGGCTCCGT GTGľTGCCCT GTGGTTTCTC CCCACGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC
Arg Thr $»r Leu Leu
310
CTG Leu GCT TTT GGC CTG Leu CTC Leu TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT GCC
Ala Phe 315 Gly Cys 320 Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly 32S Ser Ala
GAT AGT GTG TGT CCC CAA. GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT TCG
Asp Sar Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser
330 335 340 345
ΑΓΤ TGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT
TLe cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Thr Leu Tyr Asn Asp Cys
350 355 360
CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACC GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC GGC TCC
Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg G1U Cys Glu Ser Gly 5er
365 370 375
TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC AAA
Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys
380 385 390
TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC
Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu íle ser ser cys Thr Val Asp
395 400 405
CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT TGG
Arg Asp Thr Val cys Gly Cys Arg tys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp
410 415 420 425
AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC ACC CTC TGC CTC AAT GGG
Set Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Asn cys Thr Leu Cya Leu Asn Gly
430 435 440
ACC GTG CAC CTC TCC TGT CAG GAG AAA CAG AAC ACC GTC TGC ACC TGC
Thr Val His Leu ser Cys Gin Glu Lys Gin Asn Thr Val Cys Thr Cys
445 450 455
CAT GCA GGT TTC TTT CTA AGA GAA AAC GAG TGT GTC TCC TGT AGT AAC
His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Aan Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn
460 465 470
TGT AAG AAA AGC CTG GAG TGC ACG AAG TTG TCC CTA CCC CAG ATT GAG
Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Ser Leu Pro Gin íle Glu
475 480 485
AAT GIT AAG GGC ACT GAG GAC TCA GGC ACC ACA GCC GGT GCT GCC CCA
Aan Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Ala Gly Ala Ala Pro
490 495 500 505
GGT TGC CCA GAA TGC ACG CTA CAG GAA AAC CCA TTC TTC TCC CAG CCG
Gly Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gin Glu Asn Pro Phe Phe 5er Gin Pro
510 515 520
GGT GCCCCA ATA < CTT 1 CAG 1 TGC j ATG i 3GC 1 rec ' PGC ' CTC [*CT J \GA < SCA 1 TAT
Gly Ala Pro íle Leu Gin Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr
S25 530 535
CCC ACT CCA CTA AGG TCC AAG AAG ACG ATG TTG GTC CAA AAG AAC GTC
Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr ne t Leu val Gin Lys Asn Val
540 545 550
ACC TCA GAG TCC ACT TGC TGT GTA GCT AAA TCA TAT AAC AGG GTC ACA
Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr
555 560 565
GTA ATG GGG GGT TTC AAA GTG GAG AAC CAC ACG GCG TGC CAC TGC AGT
Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cya Ser
570 575 580 585
ACT TGT TAT TAT CAC AAA TCT TAAGGATCCC ' CCGAS
Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
590
Ser 1 Arg Thr Ser Leu Leu Leu 5 Ala Phe Gly Leu 10 Leu cys Leu Fro 15 Trp
Leu Gin Glu Gly Ser Ala Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle
20 25 30
His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr
35 40 45
Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg
50 55 60
Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Axg His
65 70 75 80
Cys Leu Ser Cys Sex Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin val Glu íle
85 90 95
Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn
100 105 110
Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Asn Cys
60 115 120 125
120 Thr Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gin Glu Lys Gin
130 135 140
190
Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu
240 145 150 155 160
295
Cys Val Ser Cys Sex Asn Cys Lys Lys Sex Leu Glu Cys Thr Lys Leu
165 170 175
343 Ser Leu Pro Gin íle Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr
1B0 185 190
391 Thr Ala Gly Ala Ala Pro Gly Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gin Glu Asn
195 200 205
439 Pro Phe Phe Ser Gin Pro Gly Ala Pro íle Leu Gin Cys Met Gly Cys
210 215 220
487 Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met
225 230 235 240
Leu Val Gin Lys Asn Val Thr Ser Glu Sex Thr Cys Cys Val Ala Lys
535 245 250 255
Ser Tyr Asn Arg Val Thr val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His
583 260 265 270
Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
275 280 285
631 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID NO:7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1301 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) RYSY:
(K) MENO/KĽÚČ: CDS (L) UMIESTNENIE: 279..1287 (iv) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:7:
(2) INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID NO:6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 285 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:6:
