ES2241040T3 - Proteinas hibridas que forman heterodimeros. - Google Patents

Proteinas hibridas que forman heterodimeros.

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ES2241040T3 ES97906604T ES97906604T ES2241040T3 ES 2241040 T3 ES2241040 T3 ES 2241040T3 ES 97906604 T ES97906604 T ES 97906604T ES 97906604 T ES97906604 T ES 97906604T ES 2241040 T3 ES2241040 T3 ES 2241040T3
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Abstract

UNA PROTEINA HIBRIDA INCLUYE DOS SECUENCIAS COMPRIMIDAS DE AMINOACIDOS QUE FORMAN UN DIMERO. CADA SECUENCIA CONTIENE LA PORCION DE ENLACE DE UN RECEPTOR, TAL COMO TBP1 O TBP2, O UN LIGANDO TAL COMO IL - 6, IFN - BE Y TPO, ENLAZADAS CON UNA SU BUNIDAD DE UNA HORMONA PROTEINACEA HETERODIMERICA, TAL COMO HCG. CADA SECUENCIA COMPRIMIDA CONTIENE UNA SUBUNIDAD DE LA CORRESPONDIENTE HORMONA PARA FORMAR UN HETERODIMERO CON PRESION. TAMBIEN SE DESCUBREN CORRESPONDIENTES MOLECULAS DE ADN, VECTORES DE PRESION Y CELULAS HUESPED AL IGUAL QUE COMPUESTOS FARMACEUTICOS Y UN METODO PARA PRODUCIR TALES PROTEINAS.

Description

Proteínas híbridas que forman heterodímeros.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una proteína híbrida que comprende dos secuencias aminoácidas expresadas conjuntamente formando un dímero, que comprenden cada una:
a) al menos una secuencia aminoácida seleccionada de un receptor homoméro, una cadena de un receptor heterómero, un ligando y sus fragmentos; y
b) una subunidad de una hormona proteínica heterodímera o sus fragmentos; en la que (a) y (b) se unen directamente o a través de un conector peptídico y, en cada pareja, las dos subunidades (b) son diferentes y capaces de agregarse para formar un complejo dímero.
Antecedentes de la invención
Las interacciones proteína-proteína son esenciales para las funciones fisiológicas normales de las células y los organismos multicelulares. Muchas proteínas en la naturaleza presentan funciones nuevas u óptimas cuando forman un complejo con una o más cadenas de proteína diferentes. Esto se ilustra mediante diversas combinaciones ligando-receptor, que contribuyen a la regulación de la actividad celular. Ciertos ligandos, como en factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), TNF\beta, o la gonadotropina coriónica humana (hCG), existen como complejos de múltiples subunidades. Algunos de estos complejos contienen múltiples copias de la misma subunidad. TNF\alpha y TNF\beta (denominadas conjuntamente a partir de aquí como TNF) son homotrímeros formados por tres subunidades idénticas (1-4). Otros ligandos están compuestos por subunidades no idénticas. Por ejemplo, hCG es un heterodímero (5-7). Los receptores pueden existir o funcionar también como complejos de cadenas múltiples. Por ejemplo, los receptores de TNF transducen una señal después de agregarse para formar dímeros (8, 9). Los ligandos de estos receptores promueven la agregación de dos o tres cadenas receptoras, proporcionando de esta manera un mecanismo de activación del receptor. Por ejemplo, la agregación mediada por TNF activa los receptores de TNF (10-12).
La modulación de las interacciones proteína-proteína puede ser un mecanismo útil para la intervención terapéutica en diversas enfermedades y patologías. Las proteínas de unión solubles, que pueden interaccionar con ligandos, pueden secuestrar potencialmente el ligando lejos del receptor, reduciendo por tanto la activación de esa vía particular del receptor. Alternativamente, el secuestro del ligando puede retrasar su eliminación o degradación, incrementando así su duración o efecto, y quizás su aparente actividad in vivo. En el caso del TNF, los receptores de TNF solubles se han asociado primariamente con la inhibición de la actividad del TNF (13-17).
Las proteínas de unión solubles pueden ser útiles para tratar enfermedades humanas. Por ejemplo, se ha demostrado que los receptores de TNF solubles tienen eficacia en modelos animales de artritis (18, 19).
Debido a que el TNF tiene tres sitios de unión para su receptor (10-12), y la dimerización del receptor superficial celular es suficiente para la bioactividad (8, 9), es posible que la unión de un solo receptor al TNF deje abierta la posibilidad de que este complejo 1:3 de receptor soluble:TNF (trímero) pueda aún unirse y activar un par de receptores TNF de la superficie celular. Para lograr un efecto inhibidor, se esperaría que dos de los sitios de unión del receptor sobre el trímero de TNF tengan que estar ocupados o bloqueados por la proteína de unión soluble. Alternativamente, la proteína de unión podría bloquear la orientación adecuada del TNF en la superficie celular.
Hablando en general, se sintió la necesidad de sintetizar proteínas que contuviesen dos cadenas (o ligandos) receptores, como proteína híbrida dímera. Véase Wallach et al., patente de EE.UU. 5.478.925.
La estrategia principal empleada para generar proteínas híbridas dímeras o multímeras, que contienen dominios de unión para receptores extracelulares, ha sido fusionar estas proteínas con las regiones constantes de la cadena pesada de un anticuerpo.
Esta estrategia condujo, por ejemplo, a la construcción de inmunoadhesinas CD4 (20). Éstas son moléculas híbridas que consisten en los dos primeros (o en los cuatro) dominios de tipo inmunoglobulina de CD4 fusionados con la región constante de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo. Esta estrategia para crear moléculas híbridas, se adaptó a los receptores de TNF (10, 16, 21) y condujo a la generación de construcciones con mayor actividad in vitro que las proteínas de unión monómeras solubles.
Se mantiene en general que la mayor actividad in vitro de las proteínas de fusión dímeras se debería de traducir en una actividad in vivo mayor. Un estudio mantiene esto, revelando una actividad al menos 50 veces superior para una proteína de fusión p75(TBP2)-Ig, en la protección de ratones de las consecuencias de una inyección intravenosa de LPS.
Sin embargo, a pesar de la amplia utilización de proteínas de fusión de inmunoglobulina, esta estrategia tiene varias desventajas. Una es que ciertos dominios Fc de inmunoglobulina participan en funciones efectoras del sistema inmunológico. Estas funciones pueden ser indeseables en un entorno terapéutico particular (22).
Una segunda limitación se refiere a los casos especiales en los que es deseable producir proteínas de fusión heterómeras, por ejemplo análogos solubles de los receptores de interferón IL-6 o de tipo I. Aunque hay numerosos métodos para producir anticuerpos bifuncionales (p.ej., mediante cotransfección o fusiones de hibridoma), la eficiencia de la síntesis se altera considerablemente por la mezcla de homodímeros y heterodímeros que se produce típicamente (23). Recientemente, ha habido varios trabajos que describen el uso de motivos de "cremallera" de leucina para guiar el ensamblaje de los heterodímeros (24-26). Éste parece ser un enfoque prometedor para fines de investigación, pero las secuencias no nativas o intracelulares empleadas pueden no ser adecuadas para aplicaciones crónicas en clínica, debido a la antigenicidad. La eficiencia de ensamblaje y la estabilidad posensamblaje pueden ser también limitaciones.
Por otra parte, en el caso particular de los receptores de TNF, se ha encontrado que ciertas modificaciones del receptor p55 de TNF facilitan la homodimerización y señalizan en ausencia de ligando (27, 28). Se ha descubierto que una región citoplásmica del receptor, denominada "dominio muerto", puede actuar como motivo de homodimerización (28, 30). Como una alternativa a una proteína híbrida de inmunoglobulina, la fusión del dominio extracelular del receptor de TNF a su dominio muerto citoplásmico, podría supuestamente producir una proteína secretada que se puede dimerizar en ausencia de TNF. Tales proteínas de fusión se han descrito y reivindicado en la solicitud de patente internacional WO 95/31544.
