NO321777B1 - Hybridproteiner som danner heterodimerer, DNA, ekspresjonsvektorer og vertsceller som koder for eller uttrykker disse, samt farmasoytisk sammensetning og anvendelse av hybridproteinene for fremstilling av et medikament for behandling av humane lidelser med behov for inhibering av TNF. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et hybridprotein omfattende to kouttrykte aminosyresekvenser som danner en dimer, i det hver omfatter: a) minst en arninosyresekvens valgt fra en homomerisk reseptor, en kjede av en heteromerisk reseptor, og fragmenter derav; og b) en subenhet av et heterodimerisk proteinholdig hormon eller fragmenter derav; hvor (a) og (b) er bundet direkte eller gjennom en peptidbinding, og, i hvert par, er de to

subenhetene (b) forskjellige og har evne til aggregering for å danne et dimerkompleks.

Oppfinnelsen angår videre et DNA-molekyl, en ekspresjonsvektor og en vertscelle inneholdende DNA-molekylet som koder for hybridproteinet. I tillegg angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling og en farmasøytisk sammensetning, samt anvendelse av hybridproteinet til fremstilling av et medikament spesielt for behandling av lidelser med behov for inhibering av TNF.

Protein-protein interaksjoner er vesentlige for normale fysiologiske funksjoner av celler og multicellulære organismer. Mange proteiner i naturen utviser nye eller optimale funksjoner når kompleksbundet med en eller flere andre proteinkjeder. Dette blir illustrert ved forskjellige ligandreseptor kombinasjoner som bidrar med regulering av den cellulære aktiviteten. Visse ligander, så som tumornekrosefaktor a (TNFa), TNFfi eller human chorionisk gonadotropin (hCG), oppstår som multi-subenhet komplekser. Noen av disse kompleksene inneholder multiple kopier av samme subenhet. TNFa og TNFfi (kollektivt referert til nedenfor som TNF) er homodimerer dannet av tre identiske subenheter (1-4). Andre ligander består av ikke-identiske subenheter. For eksempel er hCG en heterodimer (5-7). Reseptorer kan også oppstå eller virke som multi-kjedekomplekser. For eksempel transduserer reseptorer for TNF et signal etter at det er blitt aggregert for å danne dimerer (8,9). Ligander til disse reseptorene fremmer aggregering av to eller tre reseptorkjeder og tilveiebringer følgelig en mekanisme for reseptoraktivering. For eksempel aktiverer TNF-mediert aggregering TNF reseptorene (10-12).

Modulering av protein-protein interaksjoner kan være en nyttig mekanisme for terapeutisk intervensjon i forskjellige sykdommer og patologjer. Oppløselige bindingsproteiner som kan reagere med ligander kan potensielt avlede liganden bort fra reseptoren og derved redusere aktiveringen av den bestemte reseptorreaksjonsveien. Alternativt kan sekvestrering av liganden forsinke dets elimering eller degradering og derved øke dets virkningsvarighet, og kanskje dets tilsynelatende aktivitet in vivo. Når det gjelder TNF har oppløselige TNF reseptorer hovedsakelig vært assosiert med inhibisjon av TNF aktiviteten (13-17).

Oppløselige bindingsproteiner kan være nyttige for behandling av humane sykdommer. For eksempel er det blitt vist at oppløselige TNF reseptorer er effektive i dyremodeller forartritt(18,19).

På grunn av at TNF har 3 bindingsseter for dets reseptor (10-12) og dimerisering av celleoverflatereseptoren er tilstrekkelig for bioaktivitet (8,9), er det sannsynlig at binding av en enkelt oppløselig reseptor til TNF vil åpne for muligheten av at dette 1:3 komplekset av oppløselig reseptonTNF (trimer) fortsatt kan binde og aktivere et par av celleoverflate TNF reseptorer. For å oppnå en inbibitorisk effekt er det ventet at to av reseptorbindingssetene på TNF trimeren må være okkupert eller blokkert av oppløselig bindingsprotein. Alternativt kan bindingsproteinet blokkere den riktige orienteringen av TNF på celleoverflaten.

Det var et behov for syntetisering av proteiner som inneholder to reseptor (eller ligander) kjeder, som dimerisk hybridprotein. Se Wallach et al., US-PS 5.478.925.

Den primære strategien anvendt for dannelse av dimeriske eller multimeriske hybridproteiner, inneholdende bindingsdomener fra ekstracellulære reseptorer, har vært å fusjonere disse proteinene til de konstante regionene av antistoff tungkjeden.

Denne strategien førte for eksempel til konstruksjon av CD4 immunadhesiner (20). Disse er hybridmolekyler bestående av først to (eller alle fire) immunoglobulin-lignende domenene til CD4 fusjonert ril den konstante regionen av antistoff tung og lett kjeder. Denne strategien for dannelse av hybridmolekyler ble tilpasset til reseptorer for TNF (10,16,21) og førte til dannelsen av konstruksjoner med høyere in vitro aktivitet enn monomeriske oppløselige bindingsproteiner.

Det er kjent at høyere in vitro potens til dimeriske fusjonsproteiner kan føre til høyere in vivo aktivitet. En studie understøtter dette og viser en minst 50-ganger høyere aktivitet for et p75(TBP2)-Ig fusjonsprotein når det gjelder å beskytte mus fra konsekvensene av intravenøs LPS injeksjon (16).

Til tross for den omfattende anvendelsen av immunoglobulmfusjonsproteiner har denne strategien flere ulemper. En er at visse immunoglobulin Fc domener deltar i effektorfunksjoner i immunsystemet. Disse funksjonene kan være uønsket i et bestemt terapeutisk oppsett (22).

En andre begrensning vedrører de spesielle tilfellene hvor det er ønskelig å produsere heteromeriske fusjonsproteiner, for eksempel oppløselige analoger av heteromeriske EL-6 eller type I interferonreseptorer. Til tross for at det er en mengde fremgangsmåter for produsering av bifunksjonelle antistoffer (for eksempel ved kotransfeksjon eller hybridomfusjoner), er effektiviteten til syntesen sterkt redusert ved blanding av homodimerer og heteredimerer som vanligvis oppstår (23). Nylig har det vært flere rapporter som beskriver anvendelse av leucin zipper motiver for å rettlede oppstilling av heterodimerer (24-26). Dette ser ut til å være en lovende metode for forskningsformål, men den ikke-native eller de intracellulære sekvensene anvendt behøver ikke å være egnede for kroniske applikasjoner i klinikken på grunn av antigenisitet. Effektiviteten til oppstilling og stabilitetspostoppstilling kan også være begrensende.

I det spesielle tilfellet med TNF reseptorer er visse modifikasjoner på pS5 TNF reseptoren funnet å lette homodimerisering og signalisering i fråvær av ligand (27,28). Det er blitt oppdaget at en cytoplasmisk region av reseptoren, betegnet "død domene", kan virke som et homodimeriseringsmotiv (28,30). Som et alternativ til et immunoglobulin hybridprotein kan fusjon av ekstracellulære domener til TNF reseptoren til dets cytoplasmiske død domene resultere i et utskilt protein som kan dimerisere i fravær av TNF. Slike fusjonsproteiner er blitt beskrevet og krevd i internasjonal patentsøknad W09S/31S44.

En tredje ytterligere strategi anvendt for å danne dimerer av oppløselige TNF reseptorer har vært å kjemisk kryssbinde monomeriske proteiner med polyetylenglykol (31).