CTCGAGATGG CTACAGGTAA GCGCCCCTAA AATCCCTTTG GGCACAATGT
GTCCTGAGGG
GAGAGGCAGC GACCTGTAGA TGGGACGGGG GGACTAACCC TCAGGTTTGG
GGCTTCTGAA
120
TGTGAGTATC GCCATGTAAG CCCAGTATTT GGCCAATGTC AGAAAGCTCC
TGGTCCCTGG
180
ÄGtíSATGGAG AGAGAAAAAC AAÄCACCTCC TGGAGCACGG AGAGTGCTGC
CCTCTTGCTC
240
TCCGGCTTCCC TCTGTTGCCC TCTGGTTTCT CCCCAGGC TCC CGG ACG Set Arg Thr
TCC CTG
Ser Leu
290
293
GCC
Ala
TGT Cys
GAC Asp
TCG Ser
TGG Trp
AAA
Lys
TCC
Ser
355
CTC Leu
CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG
Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu
295 300
GAT AGT CTG TGT CCC CAA SGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA
Aap Ser Val cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin
310 315 320
ATT TGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC
íle Cys Cys Thr lys Cya His Lys gly Thr Tyr Leu Tyr
325 330 335
CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG
Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu
340 345 350
TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC ctc AGC
Phe Thr Ala Ser Clu Asn Hi» Leu Arg Hie cya Leu ser
360 365
TGC CGA AAG GAA ATG ggt CAS GTG GAG ATC TCT TCT TGC
Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin val G1U íle Ser Sex Cya
375 380
CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG
Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg
390 395 400
AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC AGC CTC TGC
Ser Glu Asn Leu P.ie Gin cys Phe Asn Cys Ser Leu Cya
405 410 415
GGC AGT
Gly Ser
305
AAT AAT Asn Asn
AAT GAC Asn Asp
AGC GGC Ser Gly
TGC TCC Cys Ser
ACA GTG Thr Val 385
CAT TAT his Tyr
CTC AAT Leu Asn
341
389
437
405
533
581
629
677
Leu Gin Glu Gly Ser Ala Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr
20 25 30
His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly
35 40 45
Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Aap Cys
50 55 60
Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg
65 70 75
Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cya Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu
85 90 95
Ser Ser cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys
100 105 110
Gin Tyr Arg His Tyr trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Asn
115 120 125
Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His leu Ser Cys Gin Glu Lys
130 135 140
Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn
L45 150 155
Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys
165 170 175
Cys Leu Pro Gin íle Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly
180 185 190
Thr Ala Gly Ala Gly Pro Arg Cys Arg Pro íle Asn Ala Thr Leu
195 200 205
Val Glu Lys Glu Gly Cya Pro Val cys íle Thr Val Asn Thr Thr
210
215
220 íle
Thr
Arg
His íle
Asn
Cys
Gin
Glu
160
Leu
Thr
Ala
11«
GGG ACC Gly
Thr
420
Cys Ala
225
Gly Tyr
Cys
Pro Thr
230
Met
Thr Arg
Val
235
Leu Gin Gly val
TGC
Cys
435
CAT
H1S
AAC Asn
TGT
Cys
GAG AAT Glu Asn
CCA CGG Pro Arg
TGC CCC
Cys Pro
500
GTG CAC CTC TCC TGC CAG GAG AAA CAG AAC ACC GTG TGC ACC
725
Val His Leu Sar Cys Cln Glu Lys Gin Asn Thr Val Cys 1 Thr
425 430 Pro Ala Leu Pro Gin Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe
245 250 255
GCA GGT TTC TTT CTA AGA GAA AAC GAG TGT GTC TCC TGT . AGT 773
Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu cys Val Ser Cys Ser Ser íle Arg Leu Pro Gly Cya Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val
440 445 450 260 265 270
AAG Lys AAA Ly. AGC Ser 455 CTG Leu GAG Glu TGC Cys ACG Thx AAG Lys 460 TTG Leu TGC Cys CTA Leu CCC Pro CAG Gin 465 ATT íle 821 Tyr Ala Val 275 Ala Leu Ser Cys Gin 280 Cys Ala Leu Cya Arg Arg 285 Ser
GTT val AAG Lys 470 GGC Gly ACT Thr GAG Glu GAC Αβρ TCA ser 475 GGC Gly ACC Thr ACA Thr GCT Ala GGT Gly 480 GCT Ala GGT Gly 86» Thr Asp 290 Cys Gly Gly Pro Lys 295 Asp His Pro Leu Thr 300 Cys Asp Asp
TGC CGC CCC ATC AAT GCC ACC CTG GCT GTG GAG AAG GAG GGC 917 Arg Phe Gin Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
Cys Arg Pro íle Asn Ala Thr Leu Ala val Glu Ly· Glu Gly 305 310 315
485 490 495
Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro íle Leu Pre
GTG TGC ATC ACC GTC AAC ACC ACC ATC TGT GCC GGT TAC TGC 965 325 330 335
Val Cys íle Thr Val Asn Thr Thr íle Cya Ala Gly Tyt Cys
Glu
Ser
Thr
Pro
Gin
505
510
Leu
240
Pro
320
CCC ACC Pro Thr 515 ATG Met ACC CGC Thr Atg CTG CTG CAG GGG GTC CTG CCG GCC CTG CCT CAG 1013
Val 520 Leu Gin Gly Val Leu 525 Pro Ala Leu Pro Gin 530
CTG GTG TGC AAC TAC CGC GAT GTG CGC TTC GAG TCC ATC CGG CTC CCT 1061
Val Val Cys Asn Tyr Arg Aap Val Arg Phe Glu Ser íle Arg Leu Pro
535 540 545
GGC TGC CCG CGC GGC GTG AAC CCC GTG GTC TCC TAC GCC GTG GCT CTC 1109
Gly Cys pro Arg Gly val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu
550 555 560
AGC TGT CAA TGT GCA CTC TGC CGC CGC AGC ACC ACT GAC TGC GGG GGT 1157