Una tercera estrategia adicional empleada para producir dímeros de receptores de TNF solubles, ha sido reticular químicamente las proteínas monómeras con polietilenglicol (31).
Sumario de la invención
Una alternativa para obtener tales proteínas dímeras, que ofrece algunas ventajas importantes, es la de la presente invención, y consiste en usar un armazón heterodímero natural que corresponde a una proteína circulante distinta de la inmunoglobulina, con una semivida larga. Un ejemplo preferido es la hCG, una proteína que se secreta bien, tiene buena estabilidad y una semivida larga (32-33). Dado el papel preeminente de hCG como marcador del embarazo, se han desarrollado muchos reactivos para cuantificar y estudiar la proteína in vitro e in vivo. Además, se ha estudiado extensivamente la hCG usando mutagénesis, y se sabe que pequeñas deleciones de la proteína, como la eliminación de cinco residuos en el extremo carboxilo-terminal de la subunidad \alpha, pueden eliminar de forma efectiva su actividad biológica, aunque conservando su capacidad para formar un heterodímero (34, 35). Se ha demostrado que se toleran pequeñas inserciones, de hasta 30 aminoácidos, en los extremos amino y carboxilo de la subunidad \alpha (36), mientras que la fusión de la subunidad \alpha al extremo carboxilo de la subunidad \beta también tiene escaso efecto sobre la formación de heterodímeros (37).
Se ha descrito también un análogo de hCG en el que un dominio Fc de inmunoglobulina se fusionó con el extremo C-terminal de la subunidad \beta de hCG; sin embargo, esta construcción no se secretaba y no se hizo ningún esfuerzo para combinarlo con una subunidad \alpha (38).
Por tanto, el principal objeto de la presente invención es una proteína híbrida que comprende dos secuencias aminoácidas expresadas conjuntamente formando un dímero, que comprenden cada una:
a) al menos una secuencia aminoácida seleccionada entre un receptor homómero, una cadena de un receptor heterómero, un ligando y sus fragmentos; y
b) una subunidad de una hormona proteínica heterodímera, o sus fragmentos; en la que (a) y (b) están unidas directamente o a través de un conector peptídico, y en cada pareja las dos subunidades (b) son diferentes y capaces de agregarse formando un complejo dímero.
Según la presente invención, el conector puede ser escindible enzimáticamente.
La secuencia (a) se selecciona preferiblemente entre: el dominio extracelular del receptor 1 de TNF (55 KDa, también denominado TBP1), el dominio extracelular del receptor 2 de TNF (75 kDa, también denominado TBP2), o sus fragmentos que contienen aún el dominio de unión al ligando; los dominios extracelulares de los receptores de IL-6 (también denominados gp80 y gp130); el dominio extracelular del receptor de IFN \alpha/\beta o del receptor IFN \gamma; un receptor de gonadotropina o sus fragmentos extracelulares; cadenas ligeras de anticuerpos o sus fragmentos, asociados opcionalmente con las respectivas cadenas pesadas; cadenas pesadas de anticuerpos o sus fragmentos, asociados opcionalmente con las cadenas ligeras respectivas; dominios Fab de anticuerpos; o proteínas ligando, como citoquinas, factores de crecimiento u hormonas distintas de las gonadotropinas, ejemplos específicos de las cuales incluyen IL-6, IFN-\beta, TPO, o sus fragmentos.
La secuencia (b) se selecciona preferiblemente entre hCG, FSH, LH, TSH, subunidad de inhibina, o sus fragmentos.
Las modificaciones de las proteínas, como la escisión química o mediante proteasa de la cadena proteica principal, o la modificación química o enzimática de ciertas cadenas laterales de aminoácidos, se puede usar para inactivar los componentes de la proteína híbrida de la invención. Esta restricción de actividad se puede lograr asimismo mediante el uso de técnicas de DNA recombinante, para alterar la secuencia codificadora de la proteína híbrida, de forma que produzca directamente la restricción de actividad a un componente, o que haga la proteína más sensible a una modificación química o enzimática posterior.
Las proteínas híbridas anteriores producirán moléculas monofuncionales, bifuncionales o multifuncionales, dependiendo de las secuencias aminoácidas (a) que se combinen con (b). En cada pareja, (a) puede estar unida al extremo amino o al extremo carboxilo de (b), o a ambos.
Una proteína híbrida monoclonal de la presente invención puede comprender, por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor de gonadotropina unido a una de las correspondientes subunidades de gonadotropina que se unen al receptor. Según tal realización, la proteína híbrida de la invención puede ser una molécula en la que, por ejemplo, el dominio extracelular del receptor de FSH está unido a FSH para incrementar la semivida plasmática e incrementar la actividad biológica.
Esta preparación se puede emplear para inducir la maduración folicular en métodos de reproducción asistida, como la inducción de ovulación o la fertilización in vitro, y para servir como medio para amplificar drásticamente la actividad biológica de la hormona esencial para el éxito del proceso, reduciendo por tanto el requerimiento de la propia hormona, y el número de inyecciones para lograr la ovulación.
El receptor de FSH y la producción del dominio extracelular del receptor de FSH humano, se han descrito respectivamente en WO 92/16620 y WO 96/38575.
Según una realización particular, el dominio extracelular del receptor de FSH (ECD), se puede fusionar ensamblado con un conector peptídico que contiene un sitio de reconocimiento/escisión de trombina (29) y representa un brazo "unido". El conector peptídico conecta el dominio extracelular de FSH con una subunidad de FSH. Esto permitirá la eliminación del dominio extracelular de FSH mediante escisión en el sitio de escisión de trombina, cuando la molécula entra en contacto con trombina en la circulación sistémica.
En otra realización, en vez del sitio de escisión de la trombina, se usa un sitio de reconocimiento enzimático para una enzima que se encuentra en su máxima abundancia en el ovario. De esta forma, a medida que la molécula ECD-FSH viaja hacia el ovario, se expondrá a enzimas que se encuentran en sus concentraciones máximas en ese tejido, y la ECD se eliminará, de forma que la FSH pueda interaccionar con el receptor unido a la membrana.
En otra realización adicional, en vez de un sitio de reconocimiento enzimático, se clona una región de articulación flexible entre ECD y FSH, de forma que el ECD no se eliminará enzimáticamente de la hormona. De esta forma, cuando la molécula ECD-FSH llega al ovario, se establecerá una competencia entre el ECD unido a la articulación y el ECD del receptor de FSH que se encuentra sobre la membrana de la célula ovárica.
En una realización adicional preferida de la invención, la proteína híbrida consiste en la agregación entre una pareja de secuencias de aminoácidos, una de las cuales contiene TBP1 (o los fragmentos desde el aminoácido 20 hasta el aminoácido 161 o hasta el aminoácido 190) como (a), y la subunidad a de hCG como (b), y la otra contiene siempre TBP1 (o los mismos fragmentos anteriores) como (a) y la subunidad p de hCG, o sus fragmentos, como (b).
Según esta realización, dependiendo de la secuencia particular que se elija como (b) (la subunidad p entera de hCG, o sus fragmentos o modificaciones), la proteína híbrida resultante tendrá una actividad (sólo la de TBP1), o una combinación de actividades (la de TBP1 con la de hCG). En este último caso, la proteína híbrida se puede usar para la preparación de una composición farmacéutica, por ejemplo, en el tratamiento combinado del sarcoma de Kaposi y de la emaciación metabólica, en el SIDA.
