KR20040009997A - 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 C-말단에 동일하거나 상이한 다른 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 N-말단이 결합된 연쇄체 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 동일한 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체(concatamer)가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지(hinge)에 결합되어 융합된 단량체(monomer) 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합된 (disulfid bond)에 의해 형성된 이량체(dimer) 단백질 또는 이의 당화 단백질, 상기 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물, 이 DNA 작제물을 함유한 재조합 DNA 플라스미드, 이 재조합 DNA 플라스미드로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포, 이 숙주 세포를 배양하여 상기 이량체 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이량체 단백질 또는 이의 당화된 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체{Concatameric Immunoadhesin}
본 발명은 일반적으로 연쇄체 단백질에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 C-말단에 동일하거나 상이한 다른 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 N-말단이 결합된 연쇄체 단백질 및 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 단백질의 직렬 연쇄체(concatamer)가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지(hinge)에 결합되어 융합된 단량체 (monomer) 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 이량체(dimer) 단백질 및 이의 당화된 이량체 단백질에 관한 것이다.
사이토카인(cytokine)은 인간의 자가항원(autoantigen)과 같이 부적절한 자극에 의해 병리학적으로 악화된 염증 반응이 유발될 때 작용하고, 사이토카인 작용 억제제인 가용성 물질들은 사이토카인을 인식할 수 있는 항체와 가용성 수용체 (soluble receptor)가 사용되고 있으며, 이 물질들에 대한 많은 특허가 있다(국제특허출원 공개 제W093/016184호, 제W096/02576호, 제W096/023067호 및 제 W01997/03682호 및 미국특허 제6,225,117호, 제5,656,272호, 제6,210,661호, 제 5,977,318호, 제5,789,192호 및 제5,434,131호). 상기한 항체와 가용성 수용체 물질들은 사이토카인과 미리 결합하여 사이토카인이 세포막에 존재하는 수용체와 결합하는 것을 방해하거나 수용체와 직접 결합함으로써 사이토카인에 의한 신호전달을 억제하는 공통적인 기작을 갖고 있다.
사이토카인 작용 억제제로 사용되는 가용성 수용체는 인간 면역글로불린 (hIg, human immunoglobulin)의 중쇄부위(heavy chain)와 연결하여 사용할 수 있는 것으로 카폰(Capon DJ) 등의 문헌(Nature 337:525, 1989)에 의해 개시되었고, 이후 가용성 수용체와 항체의 융합 단백질들이 많은 특허를 통해 교시되었다(미국특허 제5,844,095호, 제6,225,448호, 제6,090,914호, 제6,100,383호, 제6,046,310호 및 제5,521,288호).
일반적으로, 사이토카인의 가용성 수용체와 면역글로불린의 융합체는 원래분자의 단량체(monomer) 또는 면역글로불린과 융합되지 않은 분자에 비해 다음과 같은 장점을 갖고 있다(카폰 등의 상기 문헌):
1) 이량체(dimer) 형태에서 융합 단백질은 이가화(bivalency)가 되므로 리간드(ligand)에 대한 총 친화력(avidity)이 증가;
2) 혈청내에서 파괴되지 않고 존재할 수 있는 기간의 증가, 즉 분자의 안정성 증가;
3) 면역글로불린 중쇄의 Fc(fragment crystallizable) 조각을 통한 효과세포 (effector cell)의 활성화; 및
4) 단백질 분리 정제의 편리성(예, 프로테인 A를 이용한 분리 정제).
대부분의 수용체 세포외역(extracellular domain)과 면역글로불린 상쇄간의 융합체는 중쇄부위의 CH1 도메인을 제외한 형태로 제작되고 있는데 그 결과 면역글로불린의 경쇄(light chain)와 결합하지 않은 이량체로 제조된다. 이와 같이, 면역반응을 매개하는데 관여하는 단백질 또는 상기 단백질의 수용체의 경우, 원래 분자의 단량체보다는 면역글로불린과 연결하여 사용하는 것이 바람직하다는 것이 알려져 있다. 보다 구체적으로 살펴보면, 사이토카인의 한 종류인 종양괴사인자(tumor necrosis factor, 이하 'TNF'로 약칭할 수 있다)의 경우, TNF-의존성 염증 반응을 억제하기 위해 국제특허출원 공개 제W092/16221호 및 제W095/34326호에서와 같이 종양 괴사 인자 수용체를 사용하거나, 미국특허 제5,447,851호 및 국제특허출원 공개 제W094/06476호에서와 같이 TNFR-면역글로불린의 융합 단백질이 사용되고 있다. 많은 문헌에 의하면 TNFR-면역글로불린 융합 단백질은 원래 분자의 단량체 또는 면역글로불린과 융합되지 않는 분자보다 TNF에 대해 더 높은 친화력(affinity)을 갖는 것으로 보고되고 있다[레스라우어(Lesslauer W)등의 문헌(Eur. J. Immunol. 21:2883, 1991), 아쉬케나지(Ashkenazi A) 등의 문헌(PNAS USA 88:10535, 1991), 페펠(Peppel K) 등의 문헌(J. Exp. Med. 174:1483, 1991), 몰러(KM Mohler) 등의 문헌(J. Immunol. 151.1548, 1994)].
종양괴사인자의 작용을 억제하거나 면역반응을 조절함에 있어서 유효작용부위인 종양괴사인자 수용체, CD2 및 CTLA4의 세포외역 부위를 다가화 혹은 다량체화하면 그 효능의 증가를 예상할 수 있는데, 이러한 목적으로 종양괴사인자 수용체의 세포외역 부위를 면역글로불린의 중쇄와 연결한 융합된 단량체 단백질(중쇄융합단백질)과 종양괴사인자 수용체의 세포외역 부위를 면역글로불린의 경쇄와 연결한 융합된 단량체 단백질(경쇄융합단백질)을 동시에 한 세포주내에서 발현시키면 중쇄와 경쇄간의 결합에 의하여 이량체 구조의 융합 단백질을 제조할 수 있다. 이때 이량체는 유효부위가 생체내에서와 동일하게 병렬 배열된 형태로 제조되고 그 효능은 종래의 단량체에 비하여 현저히 증가됨이 제시된 바 있다[스켈론(Scallon BJ) 등의 문헌(Cytokine 7:759, 1995)] .
그러나, 상기와 같은 면역글로불린 융합 단백질의 제조 방법은 융합 단백질을 제조할 때에 중쇄와 경쇄 각각에 융합시킨 두 개의 유전자를 동시에 생산세포주에 주입해야하고, 세포가 두 종류의 융합 단백질을 생산할 때 두 단백질의 생산수율이 현저히 떨어지며, 생산된 중쇄융합단백질과 경쇄융합단백질들이 100% 결합되지 않아 단량체인 중쇄융합단백질 또는 경쇄융합단백질로부터 중쇄융합단백질과 경쇄융합단백질의 융합된 이량체를 순수 분리하는 공정 등의 기술적 곤란으로 인하여 실용화되기가 어려운 문제점이 있다. 이러한 이유 등으로 지금까지는 면역글로불린 융합 단백질 제제는 두 개의 융합단백질이 단순히 서로 병렬 배열된 이량체 형태로 제조 사용되고 있었다.
따라서, 면역반응에 관여하는 단백질의 효과를 개선하기 위하여 단일 유전자를 발현시켜 단일분자의 형태의 효능이 개선된 다가화 혹은 다량체화 단백질 제제를 생산하는 방법에 대한 요구가 다수 존재하고 있었다.
본 발명자들은 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 C-말단에 동일하거나 상이한 다른 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 N-말단이 결합된 연쇄체(concatamer) 형태의 단백질을 DNA 재조합 기술에 의해 제조하였다. 또한, 본 발명자들은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지(hinge) 부위에 결합된 단량체(monomer) 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합(disulfide bond)된 이량체(dimer) 단백질를 코딩하는 DNA 작제물을 제조한 후 이를 토대로 DNA 재조합 기술을 통해 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 이의 당화 단백질을 생성하였고, 또한 본 발명자들은 그와 같이 생성된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 이의 당화 단백질이 단순 융합된 이량체 단백질에 비하여 향상된 효능을 나타내고, 특히 연쇄 융합된 이량체 단백질이 당화되는 경우 안정성이 현저히 향상된다는 것을 발견하였다.
따라서, 한 가지 관점으로서, 본 발명은 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 C-말단에 동일하거나 상이한 다른 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 N-말단이 결합된 인쇄체 단백질을 제공한다.
다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 친지에 결합되어 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 이량체 단백질을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 현지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 포함한 재조합 DNA 플라스미드를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 포함한 재조합 DNA 플라스미드로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 포함한 재조합 DNA 플라스미드로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를, 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물이 발현되도록 하기에 적합한 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 상기 단량체 단백질의 이량체 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하여, 상기 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하고 당화 모티브가 삽입된 DNA 작제물을 포함한 재조합 DNA 플라스미드로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를, 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 현지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물이 발현되도록 하기에 적합한 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 당질화된 상기 단량체 단백질의 이량체 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하여, 상기 단량체 단백질 두개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합에 의해 융합되고 당질화된 이량체 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물에 당화 모티브를 삽입하기 위해 사용되는 DNA 프라이머를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합에 의해 융합되고 당화된 이량체 단백질을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지부분에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 단백질을 약제학적 유효량으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 약제 조성물을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합에 의해 융합되고 당화된 이량체 단백질을 약제학적 유효량으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 약제 조성물을 제공한다.
도 1은 종래의 단순 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 중합효소 연쇄반응에 의해 제조하는 과정을 도시한 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 중합효소 연쇄반응에 의해 제조하는 과정을 나타낸 개략도이다.
도 3a는 종래의 단순 융합된 단량체 단백질을 예시하는 TNFR/Fc, CD2/Fc 또는 CTLA4/Fc 융합 단백질이 세포내에서 이량체화하여 형성되는 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR/Fc]2, [CD2/Fc]2또는 [CTLA4/Fc]2융합 단백질의 구조를 도시한 것이다.
도 3b는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질을 예시하는 TNFR-TNFR/Fc, CD2-CD2/Fc 또는 CTLA4-CTLA4/Fc 융합 단백질이 세포내에서 이량체화하여 형성되는 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR-TNFR/Fc]2, [CD2-CD2/Fc]2또는 [CTLA4-CTLA4/Fc]2융합 단백질의 구조를 도시한 것이다.
도 4a는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질의 한 예로서 [TNFR1-TNFR1/Fc]2의 구조를 도시한 것이다.
도 4b는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질의 다른 예로서[TNFR2-TNFR2/Fc]2의 구조를 도시한 것이다.
도 4c는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질의 또 다른 예로서 [CD2-CD2/Fc]2의 구조를 도시한 것이다.
도 4d는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질의 또 다른 예로서 [CTLA4-CTLA4/Fc]2의 구조를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질의 다른 예로서 TNFR1-TNFR1/Fc을 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-Top10'를 작제하는 과정을 도해한 다이아그램이다.
도 6은 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc을 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig를 작제하는 과정을 도해한 다이아그램이다.
도 7은 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-Top10'의 지도이다.
도 8은 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-Top10'의 지도이다.
도 9는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig의 지도이다.
도 10은 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig의 지도이다.
도 11은 본 발명에 따라 4개의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-MG의 지도이다.
도 12는 본 발명에 따라 2개의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-MG의 지도이다.
도 13은 본 발명에 따라 2개의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig-MG의 지도이다.
도 14는 본 발명에 따라 3개의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig-MG의 지도이다.
도 15는 본 발명에 따라 순수 정제된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR1-TNFR1/Fc]2및 [TNFR2-TNFR2/Fc]2을 환원 조건 및 비환원 조건하에서 SDS-PAGE를 실시한 결과를 보여준다.
도 16은 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR1/Fc]2(●) 및 [TNFR2/Fc]2(○) 및 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR1-TNFR1/Fc]2(▼) 및 [TNFR2-TNFR2/Fc]2(▽)이 TNF 알파의 세포독성을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR1/Fc]2(●) 및 [TNFR2/Fc]2(○) 및 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR1-TNFR1/Fc]2(▼) 및 [TNFR2-TNFR2/Fc]2(▽)이 TNF 베타의 세포독성을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [CD2/Fc]2(●), 공지된 면역억제제 사이클로스포린 A(▼) 및 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [CD2-CD2/Fc]2(○)이 활성 T 림프구의 증식을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [CTLA4/Fc]2(●), 공지된 면역억제제 사이클로스포린 A(▼) 및 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [CTLA4/Fc]2(○)이 활성 T 림프구의 증식을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR1/Fc]2(●), 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR1-TNFR1/Fc]2(○) 및 본 발명에 따른 예시적인 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [mgTFR1-TNFR1/Fc]2(▽)의 혈중 반감기를 나타내는 그래프이다.
도 21은 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [CD2/Fc]2(●), 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [CD2-CD2/Fc]2(○) 및 본 발명에 따른 예시적인 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [mgCD2-CD2/Fc]2(▽)의 혈중 반감기를 나타내는 그래프이다.
도 22는 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [CTLA4/Fc]2(●), 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [CTLA4-CTLA4/Fc]2(○) 및 본 발명에 따른 예시적인 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질[mgCTLA4-CTLA4/Fc]2(▽)의 혈중 반감기를 나타내는 그래프이다.
도 23은 PBS(●), 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR1/Fc]2(■) 및 [TNFR1/Fc]2(▲) 및 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR1-TNFR1/Fc]2(×) 및 [TNFR2-TNFR2/Fc]2(A)에 의한 DBA/1 생쥐에서 콜라겐 유도 관절염(CIA) 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
일반적으로, 본 발명은 연쇄체 단백질에 관한 것이며, 보다 특정적으로는 이뮤노어드헤신(Immunoadhesin)에 관한 것이다. 이뮤노어드헤신의 전형은 면역글로불린의 Fc 영역과 수용체 또는 흡착 분자의 리간드-결합 영역을 융합시킨 항체-유사분자이다. 공지된 전형적인 이뮤노어드헤신은 항원 인지를 담당하는 항체 분자의 가변 영역이 수용체의 리간-결합 영역에 의해 치환되고 항체 Fc 영역은 보유되는 형태이다. 많은 문헌을 통해 구조적으로 다양한 형태의 이뮤노어드헤신이 제시되어 왔다. 그러나, 본 발명에 따른 이뮤노어드헤신의 구조는 지금까지 공지된 이뮤노어드헤신의 구조와는 상이하고, 또한 본 발명에 따른 구조의 이뮤노어드헤신을 가상적으로 또는 추정적으로 제조할 수 있음을 암시하는 문헌은 없다.