Ser Cys Gin Cys Ala Leu cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly
565 570 575
CCC AAG GAC CAC CCC TTG ACC TCT GAT GAC CCC CGC TTC CAG GAC TCC 1205
PrD Lys Asp His Pro Leu Thr cys Asp Aap pro Arg Phe Gin Asp Ser
580 585 590
TCT TCC TCA AAG GCC CCT CCC CCC AGC CTT CCA AGC CCA TCC CGA CTC L253
Ser Set Ser Lya Al* Pro Pro Pro Ser Leu pro Ser Pro ser Arg Leu
595 600 605 610
CCG GGG CCC TCG GAC ACC CCG ATC CTC CCA CAA T AAGGATCCCT CGAG 1301
Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pre íle Leu Pro Gin
615
620 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID NO:9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:9:
Ala Gly Ala Ala Pro Gly
5 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID NO:10 .
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID NO:8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 336 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLÓGIA: lineárna (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 4 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselina (B) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ii) TYP MOLEKULY: proteín (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:8:
(iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 10:
Ala Gly Ala Gly
Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys 1 S IC
Leu Pro Trp 15 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID NO:11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE;
(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 11:
TTTTCTCGAG ATGGCTACAG GTAAGCGCCC 30 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO: 12:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 39 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (B) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 12:
ACCTGGGGCA GCACCGGCAC AGGAGACACA
CTCGTTTTC 39 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO:13:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 42 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 13:
TGTGCCGGTG CTGCCCCAGG TTGCCCAGAA
TGCACGCTAC AG 42 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO: 14:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 14:
TTTTGGATCC TTAAGATTTG TGATAATAAC
AAGTAC 36 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII IDNO:15:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 39 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 15:
CCGTGGACCA GCACCAGCAC AGGAGACACA
CTCGTTTTC 39 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO: 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:16:
TGTGCTGGTG CTGGTCCACG GTGCCGCCCC ATCAAT 36 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO: 17:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 17:
TTTTGGATCC TTATTGTGGG AGGATCGGGG TG 32 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO: 18:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 27 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA; lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 18:
TTTTAGATCT CTTCTTGCAC AGTGGAC 27 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO: 19:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNK (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 19:
TGTGGTGCCT GAGTCCTCAG T 21 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO:20:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 41 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:20:
ACTGAGGACT CAGGCACCAC AGCCGGTGCT GCCCCAGGTTG 41 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO:21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 29 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÔGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:21: TTTTTCTAGA GAAGCAGCAG CAGCCCATG 29 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID NO:22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 75 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jednoreťazcová (D) TOPOLÔGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNK (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:22:
TTTTCCACAG CCAGGGTGGC ATTGATGGGG CGGCACCGTG GACCAGCACC AGCTGTGGTG 60 CCTGAGTCCT CAGTG 75

Claims (19)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Hybridný proteín zložený z dvoch koexprimovaných aminokyselinových sekvencii tvoriacich dimér, z ktorých každá obsahuje:
    a) aspoň jednu aminokyselinová sekvenciu z nasledujúcich homomémy receptor, reťazec heteromémeho receptora, ligand alebo ich fragmenty, ktoré si zachovali schopnosť väzby ligand-receptor,
    b) subjednotku heterodimémeho proteínového hormónu alebo jeho fragmentu, ktorý si zachováva schopnosť formovať heterodimér s rovnakou podjednotkou, kde sekvencia (a) a (b) sú naviazané priamo alebo cez peptidový linker a kde sekvencia (b) v každej z menovaných koexprimovaných sekvencii je schopná agregácie za vzniku dimémeho komplexu.