Et alternativ for oppnåelse av slike dimeriske proteiner som tilveiebringer visse fordeler og er gjenstand for foreliggende oppfinnelse og består av å anvende en naturlig heterodimerisk plattform som tilsvarer et sirkulerende ikke-immunoglobulin protein med en lang halveringstid. Et foretrukket ekser ipel er hCG, et protein som blir godt utskilt, har god stabilitet og har en lang halveringstid (32-33). På grunn av hCG lovende rolle som en markør for graviditet er mange reagenser blitt utviklet for å kvantifisere og studere proteinet in vitro og in vivo. hCG er videre omfattende blitt studert ved anvendelse av mutagenese, og det er kjent at små delesjoner i proteinet, så som fjerning av 5 residier ved ekstrem karboksyl-terminus av a subenheten effektivt kan eliminere dets biologiske aktivitet og konservere dets evne til å danne heterodimer (34,35). Små innskudd, på opptil 30 aminosyrer, er blitt vist å bli tolerert ved amino- og karboksyl-terminien til a subenhet (36), mens fusjon av a subenheten til karboksylterminusen av B subenheten også hadde liten effekt på heterodimer dannelsen (37).

En analog av hCG hvor en immunoglobulin Fc domene var fusjonert til C-teiminusen av hCG B subenheten er også blitt rapportert, men denne konstruksjonen ble ikke utskilt og det ble heller ikke forsøkt å kombinere denne med en a subenhet (38).

Hovedhensikten ifølge foreliggende oppfinnelse er derfor et hybridprotein omfattende a) minst en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av en homomerisk reseptor, en kjede av en heteromerisk reseptor og fragmenter derav som har beholdt Iigand-reseptor bindende evne; og b) en subenhet av et heterodimerisk proteinholdig hormon, eller fragmenter derav som har beholdt subenhetens evne til å danne en heterodimer med andre subenheter derav; hvori sekvensene (a) og (b) er bundet direkte eller gjennom en peptidlinker, og hvor sekvensen (b) i hver av nevnte to kouttrykte sekvenser har evne til å aggregere for å danne et dimerkompleks.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan linkeren være enzymatisk spaltbar.

Sekvens (a) blir fortrinnsvis valgt blant: den ekstracellulære domenen til TNF reseptor 1 (SS kDa, også betegnet TBP1), den ekstracellulære domenen til TNF reseptor 2 (75 kDa, også betegnet TBP2), eller fragmenter derav som fortsatt inneholder ligand bindende domene; de ekstracellulære domenene til IL-6 reseptorene (også betegnet gp80 og gpl30); den ekstracellulære domenen til IFN a/B reseptoren eller IFN y reseptoren; en gonadotropin reseptor eller dets ekstracellulære fragmenter; antistoff lettkjeder, eller fragmenter derav, eventuelt assosiert med respektive tunge kjeder; antistoff tunge kjeder eller fragmenter derav, eventuelt assosiert med respektive lette kjeder; antistoff fab domener; eller ligandproteiner, så som cytokiner, vekstfaktorer eller hormoner forskjellige fra gonadotropiner, spesifikke eksempler innbefatter IL-6, IFN-B, TPO eller fragmenter derav.

Sekvens (b) blir fortrinnsvis valgt blant en hCG, FSH, LH, TSH eller inhibin subenhet eller fragmenter derav.

Modifikasjoner på proteiner, så som kjemisk eller proteasespaltning av proteinskjelett, eller kjemisk eller enzymatisk modifikasjon av visse aminosyresidekjeder kan bli anvendt for å gjøre komponentene av hybridproteinet til oppfinnelsen inaktive. Denne begrensningen i aktiviteten kan også bli oppnådd ved anvendelse av rekombinante DNA teknikker for å endre den kodende sekvensen for hybridproteinet på en måte som resulterer direkte i begrensning av aktiviteten til en komponent, eller som gjør proteinet mer mottagelig for påfølgende kjemisk eller enzymatisk modifikasjon.

Ovennevnte hybridproteiner vil resultere i monofunksjonelle, bifunksjonelle eller multifunksjonelle molekyler, avhengig av aminosyresekvensene (a) som blir kombinert med (b). I hvert par kan (a) bli koblet til ammoterminal ende eller til karboksyterminal ende av (b), eller til begge.

Et monoklonale hybridprotein ifølge foreliggende oppfinnelse kan blant annet omfatte den ekstracellulære domenen til en gonadotropinreseptor koblet til en av de tilsvarende reseptorbindende gonadotropin subenhetene. Ifølge en slik utførelsesfbrm kan hybridproteinet ifølge oppfinnelsen være et molekyl hvor for eksempel FSH reseptor ekstracellulære domene er koblet til FSH for å øke plasmahalveringstiden og forbedre den biologiske aktiviteten.

Denne prepareringen kan bli anvendt for å indusere follikulær modning i assisterte formeringsmetoder, så som ovuleringsinduksjon eller in vitro fertilisering, og å virke som et middel for å dramatisk amplifisere den biologiske aktiviteten til hormonet som er vesentlig for vellykket fremgangsmåte og følgelig redusere kravet for både selve hormonet og antall injeksjoner for å oppnå ovulasjon.

FSH reseptoren og produksjonen av ekstracellulær domene til human FSH reseptor er blitt beskrevet i henholdsvis WO 92/16620 og WO 96/38575.

Ifølge en spesiell utførelsesfbrm kan den ekstracellulære domenen til FSH reseptoren (ECD) bli fusjonert i ramme med en peptidlinker som inneholder trombin gjenkjemielses-/spaltningssetet (29) og representerer en "tethered" arm. Peptidlinkeren kobler den ekstracellulære domenen av FSH til en FSH subenhet. Dette vil muliggjøre fjerning av den ekstracellulære domenen av FSH reseptoren ved spaltning ved trombinspaltningssetet når molekylet kommer i kontakt med trombin i systemisk . sirkulasjon.

I en annen utførelsesfbrm blir det i stedenfor trombin spaltningssetet anvendt et enzymgjenkjennelsessete for et enzym som finnes i store mengder i ovariene. På denne måten vil ECD-FSH molekylet vandre til ovariene når eksponert for enzymer tilstede i de høyeste konsentrasjonene i vevet og ECD vil bli fjernet slik at FSH kan reagere med den membranbundne reseptoren.

I en annen utførelsesfbrm blir istedenfor et enzymgj enkj enningssete, en fleksibel hengselsregion klonet mellom ECD og FSH slik at ECD ikke vil bli fjernet enzymatisk fra hormonet. På denne måten, når ECD-FSH molekylet kommer til ovarien vil en konkurranse bli etablert mellom hengselskoblet ECD og ECD til FSH reseptoren tilstede på ovariecellemembranen.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen består hybridproteinet av aggregeringen mellom et par aa sekvenser, i det en inneholder TBP1 (eller fragmenter fra aa 20 til aa 161 eller til aa 190) som (a) og a enheten til hCG som (b), og den andre inneholder alltid TBP1 (eller samme fragmenter som ovenfor) i det (a) og B subenheten til hCG, eller fragmenter derav som (b). Ifølge denne utførelsesformen, avhengig av den bestemte sekvensen som blir valgt som (b) (hele 6 subenheten til hCG, eller fragmenter eller modifikasjoner derav), vil det resulterende hybridproteinet ha en aktivitet (bare den til TBP1) eller en kombinasjon av aktiviteter (den til TBP1 med den til hCG). I dette sistenevnte tilfellet kan hybridproteinet bli anvendt for eksempel for kombinert behandling av Kapsoid sarkoma og metabolisk "wasting" i AIDS.