용어 정의
본 발명에 따른 이뮤노어드헤신의 구조적 특징으로 인해 이러한 구조의 특성상 본원 명세서에 사용되는 용어의 정의를 명백히 할 필요가 있다. 일반적으로는, 본 발명에서 별도로 정의하지 아니한, 모든 기술적 및 과학적인 관련 용어는 이 발명이 속한 기술 분야에서 통상적으로 통용되는 의미를 가진다. 그러나, 다음의 용어들은 통상적인 의미를 나타내지만 그 의미를 명확히 하고 또한 본 발명의 범위를 명백히 하고자 다음과 같이 정의한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "면역글로불린"은 다양한 종류의 항원을 특이적으로 인식하도록 B 세포에 의해 생성되고 B 세포의 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 가리킨다. 이 분자는 Y 모양으로 두 개의 동일한 경쇄와 두 개의 동일한 중쇄로 구성된다. 경쇄와 중쇄 모두는 가변 및 고정 영역을 포함한다. 4개의 쇄는 힌지 영역이라고 하는 중쇄의 플렉서블 영역(flexible region)에 위치한 디설파이드 결합에 의해 함께 고정되어 있다. 중쇄와 경쇄 모두의 가변 영역은 결합하여 두개의 동일한 항원-결합 부위를 형성한다. 중쇄 고정 영역에 의해 면역글로불린 A(IgA), D(IgD), I(IgE), G(IgG) 및 M(IgM)인 다섯 개 부류로 나누어진다. 각각의 부류는 이소타입이라고 하며 특특한 구조적 특징과 상이한 생물학적 특성을 갖고 있다. 예를 들면, IgG는 Fc 구조에서 다른 이소타입과 약간 상이하다. 또한, IgG 및 IgA는 많은 아부류가 있다. 예를 들면, 인간 IgG 이소타입내에 4가지의 아부류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 있으며 각각은1,2,3 및4 중쇄를 갖는다. 보체 활성화, 식세포-Fc 수용체에의 결합, 항원-의존 세포독성과 같은 면역글로불린 분자의 기능은 중쇄의 Fc 영역에 존재하는 구조적 결정소에 의해 매개된다. 이러한 중쇄의 Fc 영역은 본 발명에 따른 이량체 단백질의 구성 요소로서 사용되며 상기 모든 분류 또는 아부류의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다.
본원 명세서에 사용된 용어 "면역글로불린 Fc 조각"은 면역글로불린분자는기능적으로 구분되는 조각들로 나누어지는데 이 가운데 항원 결합력은 없으나 쉽게 결정체를 형성하는 조각으로서 힌지 부위(hinge region), CH2와 CH3 도메인이 결합하여 이루어지고 항체에서 효과물질 및 세포들과의 결합에 관여하는 부분을 가리킨다. 따라서, 본 발명과 관련하여 언급되는 Fc 조각은 일부 문헌에 기술된 바와는 다를 수 있으나 힌지 영역을 포함하며 이것은 단순히 본 발명을 설명하는데 있어 편리를 도모하기 위한 것으로 당업자는 본원 명세서 및 도면을 참고로 하여 충분히 이해할 것이다.
본원 명세서에 사용된 용어 "생물학적 활성 단백질"은 일반적으로 생리학적 또는 약물학적 활성을 나타내는 단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드를 가리키며, 연쇄체 또는 이뮤노어드헤신을 형성한 후 고유 활성중 적어도 일부분은 유지된다. 본원에서 "생물학적 활성"이라는 용어는 생리학적 또는 약물학적 활성으로 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 효소를 함유한 것과 같은 일부 연쇄체는 유기 용매에서 반응을 촉매할 수 있다. 마찬가지로, 콘카나발린 A, 면역글로불린 등과 같은 단백질을 함유한 일부 고분자 결합체는 또한 실험실 진단제로서 유용하다.
단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 헤모글로빈, 혈청 단백질(예, 인자 VII, VIII 및 IX를 포함한 혈액 인자), 면역글로불린, 사이토킨(예, 인터루킨), α- β- 및 γ-인터페론, 콜로니 자극 인자(G-CSF 및 GM-CSF 포함), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF) 및 포스포리파제-활성화 단백질 (PLAP)이 포함된다. 다른 일반적인 생물학적 또는 치료학적 단백질로는 인슐린, 식물 단백질(예, 렉틴 및 리신), 종양 괴사 인자(TNF) 및 연관된 대립형질체, 성장인자(예, TCFα 또는 TGFβ와 같은 조직 성장 인자 및 내피 성장 인자), 호르몬(예, 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬 및 부갑상선 호르몬, 황체호르몬 분비 호르몬 및 이의 유도체), 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(calcitonin gene related peptide, CGRP), 합성 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리쓰로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드 (growth hormone releasing peptide, GHRP), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor, THF) 등이 포함된다. 면역글로불린으로는 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 이들의 단편이 포함된다. 인터루킨, 인터페론 및 콜로니 자극 인자와 같은 일부 단백질은 또한 보통 재조합 기술을 이용한 결과로서 비당화 형태로 존재할 수 있다.
비당화 형태 또한 본 발명의 생물학적 활성 물질에 포함된다.
또한, 본 발명의 생물학적 활성 물질은 생체내 생활성(bioactivity)을 증명하는 폴리펩타이드중 일부분을 포함한다. 이의 예로는 아미노산 서열, 항체 단편, 단일쇄 결합 항원(참조: 미국특허 제4,946,778호), 항체 또는 단편의 융합체를 포함한 결합 분자, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 촉매성 항체 등이 포함된다. 기타 단백질로는 두드러기쑥, 항원 E, 꿀벌의 독액, 진드기 알레르겐 등과 같은 알레르겐 단백질이 포함된다.
또한, 본 발명의 생물학적 활성 물질은 효소를 포함한다. 효소의 예로는 탄수화물-특이적 효소, 단백질분해 효소, 산화환원 효소, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 라이아제, 이소머라제 및 리가제가 포함된다. 구체적인 효소로는 이들로 한정하는 것은 아니지만 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제 및 빌리루빈 옥시다제를 들 수 있다. 탄수화합물-특이적 효소의 예로는 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 글루코우로니다제 등이 포함된다.
본원 명세서에 사용된 용어 "면역반응에 관여하는 단백질"은 세포성 및 체액성 면역반응에서 세포간 신호 전달 과정을 담당하여 면역반응을 활성화 또는 억제시키는 단백질을 총칭한다. 면역이란 세균 또는 바이러스 등의 자신이 아닌 것으로 부터 자신을 보호하는 과정이다. 면역 반응은 세포성 및 체액성 면역 반응으로 나눌 수 있으며, T 세포와 B 세포 등의 림프구가 가장 중요한 역할을 한다. T 세포는 주로 세포성 면역 반응을 주관하며 바이러스에 감염된 세포나 암세포 들을 직접적으로 공격하여 죽이기도 하고 면역 또는 염증 반응을 활성화시키는 사이토카인이라는 물질을 분비하여 다른 면역 세포의 작용을 돕기도 한다. B 세포는 세균과 바이러스 등의 자신이 아닌 외부의 물질(항원)이 체내에 들어을 경우 항체를 만들어 이를 몰아내도록 하며 이를 체액성 면역 반응이라 한다. 세포성 면역과 체액성 면역 모두에서는 세포간의 신호 전달이 매우 필수적인 과정이며 이 과정에서 세포내 신호전달을 담당하는 세포 표면 수용체 단백질과 이 수용체에 결합하는 신호물질인 리간드 단백질이 작용한다.
본 발명에 따른 면역반응에 관여하는 단백질의 대표적인 예로는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 접착 분자(adhesion molecules), 종양 괴사 인자(TNF) 수용체,효소, 수용체 티로신 키나제, 케모카인 수용체, 기타 세포 표면 단백질, 가용성 리간드 등이 포함된다. 사이토카인은 이들로 한정되는 것은 아니지만 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-17, TNF, TGF, IFN, GM-CSF, G-CSF, EPO, TPO, M-CSF 등을 포함한다. 사이토카인 수용체는 이들로 한정되는 것은 아니지만 성장호르몬 수용체(GHR), IL-13R, IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-9R, IL-15R, TNFR, TGFR, IFNR(예, IFN-Rα-쇄, IFN-Rβ-쇄), 인터페론-αR, -βR 및 -R, GM-CSFR, G-CSFR, EPOR, cMp1, gp130, Fas(Apo 1), 을 포함한다. 효소는 이들로 한정되는 것은 아니지만 인플루엔자 C 헤마글루티닌 에스테라제, 우로키나제 등을 포함한다. 케모카인 수용체의 예로는 CCR1, CXCR1-4를 들 수 있다. 수용체 티로신 키나제의 예로는 TrkA, TrkB, TrkC, H사, REK7, Rse/Tyro-3, 간세포 성장 인자 R, 혈소판-유래된 성장 인자 R, Flt-1이 포함된다. 다른 세포 표면 단백질의 예로는 CD2, CD4, CD5, CD6, CD22, CD27, CD28, CD30, CD31, CD40, CD44, CD100, CD137, CD150, LAG-3, B7, B61,β-뉴렉신, CTLA-4, ICOS, ICAM-1, 보체 R-2(CD21), IgER, 리소좀막 gp-1,α2-마크로글로불린 수용체-연관된 단백질, 나트륨배설 펩타이드 R을 들 수 있다. 가용성 리간드로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 IL-10, 헤레굴린, 각화세포 성장 인자가 포함된다.
본 발명에 따른 면역반응에 관여하는 단백질에 대한 리간드 및 용도는 하기 표 1 내지 7에 요약한 바와 같이 당업자에게 잘 알려져 있다.
표 1. 면역반응에 관여하는 단백질-접착 분자
표 2. 면역반응에 관여하는 단백질-효소
표 3. 면역반응에 관여하는 단백질-사이토카인 수용체
표 4. 면역반응에 관여하는 단백질-종양괴사인자 수용체
표 5. 면역반응에 관여하는 단백질-수용체 티로신 키나제
표 6. 면역반응에 관여하는 단백질-세포 표면 단백질
표 7. 면역반응에 관여하는 단백질-가용성 리간드
본원 명세서에 사용된 용어 "세포외역 가용성 부위(soluble extracellulardomain)"는 인지질로 구성된 세포막을 관통하는 단백질(integral protein)에서 소수성 아미노산으로 구성되어 있어 세포막을 통과하는 부분(transmembrane domain)을 기준으로 세포외부로 노출되어 있는 부분을 가리킨다. 이 부위는 대부분 친수성 아미노산이 단백질 표면으로 향하는 구조(folding)를 하고 있어서 수용액상에서 가용성(soluble)을 나타낸다. 대부분의 세포표면 수용체 단백질에서 리간드와 결합하는 기능을 담당하는 것은 세포외역 부위이며 세포내역 부위(intracellular domain)는 세포내 신호전달 기능을 담당하고 있다.
본원 명세서에 사용된 용어 "직렬 연쇄 융합된"은 두 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위가 연결되어 하나의 긴 폴리펩타이드를 형성하고 있는 형태를 가리킨다.
본원 명세서에 사용된 용어 "연쇄체 단백질"은 직렬 연쇄 융합된 단백질을 가리킨다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각의 힌지 부위에 결합된 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 C-말단(C-terminal)에 이와 동일한 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 N-말단(N-terminal)이 펩타이드 결합되어 동일한 두 개의 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위가 하나의 긴 폴리펩타이드를 형성하고 있는 형태를 가리킨다.
본원 명세서에 사용된 용어 "단순 융합된 단량체 단백질"은 면역글로불린 Fc 조각의 힌지 부위에 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위가 결합하여 하나의 폴리펩타이드로 형성된 단량체 구조의 융합 단백질을 가리킨다. 단순 융합된 단량체 단백질은 편의상 "단백질 명칭/Fc"로 표기할 수 있다. 예를 들면 면역반응에 관여하는 단백질 TNFR1의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 조각이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질은 TNFR1/Fc로 표기된다. 또한, 면역글로불린 Fc 조각의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각이 IgG1으로부터 유래된 경우에는 TNFR1/IgGIFc로 표기된다.
본원 명세서에 사용된 용어 "단순 융합된 이량체 단백질"은 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 구조의 융합 단백질을 가리킨다. 단순 융합된 이량체 단백질은 편의상 "[단백질 명칭/Fc]2"로 표기할 수 있다. 예를 들면 면역반응에 관여하는 단백질 TNFR1의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 조각이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 구조의 융합 단백질은 [TNFR1/Fc]2로 표기된다. 마찬가지로, 면역글로불린 Fc 조각의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각이 IgG1으로부터 유래된 경우에는 [TNFR1/IgG1Fc]2로 표기된다.
본원 명세서에 사용된 용어 "연쇄 융합된 단량체 단백질"은 단순 융합된 단량체 단백질에서 힌지 부위에 결합된 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 N-말단에 이와 동일한 한 개의 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 C-말단이 직렬의 연쇄체 형태로 결합하여 하나의 폴리펩타이드로 형성된 단량체 구조의 융합 단백질을 가리킨다. 연쇄 융합된 단량체 단백질은 편의상 "단백질 명칭-단백질 명칭/Fc"로 표기할 수 있다. 예를 들면 면역반응에 관여하는단백질 TNFR1의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 조각이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질의 TNFR1의 세포외역 가용성 부위에 동일한 TNFR1의 세포외역 가용성 부위가 결합된 연쇄 융합된 단량체 단백질은 TNFR1-TNFR1/Fc로 표기된다. 마찬가지로, 면역글로불린 Fc 조각의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각이 IgG1으로부터 유래된 경우에는 TNFR1-TNFR1/IgG1Fc로 표기된다.