  2. 2. Hybridný proteín podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sekvencia (a) je jednou z nasledujúcej skupiny extraceluláma doména TNF receptora 1 - TBP1, extraceluláma doména TNF receptora 2 - TBP2 alebo ich fragmenty stále obsahujúce doménu viažucu ligand, extracelulámu doménu IFN α/β receptora alebo IFNy receptora, receptora pre gonadotropín alebo jeho extracelulámeho fragmentu, ľahkého reťazca protilátky alebo jeho fragmentu, voliteľne asociovanej so zodpovedajúcim ťažkým reťazcom, ťažkého reťazca protilátky alebo jeho fragmentu, Fab fragmentu protilátky a IL-6, rastový faktor alebo hormón iný ako gonadotropín IFN-β, TPO alebo ich fragmenty.
  3. 3. Hybridný proteín podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým,že sekvencia (b) je jednou z nasledujúcej skupiny signálny peptid ľudského rastového hormónu - hCG alebo hybridné heterodiméme proteíny vytvorené medzi dvomi polypeptidickými reťazcami tvoriacimi komplex, ako sú FSH, LH, TSH alebo inhibín a ich fragmenty.
  4. 4. Hybridný proteín podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sekvencia (a) je napojená na amino koniec sekvencie (b).
  5. 5. Hybridný proteín podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sekvencia (a) je napojená na karboxy koniec sekvencie (b).
  6. 6. Hybridný proteín podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obidve koexprimované aminokyselinové sekvencie obsahujú sekvencie pre TBP1 alebo jeho fragment zodpovedajúci aminokyselinovým zvyškom 20-161 alebo 20-190 TBP1, ako sekvencia (a) a zodpovedajúce α a β podjednotky hCG alebo jeho fragmenty ako sekvencia (b).
  7. 7. Hybridný proteín podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým,že obidve koexprimované aminokyselinové sekvencie obsahujú extracelulámu doménu receptora pre gonadotropín ako sekvencia (a) a zodpovedajúce α a β podjednotky gonadotropínu ako sekvencia (b).
  8. 8. Hybridný proteín podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že sekvencia (a) je extraceluláma doména FSH receptora a sekvencia (b) je podjednotka FSH.
  9. 9. Hybridný proteín podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že sekvencie (a) a (b) sú napojené peptidovým linkerom.
  10. 10. Hybridný proteín podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že peptidový linker obsahuje štiepiace miesto pre enzým.
  11. 11. Hybridný proteín podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že štiepiace miesto pre enzým je štiepiace miesto pre trombín.
  12. 12. Hybridný proteín podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že štiepiace miesto pre enzým je rozlišované a štiepené enzýmom, ktorý sa nachádza vo vaječníkoch.
  13. 13. Hybridný proteín podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že peptidový linker slúži ako flexibilný pánt.
  14. 14. Hybridný proteín podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že medzi dve podjednotky (b) je pridaná jedna alebo viac kovalcntných väzieb.
  15. 15. Molekula DNA, vyznačujúcasa t ý m , že kóduje hybridný proteín podľa nároku 1.
  16. 16. Expresný vektor, vyznačujúcisa t ý m , že obsahuje molekulu DNA podľa nároku 15.
  17. 17. Hostiteľská bunka, vyznačujúcasa t ý m , že obsahuje expresný vektor podľa nároku 16 a je schopná exprimovať hybridný proteín.
  18. 18. Spôsob produkcie hybridného proteínu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu hostiteľských buniek podľa nároku 17 a extrakciu nimi exprimovaného hybridného proteínu.