I en ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir en eller flere kovalente bindinger mellom de to subenhetene (b) tilsatt for å forsterke stabiliteten av det resulterende hybridproteinet. Dette kan for eksempel bli utført ved tilsetning av en eller flere ikke-native interkjede-disulfidbindinger. Setene for disse kryssbindingene kan bli utledet fra de kjente strukturene til heterodimeriske hormoner. For eksempel vil et egnet sete i hCG være å plassere cysteinresidier ved a subenhet residiet Lys45 og B subenhetresidiet Glu2l, med erstatning av en saltbro (ikke kovalent binding) med en disulfidbinding (kovalent binding). En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er PEGylerte eller andre kjemiske modifiserte former av hybridproteinene.

En ytterligere hensikt ifølge oppfinnelsen er et DNA molekyl omfattende DNA sekvensen kodende for ovennevnte hybridprotein, samt nukleotidsekvenser som er vesentlig de samme. "Nukleotidsekvenser vesentlig like" innbefatter alle andre nukleinsyresekvenser som i kraft av degenerasjonen til den genetiske koden også koder for den gitte aminosyresekvensen.

For produksjon av hybridproteinet ifølge oppfinnelsen blir DNA sekvensen (a) oppnådd fra eksisterende kloner, som (b). DNA sekvensen kodende for ønsket sekvens (a) blir ligert med DNA sekvensen som koder for ønsket sekvens (b). To av disse fusjonerte produktene blir skutt inn og ligert inn i et egnet plasmid eller hver inn i et annet plasmid. Når dannet blir ekspresjonsvektoren, eller de to ekspresjonsvektorene, innført i en egnet vertscelle, som deretter uttrykker vektoren (ene) for å tilveiebringe hybridproteinet ifølge oppfinnelsen som definert ovenfor.

Foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av hybridet ifølge oppfinnelsen er ved PCR teknologi ved anvendelse av oligonukleotider spesifikke for de ønskede sekvensene som skal bli kopiert fra kloner kodende for sekvensene (a) og (b).

Ekspresjon av hvilke som helst av rekombinante proteiner ifølge oppfinnelsen som nevnt heri kan bli oppnådd i eukaryote celler (for eksempel gjær, insekt eller pattedyrceller) eller prokaryote celler, ved anvendelse av hensiktsmessige ekspresjonsvektorer. En hvilken som helst fremgangsmåte kjent innenfor fagområdet kan bli anvendt.

For eksempel blir DNA molekylene kodende for proteinene oppnådd ifølge hvilke som helst av ovennevnte fremgangsmåter skutt inn i hensiktsmessige konstruerte ekspresjonsvektorer ifølge teknikker som er velkjente innenfor fagområdet (se Sambrook et al, 1989). Dobbelttrådet cDNA blir koblet til plasmidvektorer ved homopolymerisk tailing eller ved restriksjonskobling som innbefatter anvendelse av syntetiske DNA linkere eller butt-endede ligeringsteknikker: DNA ligaser ble anvendt for å ligere DNA molekyler og uønsket kobling blir unngått ved behandling med alkalisk fosfatase.

For å kunne uttrykke ønsket protein bør ekspresjonsvektoren omfatte også spesifikke nukleotidsekvenser inneholdende transkripsjonen og translasjonen* regulatorisk informasjon koblet til DNA kodende for ønsket protein på en slik måte for å muliggjøre genekspresjon og produksjon av proteinet. For at genet skal bli transkribert må det være en promoter som kan gjenkjennes av RNA polymerase foran dette som polymerasen bindes til og følgelig initierer transkripsjonsprosessen. Det eksisterer forskjellige slike promotere som er effektive i forskjellig grad (sterke og svake promotere).

For eukaryote verter kan forskjellige transkripsjonene og translasjonelle regulatoriske sekvenser bli anvendt, avhenger av naturen til verten. De kan være avledet fra virale kilder, så som adenovims, bovint papilloma virus, Simian virus eller lignende, hvor de regulatoriske signalene er assosiert med et bestemt gen som har et høyt ekspresjonsnivå. Eksempler er TK promoteren til herpes virus, SV40 tidlig promoter, gjær gall4 genpromoter osv. Transkripsjonelle initieringsregulatoriske signaler kan bli valgt som muliggjør represjon og aktivering slik at ekspresjonen av genene kan bli modulert.

DNA molekylet omfatter nukleotidsekvensen kodende for hybridproteinet ifølge oppfinnelsen blir skutt inn i en vektor (er) som har operabelt koblede transkripsjonelle og trranslasjonelle regulatoriske signaler, som har evne til å integrere de ønskede gensekvensene inn i vertscellen. Cellene som er blitt stabilt transformert ved innført DNA kan bli selektert ved også å innføre en eller flere markører som muliggjør for seleksjon av vertsceller som inneholder ekspresjonsvektoren. Markøren kan også tilveiebringe fototrofy til en auxotrof vert, biocid resistens, for eksempel antibiotika, eller tungmetaller så som kobber eller lignende. Det selekterbare markørgenet kan enten bli direkte koblet til DNA gensekvensene som skal bli uttrykt, eller innført inn i samme cellen ved kotransfeksjon. Ytterligere elementer kan også være nødvendig for optimal syntese av proteinene ifølge oppfinnelsen.

Faktorer av viktighet ved selektering av et bestemt plasmid eller viral vektor innbefatter: lettheten hvorved mottagercellene som inneholder vektoren kan bli gjenkjent og selektert fra de mottagercellene som ikke inneholder vektoren; antall kopier av vektorene som er ønskelig i en bestemt vert; og om det er ønskelig å kunne overføre vektoren eller vertscellene til forskjellige arter.

Når vektoren (ene) eller DNA sekvensen inneholdende konstruksjonen (ene) er blitt preparert for ekspresjon kan DNA konstruksjonene bli innført i en hensiktsmessig vertscelle ved hvilke som helst av forskjellige egnede metoder: transformasjon, transfeksjon, konjugasjon, protoplastfusjon, elektroporasjon, kalsiumfosfatpresipitasjon, direkte mikroinjeksjon osv.

Vertscellene kan være enten prokaryotiske eller eukaryotiske. Eukaryotiske verter er foretrukket, for eksempel pattedyrceller, så som humane-, ape-, muse- og kinesisk hamsterovarie (CHO) celler, på grunn av at de tilveiebringer post-translasjonelle modifikasjoner til proteinmolekylene, inkludert korrekt folding eller glykosylering ved korrekte seter. Gjærcellene kan videre utføre posttranslasjonelle peptidmodiifkasjoner inkludert glykosylering. Et antall rekombinante DNA strategier eksisterer som anvender sterke promotersekvenser og høyt kopiantall av plasmider som kan bli anvendt for produksjon av ønskede proteiner i gjær. Gjær gjenkjenner ledersekvenser på klonede pattedyrgenprodukter og utskiller peptider som bærer ledersekvensene (dvs. pre-peptider).

Etter innføring av vektorene blir vertscellene dyrket i et selektivt medium som selekterer for vekst av vektor-inneholdende celler. Ekspresjon av klonede gensekvenser resulterer i produksjon av ønskede proteiner.

Rensing av rekombinante proteiner blir utført ifølge en hvilken som helst av fremgangsmåtene kjent for dette formålet, dvs. en hvilke som helst konvensjonell prosedyre som innbefatter ekstrahering, presipitering, kromatografi, elektroforese eller lignende. En ytterligere rensningsprosedyre som kan bli anvendt istedet for rensing av proteinet ifølge oppfinnelsen er afflniteteskromatografl ved anvendelse av monoklonale antistoffer som binder målproteinet og som blir produsert og immobilisert på en gelmatrise innbefattet på en kolonne. Urene preparater inneholdende rekombinant protein blir sendt gjennom kolonnen. Proteiner vil bli bundet til kolonnen av spesifikt antistoff, mens urenhetene føres gjennom. Etter vasking blir proteinet eluert fra gelen ved en forandring i pH eller ionestyrke.

