EA002474B1 - Гибридный белок, образующий гетеродимеры, способ его получения и использования - Google Patents
Гибридный белок, образующий гетеродимеры, способ его получения и использования Download PDFInfo
- Publication number
- EA002474B1 EA002474B1 EA199800744A EA199800744A EA002474B1 EA 002474 B1 EA002474 B1 EA 002474B1 EA 199800744 A EA199800744 A EA 199800744A EA 199800744 A EA199800744 A EA 199800744A EA 002474 B1 EA002474 B1 EA 002474B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- sequence
- hybrid protein
- receptor
- accordance
- seeg
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 117
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 108
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 64
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 19
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 102000001895 Gonadotropin Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010040490 Gonadotropin Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000003325 follicular Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 claims abstract description 3
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract description 3
- 101000653510 Homo sapiens TATA box-binding protein-like 2 Proteins 0.000 claims abstract 3
- 102100030631 TATA box-binding protein-like 2 Human genes 0.000 claims abstract 3
- 102000008175 FSH Receptors Human genes 0.000 claims abstract 2
- 108010060374 FSH Receptors Proteins 0.000 claims abstract 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims abstract 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims abstract 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 26
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 10
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 10
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 3
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 claims 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 claims 1
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 claims 1
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 claims 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 claims 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 claims 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 claims 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 claims 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 64
- 102100040296 TATA-box-binding protein Human genes 0.000 abstract description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 24
- 101001125540 Homo sapiens 26S proteasome regulatory subunit 6A Proteins 0.000 abstract description 10
- 101000891654 Homo sapiens TATA-box-binding protein Proteins 0.000 abstract description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 abstract description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract description 3
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 abstract description 2
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 abstract 1
- 101710113649 Thyroid peroxidase Proteins 0.000 abstract 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 68
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 38
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 101710145783 TATA-box-binding protein Proteins 0.000 description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 102100036089 Fascin Human genes 0.000 description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 101100167439 Arabidopsis thaliana CLPC1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100509022 Arabidopsis thaliana IRM1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 101000642811 Oryza sativa subsp. indica Soluble starch synthase 1, chloroplastic/amyloplastic Proteins 0.000 description 2
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150046224 ABAT gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000010170 Death domains Human genes 0.000 description 1
- 108050001718 Death domains Proteins 0.000 description 1
- 101100210287 Drosophila melanogaster wech gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100283946 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gtr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- OTSMHWLYYJVJDL-UHFFFAOYSA-N SSSSSSSSS Chemical compound SSSSSSSSS OTSMHWLYYJVJDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001482576 Saiga Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241001479493 Sousa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000019011 Tasa Species 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-PWCQTSIFSA-N Tritiated water Chemical compound [3H]O[3H] XLYOFNOQVPJJNP-PWCQTSIFSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 240000004668 Valerianella locusta Species 0.000 description 1
- 235000003560 Valerianella locusta Nutrition 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 101150104157 YES1 gene Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- WABPQHHGFIMREM-UHFFFAOYSA-N lead(0) Chemical compound [Pb] WABPQHHGFIMREM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004088 pulmonary circulation Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005201 scrubbing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- WWJZWCUNLNYYAU-UHFFFAOYSA-N temephos Chemical compound C1=CC(OP(=S)(OC)OC)=CC=C1SC1=CC=C(OP(=S)(OC)OC)C=C1 WWJZWCUNLNYYAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C209/00—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
- C07C209/04—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by substitution of functional groups by amino groups
- C07C209/22—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by substitution of functional groups by amino groups by substitution of other functional groups
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
- A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение раскрывает гибридный белок, содержащий две коэкспрессируемые аминокислотные последовательности, образующие гетеродимер, каждая из которых представляет собой:а) по крайней мере, одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из цепи гомомерного рецептора или его фрагмента, цепи гетеродимерного рецептора или его фрагмента, лиганда, другого, чем гонадотропный гормон или его фрагмент, легкой или тяжелой цепи антитела, легкой цепи антитела, которая ассоциирована с соответствующей тяжелой цепью антитела, и тяжелой цепи антитела, которая ассоциирована с соответствующей легкой цепью антитела, причем указанный лиганд или фрагмент сохраняет лиганд-рецептор связывающую активность и указанная цепь указанного гомомерного рецептора или его фрагмента и указанная цепь указанного гетеромерного рецептора или его фрагмента сохраняют лиганд-рецептор связывающую активность либо сами по себе, либо в ассоциации с гомологичной или гетерологичной цепью указанного рецептора; иб) субъединицу гетеродимерного белкового гормона или ее фрагмент, который сохраняет способность образовывать гетеродимер с другими субъединицами данного гормона, причем последовательности а) и б) связаны непосредственным образом или через пептидный линкер, а последовательность б) при совместной экспрессии двух указанных последовательностей обладает способностью к агрегации с образованием гетеродимера. Описаны также последовательность ДНК, кодирующая гибридный белок, экспрессирующий вектор, содержащий указанную ДНК, линия клеток, содержащая указанный экспрессирующий вектор, способ продуцирования гибридного
Description
Настоящее изобретение относится к гибридному белку, содержащему две коэкспрессируемые аминокислотные последовательности, образующие гетеродимер, каждая из которых представляет собой:
а) по крайней мере, одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из цепи гомомерного рецептора или его фрагмента, цепи гетеродимерного рецептора или его фрагмента, лиганда другого, чем гонадотропный гормон или его фрагмент, легкой или тяжелой цепи антитела, легкой цепи антитела, которая ассоциирована с соответствующей тяжелой цепью антитела, и тяжелой цепи антитела, которая ассоциирована с соответствующей легкой цепью антитела, причем указанный лиганд или фрагмент сохраняет лиганд-рецептор связывающую активность, и указанная цепь указанного гомомерного рецептора или его фрагмента и указанная цепь указанного гетеромерного рецептора или его фрагмента сохраняют лиганд-рецептор связывающую активность либо сами по себе, либо в ассоциации с гомологичной или гетерологичной цепью указанного рецептора; и
б) субъединицу гетеродимерного белкового гормона, или ее фрагмент, который сохраняет способность образовывать гетеродимер с другими субъединицами данного гормона, причем последовательности а) и б) связаны непосредственным образом или через пептидный линкер, а последовательность б) при совместной экспрессии двух указанных последовательностей обладает способностью к агрегации с образованием гетеродимера. Кроме того, изобретение раскрывает последовательность ДНК, кодирующую гибридный белок, экспрессирующий вектор, содержащий указанную ДНК, линию клеток, содержащую указанный экспрессирующий вектор, способ продуцирования гибридного белка, фармацевтическую композицию, включающую гибридный белок и способ индуцирования созревания фолликулов.
Уровень техники
Взаимодействия белок-белок существенны для нормальных физиологических функций клеток и многоклеточных организмов. Многие природные белки проявляют новые или оптимальные функции, при образовании комплексов с одним или несколькими иными белковыми цепями. Это можно проиллюстрировать разно образными лиганд-рецепторными сочетаниями, которые участвуют в регуляции клеточной активности. Некоторые лиганды, такие как αфактор некроза опухолей (ΤΝΡα ΤΝΡβ или хорионический гонадотропин человека (11СС). встречаются в виде мультисубъединичных комплексов. Некоторые из этих комплексов содержат множество копий одной и той же субъеди ницы. ΤΝΡα и ΤΝΡβ (приводимые здесь совместно в качестве НСС) представляют собой гомотримеры, формируемые с помощью трех идентичных субъединиц (1-4). Другие лиганды составлены из неидентичных субъединиц. Например, 11СС представляет собой гетеродимер (5-7). Рецепторы могут также встречаться или функционировать в виде мультицепочечных комплексов.
Например, рецепторы для ΤΝΡ преобразуют сигнал после агрегирования с образованием димеров (8. 9). Лиганды с этими рецепторами стимулируют агрегацию двух или трех рецепторных цепей, тем самым позволяя осуществляться механизму рецепторной активации. Например, ΤΝΡ-опосредованная агрегация активирует рецепторы ΤΝΡ (10-12).
Модуляция взаимодействий белок-белок может быть полезным механизмом для терапевтического вмешательства при различных заболеваниях и патологиях. Растворимые связывающиеся белки, которые могут взаимодействовать с лигандами, потенциально могут отделять данный лиганд от данного рецептора, тем самым снижая активацию этого отдельного рецепторного пути. И наоборот, отделение лиганда может замедлять его элиминацию или деградацию, увеличивая тем самым длительность его действия и, возможно, его явную активность ίη νίνο. Что касается ΤΝΡ. растворимые рецепторы ΤΝΡ поначалу ассоциировали с ингибированием активности ΤΝΡ (13-17).
Растворимые связывающиеся белки могут быть полезны для лечения заболеваний человека. Например, было показано, что растворимые рецепторы ΤΝΡ эффективны в моделях артрита на животных (18. 19).
Поскольку ΤΝΡ обладает тремя участками связывания со своим рецептором (10-12). а димеризация клеточно-поверхностного рецептора является достаточной для биоактивации (8. 9). кажется вероятным, что связывание одиночного растворимого рецептора с ΤΝΡ оставляет открытой возможность того, что этот комплекс, растворимый рецептор; 4ΝΡ. 1:3. (тример) может связать и активировать еще пару клеточноповерхностных рецепторов ΤΝΡ. Следует ожидать, что для ингибирующего эффекта два участка связывания рецептора в данном ΤΝΡтримере должны быть заняты или блокированы растворимым связывающим белком. С другой стороны, связывающий белок мог бы блокировать надлежащую ориентацию ΤΝΡ на поверхности клетки.
В общем, осознавалась необходимость синтезировать белки, которые содержат две рецепторные (или лигандные) цепи, в виде димерного гибридного белка. См. Аа11асй с соавт. Патент США 5478925.
Первоначальный подход, примененный для образования димерных или мультимерных гибридных белков, содержащих домены связы3 вания из внеклеточных рецепторов, заключался в слиянии этих белков с константными областями тяжелой цепи антитела.
Эта стратегия привела, например, к созданию СО4-иммуноадгезинов (20). Они представляют собой гибридные молекулы, состоящие из первых двух (или всех четырех) иммуноглобулиноподобных доменов из СЭ4, слитых с константной областью тяжелой и легкой цепей антитела. Данный способ создания гибридных молекул был адаптирован к рецепторам ΤΝΕ (10, 16, 21) и привел к образованию конструктов с высшей активностью ίη νίίτο, чем у мономерных растворимых связывающих белков.
Широко распространено, что наивысшая ίη νίίτο эффективность при димерном слиянии белков должна преобразовываться в наивысшую ίη νίνο активность. В одном исследовании это подтверждается обнаружением, по крайней мере, более чем 50-кратным превышением активности слитого белка р75 (ΤΒΡ2)-ί§ в защите мышей от последствий внутривенной инъекции ЬР8 (16).
Однако, несмотря на широко распространенное применение иммуноглобулиновых слитых белков, данная стратегия страдает некоторыми недостатками. Один из них состоит в том, что несколько иммуноглобулиновых Есдоменов принимают участие в эффекторных функциях иммунной системы. Эти функции могут быть неподходящими для конкретного терапевтического назначения (22).
Второе ограничение относится к специальным случаям, где желательно получить гетеромерные слитые белки, например водорастворимые аналоги гетеромерного 1Ь-6 или рецепторы интерферона типа I. Хотя существуют многочисленные способы получения бифункциональных антител (например, путем котрансфекции или гибридомных слияний), эффективность синтеза является весьма проблематичной при смешивании гомодимеров и гетеродимеров, которые обычно получают (23). Недавно появилось несколько сообщений, описывающих использование мотивов лейциновая застежка для ориентации сборки из гетеродимеров (24-26). Она, по всей вероятности, представляется многообещающей для исследовательских целей, но используемые неприродные или внеклеточные последовательности непригодны для постоянного применения в клинике из-за антигенности. Эффективность сборки и устойчивость после сборки могут также иметь ограничения.
С другой стороны, для конкретного случая ΤΝΕ-рецепторов было обнаружено, что определенные модификации рецептора р55 ΤΝΕ содействуют гомодимеризации и свидетельствуют об отсутствии лиганда (27, 28). Установлено, что цитоплазматическая область данного рецептора, называемая доменом смерти, может действовать в качестве гомодимеризационного мотива (28, 30). В качестве альтернативы иммуноглобу линовому гибридному белку, слияние внеклеточного домена ΤΝΕ-рецептора с его цитоплазматическим доменом смерти могло бы, предположительно, дать секретируемый белок, который может димеризоваться в отсутствие ΈΝΕ. Такие слитые белки были описаны и заявлены в международной патентной заявке \¥О 95/31544.
Третьим, следующим подходом, используемым для образования димеров растворимых ΤΝΕ-рецепторов, явилось химическое перекрестное связывание мономерных белков с полиэтиленгликолем (31).
Сущность изобретения
Одну из альтернатив получения таких димерных белков, предлагающих некоторые важные преимущества, предоставляет настоящее изобретение, которое состоит в использовании природной гетеродимерной клеточной структуры, корреспондирующей с циркулирующим неиммуноглобулиновым белком с продолжительным временем полужизни. Предпочтительный пример представляет собой 11СС. белок, который хорошо секретируется, обладает хорошей стабильностью и обладает продолжительным временем полужизни (32-33). С установлением выдающейся роли 11СС в качестве маркера беременности, создано много реагентов для количественного анализа и изучения белка ίη νίίτο и ίη νίνο. Кроме того, 11СС широко изучали с использованием мутагенеза и стало известно, что небольшие деления в данном белке, такие как удаление пяти остатков на краю карбоксильного конца α-субъединицы, могут эффективно элиминировать ее биологическую активность с сохранением ее способности к образованию гетеродимера (34, 35). Было показано, что небольшие инсерции, до 30 аминокислот, допустимы на аминном и карбоксильном концах α-субъединицы, хотя слияние α-субъединицы с карбоксильным концом β-субъединицы также мало влияет на образование гетеродимера (37).
Сообщалось также об аналоге ЬСО, в котором иммуноглобулиновый Ес-домен был слит с С-концом йСО-субъединицы; однако, эта конструкция не секретировалась и попытки объединить ее с α-субъединицей не предпринимались (38).
По этой причине главную цель настоящего изобретения представляет гибридный белок.
Гибридный белок, содержащий две коэкспрессируемые аминокислотные последовательности, образующие гетеродимер, каждая из которых представляет собой:
а) по крайней мере, одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из цепи гомомерного рецептора или его фрагмента, цепи гетеродимерного рецептора или его фрагмента, лиганда, другого, чем гонадотропный гормон или его фрагмент, легкой или тяжелой цепи антитела, легкой цепи антитела, которая ассоциирована с соответствующей тяжелой цепью антитела, и тяжелой цепи антитела, которая ассоциирована с соответствующей легкой цепью антитела, причем указанный лиганд или фрагмент сохраняет лиганд-рецептор связывающую активность и указанная цепь указанного гомомерного рецептора или его фрагмента и указанная цепь указанного гетеромерного рецептора или его фрагмента сохраняют лиганд-рецептор связывающую активность либо сами по себе, либо в ассоциации с гомологичной или гетерологичной цепью указанного рецептора; и
б) субъединицу гетеродимерного белкового гормона, или ее фрагмент, который сохраняет способность образовывать гетеродимер с другими субъединицами данного гормона, причем последовательности а) и б) связаны непосредственным образом или через пептидный линкер, а последовательность б) при совместной экспрессии двух указанных последовательностей обладает способностью к агрегации с образованием гетеродимера.
В соответствии с настоящим изобретением, линкер может быть энзиматически расщепляемым.
Последовательность (а) предпочтительно выбрана из внеклеточного домена рецептора ΤΝΕ 1 (55 кД, называемого также ΤΝΡ 1), внеклеточного домена рецептора ΤΝΕ 2 (75 кД, называемого также ΤΝΡ 2), или их фрагментов, содержащая, кроме того, домен связывания лиганда; внеклеточных доменов из рецепторов 1Ь6 (называемых также др80 и др130); внеклеточного домена α/β рецептора ΙΕΝ или γ-рецептора ΙΕΝ; гонадотропинового рецептора или его внеклеточных фрагментов; легких цепей антитела, или их фрагментов, необязательно ассоциированных с соответствующими тяжелыми цепями; тяжелыми цепями антитела, или их фрагментами, необязательно ассоциированных с соответствующими легкими цепями; ЕаЬ-доменов антитела; или лигандных белков, такими как цитокины, факторов роста или гормонов, иных чем гонадотропины, конкретные примеры которых включают 1Ь-6, ΙΕΝ-β, ТРО, или их фрагменты.
Последовательность (Ь) предпочтительно выбрана из 11СС. Е8Н, ЬН, Τ8Ν, субъединицы ингибина, или их фрагментов.