En una realización adicional de la invención, se añaden una o más uniones covalentes entre las dos subunidades (b), para incrementar la estabilidad de la proteína híbrida resultante. Esto se puede hacer, p.ej., añadiendo una o más uniones disulfuro intercatenarias no nativas. Los sitios para estas reticulaciones se pueden deducir de las estructuras conocidas de las hormonas heterodímeras. Por ejemplo, un sitio adecuado en hCG podría ser colocar residuos de cisteína en un residuo Lys45 de la subunidad a, y en un residuo Glu21 de la subunidad p, reemplazando un puente salino (unión no covalente) por una unión disulfuro (unión covalente). Otro objeto de la presente invención son las formas pegiladas, u otras formas modificadas químicamente de las proteínas híbridas.
Un objeto adicional de la presente invención es una molécula de DNA que comprende la secuencia de DNA que codifica para la proteína híbrida anterior, así como secuencias nucleotídicas sustancialmente iguales. "secuencias nucleotídicas sustancialmente iguales" incluye todas las secuencias de ácido nucleico distintas que, en virtud de la degeneración del código genético, codifiquen también la secuencia aminoácida dada.
Para la producción de la proteína híbrida de la invención, la secuencia de DNA (a), se obtiene de clones existentes, como es (b). La secuencia de DNA que codifica la secuencia deseada (a), se liga con la secuencia de DNA que codifica la secuencia deseada (b). Dos de estos productos fusionados se insertan y ligan en un plásmido adecuado, o cada uno en un plásmido diferente. Una vez formado, el vector de expresión o los dos vectores de expresión se introducen en una célula hospedadora adecuada, que expresa a continuación el vector o vectores, para producir la proteína híbrida de la invención, según se definió anteriormente.
El método preferido para preparar el híbrido de la invención es mediante tecnología PCR, usando oligonucleótidos específicos para las secuencias deseadas a copiar a partir de los clones que codifican para las secuencias (a) y (b).
La expresión de cualquiera de las proteínas recombinantes de la invención, según se mencionan aquí, se puede efectuar en células eucariótas (p.ej. levaduras, células de insecto o de mamífero) o células procariotas, usando los vectores de expresión apropiados. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica.
Por ejemplo, las moléculas de DNA que codifican para las proteínas obtenidas mediante cualquiera de los métodos anteriores, se insertan en vectores de expresión construidos apropiadamente mediante técnicas bien conocidas en el estado de la técnica (véase Sambrook et al., 1989). El cDNA dúplex se une a vectores plasmídicos mediante prolongación con colas de homopolímeros o mediante unión de restricción que implica el uso de conectores de DNA sintéticos o técnicas de unión de extremos romos: se usan DNA-ligasas para unir las moléculas de DNA y la unión no deseable se evita mediante tratamiento con fosfatasa alcalina.
A fin de que sea capaz de expresar la proteína deseada, un vector de expresión debería comprender también secuencias nucleotídicas específicas que contengan información reguladora de transcripción y traducción, unida al DNA que codifica la proteína deseada, de tal forma que permita la expresión génica y la producción de la proteína. Primero, a fin de que el gen se transcriba, debería estar precedido por un promotor reconocible por una RNA-polimerasa, al cual se une la polimerasa y, por tanto, inicia el proceso de transcripción. Existen varios de tales promotores en uso, que trabajan con diferentes eficiencias (promotores fuertes y débiles).
Para hospedadores eucariotas, se pueden emplear diferentes secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción, dependiendo de la naturaleza del hospedador. Pueden derivar de fuentes víricas, como adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de simios o similares, en los que las señales reguladoras están asociadas con un gen particular que tiene un nivel de expresión elevado. Ejemplos son el promotor TK del Herpesvirus, el promotor temprano del SV40, el promotor del gen gal14 de la levadura, etc.
Se pueden seleccionar señales reguladoras de la iniciación de la transcripción que permiten la represión y activación, de forma que se puede modular la expresión de los genes.
La molécula de DNA que comprende la secuencia nucleotídica que codifica la proteína híbrida de la invención, se inserta en un vector o vectores, que tiene unidas operativamente las señales reguladoras de la transcripción y la traducción, el cual es capaz de integrar las secuencias génicas deseadas en la célula hospedadora. Las células que se han transformado de manera estable por el DNA introducido, se pueden seleccionar también introduciendo uno o más marcadores que permiten la selección de células hospedadoras que contienen el vector de expresión. El marcador puede proporcionar también fototrofia a un hospedador auxotrópico, resistencia a biocidas, p.ej., antibióticos o metales pesados como cobre, o similares. El gen marcador seleccionable puede estar unido directamente a las secuencias génicas de DNA a expresar, o introducido directamente en la misma célula mediante transfección conjunta. También se pueden necesitar elementos adicionales para la síntesis óptima de las proteínas de la invención.
Factores de importancia en la selección de un vector plasmídico o vírico particular incluyen: la facilidad con la que las células receptoras que contienen el vector pueden ser reconocidas y seleccionadas a partir de aquellas células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un hospedador particular; y si es deseable ser capaces de "lanzar" el vector entre células hospedadoras de diferentes especies.
Una vez que el vector o vectores o la secuencia de DNA que contiene la construcción o construcciones se ha preparado para la expresión, la construcción o construcciones de DNA se pueden introducir en una célula hospedadora apropiada mediante cualquiera de una variedad de medios adecuados: transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación de fosfato cálcico, microinyección directa, etc.
Las células hospedadoras pueden ser procariotas o eucariotas. Se prefieren los hospedadores eucariotas, p.ej., células de mamífero, como células humanas, de mono, ratón y células de ovario de hamster chino (CHO), porque proporcionan modificaciones postraducción a moléculas de proteína, incluyendo plegado correcto o glicosilación en los sitios correctos. Asimismo, las células de levadura pueden realizar modificaciones de péptidos postraducción, incluyendo la glicosilación. Existen diversas estrategias de DNA recombinante que utilizan secuencias de promotor fuerte y un número elevado de copias de plásmidos que se pueden utilizar para la producción de proteínas deseadas en levadura. La levadura reconoce secuencias guía en productos génicos de mamíferos clonados y secreta péptidos que llevan secuencias guía (es decir, precursores peptídicos).
Tras la introducción del vector o vectores, las células hospedadoras se cultivan en un medio selectivo, que selecciona el crecimiento de las células que contienen vector. La expresión de la secuencia o secuencias clonadas origina la producción de las proteínas deseadas.
La purificación de las proteínas recombinantes se realiza mediante cualquiera de los métodos conocidos para este propósito, es decir, cualquier procedimiento convencional que implique extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis o similares. Un procedimiento adicional de purificación que se puede usar preferentemente para purificar la proteína de la invención es la cromatografía de afinidad usando anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína diana y que se producen e inmovilizan sobre una matriz de gel contenida dentro de una columna. Las preparaciones impuras que contienen la proteína recombinante se hacen pasar a través de la columna. La proteína se unirá a la columna mediante el anticuerpo específico, mientras que las impurezas pasarán a través de ella. Tras el lavado, la proteína se eluye del gel mediante un cambio en el pH o en la fuerza iónica.
El término "proteína híbrida", según se usa aquí, se refiere genéricamente a una proteína que contiene dos o más proteínas diferentes o sus fragmentos.
Según se usa aquí, "proteína de fusión" se refiere a una proteína híbrida que consiste en dos o más proteínas, o sus fragmentos, unidos covalentemente entre sí.
El término "agregación", según se usa aquí, designa la formación de interacciones no covalentes fuertemente específicas entre dos cadenas polipeptídicas que forman un complejo, como las existentes entre la subunidad \alpha y \beta de una hormona heterodímera (como FSH, LH, hCG o TSH).
Los términos "ligando" o "proteína ligando", según se usan aquí, se refieren a una molécula, distinta de un anticuerpo o inmunoglobulina, capaz de unirse al dominio de unión a ligando de un receptor; tal molécula puede existir en la naturaleza o se puede modificar químicamente o sintetizar químicamente.
El término "dominio de unión a ligando", según se usa aquí, se refiere a una porción del receptor que está implicada en la unión a un ligando, y es generalmente una porción o esencialmente todo el dominio extracelular.