Betegnelsen "hybrid protein", som anvendt heri, refererer generelt til et protein som inneholder to eller flere forskjellige proteiner eller fragmenter derav.

Som anvendt heri refererer "fusjonsprotein" ril et hybridprotein som består av to eller flere proteiner eller fragmenter derav koblet sammen kovalent.

Betegnelsen "aggregering", som anvendt heri, betyr dannelsen av sterke spesifikke ikke-kovalente interaksjoner mellom de to polypeptidkjedene som danner et kompleks, som de som eksisterer mellom ot og B subenheten til et heterodimerisk hormon (så som FSH, LH,hCG eller TSH).

Betegnelsene "ligand" eller "ligand protein", som anvendt heri, refererer til et molekyl forskjellig fra et antistoff eller et immunoglobulin som har evne til å bli bundet av ligand-bindende domene til en reseptor. Et slikt molekyl kan være naturlig eller kan bli modifisert kjemisk eller bli kjemisk syntetisert

Betegnelsen "ligand-bindende domene", som anvendt heri, refererer til en del av reseptoren som er involvert i binding av en ligand og er generelt en del eller vesentlig hele den ekstracellulære domenen.

Betegnelsen "reseptor", som anvendt heri som refererer til et membranprotein, hvor bindingen til respektive ligander utløser sekundære cellulære responser som resulterer i aktivering eller inhibisjon av den intracellulære prosessen.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse anvendelse av hybridproteinet som et medikament Medikamentet er fortrinnsvis presentert i form av en farmasøytisk sammensetning omfattende proteinet ifølge oppfinnelsen sammen med en eller flere farmasøytiske akseptable bærere og/eller eksipienter. Slike farmasøytiske sammensetninger representerer et ytterligere aspekt av oppfinnelsen.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Oppfinnelsen vil bli bedre forstått med referanse til tegningene hvor:

figurene l(a) og l(b) viser TBP(20-161)-hCGa og TBP(20-161)-hCGB konstruksjoner, og korresponderende sekvenser (SEQ ID NO: 1-4). Figurene 2(a) og 2(b) viser TBP(20-190)-hCGa og TBP(20-190)-hCGB konstruksjoner, og korresponderende sekvenser (SEQ ID NO: 5-8). Figur 3 er en skjematisk oppsummering av konstruksjoner av figurene 1 og 2 som viser p55 TNFRl, TBPl og TBP1 fusjonskonstruksjonene. Linkersekvensene vist på de siste to linjene er SEQ ID NO: 9 (Ala-Gly-Ala-Ala-Pro-Gly) og SEQ ID NO: 10 (Ala-Gly-Ala-Gly). Figur 4 er en graf som illustrerer doseavhengig beskyttende effekt av CHO celle uttrykt TBP-hCG(20-190) på TNFa-indusert cytotoksisitet på BT-20 celler og forskjellige kontroller. Figur 5 er en graf som illustrerer doseavhengig beskyttende effekt av COS celle uttrykt TBP-hCG(20-190) på TNFa-indusert cytotoksisitet på BT-20 celler og forskjellige kontroller. Figur 6 er en graf som illustrerer doseavhengig beskyttende effekt av affinitetsrenset CHO celle uttrykt TBP-hCG(20-161) på TNFa-indusert cytotoksisitet på BT-20 celler og forskjellige kontroller.

OPPFINNELSEN VIL NÅ BU BESKREVET I FØLGENDE EKSEMPLER

EKSEMPLER

Materialer og metoder

Cellelinjene anvendt i denne studien ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC), Rockville. Maryland, dersom ikke annet er angitt. CHO-DUKX cellelinjen ble oppnådd fra L. Chasin at Columbia University through D. Houseman at MIT (39). CHO-DUKX celler som mangler et funksjonelt gen for dihydrofolat reduktase ble rutinemessig opprettholdt i fullstendig a-pluss modifisert Eagles Medium (a(+)MEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS). COS-7 cellene ble rutinemessig opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% FBS. Dersom ikke annet er angitt ble cellene splittet for å opprettholde disse i log veksfase, og kultureagenser ble oppnådd fra GIBCO (Grand Island, New York). 1. Oppstilling av genetiske konstruksjoner kodende for hvbridproteinene Nummeroppstillingen for pSS TNF reseptoren er basert på kloningsartikkelen til Wallach (40), mens nummereringen for hCG subenhetene er basert på nummereringsoppføringer fra kloningsartikkelen til Fiddes (41,42). Betegnelsen TBP, eller TNF bindende protein, refererer til ekstracellulære domenedeler av TNF reseptorer som har evne til å binde TNF. I disse eksemplene vil DNA konstruksjonene bli betegnete TBP-hybrid proteiner, med partner og region av TBP indikert i konstruksjons-nomenklaturen. Alle TBP-hCG konstruksjoner inneholder humant veksthormon (hGH) signalpeptidet i stedet for nativ pSS signalsekvens. I tillegg er hGH signalpeptidet blitt plassert slik at det øyeblikkelig går forut for TBP residiet Asp20, som er betraktet å gjøre dette til det første residiet i modent, utskilt protein. Disse modifikasjonene er ikke essensielle for det grunnleggende konseptet ved anvendelse av hCG som en partner for hybridproteinet.

DNA kodende for hybridproteiner ble konstruert ved anvendelse av PCR metodologi (43).

a. TBP1 ( 20- 16n- hCG

Opprinnelig TBP-hCG konstruksjon ble omkonstruert for å inneholde ligand bindende domene fra den ekstracellulære regionen til p55 TNF reseptoren (fra Asp20 inklusivt residie Cysl61) fusjonert gjennom en kortere linker til hCG a og B subenhetene (begynnende ved henholdsvis residiene aCys7 eller fiPro7). Denne konstruksjonen, nedenfor referert til som TBP1 (20-16l)-hCG, er en heterodimer av to modifiserte hCG subenheter, TBPl(20-161)-hCGa ogTBPl(20-161)-hCGB.

Oligodeoksynukleotidprimerne anvendt for TBPl(20-161)-hCGa konstruksjonen var:

Disse og alle andre primere beskrevet i disse eksemplene ble syntetisert på en Applied Biosystems Model 392 DNA syntese maskin (ABL Foster City, California), ved anvendelse av fosforamidit kjemi.

På grunn av at begge TBP-hCG subenhet konstruksjonene har samme 5'-ende (dvs. 5'-enden av hGH/TBP konstruksjonen), primer 1 (otB) ble anvendt for begge TBP-hCG subenhet konstruksjoner. De andre primerne anvendt for TBP1 (20-161)-hCGB konstruksjonen var:

Primerne 2 (a) og 3 (a) er revers komplementer og dekker både 3'-enden av en kodende region for pSS ekstracellulær domene, og 5'-enden av hCG a subenheten. Likeledes er primerne 2 (B) og 3 (3) også revers komplementer, og dekker både 3'-enden av den kodende regionen for pSS ekstracellulær domene, og 5'-enden av hCG B subenheten.