Модификации белков, такие как химическое или протеазное расщепление основной цепи, либо химическая или энзиматическая модификация некоторых аминокислотных боковых цепей, может использоваться для приведения данных компонентов гибридного белка настоящего изобретения в неактивное состояние. Это ограничение активности можно также осуществить с помощью использования методик рекомбинантной ДНК для изменения кодирующей последовательности данного гибридного белка способом, что непосредственно ведет к ограничению активности по одному из компонентов или что придает данному белку большую склонность к последующей химической или энзиматической модификации.
Вышеуказанные гибридные белки будут давать монофункциональные, бифункциональные или мультифункциональные молекулы, в зависимости от аминокислотных последовательностей (а), которые объединены с (Ь). В каждой паре (а) может соединяться с аминоконцом или с карбоксиконцом (Ь) или с обоими.
Моноклональный гибридный белок настоящего изобретения может, например, включать внеклеточный домен гонадотропинового рецептора, присоединенный к одной из аналогичных рецептор-связывающихся субъединиц гонадотропина. В соответствии с таким вариантом осуществления настоящего изобретения, гибридный белок настоящего изобретения может быть молекулой, в которой, например, Р8Нрецепторный внеклеточный домен присоединен к Р8Н, чтобы увеличить время полужизни в плазме и улучшить биологическую активность.
Этот препарат можно употребить, чтобы индуцировать фолликулярное созревание для содействия способам репродукции, таким как индукция овуляции или оплодотворения ίη νΐΐΓΟ, и чтобы служить в качестве средств для резкого умножения биологической активности данного гормона, существенного для успеха данного процесса, снижая таким образом потребность и в самом гормоне и в количестве инъекций для достижения овуляции.
Р8Н-рецептор и получение внеклеточного домена человеческого Р8Н-рецептора было описано, соответственно, в \УО 92/16620 и \УО 96/38575.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения, внеклеточный домен Р8Н-рецептора (ЕСЭ) можно слить в конструкцию с пептидным линкером, которая содержит сайт распознавания/ расщепления тромбина (29) и представляет собой привязанное плечо. Этот пептидный линкер соединяет внеклеточный домен Р8Н с Р8Нсубъединицей. Это позволяет удалять внеклеточный домен из Р8Н-рецептора путем отщепления в сайте расщепления тромбина в виде молекулы, находящейся в контакте с тромбином в большом круге кровообращения.
В следующем варианте осуществления настоящего изобретения, вместо сайта расщепления тромбина, использовали сайт распознавания фермента для фермента, который обнаружен в наибольшем избытке в яичнике. В данном способе в качестве молекулы ЕСП-Е8Н, двигающейся к яичнику, она подвергается действию ферментов, обнаруживаемых в наивысших концентрациях в этих тканях, а ЕСЭ удаляется так, чтобы Е8Н мог взаимодействовать с рецептором, связанным с мембраной.
В очередном варианте осуществления настоящего изобретения, вместо сайта распозна002474 вания фермента, клонировали гибкую шарнирную область между ЕСЭ и Е8Н так, чтобы не удалять энзиматически ЕСЭ из данного гормона. В данном способе, при появлении молекулы ЕСЭ-ЕЗН в яичнике, устанавливается конкуренция между ЕСЭ. присоединенным к шарниру, и Е8Н-рецептором, обнаруживаемым на мембране овариальной клетки.
В следующем варианте осуществления настоящего изобретения гибридный белок состоит из ассоциации между парой аа-последовательностей, одна из которых входит в ТВР1 (или фрагменты от аа 20 до аа 161 или до аа 190) в качестве (а) и α-субъединицей НСС в качестве (Ь). а другая всегда входит в ТВР1 (или те же вышеуказанные фрагменты) в качестве (а) и βсубъединицей 11СС. или ее фрагментов, в качестве (Ь). В соответствии с данным вариантом настоящего изобретения в зависимости от конкретной последовательности, которая выбрана как (Ь) (полная β-субъединица 11СС. или ее фрагменты или ее модификации). получающийся гибридный белок будет обладать одной активностью (только ТВР1) или объединенными активностями (ТВР1 и 11СС). В данном последнем случае гибридный белок может использоваться, например, для совместного лечения саркомы Капоши и метаболического истощения в ΆΙΌ8.
В очередном варианте настоящего изобретения одну или несколько связей между двумя субъединицами (Ь) добавляли для усиления стабильности получаемого гибридного белка. Это может быть сделано, например, путем добавления одной или нескольких искусственных межцепочечных дисульфидных связей. Участки для этих поперечных связей могут быть установлены из известных структур гетеродимерных гормонов. Например, подходящий участок для 11СС может находиться в месте цистеиновых остатков по α-субъединичному остатку Ьуз45 и βсубъединичному остатку С1и21. замещая солевой мостик (не ковалентная связь) на дисульфидную связь (ковалентная связь). Другая цель настоящего изобретения заключается в ПЭГ овых или других химически модифицированных формах гибридных белков.
Очередной целью настоящего изобретения является молекула ДНК, включающая последовательность ДНК, кодирующая вышеуказанный гибридный белок, а также практически те же нуклеотидные последовательности. Практически те же нуклеотидные последовательности включают все другие последовательности нуклеиновых кислот, которые, по причине вырожденности генетического кода, кодируют также данную аминокислотную последовательность.
Для получения гибридного белка настоящего изобретения ДНК-последовательность (а) получали из существующих клонов, как и (Ь).
Последовательность ДНК, кодирующую требуемую последовательность (а), лигировали с последовательностью ДНК, кодирующей требуемую последовательность (Ь). Два из этих слитых продукта инсерцировали и лигировали в подходящую плазмиду или каждый - в отдельную плазмиду. Сразу после формирования экспрессионный вектор или два экспрессионных вектора интродуцировали в подходящую хозяйскую клетку, которая затем экспрессирует вектор(ы) с получением гибридного белка настоящего изобретения, указанного выше.
Предпочтительный способ получения белкового гибрида настоящего изобретения осуществляют посредством техники РСВ с использованием олигонуклеотидов, специфичных для требуемых последовательностей, для копирования клонов кодирующих последовательности (а) и (Ь).
Экспрессия любого из рекомбинантных белков настоящего изобретения, как указано здесь выше, может быть эффективной в эукариотических клетках (например, дрожжей, клетках насекомых или млекопитающих) или в прокариотических клетках с использованием надлежащих экспрессионных векторов. Можно применить любой способ, известный в данной области техники.
К примеру, молекулы ДНК, кодирующие белки, получали любым вышеуказанным способом и инсерцировали в соответственно сконструированные экспрессионные векторы с помощью методик, хорошо известных в данной области техники (см. 8ашЬтоок с соавт., 1989). Двухцепочечную кДНК присоединяли к плазмидным векторам путем присоединения к гомополимерному хвосту или путем ограниченного присоединения с использованием синтетических ДНК-линкеров или методами лигирования по тупым концам: ДНК-лигазы, используемые для лигирования молекул ДНК и присоединяющиеся неправильно, удаляли путем обработки щелочной фосфатазой.
Для того чтобы обладать способностью экспрессировать требуемый белок, экспрессионный вектор должен также включать специфические нуклеотидные последовательности, содержащие транскрипционную и трансляционную регуляторную информацию, связанную с ДНК, кодирующей требуемый белок таким образом, чтобы дать возможность экспрессироваться гену и наработать белок. Вначале, для того, чтобы данный ген транскрибировался, ему должен предшествовать промотор, распознаваемый РНК-полимеразой, с которым данная полимераза связывается и, таким образом, инициирует процесс транскрипции. Существует множество таких используемых промоторов, которые работают с разными эффективностями (сильные и слабые промоторы).
Для эукариотических хозяев можно использовать разные транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности, в зависимости от природы данного хозяина. Их можно получать из вирусных источников, таких как аденовирус, вирус папилломы крупного рогатого скота, обезьяний вирус и т.п., где эти регуляторные сигналы ассоциируются с конкретным геном, который обладает высоким уровнем экспрессии. Примерами являются ТК-промотор герпес-вируса, ранний промотор 8У40, промотор дрожжевого гена да14 и т.д. Можно выбрать сигналы, регулирующие инициацию транскрипции, которые позволяют репрессировать и активировать так, чтобы модулировать экспрессию генов.
Молекулу ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую гибридный белок настоящего изобретения, инсерцировали в вектор(ы), обладающий присоединенными путем сшивания транскрипционными и трансляционными регуляторными сигналами, которые обладают способностью к интегрированию требуемых генных последовательностей в хозяйскую клетку. Клетки, которые устойчиво трансформировали с помощью интродуцируемой ДНК, могут быть также отобраны путем интродуцирования одного или нескольких маркеров, которые открывают возможность для селекции хозяйских клеток, которые содержат данный экспрессионный вектор. Маркер можно создать также фототрофным для ауксотрофного хозяина, биоцидустойчивым, например, к антибиотикам или тяжелым металлам, таким как медь, или подобным. Селектируемый маркерный ген можно присоединить либо непосредственно к ДНК-овым генным последовательностям для его экспрессии, либо интродуцировать в ту же клетку котрансфекцией. Для оптимального синтеза белков настоящего изобретения могут быть также нужны дополнительные элементы.
Факторы, существенные для селекции конкретной плазмиды или вирусного вектора включают: легкость, с которой реципиентные клетки, содержащие вектор, могут быть распознаны и отселектированы от других реципиентных клеток, не содержащих данный вектор; численность копий данного вектора, необходимого для конкретного хозяина; и обладание способностью быть челночным вектором между хозяйскими клетками разных видов.
Как только для экспрессии получали вектор(ы) или последовательность ДНК, содержащие указанную конструкцию(и), эти ДНКконструкция(и) могут быть интродуцированы в надлежащую хозяйскую клетку любым подходящим образом: трансформацией, трансфекцией, конъюгацией, протопластным слиянием, электропорацией, кальцийфосфатным осаждением, прямой микроинъекцией и т.д.
Хозяйские клетки могут быть либо прокариотическими, либо эукариотическими. Предпочтительными являются эукариотические хозяева, например клетки млекопитающих, такие как человека, обезьяны, мыши, и яйцеклетки китайского хомячка (СНО), поскольку они обеспечивают посттрансляционные модификации белковым молекулам, в том числе правильную упаковку или гликозилирование по правильным сайтам. Дрожжевые клетки могут также нести посттрансляционные пептидные модификации, в том числе гликозилирование. Существуют многочисленные рекомбинантные методики, которые используют сильные промоторные последовательности и множество высококопийных плазмид, которые могут использоваться для получения в дрожжах нужных белков. Дрожжи распознают лидерные последовательности в клонируемых генных продуктах млекопитающих и секретируют пептиды, несущие лидерные последовательности (т.е. препептиды).
После интродукции вектора(ов) клетки хозяина выращивают на селективной среде, которая в течение роста селектирует клетки, содержащие вектор. Экспрессия клонируемой генной последовательности(стей) приводит к получению требуемых белков.
Выделение очисткой рекомбинантных белков осуществляют любым методом, известным для этой цели, т.е. любой удобной процедурой, включающей экстракцию, осаждение, хроматографию, электрофорез или им подобные. Последующая процедура выделения очисткой, которую можно предпочтительно принять для выделения очисткой белка настоящего изобретения, представляет собой хроматографию по сродству, с использованием моноклональных антител, которые связывают мишенный белок и которые получали и иммобилизовали в гелевую матрицу, содержащуюся в колонке. Загрязненные препараты, содержащие рекомбинантный белок, пропускают через колонку. Данный белок будет связываться в колонке с помощью специфического антитела, а примеси будут проскальзывать сквозь неё. После промывки этот белок элюируют из геля путем изменения рН или ионной силы.
Термин гибридный белок, как он используется здесь, исходно относится к белку, который содержит два или несколько отличающихся белков или его фрагментов.
Используемый здесь слитой белок относится к гибридному белку, который состоит из двух или нескольких белков или их фрагментов, соединенных вместе ковалентно.
Термин агрегирование, используемый здесь, означает образование весьма специфичных нековалентных взаимодействий между двумя полипептидными цепями, образующими комплекс, такой как комплекс, существующий между α- и β-субъединицей гетеродимерного гормона (такого как Р8Н, ЬН, ЙСС или Т8Н).
Термины лиганд или лигандный белок, используемые здесь, относятся к молекуле, иной, чем антитело или иммуноглобулин, спо11 собной к связыванию с рецептором лигандсвязывающего домена; такая молекула может встречаться в природе или может быть химически модифицирована или химически синтезирована.
Термин лиганд-связывающий домен, используемый здесь, относится к части рецептора, который участвует в связывании лиганда и является, как правило, частью или практически всем внеклеточным доменом.
Термин рецептор, используемый здесь, относится к мембранному белку, который связывается с соответствующим лигандным, запускающим вторичные клеточные ответы, которые активируют или ингибируют внутриклеточный процесс.
Другая цель в настоящем изобретении заключается в использовании данного гибридного белка в качестве лекарственного средства. Это лекарственное средство предпочтительно представлено в форме фармацевтической композиции, включающей белок настоящего изобретения вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или инертными наполнителями. Такие фармацевтические композиции представляют дальнейшую цель настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
Настоящее изобретение будет лучше понято при ссылке на прилагаемые чертежи.
Фиг. 1(а) и 1(Ь) показывают, соответственно, конструкции ТВР (20-161)-1СОа и ТВР (20161)-1ιΟΌβ и аналогичные последовательности (8ЕО ΙΌ N08:1-4). Линкерная последовательность, показанная на фиг. 1(а), представляет собой А1а-61у-А1а-А1а-Рго-О1у (8Е0 ΙΌ N0:9). Линкерная последовательность, показанная на фиг. 1(Ь), представляет собой А1а-01у-А1а-01у (8ЕО ΙΌ N0:10).
Фиг. 2(а) и 2(Ь) показывают, соответственно, конструкции ТВР (20-190)-1С0а и ТВР (20190)-1ιΟΟβ и аналогичные последовательности (8ЕО ΙΌ N08:5-8).
Фиг. 3 представляет собой графическую иллюстрацию дозозависимого защитного эффекта СНО-клеток, экспрессирующих ТВР-1100 (20-190), на цитотоксичность, индуцируемую ТНЕа. в клетках ВТ-20 и разные контроли.
Фиг. 4 представляет собой графическую иллюстрацию дозозависимого защитного эффекта СО8-клеток, экспрессирующих ТВР-1С0 (20-190), на цитотоксичность, индуцируемую Т\Еа. в ВТ-клетках и разные контроли.
Фиг. 5 представляет собой графическую иллюстрацию дозозависимого защитного эффекта, выделенного очисткой по сродству, ТВР1100 (20-161), экспрессируемого СНО-клеткой, на индуцируемую ТОТа-цитотоксичность в ВТклетках и разные контроли.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения
Далее настоящее изобретение описывается при помощи нижеследующих примеров, которые не должны быть построены так, чтобы ограничивать каким-либо образом настоящее изобретение.
Примеры
Материалы и методы
Клеточные линии, используемые в данном исследовании, если не оговорено особо, были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС), КоскуШе, Магу1аи6. Клеточная линия СН0-ЭиКХ была получена от Ь. Сйаып при Колумбийском университете через Ό. Ноикетап на М1Т (39).
Клетки СН0-ЭиКХ, у которых отсутствовал функциональный ген по дигидрофолатредуктазе, обычно поддерживали в а-плюс модифицированной среде Игла а(+)МЕМ с добавлением 10% сыворотки плода коровы (ЕВ8). Клетки С08-7 обычно поддерживали в модифицированной Дюльбекко среде Игла (ΌΜΕΜ) с добавлением 10% ЕВ8. Если не оговорено особо, клетки отделяли для поддержания их в 1од-фазе роста, а реагенты для культивирования получали от 01ВС0 (Огаиб Шайб, Кед Уогк).
1. Сборка генных конструктов, кодирующих гибридные белки.
Нумерация, применяемая для р55 ЮТрецептора, основывается на статье \Уа11ас11 (40) по клонированию, а нумерация, используемая для йСО-субъединиц, основывается на нумерации значений из статей Е1ббек по клонированию (41, 42). Наименование ТВР, или ТКЕсвязывающий белок, относится к внеклеточным доменным частям ΤΝΕ-рецепторов, способных связывать ЮТ. В этих примерах ДНКконструкты именуются в качестве ТВРгибридных белков с партнером и областью ТВР, указанной в номенклатуре данного конструкта. Все ΤΒΡ-йСО-конструкты содержат сигнальный пептид человеческого гормона роста (1ОН) вместо природной сигнальной последовательности р55. Кроме того, сигнальный пептид 1ОН помещали таким образом, чтобы он непосредственно предшествовал ТВР-остатку Акр20, который, как ожидается, сделает этот первый остаток по достижении зрелости секретируемым белком. Эти модификации несущественны для основной идеи об использовании 1СО в качестве партнера данного гибридного белка.