본원 명세서에 사용된 용어 "연쇄 융합된 이량체 단백질"은 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 구조의 융합 단백질을 가리킨다. 연쇄 융합된 이량체 단백질은 편의상 "[단백질 명칭-단백질 명칭/Fc]2"로 표기할 수 있다. 예를 들면 면역반응에 관여하는 단백질 TNFR1의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 조각이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질의 TNFR1의 세포외역 가용성 부위에 동일한 TNFR1의 세포외역 가용성 부위가 결합된 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 구조의 융합 단백질은 [TNFR1-TNFR1/Fc]2로 표기된다. 마찬가지로, 면역글로불린 Fc 조각의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각이 IgG1으로부터 유래된 경우에는 [TNFR1-TNFR1/IgG1Fc]2로 표기된다.
본원 명세서에 사용된 "벡터"라는 용어는 외래 유전자를 숙주 세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주 세포 내로 유입할 수 있는 방안을 갖추어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여 한다. 여기서, 외래 유전자로는 예를 들면 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물이 그에 해당한다.
본원 명세서에 사용된 "재조합 발현 플라스미드"라는 용어는 일반적으로 외래 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동적으로 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 재조합 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 이종 DNA가 생성될 수 있다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본원 명세서에 사용된 "작동적으로 연결된(operably linked)"이라는 용어는 벡터의 각 구성 성분들이 고유한 작용을 할 수 있도록 형성된 성분들의 배열을 의미한다. 따라서, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열(control sequence)은 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 작용하는 한 조절 서열이 코딩 서열과 인접해 있을 필요는 없다. 예를 들면, 개재 서열(intervening sequence)이 프로모터 서열과 코딩 서열사이에 존재할 수 있는데, 이 경우 프로모터 서열은 코딩 서열에 "작동적으로 연결"되었다고 할 수있다.
본원 명세서에 사용되는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, 챠이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, 사람 태아신장 293 세포(human embryoni kidney cells), BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 클로닝할 때에는 동물세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T 안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
본 발명에 따른 직렬 연쇄체 형태의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 이. 콜라이에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
본원 명세서에 사용된 용어 '형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "모티프 서열"은 발현된 단백질이 세포막 밖으로 수송되도록 유도하는 아미노산 서열로서 리더 서열이라고도 한다. 세포막 밖으로 수송되는 표면 단백질 혹은 분비 단백질은 일반적으로 세포막에서 모티브 펩티다제 (signal peptidase)에 의해 잘려지게 되는 N'-말단 서열을 가지고 있다. 이 특정 N'-말단 서열을 모티브 서열 또는 펩타이트(signal sequence or peptide), 혹은 리더 서열 또는 펩타이드(leader sequence or peptide)라 부른다. 분비(수송)가 가능한 단백질 혹은 세포외막이나 주변 세포질에 존재하는 모든 단백질들은 모두 자기만을 위한 특정 모티브 서열을 가지고 있다. 이러한 각각의 단백질 가지고 있는 모티브 서열 사이에는 어떤 특별한 상동성(homology)을 가지고 있지 않으며, 같은 단백질이라도 유래한 숙주(host)에 따라서 그 모티브 서열이 다름을 알 수 있다. 모티브 서열이 작용하는데는 그 1차 구조, 즉 아미노산 서열보다 그들이 가지고 있는 2차 구조 혹은 비극성, 전하 잔기(apolar, charged residue)의 분포가 더 중요하다. 이러한 특질을 가진 모티브 서열사이에는 특별한 상동성이 없지만 몇 가지 공통되는 특징은 있다. 모티브 서열은 우선 N'-말단 쪽에 한 개 혹은 몇 개의 아주 짧은 양전하를 띤 친수성 영역(hydrophilic region)인 N 도메인이 있으며 이 도메인에 뒤이어 다소 긴 소수성 영역인 H-도메인이 이어져 있다. 대장균인 경우 모티브 서열의 길이는 약 18 - 30개의 아미노산으로 구성되어 있다. N-도메인은 극성을 나타내고(polar) Lys, Arg과 같은 양전하를 띈 아미노산이 많이 존재한다. H-도메인에는 주로 소수성 잔기와 Ala, Leu 같은 아미노산이 많이 존재하며 Pro, Lys, Arg, Asn, Glu과 같이 극성을 나타내거나 전하를 띤 아미노산은 드물다. 대신 많은 양의 Ala, Leu은 모티브 펩타이드 α-나선 구조를 이루어 막전이가 보다 쉽게 일어나도록 도와준다. H-도메인과 실제 분비하고자 하는 단백질 사이에는 C-도메인이 존재한다. 이 영역은 일반적으로 덜 소수성이며 LebB, LspA와 같은 모티브 펩티다제에 의해 인식이 가능한 서열이 있다. 아직까지 이 모티브 펩티다제들이 정확하게 어느 부위를 자르는지 정확하게 예측할 수는 없지만 일반적으로 C-영역에 있는 Ala-X-Ala 서열 다음 부분을 대부분 자르고 있다. 위에서 언급한 모티브 서열 가지고 있는 전단백질(preprotein)들은 여러 단백질들과 상호작용을 하며 세포막에 도달한 후, 모티브 펩티다제에 의해 특정 부위가 잘린 후 성숙한 형태의 단백질로 바뀐다. 이러한 특징을 가진 모티브 서열은 세포 표면 발현 모체를 선택하는데 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 외래 단백질과 융합된 단백질은 안정적으로 세포 표면 밖으로 매우 높은 효율로 이동시켜야 한다. 일반적으로 표면 발현 모체를 선택하는데 있어 우수한 분비능을 가진 표면 단백질을 선택하여야 하며 통상적으로 분비능이 우수한 분비 모티브 서열을 가지고 있는 표면 단백질을 이용한다.
본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질의 제조
본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질은 일반적으로 (a) 면역글로불린 Fc 조각을 코딩하는 유전자와 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 운전자로부터 단순 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 제조하고, (b) 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물 및 상기 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 유전자에 동일한 제한효소 인식서열을 중합효소 연쇄반응으로 삽입하며, (c) 상기 제한효소 인식서열과 일치하는 제한효소를 사용하여, 상기 단순 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물 및 상기 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 유전자의 제한효소 인식서열 부위를 절단하고, (d) 양쪽 DNA 서열의 절단된 부분을 라이게이즈로 연결하여 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 제조하며(도 2), (e) 제조된 연쇄 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물을 벡터에 작동적으로 연결하여 재조합 발현 플라스미드를 작제하고, (f) 작제된 재조합 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키며, (g) 형성된 형질전환체 또는 형질감염체를 연쇄 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물이 발현되도록 하기에 적절한 조건하에서 배양하여 배양물로부터 목적하는 연쇄 융합된 이량체 단백질을 분리 정제함으로써 제조한다.
면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편은 특정 제한효소의 인식서열과 리더 서열의 코딩 서열을 갖는 한 프라이머와 상기 세포외역 가용성 부위의 3' 말단서열과 면역글로불린 Fc의 특정 부위의 5'말단의 일부 서열을 코딩하는 안티센스 서열을 갖는 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성한다.
면역글로불린 Fc의 특정 부위를 코딩하는 DNA 단편은 상기 면역반응 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 3'말단의 일부 서열을 포함하고, 상기 면역글로불린 Fc의 특정 부위의 5'말단을 코딩하는 서열을 갖는 한 프라이머와 특정 제한효소의 인식서열과 면역글로불린 Fc의 특정부위의 3'말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 이용하여 생성한다.
이와 같이 생성된 상기 면역반응 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA단편과 면역글로불린 Fc의 특정 부위를 코딩하는 DNA 단편을 한 시험관에서 혼합하고 DNA 가닥을 분리한 후, 공통되는 서열사이에서 상보적 결합이 일어나도록 유도한다. 이후 중합효소를 이용하며 각 DNA 가닥의 3' 말단으로부터 중합반응을 일으켜 완전한 두 가닥의 DNA 단편을 생성한다. 이를 주형으로 하여 상기 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 서열을 갖는 프라이머와 상기 면역글로불린 Fc의 특정부위의 3'말단을 코딩하는 프라이머를 사용한 중합효소연쇄반응을 일으켜, 상기 단백질의 세포외역 가용성 부위의 DNA단편과 상기 면역글로불린 Fc의 특정부위의 DNA단편의 서열을 포함하는 면역글로불린 융합 유전자를 증폭시킨다.
이렇게 생성된 면역글로불린 융합 유전자와 상기 단백질의 세포외역 가용성 부위의 서열을 갖는 DNA단편에 동일한 제한효소 인식서열을 중합효소 연쇄반응을 이용하여 삽입한 후, 제한효소를 사용하여 상기 제한효소 인식서열 부위를 절단하고, 절단된 부분을 라이게이즈로 연결하여 연쇄체 형태의 면역글로불린 융합 유전자를 제조한다.
이러한 면역글로불린 융합 유전자는 단백질의 세포외 분비를 촉진하기 위해 단백질에 모티브 서열이 포함되도록 제작할 수 있다. 예를 들면, CTLA-4분자는 비정상적으로 길며 수용성이 높은 N'-말단의 친수성이 높은 여유분(redundancy)을 갖는 매우 특이한 리더 서열를 갖고 있다(Harper K, et al., J Immunol 147:1037-1044, 1991; and Brunet JF, Nature 328:267-270, 1987). 통상 대부분의 막표면 단백질이나 분비형 단백질은 그 N-말단에 소수성이 높은 20-24 개의 아미노산으로 구성되는 리더 서열을 갖는다. 그러나 본 CTLA-4분자는 16개의 친수성이 높은 N-말단의 16개의 아미노산과 소수성이 높은 전형적인 막영역에 해당되는 21개의 아미노산 등 도합 37개의 아미노산으로 구성되고 있다. 따라서, 종래에는 CTLA4Ig 융합단백질을 제조할 때에 분자의 리더 서열을 온코스타틴 M(Linsley PS et al., JExp Med 174:561-569, 1991) 혹은 IL-6(Yamada A, et al., Microbiol Immunol 40:513-518, 1996)의 리더 서열로 전부 교체하여 발현하고 있다. 본 발명에 이르러, 정상적인 상태에서 CTLA-4분자는 리더서열의 특성에 의하여 세포내부에 잔류되지만 최소한 N말단 6개의 아미노산이상을 제거하면 발현세포밖으로 분비가 용이하게 이루어짐이 확인되었다. 바람직한 리더 서열은 ACLGFQRHKAQKNLAA이 제외된 MRTWPCTLLFFIPVFCKA의 아미노산 서열이다.
상기 제조된 면역글로불린 융합 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 발현 플라스미드를 제조한 후, 이 플라스미드를 숙주 세포에 도입하여 형질감염체 또는 형질전환체를 제조하고, 이들 세포를 증폭 배양하여 생성된 연쇄체 형태의 융합 단백질을 정제함으로써 목적하는 연쇄 융합된 이량체 단백질을 얻을 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질의 제조를 위해 사용되는 숙주 세포는 골수종 세포주, CHO 세포, 원숭이 COS 세포, 사람 태아신장 293 세포 및 백큐로바이러스-감염된 곤충 세포이다. 이들 시스템에서 형성된 목적하는 폴리펩타이드는 집합하여 세포 배양 배지로 분비된다. 그런 다음, 본 발명의 연쇄 융합된 이량체 단백질은 면역글로불린과 상당 부분 동일한 방식으로 프로테인 A 또는 프로테인 G 친화성 크로마토그래피에 의해 실질적으로 정제할 수 있다. 사실, 효율적인 포유동물 세포 발현 및 이러한 유형의 정제는 면역반응에 관여하는 단백질을 이량체 단백질로서 발현하는데 상당한 이점이 된다.
본 발명에 따른 당화된 연쇄 융합된 이량체 단백질의 제조
숙주 세포로서 진핵 세포에 의해 생성되는 분비 단백질들은 당쇄의 수식에 의해 변형된다. 당쇄의 수식은 단백질의 물리적 성질은 물론 단백질의 생체내에서 의 안정성 및 기능에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 한가지 바람직한 양태는 숙주 세포로서 상기된 동물 세포주를 이용한 유전자 재조합 기술을 이용하여 목적하는 연쇄 융합된 이량체 단백질의 생산을 용이하게 하며, 또한 체내 안정성을 증가시키기 위해 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성부위에 부가적인 당쇄를 첨가하는 것을 포함한다.
당쇄의 수식에는 두 가지 유형이 있다. 하나는, O-형 당쇄 수식으로 아미노산 세린이나 쓰레오닌의 잔기에 올리고당이 결합하는 것이고, 또 다른 하나는 N-형 당쇄수식으로 아스파라긴산의 잔기에 올리고당이 결합하는 형태이다. 특히, N-형 당쇄수식은 특정 아미노산 배열을 가질 때 일어나며 그 서열은 Asn-X-Ser/Thr로 알려져 있다(여기서, X는 프롤린을 제외하고 어떤 아미노산도 가능하다). N-연결된 올리고당과 O-연결된 올리고당의 구조는 시로 다르며 일반적으로 각 타입에서 발견되어지는 당 잔기들 또한 서로 다르다. 예를 들어, O-연결된 당 잔기에서는, N-아세틸갈락토사민이 변함없이 세린이나 쓰레오닌에 연결되어 있다. 모든 N-연결된 올리고당에서는, N-아세틸글루코사민이 아스파라긴에 연결되어 있다. O-연결된 올리고당은 일반적으로 1-4개의 당잔기만을 포함하고 있는 반면에, N-연결된 올리고당은 N-아세틸글루코사민과 만노스를 항상 포함하며 적어도 5개 이상의 당잔기로 이루어져 있다.
본 발명은 부가적인 당쇄 결합 부위를 갖도록 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 서열상에, 상기된 O-형 또는 N-형 당쇄수식이 발생하도록 하나 이상의 뉴클레오타이드를 변이시키고 그 DNA를 동물 숙주 세포를 통해 발현하면서 자연적으로 당쇄수식이 일어나도록 하는 것이다. 한 가지 양태로서, 본 발명에 따른 당화된 연쇄 융합된 이량체 단백질은 N-형 당쇄수식이 일어날 수 있는 Asn-X-Ser/Thr 서열이 부가 및/또는 증가하도록 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 서열을 변이시킴으로써 달성된다.