El término "receptor", según se usa aquí, se refiere a una proteína de membrana, cuya unión con el ligando respectivo activa respuestas celulares secundarias que producen la activación o inhibición de un proceso intracelular.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de la proteína híbrida como medicamento. El medicamento se presenta preferiblemente en forma de una composición farmacéutica que comprende la proteína de la invención junto con uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones farmacéuticas representan también un aspecto adicional de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La invención se entenderá mejor mediante referencia a los dibujos anexos, en los que:
Las Figuras 1(a) y 1(b) muestran las construcciones TBP(20-161)-hCG\alpha y TBP(20-161)-hCG\beta, respectivamente, y las secuencias correspondientes (SEQ ID N^{os}: 1-4).
Las Figuras 2(a) y 2(b) muestran las construcciones TBP(20-190)-hCG\alpha y TBP(20-190)-hCG\beta, respectivamente, y las secuencias correspondientes (SEQ ID N^{os}: 5-8).
La Figura 3 es un gráfico que ilustra el efecto protector dependiente de dosis de TBP-hCG(20-190) expresada en células CHO, sobre la citotoxicidad inducida por TNF\alpha sobre células BT-20 y diversos testigos.
La Figura 4 es un gráfico que ilustra el efecto protector dependiente de dosis de TBP-hCG(20-190) expresada en células COS, sobre la citotoxicidad inducida por TNF-\alpha sobre células BT-20 y diversos testigos.
La Figura 5 es un gráfico que ilustra el efecto protector dependiente de dosis de TBP-hCG(20-161) purificada por afinidad, expresada en células CHO, sobre la citotoxicidad inducida por TNF\alpha sobre células BT-20 y diversos testigos.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La invención se describirá ahora por medio de los siguientes Ejemplos, que no se debe de considerar que limitan de ninguna forma la presente invención.
Ejemplos Materiales y métodos
Las líneas celulares obtenidas en este estudio se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, a no ser que se especifique otra cosa. La línea celular CHO-DUKX se obtuvo de L. Chasin en la Universidad de Columbia, a través de D. Houseman en MIT (39). Las células CHO-DUKX, que carecen de un gen funcional para dihidrofolato-reductasa, se mantuvieron rutinariamente en un medio de Eagles modificado \alpha-plus completo (\alpha (+)MEM), completado con suero bovino fetal al 10% (FBS). Las células COS-7 se mantuvieron rutinariamente en medio de Eagles modificado con Dulbecco (DMEM), complementado con FBS al 10%. A menos que se especifique otra cosa, las células se fraccionaron para mantenerlas en fase log de crecimiento, y los reactivos de cultivo se obtuvieron de GIBCO (Grand Island, Nueva York).
1. Ensamblaje de las construcciones genéticas que codifican las proteínas híbridas
Las asignaciones de numeración para el receptor p55 de TNF se basan en el trabajo de clonación de Wallach (40), mientras que las asignaciones de numeración para las subunidades hCG se basan en las asignaciones de numeración procedentes de los trabajos de clonación de Fiddes (41, 42). La denominación TBP, o proteína de unión a TNF, se refiere a las porciones del dominio extracelular de los receptores de TNF capaces de unirse a TNF. En estos Ejemplos, las construcciones de DNA se denominarán proteínas híbridas de TBP, con la pareja y la región de TBP indicadas en la nomenclatura de la construcción. Todas las construcciones TBP-hCG contienen el péptido señal de la hormona de crecimiento humana (hGH), en lugar de la secuencia señal de p55 nativa. Además, el péptido señal de hGH se ha colocado de forma que precede inmediatamente el residuo Asp20 de TBP, que se anticipa para hacer de éste el primer residuo en la proteína madura, secretada. Estas modificaciones no son esenciales para el concepto básico de usar hCG como pareja de la proteína híbrida.
Los DNAs que codifican las proteínas híbridas se construyeron usando metodología PCR (43).
a. TBP1 (20-161)-hCG
La construcción inicial TBP-hCG se obtuvo mediante ingeniería genética para que contuviese el dominio de unión a ligando de la región extracelular del receptor de TNF p55 (desde Asp20 hasta el residuo Cys161, inclusive), fusionado a través de un conector corto a las subunidades hCG \alpha y \beta (empezando en los residuos \alphaCys7 o \betaPro7, respectivamente). Esta construcción, denominada a partir de aquí TBP1 (20-161)-hCG, es un heterodímero de dos subunidades de hCG, TBP1 (20-161)-hCG\alpha y TBP1 (20-161)-hCG\beta.
Los cebadores oligonucleotídicos usados para la construcción TBP1 (20-161) - hCG\alpha fueron:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \hskip0.2cm  cebador 1  ( \alpha  \beta ) \+ TTT TCT
CGA GAT GGC TAC AGG TAA GCG CCC (SEQ ID Nº: 11)\cr 
 \hskip0.2cm  cebador 2  ( \alpha ) \+ ACC TGG GGC AGC
ACC GGC ACA GGA GAC ACA CTC GTT TTC (SEQ ID Nº: 12)\cr 
 \hskip0.2cm  cebador 3  ( \alpha ) \+ TGT GCC GGT GCT
GCC CCA GGT TGC CCA GAA TGC ACG CTA CAG (SEQ ID Nº: 13)\cr 
 \hskip0.2cm  cebador 4  ( \alpha ) \+ TTT TGG ATC CTT
AAG ATT TGT GAT AAT AAC AAG TAC (SEQ ID Nº:
14)\cr}
Éstos y todos los demás cebadores descritos en estos Ejemplos, se sintetizaron en una máquina de síntesis de DNA de Applied Biosystems Modelo 392 (ABI, Foster City, California), usando química de fosforamidita.
Debido a que ambas construcciones de subunidades de TBP-hCG tienen el mismo extremo 5' (es decir, el extremo 5' de la construcción TBP-hCG), se usó el cebador 1(\alpha\beta) para ambas construcciones de la subunidad TBP-hCG. Los otros cebadores usados para la construcción TBP1(20-161)-hCG\beta fueron:
cebador 2(\beta) CCG TGG ACC AGC ACC AGC ACA GGA GAC ACA CTC GTT TTC (SEQ ID Nº: 15)
cebador 3(\beta) TGT GCT GGT GCT GGT CCA CGG TGC CGC CCC ATC AAT (SEQ ID Nº: 16)
cebador 4(\beta) TTT TGG ATC CTT ATT GTG GGA GGA TCG GGG TG (SEQ ID Nº: 17)
Los cebadores 2(\alpha) y 3(\alpha) son complementos inversos, y cubren ambos el extremo 3' de la región que codifica el dominio extracelular de p55, y el extremo 5' de la subunidad hCG \alpha. De forma similar, los cebadores 2(\beta) y 3(\beta) son también complementos inversos, y cubren el extremo 3' de la región que codifica el dominio extracelular de p55 y el extremo 5' de la subunidad hCG \beta.
Se realizaron dos reacciones PCR para cada una de las construcciones de las subunidades TBP-hCG. La primera usó los cebadores 1(\alpha\beta) y 2(\alpha o \beta), y usó como molde un plásmido que codificaba los residuos de p55 solubles 20-180, precedidos por el péptido señal de hGH (plásmido pCMVhGHspcDNA.pA4). La segunda usó los cebadores 3(\alpha o \beta) y 4(\alpha o \beta), y usó como molde, bien el plásmido pSVL-hCG\alpha o pSVL-hCG\beta (44). La PCR se realizó usando polimerasa Vent® de New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) según las recomendaciones del fabricante, usando para cada reacción 25 ciclos y las siguientes condiciones:
100 \mug de molde de DNA
1 \mug de cada cebador
2 U de polimerasa Vent® (New England Biolabs)
desnaturalización a 99ºC durante 30 segundos
hibridación a: 59ºC durante 30 segundos para los cebadores 1(\alpha\beta) y 2(\alpha)
59ºC durante 30 segundos para cebadores 3(\alpha) y 4(\alpha)
57ºC durante 30 segundos para cebadores 1(\alpha\beta) y 2(\beta)
63ºC durante 30 segundos para cebadores 3(\beta) y 4(\beta)
extensión a 75ºC durante 75 segundos.