ДНК, кодирующие гибридные белки, конструировали с использованием РСК.-методики (43).
а. ТВР1 (20-161)-1СО.
Начальный ΤΒΡ-йСО-конструкт создали биотехнологически, содержащим лигандсвязывающий домен внеклеточной области
ΤΝΕ-рецептора р55 (из Акр20, включающего остаток Суз161). слитый через короткий линкер с α и β субъединицами ЕСО (начинающихся, соответственно, с остатков аСуз7 или βΡτο7). Этот конструкт, именуемый ниже как ТВР1 (20161)-11СС. представляет собой гетеродимер из двух модифицированных 11СС-субъединиц. ТВР1 (20-161)-ЕСОа и ТВР1 (20-161)-№6β.
Олигонуклеотидными праймерами, используемыми для конструкта ТВР1 (20-161)ЕСОа. были праймер 1 (αβ) ТТТ ТСТ СОЛ ОЛТ ООС ТАС АОО ТАА ОСО ССС (8ЕО ГО N0:11) праймер 2 (а) АСС ТОО ООС АОС АСС ООС АСА ООА ОАС АСА СТС ОТТ ТТС (8ЕО ГО N0:12) праймер 3 (а) ТОТ ОСС ООТ ОСТ ОСС ССА ООТ ТОС ССА ОАА ТОС АСО СТА САО (8ЕО ГО N0:13) праймер 4(а) ТТТ ТОО АТС СТТ ААО АТТ ТОТ ОАТ ААТ ААС ААО ТАС (8ЕО ГО N0:14)
Эти и все другие праймеры, описываемые в этих примерах, были синтезированы на ДНКсинтезаторе Аррйсб Вюзу51етз Мо6е1 392 (АВ1. Роз1ет СЕу. СаЕЕогша). с использованием химии амидофосфитного процесса.
Поскольку оба ТВР-ЕСО-субъединичных конструкта обладают одним и тем же 5'-концом (т.е. 5'-конец ЕСО/ТВР-конструкта), для обоих ТВР-ЕСО-субъединичных конструктов использовали праймер 1 (πβ). Другими праймерами, используемыми для конструкта ТВР1 (20-161)ΕΕΌβ были праймер 2(β) ССО ТОО АСС АОС АСС АОС АСА ООА ОАС АСА СТС ОТТ ТТС (8ЕО ГО N0:15) праймер 3(β) ТОТ ОСТ ООТ ОСТ ООТ ССА СОО ТОС СОС ССС АТС ААТ (8ЕО ГО N0:16) праймер 4(β) ТТТ ТОО АТС СТТ АТТ ОТО ООА ООА ТСО ООО ТО (8ЕО ГО N0:17)
Праймеры 2(а) и 3(а) представляют собой обратные комплементы и покрывают и 3'-конец кодирующей области р55 внеклеточного домена, и 5'-конец а-субъединицы ЕСО. Аналогично, праймеры 2(β) и 3(β) также представляют собой обратные комплементы, и покрывают и 3'-конец кодирующей области внеклеточного домена р55, и 5'-конец β-субъединицы ЕСО.
Две РСК-реакции были осуществлены для каждого из двух ТВР-ЕСО-субъединичных конструктов. В первой использовали праймеры 1(αβ) и 2 (а или β). а в качестве матрицы использовали плазмиду, кодирующую остатки 20180 растворимого р 55. предшествующие ЕСОсигнальному пептиду (плазмида
ЕСМУЕОН5реОНА.рА4). Во второй использовали праймеры 3 (а или β) и 4 (а или β). а в качестве матрицы использовали либо плазмиду р8УЪ-ЕСОа. либо - ρδΥΕ-ΕΡΌβ (44). РСК осуществляли с использованием УеШ(ТМ)полимеразы из №\ν Епфапб Вю1аЬз (Веует1у. МаззасЕизеЕз). в соответствии с рекомендациями изготовителей, используя в каждой реакции 25 циклов и нижеследующие условия:
100 мкг матричной ДНК мкг каждого праймера
Ед. УеШ (ТМ)-полимеразы (№\ν Епд1апб Вю1аЬз) денатурирация при 99°С в течение 30 с отжиг при
59°С в течение 30 с для праймеров 1(αβ) и 2(а)
59°С в течение 30 с для праймеров 3(а) и 4(а)
57°С в течение 30 с для праймеров 1(αβ) и 2(β)
63°С в течение 30 с для праймеров 3(β) и 4(β) удлинение при 75°С в течение 75 с.
Ожидаемые размеры РСК-продуктов подтверждали электрофорезом в 2%-ном агарозном геле и окрашиванием этидийбромидом. Затем полученные фрагменты выделяли очисткой путем пропускания их через \У|/агб-колонку (Рготеда). в соответствии с рекомендациями изготовителей колонки.
Конечную кодирующую последовательность для ТВР1 (20-161)-ЕСОа собирали слиянием, применяя РСК-праймер 1(πβ) и праймер 4(а), используя в качестве матрицы выделенные очисткой продукты из фрагментов р55 и ЕСОа. полученных в первых РСК-реакциях. Первые две матрицы, которые связаны с перекрыванием между праймерами 2(а) и 3(а). могущие быть денатурированными и отожженными совместно, проходили 10 циклов РСК в отсутствие какихлибо добавляемых праймеров. Условия в этих циклах были практически теми же, что и ранее использованные условия, за тем исключением, что отжиг осуществляли при 67°С, а удлинение осуществляли в течение 2 мин. По окончании этих 10 циклов добавляли праймеры 1(αβ) и 4(а) и осуществляли следующие 10 циклов. Условия для этих заключительных реакций были теми же, которые использовали раньше, за исключением того, что использовали температуру отжига 59°С, а удлинение осуществляли в течение 75 с.
Анализ продуктов этой реакции электрофорезом в 1 %-ном агарозном геле подтвердил, что получен ожидаемый фрагмент - около 1100 п. н. Продукты данной реакции пропускали через \У|/агб-колонку для выделения очисткой фрагмента, который затем обрабатывали с помощью ХЬа1 и ВатН1 и повторно выделяли очисткой в 0.7%-ном легкоплавком геле агарозы. Выделенный очисткой фрагмент субклонировали в плазмиде р8УЪ (РЕагтас1а). которую вначале обрабатывали с помощью ХЬа1 и ВатН1 и выделяли очисткой в геле 0.8%-ного легко15 плавкого агарозного геля. После лигирования с помощью Т4-лигазы полученную смесь использовали для трансформации АО1 Е. сой, а затем помещали в ЬВ/ампициллиновые чашки на ночное культивирование при 37°С. Плазмидные ДНК из ампициллин-резистентных колоний анализировали путем обработки с помощью Х1ю1 и ВатН1, чтобы подтвердить присутствие вставки (которую вырезали в этой обработке). Обнаружили шесть клонов, содержащих вставки, а один (клон 7) отобрали для дальнейшей работы и обозначили Р^УЪТВРйСба (содержащий ТВР1 (20-161)-1ιΟΟα). Дидезоксисеквенирование ДНК (с использованием 8ес.|испа5с|Л|. и.8. Вюсйеткак, С1ссс1апб. 0Ыо) вставки в данном векторе подтвердило, что полученный конструкт был корректным и что нежелательные изменения не были интродуцированы.
Конечную кодирующую последовательность для ТВР1 (20-161)-1ιί.Όβ составляли способом, аналогичным способу, описанному для ТВР1 (20-161)-1ιΟΟα. применяя слияние с помощью РСК праймеров 1(αβ) и 4(β) и используя в качестве матрицы выделенные очисткой продукты из р55 и ΙιΟΟβ -фрагментов, полученных в первых РСК-реакциях. Результирующую р8УЪплазмиду, содержащую интересующую вставку, обозначили р8УЕТВР1СОв.
Ь. ТВР (20-190)-1СО.
Вторую группу ТВР-йСО-белков получали путем модификации ТВР (20-161)-1СОконструктов с образованием аналога, содержащего ТВР, охватывающего от Л§р20 до Т1г190, вместо области 20-161 в первоначальном аналоге. Это сделали путем замещения фрагмента, между сайгами Вд111 и ХЬа1 в плазмиде р8УЕТВР1СОа, на РСК-фрагмент, содержащего данную замену. Этот РСВ-фрагмент получили, используя РСВ-слияние. Праймерами были праймер 1 ТТТ ТЛО АТС ТСТ ТСТ ТОС АСА ОТО ОАС (8ЕО ГО N0:18) праймер 2 ТОТ ООТ ОСС ТОА ОТС СТС АОТ (8ЕО ГО N0:19) праймер 3 АСТ ОАО ОАС ТСА ООС АСС АСА ОСС ООТ ОСТ ОСС ССА ООТ ТО (8ЕО ГО N0:20) праймер 4 ТТТ ТТС ТАО АОА АОС АОС АОС АОС ССА ТО (8ЕО ГО N0:21)
Праймеры 1 и 2 использовали для получения последовательности, кодирующей дополнительные р55-остатки из 161-190. РСВ-реакцию осуществляли практически так же, как она описана раньше, с использованием 1 мкг каждого праймера и риС-р55 в качестве матрицы. Аналогично, праймеры 3 и 4 использовали для получения с помощью РСК линкера между 3'концом ТВР-кодирующей области и 5'-концом области, кодирующей α-субъединицу 1СО, используя в качестве матрицы плазмиду р8V^ТВРйСОα. Правильный размер продуктов из этих РСВ-реакций (соответственно, около 296 п.н. и 121 п.н.) подтвердили в полиакриламидном гелевом электрофорезе (РАОЕ) в 8%ном геле, а затем выделили очисткой с использованием \У|/агб-колонки. Созданные праймеры 2 и 3 были такими, что они содержали область перекрывания так, чтобы два РСВ-продукта (из праймеров 1 и 2 и из праймеров 3 и 4) могли бы быть гибридизованы в РСВ-слиянии с праймерами 1 и 4. После реакции слияния полученный требуемый продукт, около 400 п.н., подтвердили и выделили очисткой с использованием 1,5%-ного агарозного геля и \У|/агб-колонки. Эту ДНК затем обработали с помощью Вд1 II и ХЬа1 и лигировали с р8V^ТВРйСОα, обработанной Вд111/ХЬа1. Наличие вставки в плазмидах, выделенных из трансформированной АО1 Е. сой, подтвердили путем обработки с помощью Вд111 и ХЬа1. Полученный новый конструкт обозначили р8УЬТВР (20-190)-1ιί.Όα.
Аналогично, плазмиду р8УЪТВРйСОв модифицировали путем замещения Вд111-Хст1фрагмента. Однако это сделали путем субклонирования единственного РСВ-продукта, а не с помощью слияния РСВ-продукта. Праймеры 1 и 2Ь (см. ниже) использовались с риС-р55 в качестве матрицы.
праймер 2Ь ТТТ ТСС АСА ОСС АОО ОТО ОСА ТТО АТО ООО СОО САС СОТ ООА ССА ОСА ССА ОСТ ОТО ОТО ССТ ОАО ТСС ТСА ОТО (8ЕО ГО N0:22)
Этот РСВ-продукт (около 337 п.н.) подтверждали и выделяли очисткой, как описано выше, обрабатывая с помощью Вд1 II и Хст1, а затем лигируя р8УЪТВРйСОв, обработанную в Вд111/ХЬа1. Наличие вставки в плазмидах, выделенных из трансформированной АО1 Е. сой, подтверждали путем обработки с помощью Вд111 и Хст1. Полученный новый конструкт обозначили р8УЬТВР (20-190) -1ιί.Όβ.
Впоследствии эти новые конструкты подтвердили путем секвенирования ДНК.
В дополнение к получению этих новых плазмид, основанных на р8УЬ, эти конструкты субклонировали также в другие экспрессионные векторы, чтобы сделать их вполне подходящими для стабильной экспрессии в СНО, особенно - в вектор Όα, ранее описанный в качестве плазмиды СЬН3АХ8У2ПНЕВ (45). Это осуществляли путем преобразования ВатН1-сайта, фланкирующего вставки в векторах, основанных на р8УЪ, в Х1о1-сайт, а затем вырезая данную вставку с Х1ю1 и клонируя её в Όα, обработанный Х1юЕ
2. Временная и постоянная экспрессия гибридных белков.
Трансфекции СО8-7-клеток (АТСС СКЬ
1651, ссылка 46) для временной экспрессии
ТВР-йСО-гибридных белков осуществляли с использованием электропорации (47). Экспоненциально растущие клетки С08-7 удаляли трипсинизацией, собирали мягким центрифугированием (800 об./мин, 4 мин), отмывали холодным фосфатно-солевым буферным раствором (РВ8), рН 7,3-7,4, и затем переосаждали центрифугированием. Клетки ресуспендировали при концентрации 5 х 106 клеток на 400 мкл холодного РВ8 и смешивали с 10 мкл плазмидной ДНК в предварительно охлажденной кювете с 2 мм промежутком для электропорации. Для контрансфекций использовали 5 мкг каждой плазмиды. Указанную кювету и клетки предварительно охлаждали на льду в течение следующих 10 мин и затем подвергали электропорации, используя прибор ВТХ Модель 600 и условия 125 В, 950 мкФ и В=8. Потом группу клеток, охлажденных в течение 10 мин на льду, переносили в 15 мл коническую пробирку, содержащую 9,5 мл полной среды (модифицированная Дюльбекко среда Игла (ЭМЕМ) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (ЕВ8) и 1% Ьглутамина) при комнатной температуре, и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. После осторожного смешивания в 15 мл пробирке, её содержимое полностью высевали на две Р100-чашки и помещали в 37°С 5% СО2инкубатор. Через 18 ч эту среду меняли, а в некоторых случаях заменяли новой средой, содержащей только 1% или 0% ЕВ8. После следующих 72 ч собирали эту кондиционированную среду, центрифугировали для удаления из нее клеток и хранили замороженной при -70°С.
Трансфекции клеток СНО-ЭИКХ (СНО) для временной или постоянной экспрессии осуществляли с использованием кальцийфосфатного осаждения ДНК. За 24 ч до трансфекции экспоненциально растущие СНО-клетки помещали в 100 мм культуральные чашки при плотности 7,5 х 105 клеток на чашку. В день трансфекции 10 мкг плазмидной ДНК вносили в 0,5 мл трансфекционного буфера (см. ниже), добавляли 31 мкл 2М СаС12, полученный раствор ДНК-СаС12 смешивали путем встряхивания и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 45 мин. После этого данную среду отсасывали из этих чашек, к клеткам добавляли ДНК с использованием стерильной пластиковой пипетки и эти клетки оставляли при комнатной температуре на 20 мин. В конце этого периода в эти чашки вносили 5 мл полной а(+)МЕМсреды, содержащей 10% ЕВ8, которые инкубировали при 37°С в течение 4-6 ч. Затем эту среду отсасывали из инкубированных чашек и клетки подвергали глицериновому шоку путем инкубирования их с раствором из 15% глицерола в трансфецирующем буфере при 37°С в течение 3,5 мин. После удаления глицеринового раствора клетки дважды промывали с РВ8, вновь заполняли 10 мл полной питательной а(+)МЕМ-среды, 10% ЕВ 8 и возвращали в инкубатор на 37°С. Для постоянных трансфекций через 48 ч клетки снимали, 1:10, и подпитывали на селективной среде (полная α-минус МЕМ (отсутствие нуклеозидов), 10% диализированной ЕВ8 и 0,02 мкМ метотрексата). Нетрансфецированные (нерезистентные) клетки обычно элиминировались за 3-4 недели, оставляя популяцию из трансфецированных, метотрексатрезистентных клеток.
3. Количественный анализ экспрессии.
Секрецию гибридных белков трансфецированными клетками определяли с использованием коммерческого набора для определения растворимого р55 (Κ&Ό 8уЧст5: Мшпеаройк, Мтпс5о1а). в соответствии с инструкциями изготовителей. Данный анализ дает также оценку уровня гибридных белков в стандартизованной и процессируемой среде, которая служит в качестве основы для отбора доз, используемых для биоанализа.
4. Оценка образования гетеродимера.
Чтобы оценить способность ТВР-ЙССсубъединичных гибридов на объединение и формирование гетеродимеров, осуществляли сэндвич-иммунотест с использованием антител к йСС-субъединицам. В этом анализе моноклональными антителами к ЙССР-субъединице покрывали планшеты для микротитрования и использовали для аналитического связывания. Вначале детектировали поликлональные козьи антитела, направленные против человеческой αсубъединицы Т8Н (№ 0824226 Вюбеыдп 1п1етпа1юпа1: КепнепЬипкроп, Маше), которые, в свою очередь, определяли с использованием конъюгированных с пероксидазой хрена кроличьих антител к козьим поликлональным антителам (Сарре1; Оигйат, ΝοΠίι Сатойпа).