당화를 위한 DNA 서열의 변이는 통상적인 방법에 의해 실시될 수 있다. 한 가지 바람직한 양태로서, 연쇄체 결합부위, 즉 두 개의 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위가, 세포내 단백분해효소의 공격으로부터 보호되도록 하여 혈중에서의 반감기를 증가시키는 효과를 얻기 위해, 서로 결합되는 부위에 중합효소 연쇄반응을 이용하여 다당화(multiglycosylation)로 수식되는 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 제작할 수 있다. 특정적인 양태로서, 당화 모티브 펩타이드 서열은 제한효소 EcoRI과 세포외역 가용성부위의 리더 서열을 포함한 한 프라이머와 연쇄체 형태의 융합 유전자의 첫 번째 세포외역 가용성부위의 3' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열과 두 번째 세포외역 가용성부위의 5' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열을 가지고 당화 모티브로 치환된 염기서열을 가진 안티센스 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 제작한 DNA 단편과, 연쇄체 형태의 융합 유전자의 첫 번째 세포외역 가용성부위의 3' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열과 두 번째 세포외역 가용성부위의 5' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열을 가지고 당화 모티브로 치환된 염기서열을 기진 한 프라이머와 면역글로블린 G1의 Fc 부위의 3' 말단과 제한효소 XbaI를 코딩하는 안티센스 프라이미를 이용한 중합효소 연쇄반응으로 제작된 DNA 단편을 한 시험관에 동시에 넣고 2차 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 삽입하였다.
본 발명의 구체적인 양태는 면역반응에 관여하는 단백질인 TNFR1, TNFR2, CD2 및 CTLA4의 세포외역 가용성 부위를 포함한다. 이들의 양태에 관한 첨부된 도면, 서열목록 및 실시예 참고로 하여 본 발명은 구체화될 것이다.
종양괴사인자-알파[TNF-α, 카케크틴(cachectin)으로도 알려져 있음]와 종양괴사인자-베타TNF-`포톡신(lymphotoxin)으로도 알려져 있음]는 다면적인 사이토카인으로 염증, 세포 면역 반응, 패혈증, 세포독성, 악액질, 류마티스성 관절염, 염증 관련 질환[타타글리아(Tartaglia LA) 등의 문헌(Immunol. Today 13:151, 1992)]과 항바이러스성 반응[뷰틀러(Butler P)의 문헌(Peptide Growth Factor Ⅱ, 1990, Springer -Verlag, Berlin, pp.39-70)]을 유발한다. 세포 독성을 포함한 대부분의 TNF-α와 TNF-β의 작용들은 이들 각각이 삼중체 형태로 TNF 수용체에 결합함에 기인한다[맥 등의 문헌(J.Biol. Chem. 267:2119, 1992)]. TNF 수용체에는 분자량 55 킬로달톤(KDa)인 타입 I(TNFR1, p55)과 분자량 약 75 칼로달톤(KDa)인 타입 Ⅱ(TNFR2, p75)의 두 가지가 존재한다[스미스(Smith CA) 등의 문헌(Science 248:1019, 1990), 로처(Loetscher H) 등의 문헌(Cell 61:351, 1990), 샬(Schall) 등의 문헌(Cell 61:361, 1990)]. 이 두 수용체는 모두 TNF-α와 TNF-β에 대하여 거의 유사한 친화력을 나타내는 것으로 보고되었다(샬 등의 상기 문헌). 이들 가용성 수용체의 면역글로불린과의 융합 단백질은 TNF-α와 TNF-β와 결합함으로써 세포막에 존재하는 수용체와의 결합을 방해하여 그 작용을 억제하는 효과를 나타내며, TNF-의존성 염증을 완화시킬 수 있는 효과적인 물질로 사용되고 있다.
면역반응을 조절하는 세포표면 항원중에 T 림프구의 충분한 활성반응을 얻기 위한 이차자극을 제공하는 공조자극계 항원인 CD2 및 CTLA4의 경우도 종양괴사인자 수용체와 동일한 방법으로 가용성 형태의 경우 각종 면역 질환을 치료할 수 있는 치료제로 사용될 수 있다. 체내의 면역반응은 T 림프구의 특정 수용체와 결합하는항원제시세포의 표면 항원 분자들 즉, T 림프구와 항원제시세포의 백혈구 항원 분자들에 의해 이루어지며, 항원제시 과정 중에 이차 신호인 공조신호가 없으면 T 림프구는 세포사멸 또는 클론 활성 무력화 유도에 의해 소멸된다. CD2의 경우는 항원제시세포의 LFA-3과 결합하는 T 림프구의 백혈구 항원으로 백혈구 세포의 부착 및 동조자극에 관여하며 CD28에 의한 동조자극과 병행하여 T 림프구의 활성화를 촉진한다. CTLA4의 경우는 T-림프구가 활성화한 후 발현되며, 휴식기가 되면 발현량이 증가하는 양상을 나타낸다. CTLA4는 항원제시세포의 B7과의 결합력이 CD28의 20배 이상이며, B7과 결합한 후 T-림프구의 활성을 억제하는 신호를 전달한다.
한 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 6의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc, 서열번호: 8의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc, 서열번호: 18의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc 및 서열번호: 20의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc을 제공한다.
다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 5의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물(TNFR1-TNFR1-IgG), 서열번호: 7의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물 (TNFR2-TNFR2-IgG), 서열번호: 17의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물(CD2-CD2-IgG) 및 서열번호: 19의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc를 코딩하는 DNA 작제물(CTLA4-CTLA4)을 제공한다.
또 다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 5의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-Top10', 서열번호: 7의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-Top10', 서열번호: 17의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig 및 서열번호: 19의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig를 제공한다. 이들 재조합 발현 플라스미드는 부다페스트 협약하의 국제기탁기관 KCCM에 기탁하고 각각 수탁번호 KCCM 10288, KCCM 10291, KCCM 10402 및 KCCM 10400를 부여받았다.
또 다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 5의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-Top10'로 형질감염 또는 형질전환된 포유동물 숙주 세포(예, TR11Ig-CHO), 서열번호: 7의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-Top10'로 형질감염 또는 형질전환된 포유동물 숙주 세포(예, TR22Ig-CHO), 서열번호: 17의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig로 형질감염 또는 형질전환된 포유동물 숙주 세포 및 서열번호: 19의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig로 형질감염 또는 형질전환된 포유동물 숙주세포를 제공한다. 상기 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-Top10'로 형질감염된 챠이니즈 햄스터 난소 세포주 TR11Ig-CHO 및 상기 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-Top10'로 형질감염된 챠이니즈 햄스터 난소 세포주 TR22Ig-CHO는 부다페스트 협약하의 국제기탁기관 KCCM에 기탁하고 각각 수탁번호 KCLRF-BP-00046 및 KCLRF-BP-00047을 부여받았다.
또 다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 10의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR1-TNFR1/Fc, 서열번호: 12의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR2-TNFR2/Fc, 서열번호: 22의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCD2-CD2/Fc 및 서열번호: 24의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCTLA4-CTLA4/Fc을 제공한다.
또 다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호. 9의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물, 서열번호: 11의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물, 서열번호: 21의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCD2-CD2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물 및 서열번호: 23의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCTLA4-CTLA4/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 제공한다. 당화 모티브 펩타이드를 생성할 수 있게 하기 위하여 TNFR/Fc, CD2/Fc 및 CTLA4/Fc 연쇄체 형태의 융합 유전자의 세포외역 가용성 부위 결합부위를 코딩하는 염기서열에 해당하는 양방향 프라이머를 제작하였다. 이 프라이머는 연쇄체 형태의 융합 유전자의 임의의 아미노산을 코딩하는 염기서열이 아스파라진(asparagin, N)을 코딩하는 염기서열 (AAT, AAC)로 치환될 수 있는 염기서열과 세린(serine, S) 혹은 트레오닌 (threonine, T)을 코딩하는 염기서열(세린:TCC, 트레오닌:ACC, ACG, ACA)로 치환될 수 있는 염기서열을 가지도록 하였다. 프라이머 제작시 복수의 아미노산 코드 서열중 한 서열의 선택은 중합효소 연쇄반응의 효율을 최대화하기 위하여 염기서열이 최소로 치환될 수 있는 조건 및 프라이머 결합 온도(melting temperature, Tm)를 고려하여 결정되었다.
또 다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 9의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-MG, 서열번호: 11의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-MG, 서열번호: 21의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCD2-CD2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig-MG 및 서열번호: 23의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCTLA4-CTLA4/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig-MG를 제공한다. 이들 재조합 발현 플라스미드는 부다페스트 협약하의 국제기탁기관 KCCM에 기탁하고 각각 수탁번호 KCCM 10404, KCCM (10407), KCCM 10401 및 KCCM 10399를 부여받았다.
또 다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 9의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-MG로 형질전환 또는 형질감염된 포유동물 숙주 세포, 서열번호: 11의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-MG로 형질전환 또는 형질감염된 포유동물 숙주 세포, 서열번호: 21의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCD2-CD2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig-MG로 형질전환 또는 형질감염된 포유동물 숙주 세포 및 서열번호: 23의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCTLA4-CTLA4/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig-MG로 형질전환 또는 형질감염된 포유동물 숙주 세포를 제공한다.
본 발명에 따라 제조된 형질전환체 또는 형질감염체를 배양하고 배양물로부터 분리된 본 발명의 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질은 상기 표1에 수록한 바와 같이 면역글로불린에 결합된 연쇄체 형태의 면역반응에 관여하여 단백질의 종류에 따라 치료제, 진단제 및 연구용 도구로 다양하고 유용하게 사용될 수 있으며 이들의 용법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 특히 치료제로서 사용하는 경우는 통상적으로 알려져 있는 유효량을 적용할 수 있으나 특정 환자에 대한 특정 유효량은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 변할 수 있음은 이해될 것이다. 또한, 당업자는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질이 치료제로 사용되는 경우 이들의 투여 방식 및 경로도 면역반응에 관여하는 단백질의 통상적인 투여 방식 및 경로를 적용할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단순히 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명할 것이다. 설명의 편의를 위해 본 발명과 관련하여 하기 실시예에 따라 제조된 DNA 작제물, 재조합 발현 플라스미드, 형질전환 세포주, 사용된 프라이머에 관한 서열목록 및 기탁 정보를 아래 표 8 및 9에 요약한다.
표 8. DNA 작제물 등에 관한 정보
표 9. 프라이머에 관한 정보
실시예 1
인체 TNFR
A. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 제조(도 1 및 도 5)
a. TNFR1의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편
인체 TNF 수용체 타입 I(TNFR1, p55)의 세포외역 가용성 부위와 인체 면역글로불린 G1의 Fc 부위가 연결된 융합 유전자를 제조하기 위해 문헌[홀튼 등의 Biotechniques 8:528, 1990)]에 기술되어 있는 방법과 동일한 방법으로 중합효소 연쇄반응 방법(PCR)을 수행하였다.
제한효소 EcoR1의 인식서열과 리더 서열(서열번호 2의 펩타이드 1-20)의 코딩 서열을 갖는 한 프라이머(서열번호: 25의 뉴클레오타이드)와 상기 세포외역 가용성 부위(TNFR1-ED)의 3' 말단서열과 면역글로블린 Gl(IgG1)의 힌지 부위(hinge region: H)의 5' 말단의 일부 서열을 코딩하는 안티센스 서열(서열번호: 26의 뉴클레오타이드)을 갖는 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 TNFR1의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편을 생성하였다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 건강한 성인의 단핵구 세포(T림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.
건강한 성인의 혈액을 채취하고 알피엠아이-1640[RPMI-1640(Gibco BRL, USA)] 배지와 1:1로 희석하여 이를 피콜-하이팩 [Ficoll-hypaque(Amersham, USA)]를 사용하여 밀도구분 원심분리(density-gradient centrifugation)하여 상부에 형성된 T 림프구 세포층을 얻었다. 그리고 알피엠아이-1640 배지로 3회 세척하고 여기에 10% 우태아혈청(FBS, Gibco BRL,5 USA) 함유 알피엠아이-1640 배지를 가하여 T 림프구 세포가 5×105개/ml로 하고, 류코아굴루티닌[leukoagglutinin (Pharmacia, USA)]을 3.5㎍/ml가 되도록 첨가한 후, 5% CO2배양기에, 37℃에서 2일간 배양하였다.
mRNA는 트리리젠트 [Tri-Reagent(MRC, USA)] mRNA 분리 키트를 이용하여 순수 분리하였다. 우선 인간 T 림프구 2×107개의 세포를 인산완충 생리식염수용액(phosphate buffered saline, PBS, pH7.2)으로 3회 세척한 후 1㎖ 트리리젠트로 수차례 섞어서 RNA를 용해시켰다. 이 튜브에 0.2㎖ 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 강하게 흔들어준 후, 실온에서 15분간 방치한 다음, 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심분리하였다. 상층액을 1.5㎖ 튜브로 옮기고 0.5㎖ 이소프로판올(isopropanol)을 첨가한 후, 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 버린 후, 침전물에, 75% 에탄올(Ethanol)-25% 디이피씨[DEPC(Sigma, USA)]를 처리한 3차 증류수를 1㎖ 첨가하여 2∼3회 섞은 후 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 완전히 제거하고 공기 중에서 건조시켜 잔여 에탄올을 제거한 후 RNA를 디이피씨를 처리한 3차 증류수 50㎕로 녹였다.