To PCR reaksjoner ble kjørt for hver av de to TBP-hCG subenhet konstruksjonene. De første anvendte primerne 1 (aB) og 2 (a eller B), og anvendte som templat et plasmid kodende for oppløselig pSS residiene 20-180 som går forut for hGH signalpeptidet (plasmid pCMVhGHspcDNA.pA4). De andre anvendte primerne 3 (a eller fi) og 4 (a eller fl), og anvendte som templat enten plasmid pSVL-hCGa eller pSVL-hCGB (44). PCR ble utført ved anvendelse av Vent (TM) polymerase fra New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) i henhold til forhandlerens anbefalinger ved anvendelse for hver reaksjon 25 sykluser og følgende betingelser:

100 ug templat DNA

1 fig av hver primer

2 U Vent (™) polymerase (New England Biolabs) denaturering ved 99°C i 30 sekunder.

Sammensmeltet ved: S9°C i 30 sekunder for primerne l(cd3) og 2 (a)

S9°C i 30 sekunder for primerne 3 (a) og 4 (a)

57°C i 30 sekunder for primerne 1 (afl) og 2 (fl)

63°C i 30 sekunder for primerne 3 (fl) og 4 (fl)

ekstensjon ved 75°C i 75 sekunder.

PCR produktene ble bekreftet å ha ventet størrelse ved elektroforese i en 2% agarosegel og ethidiumbromid-farging. Fragmentene ble deretter renset ved å føre dem over en Wizard kolonne (Promega) i henhold til forhandleren av kolonnen.

Den endelige kodende sekvensen for TBP1 (20-16 l)-hCGcc ble oppstilt ved fusjons PCR ved anvendelse av primer 1 (ofl) og primer 4 (a) og anvendelse som templat rensede produkter fra p55 og hCG a fragmenter oppnådd fra de første PCR reaksjonene. Først ble de to templatene, som på grunn av overlapp mellom primerne 2 (a) og 3 (a) kunne bli denaturert og smeltet sammen, sendt gjennom 10 cykluser med PCR i fravær av eventuelt tilsatte primere. Betingelsene for disse syklusene var vesentlig de samme som de som ble anvendt tidligere, med unntagelse av at sammensmeltningen ble utført ved 67°C og ekstensjonen ble utført i 2 minutter. I slutten av disse 10 syklusene ble primerne 1 (afl) og 4 (a) tilsatt, og ytterligere 10 sykluser ble utført. Betingelsene for dette endelige settet av reaksjoner var de samme som anvendt tidligere med unntagelse av at en sammensmeltningstemperatur på 59°C ble anvendt, og ekstensjonen ble utført i 75 sekunder.

Analyser av produktene i denne reaksjonen ved elektroforese i en 1% agarosgel bekreftet at det ventede fragmentet på omtrent 1100 bp ble oppnådd. Reaksjonen ble ført over en Wizard kolonne for å rense fragmentet som deretter ble spaltet med Xbal og BamHI og på ny renset i en 0,7% lav-smeltepunkt agarosegel. Renset fragment ble subklonet inn i plasmid pSVL (Pharmacia), som først var blitt spaltet med Xbal og BamHI og gelrenset på en 0,8% lavt smeltepunkt agarosgel. Etter ligering med T4 ligase ble blandingen anvendt for å transformere AG1 £. coli og deretter sådd ut på LB/ampicillin skåler for over natt dyrking ved 37°C. Plasmid DNA fra ampicillin-resistente kolonier ble analysert ved spaltning med Xhol og BamHI for å bekrefte tilstedeværelse av innskuddet (som blir spaltet ut i denne spaltningen). Seks kloner ble funnet å inneholde innskudd, og en (klon 7) ble selektert for ytterligere arbeid og betegnet pSVLTBPhCGa (inneholdende TBP1 (20-161=-hCGa). Dideoksy DNA sekvensering (ved anvendelse av Sequenase™, U.S. Biochemicals, Cleveland, Ohio) av innskuddet i denne vektoren bekreftet at konstruksjonen var korrekt, og at ingen uønskede forandringer var blitt innført.

Den endelige kodende sekvensen for TBP1 (20-161)-hCGA ble oppstilt på en måte som ligner den beskrevet for TBP1 (20-161)-hCGa ved anvendelse av fusjons PCR og primerne 1 (ocB) og 4 (fi) og anvendelse som templat rensede produkter fra pSS og hCG 6 fragmenter oppnådd fra første PCR reaksjoner. Resulterende pSVL plasmid inneholdende innskudd av interesse ble betegnet pSVLTBPhCGB.

b. TBP ( 20- 190)- hCG

Det andre settet av TBP-hCG proteiner ble fremstilt ved modifikasjon av TBP(20-161)-hCG konstruksjoner for å produsere en analog inneholdende TBP begynnende fra Asp20 til Thrl90, i stedenfor 20-161 regionen i den opprinnelige analogen. Dette ble utført ved erstatning av fragmentet mellom Bgin og Xbal setene i plasmid pSVLTBPhCGa med et PCR fragment inneholdende forandringen. Dette PCR fragmentet ble dannet ved

anvendelse av fusjons PCR. Primerne var:

Primerne 1 og 2 ble anvendt for å danne sekvensen kodende for ytterligere pSS residier fra 161-190. PCR reaksjonen ble utført vesentlig som beskrevet tidligere ved anvendelse av 1 ug av hver primer og pUC-pSS som templat. Likeledes ble primerne 3 og 4 anvendt for å danne ved PCR linkeren mellom 3-enden av TBP-kodende region, og 5'-enden av hCG a subenhet kodende region ved anvendelse som et templat plasmid pSVLTBPhCGa. Produkter fra disse PCR reaksjonene ble bekreftet å ha riktig størrelse (omtrent henholdsvis 296 bp og 121 bp) ved polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) på en 8% gel, og ble deretter renset ved anvendelse av en Wizard kolonne. Konstruksjon av primerne 2 og 3 var slik at de inneholdt en region med overlapping slik at de to PCR produktene (fra primerne 1 og 2, og fra primerne 3 og 4) kunne bli sammensmeltet for fusjons PCR med primerne 1 og 4. Etter fusjonsreaksjonen ble ønsket produkt med omtrent 400 bp bekreftet og renset ved anvendelse av en 1,5% agarosegel og en Wiazard kolonne. Dette DNA ble deretter spaltet med Bgin og Xbal og ligert med BglH/Xbal-spaltete pSVLTBPhCGa. Tilstedeværelse av et innskudd i plasmidene isolert fra transformert AG1 E. coli ble bekreftet ved spaltning med BglH og Xbal. Den nye konstruksjonen ble betegnet pSVLTBP (20-190)-hCGa.

Likledes ble plasmid pSVLTBPhCGB modifisert ved substitusjon av Bglll-Xcml fragmentet. Dette ble derimot utført ved subkloning av et enkelt PCR produkt, i stedenfor med et fusjons PCR produkt. Primerne 1 og 2b (se nedenfor) ble anvendt med pUC-p55 som templat

Resulterende PCR produkt (omtrent 337 bp) ble bekreftet og renset som beskrevet ovenfor, spaltet med BgUI og Xcml, og deretter ligert inn i Bgin/Xbal-spaltet pSVLTBPhCGB. Tilstedeværelse av et innskudd i plasmider isolert fra transformert AG1 E. coli ble bekreftet ved spaltning med BglH og Xcml. Den nye konstruksjonen ble betegnet pSVLTBP (20-190)-hCG0.

De nye konstruksjonene ble deretter bekreftet ved DNA sekvensering.

I tillegg til å produsere disse nye pSVL-baserte plasmidene ble disse konstruksjonene også subklonet inn i andre ekspresjonsvektorer som sannsynligvis er mer egnede for stabil ekspresjon i CHO, spesielt vektor Da, tidligere beskrevet som plasmid CLH3AXSV2DHFR (45). Dette ble oppnådd ved konvertering av et BamHI sete som flankerer innskuddene i pSVL-baserte vektorer til et Xhol sete, og deretter utspaltning av innskuddet med Xhol og kloning av dette inn i Xhol spaltet Da.