В данной работе использовали несколько различных антител к антителам β-субъединицы ЙС6, которые все не выявляют перекрестной реактивности со свободными α-субъединицами. Одно из этих антител (3/6) используется в коммерчески доступном МА1Ас1опе ЙС6 аналитическом наборе (Вю6а1а; Воте, Италия).
Планшеты с высоким связыванием белка для микротитрования (Сойаг N3590) покрывали антителом для связывания путем инкубации (2 ч при 37°С) со 100 мкл/лунку раствора антитела 5 мкг/мл в покрывающем буфере (РВ8/рН 7,4, 0,1 мМ Са++, 0,1 мг Мд). После однократной промывки раствором для промывания (РВ8, рН 7,4 + 0,1% Твин 20) данный планшет фиксировали путем полного заполнения лунок (~400 мкл/лунку) фиксирующим раствором (3% бычий сывороточный альбумин (В8А): фракция V - А-4503 81дта) в РВ8, рН 7,4 и инкубации в течение 1 ч при 37°С или в течение ночи при 4°С. Затем планшет дважды промывали промывочным раствором и добавляли стандартный и экспериментальный образцы, разбавленные разбавителем (5 мг/мл В8А в РВ8, рН 7,4) с получением объема 100 мкл. После инкубирования образцов и планшета в течение 2 ч при 37°С, этот планшет снова дважды промывали промывочным раствором. Первичное детектируемое антитело, в разведении разбавителем 1:5000, вносили (100 мкл/лунку) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Вносили вторичное детектируемое антитело (кроличьи антитела, конъюгированные с НИР, к козьим антителам 1д), разбавленное 1:5000 разбавителем (из расчета 100 мкл/лунку), и после инкубации в течение 1 ч при 37°С планшет трижды промывали промывочным раствором. Добавляли 100 мкл субстратного раствора ТМВ (Кпкедаатб апб Репу ЬаЬогаЮпек), этот планшет инкубировали 20 мин в темноте при комнатной температуре и затем данную ферментативную реакцию останавливали добавлением 50 мкл/лунку 0,3М Н2§04. Затем этот планшет анализировали с использованием устройства для прочтения планшета для микротитрования при длине волны 450 нм.
5. Частичное выделение очисткой.
Для лучшего количественного определения активностей этих гибридных белков, ТВР1СО-гибридные белки частично выделяли иммунноаффинной хроматографией. Используемое антитело было моноклональным антителом, коммерчески доступным от Κ.&Ό ЗуЧепъ (МАВ #225). Используемая колонка была наполнена СИВг-активированной сефарозой, нагруженной антителом, по прилагаемым инструкциям изготовителей (Р1атшас1а).
Стандартизованную (кондиционную) среду собирали через конец сливной трубки матрасов Т-175 каждой линии, используя ежедневный сбор из 50 мл δΕΜΙΙ-среды (01ВС0), пять сборов с каждой линии. Эти сборы подвергали центрифугированию (1000 об./мин) для удаления клеточного дебриса. Затем в этом материале определяли ТВР-содержимое с применением коммерческого иммуноанализа и концентрировали так, чтобы легко различимая концентрация ТВР составляла около 50 нг/мл.
мл концентрированного ТВР-11СС (образец № 18873) переносили приблизительно в 1М №101 добавлением ЫаС1 и доведения этого раствора до проводимости приблизительно 85 ш8/сш. Его пропускали через 0,5 мл анти-ТВР иммунно-аффинную колонку. Пропущенный через колонку раствор собирали, пропускали через колонку второй раз. После этого колонку промывали 1М ΝιΟΙ в РВ8. Связавшийся ТВР (20-161)-100 собирали после элюирования с помощью 50 мМ лимонной кислоты (рН 2,5). Полученный элюат (приблизительно 7 мл) концентрировали путем фильтрации, используя Ашюоп Сеп1псоп-10'§ в соответствии с инструк циями изготовителей (Ашюоп), до объема приблизительно 200 мкл. Приблизительно 800 мкл РВ8 добавляли для доведения образца до объема 1 мл, который хранили при 4°С до тестирования в биоанализе.
6. Определение анти-Т№-активности.
Описано множество анализов по цитотоксичности, индуцированной ΤΝΕ ίη уйго. для оценивания аналогов растворимых ΤΝΕрецепторов. Мы применили анализ, используя карциномную линию клеток молочной железы человека, клетки ВТ-20 (АТСС НТВ 19). Использование этих клеток в качестве основы для ТВР-биоанализа описано раньше (48). Эти клетки культивировали при 37°С в среде ИРМ1 1640 с добавлением 10%-ной инактивированной нагреванием ЕВ8. Клетки растили до максимум 80-90% слияния (конфлюэнтности), снимали отслаиванием каждые 3-4 дня при плотности посева около 3 х 106 клеток на матрас Т175 см2.
ВТ-20-анализ использовали, включая клеточное окрашивание кристаллическим фиолетовым в качестве метода детектирования для анализа выживания клеток после обработки с помощью ΤΝΕ. Мертвые клетки не способны поглощать и удерживать данный краситель.
Коротко, протокол, используемый для анализа активности анти-ΤΝΕ, заключается в нижеследующем. Рекомбинантный человеческий ΤΝΡα (Κ.&Ό §у81еш8) и экспериментальные образцы помещали в среду (ИРМ1 1640 с 5% инактивированной нагреванием ЕВ8), вносили в лунки 96-луночных планшетов для культивирования. Затем в эти планшеты помещали клетки при плотности 1 х 105 клеток/лунку. В исследованиях по титрованию заблаговременно определяли количество добавленного ΤΝΕ и соответствующую дозу, при которой около 50% клеток погибало.
После внесения образцов клетки культивировали в течение 48 ч при 39°С, после чего определяли долю живых клеток, используя окрашивание кристаллическим фиолетовым и устройство для считывания планшета для микротитрования (570 нм).
Результаты
1. Изучение конструктов.
Краткое изучение созданных гибридных белков суммировано ниже; два контрольных белка, мономерный растворимый р55 (г-КГВР-1) и димерный ТВР-иммуноглобулиновый слитый белок ^ВРО^О.^,) (полученный практически, как описано в (10)), были изучены в сравнительных целях.
| Конструкт | ТВР Ν-концевой | ТВР С-концевой | Партнер в слиянии |
| г-МВР-1 | смесь из 9 и 20 | 180 | Нет |
| ΤΗΟ-ΙμΟ.! | смесь из 9 и 20 | 190 | Тяжелая цепь константной области 1дО3 |
| ТВР (20-161)-100 | 20 | 161 | 1СОа и ΙΟΟβ (гетеродимер) |
| ТВР (20-190)-100 | 20 | 190 | 1СОа и ΙΟΟβ (гетеродимер) |
Последовательности ДНК, кодирующие ТВР (20-190)-ЬСО и ТВР (20-161)-ЬСО, представлены, соответственно, на фиг. 1 и 2.
2. Секреция ТВР-йСО-белков.
Обнаружено, что у трансфицированных клеток млекопитающих все анализируемые конструкты продуцируются и секретируются в культуральную среду. Данные, иллюстрирующие это, показаны в табл. 1 и 2.
3. ТВР-11СС(а/Р)-слитые белки смонтированы в гетеродимеры.
Объединение ТВР-йСОа и ТВР-НССР подтверждали с использованием сандвич-анализа для йСО-гетеродимера. Только объединенная трансфекция а и β слитых субъединиц приводила к детекции гетеродимера (табл. 3).
4. ТВР-йСО-гибридные белки проявляют большую активность, чем ТВР-мономер.
Обнаружено, что гибридные белки, продуцируемые либо в СО8-7, либо в СНО-клетках, являются сильными ингибиторами ТИРа в ВТ20-биоанализе. Некоторые из проанализированных образцов кратко суммированы в табл. 4.
Негативные контроли (стандартизованная среда из псевдотрансфекций) были включены для 1х-средовых образцов.
Как проиллюстрировано на фиг. 3-5 (точки на у-оси), добавление ТИР (2,5 нг/мл) приводит к четкому снижению численности живых клеток (как установлено при ΟΌ 570). В каждом случае активные образцы обладают, в качестве максимального защитного эффекта, восстановлением клеточной жизнеспособности до уровня, обнаруживаемого в отсутствие добавленного ТИР (т.е. в контроле, помеченном только клетки).
Позитивные контроли, г-йТВР-1 и ТВР1дС3. оба являются защитными, показывая четкую дозовую зависимость и ΕΌ50, приблизительно 100 нг/мл для г-йТВР-1 (фиг. 3-5) и около 1,5 нг/мл для ТВР-1дС3 (фиг. 3) соответственно.
ТВР-йСО-конструкты из 1х-сред (СНО или СО8) или выделенные в иммунной очистке показывают дозозависимую защиту с приблизительными ΕΌ50 в диапазоне от 2-11 нг/мл (фиг. 3-5).
Результаты по ίη νίίτο-биоанализу приведены в табл. 5. Представленные данные свидетельствуют, что гибридные белки ингибируют ΤΝΕ-цитотоксичность и что они намного сильнее, чем ТВР-мономер. Негативные контроли лишены защитной активности.
Помимо того, что димеризация ТВР повышает эффективность, представляется также возможным, что активность гибридных белков связана не с димерным взаимодействием ТВР, а со стерическим ингибированием и обусловлена партнером данного гибрида, вмешивающегося в связывание растворимого ТВР/ТИР с поверхностно-клеточными ΤΝΕ-рецепторами.
Все ссылки, приводимые здесь, в том числе журнальные статьи или рефераты, опубликованные или аналогичные патентным заявкам США или иностранным патентным заявкам, патенты, изданные в США или иностранные, или какие-либо иные ссылки, полностью включены здесь путем ссылки, в том числе все данные, таблицы, фигуры и текст, представленные в этих приводимых ссылках. Кроме того, полное содержание ссылок, приводимых в рамках ссылок, приведенных здесь, также полностью включены путем ссылки.
Ссылка на стадии известного способа, стадии традиционных способов, известные способы или традиционные способы не представляют собой, в любом случае, признания того, что любой аспект, описание или вариант осуществления настоящего изобретения является раскрытым, описанным или предполагаемым в данной, относящейся к делу, области техники.
Предшествующее описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения столь полно выявляет общую суть настоящего изобретения, что другие, применив знания специалиста в рамках данной области (в том числе, содержание ссылок, приводимых здесь), могут легко модифицировать и/или адаптировать для всевозможного применения такие конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, без чрезмерного экспериментирования, не выходя за рамки общей идеи настоящего изобретения. По этой причине подразумевается, что такие адаптации и модификации ограничиваются значением и сферой, эквивалентными раскрываемым вариантам осуществления настоящего изобретения, основанным на указании и принципе, представленных здесь. Необходимо иметь в виду, что фразеология или терминология представлена здесь с целью описания, а не ограничения, так, чтобы терминология или фразеология настоящего описания интерпретировалась бы младшими специалистами в свете указаний и установки, представленных здесь, в сочетании со знанием рядового специалиста в данной области.
Таблицы
| Таблица 1: СО8-7 временная экспрессия (ТВР-ЕЫ8Л) | |
| Гибридный белок | Концентрация, пг/мл |
| ТВР1 | 66 |
| ТВР-ЬССа (20-161) | 5,1 |
| ТВР-ЬСОв (20-161) | 0,5 |
| ТВР-ЬСО (20-161) | 2,7 |
| Контроль | <0,25 |
Конструкты экспрессировали с использованием ρ8ΥΕ (Рйагшас1а).
| Таблица 2: СО8-7 временная экспрессия (ТВР-ЕЬ18Л) | |
| Гибридный белок | Концентрация, нг/мл |
| ТВР1 | 131 |
| ТВР-ЬССа (20-190) | 81 |
| ΤΒΙΜιΟ,β (20-190) | 9 |
| ΤΒΙΜιΟ, (20-190) | 62 |
| Контроль | <1 |
Конструкты экспрессировали с использованием мышиного металлотионеинового промоторсодержащего вектора рЭа.
| Таблица 3: СО8-7 временная экспрессия (анализ ЬСС-гетеродимера) | |
| Гибридный белок | Концентрация, нг/мл |
| ТВР1 | <0,2 |
| таР-ЬССа (20-190) | <0,2 |
| таР-ЬССР (20-190) | <0,2 |
| ТОР-ЬСС (20-190) | 38 |
| Контроль | <0,2 |
Конструкты экспрессировали с использованием мышиного металлотионеинового промоторсодержащего вектора ρΌα.
| Таблица 4: Образцы, проанализированные на анти-ΤΝΙ'-активность | ||
| Конструкт | Источник клеток | Происхождение образца |
| γ-ΗΤ'ΒΟ-1 | СНО | выделенный очисткой |
| 1110-003 | СНО | 1 х-кондиционированная среда |
| ΤΒΒ (20-161)-ЬСС | СНО | выделенный иммунной очисткой (антиТВР) |
| ΤΒΒ (20-190)-ЬСС | СНО | 1 х-кондиционированная среда |
| ΤΒР(20-190)-ЬСС | СО8 | 1 х-кондиционированная среда |
| Таблица 5: Предварительная оценка гибридных белков в анализе на ТЫ'-цитотоксичность | ||
| Конструкт | Партнер слияния | Анти-ТЫЕактивность (ЕБ50) в ВТ-20биоанализе |
| γ-ΗΤ'ΒΟ-1 | нет | 100 нг/мл |
| 1110-003 | тяжелая цепь константной области 1дС3 | 1,5 нг/мл |
| ТВР (20-161 )-ЬСС | ЬССа и ЬССв (гетеродимер) | 2 нг/мл |
| ТВР (20-190)-ЬСС | ЬССа и ЬССв (гетеродимер) | 8-11 нг/мл |
Ссылки:
1. 8тйЬ К.А. с соавт., б. ΒίοΙ. СЬет. 262:6951-6954, 1987.
2. Еск М.б. с соавт., б. ΒίοΙ. СЬет. 264:17595-17605, 1989.
3. бопез Ε.Υ. с соавт., Ыа1ите 338:225-228, 1989.
4. Еск М.б. с соавт., б. ΒίοΙ. СЬет.267:21192122, 1992.
5. Р1егсе б.С. с соавт., Аппи. Неу. Вюсйеш. 50:465-495, 1981.
6. ЬарШогп А.б. с соавт., Ыа1ите 369:455461, 1994.
7. \Уи Н. с соавт., 81тис1ите 2:545-550, 1994.
8. Епде1тапп Н., с соавт., б. ΒίοΙ. СЬет. 265:14497-14504, 1990.
9. Абат Ό. с соавт., б. ΒίοΙ. СЬет. 270:17482-17487, 1995.
10. Гое18сЬет Н.К. с соавт., б. ΒίοΙ. СЬет. 266:18324-18329, 1991.
11. Βημι^ι· Ω.\ν. с соавт., Се11 73:431-445, 1993.
12. Репшса Ό. с соавт., Β^οсЬет^8ί^у 32:3131-3138, 1993.
13. Епде1тапп Н. с соавт., б. ΒίοΙ. СЬет. 265:1531-1536, 1990.
14. Уап 2ее К.б. с соавт., Ргос. №П1. Асаб. 8ск И8А 89:4845-4849, 1992.
15. Абегка Ό. с соавт., б. Ехр. Меб. 175:323329, 1992.
16. МоЬ1ег К.М. с соавт., б. Iттипο1. 151:1548-1561, 1993.
17. Βе^ι^п^ К. с соавт., Еиг. Су1окте ЫеЩ., 1993.
18. Р1дие1 Р.Е. с соавт., 1ттипо1оду 77:510514, 1992.
19. \νί11ίηιη5 К.О. с соавт., 1ттипо1оду 84:433-439, 1995.
20. Саροп Ό.6. с соавт., Ыа1ите 337:525-531, 1989.
21. А511кепа/1 А. с соавт., Ргос. №111. Асаб. 8ск 88:10535-10539, 1991.
22. 8ш11ет5 А.б. с соавт., б. Ехр. Меб. 179:849-856, 1994.
23. №1ап О. с соавт., ΒϊόοΗμ. Βίορίρνδ. Ас1а 1040:1-11, 1990.
24. Кобпдиез М.Ь. с соавт., б. 1ттипо1. 151:6954-6961, 1993.
25. СЬапд Н.-С. с соавт., Ргос. №-Н1. Асаб. 8ск И8А 91:11408-11412, 1994.
26. \νιι Ζ. с соавт., б. Βίο1. СЬет. 270:16039-16044, 1995.
27. ΒΒζζοπί Е. с соавт., Ргос №г11. Асаб. 8ск И8А 92: 5376-5380, 1995.