cDNA 합성은 1.5㎖ 튜브에 정제된 2㎍ mRNA와 1㎕ 올리고 디티[oligo dT(dT30, Promega, USA)] 프라이머를 10μM의 농도로 혼합하고, 70℃에서 2분간 가열한 후, 얼음에 넣어 2분간 식혔다. 이 혼합물에 200U 엠-엠엘브이(M-MLV) 역전사효소[reverse transcriptase(Promega, USA)], 10㎕ 5× 반응완충용액(reaction buffer) [250mM 트리스-에이치씨엘(Tris-HCl), pH 8.3, 375mM 염화칼륨(KCl), 15mM염화마그네숨(MgCl2), 50mM 디티티(DTT)], 1㎕ 디엔티피[dNTP(각각 10mM의 농도, Takara, Japan)]를 넣고 디이피씨를 처리한 3차 증류수로 50㎕가 되도록 첨가한후, 42℃에서 1시간 반응시켜 1차 cDNA를 합성하였다.
b. 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편
TNFR 세포외역 가용성부위의 3'말단의 일부 서열을 포함하고 IgG1의 힌지 부위의 5'말단을 코딩하는 서열을 갖는 한 프라이머[서열번호: 27의 뉴클레오타이드)와 Xbal의 인식서열과 IgG1 Fc의 3' 말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머(서열번호: 28의 뉴클레오타이드)를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편을 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 회복기에 있는 원인 불명의 열 환자의 말초 혈액 세포(B 림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.
c. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물
상기 생성된 TNFR1의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편과 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편을 한 시험관에서 혼합한 후, 공통되는 서열(TNFR1 세포외역 가용성 부위 3' 말단과 IgG1 힌지 부위의 5' 말단을 포함하는 서열)사이에서 상보적 결합이 일어나도록 유도하였다. 이를 주형으로 하여 TNFR1의 5' 말단을 코딩하는 서열을 갖는 프라이머(서열번호: 25의 뉴클레오타이드)와 IgG1Fc의 3'말단을 코딩하는 프라이머(서열번호: 27의 뉴클레오타이드)를 사용한 중합효소 연쇄반응을 일으켜, 상기 TNFR1 세포외역 가용성 부위의 DNA 단편과 IgG1 Fc부위의 DNA 단편의 서열을 포함하는 목적하는 TNFR1/Fc 코딩 DNA 작제물을 증폭시켰다. 제조된 유전자는 발현 후 단백질의 분비를 용이하게 하기 위한 리더 시퀀스를 포함한다.
d. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 발현
상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 제한효소 EcoR1과 Xba1으로 소화시키고, 시판되고 있는 클로닝 벡터(stratagene사 제품) 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+)]의 EcoR1/Xba1 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 전체 코딩 영역 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다(서열번호: 1). 이때 생성된 융합 단백질은 단순 융합된 단량체 단백질로서 TNFR1/Fc라 명명하였고, 타원형 구조는 융합 유전자의 1 차 발현 산물 단백질의 구조를 나타낸다. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc의 추정 아미노산 서열은 서열번호: 2에 해당한다.
B. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 제조(도 1 및 도 5)
a. TNFR2의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편
인체 TNF 수용체 타입 Ⅱ(TNFR2, p75)의 세포외역 가용성 부위와 인체 면역글로불린 G1의 Fc 부위가 연결된 융합 유전자를 상기 TNFR1의 제조 과정과 동일한 절차에 따라 제조하였다.
제한효소 EcoR1의 인식서열과 리더 서열(서열번호 4의 펩타이드 1-22)의 코딩 서열을 갖는 한 프라이머(서열번호: 29의 뉴클레오타이드)와 상기 세포외역 가용성 부위(TNFR2-ED)의 3' 말단서열과 면역글로블린 G1(IgG1)의 힌지 부위(hinge region: H)의 5' 말단의 일부 서열을 코딩하는 안티센스 서열(서열번호: 30의 뉴클레오타이드)을 갖는 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 TNFR2의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편을 생성하였다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 TNFR1에서와 동일하게 건강한 성인의 단핵구 세포(T림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.
b. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물
상기 생성된 TNFR2의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편과 상기 TNFR1에 기술된 바와 같이 제조된 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편을 한 시험관에서 혼합한 후, 공통되는 서열(TNFR2 세포외역 가용성 부위 3' 말단과 IgG1 힌지 부위의 5' 말단을 포함하는 서열)사이에서 상보적 결합이 일어나도록 유도하였다. 이를 주형으로 하여 TNFR2의 5' 말단을 코딩하는 서열을 갖는 프라이머(서열번호: 29의 뉴클레오타이드)와 IgG1 Fc의 3'말단을 코딩하는 프라이머(서열번호: 31의 뉴클레오타이드)를 사용한 중합효소 연쇄반응을 일으켜, 상기 TNFR2 세포외역 가용성 부위의 DNA 단편과 IgG1 Fc 부위의 DNA 단편의 서열을 포함하는 목적하는 TNFR2/Fc 코딩 DNA 작제물을 증폭시켰다. 제조된 유전자는 발현 후 단백질의 분비를 용이하게 하기 위한 리더 시퀀스를 포함한다.
c. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 발현
상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 제한효소 EcoR1과 Xba1으로 소화시키고, 시판되고 있는 클로닝 벡터(stratagene사 제품) 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+)]의 EcoR1/Xba1 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 전체 코딩 영역 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다(서열번호: 3). 이때 생성된 융합 단백질은 단순 융합된 단량체 단백질로서TNFR2/Fc라 명명하였고, 타원형 구조는 융합 유전자의 1 차 발현 산물 단백질의 구조를 나타낸다. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR2/Fc의 추정 아미노산 서열은 서열번호: 4에 해당한다.
C. 연쇄 융합된 단량체 단백질 TFR1-TFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 제조(도 2 및 도5)
TNFR1 세포외역 가용성 부위가 연쇄체(concatamer)의 형태를 갖는 융합 유전자, 즉 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 만들기 위해, TNFR1 세포외역 가용성 부위의 염기 서열과 상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물에 동일한 제한효소(BamHI) 인식서열을 중합효소 연쇄반응을 이용하여 삽입한 후 BamHI으로 절단된 부분을 라이게이즈 (ligase)로 연결하였다. 이 반응은 상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물(서열번호: 1의 뉴클레오타이드)을 주형으로 사용하였다.
서열번호: 25의 뉴클레오타이드에 해당하는 프라이머와 서열번호: 33의 뉴클레오타이드에 해당하는 프라이머를 사용하여 3' 말단에 BamHI 인식 서열을 갖는 TNFR1 세포외역 가용성 부위의 단편을 증폭하였고, 또한 서열번호: 28이 뉴클레오타이드에 해당하는 프라이머와 서열번호: 32의 뉴클레오타이드에 해당하는 프라이머를 사용하여 5' 말단에 BamHI 인식서열온 갖는 다른 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 단편을 각각 증폭하였다. 중합효소 연쇄반응은 1㎕ 1차 cDNA, 2U 피에프유(pfu) DNA 중합효소[polymerase (Stratagene, USA)], 10㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [200mM 트리스-HCI, pH 8.75, 100mM 황산암모늄 [(NH4)2SO4], 100mM 염화칼륨(KCl), 20mM 염화마그네숨(MgCl2)], 1% 트리톤(등록상표 Triton) X-100, 1mg/㎖ 우혈청알부민(BSA), 3㎕ 프라이머1(10μM). 3㎕ 프라이머2(10μM), 2㎕ 디엔티피(dNTP, 각각 10mM)를 넣고 3차 증류수로 100㎕가 되도록 첨가한 후 실시하였다. 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 처리한 다음 95℃ 1분, 58℃ 1분30초, 72℃ 1분30초씩 31회 반응시키고, 72℃ 15분간 더 반응 시켜 중합효소 연쇄반응 산물이 완전한 평활 말단이 되도록 하였다.
중합효소 연쇄반응 산물들을 0.8% 아가로즈 젤(agarose gel)에 전기영동한 후, 큐엑스 투 젤 추출 키트[Qiaex Ⅱ gel extraction kit(Qiagen, USA)]를 이용하여 순수 분리하였다. 순수분리된 중합효소 연쇄반응 산물들을 제한효소 BamHI으로 처리한 후 페놀/클로로포름 추출 방법으로 순수 분리하였다 이어서, BamHI으로 처리된 두 종류의 DNA 단편을 라이게이즈로 결합시켰다.
D. 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 제조(도 2 및 도5)
TNFR2 세포외역 가용성 부위의 염기 서열과 상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물에 동일한 제한효소(BamH1) 인식서열을 중합효소 연쇄반응을 이용하여 삽입한 후 BamH1으로 절단된 부분을 라이게이즈로 연결하여 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 제조하였다.
3'말단에 BamHI 인식서열을 갖는 TNFR2 세포외역 가용성부위의 단편은 서열번호: 34의 뉴클레오타이드에 해당하는 프라이머와 서열번호: 35의 뉴클레오타이드에 해당하는 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 중합효소 연쇄반응은 TNFR1의 경우와 동일하게 실시하였다. 단 서열번호: 3의 상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 주형으로 사용하였다. 중합효소 연쇄반응 산물은 TNFR1의 경우와 동일하게 분리하였다.
E. 당화 모티브를 갖는 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물
TNFR1 세포외역 가용성부위의 결합부위에서 소수성을 나타내는 펩타이드 부위(서열번호: 6 197-216의 펩타이드)를 제외하고 첫 번째 TNFR1 세포외역 가용성부위의 3'의 말단의 일부(서열번호: 5 565-591의 뉴클레오타이드)와 두 번째 TNFR1 세포외역 가용성부위의 5' 말단의 일부(서열번호:5 649-681의 뉴클레오타이드)를 포함한 안티센스 프라이머(서열번호: 37의 뉴클레오타이드)와 제한효소 EcoRI을 가지고 리더 서열을 포함한 프라이머(서열번호: 25의 뉴클레오타이드)를 사용한 중합 효소 연쇄반응을 이용하여 DNA 단편을 제작하였다.
또한 상기한 프라이머에서 서열번호: 5의 565-567(CTG, Leu), 574-576(ACG, Thr), 652-654(CTA, Leu) 및 670-672(AGA, Arg)에 해당하는 뉴클레오타드를 AAC(Asn, N)로, 서열번호. 5의 571-573(TGC, Cys) 및 580-582(TTG, Leu)에 해당하는 뉴클레오타이드를 ACC(Thr, T)로, 서열번호: 5의 658-660(GAC, Asp)을 TCC(Ser, S)로 대치한 염기서열을 포함하도록 제작(서열번호: 36 및 37의 뉴클레오타이드)하여 총 4개의 당화 모티브 펩타이드 부위(서열번호: 10 189-191, 192-194, 198-200, 204-206의 펩타이드)를 삽입하였다.
이 반응에서 연쇄체 형태의 TNFR1-TNFR1/Fc 유전자(서열번호: 5의 뉴클레오타이드)를 주형으로 사용하였다. 최초 중합효소 연쇄반응시 안티센스 프라이머의 절반만이 주형으로 사용된 연쇄체 형태의 TNFR1-TNFR1/Fc 유전자에 결합하도록 유도하였으며 연쇄반응이 진행되면서 주형에 걸합되지 아니한 부위가 중합효소에 의해 완전한 두가닥의 DNA를 이루도록 하여 리더 서열을 포함한 TNFR1 세포외역 부위 3' 말단에 두 번째 세포외역 가용성부위의 일부를 코딩하는 5' 말단 염기 서열이 결합된 상태의 DNA 단편을 얻을 수 있게 하였다. 이와 같이 두 번째 세포외역 가용성부위의 일부 5' 말단 염기서열은 이후 2차 중합효소 연쇄반응시 다음에 설명하는 두 번째 DNA 단편과 상보적 결합이 가능하는 작용을 하게 된다.
두 번째 DNA 단편은 첫 번째 TNFR1 세포외역 가용성부위 3' 말단의 일부(서열번호: 5 565-591의 뉴클레오타이드)와 두 번째 TNFR1 세포외역 가용성부위의 5'말단의 일부(서열번호: 5 649-681의 뉴클레오타이드)를 포함한 한 프라이머(서열번호: 36의 뉴클레오타이드)와 제한효소 Xba1의 인식서열과 IgG1 Fc의 3' 말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머(서열번호: 28의 뉴클레오타이드)를 사용한 중합효소 연쇄반응을 이용하여 제작하였다. 이 반응도 상기한 바와 같이 세포외역 가용성부위에 해당하는 프라이머의 절반만이 주형에 결합하도록 유도하였으며, 결과적으로 상기한 DNA 단편과 동일하게 TNFR1 세포외역 부위 5' 말단에 첫 번째 세포외역 가용성부위 3' 말단의 일부를 코딩하는 염기 서열을 갖도록 하였다.
이어서 상기한 두 종류의 중합효소 연쇄반응 결과물인 DNA 단편을 동일한 시험관에 혼합한 후 중복되는 상보적 염기서열 사이에서의 결합을 유도한 후, 연쇄체 형태 유전자의 각 5' 및 3' 말단에 해당하는 프라이머(서열번호: 25와 28)를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하므로써 두 DNA 단편을 결합시켰으며 이를 mgTNFR1-TNFR1-1gG라고 명명하였다.
F. 당화 모티브를 갖는 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물
TNFR2 세포외역 가용성부위의 결합부위에서 소수성을 나타내는 펩타이드 부위(서열번호: 8 203-263의 펩타이드)를 제외하고 첫 번째 TNFR2 세포외역 가용성부위의 3'의 말단의 일부[서열번호: 7 586-606의 뉴클레오타이드]와 두 번째 TNFR2 세포외역 가용성부위의 5' 말단의 일부[서열번호: 7 790-807의 뉴클레오타이드]를 포함한 안티센스 프라이머[서열번호: 39의 뉴클레오타이드]와 제한효소 EcoRI을 가지고 리더 시퀀스를 포함한 프라이머[서열번호: 29의 뉴클레오타이드]를 사용한 중합효소 연쇄반응을 이용하여 DNA 단편을 제작하였다.
또한 상기한 프라이머에서 서열번호: 7의 595-597(GTC, Val) 및 799-801(GGG, Gly)에 해당하는 뉴클레오타이드를 AAC(Asn, N)로 대치한 염기서열을 포함하도록 제작(서열번호: 38 및 39의 뉴클레오타이드)한 프라이머를 이용하여 총 2개의 당화 모티브 펩타이드 부위(서열번호: 12 199-201, 206-208의 펩타이드)를 삽입하였다.