Se confirmó que los productos de PCR eran del tamaño esperado mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2% y tinción con bromuro de etidio. Los fragmentos se purificaron a continuación mediante paso sobre una columna de Wizard (Promega) según las recomendaciones del fabricante de la columna.
La secuencia codificadora final de TBP1(20-161)-hCG\alpha se ensambló mediante PCR de fusión, usando el cebador 1(\alpha\beta) y el cebador 4(\alpha), y usando como molde los productos purificados procedentes de los fragmentos de p55 y hCG \alpha obtenidos de las primeras reacciones de PCR. Primeramente, los dos moldes, que debido al solapamiento entre los cebadores 2(\alpha) y 3(\alpha) se podían desnaturalizar e hibridar conjuntamente, se hicieron pasar a través de 10 ciclos de PCR, en ausencia de ningún cebador añadido. Las condiciones para estos ciclos fueron esencialmente las mismas que las usadas anteriormente, excepto porque la hibridación se realizó a 67ºC y la extensión se realizó durante 2 minutos. Al final de estos 10 ciclos, se añadieron los cebadores 1(\alpha\beta) y 4(\alpha), y se realizaron otros 10 ciclos. Las condiciones para este conjunto final de reacciones fueron las mismas que se usaron anteriormente, excepto porque se usó una temperatura de hibridación de 59ºC, y la extensión se realizó durante 75 segundos.
El análisis de los productos de esta reacción mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% confirmó que se obtenía el fragmento esperado de aproximadamente 1100 pb. La reacción se hizo pasar a través de una columna de Wizard para purificar el fragmento, que se digirió a continuación con XbaI y BamHI y se volvió a purificar en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 0,7%. El fragmento purificado se subclonó en el plásmido pSVL (Pharmacia), que se había digerido previamente con XbaI y BamHI y se había purificado en gel sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 0,8%. Después del ligamiento con ligasa T4, la mezcla se usó para transformar E. coli AG1 y luego se sembró sobre placas de LB/ampicilina, para su cultivo durante la noche a 37ºC. Los DNAs plasmídicos procedentes de colonias resistentes a ampicilina se analizaron mediante digestión con XhoI y BamHI para confirmar la presencia del inserto (que se escinde en este digerido). Se encontraron seis clones que contenían insertos y uno (clon 7) se seleccionó para un avance posterior y se denominó pSVLTBPhCG\alpha (que contenía TBP1(20-161)-hCG\alpha). La secuenciación de DNA didesoxi (usando Sequenase®, U.S. Biochemicals, Cleveland, Ohio) del inserto en este vector, confirmó que la construcción era correcta, y que no se habían introducido cambios no deseados.
La secuencia codificadora final de TBP1(20-161)-hCG\beta se ensambló de forma similar a la descrita para TBP1(20-161)-hCG\alpha, usando PCR de fusión y los cebadores 1(\alpha\beta) y 4(\beta), y usando como molde los productos purificados de los fragmentos de p55 y hCG\beta obtenidos de las primeras reacciones PCR. El plásmido pSVL resultante que contenía el inserto de interés, se denominó pSVLTBPhCG\beta.
b. TBP(20-190)-hCG
Se preparó un segundo conjunto de proteínas TBP-hCG, mediante modificación de las construcciones TBP(20-161)-hCG, para producir un análogo que contenía TBP que se extendía desde Asp20 hasta Thr190, en lugar de la región 20-161 del análogo inicial. Esto se realizó reemplazando el fragmento entre los sitios BglII y XbaI en el plásmido pSVLTBPhCG\alpha con un fragmento de PCR que contenía el cambio. Este fragmento de PCR se generó usando PCR de fusión. Los cebadores fueron:
cebador 1 TTT TAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC (SEQ ID Nº: 18)
cebador 2 TGT GGT GCC TGA GTC CTC AGT (SEQ ID Nº: 19)
cebador 3 ACT GAG GAC TCA GGC ACC ACA GCC GGT GCT GCC CCA GGT TG (SEQ ID Nº:20)
cebador 4 TTT TTC TAG AGA AGC AGC AGC AGC CCA TG (SEQ ID Nº: 21).
Los cebadores 1 y 2 se usaron para generar la secuencia que codificaba los residuos adicionales de p55 de 161-190. La reacción PCR se realizó esencialmente como se describió anteriormente, usando 1 \mug de cada cebador y pUC-p55 como molde. De forma similar, los cebadores 3 y 4 se usaron para generar mediante PCR el conector entre el extremo 3' de la región que codifica TBP, y el extremo 5' de la región que codifica la subunidad hCG\alpha, usando como molde el plásmido pSVLTBPhCG\alpha. Se confirmó que los productos de estas reacciones PCR tenían el tamaño correcto (aproximadamente 296 pb y 121 pb respectivamente) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) sobre un gel al 8%, y luego se purificaron usando una columna Wizard. El diseño de los cebadores 2 y 3 fue tal, que contenían una región de solapamiento, de forma que los dos productos de PCR (procedentes de los cebadores 1 y 2 y de los cebadores 3 y 4) se podían hibridar para PCR de fusión con los cebadores 1 y 4. Posteriormente a la reacción de fusión, se confirmó el producto deseado de aproximadamente 400 pb y se purificó usando un gel de agarosa al 1,5% y una columna de Wizard. Este DNA se digirió a continuación con BglII y XbaI, y se ligó con pSVLTBPhCG\alpha digerido con BglII/XbaI. La presencia de un inserto en plásmidos aislados procedentes de E. coli AG1 transformada, se confirmó mediante digestión con BglII y XbaI. La nueva construcción se denominó pSVLTBP(20-190)-
hCG\alpha.
De forma similar, el plásmido pSVLTBPhCG\beta se modificó mediante sustitución del fragmento BglII-XcmI. Sin embargo, esto se hizo mediante subclonación de un único producto de PCR, más que con un producto de PCR de fusión. Se usaron los cebadores 1 y 2b (véase debajo) con pUC-p55 como molde.
100
El producto de PCR resultante (aproximadamente 337 pb) se confirmó y purificó según se describió anteriormente, se digirió con BglII y XcmI, y luego se ligó en pSVLTBPhCG\beta digerido con BglII/XbaI. La presencia de un inserto en plásmidos aislados de E. coli AG1 transformada se confirmó mediante digestión con BglII y XcmI. La nueva construcción se denominó pSVLTBP(20-190)-hCG\beta.
Las nuevas construcciones se confirmaron posteriormente mediante secuenciación de DNA.
Además de producir estos nuevos plásmidos basados en pSVL, estas construcciones se subclonaron también en otros vectores de expresión que posiblemente eran más adecuados para expresión estable en CHO, particularmente el vector D\alpha, descrito previamente como plásmido CLH3AXSV2DHFR (45). Esto se logró convirtiendo un sitio BamHI que flanqueaba los insertos en los vectores basados en pSVL, en un sitio XhoI, y luego escindiendo el inserto con XhoI y clonándolo en D\alpha digerido con XhoI.