28. ΒοΗω М.Р. с соавт., б. Βίο1. СЬет. 270:387-391, 1995.
29. Уи Т.-К.Н. с соавт., Се11, 64:1057-1068, 1991.
30. 8опд ΗΥ. с соавт., б. Βίο1. СЬет. 269:22492-22495, 1994.
31. Ви88е11 О.А. с соавт., б. 1пТес1юи8 Όίδеазез 171:1528-1538, 1995.
32. Као С.У. с соавт., Ат. б. 0Ьз1е1. Супесо1., 146, 65-68, 1983.
33. Эатегуооб М.Э. с соавт., ЕегО1. 81еб1. 52, 398-400, 1989.
34. СЬеп Е. с соавт., Мо1. Епбостшо1. 6:914919, 1992.
35. Β^е1^π8ка М. с соавт., б. Се11 Βίο1. 111:330а, 1990.
36. ЕигиЬазЫ М. с соавт., Мо1. Епбостшо1. 9:54-63, 1995.
37. 8идаЬага Т. с соавт., Ргос. №П1. Асаб. 8ск И8А 92:2041-2045, 1995.
38. ΙοΗηδοπ θ.Ά. с соавт., Βιο1. Кергой. 52:68-73, 1995.
39. иВаиЬ О. и Сйазт Ь. Ргос. Ыа11. Асай. 8οί и§А 77:4216-4220, 1980.
40. Ыорйаг Υ. с соавт., ЕМВО Е 9:32693278, 1990.
41. Е1ййез ЕС. с соавт., ЫаШге 281:351-356,
1979.
42. Е1ййез ЕС. с соавт., ЫаШге 286:684-687,
1980.
43. Εΐιοη Ε.Ά., в Сиггеп! Рго1осоЕ ΐπ Мо1еси1аг Вю1о§у, под ред. АизиЬ1е Е. М. и др., .Ιοίιπ ^Неу & δοηδ, 1993.
44. СатрЬе11 К. , Ргос. Ыа11. Асай. 8с1. и§А 88:760-764, 1991.
45. Со1е Ε.8. с соавт., Вю1есйпо1о§у, 11, 1014-1024, 1993.
46. Ои/тап Υ., Се11 23:175-182, 1981.
47. СЕи О. с соавт., Ыис1. Ас1й Кез. 15:13111326, 1987.
48. Υеπ Е с соавт., Е 1ттипо1йегару 10:174-181, 1991.
Список последовательностей (1) ОЕЩ4Е СВЕДЕНИЯ:
(ί) ЗАЯВИТЕЛЬ:
(A) ИМЯ: АррИес! РезеагсЬ Зузкепз АКБ Но1<±шд Ν.ν.
(B) УЛИЦА: 14 ЦоЬп В. Согзтгамед (C) ГОРОД: Сигасао (Ό) СТРАНА: ЫеШег1апс1з АпЫИез (Е) ПОЧТОВЫЙ МОД (ΖΙΡ) :
(A) ИМЯ: СЙМРВЕЬЬ. КоЬегТ. С.
(B) УЛИЦА: 25 МеаНоиЪгоок ϋΓΪνβ (C) ГОРОД: ИгепЬЬат (ϋ) ШТАТ: МаззасЬизеккз (Е) СТРАНА: Соеданеннье Штаты Америки (A) ИМЯ; ДАМЕ5ОТ, ВгасДогЦ А.
(B) УЛИЦА: 76 КсЬЫпз ЗЬгеек (C) ГОРОД: Μίΐίοη (ϋ) ШТАТ: МаззасЬизеЬкз (Е) СТРАНА: Соеданеннье штаты Америки (A) ИМЯ: СНАРРЕЬ, ЗсоТО С.
(B) УЛИЦА: 125 Сапкоп Адепие (C) ГОРОД: ΜίΙΡοη (Ω) ШТАТ: МаззасЬизеЪкз (Е) СТРАНА: Соединенные Штаты Америки (ί) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: ГИБРИДНЫЕ БЕЛКИ (ϊΐ) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 22 ( ίίί) АДРЕС ДЛЯ СООБЩЕНИЙ:
(А) АДРЕСАТ: ВВОЖУ ΑΝΟ ΝΕΙΜΑΒΚ (B) УЛИЦА: 419 5еиепЫ1 Зкгеек Ν.Ν., Зке. 300 (C) ГОРОД: КазЫпдкоп (B) ШТАТ: Б.С.
(Е) СТРАНА: США (Г) ΖΙΡ: 22207 (V) ФОРМА КСМПНОТЕРНОГО ПРОЧТЕНИЯ:
(A) ТИП НОСИТЕЛЯ ДАННЫХ: Мягкий даек (B) КОМПЬЮТЕР: совместим,й с персональными компьютерами ф>гре.-ы ΙΕΜ (C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РС-003/МБ-ЕС6 (ϋ) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: РакепкШ Не1еазе #1.0, Уегзюп #1.30 (νί) ПРВДЦУЩЯЕ ДАННЫЕ О ЗАЯВКЕ:
(A) НОМЕР ЗАЯВКИ: 60/011,936 (B) ДАТА ПОДАЧИ: 20 Февраля 1996 г.
(С) КЛАССИФИКАЦИЯ:
(νϋΐ) СВЕДЕНИЯ О ПАТЕНТНОМ ПОВЕРЕННОМ:
(A) ИМЯ: ВгоиНу, Нодег Ь.
(B) РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР: 25,618 (C) ССЫЛКА/НОМЕР ДЕЛА: САМРВЕШ=2А ВОТ (ΐχ) ТЕЖКОЧЧУНИКАЦИОННБЕ СВЕДЕНИЯ:
(A) ТЕЛЕФОН: (202) 628-5197 (B) ТЕЛЕФАКС: (202) 737-3528 (2) СВЕДЕНИЯ О ЗЕХ2 Ю ГО: 1:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПССЛЕДОВАТЕПЬНСХТГИ:
(A) ДЛИНА: 1049 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (И) (ΐχ) (С) СТРУКТУРА ИДТИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВОД МОЛЕКУЛЫ: кДНК
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ:
(A) ИМЯ/КЖМ: С№ (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 278..1047
СПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕ<2 ГО N0:1
ВСАСААТСТС (х!)
ТССАСАТВВС ТАСА6СТААВ
ССССССТААА АТСССТТТСС
АСАСССАССС АССТСТАСАТ савАСВсаса састаассст
СТСАСТАТСС ССАТСТААСС
ТССТСАСССС
САССТТТСВС
ССТТСТСААТ
120
ССАСТДТТТС СССААТСТСА
СССАТССА6А 8А8АААААСА
САААССТССТ сстссствса
180
ААСАССТССТ ССАССАСССА ссаастссст стсттсссст
САТ АВТ СТС
Азр Зег Уа1 састсстссс стсттсстст
24<
СТССТТТСТС СССА8СС ТСС ССС АСС ТСС СТС СТС
Зег Агд ТЬг Зег Ьеи Ьеи
5
Ьеи Ьеи твт
Суз
АСС ТЬг
343
САА
В1п
ААС
Ьуз сса вас сса вас
Рго 61у Рго С1у 55
САС ССТ САА ААТ ААТ ТСС
ССА ААА ТАТ АТС ___ _______________
С1у Ьуз Туг Не ΗΪ3 Рго С1п Азп Азп Зег 30 35
ТСС
Суз
САС ААА ССА АСС ТАС ТТС ТАС ААТ САС ТСТ
Ηχε Ьуз С1у ТЬг Туг Ьеи Туг Азп Азр Суз 45 50
ВАТ
САС
С1п Азр
ТТС АСС ССТ ТСА
РЬе ТЬг А1а Зег
391
439
АСС ВАС ТСС АВС ВАС ТСТ САС АСС ССС ТСС
ТЬг Азр Суз Агд С1и Суз С1и Зег С1у Зег 65 70
ТСС ССА ААС САА АТС ССТ Суз Агд Ьуз 61и
ССС САС АСС
Агд Азр ТЬг
105
487
535
САС СТС САС АТС ТСТ ТСТ ТСС АСА СТС САС
МеЬ С1у С1п νβΐ С1и Не 5ег Зег Суз ТЬг Уа1 Азр 95 100
СТС
Уа1
ΤΘΤ ВВС Суз С1у стт Ьеи
583
ТСС АСС ААС ААС САС ТАС ССС САТ ТАТ ТСС
Суз Агд Ьуз Азп С1п Туг Агд Ηίε Туг Тгр 110 115
ТТС САС РЬе С1п
СТС Ьеи
САТ ССА ССТ .
Н1з А1а 61у РЬе
ТТС
631
ТСС ТТС ААТ ТСС АСС СТС ТСС СТС ААТ ССС Суз РЬе Азп Суз Зег Ьеи Суз Ьеи Азп С1у 125 130
САС ВАС ААА САС ААС АСС 6ТВ ТСС АСС ТВС
С1п С1и Ьуз С1п Азп ТЬг Уа1 Суз ТЬг Суз
145 150
ССТ ССС ССА ССТ
А1а А1а Рго С1у
170 ___
ТСС САС ССС ССТ ССС ССА АТА СТТ САС ТСС АТС ВВС
Зег В1п Рго С1у А1а Рго Не Ьеи 61п Суз Мер С1у 185 190
ТСС ССА САА ТСС АСС СТА САС САА ААС ССА ТТС ТТС
Суз Рго 61и Суз ТЬг Ьеи С1п С1и Азп Рго РЬе РЬе 175 180
АСА ССА ТАТ ССС АСТ ССА СТА АСС ТСС ААС ДАВ АСС
Агд А1а Туг Рго ТЬг Рго Ьеи Агд Зег Ьуз Ьуз ТЬг
200 205 210
Туг Рго ТЬг Рго Ьеи Агд 3е1 205
АСС ВТС АСА СТС АТС ССС ССТ ТТС ААА СТС САС ААС
Агд Уа1 ТЬг Уа1 Мер С1у С1у РЬе Ьуз Уа1 С1и Азп 235 240
САС ТСС АСТ АСТ ТСТ ТАТ ТАТ САС ААА ТСТ Нхз Суз Зег ТЬг Суз Туг Туг Нхз Ьуз Зег 250 255 (2) СВЕДЕНИЯ О ЗЕ£ ГО N0:2:
ТА АВ
727
775
823
871
919
96’ (I) (11)
САС АСС ВВС ТВС
ΗΪ3 ТЬг С1у Суз
245
1015
1049
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 256 аминокислот (B) ВОД: аминокислота (C) ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВОД, МОЛЕКУЛЫ: белок
N0:2:
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е0 ΙΟ
| Ьеи 5 | Ьеи | Ьеи | А1а | РЬе | С1у 10 | Ьеи | Ьеи | Суз | Ьеи | Рго 15 | Тгр |
| Бег | А1а | Азр | Зег | Уа1 25 | Суз | Рго | С1п | б1у | Ьуз 30 | Туг | Не |
| Азп | Зег | Не | Суз 40 | Суз | ТЬг | Ьуз | Суз | Н±з 45 | Ьуз | С1у | ТЬг |
| Азр | Суз | Рго 55 | СЦу | Рго | <Э1у | (31п | Азр 60 | ТЬг | Азр | Суз | Агд |
| С1у | Зег | РЬе | ТЬг | А1а | Зег | С1и | Азп | ΗΪ3 | Ьеи | Агд | Н13 |
(х!)
| СУ= Ьеи | Зег Суз Зег 85 | Ьуз Суз Агд Ьуз С1и МеЬ В1у В1п νβΐ С1и 11е | |||||||||||||
| 90 | 95 | ||||||||||||||
| Бег | Зег | Суз | ТЬг | Уа1 | Азр | Агд | Азр | ТЬг | Уа1 | Суз | С1у | Суз | Агд | Ьуз | Азп |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| <Э1п | Туг | Агд | Н13 | Туг | Тгр | Бег | С1и | Азп | Ьеи | РЬе | б1п | Суз | РЬе | Азп | Суз |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Зег | Ьеи | Суз | Ьеи | Азп | С1у | ТЬг | νηΐ | Нхз | Ьеи | Зег | Суз | С1п | С1и | Ьуз | С1п |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Азп | ТЬг | Уа1 | Суз | ТЬг | Суз | ΗΪ3 | А1а | 61у | РЬе | РЬе | Ьеи | Агд | С1и | Азп | С1и |
| 145 | 150 | 155 | 150 | ||||||||||||
| Суз | Уа1 | Зег | Суз | А1а | <31у | А1а | А1а | Рго | <31у | Суз | Рго | 61и | Суз | ТЫ | Ьеи |
| 165 | 170 | 175 |
| αΐη | <31и | Азп | Рго | РЬе | РЬе | Бег | Е1П | Рго | (31у | А1а | Рго | 11е | Ьеи | 31п | Суз |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| МеЪ | С1у | Суз | Суз | РЬе | Бег | Агд | А1а | Туг | Рго | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | Зег | Ьуз |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Ьуз | ТЬг | Мек | Ьеи | Уа1 | С1п | Ьуз | Азп | Да1 | ТЬг | Бег | О1и | Зег | ТЬг | Суз | Суз |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Уа1 | А1а | Ьуз | Зег | Туг | Азп | Агд | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Мек | С1у | С31у | РЬе | Ьуз | Уа1 |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| <31и | Азп | Н13 | ТЬг | С1у | Суз | ΗΪ3 | Суз | Зег | ТЬг | Суз | Туг | Туг | ΗΪ8 | Ьуз | Зег |
| 245 | 250 | 255 |
(2) СВЕДЕНИЯ О 5ЕО Ιϋ N0: 3:
(ι)
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) (B) (C) (О
ДЛИНА: 1202 пары оснований ВОД: нуклеиновая кислота СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная
СТСЗАСАТСС
САСАССТАСС (11) (IX)
ВОД МОЛЕКУЛЫ: кДНК
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ:
(A) ИМЯ/КЛЕСЧ: СС6 (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 279.. 1199 (XI)
СТАСАССТАА
ОПИСАНИЕ ПССЛЕДОВАДЕДЬНОСТИ: ЗЕО 10 N0:
СТССТСАССС
СССССССТАА
ААТСССТТТО
СССАСААТСТ
САССТСТАСА
ТСССАССССС
ЗСАСТААССС
ТЗАСЗТТТЗЗ
СССТТСТСАА
ТСТСАСТАТС
СССАТСТААС
СССАЗТАТТТ
ССССААТСТС
АЗАААЗСТСС
ТССТСССТСС
АСЗЗАТЗЗАЗ
АЗАЗАААААС
АААСАЗСТСС
ТССАССАССС
АСАСТССТСС
ССТСТТОСТС
3:
120
180
240 тссззстссс тстсттсссс тстсстттст
ССССАССС ТСС ССС АСС ТСС СТО
Зег Агд ТЬг Зег Ьеи 260
293
ССС СТО
С1у Ьеи
СТС ТСС СТС
Ьеи Суз Ьеи
270
ССС ТСС
Рго Тгр
СТТ
САА САС ССС АСТ
С1п С1и С1у Зег
275
341
ССС САТ АСТ СТС
А1а Азр Зег νηΐ
280
ТСТ ССС
Суз Рго
САА ССА ААА
С1п С1у Ьуз
285
ТАТ АТС
Туг 11е
САС Нхз
ССТ САА ААТ ААТ
Рго С1п Азп Азп
290
389
ТСС АТТ ТСС ТСТ Зег 11е Суз 295
Суз
АСС ААС
ТЬг Ьуз
ТСС САС ААА
Суз Н1з Ьуз
300
СОА АСС
С1у ТЬг
ТАС
305
ТТС ТАС ААТ ЗАС Ьеи Туг Азп Азр
437
ТОТ ССА ССС
Суз Рго 31у
310
ССС Рго
САТ АСС САС
Азр ТЬг Азр
САС
С1и
ТСТ САС АСС ССС
Суз 31и Зег С1у
325
485
ТСТ ТТС АСС
Зег РЬе ТЬг зет
А1а
ТСА САА
Зег 31и
330
ААС САС СТС Азп Нхз Ьеи
АЗА САС
Агд Нхз
335
ТСС Суз
СТС АСС ТСС ТСС
Ьеи Зег Суз Зег
340
533
ААА ТСС ССА ААС
Ьуз Суз Агд Ьуз
345
САА АТС
С1и Мее
ССТ САС СТС
С1у С1п Уа1
350
ЗАЗ АТС
С1и 11е
ТСТ Зег
ТСТ ТСС АСА СТС
Зег Суз ТЬг Уа1
355
581
| Ьеи С1п С1и С1у Зег | А1а Азр Зег Уа1 Суз Рго С1п С1у Ьуз Туг | 11е | |||||||||||||
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| НХЗ | Рго | αΐη 35 | Азп | Азп | Зег | 11е | Суз 40 | Суз | ТЬг | Ьуз | Суз | Нхз 45 | Ьуз | С1у | ТЬг |
| Туг | Ьеи 50 | Туг | Азп | Азр | Суз | Рго 55 | С1у | Рго | С1у | 01п | Азр 60 | ТЬг | Азр | Суз | Агд |
| С1и 65 | Суз | (31и | Зег | С1у | Зег 70 | РЬе | ТЬг | А1а | Зег | С1и 75 | Азп | Нхз | Ьеи | Агд | НХЗ ВО |
| Суз | Ьеи | Зег | Суз | Зег 85 | Ьуз | Суз | Агд | Ьуз | С1и 90 | Мес | 61у | С1п | Уа1 | С1и 95 | 11е |
| Зег | Зег | Суз | ТЬг 100 | Уа1 | Азр | Агд | Азр | ТЬг 105 | Уа1 | Суз | С1у | Суз | Агд 110 | Ьуз | Азп |
| С1п | Туг | Агд 115 | НХЗ | Туг | Тгр | Зег | С1и 120 | Азп | Ьеи | РЬе | С1п | Суз 125 | РЬе | Азп | Суз |
| Зег | Ьеи 130 | Суз | Ьеи | Азп | С1у | ТЬг 135 | Уа1 | ΗΪ3 | Ьеи | Зег | Суз 140 | <31П | С1и | Ьуз | С1п |
| Азп 145 | ТЬг | Уа1 | Суз | ТЬг | Суз 150 | Нхз | А1а | С1у | РЬе | РЬе 155 | Ьеи | Агд | С1и | Азп | <31 и 160 |
| Суз | Уа1 | Зег | Суз | А1а 165 | С1у | А1а | С1у | Рго | Агд 170 | Суз | Агд | Рго | 11е | Азп 175 | А1а |
| ТЬг | Ьеи | А1а | 57а1 180 | С1и | Ьуз | С1и | С1у | Суз 185 | Рго | Уа1 | Суз | 11е | ТЬг 190 | Уа1 | Азп |
| ТЬг | ТЬг | Не 195 | Суз | А1а | <31у | Туг | Суз 200 | Рго | ТЬг | Мер | ТЬг | Агд 205 | Уа1 | Ьеи | С1п |
| <31у | Уа1 210 | Ьеи | Рго | А1а | Ьеи | РГО 215 | <31п | νβΐ | Уа1 | Суз | Азп 220 | Туг | Агд | Азр | Уа1 |
| Агд 225 | РЬе | С1и | Зег | 11е | Агд 230 | Ьеи | Рго | С1у | Суз | Рго 235 | Агд | <31у | Уа1 | Азп | Рго 240 |
| Уа1 | Уа1 | Зег | Туг | А1а 245 | Уа1 | А1а | Ьеи | Зег | Суз 250 | С1п | Суз | А1а | Ьеи | Суз 255 | Агд |
| Агд | Зег | ТЬг | ТЬг 260 | Азр | Суз | С1у | <31у | Рго 265 | Ьуз | Азр | Нхз | Рго | Ьеи 270 | ТЬг | Суз |