이 반응에서 연쇄체 형태의 TNFR2-TNFR2/Fc 유전자[서열번호: 7의 뉴클레오타이드]를 주형으로 사용하였다. 최초 중합효소 연쇄반응시 안티센스 프라이머의 절반만이 주형으로 사용된 연쇄체 형태의 TNFR2-TNFR2/Fc 유전자에 결합하도록 유도하였으며 연쇄반응이 진행되면서 주형에 결합되지 아니한 부위가 중합효소에 의해 완전한 두가닥의 DNA를 이루도록 하여 리더 시퀀스를 포함한 TNFR2 세포외역 부위 3' 말단에 두 번째 세포외역 가용성부위의 일부를 코딩하는 5' 말단 염기 서열이 결합된 상태의 DNA 단편을 얻을 수 있게 하였다. 이와 같이 두 번째 세포외역 가용성부위의 일부 5' 말단 염기서열은 이후 2차 중합효소 연쇄반응시 다음에 설명하는 두 번째 DNA 단편과 상보적 결합이 가능하는 작용을 하게 된다.
두 번째 DNA 단편은 첫 번째 TNFR2 세포외역 가용성부위 3' 말단의 일부(서열번호: 7 586-606의 뉴클레오타이드)]와 두 번째 TNFR2 세포외역 가용성부위의 5'말단의 일부[서열번호: 7 790-807의 뉴클레오타이드]를 포함한 한 프라이머(서열번호: 38의 뉴클레오타이드)와 제한효소 Xba1의 인식서열과 IgG1 Fc의 3' 말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머(서열번호: 28의 뉴클레오타이드)를 사용한 중합효소 연쇄반응을 이용하여 제작하였다. 이 반응도 상기한 바와 같이 세포외역 가용성부위에 해당하는 프라이머의 절반만이 주형에 결합하도록 유도하였으며, 결과적으로 상기한 DNA 단편과 동일하게 TNFR2 세포외역 부위 5' 말단에 첫 번째 세포외역 가용성부위 3' 말단의 일부를 코딩하는 염기 서열을 갖도록 하였다.
이어서 상기한 두종류의 중합효소 연쇄반응 결과물인 DNA 단편을 동일한 시험관에 혼합한 후 중복되는 상보적 염기서열 사이에서의 결합을 유도한 후, 연쇄체 형태 유전자의 각 5' 및 3' 말단에 해당하는 프라이머[서열번호: 29와 28]를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하므로써 두 DNA 단편을 결합시켰으며 이를 mgTNFR2-TNFR2-IgG라고 명명하였다.
G. 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR-TNFR/Fc 및 이의 당화 단백질을 코딩하는 DNA 작제물의 클로닝
상기 제조된 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR-TNFR/Fc 및 이의 당화 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+), Stratagene, USA]의 EcoRI/XbaI 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 이때 생성된 융합 단백질은 연쇄 융합된 단량체 단백질로서 TNFR1-TNFR1/Fc와 TNFR2-TNFR2/Fc, 이의 당화 단백질로서 mgTNFR1-TNFR1/Fc와 mgTNFR2-TNFR2/Fc라 명명하였고, 이들의 추정 아미노산 서열은 각각 서열번호: 6, 8, 10 및 12에 해당한다.
벡터로 사용할 10㎕ 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ (+), Stratagene, USA)]를 15U EcoRI과 15U XbaI, 5㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [100mM 트리스-HCl, pH 7.5, 100mM 염화마그네슘(MgCl2), 10mM 디티티 (DTT), 500nM 염화나트륨(NaCl)], 5㎕ 0.1% 우혈청알부민[BSA(Takara, Japan)]을 섞은 후, 3차 증류수로 50㎕가 되도록 첨가한 후 37℃에서 2시간 반응시켜 DNA를 소화시켰다. 반응물을 0.8% 아가로즈 겔에 전기영동한 후, 큐엑스 투 젤 추출 키트 [Qiaex Ⅱ gel extraction kit(Qiagen, USA)]로 순수 분리하였다.
EcoRI과 XbaI으로 소화된 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+), Stratagene, USA] 100ng과 제한효소로 소화시킨 20ng의 중합효소 연쇄반응 산물을 혼합하고 0.5U 티포(T4) DNA 라이게이즈[ligase(Amersham, USA)], 1㎕ 10X반응완충용액(reaction buffer) [300mM 트리스-에이치씨엘(Tris-HCl), pH 7.8, 100mM 염화마그네습(MgCl2), 100mM 디티티(DTT), 10mM 에이티피(ATP)]를 넣은 후 3차 증류수로 10㎕가 되도록 첨가한 후 16℃ 수조(water bath)에서 16시간 동안 반응시켰다. 대장균[E. coil Top10(Novex, USA)]을 리비듐 클로라이드(RbCl, ribidium chloride, Sigma, USA)법으로 컴피턴트 세포(competent cell)를 만든 후 형질전환시켜 암피실린(ampicillin, Sigma, USA)을 50㎍/㎖ 함유한 엘비(LB) 고체 배지에 도말하고 37℃에서 16시간 배양하였다. 생성된 콜로니들을 암피실린이 50㎍ /㎖ 함유된 엘비(LB) 액체배지 4㎖에 접종한 후 37℃에서 16시간동안 진탕 배양하였다. 이 중 1.5㎖을 샘브룩(Sambrook J) 등의 문헌(Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.25-1.31, p1.63-1.69, p7.26-7 29, 1989)에 기술된 알칼리 분해(alkaline lysis)법으로 플라스미드를 소량 추출한 후, EcoRI과 XbaI으로 소화시켜 클로닝의 유무를 확인하였다.
전체 코딩영역 서열은 다이데옥시 체인 터미네이션 [Dideoxy chain termination(생어(Sanger F) 등의 문헌, PNAS USA, 74:5483, 1977)법을 이용한 다음과 같은 DNA 서열화 방법에 의해 확인하였다. 상기의 알칼리 분해법으로 추출한 플라스미드 와 시쿼네이즈(등록상표 Sequenase ver. 2.0, Amersham, USA) 및35S 디에이티피(dATP, Amersham, USA)를 사용하여 제품 사용법에 준하는 방법으로 DNA 서열화 반응을 진행시켰다. 6% 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)에 위의 시료를 로딩(loading)하고 전압을 1800∼2000V 사이로 유지하여 젤의 온도를 50℃로유지하면서 2시간 전기영동한 후, 건조시킨 다음 엑스레이 필름(Kodak, USA)에 2일동안 노출시킨 후 DNA 염기 서열을 판독하였다.
실시예 2 및 3
CD2 및 CTLA4
CD2 및 CTLA4의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편은, 제한효소 EcoRI의 인식서열과 리더 서열[CD2(서열번호: 14의 펩타이드 1-24), CTLA4(서열번호. 16의 펩타이드 1-21)]의 코딩 서열[(CD2(서열번호: 13의 뉴클레오타이드, CTLA4(서열번호: 15의 뉴클레오타이드)]을 갖는 한 프라이머[CD2(서열번호: 40의 뉴클레오타이드, CTLA4(서열번호: 43의 뉴클레오타이드)]와, 제한효소 PstI의 인식서열과 상기 세포외역 가용성 부위의 3' 말단 서열을 코딩하는 안티센스 서열[CD2(서열번호: 13의 뉴클레오타이드, CTLA4(서열번호: 15의 뉴클레오타이드)]을 갖는 다른 프라이머[CD2(서열번호: 41), CTLA4(서열번호: 44)]를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 건강한 성인의 단핵구 세포(T림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.
또한, 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편은, 제한효소 PstI의 인식서열과 IgG1의 상쇄부위의 5'말단을 코딩하는 서열을 갖는 한 프라이머(서열번호: 42의 뉴클레오타이드)와 Xba1의 인식서열과 IgG1 Fc의 3' 말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머(서열번호: 28)를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 회복기에 있는 원인 불명의 열 환자의 말초 혈액 세포(B 림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.
이어서 상기 생성된 CD2 및 CTLA4의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편과 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편을 제한효소 PstI으로 소화시키고 티포 디엔에이 라이게이즈(T4 DNA ligation)를 이용하여 결합시키므로써 단순 이량체 형태의 CD2/Fc 및 CTLA4/Fc 유전자를 제작하였다. 여기서 CH2 및 CH3는 중쇄의 제 2, 제 3 불변 도메인을 나타내며, 제조된 유전자는 발현 후 단백질의 분비를 용이하게 하기 위한 리더 서열을 포함한다.
상기 생성된 융합 유전자 단편을 제한효소 EcoRI과 XhaI으로 소화시키고, 시판되고 있는 클로닝 벡터(stratagene사 제품) 피블루스크립트 케이에스투 플러스 [pBluescript KS Ⅱ(+)]의 EcoR1/ Xba1 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 전체 코딩 영역 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다(서열번호:13 및 15). 이때 생성된 융합 단백질을 각각 CD2/Fc, CTLA4/Fc라 명명하였고, 이들의 추정 아미노산 서열은 각각 서열번호: 14 및 16에 해당한다.
중합효소 연쇄반응은 1㎕차 cDNA, 2U 피에프유(Pfu) DNA 중합효소 [polymerase (Stratagene, USA)], 10㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [200mM 트리스-에이치씨엘, pH 8.75, 100mM 황산암모늄[(NH4)2SO4], 100mM 염화칼륨(KCl), 20mM 염화마그네습(MgCl2)], 1% 트리톤(등록상표 Triton) X-100, 1mg/㎖ 우혈청알부민(BSA), 3㎕ 프라이머1(10uM), 3㎕ 프라이머2(10uM), 2㎕ 디엔티피(dNTP, 각각 10mM)를 넣고 3차 증류수로 100㎕가 되도록 첨가한 후 실시하였다. 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 처리한 다음 95℃ 1분, 58℃ 1분30초, 72℃ 1분30초씩 31회 반응시키고, 72℃ 15분간 더 반응 시켜 중합효소 연쇄반응 산물이 완전한 평활 말단이 되도록 하였다.
연쇄체 형태의 CD2-CD2/Fc 및 CTLA4-CTLA4/Fc 융합 유전자는 다음과 같이 제조하였다.
CD2 및 CTLA4의 세포외역 가용성 부위가 연쇄체(concatamer)의 형태를 갖는 융합 유전자를 만들기 위해, CD2 및 CTLA4 세포외역 가용성 부위의 서열을 상술한 제한효소 PstI과 티포 디엔에이 폴리머레이즈(T4 DNA polymerase)를 이용하여 평활말단을 갖도록 한 단순 이량체 형태의 융합 유전자에서 세포외역과 면역글로블린의 결합 분위에 라이게이즈를 이용하여 평활 말단 접합(blunt end ligation)시키므로써 삽입하였다. 구체적으로, CD2 및 CTLA4 세포외역 가용성부위의 리더 서열이 종료되는 부위[CD2(서열번호: 14의 펩타이드 25), CTLA4(서열번호: 16의 펩타이드 22)]를 코딩하는 코딩서열[CD2(서열번호: 13의 뉴클레오타이드), CTLA4(서열번호: 15의 뉴클레오타이드)]을 갖는 한 프라이머[CD2(서열번호: 45의 뉴클레오타이드), CTLA4(서열번호: 47의 뉴클레오타이드)]와 상기 세포외역 가용성 부위의 3' 말단 서열을 코딩하는 안티센스 서열[CD2(서열번호: 13의 뉴클레오타이드), CTLA4(서열번호: 15의 뉴클레오타이드)]을 갖는 다른 프라이머[CD2(서열번호, 46), CTLA4(서열번호: 48)]를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시켰다. 이 반응은 상기한 단순 이량체 융합 유전자[CD2(서열번호: 13의 뉴클레오타이드), CTLA4(서열번호: 15의 뉴클레오타이드)]를 주형으로 사용하였다.
또한, 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+)]에 삽입된 단순 이량체 형태의 CD2/Fc 및 CTLA4/Fc를 제한효소 PstI으로 소화시켜 3' 말단이 돌출된 형태(3' overhang)의 절단면을 생성하도록 하였다. 절단면의 3' 돌출 말단을 티포 디엔에이 폴리머레이즈(T4 DNA polymerase)을 처리하여 부분적으로 제거 (partial deletion)시켜 평활 말단이 되도록 하였다. 세포외역 가용성 부위가 연쇄체(concatamer)의 형태를 갖는 융합 유전자를 만들기 위해, 상기한 중합효소 연쇄반응으로 제작한 CD2 및 CTLA4 세포외역 가용성 부위를 평활 말단으로 제작된 단순 이량체 유전자의 절단면에 라이게이즈를 이용하여 평활 말단 접합(blunt end ligation)시키므로써 삽입하여 클로닝하였다. 이때 생성된 융합 단백질은 연쇄 융합된 단량체 단백질로서 각각 CD2-CD2/Fc와 CTLA4-CTLA4/Fc라 명명하였고, 이들의 추정 아미노산 서열은 각각 서열번호: 18 및 20에 해당한다.
다당화(multiglycosylation) 형태의 연쇄체 융합 유전자는 다음과 같이 제작하였다.
당화 모티브 펩타이드 서열은 제한효소 EcoRI과 세포외역 가용성부위의 리더 시퀀스를 포함한 한 프라이머와 연쇄체 형태의 융합 유전자의 첫 번째 세포외역 가용성부위의 3' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열과 두 번째 세포외역 가용성부위의 5' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열을 가지고 당화 모티브로 치환된 염기서열을 가진 안티센스 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 제작한 DNA 단편과, 연쇄체 형태의 융합 유전자의 첫 번째 세포외역 가용성부위의 3' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열과 두 번째 세포외역 가용성부위의 5' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열을 가지고 당화 모티브로 치환된 염기서열을 가진 한 프라이머와 면역글로블린 G1의 Fc 부위의 3' 말단과 제한효소 XbaI를 코딩하는 안티센스 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응으로 제작된 DNA 단편을 한 시험관에 동시에 넣고 2차 중합효소 연쇄반응을 수행하므로써 삽입하였다.