  19. 19. Farmaceutická zmes, vyznačujúca sa tým, že obsahuje hybridný proteín podľa nároku 1 a farmaceutický prijateľný nosič a/alebo vehikulum.
SK1148-98A 1996-02-20 1997-02-20 Hybridný proteín tvoriaci heterodimér, molekula DNA, expresný vektor, hostiteľská bunka, spôsob produkcie hybridného proteínu a farmaceutická zmes SK282326B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1193696P 1996-02-20 1996-02-20
PCT/US1997/002315 WO1997030161A1 (en) 1996-02-20 1997-02-20 Hybrid proteins which form heterodimers

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK114898A3 SK114898A3 (en) 1999-07-12
SK282326B6 true SK282326B6 (sk) 2002-01-07

Family

ID=21752599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1148-98A SK282326B6 (sk) 1996-02-20 1997-02-20 Hybridný proteín tvoriaci heterodimér, molekula DNA, expresný vektor, hostiteľská bunka, spôsob produkcie hybridného proteínu a farmaceutická zmes

Country Status (25)

Country Link
US (5) US6193972B1 (sk)
EP (1) EP0894141B1 (sk)
JP (2) JP4140927B2 (sk)
KR (1) KR100369985B1 (sk)
CN (1) CN1261579C (sk)
AT (1) ATE295887T1 (sk)
AU (1) AU706504B2 (sk)
BG (1) BG64510B1 (sk)
BR (1) BR9707589A (sk)
CA (1) CA2245877C (sk)
CZ (1) CZ291212B6 (sk)
DE (1) DE69733309T2 (sk)
DK (1) DK0894141T3 (sk)
EA (1) EA002474B1 (sk)
EE (1) EE04025B1 (sk)
ES (1) ES2241040T3 (sk)
HU (1) HUP9900619A3 (sk)
IL (1) IL125864A (sk)
NO (1) NO321777B1 (sk)
NZ (1) NZ331539A (sk)
PL (1) PL187400B1 (sk)
PT (1) PT894141E (sk)
SK (1) SK282326B6 (sk)
UA (1) UA52646C2 (sk)
WO (1) WO1997030161A1 (sk)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUP9900619A3 (en) * 1996-02-20 2001-11-28 Applied Research Systems Hybrid proteins which form heterodimers
US6635740B1 (en) * 1997-03-27 2003-10-21 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Ligand/lytic peptide compositions and methods of use
CA2301846A1 (en) 1997-09-04 1999-03-11 Gryphon Sciences Modular protein libraries and methods of preparation
EA006605B1 (ru) * 2000-02-22 2006-02-24 Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО чХГ
US20030228600A1 (en) * 2000-07-14 2003-12-11 Eppendorf 5 Prime, Inc. DNA isolation method and kit
IL147414A0 (en) * 2001-12-31 2002-08-14 Yeda Res & Dev Ifnar2 mutants, their production and use
US20030157091A1 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 Dyax Corporation Multi-functional proteins
DE10247755B4 (de) * 2002-10-14 2006-01-19 Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine
BRPI0507174A (pt) * 2004-01-28 2008-04-01 Syntonix Pharmaceuticals Inc proteìnas de fusão hormÈnio-fc (fsh-fc) heterodiméricas estimuladoras de folìculo para o tratamento da infertilidade
WO2006067210A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Laboratoires Serono S.A. Bcma polypeptides and uses thereof
US7691611B2 (en) 2005-06-03 2010-04-06 Ares Trading S.A. Production of recombinant IL-18 binding protein
EP2200634B1 (en) * 2007-09-21 2015-02-11 The Regents of The University of California Targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
CN101960014B (zh) * 2008-02-01 2013-10-16 克罗莫塞尔公司 细胞系以及制备和使用其的方法
CN102002495B (zh) * 2009-08-31 2012-07-18 成都蓉生药业有限责任公司 用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达框、表达载体及制备方法
CN107840894A (zh) * 2011-03-25 2018-03-27 格兰马克药品股份有限公司 异二聚体免疫球蛋白
CA2901226C (en) 2013-02-18 2020-11-17 Vegenics Pty Limited Vascular endothelial growth factor binding proteins
JP7439372B2 (ja) * 2018-06-21 2024-02-28 シャタック ラボ，インコーポレイテッド ヘテロ二量体タンパク質及びその使用