2. Expresión transitoria y estable de las proteínas híbridas
Se realizaron transfecciones de células COS-7 (ATCC CRL 1651, ref. 46) para la expresión transitoria de las proteínas híbridas TBP-hCG, usando electroporación (47). Se eliminaron células COS-7 que crecían exponencialmente, mediante tripsinización, se recogieron mediante centrifugación suave (800 rpm, 4 minutos), se lavaron con solución salina fría tamponada con fosfato (PBS), pH 7,3-7,4 y luego se volvieron a obtener glóbulos mediante centrifugación. Las células se volvieron a poner en suspensión a una concentración de 5 x 10^{6} células por 400 \mul de PBS frío, y luego se mezclaron con 10 \mug de DNA plasmídico en una cubeta de electroporación preenfriada, de 2 mm de espacio intermedio. Para cotransfecciones, se usaron 5 \mug de cada plásmido. La cubeta y las células se enfriaron en hielo durante 10 minutos adicionales, y luego se sometieron a electroporación usando un instrumento de BTX modelo 600 y condiciones de 125 V, 950 \muF y R = 8. A continuación, las células se dejaron enfriar en hielo durante 10 minutos, se transfirieron a un tubo cónico de 15 ml que contenía 9,5 ml de medio completo (medio de Dulbecco modificado con Eagle (DMEM), complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y L-glutamina al 1%) a temperatura ambiente, y se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Tras mezcladura suave en el tubo de 15 ml, el contenido completo se sembró en dos placas P100 y se colocó en una incubadora de CO_{2} al 5%, a 37ºC. Tras 18 horas, el medio se cambió, y en algunos casos el nuevo medio contenía sólo FBS al 1% o al 0%. Tras otras 72 horas, el medio condicionado se sembró, se centrifugó para eliminar las células y luego se almacenó congelado a -70ºC.
Las transfecciones de células CHO-DUKX (CHO) para expresión transitoria o estable, se realizaron usando precipitación de DNA en fosfato cálcico. Veinticuatro horas antes de la transfección, las células CHO que crecían exponencialmente se sembraron en placas de cultivo de 100 mm, a una densidad de 7,5 x 10^{5} células por placa. En el día de la transfección, se introdujeron 10 \mug de DNA plasmídico en 0,5 ml de tampón de transfección (véase más adelante), se añadieron 31 \mul de CaCl_{2} 2 M, la solución de DNA-CaCl_{2} se mezcló mediante movimiento vorticial y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Después de esto, el medio se aspiró de las placas, el DNA se añadió a las células usando una pipeta de plástico estéril, y las células se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Al final de este período, se añadieron a las placas 5 ml de \alpha (+)MEM completo que contenía FBS al 10%, las cuales se incubaron a 37ºC durante 4-6 horas. El medio se eliminó luego por aspiración, y las células se sometieron a un choque de glicerol, incubándolas con una solución de glicerol al 15% en tampón de transfección a 37ºC durante 3,5 minutos. Tras la eliminación de la solución de glicerol, las células se lavaron dos veces con PBS, se volvieron a alimentar con 10 ml de \alpha (+)MEM completo, FBS al 10%, y se devolvieron a la incubadora a 37ºC. Para transfecciones estables, tras 48 horas las células se fraccionaron 1:10 y se alimentaron con medio de selección (\alpha-menos MEM completo (carente de nucleósidos), FBS dializado al 10%, y metotrexato 0,02 \muM). Las células no transfectadas (no resistentes) se eliminaron típicamente en 3-4 semanas, dejando una población de células transfectadas, resistentes a metotrexato.
3. Cuantificación de expresión
La secreción de las proteínas híbridas por las células transfectadas se valoró usando un kit de análisis comercial para p55 soluble (R&D Systems; Minneapolis, Minnesota), según las instrucciones del fabricante. Este análisis proporciona también una estimación de las concentraciones de proteína híbrida en medios condicionados y tratados, que sirvió como base para seleccionar las dosis a usar en el bioanálisis.
4. Valoración de formación de heterodímeros
Para valorar la capacidad de las fusiones de subunidades TBP-hCG para combinarse y formar heterodímeros, se realizó un inmunoanálisis intercalado, usando anticuerpos para las subunidades hCG. En este inmunoanálisis, se recubrieron placas de microvaloración con un anticuerpo monoclonal para la subunidad hCG \beta y se usaron para la captura del analito. El anticuerpo de detección principal es un anticuerpo policlonal de cabra fabricado frente a la subunidad TSH \alpha humana (nº 082422G- Biodesign International; Kennenbunkport, Maine), que se detecta a su vez usando anticuerpo policlonal anti-cabra de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (Cappel; Durham, North Carolina).
En este trabajo se usaron varios anticuerpos anti-subunidad hCG \beta diferentes, ninguno de los cuales muestra reactividad cruzada detectable con la subunidad \alpha libre. Uno de estos anticuerpos (3/6) se usa en el kit de análisis de hCG del clon MAIA disponible en el comercio (Biodata; Roma, Italia).
Se recubrieron placas de microvaloración que se unen a gran cantidad de proteína (Costar nº 3590), con anticuerpo de captura mediante incubación (2 horas a 37ºC) con 100 \mul/pocillo de una solución de 5 \mug/ml de anticuerpo en tampón de recubrimiento (PBS, pH 7,4, Ca^{++} 0,1 mM, Mg^{++} 0,1 mM). Tras lavar una vez con solución de lavado (PBS, pH 7,4 + Tween 20 al 0,1%), la placa se bloquea rellenando completamente los pocillos (\approx 400 \mul/pocillo) con solución bloqueante (albúmina de suero bovino al 3% (BSA; fracción V-A-4503 Sigma) en PBS, pH 7,4) e incubando durante una hora a 37ºC o durante la noche a 4ºC. La placa se lava luego dos veces con solución de lavado, y se añaden las muestras de referencia y experimental diluidas (5 mg/ml de BSA en PBS, pH 7,4), para producir un volumen de 100 \mul. Tras incubar las muestras y la placa durante dos horas a 37ºC, la placa se lava de nuevo dos veces con solución de lavado. Se añade (100 \mul/pocillo) el anticuerpo de detección principal, diluido en diluyente 1:5000, y se incuba durante una hora a 37ºC. Se añade (100 \mul/pocillo) el anticuerpo de detección secundario (Ig anti-cabra de conejo conjugada con HRP), diluido en diluyente 1:5000, y tras incubación durante 1 hora a 37ºC, la placa se lava tres veces con solución de lavado. Se añaden 100 \mul de solución sustrato de TMB (Kirkegaard and Perry Laboratories), la placa se incuba 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, y luego se para la reacción enzimática mediante adición de 50 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 0,3 M. Después se analiza la placa usando un conjunto lector de placa de microvaloración para una longitud de onda de 450 nm.
5. Purificación parcial
Para cuantificar mejor las actividades de estas proteínas híbridas, se purificaron parcialmente proteínas híbridas TBP-hCG mediante cromatografía de inmunoafinidad. El anticuerpo usado fue un anticuerpo monoclonal disponible comercialmente de R&D Systems (MAB Nº 225). La columna fue sefarosa activada con CNBr, cargada con el anticuerpo siguiendo las instrucciones del fabricante (Pharmacia).
Se recogió medio condicionado de matraces confluyentes T-175 de cada línea, usando recogidas diarias de 50 ml de medio SFMII, cinco recogidas para cada línea. Las recogidas se sometieron a centrifugación (100 rpm), para eliminar los desechos celulares. El material se analizó después para el contenido de TBP, usando el inmunoanálisis comercial y se concentró (unidades Centricon de Amicon; Beverly, Massachusetts), de forma que la concentración de TBP aparente era aproximadamente 50 ng/ml.
Se llevaron diez ml de TBP-hCG concentrado (muestra nº 18873) hasta NaCl aproximadamente 1 M, mediante adición de NaCl y ajuste de la solución hasta una conductividad de aproximadamente 85 mS/cm. Ésta se hizo pasar a través de una columna de inmunoafinidad anti-TBP de 0,5 ml. El flujo a través de la misma se recogió y se pasó a través de la columna una segunda vez. Después de esto, la columna se lavó con NaCl 1 M en PBS. El TBP(20-161)-hCG unido se recogió tras elución con ácido cítrico 50 mM (pH 2,5). El eluato (aproximadamente 7 ml) se concentró mediante filtración usando Centricon-10 de Amicon, según las instrucciones del fabricante (Amicon), hasta un volumen de aproximadamente 200 \mul. Se añadieron aproximadamente 800 \mul de PBS para llevar el volumen de la muestra hasta 1 ml, el cual se almacenó a 4ºC hasta que se analizó mediante bioanálisis.