| Азр | Азр | Рго 275 | Агд | РЬе | С1п | Азр | Зег 280 | Зег | Зег | Зег | Ьуз | А1а 285 | Рго | Рго | Рго |
| Зег | Ьеи | Рго | 8ег | Рго | Зег | Агд | Ьеи | Рго | С1у | РГО | Зег | Азр | ТЬг | Рго | 11е |
290 295 300
САС ССС САС АСС СТС ТОТ ССС ТСС АСС ААС ААС
Азр Агд Азр ТЬг Уа1 Суз С1у Суз Агд Ьуз Азп
360 365 САЗ
31п
ТАС ССС САТ
Туг Агд Η1Ξ 370
ТАТ Туг
629
ТСС АСТ САА ААС СТТ ТТС САС ТСС ТТС ААТ ТСС
Тгр Зег С1и Азп Ьеи РЬе С1п Суз РЬе Азп Суз 375 380
АСС Зег 385
СТС ТСС СТС Ьеи Суз Ьеи
ААТ
677
ССС АСС СТС САС СТС ТСС ТСС САС САС ААА САС
С1у ТЬг Уа1 Ηχε Ьеи Зег Суз С1п С1и Ьуз С1п 390 395 400
ААС Азп
АСС СТО ТСС
ТЬг Уа1 Суз ТЬг • 405
АСС
725
Азп С1и
415
ТОТ
Суз
СТС ТСС ТСТ ССТ
Уа1 Зег Суз А1а
420
773
Ьеи Рго СПп
305 (2) СВЕДЕНИЯ О 3ΕΏ 10 N0: 5:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 1147 пары оснований (B) ВОД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (Э) ТОПОЛОГИЯ: линейная
ССТ ССТ ССТ ССА ССС ТСС ССС ССС АТС ААТ ССС
С1у А1а С1у Рго Агд Суз Агд Рго 11е Азп А1а 425 430
АСС ТЬг
СТС ССТ СТС САС
Ьеи А1а Уа1 С1и
435
821
ААС САЗ ССС ТСС ССС СТС ТСС АТС АСС СТС ААС Ьуз 81и С1у Су£ ~ .
АСС
Рго Уа1 Суз 11е ТЬг Уа1 Азп ТЬг 445
АСС АТС ТОТ ССС ТЬг
450
Не Суз А1а
СТС
ССС ТАС ТСС ССС АСС АТС АСС ССС СТС СТС САС ССС _ .
С1у Туг Суз Рго ТЬг МеЪ ТЬг Агд \7а1 Ьеи С1п С1у Да1 455 460 465
СТС ССС ССС Ьеи ~
917
СТС ССТ САС СТС СТС ТСС ААС ТАС ССС САТ СТО ССС ТТС
Ьеи Рго С1п Уа1 Уа1 Суз Азп Туг Агд Азр Уа1 Агд РЬе 470 475 --480
САЗ
31и
965
ССС СТО СТС
Рго Уа1 Уа1
ТСС Зег
ТАС зет
Туг А1а
500
1013 (11) ВОД МОЛЕКУЛЫ: ОДНИ (ίχ) ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ:
(A) ИМЯ/КЛКН: СГ6 (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 278..1132 (х!) ОПИСАНИЕ ПОСШЕДСВАТЕЛЬНООТИ: ЗЕО 10 Ю: 5:
ТССАСАТССС ТАСАССТААС ССССССТААА АТСССТТТСС ССАСААТСТС ТССТСАСССС60
АСАСССАССС АССТСТАСАТ СССАСССССС САСТААСССТ САССТТТССС ССТТТТСААТ120
СТСАСТАТСС ССАТСТААСС ССАСТАТТТС СССААТСТСА САААССТССТ ССДСССТССА180
ОССАТССАСА САСАААААСА ААСАССТССТ ССАССАСССА САСТССТССС СТСТТССТСТ240
ССС ССС АСС АСС
СТС ССТ СТС АСС ТСТ САА ТСТ ССА СТС ТСС
Уа1 А1а Ьеи Зег Суз С1п Суз А1а Ьеи Суз Агд Агд Зег ТЬг -- — - 515
505
510
АСТ САС
ТЬг Азр
1061
СССССТСССТ СТСТТССССТ СТССТТТСТС СССАССС ТСС ССС АСС ТСС СТС СТС 295
Зег Агд ТЬг Зег Ьеи Ьеи
310
ТСС ССС ССТ ССС ААС САС САС ССС ТТС АСС ТСТ САТ САС
Суз С1у 31у Рго Ьуз Азр Нхз Рго Ьеи ТЬг Суз Азр Азр
520 525 530
ССС
Рго
ССС ттс
Агд РЬе
1109
САС САС ТСС ТСТ ТСС ТСА ААС ССС ССТ ССС ССС АСС СТТ
С1п Азр Зег Зег Зег Зег Ьуз А1а Рго Рго Рго Зег Ьеи
535 540 545
ССА АСС ССА Рго Зег Рго
1157
1202 (1)
ХАРАКТЕЯ4СГИКИ ПОСДВДОВАТЕЛЬНОСГИ:
(A) ДЛИНА: 307 аминокислот (B) ВОД: аминокислота (C) ТОПОЛОГИЯ: линейная (И)
ВОД МОЛЕКУЛЫ: белок (XI)
Зег Агд ТЬг Зег
ОПИСАНИЕ ПООЛВДОВАГЕПЬНОСГИ; 5Е0 ГО N0:4:
Ьеи Ьеи Ьеи А1а РЬе <31у Ьеи Ьеи Суз Ьеи Рго Тгр
10 15
| СТС | ССТ | ТТТ | ССС | СТС | СТС | ТСС | СТС | ССС | ТСС | СТТ | САА | САС | ССС | АСТ ССС | 343 |
| Ьеи | А1а | РЬе | С1у | Ьеи | Ьеи | Суз | Ьеи | Рго | Тгр | Ьеи | С1п | С1и | С1у | Зег А1а | |
| 315 | 320 | 325 | |||||||||||||
| САТ | АСТ | СТС | ТСТ | ССС | САА | ССА | ААА | ТАТ | АТС | САС | ССТ | САА | ААТ | ААТ ТСС | 391 |
| Азр | Зег | Уа1 | Суз | Рго | С1п | С31у | Ьуз | Туг | 11е | Нхз | Рго | С1п | Азп | Азп Зег | |
| 330 | 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| АТТ | ТСС | ТСТ | АСС | ААС | ТСС | САС | ААА | ССА | АСС | ТАС | ТТС | ТАС | ААТ | САС ТОТ | 439 |
| 11е | Суз | Суз | ТЬг | Ьуз | Суз | Нхз | Ьуз | С1у | ТЬг | Туг | Ьеи | Туг | Азп | Азр Суз | |
| 350 | 355 | 360 | |||||||||||||
| ССА | ССС | ССС | ССС | САС | САТ | АСС | САС | ТСС | АСС | САС | ТОТ | САС | АСС | ССС ТСС | 487 |
| Рго | С1у | Рго | С1у | Θΐη | Азр | ТЬг | Азр | Суз | Агд | С1и | Суз | С1и | Зег | С1у Зег | |
| 365 | 370 | 375 | |||||||||||||
| ТТС | АСС | ССТ | ТСА | САА | ААС | САС | СТС | АСА | САС | ТСС | СТС | АСС | ТСС | ТСС ААА | 535 |
| РЬе | ТЬг | А1а | Зег | С1и | Азп | Нхз | Ьеи | Агд | Нхз | Суз | Ьеи | Зег | Суз | Зег Ьуз | |
| 380 | 385 | 390 | |||||||||||||
| ТСС | ССА | ААС | САА | АТС | ССТ | САС | СТС | САС | АТС | ТСТ | ТСТ | ТСС | АСА | СТС САС | 583 |
| Суз | Агд | Ьуз | С1и | Мер | С1у | С1п | Уа1 | С1и | 11е | Зег | Зег | Суз | ТЬг | Уа1 Азр | |
| 395 | 400 | 405 | |||||||||||||
| ССС | САС | АСС | СТС | ТСТ | ССС | ТСС | АСС | ААС | ААС | САС | ТАС | ССС | САТ | ТАТ ТСС | 631 |
| Агд | Азр | ТЬг | Уа1 | Суз | С1у | Суз | Агд | Ьуз | Азп | С1п | Туг | Агд | Нхз | Туг Тгр | |
| 410 | 415 | 420 | 425 | ||||||||||||
| АСТ | САА | ААС | СТТ | ТТС | САС | ТСС | ТТС | ААТ | ТСС | АСС | СТС | ТСС | СТС | ААТ ССС | 679 |
| Зег | С1и | Азп | Ьеи | РЬе | С1п | Суз | РЬе | Азп | Суз | ТЬг | Ьеи | Суз | Ьеи | Азп С1у | |
| 430 | 435 | 440 | |||||||||||||
| АСС | СТС | САС | СТС | ТСС | ТСТ | САС | САС | ААА | САС | ААС | АСС | СТС | ТСС | АСС ТСС | 727 |
| ТЬг | Уа1 | Нхз | Ьеи | Зег | Суз | С1п | С1и | Ьуз | С1п | Азп | ТЬг | Уа1 | Суз | ТЬг Суз | |
| 445 | 450 | 455 | |||||||||||||
| САТ | ССА | ССТ | ТТС | ТТТ | СТА | АСА | САА | ААС | САС | ТСТ | СТС | ТСС | ТСТ | АСТ ААС | 775 |
| Нхз | А1а | С1у | РЬе | РЬе | Ьеи | Агд | С1и | Азп | С1и | Суз | Уа1 | Зег | Суз | Зег Азп | |
| 460 | 465 | 470 | |||||||||||||
| ТСТ | ААС | ААА | АСС | СТС | САС | ТСС | АСС | ААС | ТТС | ТСС | СТА | ССС | САС | АТТ САС | 823 |
| Суз | Ьуз | Ьуз | Зег | Ьеи | С1и | Суз | ТЬг | Ьуз | Ьеи | Зег | Ьеи | Рго | С1п | 11е 01и | |
| 475 | 480 | 485 | |||||||||||||
| ААТ | СТТ | ААС | ССС | АСТ | САС | САС | ТСА | ССС | АСС | АСА | ССС | ССТ | ССТ | ССС ССА | 871 |
| Азп | Уа1 | Ьуз | С1у | ТЬг | С1и | Азр | Зег | С1у | ТЬг | ТЬг | А1а | С1у | А1а | А1а Рго | |
| 490 | 495 | 500 | 505 |
Суз ТИг Ьеи С1п О1и Азп Рго РЬе РЬе Зег С1п Рго
510 515 520
919
СОТ ССС ССА АТА СТТ САО ТСС АТО ОСС ТОС ТСС ТТС ТСТ АСА ОСА ТАТ
С1у А1а Рго Не Ьеи О1п Суз Мек С1у Суз Суз РЬе Зег Агд А1а Туг
525 530 535
967
| ТСС | ТТС | АСС | ССТ | ТСА | САА | ААС | САС | СТС | АСА | САС | Т6С | СТС | АСС | тсс | ТСС | 533 |
| Зег | РЬе | ТЬг | А1а | Зег | С1и | Азп | Нхз | Ьеи | Агд | Ηίδ | Суз | Ьеи | Зег | Суз | Зег | |
| 355 | 360 | 365 | 370 | |||||||||||||
| ААА | ТОС | ССА | ААС | САА | АТС | ССТ | САС | СТС | САС | АТС | ТСТ | ТСТ | ТСС | АСА | СТС | 581 |
ССС АСТ ССА СТА АСС ТСС ААб ААб АСб АТО ТТС СТС САА ААб ААС 6ТС
Рго ТЬг Рго Ьеи Агд Зег Ьуз Ьуз ТЬг Мек Ьеи Уа1 С1п Ьуз Азп Уа1 540 545 550
1015
АСС ТСА САС ТСС АСТ ТОС ТОТ СТА ССТ АДА ТСА ТАТ ААС АСС СТС АСА
ТЬг Зег О1и Зег ТЬг Суз Суз Уа1 А1а Ьуз Зег Туг Азп Агд Уа1 ТЬг 555 560 565
1063
СТА АТО ОСО ОСТ ТТС ААА ОТО ОАО ААС САС АСС ОСС ТОС САС ТСС АбТ Уа1 Мек С1у С1у РЬе Ьуз Уа1 О1и Азп Нхз ТЬг А1а Суз Нхз Суз Зег 570 575 580 585
1111
АСТ ТСТ ТАТ ТАТ САС ААА ТСТ ТААббАТССС ТСОАО ТЬг Суз Туг Туг Нхз Ьуз Зег
590 (2) СВЕДЕНИЯ О 5В0 10 N0:6:
1147 (11)
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДСВАГЕЛЬНССГИ:
(A) ДЛИНА: 258 аминокислот (B) ВИД: аминокислота (C) ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВОД МОЛЕКУЛЫ: белок
ОПИСАНИЕ ПОСЖДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ЕО ТО N0:6 (Х1)
| Зег | Агд | ТЬг | Зег | Ьеи | Ьеи | Ьеи | А1а | РЬе | □1у | ьеи | Ьеи | Суз | Ьеи | Рго |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Ьеи | 61п | 61и | <31у | Зег | А1а | Азр | Зег | Уа1 | Суз | Рго | 61п | 61у | Ьуз | Туг |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Ηίε | Рго | 61п | Азп | Азп | Зег | Не | Суз | Суз | ТЬг | Ьуз | Суз | ΗΪ3 | Ьуз | 61у |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Туг | Ьеи | Туг | Азп | Азр | Суз | Рго | С1у | Рго | 61у | 61п | Азр | ТИг | Азр | Суз |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| 61и | Суз | С1и | Зег | С1у | Зег | РЬе | ТЬг | А1а | Зег | 61и | Азп | Ηίε | Ьеи | Агд |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Суз | Ьеи | Зег | Суз | Зег | Ьуз | Суз | Агд | Ьуз | 61и | МеЬ | 61 у | 61п | Уа1 | 61и |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||
| Зег | Зег | Суз | ТЬг | Уа1 | Азр | Агд | Азр | ТЬг | Уа1 | Суз | С1у | Суз | Агд | Ьуз |
| Ьуз | Суз | Агд | Ьуз | С1и | Мек | С1у | С1п | Уа1 | С1и | 11е | Зег | Зег | Суз | ТЬг | Уа1 | |
| 375 | 380 | 385 | ||||||||||||||
| 6АС | ССб | САС | АСС | СТб | ТСТ | ОСС | ТбС | Абб | ААб | ААС | САб | ТАС | Сбб | САТ | ТАТ | 629 |
| Азр | Агд | Азр | ТЬг | Уа1 | Суз | С1у | Суз | Агд | Ьуз | Азп | С1п | Тут- | Агд | Нхз | Туг | |
| 390 | 395 | 400 | ||||||||||||||
| ТОС | АСТ | ОАА | ААС | СТТ | ТТС | САС | ТСС | ТТС | ААТ | ТСС | АСС | СТС | ТСС | СТС | ААТ | 677 |
| Тгр | Зег | О1и | Азп | Ьеи | РЬе | Θΐη | Суз | РЬе | Азп | Суз | Зег | Ьеи | Суз | Ьеи | Азп | |
| 405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
| ССС | АСС | СТС | САС | СТС | ТСС | тсс | САС | САС | ААА | САС | ААС | АСС | СТС | ТСС | АСС | 725 |
| С1у | ТЬг | Уа1 | нхз | Ьеи | Зег | Суз | С1п | С1и | Ьуз | С1П | Азп | ТЬг | Уа1 | Суз | ТЬг | |
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
| ТСС | САТ | ССА | сот | ТТС | ТТТ | СТА | АСА | САА | ААС | САС | ТСТ | СТС | ТСС | ТСТ | АСТ | 773 |
| Суз | Нхз | А1а | С1у | РЬе | РЬе | Ьеи | Агд | С1и | Азп | С1и | Суз | Уа1 | Зег | Суз | Зег | |
| 435 | 440 | 445 | 450 | |||||||||||||
| ААС | ТСТ | ААС | ААА | АСС | СТС | САС | ТбС | АСС | ААС | ТТС | ТСС | СТА | ССС | САС | АТТ | 821 |
| АЗП | Суз | Ьуз | Ьуз | Зег | Ьеи | С1и | Суз^ | ТЬг | Ьуз | Ьеи | Суз | Ьеи | Рго | С1п | Не | |
| 455 | 460 | 465 | ||||||||||||||
| САС | ААТ | СТТ | ААС | ССС | АСТ | САС | САС | ТСА | ССС | АСС | АСА | ССТ | ССТ | ССТ | ССТ | 869 |
| С1и | Азп | Уа1 | Ьуз | С1у | ТЬг | С1и | Азр | Зег | С1у | ТЬг | ТЬг | А1а | С1у | А1а | С1у | |
| 470 | 475 | 480 | ||||||||||||||
| ССА | ССС | тсс | ССС | ССС | АТС | ААТ | ССС | АСС | СТС | ССТ | СТС | САС | ААС | САС | ССС | 917 |
| Рго | Агд | Суз | Агд | Рго | Не | Азп | А1а | ТЬг | Ьеи | А1а | Уа1 | С1и | Ьуз | С1и | С1у | |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||||
| ТСС | ССС | СТС | ТСС | АТС | АСС | СТС | ААС | АСС | АСС | АТС | ТСТ | ССС | ССС | ТАС | ТСС | 965 |
| Суз | Рго | νηΐ | Суз | Не | ТЬг | Уа1 | Азп | ТЬг | ТЬг | Не | Суз | А1а | С1у | Туг | Суз | |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
| ССС | АСС | АТб | АСС | ССС | СТС | СТС | САС | СбС | СТС | СТС | ССС | ОСС | СТС | ССТ | САС | 1013 |
| Рго | ТЬг | Мек | ТЬг | Агд | Уа1 | Ьеи | С1п | С1у | Уа1 | Ьеи | Рго | А1а | Ьеи | Рго | С1п | |
| 515 | 520 | 525 | 530 | |||||||||||||
| СТС | СТС | ТСС | ААС | ТАС | ССС | САТ | СТС | ССС | ТТС | САС | ТСС | АТС | ССС | СТС | ССТ | 1061 |
| Уа1 | Уа1 | Суз | Азп | Туг | Агд | Азр | Уа1 | Агд | РЬе | С1и | Зег | Не | Агд | Ьеи | Рго | |
| 535 | 540 | 545 | ||||||||||||||
| ССС | ТСС | ССС | ССС | ССС | СТС | ААС | ССС | СТС | СТС | ТСС | ТАС | ССС | СТС | ССТ | СТС | 1109 |
| С1у | Суз | Рго | Агд | О1у | Уа1 | Азп | Рго | Уа1 | Уа1 | Зег | Туг | А1а | Уа1 | А1а | Ьеи | |
| 550 | 555 | 560 | ||||||||||||||
| АСС | ТСТ | САА | ТСТ | ССА | СТС | ТСС | ССС | ССС | АСС | АСС | АСТ | САС | ТОС | ССС | сст | 1157 |