2. Forbi<g>ående oe stabil ekspresjon av h<y>bride proteiner

Transfeksjoner av COS-7 cellene (ATCC CRL1651, ref. 46) for forbigående ekspresjon av TBP-hCG hybridproteiner ble utført ved anvendelse av elektroporasjon (47). Eksponensielt voksende COS-7 celler ble fjernet ved trypsinering, samlet ved forsiktig sentrifugering (800 rpm, 4 minutter), vasket med kald fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,3-7,4, og deretter repelletert ved sentrifugering. Cellene ble resuspendert i en konsentrasjon på 5 x IO<6> celler pr 400 ul kald PBS og blandet med 10 ug plasmid DNA i en foravkjølt 2 mm gap elektroporasjonskuvette. For kotransfeksjoner ble 5 ug av hvert plasmid anvendt. Kuverten og cellene ble avkjølt på is i ytterligere 10 minutter, og deretter utsatt for elektroporasjon ved anvendelse av et BTX modell 600 instrument og betingelsene 125V, 950 uF og R=8. Deretter ble cellene avkjølt på is i 10 minutter, overført til et 15 ml konisk rør inneholdende 9,5 ml fullstendig medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føt alt bovint serum (FBS) og 1% L-glutamin) ved romtemperatur, og latt stå ved romtemperatur i 5 minutter. Etter forsiktig blanding i 15 ml rør ble hele innholdet sådd ut på to Pl00 skåler og plassert i en 37°C, 5% C02 inkubator. Etter 18 timer ble mediet skiftet, og i noen tilfeller inneholdt det nye mediet bare 1% eller 0% FBS. Etter ytterligere 72 timer ble det kondisjonerte mediet høstet, sentrifugert for å fjerne celler og lagret i frossen tilstand ved -70°C.

Transfeksjoner av CHO-DUKX (CHO) celler for forbigående eller stabil ekspresjon ble utført ved anvendelse av kalsiumfosfatpresipitasjon av DNA. 24 timer før transfeksjon ble eksponensielt voksende CHO celler sådd ut på 100 mm kulturskåler i en tetthet på 7,5xl0<5> celler pr skål. På transfeksjonsdagen ble 10 ug plasmid DNA brakt til 0,5 ml i transfeksjonsbuffer (se nedenfor), 31 ul 2 M CaCfe ble tilsatt, DNA-CaCk oppløsningen ble blandet ved vortex behandling, og latt stå ved romtemperatur i 45 minutter. Etter dette ble mediet sugd ut fra skålene, DNA ble tilsatt til cellene ved anvendelse av en steril plastpipette og cellene ble latt stå ved romtemperatur i 20 minutter. I slutten av denne perioden ble 5 ml fullstendig a(+)MEM inneholdende 10% FBS tilsatt til skålene som ble inkubert ved 37°C i 4-6 timer. Mediet blir deretter sugd av skålene, og cellene ble utsatt for et glycerol sjokk ved å inkubere dem med en oppløsning av 15% glycerol i transfeksjonsbuffer ved 37°C i 3,5 minutter. Etter fjerning av glyceroloppløsningen ble cellene vasket to ganger med PBS, tilført på ny 10 ml fullstendig a(+)MEM, 10% FBS og returnert til 37°C inkubatoren. For stabile transfeksjoner ble cellene etter 48 timer splittet 1:10 og tilført seleksjonsmedium (fullstendig a-minus MEM (som mangler nukleosider), 10% dialysert FBS og 0,02 um metotreksat). Ikke-transfekterte (ikke-resistente) celler ble vanligvis eliminert iløpet av 3-4 uker og tilveiebrakte en populasjon av transfekterte, metotreksat-resistente celler.

3. Kvantifisering av ekspresjon

Sekresjon av hybride proteiner ved transfekterte celler ble vurdert ved anvendelse av et kommersielt analysesett for oppløselig pSS (R&D Systems; Minneapolis, Minnesota) i henhold til forhandlerens instruksjoner. Denne analysen tilveiebringer også en vurdering av hybridproteinnivåene i kondisjonert og prosessert medium, som virker som grunnlag for selektering av doser som skal bli anvendt i bioanalysen.

4. Vurdering av heterodimerdannelse

For å vurdere evnen som TBP-hCG subenhet fusjoner har til å kombinere og danne heterodimerer ble en sandwich immunoanalyse ved anvendelse av antistoffer mot hCG subenheter utført. I denne analysen blir et monoklonalt antistoff mot hCG 6 subenheten belagt på mikrotiterskåler og anvendt for analytt oppfanging. Primært deteksjonsantistoff er et geitepolyklonalt antistoff dannet mot human TSH a subenhet (#082422G - Biodesign International, Kennenbunkport, maine), som igjen blir detektert ved anvendelse av et teste pepperrotperoksidasekonjugert kanin anti-geitee polyklonalt antistoff (Cappel, Durham, North Carolina).

Flere forskjellige anti-hCG fl subenhet antistoffer ble anvendt i dette arbeidet og alle viser ingen detekterbar kryssreaktivitet ved fri a subenhet. En av disse antistoffene (3/6) blir anvendt i kommersielt tilgjengelig MAIAklon hCG analysesett (Biodata; Rome, Italy).

Høyt-protein bindende mikrotiterskåler (Costar #3590) ble belagt med oppfangingsantistoff ved inkubasjon (2 timer ved 37°C) med 100 ul/brønn med en 5 uVml oppløsning av antistoff i belegningsbuffer (PBS, pH 7,4,0,1 mM Ca", 0,1 mM Mg"). Etter en gangs vasking med vaskeoppløsning (PBS, pH 7,4 + 0,1% Tween 20) blir skålen blokkert ved fullstendig fylling av brønnene («400 ul/brønn) med blokkeringsoppløsning (3% bovin serumalbumin (BSA; fraksjon V - A-4503 Sigma) i PBS, pH 7,4) og inkubering i 1 time ved 37°C eller over natt ved 4°C. Skålen blir deretter vasket to ganger med vaskeoppløsning, og referanse og eksperimentelle prøver, fortynnet i fortynningsmiddel (5 mg/ml BSA i PBS, pH 7,4) for å tilveiebringe et 100 ul volum blir tilsatt. Etter inkubering av prøvene og skålen i 2 timer ved 37°C blir skålen igjen vasket to ganger med vaskeoppløsning. Primært deteksjonsantistoff, fortynnet 1:5000 i fortynningsmiddel, blir tilsatt (100 pl/brønn) og inkubert i 1 time ved 37°C. Sekundært deteksjonsantistoff (HRP konjugert kanin anti-geite lg), fortynnet 1:5000 i fortynningsmiddel, blir tilsatt (100 ul/brønn) og etter inkubasjon i 1 time ved 37°C blir skålen vasket tre ganger med vaskeoppløsning. 100 fil TBM substratoppløsning (Kirkegaard and Perry Laboratories) blir tilsatt, skålen blir inkubert i 20 minutter i mørket ved romtemperatur, og deretter blir den enzymatiske reaksjonen stoppet ved tilsetning av 50 ul/brønn 0,3M H2S04. Skålen blir deretter analysert ved anvendelse av en mikrotiterskål avleser innstilt på en bølgelengde på 450 nm.