6. Valoración de actividad anti-TNF
Se han descrito numerosos análisis de citotoxicidad inducida por TNF in vitro, para evaluar análogos de receptores de TNF solubles. En esta patente se utilizó un análisis empleando una línea celular de carcinoma de mama humano, células BT-20 (ATCC HTB 19). El uso de estas células como base para un análisis de TNF se ha descrito previamente (48). Estas células se cultivan a 37ºC en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10% inactivado térmicamente. Las células se cultivaron hasta una confluencia máxima de 80-90%, que implicaba fraccionar cada 3-4 días con una densidad de siembra de aproximadamente 3 x 10^{6} células por matraz T175 cm^{2}.
El análisis de BT-20 usa la inclusión de un colorante celular, cristal violeta, como método de detección para valorar la supervivencia de células tras tratamiento con TNF. Las células muertas son incapaces de absorber y retener el colorante.
En resumen, el protocolo usado para el análisis de la actividad anti-TNF es el siguiente. TNF\alpha humano recombinante (R&D Systems) y las muestras experimentales se constituyen en medio (RPMI 1640 con FBS termoinactivado al 5%) y se añaden a los pocillos de placas de cultivo de 96 pocillos. Las células se siembran a continuación en estos pocillos a una densidad de 1 x 10^{5} células/pocillo. La cantidad de TNF\alpha añadida se determinó anteriormente en estudios de titulación, y representa una dosis a la cual mueren aproximadamente 50% de las células.
Tras la adición de las muestras, las células se cultivan durante 48 horas a 39ºC, tras lo cual, la proporción de células vivas se determina usando tinción con cristal violeta y un lector de placa de microvaloración (570 nm).
Resultados 1. Construcciones en estudio
Los diseños de las proteínas híbridas estudiadas se resumen brevemente debajo; se estudiaron dos proteínas testigo, una proteína monómera soluble p55 (r-hTBP-1) y una proteína de fusión dímera TBP-inmunoglobulina (TBP-IgG3) (preparada esencialmente según se describe en (10)), con fines comparativos.
Construcción TBP N-terminal TBP C-terminal Pareja de fusión
r-hTBP-1 mezcla de 9 y 20 180 ninguna
TBP-IgG3 mezcla de 9 y 20 190 región constante de la
cadena pesada de IgG3
TBP(20-161)-hCG 20 161 hCG\alpha y hCG\beta
(heterodímero)
TBP(20-190)-hCG 20 190 hCG\alpha y hCG\beta
(heterodímero)
Las secuencias de los DNAs que codifican TBP(20-190)-hCG y TBP(20-161)-hCG se proporcionan en las Figuras 1 y 2, respectivamente.
2. Secreción de proteínas TBP-hCG
Se descubrió que todas las construcciones analizadas se producían y secretaban hacia medios de cultivo por células de mamífero transfectadas. Los datos que ilustran esto se muestran en las Tablas 1 y 2.
3. Las proteínas de fusión TBP-hCG(\alpha/\beta) se ensamblan en heterodímeros
La combinación de TBP-hCG\alpha y TBP-hCG\beta se confirmó usando el análisis de intercalación para el heterodímero hCG. Sólo la transfección combinada de fusiones de subunidades \alpha y \beta producía la detección de heterodímero (Tabla 3).
4. Las proteínas híbridas TBP-hCG exhibían actividad incrementada respecto al monómero TBP
Se descubrió que las proteínas híbridas producidas en células COS-7 o CHO eran inhibidores potentes de TNF\alpha en el bioanálisis de BT-20. Algunas de las muestras analizadas se resumen en la Tabla 4.
Se incluyeron testigos negativos (medios condicionados procedentes de falsas transfecciones) para las muestras de medios 1x.
Según se ilustra en las Figuras 3-5 (puntos sobre el eje y), la adición de TNF (2,5 ng/ml) produce una clara reducción del número de células vivas (según se valoró mediante DO 570). En cada caso, las muestras activas tienen como efecto protector máximo el restablecimiento de la viabilidad celular hasta el nivel observado en ausencia de TNF (es decir, el testigo denominado "células solas").
Los testigos positivos, r-hTBP-1 y TBP-IgG3, son ambos protectores, mostrando una clara dependencia de dosis y DE50 (dosis medianas efectivas) de aproximadamente 100 ng/ml para r-hTBP-1 (Figs. 3-5) y aproximadamente 1,5 ng/ml para TBP-IgG3 (Fig. 3), respectivamente.
Las construcciones TBP-hCG procedentes de medios 1x (CHO o COS) o de la inmunopurificación, muestran protección dependiente de dosis con DE50 aproximados que varían de 2 a 11 ng/ml (Figs. 3-5).
Los resultados del bioanálisis in vitro se describen en la Tabla 5. Los datos indican que las proteínas híbridas inhiben la toxicidad de TNF, y que son sustancialmente más potentes que el monómero TBP. Los testigos negativos carecían de actividad protectora.
Además de la posibilidad de que la dimerización de TBP pueda incrementar la actividad, también es posible que la actividad de las proteínas híbridas no esté relacionada con la interacción dímera con TBP, sino más bien con la inhibición estérica debida a la interferencia de la pareja del híbrido con la unión del TBP/TNF soluble a los receptores de TNF de la superficie celular.
La referencia a etapas del método conocidas, etapas del método convencionales o métodos convencionales, no es de ningún modo una admisión de que ningún aspecto, descripción o realización de la presente invención esté descrita, enseñada o sugerida en el estado de la técnica relevante.
La descripción anterior de las realizaciones específicas revelará tan completamente la naturaleza general de la invención, que otros podrán, aplicando el conocimiento comprendido en el estado de la técnica (incluyendo los contenidos de las referencias aquí citadas), modificar y/o adaptar fácilmente tales realizaciones específicas para diversas aplicaciones, sin experimentación innecesaria, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por tanto, se pretende que tales adaptaciones y modificaciones estén comprendidas en el significado y tipo de equivalentes de las realizaciones descritas, basadas en las enseñanzas y orientaciones presentadas en esta memoria. Se tiene que entender que la fraseología y terminología en esta memoria es para fines de descripción y no de limitación, de forma que la terminología o fraseología de la presente memoria se tiene que interpretar por el experto en la técnica a la luz de las enseñanzas y orientaciones presentadas en esta memoria, en combinación con el conocimiento del técnico medio en la materia.
Tablas TABLA 1 Expresión transitoria de COS-7 (TBP-ELISA)
Proteína híbrida Concentración (pg/ml)
TBP1 66
TBP-hCG\alpha(20-161) 5,1
TBP-hCG\beta(20-161) 0,5
TBP-hCG(20-161) 2,7
testigo <0,25
Las construcciones se expresaron usando pSVL (Pharmacia)
TABLA 2 Expresión transitoria de COS-7 (TBP-ELISA)
Proteína híbrida Concentración (pg/ml)
TBP1 131
TBP-hCG\alpha (20-190) 81
TBP-hCG\beta(20-190) 9
TBP-hCG(20-190) 62
testigo <1
Las construcciones se expresaron usando un vector que contenía un promotor de metalotioneína de ratón - pD\alpha
TABLA 3 Expresión transitoria de COS-7 (análisis del heterodímero de hCG)
Proteína híbrida Concentración (pg/ml)
TBP1 <0,2
TBP-hCG\alpha (20-190) <0,2
TBP-hCG\beta(20-190) <0,2
TBP-hCG(20-190) 38
testigo <0,2
Las construcciones se expresaron usando un vector que contenía un promotor de metalotioneína de ratón - pD\alpha
TABLA 4 Muestras analizadas para actividad anti-TNF
Construcción Fuente de células Naturaleza de la muestra
r-hTBP-1 CHO purificada
TBP-IgG3 CHO medio condicionado 1x
TBP(20-161)-hCG CHO inmunopurificada (anti-TBP)
TBP(20-190)-hCG CHO medio condicionado 1x
TBP(20-190)-hCG COS medio condicionado 1x
TABLA 5 Valoración preliminar de las proteínas híbridas en el análisis de citotoxicidad de TNF
Construcción Pareja de fusión Actividad anti-TNF (DE50) en
bioanálisis de BT-20^{**}
r-hTBP-1 ninguna 100 ng/ml
TBP-IgG3 región constante de la cadena 1,5 ng/ml
pesada de IgG3
TBP(20-161)-hCG hCG\alpha y hCG\beta (heterodímero) 2 ng/ml
TBP(20-190)-hCG hCG\alpha y hCG\beta (heterodímero) 8-11 ng/ml
** La cuantificación de material para la dosificación y estimación de DE50 se realizó usando el TBP
\hskip0.4cm ELISA.