KR20220012256A (ko) * 2019-05-24 2022-02-03 프로비바 테라퓨틱스 (홍콩) 리미티드 Il-2 조성물 및 이의 사용 방법

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0325224B1 (en) * 1988-01-22 1996-07-31 ZymoGenetics, Inc. Methods of producing secreted receptor analogs
US6225449B1 (en) * 1991-10-04 2001-05-01 Washington University Hormone analogs with multiple CTP extensions
US5705478A (en) * 1989-02-21 1998-01-06 Washington University Covalently linked β subunits of the glycoprotein hormones as antagonists
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
IL99120A0 (en) * 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5932448A (en) * 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
NZ251820A (en) 1992-03-30 1996-07-26 Immunex Corp Fusion proteins with tnf-r (tumour necrosis factor-receptor) peptide linked to another tnf-r or an il-1r (interleukin-1-receptor) peptide
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
IL111125A0 (en) * 1994-05-11 1994-12-29 Yeda Res & Dev Soluble oligomeric tnf/ngf super family ligand receptors and their use
HUP9900619A3 (en) * 1996-02-20 2001-11-28 Applied Research Systems Hybrid proteins which form heterodimers
US6194177B1 (en) * 1996-02-20 2001-02-27 Applied Research Systems Ars Holding N.V. DNA encoding a hybrid heterodimeric protein

Also Published As

Publication number Publication date
US6663867B2 (en) 2003-12-16
HUP9900619A2 (hu) 1999-06-28
EP0894141B1 (en) 2005-05-18
US20100075402A1 (en) 2010-03-25
NZ331539A (en) 2000-01-28
DK0894141T3 (da) 2005-08-22
WO1997030161A1 (en) 1997-08-21
BR9707589A (pt) 2000-01-04
SK114898A3 (en) 1999-07-12
JP4140927B2 (ja) 2008-08-27
EE9800256A (et) 1999-02-15
KR100369985B1 (ko) 2004-03-26
BG64510B1 (bg) 2005-05-31
DE69733309D1 (de) 2005-06-23
EE04025B1 (et) 2003-04-15
JP2000504586A (ja) 2000-04-18
KR19990082482A (ko) 1999-11-25
DE69733309T2 (de) 2006-01-19
PL328454A1 (en) 1999-02-01
JP2008019258A (ja) 2008-01-31
CA2245877A1 (en) 1997-08-21
ATE295887T1 (de) 2005-06-15
IL125864A (en) 2007-07-04
HUP9900619A3 (en) 2001-11-28
CZ291212B6 (cs) 2003-01-15
US20090240039A1 (en) 2009-09-24
US7291339B2 (en) 2007-11-06
AU2125297A (en) 1997-09-02
PT894141E (pt) 2005-09-30
AU706504B2 (en) 1999-06-17
EA199800744A1 (ru) 1999-02-25
US20040230034A1 (en) 2004-11-18
NO983799L (no) 1998-10-19
NO321777B1 (no) 2006-07-03
CN1212017A (zh) 1999-03-24
ES2241040T3 (es) 2005-10-16
US6193972B1 (en) 2001-02-27
EA002474B1 (ru) 2002-06-27
US20010014333A1 (en) 2001-08-16
CN1261579C (zh) 2006-06-28
UA52646C2 (uk) 2003-01-15
CZ264498A3 (cs) 1998-12-16
EP0894141A1 (en) 1999-02-03
IL125864A0 (en) 1999-04-11
NO983799D0 (no) 1998-08-19
CA2245877C (en) 2013-09-03
PL187400B1 (pl) 2004-06-30
BG102705A (en) 1999-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20100075402A1 (en) DNA coding for polypeptide fusion
US6194177B1 (en) DNA encoding a hybrid heterodimeric protein
EP1032688B1 (en) Single-chain bifunctional glycoprotein hormones
AU6633194A (en) Modified protein and peptide pharmaceuticals
KR20220025698A (ko) 다기능 융합 단백질 및 이의 용도
HU227311B1 (en) Single-chain forms of the glycoprotein hormone quartet
US20050250185A1 (en) OGH fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
US20040220088A1 (en) Multiple domain glycoprotein hormones and methods of using
EP1541689B1 (en) Hybrid proteins which form heterodimers
WO2005058953A2 (en) Ogh fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
Ashkenazi et al. Immunoadhesins: an alternative to human monoclonal antibodies
JP2000508164A (ja) Ｉｌ―６変異蛋白質
IL183048A (en) Trail polypeptide receptor and DNA encoded by it