5. Delvis rensing

For bedre å kvantifisere aktivitetene til disse hybridproteinene ble TBP-hCG hybridproteiner delvis renset ved immunoafflnitetskromatografl. Det anvendte antistoffet var en monoklonal kommersielt tilgjengelig fra R&D Systeems (MAB #225). Kolonnen var CNBr-aktivert sepharose, tilført antistoff ved å følge forhandlerens (Pharmacia) instruksjoner.

Kondisjoneringsmediet ble samlet fra konfluente T-175 flasker fra hver linje ved anvendelse av daglige høstinger av 50 ml SFMII medium (GIBCO), med fem høstinger for hver linje. Samlingene ble utsatt for sentrifugering (1000 RPM) for å fjerne cellulært debris. Materialet ble deretter analysert for TBP innhold ved anvendelse av den kommersielle immunoanalysen og konsentrert (Centricon enheter til Amicon; Beverly, Massachusetts) slik at den tilsynelatende TBP konsentrasjonen var omtrent 50 ng/ml. 10 ml konsentrert TBP-hCG (prøve #18873) ble brakt til omtrent IM NaCl ved tilsetning av NaCl og justering av oppløsningen til en ledningsevne på omtrent 85 mS/cm. Dette ble sendt gjennom en 0,5 ml anti-TBP immunoaffinitetskolonne. Gjennomstrømningen ble samlet og kjørt gjennom kolonnen for annen gang. Etter dette ble kolonnen vasket med 1 ml NaCl i PBS. Bundet TBP(20-161)-hCG ble samlet etter eluering med 50 mM sitronsyre (pH 2,5). Eluatet (omtrent 7 ml) ble konsentrert ved filtrering ved anvendelse av Amicon Centricon-10 i henhold til forhandlerens (Amicon) instruksjoner, til et volum på omtrent 200 ul. Omtrent 800 fil PBS ble tilsatt for å bringe prøvevolumet til 1 ml som ble lagret ved 4°C helt til den ble testet ved bioanalyse.

6. Vurdering av anti- TNF aktivitet

En mengde in vitro TNF-induserte cytotoksisitetsanalyser er blitt beskrevet for vurdering av analoger av oppløselige TNF reseptorer. Vi anvendte en analyse som anvender en human brystcarcinoma cellelinje, BT-20 celler (ATCC HTB 19). Anvendelse av disse cellene som grunnlag for en TNF bioanalyse er tidligere blitt beskrevet (48). Disse cellene blir dyrket ved 37°C i RPMI1640 medium supplementert med 10% varme-inaktivert FBS. Cellene ble dyrket til maksimal 80-90% konfluens, med splitting hver 3-4 dager med en utsåingstetthet på omtrent 3xl0<6> celler pr T175cm<2 >flaske.

BT-20 analysen anvender inklusjon av en cellulær markør, krystallfiolett, som en deteksjonsmetode for å vurdere overlevelse av celler etter behandling med TNF. Døde celler kan ikke ta opp og beholde fargestoffet.

Protokollen anvendt for analysering av anti-TNF aktivitet er som følger. Rekombinant human TNFa (R&D Systems) og eksperimentelle prøver blir opprettholdt i medium (RPMI 1640 med 5% varme-inaktivert FBS) og tilsatt til brønnene av 96-brønn kulturskåler. Cellene blir deretter sådd ut i disse brønnene i en tetthet på lx IO5 celler/brønn. Mengden av TNFa tilsatt ble bestemt tidligere i titreringsstudier, og representerer en dose hvor omtrent 50% av cellene blir drept.

Etter tilsetning av prøvene blir cellene dyrket i 48 timer ved 39°C, hvoretter andelen av levende celler blir bestemt ved anvendelse av krystallfiolett farging og en mikrotiterskålavleser (570 nm).

RESULTATER

1. Konstruksjoner som studeres

Konstruksjoner av hybridproteiner som blir studert er i korte trekk oppsummert nedenfor. To kontrollproteiner, et monomerisk oppløselig p55 (r-hTBP-1) og et dimerisk TBP-immunoglobulin fusjonsprotein (TBP-IgG3) (fremstilt vesentlig som beskrevet i (10)), ble studert for sammenlignende formål.

Sekvenser av DNA kodende for TBP(20-190)-hCG og TBP(20-161)-hCG er angitt i figurene 1 og 2.

2. Sekresjon av TBP- hCG proteiner

Alle konstruksjonene som ble testet ble funnet å bli produsert og skilt ut i kulturmediet av transfekterte pattedyrceller. Data som illustrerer dette er vist i tabellene 1 og 2. 3. TBP- hCG ( a / Bi ) fusjonsproteiner oppstilt i heterodimerer Kombinasjonen av TBP-hCGa og TBP-hCGB ble bekreftet ved anvendelse av sandwich analyse for hCG heterodimeren. Bare den kombinerte transfeksjonen av a og B subenhet fusjonene resulterte i heterodimer deteksjon (tabell 3). ■ 4. TBP- hCG hvbridproteiner utviste øket aktivitet over TBP monomeren Hybridproteiner produsert i enten COS-7 eller CHO celler ble funnet å være potente inhibitorer av TNFa i BT-20 bioanalysen. Noen av prøvene som er blitt testet er oppsummert i tabell 4.

Negative kontroller (kondisjonert medium fra narretransfeksjoner) ble innbefattet for lx medieprøvene.

Som illustrert i figurene 3-5 (punkter på Y-aksen) resulterte tilsetning av TNF (2,5 ng/ml) i en klar reduksjon i levende celleantall (som vurdert ved OD 570). I hvert tilfelle har de aktive prøvene som en beskyttende effekt opprettelse av cellelevedyktighet til det nivået som fremkommer i fravær av tilsatt TNF (dvs. kontrolhnerket "kun celler").

Positive kontroller, r-hTBP-1 og TBP-IgG3 er begge beskyttende og viser en klar dose-avhengighet og ED50 på omtrent 100 ng/ml for r-hTBP-1 (figurene 3-5) og omtrent 1,5 ng/ml for TBP-IgG3 (fig. 3).

TBP-hCG konstruksjoner fra lx medium (CHO eller COS) eller fra immunrensing viser dose-avhengig beskyttelse, med omtrent ED50 varierende fra 2-11 ng/ml (fig. 3-5).

Resultater fra in vitro bioanalysen er angitt i tabell 5. Dataene indikerer at hybridproteinene inhiberer TNF cytotoksisitet, og at de er vesentlig mer potente enn TBP monomeren. De negative kontrollene manglet beskyttende aktivitet.

I tillegg til muligheten av at dimerisering av TBP kan øke potensen, er det også mulig at aktiviteten av hybridproteinene ikke er relatert til dimerisk interaksjon med TBP, men til sterisk inhibisjon på grunn av partneren til hybriden som interfererer med oppløselig TBP/TNF binding til celleoverflate TNF reseptorer.

Alle referanser sitert heri, inkludert journalartikler eller abstrakter, publiserte eller tilsvarende US eller utenlandske patentsøknader, godkjente US eller utenlandske patenter er innkorporert heri som referanse, inkludert alle data, tabeller, figurer og teksten presentert i de siterte referansene.

REFERANSER

1. Smith, R.A. et al., J. Biol. Chem. 262:6951-6954, .1987. 2. Eek, M.J. et al., J. Biol. Chem.; 264:17595-17605, 1989. 3. Jones, E.Y. et al , Nature 338:225-228, 1989. 4. Eek, M.J. et al., J. Biol. Chem. 267:2119-2122, 1992. 5. Pierce, J.G. et al., Annu. Rev. Biochem. 50:465-495, 1981. 6. Lapthorn, A.J. et al., Nature 369:455-461, 1994. 7. Wu, H.f et al., Structure 2:545-550, 1994. 8. Engelmann, H., et al., J. Biol. Chem. 265:14497-14504, 1990. 9. Adam, D. et al., J. Biol. Chem. 270:17482-17487, 1995. 10. Loetscher, H.R., et al., J. Biol. Chem. 266:18324-18329, 1991. 11. Banner, D.W., et al., Cell 73:431-445, 1993. 12. Pennica, D., et al., Biochemistry 32:3131-3138, 1993. 13. Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem. 265:1531-1536, 1990. 14. Van Zee, K.J. et al., Proe. Ratl. Acad. Sei.

USA 89:4845-4849, 1992. 15. Aderka, D. et al., J. Exp. Med. 175:323-329, 1992. 16. Mohler, K.M., et al., J. Immunol. 151:1548-1561, . 1993. 17. Bertini, R., et al., Eur. Cytokine Netw., 1993. 18. Piguet, P.F., et al., Immunology 77:510-514, 1992. 19. Williams, R.O., et al., Immunology 84:433-439, 1995. 20. Capon, D.J., et al., Nature 337: 525-531, 1989. 21. Ashkenazi, A., et al., Proe.Nati. Acad. Sei. 88:10535-10539, 1991. 22. Suitters, A.J., et al. J. Exp. Med. 179:849-856, 1994. 23. Nolan, O.et al., Biochim. Biophys. Acta 1040:1-11, 1990. 24. Rodrigues, M.L., et al., J. Immunol. 151:6954-6961, 1993. 25. Chang, H.-C, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:11408-11412, 1994. 26. Wu, Z., et al., J. Biol. Chem. 270:16039-16044, 1995. 27. Bazzoni, F. et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92:5376-5380, 1995. 28. Boldin, M.P., et al., J. Biol. Chem. 270:387-391,1995. 29. Vu, T.-K.H., et al., Cell, 64:1057-1068, 1991. 30. Song, H.Y., et al., J. Biol. Chem. 269:22492-22495, 1994. 31. Russell, D.A., et al., J. Infectious Diseases 171:1528-1538, 1995. 32. Rao CV. et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 146, 65-68, 1983. 33. Damewood M.D. et al.,. Fertil. Steril. 52, 398-400, 1989. 34. Chen, F., et al., Mol. Endocrinol. 6:914-919, 1992. 35. Bielinska, M., et al., J. Cell Biol. 111:330a, 1990. 36. Furuhashi, M., et al., Mol Endocrinol. 9:54-63, 1995.. 37. Sugahara, T., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92:2041-2045, 1995. 38.. Johnson, G.A., et al., Biol. Reprod. 52:68-73, 1995. 39. Urlaub, G. and Chasin, L. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77r.-4216-4220, 1980. 40. Nophar, Y., et al., EMBO J. 9:3269-3278, 1990. 41. Fiddes, J.C. et al., Nature 281:351-356, 1979. 42. Fiddes, J.C. et al.. Nature 286:684-687, 1980. 43. Elion, E.A., in Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausuble, FM. et al., John Wiley & Sons, 1993. 44. Campbell, R., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:760-764, 1991. 45. Cole E.S. et al., Biotechnology, 11, 1014-1024, 1993. 46. Gluzman, Y., Cell 23:175-182, 1981. 47. Chu, G. et al., Nucl. Acid Res. 15:1311-1326, 1987. 48. Yen, J. et al., J. Immunotherapy 10:174-181, 1991.

Claims (25)

1. Hybridprotein omfattende to kouttrykte aminosyresekvenser som danner en dimer, karakterisert ved at hver omfatter: a) minst en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av en homomerisk reseptor, en kjede av en heteromerisk reseptor og fragmenter derav som har beholdt ligandreseptor bindende evne; og b) en subenhet av et heterodimerisk proteinholdig hormon, eller fragmenter derav som har beholdt subenhetens evne til å danne en heterodimer med andre subenheter derav; hvori sekvensene (a) og (b) er bundet direkte eller gjennom en peptidlinker, og hvor sekvensen (b) i hver av nevnte to kouttrykte sekvenser har evne til å aggregere for å danne et dimerkompleks.

2. Hybridprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte sekvens (a) blir valgt fra gruppen bestående av TBP1, TBP2 eller fragmenter derav som fortsatt inneholder ligandbindende domene; den ekstracellulære domenen av IFNot/J3 reseptor eller LFNv reseptor; en gonadotropinreseptor eller ekstracellulære fragmenter derav.

3. Hybridprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte sekvens (b) blir valgt fira gruppen bestående av subenhetene hCG, FSH, LH, TSH eller inhibin, og fragmenter derav.

4. Hybridprotein ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte sekvens (b) er hCG og hCG har blitt mutagenisert for å eliminere dens biologiske aktivitet.

Hybridprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at sekvensen (a) er koblet til aminoterminus, karboksyterminus, eller begge, til sekvens

6. Hybridprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte hybridprotein er et monofunksjonelt, bifunksjonelt eller multifunksjonelt molekyl.

7. Hybridprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte kouttrykte aminosyresekvenser hver innbefatter sekvensen for TBP1 eller fragment derav som tilsvarer aminosyreresidiene 20-161 eller 20-190 til TBP1, som sekvens (a) og respektive a og p subenheter av hCG eller fragmenter derav, som sekvens (b).

8. Hybridprotein ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte protein omfatter SEQ ID NO: 2 og 4, eller SEQ ID NO: 6 og 8.

9. Hybridprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte to kouttrykte aminosyresekvenser hver innbefatter den ekstracellulære domenen til en gonadotropinreseptor som sekvens (a) og respektive a og B subenheter til et gonadotropin som sekvens (b).

10. Hybridprotein ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte sekvens (a) er FSH reseptor ekstracellulær domene og sekvens (b) er en subenhet av FSH.

11. Hybridprotein ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte sekvenser (a) og (b) er koblet med en peptidlinker.

12. Hybridprotein ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte peptidlinker har et enzymspaltningssete.

13. Hybridprotein ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte enzymspaltningssete er et trombinspaltningssete.

14. Hybridprotein ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte enzymspaltningssete blir gjenkjent og spaltet av et enzym som finnes i ovariene.

15. Hybridprotein ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte peptidlinker virker som en fleksibel hengsel.

16. Hybridprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at en eller flere kovalente bindinger mellom de to subenhetene (b) blir tilsatt.

17. DNA molekyl, karakterisert ved at det koder for et hybridprotein ifølge krav 1.

18. Ekspresjonsvektor inneholdende en eller to DNA-molekyler kodende for aminosyresekvenser som danner et hybridprotein i henhold til krav 17.

19. Ekspresjonsvektor ifølge krav 18, karakterisert ved at nevnte DNA-molekyl er SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 eller SEQ ID NO: 7

20. Vertscelle, karakterisert ved at den inneholder en eller to forskjellige ekspresjonsvektorer ifølge krav 18 og har evne til å uttrykke nevnte hybridprotein.

21. Fremgangsmåte for fremstilling av hybridprotein, karakterisert ved at den omfatter dyrking av en vertscelle ifølge krav 19 og isolering av hybridproteinet som derved blir uttrykt.

22. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et hybridprotein ifølge krav 1 og en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller eksipient.

23. Anvendelse av hybridprotein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-16 for fremstilling av et medikament.

24. Anvendelse av et hybridprotein ifølge krav 7 for fremstilling av et medikament for behandling av humane lidelser med behov for inhibering av TNF.

25. Anvendelse av hybridprotein ifølge krav 10 for fremstilling av et medikament for induksjon av follikulær modning.