CD2/Fc 및 CTLA4/Fc 연쇄체 융합 유전자의 경우도 상기한 TNFR/Fc의 방법과 동일한 방법으로 변형된 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄반응을 이용하여 당화 모티브 펩타이드를 삽입시켰으며 TNFR/Fc의 경우와는 다르게 CD2 및 CTLA4 세포외역 가용성부위 결합되는 펩타이드 서열은 그대로 유지하였다.
CD2/Fc 및 CTLA4/Fc 연쇄체 융합 단백질의 다당화 과정은 CD2/Fc의 경우 서열번호:17의 598-600(CCT, Pro) 및 616-618(GAG, Glu)에 해당하는 누클레오티드를 AAT(Asn, N)로 대치한 염기서열을 포함하도록 제작한 프라이머(서열번호:49 및 50의 누클레오티드)를 이용하여 총 2개의 당화 모티브 펩타이드 부위(서열번호:200-202, 206-208의 펩타이드)를 삽입하여 완성하였고, CTLA4/Fc의 경우는 서열번호:19의 403-405(GTA, Val), 424-426(CCA, Pro)에 해당하는 누클레오티드를 AAT(Asn, N)로, 서열번호:19의 409-411(GAT, Asp), 445-407(GTG, Val)에 해당하는 누클레오티드를 각각 ACA(Thr, T) 및 ACG(Thr, T)로 대치한 염기서열을 포함하도록 제작한 프라이머(서열번호:51및 52의 누클레오티드)를 이용하여 총 3개의 당화 모티브 펩타이드 부위(서열번호:24 136-138, 142-144, 147-149의 펩타이드)를 삽입하여 완성하였다. 이때 생성된 융합 단백질은 연쇄 융합된 단량체 단백질로서 각각 mgCD2-Cd2/Fc 및 mgCTLA4-CTLA4/Fc라 명명하고 이들의 추정 아미노산 서열은 각각 서열번호 22 및 24에 해당한다.
실시예 4
단순/연쇄 융합된 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질의 발현 및 정제
챠이니즈 햄스터의 난소 케이원 세포주(CHO-K1, ATCC CCL-61, Ovary, Chinese hamster, Cricetulus griseus)에서 융합 단백질을 발현시키기 위하여, TNFR/Fc 융합 유전자를 포함한 블루스크립트 케이에스투 플러스 플라스미드 DNA를 형질 전환된 대장균에서 추출한 후, 제한효소 EcoR1과 Xba1으로 소화시켜 얻은 TNFR/Fc 단편을 동물세포 발현 벡터인 피씨알쓰리(pCR™3, Invitrogen, USA) 플라스미드의 EcoR1/ Xba1 부위에 삽입하여, 발현 벡터를 제조한 후 이를 각각 플라스미드 pTR11-Top10' 및 플라스미드 pTR22-Top10'로 명명하고, 2001년 7월 10일자로 한국미생물 보존센터(KCCM)에 각각 KCCM 10288, 및 KCCM 10291의 수탁번호로 기탁하였다.
형질 감염은 상기 TNFR/Fc 융합 유전자를 포함한 플라스미드 pTR11-Top10' 및 플라스미드 pTR22-ToP10' DNA 중 어느 하나를 지브코 비알엘(Gibco BRL, USA)사의 리포펙타민(Lipofectamine™) 시약과 혼합함으로써 수행하였다. 1∼3 × 105cells/well의 농도의 챠이니즈 햄스터의 난소(CHO-K1) 세포를 6구 조직 배양판 (six-well tissue culture plate, Nunc, USA)에 접종하고 10% 우태아혈청(FBS)을 함유한 디엠이엠(DMEM) 배지에서 세포가 50 ∼ 80%가 되도록 배양한 후, 혈청이 없는 디엠이엠(DMEM) 배지에서 상기 TNFR/Fc 융합 유전자를 포함한 플라스미드pTR11-Top10' 및 플라스미드 pTR22-Top10' DNA 중 어느 하나를 1∼ 2㎍ 취하고, 리포펙타민(Gibco BRL, USA)을 2∼25㎕ 취하여 상온에서 15~45분간 반응시킨 DNA-리포좀 혼합체(Liposome complex)를 세포 배양판에 첨가시켰다. 5시간동안 배양한 후 혈청이 20%가 함유된 디엠이엠(DMEM) 배지를 첨가하여 18∼24시간 배양하였다. 최초 형질 감염 후에 세포를 1.5 mg/㎖의 제네티신(Geneticin, G418, Gibco BRL, USA)이 첨가된 10% 우태아혈청 디엠이엠(DMEM) 배지에서 3주간 배양하고, 형성된 집락을 분리하여 증폭 배양하였다. 융합 유전자의 발현 여부는 퍼옥시데이즈가 표지된 염소 항 인간 면역 글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)을 사용한 효소 면역 검사법(ELISA)을 통해 검사하였다.
효소 면역 검사법(ELISA)은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 먼저, 1mg/㎖ 염소 항 인간 면역 글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)를 0.1M 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)에 1:2000으로 희석한 후, 96구 효소 면역 검사판(96-well flexible plate, Falcon, USA)에 100㎕씩 분주하고 랩으로 봉한 후 4℃에서 16시간 이상 방치하여 항체가 검사판 표면에 코팅되게 하였다. 이를 세척완충용액(washing buffer) [0.1% 트윈-20(Tween-20) 함유 , 1X 인산완충 생리식염수(PBS, Phosphate buffered saline)로 3회 세척한 후 희석용액[diluent buffer(1X 인산완충 생리식염수 48.5㎖, 우태아 혈청 1.5㎖, 트윈-20 50㎕)을 180㎕씩 분주하였다. 첫 구(well)에 배양한 상층액 20㎕를 넣은 후 마이크로 피펫 (micropipette)을 이용하여 연속적으로 희석하였고, 양성 대조군으로 0.01㎍/㎕ 인간 면역 글로블린(human IgG, Sigma, USA)를, 음성 대조군으로 형질감염되지 않은챠이니즈 햄스터의 난소 케이원(CHO-K1) 세포의 배양액을 사용하여 동일하게 희석하였다. 희석이 끝난 96구 효소 면역 검사판(Falcon, USA)를 호일로 싸서 37℃에서 1시간 30분간 반응시킨 후, 세척용액으로 3회 세척하였다. 퍼옥시데이즈가 표지된 염소 항 인간 면역 글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)를 희석용액으로 1:5000 희석한 다음 이를 100㎕씩 분주하고 호일로 싼 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 세척용액으로 3회 세척한 후 티엠비 퍼옥시데이즈 시스템(TMB microwell peroxidase substrate system, KPL, USA)을 이용하여 발색시키고, 흡광기(microplate reader, Bio-RAD, Model 550, Japan)로 파장 630nm에 대한 흡광도를 측정하여 발현 여부를 확인하였다.
이렇게 제조된 형질전환체(transfectant)를 각각 TR11Ig-CHO 및 TR22Ig-CHO로 명명하고, 2001년 7월 7일자로 한국세포주 연구재단 (KCLRF)에 각각 KCLRF-BP-00046 및 KCLRF-BP-00049의 수탁번호로 기탁하였으며, 상기 형질전환체가 생성한 융합 단백질을 정제할 목적으로 무혈청배지(serum free media) 중 CHO-S-SFM Ⅱ(Gibco BRL, USA)에 적응시키기 위하여 다음의 과정으로 진행하였다. 약 3×105개의 세포를 6구판(6-well plate)에 접종한 후 16시간동안 5% CO237℃ 배양기에서 배양하여 정착시킨후 현미경 하에서 약 30∼50%의 면적에 cell이 부착된 것을 확인하고 10% 우태아 혈청 함유 DMEM와 CHO-S-SFM Ⅱ의 비율을 8:2가 되도록 배지를 교체하여 배양하였다. 이 비율로 3회 계대 배양한 후, 각각 6:4의 비율로 3회, 4:6의 비율로 3회, 3:7의 비율로 3회, 2:8의 비율로 3회, 및 1:9의 비율로 3회 계대 배양한 후 최종적으로 100% CHO-S-SFM Ⅱ 배지에서 계대 배양하여, 이의 발현량을 효소 면역 검사법을 이용하여 측정하였다.
이 세포들을 우혈청배지가 없는 CHO-S-SFM Ⅱ(Gibco BRL, USA) 배지에서 대량 배양후 각각의 융합 단백질을 함유한 배양액을 200×g, 12분간 원심분리하여 세포 찌꺼기들을 완전히 제거하고 프로테인 에이 컬럼(HiTrap protein A column, Amersham, USA)을 이용한 다음의 방법으로 순수 분리하였다. 20mM 인산화 나트륨 (Sodium phosphate, pH 7.0, sigma, USA)을 1㎖/min의 속도로 2분간 통과시킨 후, 10㎖ 배양액을 동일한 속도로 컬럼을 통과시켜 프로테인 에이에 융합 단백질이 결합하도록 하였다. 20mM 인산화 나트륨(pH 7.0)을 2분간 동일 속도로 통과시켜 세척한 후, 0.1M 시트르산(C6H8O7. H2O. citric acid, pH 3.0, sigma, USA)을 3분간 동일속도로 통과시키면서 500㎕씩 1.5㎖ 튜브에 순차적으로 추출물을 분주하였다. 이를 1M 트리스(Tris, pH 11.0, USB, Sigma)를 이용하여 PH 7.0으로 적정하였으며 각 튜브의 융합 단백질의 존재 유무는 상기에 기술한 효소면역 검사법(ELISA)을 통하여 확인하였다. 순수 분리한 융합 단백질은 센트리콘 30(Centricon 30, Amicon, USA)을 사용하여 4℃에서 2000×g, 30분간 원심분리하여 농축하였다.
실시예 5
정제된 TNFR1-TNFR1/Fc 및 TNFR2-TNFR2/Fc의 SDS-PAGE
프로테인 A 컬럼을 이용하여 순수 정제된 단백질을 환원제(디설파이드 결합파괴)인 DTT를 첨가한 환원 조건과 DTT가 포함되지 않은 비환원 조건으로 SDS-PAGE를 수행하였다. 각각의 SDS-PAGE상에서의 분자량 측정 결과는 다음의 표와 같다.
TNFR/Fc 단백질은 세포내에서 이량체로 존재함을 확인할 수 있었다. TNFR1-TNFR1-Ig의 아미노산 서열로 추정한 분자량은 약 70 kDa, SDS-PAGE 상에서 약 102 kDa으로 추정된다. 이 차이는 당단백질의 전기영동 상에서 나타나는 일반적인 현상으로 당화된 부분에 의해 전기영동상에서의 이동속도가 늦어지므로 일어나는 특징이다.
실시예 6
단순/연쇄 융합된 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질의 TNF 알파(α)와 TNF (β)의 세포 독성 중화 효과 실험
TNFR/Fc 융합 단백질의 TNF 알파(α)와 TNF 베타(β)에 유도되는 세포독성을 억제하는 효과를 검사하기 위하여 L929 세포[ATCC, Mus musculus (mouse), NCTC clone 929(derivative of Strain L; L-929;L cell]를 이용하였다. 이 분석은 TNF에 의해 유도되는 세포독성을 억제하는 TNFR의 활성[스칼론(Scallon) 등, Cytokine 7:759, 1995)에 기초를 두고 있다.
L929 세포를 96구 판(96-well plate)에 3×104cells/well이 되게 접종하고, 37℃, CO2배양기에서 24시간 배양한다. 이어서, 엑티노마이신 디(Actinomycin D,Sigma, USA)를 3㎍/㎖이 되게 첨가하고, 100% 세포독성을 나타내는 농도(0.5 ∼ 2 ng/㎖)의 TNF 알파 및 베타(R&D, USA)와 10배씩 연속적으로 희석한 TNFR 표본과 함께 16~18시간 배양한다. 이어서 96구 판에 있는 세포를 염색시약인 크리스탈 바이올렛(crystal violet, Wako pure chemical industrips, Japan)으로 염색하고 세포 활성도는 흡광도 595 nm에서 흡광기(spectrophotometer, Bio-RAD, Model-550, Japan)를 이용하여 측정하였다.
하기의 표 10은 각 TNFR/Fc 융합 단백질의 억제농도 중간값(IC50)으로서, 단순 이량체 형태의 융합 단백질 (TNFR1-Ig, TNFR2-Ig)보다 연쇄체 형태의 융합 단백질(TNFR1-TNFR1-Ig, TNFR1-TNFR2-Ig, TNFR2-TNFR1-Ig, TNFR2-TNFR2-Ig)이 두 종류의 TNF에 대한 세포독성을 억제하는 효과가 모두 현저히 높은 것을 알 수 있다. 또한 기존의 단순 이량체 형태와 본 발명의 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질이 TNF 알파(도 5)와 베타(도 6)의 세포독성을 억제하는 효과를 대비하면 본 발명의 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질이 TNF 알파와 베타의 세포독성을 현저하게 억제하는 것이 더욱 명백하게 나타난다.
[표 10]
실시예 7
단순/연쇄 융합된 이량체 CD2/Fc 융합 단백질과 CTLA4/Fc 융합 단백질의 활성 면역 세포 증식 억제 효과 실험
발열 환자의 B 림프구에 엡스타인-바 바이러스(Ebstein-Barr virus)를 형질 감염시켜 만든 B 림프구 세포주인 WT100BIS를 T 림프구의 항원제시세포로 사용하기 위하여 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640에 배양하였다. 이를 2,000rpm에서 2분간 침전시킨 후 5.0×105/㎖이 되도록 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640에 다시 푼 다음 3,000 라드(rd)의 감사선(-ray)으로 조사 (irradiation)시켰다.
T 림프구는 건강한 사람의 혈액에서 피콜-하이팩 [Ficoll-hypaque (Amersham, USA)]를 이용하여 분리한 다음 2.0×106/㎖이 되도록 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640으로 배양하였다.