| Зег | Суз | О1п | Суз | А1а | Ьеи | Суз | Агд | Агд | Зег | ТЬг | ТЬг | Азр | Суз | С1у | С1у | |
| 565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
| ССС | ААС | САС | САС | ССС | ТТС | АСС | ТбТ | САТ | САС | ССС | СОС | ТТС | САС | САС | тсс | 1205 |
| Рго | Ьуз | Азр | Ηίδ | Рго | Ьеи | ТЬг | Суз | Азр | Азр | Рго | Агд | РЬе | С1п | Азр | Зег | |
| 580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
| ТСТ | ТСС | ТСА | ААС | ССС | ССТ | ССС | ССС | АСС | СТТ | ССА | АСС | ССА | ТСС | ССА | СТС | 1253 |
| Зег | Зег | Зег | Ьуз | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Ьеи | Рго | Зег | Рго | Зег | Агд | Ьеи | |
| 595 | 600 | 605 | 610 | |||||||||||||
| ССС | ССС | ССС | ТСС | САС | АСС | ССС | АТС | СТС | ССА | САА | Т ААССАТСССТ ССАС | 1301 | ||||
| Рго | С1у | Рго | Зег | Азр | ТЬг | Рго | Не | Ьеи | Рго | С1п | ||||||
| 615 | 620 | |||||||||||||||
| (2) | СВЕДЕНИЯ | 0 31 | ЕС-ТО N0:8 |
| Суз | РЬе | Зег | Агд | А1а | Туг | Рго | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | Зег | Ьуз | Ьуз | ТЬг | Мее |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Ьеи | Уа1 | 61п | Ьуз | Азп | Уа1 | ТЬг | Зег | 61и | Зег | ТЬг | Суз | Суз | Уа1 | А1а | Ьуз |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Зег | Туг | Азп | Агд | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Мее | 61 у | 61у | РЬе | Ьуз | Уа1 | 61и | Азп | Ηίε |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| ТЬг | А1а | Суз | ΗΪ3 | Суз | Зег | ТЬг | Суз | Туг | Туг | Ηίε | Ьуз | Зег | |||
| 275 | 280 | 285 |
(2) СВЕДЕНИЯ О 5Ε0 Ю N0: 7:
(1)
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 1301 па^ оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная
СТССАСАТСС
САСАСОСАСС
ТСТСАОТАТС
АОССАТСбАб
ТССббСТССС
СТС Ьеи
СТб Ьеи
6СС
А1а
ТСб Зег (И) (1х)
ВД ГО1ЕКУЛЫ: кДНК
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ:
(A) ИМЯ/КЖМ: СЕВ (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 279.. 1287
СПИСАНИЕ ПССЛЕДСВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕС ΙΌ N0: 7:
ААТСССТТТб (XI)
СТАСАССТАА
СССССССТАА
СССАСААТОТ
СТССТСАССС
САССТСТАСА
СССАТСТААС
АбАбАААААС
ТСТбТТбССС сст
А1а
САТ
Азр
АТТ Не
ТбТ
Суз
ССА Рго 340
АбТ Зег
ТбС
Суз
325
СбС
С1у тсссассссс
СССАСТАТТТ
АААСАССТСС
ТСТббТТТСТ
ССАСТААССС
ССССААТСТС
ТбОАССАббб
ТСАССТТТОС
АСАААССТСС
АОАСТССТСС
СССТТСТСАА
ТССТСССТСС
ССТСТТССТС
ССССАССС ТСС Сбб АСб ТСС СТС
Зег Агд ТЬг Зег Ьеи
290
120
180
240
293 ттт РНе ббб б1у
295
СТб Ьеи
СТС ТбС
Ьеи Суз
СТО ССС ТОО СТТ САА
Ьеи Рго Тгр Ьеи 61п 300
САб
С1и
66С б1у 305
АбТ Зег
341 бТб
Уа1
310
ТбТ
Суз
ССб Рго
ТбТ
Суз
АСС ТЬг
ССС Рго
ААС ьуз ббб
61у
САб
О1П
САА ОСА
С1п С1у
ТбС САС
Суз Нхз
3?0
САТ АСб
Азр ТЬг
345
ΑΑΑ ТАТ АТС САС ССТ
Ьуз Туг 11е Нхз Рго 315
ΑΑΑ ССА АСС ТАС ТТО
Ьуз 61у ТЬг Туг Ьеи
335
САА 61п 320
ТАС
Туг
САС ТбС АСС ОАО ТОТ
Азр Суз Агд С1и Суз
350
ААТ Азп
ААТ
Азп
ЛАТ
Азп
САС
Азр
389
437
САб
С1и
АбС Зег ббС б1у
485 (1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДСВАИШЬНОСГИ:
(A) ДЛИНА: 336 аминокислот (B) ВОД: аминокислота (C) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВОД МОЛЕКУЛЫ: белок (Х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ТО N0:8:
Зег Агд ТЬг Зег Ьеи Ьеи Ьеи А1а 15
Ьеи 61п 61и 61у Зег А1а Азр Зег 20
Ηί3 Рго 61п Азп Азп Зег Не Суз 3540
Туг Ьеи Туг Азп Азр Суз Рго С1у 5055
61и Суз С1и Зег С1у Зег РЬе ТЬг 65 70,
Суз Ьеи Зег Суз Зег Ьуз Суз Агд 65
Зег Зег Суз ТЬг Уа1 Азр Агд Азр 100
С1п Туг Агд ΗΪ3 Туг Тгр Зег 61и 115120
Зег Ьеи Суз Ьеи Азп 61у ТЬг Уа1 130135
Азп ТЬг Уа1 Суз ТЬг Суз Ηίε А1а 145150
Суз Уа1 Зег Суз Зег Азп Суз Ьуз 165
Суз Ьеи Рго С1п 11е 61и Азп Уа1 180
ТЬг А1а 61у А1а 61у Рго Агд Суз 195200
7а1 61и Ьуз 61и 61у Суз Рго Уа1 210215
Суз А1а 61у Туг Суз Рго ТЬг МеЕ 225230
Рго А1а Ьеи Рго 61п Уа1 Уа1 Суз 245
Зег 11е Агд Ьеи Рго 61у Суз Рго 260
Туг А1а Уа1 А1а Ьеи Зег Суз 61п 275280
ТЬг Азр Суз 61у 61у Рго Ьуз Азр 290295
Агд РЬе 61п Азр Зег Зег Зег Зег 305310
Зег Рго Зег Агд Ьеи Рго 61у Рго 325
РЬе 61у Ьеи Ьеи Суз Ьеи Рго Тгр
15
Уа1 Суз Рго 61п 61у Ьуз Туг Не 25 30
Суз ТЬг Ьуз Суз Ηίε Ьуз 61у ТЬг 45
Рго 61у 61п Азр ТЬг Азр Суз Агд 60
А1а Зег 61и Азп Ηίδ Ьеи Агд Ηίε
7580
Ьуз 61и Мек С1у 61п Уа1 С1и 11е 9095
ТЬг Уа1 Суз 61у Суз Агд Ьуз Азп 105110
Азп Ьеи РЬе 61п Суз РЬе Азп Суз 125
Ηίε Ьеи Зег Суз 61п 61и Ьуз 61п 140
61у РЬе РЬе Ьеи Агд 61и Азп 61и 155160
Ьуз Зег Ьеи 61и Суз ТЬг Ьуз Ьеи 170175
Ьуз 61у ТЬг 61и Азр Зег 61у ТЬг 185190
Агд Рго Не Азп А1а ТЬг Ьеи А1а 205
Суз Не ТЬг νβΐ' Азп ТЬг ТЬг Не 220
ТЬг Агд Уа1 Ьеи С1п 61у \7а1 Ьеи
235240
Азп Туг Агд Азр Уа1 Агд РЬе 61и 250255
Агд б1у Уа1 Азп Рго Уа1 Уа1 Зег
265270
Суз А1а Ьеи Суз Агд Агд Зег ТЬг 285
ΗΪ5 Рго Ьеи ТЬг Суз Азр Азр Рго 300
Ьуз А1а Рго Рго Рго Зег Ьеи Рго
315 320
Зег Азр ТЬг Рго Не Ьеи Рго 61п
330 335 (2)
СВЕДЕНИЯ О ЗЕО Ю N0:9:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСДВДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 6 аминокислот (B) ВОД: аминокислота (C) ТОПОЛОГИЯ: линейная (11) ВОД МОЛЕКУЛЫ: петущ (Х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛВДОВАТЕЛЬНОСЛИ: ЭД Ю N0:9:
(2) СВЕДЕНИЯ О 5ВД Ιϋ N0:10:
(1)
ХАРАКТЕЕИСТИКИ ПССЛВДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 4 аминокислоты (B) ВОД: аминокислота (C) ТОПОЛОГИЯ: линейная (и)
ВОД МОЛЕКУЛЫ: пептид (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (И) ВИД МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χί) СПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ГО N0: 17:
ТТТТ00АТСС ТТАТТОТООС АОСАТСОССС ТО 32 (2) СВЕДЕНИЯ О ЗЕО Ю N0: 18:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛВДОВАТЕЛЬНОСГИ:
(A) ДЛИНА: 27 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (Э) ТОПОЛОГИЯ: линейная (И) ВИД МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО 10 КО: 18:
СПИСАНИЕ ПОСЛВДОВАТЕЛЬНОСЛИ: ЗЕ£> Ю N0:10:
(XI)
А1а 01 у А1а С1у (2) СВЕДЕНИЯ О ЗЕО ТО N0: 11:
ТТТТАСАТСТ СТТСТТССАС АЗТОСАС 27 (2) СВЕДЕНИЯ О ЗЕО ТО N0: 19:
(1)
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПССЛВДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) (B) (C) (Ц)
ДЛИНА: 30 пар оснований ВОД: нуклеиновая кислота СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная (11)
ВОД МОЛЕКУЛЫ: ОДНК (Х1)
ОПИСАНИЕ ПОСЛВДОВАТЕЛЬНОСЛИ: ЗЕО Ю N0: 11:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛВДОВАТЕПЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 21 пара оснований (B) ВЦЦ: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) вед МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χί) СПИСАНИЕ ПОСЛВДОВАТЕЛЬНОСГИ: ЗЕО ГО N0: 19:
ТТТТСТСОАО АТОССТАСАС СТААСССССС (2) СВОДЕ,НИЯ о ЗЕО 10 N0: 12:
тотоотесст састсстсас т (I)
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПССПВДЭВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) (B) (C) (О
ДЛИНА: 39 пар оснований вед: нуклеиновая кислота СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная вед МОЛЕКУЛЫ: кДНК (XI)
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0: 12:
АССТСОООСА ОСАСССОСАС АООАОАСАСА СТСОТТТТС (2) СВЕДЕНИЯ О ЗЕО Ю N0: 13:
(1)
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛВДОВАТЕПЬНОСТИ:
(A) (B) (C) (О)
ДЛИНА: 42 пары оснований ВОД: нуклеиновая кислота СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная (11)
ВОД МОЛЕКУЛЫ: ОДНК (XI)
ОПИСАНИЕ ПОСЛВДСЖАТЕПЬНОСЛИ: ЗЕО ТО N0: 13:
ТОТОСССОТО СТСССССАСС ТТОСССАОАА ТССАСССТАС АС (2) СВЕДЕНИЯ О (2) СВЕДОНИЯ О ЗЕО ТО N0: 20:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛВДОВАТЕПЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 41 пара оснований (B) ВЦЦ: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВЦЦ МОЛЕКУЛЫ: ВДНК (χί) ОПИСАНИЕ ПССЛВДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ТО N0: 20:
ЗЕО ТО N0: 14:
АСТ0А00АСТ СА0ССАССАС А0ССОСТ0СТ 0ССССА00ТТ О 41 (2) СВЕДЕНИЯ О ЗЕО ТО N0: 21:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 29 пар оснований (B) ЕЦЦ: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВВД МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χί) СПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ТО N0: 21:
(1)
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛВДОВАГЕЛЬНОСТМ:
(A) (B) (C)
ТО)
ДЛИНА: 36 пар оснований ВОД: нуклеиновая кислота СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ; линейная (11)
ВОД МОЛЕКУЛЫ: ОДНК (XI)
СПИСАНИЕ ПСХЛВДОВАТЕПЬНОСЛИ: ЗЕО ТО N0: 14:
ТТТТОСАТСС ТТААСАТТТО ТОАТААТААС ААСТАС (2) СВЕДЕНИЯ О ЗЕО ТО N0: 15:
(11) (XI)
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛВДОВАТЕПЬНОСТИ:
(A) (B) (C)
ТО)
ДЛИНА: 39 пар оснований ВОД: нуклеиновая кислота СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОЮЛОГИЯ: линейная
ВОД МОЛЕКУЛЫ: ОДНК
ОПИСАНИЕ ПОСЛВДОВАТЕЛЬНОСЛИ: ЗЕО ТО N0: 15:
СССТООАССА ОСАССАОСАС АОСАОАСАСА СТССТТТТС (2) СВЕДЕНИЯ О ЗЕО Ю N0: 16:
(1)
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСПВДОВАТЕЛЬНССГИ:
(A) (B) (C) (О)
ДЛИНА: 36 пар оснований ВЦЦ: нуклеиновая кислота СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная (11)
ВОД МОЛЕКУЛЫ: кДНК (XI)
ОПИСАНИЕ ПОСЛВДОВАТЕПЬНОСТИ: ЭД Ю N0: 16:
Т0Т0СТ03ТС СТООТССАСО СТСССССССС АТСААТ (2) СВЕДЕНИЯ О ЗЕО ГО N0: 17:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПСОПЕДОВАГЕЛЬНССЛ (A) ДЛИНА: 32 пары оснований (B) ВЦЦ: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТТТТТСТА0А 0АА0СА0САО САОСССАТ0 29 (2) СВЕДЕНИЯ О ЗЕО ГО N0: 22:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПССЛВДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 75 пар оснований (B) ВЦЦ: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВВД МОЛЕКУЛЫ: кДНК (χϊ) ОПИСАНИЕ ПОСЛВДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО 10 N0: 22:
ТТТТССАСАС ССАСС0Т00С АТТОАТОО00 СО0САСС0Т0 ОАССА0САСС АОСТ0ТС0Т0 60
ССТОА0ТССТ СА0ТО 75
Claims (20)
1. Гибридный белок, содержащий две коэкспрессируемые аминокислотные последовательности, образующие гетеродимер, каждая из которых представляет собой:
а) по крайней мере, одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из цепи гомомерного рецептора или его фрагмента, цепи гетеродимерного рецептора или его фрагмента, лиганда, другого, чем гонадотропный гормон или его фрагмент, легкой или тяжелой цепи антитела, легкой цепи антитела, которая ассоциирована с соответствующей тяжелой цепью антитела, и тяжелой цепи антитела, которая ассоциирована с соответствующей легкой цепью антитела, причем указанный лиганд или фрагмент сохраняет лиганд-рецепторсвязывающую активность и указанная цепь указанного гомомерного рецептора или его фрагмента и указанная цепь указанного гетеромерного рецептора или его фрагмента сохраняют лиганд-рецептор-связывающую активность либо сами по себе, либо в ассоциации с гомологичной или гетерологичной цепью указанного рецептора; и
б) субъединицу гетеродимерного белкового гормона или ее фрагмент, который сохраняет способность образовывать гетеродимер с другими субъединицами данного гормона, причем последовательности а) и б) связаны непосредственным образом или через пептидный линкер, а последовательность б) при совместной экспрессии двух указанных последовательностей обладает способностью к агрегации с образованием гетеродимера.