Referencias
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48. Yen, J. et al., J. Immunotherapy 10:174-181, 1991.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Applied Research Systems ARS Holding N.V:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 14 John B. Gorsiraweg
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Curaçao
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Antillas holandesas
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: CAMPBELL, Robert C.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 25 Meadowbrook Drive
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Wrentham
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Massachusetts
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: JAMESON, Bradford A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
STREET: 76 Robins Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Milton
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
ESTADO: Massachusetts
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: CHAPPEL, Scott C.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 125 Canton Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Milton
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Massachusetts
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS HÍBRIDAS
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 22
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: BROWDY AND NEIMARK
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 419 Seventh Street N.W., Ste. 300
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: D.C.
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 22207
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
SOPORTE LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn emisión nº 1.0, Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD PREVIOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 60/011.936
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE SOLICITUD: 20 de febrero de 1996
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Browdy, Roger L.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 25.618
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE SUMARIO: CAMPBELL=2A PCT
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (202) 628-5197
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (202) 737-3528
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1049 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGOS DISTINTIVOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 278..1047
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 256 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1202 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGOS DISTINTIVOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 279..1199
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
5
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 307 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1147 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGOS DISTINTIVOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 278..1132
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 285 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
11
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1301 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGOS DISTINTIVOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 279..1287
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 336 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
15
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Ala Ala Pro Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Ala Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTCTCGAG ATGGCTACAG GTAAGCGCCC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCTGGGGCA GCACCGGCAC AGGAGACACA CTCGTTTTC 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTGCCGGTG CTGCCCCAGG TTGCCCAGAA TGCACGCTAC AG 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTGGATCC TTAAGATTTG TGATAATAAC AAGTAC 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA : cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGTGGACCA GCACCAGCAC AGGAGACACA CTCGTTTTC 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTGCTGGTG CTGGTCCACG GTGCCGCCCC ATCAAT 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTGGATCC TTATTGTGGG AGGATCGGGG TG 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTAGATCT CTTCTTGCAC AGTGGAC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTGGTGCCT GAGTCCTCAG T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTGAGGACT CAGGCACCAC AGCCGGTGCT GCCCCAGGTT G 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTTCTAGA GAAGCAGCAG CAGCCCATG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 75 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
17

Claims (25)

1. Una proteína híbrida que comprende dos secuencias aminoácidas expresadas conjuntamente formando un dímero, que comprenden cada una:
(a)
al menos una secuencia aminoácida seleccionada del grupo formado por un receptor homómero, una cadena de un receptor heterómero y los fragmentos de las mismas que mantengan la capacidad de unión ligando-receptor; y
(b)
Una subunidad de una hormona proteínica heterodímera o sus fragmentos que mantengan la capacidad de la subunidad para formar un heterodímero con otras de sus subunidades.
en la que las secuencias (a) y (b) están unidas directamente o a través de un conector peptídico, y en la que la secuencia (b) en cada una de dichas dos secuencias expresadas conjuntamente es susceptible de agregarse para formar un complejo dímero.
2. Una proteína híbrida según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia (a) se selecciona del grupo formado por TBP1, TBP2 o sus fragmentos que contengan todavía el dominio de unión al ligando; el dominio extracelular del receptor IFN\alpha/\beta o el receptor IFN\gamma; o un receptor de gonadotropina o sus fragmentos extracelulares.
3. Una proteína híbrida según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia (b) se selecciona del grupo formado por las subunidades de hCG, FSH, LH, TSH o inhibina y sus fragmentos.
4. Una proteína híbrida según la reivindicación 3, en la que dicha secuencia (b) es hCG y hCG se ha mutagenizado para eliminar su actividad biológica.
5. Una proteína híbrida según la reivindicación 1, en la que la secuencia (a) está unida al extremo amino, al extremo carboxilo, o a ambos extremos de la secuencia (b).
6. Una proteína híbrida según la reivindicación 1, en la que dicha proteína híbrida es una molécula monofuncional, bifuncional o multifuncional.
7. Una proteína híbrida según la reivindicación 1, en la que dichas dos secuencias aminoácidas expresadas conjuntamente incluyen cada una la secuencia de TBP1 o su fragmento correspondiente a los residuos aminoácidos 20-161 o 20-190 de TBP1, como secuencia (a), y las respectivas subunidades \alpha y \beta de hCG o sus fragmentos, como secuencia (b).
8. Una proteína híbrida según la reivindicación 7, en la que dicha proteína comprende SEQ ID Nº: 2 y 4, o SEQ ID Nº: 6 y 8.
9. Una proteína híbrida según la reivindicación 1, en la que dichas dos secuencias aminoácidas expresadas conjuntamente incluyen cada una el dominio extracelular de un receptor de gonadotropina como secuencia (a) y las subunidades \alpha y \beta respectivas de una gonadotropina como secuencia (b).
10. Una proteína híbrida según la reivindicación 9, en la que dicha secuencia (a) es el dominio extracelular del receptor de FSH y la secuencia (b) es una subunidad de FSH.
11. Una proteína híbrida según la reivindicación 9, en la que dichas secuencias (a) y (b) están unidas con un conector peptídico.
12. Una proteína híbrida según la reivindicación 11, en la que dicho conector peptídico tiene un sitio de escisión enzimática.
13. Una proteína híbrida según la reivindicación 12, en la que dicho sitio de escisión enzimática es un sitio de escisión de trombina.
14. Una proteína híbrida según la reivindicación 12, en la que dicho sitio de escisión enzimática es reconocido y escindido por una enzima que se encuentra en el ovario.
15. Una proteína híbrida según la reivindicación 11, en la que dicho conector peptídico sirve como articulación flexible.
16. Una proteína híbrida según la reivindicación 1, en la que se añaden una o más uniones covalentes entre las dos subunidades (b).
17. Una molécula de DNA que codifica una de dichas dos secuencias aminoácidas que forman una proteína híbrida según la reivindicación 1.
18. Un vector de expresión que contiene una o dos moléculas de DNA que codifican secuencias aminoácidas que forman una proteína híbrida según la reivindicación 17.
19. El vector de expresión de la reivindicación 18, en la que dicha molécula de DNA es SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 5 o SEQ ID Nº: 7.
20. Una célula hospedadora que contiene uno o dos vectores de expresión diferentes según la reivindicación 18 y susceptible de expresar dicha proteína híbrida.
21. Un método para producir una proteína híbrida que comprende cultivar una célula hospedadora según la reivindicación 19, y recuperar la proteína híbrida expresada por la misma.
22. Una composición farmacéutica que comprende una proteína híbrida según la reivindicación 1 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
23. Uso de la proteína híbrida de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para la preparación de un medicamento.
24. Uso de la proteína híbrida de la reivindicación 7 para la preparación de un medicamento para enfermedades humanas que requieren la inhibición del TNF.
25. Uso de la proteína híbrida de la reivindicación 10 para la preparación de un medicamento para inducir la maduración folicular.
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