일차 혼합 림프구 반응 [Primary Mixed Lymphocyte Reaction(MLR)]을 실행하기 위하여 WT100BIS와 T 림프구를 150mm 세포 배양 접시에 각각 15㎖씩 섞고 3일간 배양한 후에 15㎖의 10% 우테아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640을 첨가하여 3일간 더 배양하였다. 총 6일간 배양한 후에 상기의 방법대로 피콜-하이팩 [Ficoll-hypaque (Amersham, USA)]을 이용하여 살아있는 T 림프구를 순수 분리. 분리한 림프구는 45% 우태아 혈청, 45% 알피엠아이(RPMI) 1640, 10% 디엠에스오(DMSO)로 만든 배지를 이용하여 얼린 후 액체질소에 보관하였다.
일차 혼합 림프구 반응을 시킨 T 림프구를 2차 혼합 림프구 반응을 실시하기 위하여 녹인 후, 알피엠아이(RPMI) 1640 배지를 이용하여 2회 세척하였고 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640에 3.0x105cells/㎖이 되도록 하였다.
항원제시세포로 사용할 WT100BIS는 새로 배양하여 상기의 방법대로 배양한 후 3,000 라드(rd)의 감사선(-ray)으로 조사(irradiation)시켜 준비하고 7.5× 104Cells/㎖이 되도록 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640에 준비하였다. 준비된 WT100BIS를 100㎕씩 96구 평판 세포 배양판에 넣고 CD2/Fc 및 CTLA4/Fc 융합 단백질을 최종 농도 10, 1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4㎍/㎖ 되도록 혼합한 후 상기의 일차 혼합 림프구 반응을 시킨 T 림프구를 100㎍씩 첨가하였다. 이를 5% CO237℃ 배양기에서 2일간 배양한 후, 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640를 100㎕ 첨가하고 2일간 더 배양하였다. 총 4일간의 배양 중 마지막 6시간은3H-타이미딘[thymidine (Amersham)]을 1.2μCi/㎖가 되도록 첨가하여 배양하였다.
배양이 종료된 후 96구 세포 배양판을 4℃, 110×g, 10분간 원심 분리하여 T-림프구를 침전시켜 상층액을 제거하였고, 200㎕ 1X 인산완충용액으로 세척하였다. 동일한 조건으로 원심 분리한 후 인산완충용액을 제거하고, 남아있는3H-타이미딘 [thymidine (Amersham)]을 제거하기 위해 차가운 200㎕ 10% 티씨에이 [trichloridic acid(TCA, Merck)]를 첨가하고 2분간 흔들어 준 후 5분간 4℃에서 반응시켰다.
위와 동일한 조건에서 원심 분리한 후 상층액을 제거하였으며 차가운 200㎕ 70% 에탄올을 첨가한 후 4℃에서 5분간 방치하여 T 림프구를 고정하였다. 원심 분리한 후 상층액을 제거하였고, 상기의 방법과 동일한 조건으로 10% 티씨에이(TCA)를 처리하여 남아있는3H-타이미딘 [thymidine (Amersham)]를 완전히 제거하였다.
여기에 100㎕ 2% 에스디에스 [SDS(pH 8.0)]/0.5N 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켜 세포 용해를 실시하였고, 25℃ 110×g 10분간 원심 분리하여 T 림프구를 침전시키고 상층액 중 50㎕를 96구 샘플판(Wallac)으로 옮겼다. 상층액에 1.5배의 옵티페이스 슈퍼믹스 [OptiPhase SuperMix(Wallac)]를 넣어 5분간 흔들어 준 후 액체 흡광기 [1450 MicroBeta TriLux microplate liquid scintillation and luminescence counter(Wallac)]를 이용하여3H에 대한 cpm값을 측정하여 T 림프구의 증식여부를 확인하였다. 도 18 및 도 19에서와 같이 연쇄 융합된 이량체 CD2/Fc 및 CTLA4/Fc가 단순 융합된 이량체에 비해 탁월하게 활성 면역세포 증식을 억제함을 알 수 있었다.
실시예 8
당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질의 마우스 혈중 농도 반감기 증가 효과 실험
당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [mgTNFR1-TNFR1/Fc]2, [mgTNFR2-TNFR2/Fc]2, [mgCD2-CD2/Fc]2및 [mgCTLA4-CTLA4/Fc]2의 혈중 반감기 측정은 마우스 (ICR, 샘타코)의 복강에 정제된 각 융합 단백질 5㎍을 주사한 후 최고 120 시간(5일)동안 일정 간격으로 혈액을 채취한 후 단백질의 농도를 효소면역 검사법(ELISA)을 이용하여 확인하므로 써 수행하였다. 도 20, 21, 22에서와 같이 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질이 자연 형태의 동일 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질에 비해 혈중 반감기가 증가되었음을 알 수 있었으며 이는 지속적인 효과를 통해 효능증대를 기대할 수 있는 결과라 할 수 있다.
실시예 9
DBA/1 생쥐의 콜라겐 유도 관절염에 대한 단순/연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc융합 단백질의 효과 실험
아스로젠 씨아이에이 보조제(Arthrogen-CIA ajuvant, Chondrex, USA) 중의 0.05M의 아세트산에 2mg/㎖의 농도로 녹인, 타입 Ⅱ 콜라겐을 DBA/1 생쥐 한 마리당 꼬리에 100 ㎍씩 주입하여 콜라겐 유도 관절염(CIA; Collagen Induced Arthritis)을 발병시켰다. 부스팅(Boosting)은 3주 후에 하였으며 불완전 프로인트보조제(incomplete Freund's adjuvant, Difco, USA)를 이용하였다.
DBA/1 생쥐에 타입 Ⅱ 콜라겐 100㎍으로 면역화시킨 후에 3-4 주 후에 관절염 증상이 나타났다. 증상이 나타난 후 3-5일이 지나면 생쥐의 발이 빨갛게 부어오르며, 염증성 관절염(inflammatory arthritis)은 3-4주 이상 지속되었으며, 염증이 약화되어도 관절은 영구히 경직된다. 관절염 심도의 주관적 척도를 나타내는 표 11에 근거하여 1주일에 2-3회 측정하였다(각 실험군에서 5마리 생쥐에서의 평균값을 구함). 콜라겐 유도 관절염에 대한 단순 및 연쇄체 형태의 이량체의 TNFR/Fc 효과를 측정하기 위하여 생쥐에 TNFR/Fc 또는 인산완충 생리식염수(PBS)를 복강내로 주사하였다. TNFR/Fc는 실험군당 5마리의 생쥐에 제19일 내지 45일동안 2일에 한번씩 10 ㎍을 주사하였다(도 7의 화살표시). 5마리의 대조군 생쥐에는 PBS를 주사하였다. 상기 측정결과를 나타낸 도 1에서와 같이, 기존 단순 이량체 형태의 TNFR/Fc 융합단백질을 주입한 생쥐의 경우 대조군인 인산완충 생리식염수를 주사한 생쥐에서 발병한 관절염 지표의 수치와 비교할 때 약 26∼38% 감소된 효과를 보였으나 (제 45일 측정치를 기준), 연쇄체 형태의 이량체인 TNFR1-TNFR1-Ig, TNFR2-TNFR2-Ig를 주입한 경우는 42~55% 감소된 효과를 나타냈다. 이와같이 단순 이량체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질에 비해 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질이 생쥐의 관절염을 현저히 감소시키는 것을 알 수 있다.
[표 11]
*생쥐의 각 다리의 심도스코어를 더하여 계산하며 한 마리당 16이 최고이다.
상기 결과들은 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질이 생쥐의 CIA의 발병율을 저하시키는데 기존의 단순 이량체 형태의 융합 단백질에 비해 효과적이며, 따라서 관절염 치료에 사용함에 있어서 연쇄체 형태의 단백질제제가 기존의 단백질 제제에 비해 효과적인 치료제로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명의 연쇄체 단백질, 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 이의 당화 수식 단백질은 증가된 효능 및 고도의 안정성을 나타내고 고수율로 생성할 수 있다.

Claims (35)

  1. 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 C-말단에 동일하거나 상이한 다른 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 N-말단이 결합된 연쇄체 단백질.
  2. 동일한 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합되어 증가된 효능 및 고도의 안정성을 갖는 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 면역글로불린이 IgG인 이량체 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 면역반응에 관여하는 단백질이 사이토카인, 사이토카인 수용체, 접착 분자, 종양 괴사 인자 수용체, 수용체 티로신 키나제, 케모카인 수용체 및 세포 표면 수용체의 세포외역 가용성 부위로 이루어진 그룹중에서 선택된 한 종인 이량체 단백질.
  5. 제4항에 있어서, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-17, TNF, TGF, IFN, GM-CSF, G-CSF, EPO, TPO, M-CSF, GHR, IL-13R, IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-9R, IL-15R, TNFR, TGFR, IFNR, 인터페론-αR, -βR 및 -R, GM-CSFR, G-CSFR, EPOR, cMpl, gp130, Fas(Apo 1), CCR1, CXCR1-4, TrkA, TrkB, TrkC, H사, REK7, Rse/Tyro-3, 간세포 성장 인자 R, 혈소판-유래된 성장 인자 R, Flt-1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD22, CD27, CD28, CD30, CD31, CD40, CD44, CD100, CD137, CD150, LAG-3, B7, B61,β-뉴렉신, CTLA-4, ICOS, ICAM-1, 보체 R-2(CD21), IgER, 리소좀막 gp-1,α2-마크로글로불린 수용체-연관된 단백질 및 나트륨배설 펩타이드 R로 이루어진 그룹중에서 선택되는 이량체 단백질.
  6. 제2항에 있어서, 상기 단량체 단백질이 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 이량체 단백질.
  7. 동일한 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물.
  8. 제7항에 있어서, 면역글로불린이 IgG인 DNA 작제물.
  9. 제7항에 있어서, 면역반응에 관여하는 단백질이 사이토카인, 사이토카인에 대한 수용체 및 세포 표면 수용체의 세포외역 가용성 부위로 이루어진 그룹중에서선택된 한 종인 DNA 작제물.
  10. 제9항에 있어서, 사이토카인이 IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, TNF, TGF, INF, GM-CSF 및 G-CSF로 이루어진 그룹중에서 선택되고, 사이토카인에 대한 수용체가 IL-IR, IL-2R, IL-4R, IL-6R, IL-7R, TNFR, TGFR, INFR, GM-CSFR 및 G-CSFR로 이루어진 그룹중에서 선택되며, 세포 표면 수용체가 CD2, CD4, CD40, CTLA-4, ICOS 및 ICAM-1로 이루어진 그룹중에서 선택되는 DNA 작제물.
  11. 제7항에 있어서, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 17 또는 서열번호 19의 핵산 서열을 갖는 DNA 작제물.
  12. 제7항의 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드.
  13. 제12항에 있어서, 플라스미드 pTR11-Top10'(기탁번호: KCCM 10288), 플라스미드 pTR22-Top10'(기탁번호: KCCM 10289), 플라스미드 pCD22Ig(기탁번호: KCCM 10402) 또는 플라스미드 pCT44Ig(기탁번호: KCCM 10400)인 재조합 발현 플라스미드.
  14. 제12항의 재조합 발현 플라스미드로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
  15. 제14항에 있어서, 포유동물 세포인 형질전환체 또는 형질감염체.
  16. 제14항 또는 15항에 있어서, 재조합 발현 플라스미드가 플라스미드 pTR11-Top10'(기탁번호: KCCM 10288), 플라스미드 pTR22-Top10'(기탁번호: KCCM 10289), 플라스미드 pCD22Ig(기탁번호: KCCM 10402) 또는 플라스미드 pCT44Ig(기탁번호: KCCM 10400)인 형질전환체 또는 형질감염체.
  17. 제16항에 있어서, 세포주 TR11Ig-CHO(기탁번호: KCLRF-BP-00046) 또는 TR22Ig-CHO(기탁번호: KCLRF-BP-00047)인 형질전환체 또는 형질감염체.
  18. 제14항의 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를, 동일한 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지 부위에 결합된 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물이 발현되도록 하기에 적합한 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 상기 단량체 단백질로부터 형성된 이량체 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하여, 상기 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 제조하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 연쇄 융합된 단랑체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물이, 면역글로불린 Fc 조각을 코딩하는 단편과 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편을 결합시켜 단순 융합된 단량체 단백질을 코딩하는DNA 작제물을 제조하고, 제조된 DNA 작제물을, 상기 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편과 동일한 제2의 DNA 단편과 결합시켜 제조된 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물에 당화 모티브를 삽입시킴을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 당화 모티브가 세포외역 가용성 부위 두 개가 서로 결합되는 부위 근처에 삽입되는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 연쇄 융합된 단량체 단백질에 리더 서열을 포함시킴을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 연쇄 융합된 단량체 단백질이 CTLA4이고 상기 리더 서열이 MACLGFQRHKAQKNLAARTWPCTLLFFIPVFCKA의 아미노산 서열을 갖는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 리더 서열이 ACLGFQRHKAQKNLAA이 제외된 MRTWPCTLLFFIPVFCKA의 아미노산 서열을 갖는 방법
  25. 제18항 내지 24항중 어느 한 항에 있어서, 형질전환체 또는 형질감염체가 포유동물 세포인 방법.
  26. 동일한 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합되고 당화되어 증가된 효능 및 고도의 안정성을 갖는 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 상기 단량체 단백질이 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 22 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 이량체 단백질.
  28. 동일한 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되고 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물.
  29. 제28항에 있어서, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 21 또는 서열번호 23인 DNA 작제물.
  30. 제28항의 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드.
  31. 제30항에 있어서, 플라스미드 pTR11Ig-MC(KCCM 10404), pTR22Ig-MG(미정),pCD22Ig-MG(KCCM 10401) 또는 pCT44Ig-MG(KCCM 10399)인 재조합 발현 플라스미드.
  32. 제30항의 재조합 발현 플라스미드로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
  33. 제32항에 있어서, 포유동물 세포인 형질전환체 또는 형질감염체.
  34. 제2항에 따른 이량체 단백질을 포함하는 약제학적 또는 진단학적 조성물.
  35. 제26항에 따른 당화된 이량체 단백질을 포함하는 약제학적 또는 진단학적 조성물.
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