2. Гибридный белок по п. 1. отличающийся тем, что последовательность а) выбирают из группы, состоящей из ΤΝΓ связывающего белка (ТВР1), ΤΝΓ связывающего белка 2(ТВР2) или фрагмента указанных ТВР1 или ТВР2, включающего лиганд-связывающий домен, внеклеточного домена рецептора ΙΕΝα/β или ΙΕΝγ. рецептора гонадотропного гормона или его внеклеточных фрагментов, легких цепей антитела или их фрагментов, необязательно ассоциированных с соответствующими тяжелыми цепями, тяжелых цепей антитела или их фрагментов, необязательно ассоциированных с соответствующими легкими цепями, ЕаЬ-доменов антитела и интерлейкина 6. интерферона-бета, тромбопоэтина или их фрагментов.
3. Гибридный белок по п.1. отличающийся тем, что указанную последовательность б) выбирают из группы, состоящей из субъединиц хорионического гонадотропина человека (ХГЧ, 11СС). фолликулостимулирующего гормона (ФСГ, Е8Н). лютеинизирующего гормона (ЛГ, ЬН). тиреостимулирующего гормона (Τ8Η) или ингибина или их фрагментов.
4. Гибридный белок по п.1. отличающийся тем, что последовательность а) присоединена либо непосредственным образом, либо через пептидный линкер к Ν-концу последовательности б).
5. Гибридный белок по п.1. отличающийся тем, что последовательность а) присоединена либо непосредственным образом, либо через пептидный линкер к С-концу последовательности б).
6. Гибридный белок по п.1. отличающийся тем, что последовательность а) представляет собой последовательность ΤΝΕ связывающего белка 1 (ТВР1) или его фрагмента, включающе го аминокислотные остатки 20-161 или 20-190. а последовательность б) представляет собой альфа- и бета-субъединицы гонадотропина.
7. Гибридный белок по п. 1. отличающийся тем, что последовательность а) представляет собой внеклеточный домен гормона гонадотропного рецептора, а последовательность б) представляет собой альфа- и бета-субъединицы гонадотропина.
8. Гибридный белок по п.7. отличающийся тем, что последовательность а) представляет собой внеклеточный домен рецептора фолликулостимулирующего гормона (Е8Н). а последовательность б) представляет собой субъединицу Е8Н.
9. Гибридный белок по п.7. отличающийся тем, что указанные последовательности а) и б) соединены пептидным линкером.
10. Гибридный белок по п.9. отличающийся тем, что указанный пептидный линкер содержит расщепляемый ферментом сайт.
11. Гибридный белок по п.10. отличающийся тем, что указанный расщепляемый ферментом сайт представляет собой сайт, расщепляемый тромбином.
12. Гибридный белок по п.10. отличающийся тем, что указанный расщепляемый ферментом сайт распознается и расщепляется ферментом, который обнаруживается в яичнике.
13. Гибридный белок по п.9. отличающийся тем, что указанный пептидный линкер служит в качестве подвижного шарнира.
14. Гибридный белок по п. 1. в котором добавлена одна или более связей между каждой последовательностью б), которые агрегируют с образованием гетеродимера.
15. Последовательность ДНК, кодирующая гибридный белок по п. 1.
16. Экспрессирующий вектор, содержащий последовательность ДНК по п.15.
17. Линия клеток, содержащая экспрессирующий вектор по п. 16 и способная экспрессировать указанный гибридный белок.
18. Способ продуцирования гибридного белка, включающий культивирование линии клеток по п. 17 и выделение экспрессируемого в указанных клетках гибридного белка.
19. Фармацевтическая композиция, включающая гибридный белок по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
20. Способ индуцирования созревания фолликулов, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтической композиции, содержащей гибридный белок по п.8.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1193696P | 1996-02-20 | 1996-02-20 | |
| PCT/US1997/002315 WO1997030161A1 (en) | 1996-02-20 | 1997-02-20 | Hybrid proteins which form heterodimers |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA199800744A1 EA199800744A1 (ru) | 1999-02-25 |
| EA002474B1 true EA002474B1 (ru) | 2002-06-27 |
Family
ID=21752599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA199800744A EA002474B1 (ru) | 1996-02-20 | 1997-02-20 | Гибридный белок, образующий гетеродимеры, способ его получения и использования |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6193972B1 (ru) |
| EP (1) | EP0894141B1 (ru) |
| JP (2) | JP4140927B2 (ru) |
| KR (1) | KR100369985B1 (ru) |
| CN (1) | CN1261579C (ru) |
| AT (1) | ATE295887T1 (ru) |
| AU (1) | AU706504B2 (ru) |
| BG (1) | BG64510B1 (ru) |
| BR (1) | BR9707589A (ru) |
| CA (1) | CA2245877C (ru) |
| CZ (1) | CZ291212B6 (ru) |
| DE (1) | DE69733309T2 (ru) |
| DK (1) | DK0894141T3 (ru) |
| EA (1) | EA002474B1 (ru) |
| EE (1) | EE04025B1 (ru) |
| ES (1) | ES2241040T3 (ru) |
| HU (1) | HUP9900619A3 (ru) |
| IL (1) | IL125864A (ru) |
| NO (1) | NO321777B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ331539A (ru) |
| PL (1) | PL187400B1 (ru) |
| PT (1) | PT894141E (ru) |
| SK (1) | SK282326B6 (ru) |
| UA (1) | UA52646C2 (ru) |
| WO (1) | WO1997030161A1 (ru) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HUP9900619A3 (en) * | 1996-02-20 | 2001-11-28 | Applied Research Systems | Hybrid proteins which form heterodimers |
| US6635740B1 (en) * | 1997-03-27 | 2003-10-21 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Ligand/lytic peptide compositions and methods of use |
| CA2301846A1 (en) | 1997-09-04 | 1999-03-11 | Gryphon Sciences | Modular protein libraries and methods of preparation |
| EA006605B1 (ru) * | 2000-02-22 | 2006-02-24 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО чХГ |
| US20030228600A1 (en) * | 2000-07-14 | 2003-12-11 | Eppendorf 5 Prime, Inc. | DNA isolation method and kit |
| IL147414A0 (en) * | 2001-12-31 | 2002-08-14 | Yeda Res & Dev | Ifnar2 mutants, their production and use |
| US20030157091A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Dyax Corporation | Multi-functional proteins |
| DE10247755B4 (de) * | 2002-10-14 | 2006-01-19 | Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. | Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine |
| BRPI0507174A (pt) * | 2004-01-28 | 2008-04-01 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | proteìnas de fusão hormÈnio-fc (fsh-fc) heterodiméricas estimuladoras de folìculo para o tratamento da infertilidade |
| WO2006067210A1 (en) | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Laboratoires Serono S.A. | Bcma polypeptides and uses thereof |
| US7691611B2 (en) | 2005-06-03 | 2010-04-06 | Ares Trading S.A. | Production of recombinant IL-18 binding protein |
| EP2200634B1 (en) * | 2007-09-21 | 2015-02-11 | The Regents of The University of California | Targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities |
| CN101960014B (zh) * | 2008-02-01 | 2013-10-16 | 克罗莫塞尔公司 | 细胞系以及制备和使用其的方法 |
| CN102002495B (zh) * | 2009-08-31 | 2012-07-18 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达框、表达载体及制备方法 |
| CN107840894A (zh) * | 2011-03-25 | 2018-03-27 | 格兰马克药品股份有限公司 | 异二聚体免疫球蛋白 |
| CA2901226C (en) | 2013-02-18 | 2020-11-17 | Vegenics Pty Limited | Vascular endothelial growth factor binding proteins |
| JP7439372B2 (ja) * | 2018-06-21 | 2024-02-28 | シャタック ラボ，インコーポレイテッド | ヘテロ二量体タンパク質及びその使用 |
| KR20220012256A (ko) * | 2019-05-24 | 2022-02-03 | 프로비바 테라퓨틱스 (홍콩) 리미티드 | Il-2 조성물 및 이의 사용 방법 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0325224B1 (en) * | 1988-01-22 | 1996-07-31 | ZymoGenetics, Inc. | Methods of producing secreted receptor analogs |
| US6225449B1 (en) * | 1991-10-04 | 2001-05-01 | Washington University | Hormone analogs with multiple CTP extensions |
| US5705478A (en) * | 1989-02-21 | 1998-01-06 | Washington University | Covalently linked β subunits of the glycoprotein hormones as antagonists |
| US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| US5650150A (en) * | 1990-11-09 | 1997-07-22 | Gillies; Stephen D. | Recombinant antibody cytokine fusion proteins |
| IL99120A0 (en) * | 1991-08-07 | 1992-07-15 | Yeda Res & Dev | Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| US5932448A (en) * | 1991-11-29 | 1999-08-03 | Protein Design Labs., Inc. | Bispecific antibody heterodimers |
| NZ251820A (en) | 1992-03-30 | 1996-07-26 | Immunex Corp | Fusion proteins with tnf-r (tumour necrosis factor-receptor) peptide linked to another tnf-r or an il-1r (interleukin-1-receptor) peptide |
| US5447851B1 (en) * | 1992-04-02 | 1999-07-06 | Univ Texas System Board Of | Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells |
| IL111125A0 (en) * | 1994-05-11 | 1994-12-29 | Yeda Res & Dev | Soluble oligomeric tnf/ngf super family ligand receptors and their use |
| HUP9900619A3 (en) * | 1996-02-20 | 2001-11-28 | Applied Research Systems | Hybrid proteins which form heterodimers |
| US6194177B1 (en) * | 1996-02-20 | 2001-02-27 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | DNA encoding a hybrid heterodimeric protein |
-
1997
- 1997-02-20 HU HU9900619A patent/HUP9900619A3/hu unknown
- 1997-02-20 EA EA199800744A patent/EA002474B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 IL IL125864A patent/IL125864A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 AU AU21252/97A patent/AU706504B2/en not_active Ceased
- 1997-02-20 WO PCT/US1997/002315 patent/WO1997030161A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-20 CN CNB971924112A patent/CN1261579C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-20 SK SK1148-98A patent/SK282326B6/sk unknown
- 1997-02-20 UA UA98094928A patent/UA52646C2/ru unknown
- 1997-02-20 KR KR10-1998-0706215A patent/KR100369985B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 CA CA2245877A patent/CA2245877C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-20 DE DE69733309T patent/DE69733309T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-20 ES ES97906604T patent/ES2241040T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-20 US US08/804,166 patent/US6193972B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-20 JP JP52949897A patent/JP4140927B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-20 DK DK97906604T patent/DK0894141T3/da active
- 1997-02-20 PL PL97328454A patent/PL187400B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 AT AT97906604T patent/ATE295887T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 BR BR9707589-2A patent/BR9707589A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-20 NZ NZ331539A patent/NZ331539A/xx unknown
- 1997-02-20 EP EP97906604A patent/EP0894141B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-20 EE EE9800256A patent/EE04025B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 CZ CZ19982644A patent/CZ291212B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 PT PT97906604T patent/PT894141E/pt unknown
-
1998
- 1998-08-19 NO NO19983799A patent/NO321777B1/no unknown
- 1998-08-20 BG BG102705A patent/BG64510B1/bg unknown
-
2001
- 2001-01-09 US US09/756,186 patent/US6663867B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-12-01 US US10/724,226 patent/US7291339B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-07-10 JP JP2007181534A patent/JP2008019258A/ja active Pending
- 2007-09-26 US US11/861,835 patent/US20100075402A1/en not_active Abandoned
- 2007-10-30 US US11/929,292 patent/US20090240039A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA002474B1 (ru) | Гибридный белок, образующий гетеродимеры, способ его получения и использования | |
| Huang | Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and MIMETIBODY™ technology | |
| ES2207278T3 (es) | Heterominicuerpos. | |
| US6194177B1 (en) | DNA encoding a hybrid heterodimeric protein | |
| US6294353B1 (en) | Targeted hetero-association of recombinant proteins to multi-functional complexes | |
| JP5077924B2 (ja) | 分泌された三量体受容体類似体及び生物学的活性融合タンパク質を製造するための方法及び組成物 | |
| CA2175893A1 (en) | Protein tyrosine kinases named rse | |
| KR20220025698A (ko) | 다기능 융합 단백질 및 이의 용도 | |
| Ashkenazi et al. | Immunoadhesins: an alternative to human monoclonal antibodies | |
| EP1557432B1 (en) | Hybrid proteins which form heterodimers | |
| EP0386203A1 (en) | Methods for producing gonadotropin and tsh super-agonists | |
| RU2815388C2 (ru) | Многофункциональные слитые белки и их применения | |
| Brandenburg | Insulin–challenge and fascination | |
| CA2219948A1 (en) | Single chain gonadotropins, dna encoding them and method of producing |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |