DE60109412T2

DE60109412T2 - Therapeutische peptide

Info

Publication number: DE60109412T2
Application number: DE60109412T
Authority: DE
Inventors: Gerard Michael TOVEY; Pierre Eid
Original assignee: Medarex LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 2000-01-25
Filing date: 2001-01-25
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2021-01-26
Also published as: JP2003525040A; WO2001055215A1; ES2240475T3; AU2865801A; US20070042963A1; EP1250358A1; DE60109412D1; ATE291033T1; US20040067888A1; GB0001712D0; EP1250358B1; CA2397267A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutische Peptide zur Verwendung als Typ 1-Interferon (Typ 1-IFN)-Antagonisten, insbesondere solche Peptide, die sich von einem extrazellulären Anteil des menschlichen Typ 1-IFN-Rezeptors (IFN-R) ableiten.
Hintergrund der Erfindung
Die Typ 1-Interferone stellen eine Familie von multifunktionalen Cytokinen, die die Kommunikation zwischen Zellen höherer Organismen vermitteln, dar. Sie umfassen IFN-β, IFN-ω, IFN-τ und verschiedenen Unterarten von IFN-α. Die Interferone stellen die erste Verteidigungslinie des Körpers gegen virale Infektionen und die Entwicklung von Krebs dar.
Bei abnormaler Produktion von IFN-α wurde jedoch berichtet, dass sie mit mehreren Autoimmunkrankheiten in Zusammenhang steht, umfassend systemischer Lupus erythematodes (Shiozawa et al., 1992, Arthr. & Rheum., 35, 417), rheumatoide Arthritis (Hopkins & Meager, 1988, Clin. Exp. Immunol., 73, 88), Typ 1-Diabetes (Stewart et al., 1993, Science, 260, 1942; Huang et al., 1994, Cell, 1, 469), Psoriasis (Shmid et al., 1994, J. Interferon Res., 14, 229) und Multiple Sklerose (Degré et al., 1976, Acta Neurol. Scand., 53, 152). Mehrere klinische Berichte beschreiben ebenfalls die Entwicklung von Symptomen der Autoimmunkrankheit oder die Verschlimmerung der zugrunde liegenden Autoimmunkrankheit bei Patienten, die mit rekombinantem IFN-α2 behandelt wurden (siehe beispielsweise Wada et al., 1995, Am. J. Gastroenterol., 90, 1366 und Perez et al., 1995, Am. J. Hematol., 49, 365). Ferner wurde bei AIDS-Patienten eine direkte Korrelation zwischen dem Pegel von zirkulierendem IFN-α und dem Fortschreiten der Krankheit berichtet (Mildvan et al., 1992, The Lancet, 339, 353). Die Ergebnisse anderer Untersuchungen legen nahe, dass IFN-α ferner eine wichtige Rolle bei der Allotransplantatabstoßung (Afifi et al., 1985, J. Immunol., 134, 3739) und bei der Transplantat-versus-Wirt-Reaktion (Graft-versus-Host Krankheit GVHD) (Cleveland et al., 1987, Cell Immuno1., 110, 120) spielt.
Es wurde beispielsweise gezeigt, dass die Behandlung von Cynomologous-Affen mit einem anti-IFN-R-monoklonalen Antikörper, der mit Typ 1-IFN an den IFN-R kompetitiv bindet, zu einem deutlichen Anstieg des Hautallotransplantat-Überlebens führt. Es wurde auch gezeigt, dass die Behandlung von Tieren mit dem gleichen Antikörper zusammen mit einer von unterhalb der Wirkung liegenden Dosis von Cyclosporin A zu einem verlängerten Allotransplantat-Überleben bei Tieren mit verschiedenen Haupthistokompatibilitätsklasse I- und II-Antigenen führt. Von der Behandlung von Cynomologous-Affen mit einem Antikörper, der die IFN-Bindung an den IFN-R kompetitiv hemmt, zusammen mit einer unterhalb der Wirkung liegenden Dosis von Cyclosporin A wurde außerdem gefunden, dass sie zu einer deutlichen Hemmung der Transplantat-versus-Wirt-Reaktion bei Tieren, die mit allogenetischem Knochenmark von Haupthistokompatibilitätsklasse I- und II-Antigen verschiedenen Tieren transplantiert sind, führt (Tovey et al., 1996, J. Leuk. Biol., 59, 512–517; Benizri et al., 1998, J. IFN & Cytokine Res., 18, 273–284).
Mit Simian-Immunodefizienz-Virus (SIV) infizierte Makaken werden als ein Modell, das zur Untersuchung von Wirtsfaktoren, die eine Rolle bei der Entwicklung von AIDS spielen, erachtet. Bei diesem Tiermodell wird die Produktion von IFN-α während der Erstinfektion beobachtet, sie reicht jedoch nicht aus, um die Bildung einer chronischen Infektion und die Entwicklung eines Immundefektes zu verhindern. Eine zweite IFN-α-Produktionsphase bei SIV-infizierten Makaken wird nach mehreren Monaten beobachtet. Es gibt einen engen Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von Interferon in dieser zweiten Phase und dem Verlust von CD4+-Zellen, was mit der Entwicklung von klinischen Anzeichen der Krankheit einhergeht.
Es wurde gefunden, dass die Verabreichung eines anti-IFN-R-Antikörpers, der kompetitiv an den IFN-R mit Typ 1-IFN bindet, bei SIV-infizierten Makaken mit hohen Pegeln von zirkulierendem IFN-α zu einem ausgeprägten und verlängerten Anstieg des Pegels von zirkulierenden CD4+-Zellen führt (Khatissian et al., AIDS & Human Retroviruses, 12, 1273–1278). Daher sind Typ 1-IFN-Antagonisten bei der HIV-Infektionsbehandlung oder -vorbeugung sowie bei mehreren anderen Krankheiten, von denen gezeigt wurde, dass Typ 1-IFN bei der Krankheitsentwicklung eine Rolle spielt, von Interesse.
Der menschliche IFN-R ist einer Heterodimer, das aus zwei Polypeptidketten, IFNAR1 und IFNAR2, zusammengesetzt ist. Das Vorhandensein der beiden Ketten ist für die Bindung von Typ 1-IFN mit hoher Affinität erforderlich. Die menschlichen Gene für IFNAR1 und IFNAR2 wurden kloniert (Uze et al., 1990, Cell, 60, 224–234; Novick et al., 1994, Cell, 77, 391–400). Die Expression der IFNAR1-Kette in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen ermöglichte die Herstellung einer Reihe von rekombinanten löslichen Proteinen, die der extrazellulären Domäne von IFNAR1 entsprechen, entweder als native, isolierte Sequenzen oder als mit den γ- oder κ-Ketten des menschlichen IgG1 verbundenen Proteinen (Benoit et al., 1993, J. Immunol., 150, 707–716).
Das U.S.-Patent Nr. 5,861,258 betrifft die Expression des menschlichen Typ 1-IFN-Rezeptors in nichtmenschlichen Zellen und die Verwendung von solchen Zellen zum Screening nach α-Interferon-Agonisten.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurden kurze Peptide von der IFNAR1-Kette abgeleitet, die besonders wirksame Typ 1-IFN-Antagonisten sind. Bei diesen Peptiden geht man davon aus, dass sie von der Bindungsstelle für menschliches Typ 1-IFN auf dessen Rezeptor abstammen.
Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid, das aus

(i) FSSLKLNVY (Sequenz ID Nr. 1);
(ii) dem Peptid der Sequenz ID Nr.1 mit einem weiteren Asparaginrest (N) am C-Terminus oder einem weiteren Glutaminsäurerest (E) am N-Terminus;
(iii) NFSSLKLNVYE (Sequenz ID Nr. 2);
(iv) einem Peptid gemäß einem der vorstehenden Punkte (i) bis (iii), wobei der zweite Serinrest vom N-Terminus durch einen Alaninrest substituiert ist,

Diese Peptide sind in der Lage, die Bindung eines Typ 1-IFN an den menschlichen IFN-R zu hemmen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt in %-Werten die Typ 1-IFN-Bindung an den IFN-R, wie durch kultivierte Daudi-Zellen in Gegenwart des monoklonalen Antikörpers 64G12 oder des gleichen Antikörpers zusammen mit einem aus der IFNAR1-Kette abgeleiteten Peptid oder Polypeptid dargestellt (löslicher IFNAR1 = Aminosäurereste 1 bis 427 des extrazellulären Domänenbereichs der IFNAR1-Kette, wie von Uze et al., 1990, Cell, 60, 224–234 berichtet; IFNAR1-Pep = Sequenz ID Nr. 2).
2 zeigt Ergebnisse von ELISA-Bindungstests des Peptids der Sequenz ID Nr. 2 und veränderten Versionen davon an den monoklonalen Antikörper 64G12.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Peptide gemäß der Erfindung umfassen Peptide, die aus einem Teil der nativen IFNAR1-Sequenz bestehen. Von diesen Peptiden ist das 9-mer der Sequenz ID Nr. 1, das den Aminosäureresten 88–97 der IFNAR1-Kette entspricht, besonders bevorzugt. Weitere bevorzugte Peptide gemäß der Erfindung, die der nativen IFNAR1-Sequenz entsprechen, sind die 10-mere mit einem zusätzlichen Asparaginrest (N) am C-Terminus der Sequenz ID-Nr. 1 oder einem zusätzlichen Glutaminsäurerest (E) am N-Terminus der Sequenz ID Nr. 1 und das 11-mer NFSSLKLNVYE (Sequenz ID Nr. 2).
Die Peptide gemäß der Erfindung, die einer nativen Sequenz der IFNAR1-Kette entsprechen, sind in der Lage, den anti-IFN-R-monoklonalen Antikörper 64G12, der von der European Collection of Cell Structures (früher als European Collection of Animal Cell Cultures, ECACC, bekannt) unter der Hinterlegungsnummer 92022605 erhältlich ist (die Hybridomhinterlegung wurde am 26. 2. 1992 im Namen des Laboratoire Europeen De Biotechnologie S.A. mit seinem eingetragenen Büro in der Boulevard Camelinat 28, 92233 Gennevilliers, Frankreich, vorgenommen), oder einen funktionell äquivalenten Antikörper an den extrazellulären Domänenteil des IFNAR1 spezifisch zu binden. Solche Antikörper, die mit Typ 1-IFN an den IFN-R kompetitiv binden, sind in der veröffentlichten internationalen Anmeldung WO 93/20187 beschrieben. Peptidanaloga gemäß der Erfindung weisen üblicherweise auch die Fähigkeit auf, an Mab 64G12 oder an einen Antikörper, der kompetitiv mit Mab 64G12 an das gleiche Epitop der IFNAR1-Kette bindet, zu binden.
Ein wie vorstehend beschriebenes Peptid gemäß der Erfindung kann mit einer zusätzlichen nicht-IFNARI-Sequenz am C- und/oder am N-Terminus verbunden sein, was die Funktion als Typ 1-IFN-Antagonist nicht aufhebt.
Ein Peptid gemäß der Erfindung kann bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Vielzahl von Krankheiten, die durch eine abnormale oder verlängerte Produktion von Typ 1-IFN gekennzeichnet sind, Anwendung finden. Solche Krankheiten umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Allo- oder Xenotransplantat-Abstoßung, Transplantat-versus-Wirt-Reaktion, Autoimmunkrankheiten, die mit abnormaler Produktion von Typ 1-IFN in Zusammenhang stehen, umfassend systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis; Typ 1-Diabetes, Psoriasis und multiple Sklerose und Immundefektstörungen, die mit der Produktion von Typ 1-IFN in Zusammenhang stehen, wie z.B. SCID und AIDS.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid gemäß der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst. Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung kann in üblicher Weise formuliert sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Peptids gemäß der Erfindung zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder der Vorbeugung einer Krankheit, die aus Allotransplantat- oder Xenotransplantatabstoßung, Transplantat-versus-Wirt-Reaktion, Autoimmunkrankheiten, die mit abnormaler Produktion von Typ 1-IFN in Zusammenhang stehen und Immundefektkrankheiten, die mit Typ 1-IFN-Produktion in Zusammenhang stehen, ausgewählt ist, bereit. Es ist vorteilhaft, dass ein Peptid gemäß der Erfindung in Dosierungen, die in der Peptidtherapeutik üblich sind, verabreicht werden kann.
Ein Peptid gemäß der Erfindung kann durch in vivo-Expression einer korrespondierenden Nucleinsäure, die das Peptid kodiert, verabreicht werden. Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Nucleinsäure, die zum Exprimieren eines Peptids oder Polypeptids gemäß der Erfindung in menschlichen Zellen befähigt ist, zur Verwendung als Typ 1-IFN-Antagonist bereit. Eine solche Nucleinsäure kann ein viraler Vektor oder ein nichtviraler Vektor sein, umfassend solche Vektoren, die in einer Form zur Abgabe einer Nucleinsäure gemäß der Erfindung an menschliche Zellen verpackt sind. Die Nucleinsäuren gemäß der Erfindung umfassen somit virale Vektoren in einer Form, die zur viralen Vektortherapie befähigt sind, beispielsweise einen rekombinanten Retrovirus, einen Adenovirus oder einen attenuierten Influenzavirus. Eine Nucleinsäure gemäß der Erfindung kann alternativ ein nichtviraler Vektor sein, beispielsweise in Liposomen verpackt oder in Surfactin-enthaltenden Teilchen zur Vektorabgabe verpackt.
Ein Peptid oder Polypeptid gemäß der Erfindung kann durch eine Synthese unter Verwendung üblicher Verfahren oder durch Expression einer Nucleinsäure in Wirtszellen hergestellt werden. Es kann durch Fragmentierung einer längeren Sequenz, beispielsweise eines Fusionspolypeptids mit einer entsprechenden Proteasespaltungsstelle zur Spaltung, hergestellt werden, um das gewünschte Peptid oder Polypeptid gemäß der Erfindung zu erhalten.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung:
Beispiele
Beispiel 1
Hemmung der Typ 1-IFN-Bindung an den IFN-R auf Daudi-Zellen
Kulturen von exponentiell wachsenden Daudi-Zellen (2 Millionen Zellen/0,2 ml RPMI 1640 Medium mit 10% fötalem Kälberserum) wurden mit Mab 64G12 (2 μg), allein oder zusammen mit folgendem behandelt: (i) einem löslichen, über Affinitätschromatographie gereinigten, rekombinanten Polypeptid, das den Aminosäuren 1 bis 427 der extrazellulären Domänenbereichssequenz der IFNAR1-Kette entspricht, wie von Uze et al., 1990, Cell, 60, 224–234 berichtet (hergestellt wie von Benoit et al., 1993, J. Immunol., 150, 707–716 und in der offengelegten Internationalen Anmeldung WO92/18626 beschrieben, und zunächst auf einer NINTA-Agarosesäule (Qiagen) gereinigt und anschließend mit 300 mM Imidazol eluiert. Der eluierte, teilweise gereinigte, lösliche IFNAR1 wurde dann auf eine 5,0 ml 64G12 Mab-Sepharosesäule aufgetragen und mit 0,1 M Glycin, pH 2,8 eluiert. Der eluierte IFNAR1 war rein, wie durch SDS-PAGE unter denaturierenden Bedingungen ermittelt) oder (ii) dem Peptid der Sequenz ID Nr. 2 (dem 11-mer). Nachfolgend wurde ¹²⁵I-markiertes menschliches IFN-α2 zugegeben (Iodierung wie von Mogensen et al., 1981, Int. J. Cancer, 28, 575–582 beschrieben; 90000 cpm, 0,13 nM) und 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit Kulturmedium, das 1% fötales Kälberserum enthielt, gewaschen und das Zellpellet wurde in einem Gammazähler gezählt. Die IFN-Bindung in %-Werten ist in 1 gezeigt.
Das 11-mer stellte in Gegenwart des anti-IFN-R monoklonalen Antikörpers 64G12 die IFN-Bindung zu einem hohen Grad wieder her. Das gleiche Peptid beeinflusst nicht die Fähigkeit eines nicht-neutralisierenden anti-IFN-R-Antikörpers (34F10), der ein von der Ligandenbindungstelle beabstandetes Epitop des IFN-R erkennt, an den IFN-R zu binden (Eid und Tovey, JICR, 15, 205–211, 1995).
Sowohl bei dem 9-mer als auch bei dem 11-mer wurde durch ELISA gezeigt, dass sie spezifisch den Mab 64G12 binden, wie im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben ist.
Beispiel 2
Binden von Peptiden an Mab 64G12
Das 11-mer (Sequenz ID Nr. 2) und mehrere modifizierte Versionen dieses Polypeptids, die durch Deletion oder Substitution abgeleitet waren, wurden mit ELISA auf die Fähigkeit, den Mab 64G12 zu binden, getestet. Die getesteten, mutierten Versionen der Sequenz ID Nr. 2 sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Peptide wurden am N-Terminus mit einer Abstandshaltersequenz SGSG zwischen dem Peptid und dem Biotin, d.h. mit einem Biotin-SGSG-Peptid, biotinyliert.
Das ELISA-Screening zur Mab 64G12-Bindungsfähigkeit wurde unter Verwendung von Nunc Maxisorbplatten, die mit 5 μg/ml, 100 μl/Vertiefung, Streptavidin beschichtet waren, über Nacht bei 37°C durchgeführt. Die Platten wurden dann 1 Stunde bei 20°C mit 200 μl/Vertiefung PBS, das 0,1% Tween 20, 1% Natriumcaseinat (GAST) enthielt geblockt. Die Peptide wurden durch Zugeben von 50 μl DMSO und 0,6 ml 40%-igem Acetonitril pro Röhrchen gelöst. Zur Peptidbeschichtung wurden 100 μl PBS, 0,1% Tween 20 (PT) zu jeder Vertiefung zugegeben, gefolgt von 2 μl jeder Peptidlösung (Endkonzentration des Peptids 20 μM). Nach 30 Minuten wurde der monoklonale Antikörper mit 1 μg/ml in PT für 1 Stunde bei 20°C zugegeben. Die Platten wurden gewaschen und 100 μl/Vertiefung einer 1/2000 Verdünnung von mit Meerrettichperoxidase markiertes Ziege-anti-Maus-IgG (H + L) in CAST plus 1% Schafserum (CASS) wurden für 1 Stunde bei 20°C zugegeben. Nach dem Waschen wurden 100 μl ABTS-Substrat auf alle Vertiefungen verteilt. Die Extinktion wurde nach 10-minütiger und nach 45-minütiger Inkubation auf einem Plattenzähler unter Verwendung von zwei Wellenlängen (405 und 490 nm) zur Hintergrundkorrektur gemessen. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
Die folgenden Schlüsse können aus 2 hinsichtlich der Bedeutung der Positionen in der Sequenz ID Nr. 2 für die Mab 64G12-Bindung gezogen werden:

– das N-terminale Asparagin (N) an Position 1 ist für die Bindung nicht kritisch;
– die C-terminale Glutaminsäure (E) an Position 11 ist für die Bindung nicht kritisch;
– Deletion von Positionen 2 (F) und 3 (S) verringert die Bindung;
– Deletion von Position 4 (S) oder 5 (L) verhindert die Bindung mit dem Peptid KLNVYE, wobei man nur Hintergrundbindung sieht;
– Substitution des Serinrests an Position 4 durch Alanin oder Glycin beeinflusst die Bindung nicht wesentlich;
– Substitution des Leucinrests an Position 5 durch Alanin oder Glycin verringert die Bindung erheblich;
– Position 6 (K) und Position 7 (L) sind für die Bindung kritisch;
– Substitution des Lysinrests an Position 6 oder des Leucinrests an Position 7 durch Alanin oder Glycin hemmt die Bindung vollständig;
– Verlust des Tyrosinrests an Position 10 verringert die Bindung dramatisch.

Es kann davon ausgegangen werden, dass die Peptidanaloga der Sequenz ID Nr. 1 oder der Sequenz ID Nr. 2, die die Fähigkeit beibehalten, spezifisch den Mab 64G12 oder einen funktionell äquivalenten Antikörper zu binden, wirksame Typ 1-IFN-Antagonisten sind.
Tabelle 1 Sequenzen und Analytische Daten von modifizierten Peptiden des Hu IFNAR1-Rezeptors

Claims

Peptid ausgewählt aus: (v) FSSLKLNVY (Sequenz ID Nr. 1); (vi) das Peptid der Sequenz ID Nr.1 mit einem weiteren Asparaginrest (N) am C-Terminus oder einem weiteren Glutaminsäurerest (E) am N-Terminus; (vii) NFSSLKLNVYE (Sequenz ID Nr. 2); (viii) Peptid gemäß einem der vorstehenden Punkte (i) bis (iii), wobei der zweite Serinrest vom N-Terminus durch ein Alaninrest substituiert ist.
Peptid gemäß Anspruch 1, das am C- und/oder N-Terminus mit einer weiteren nicht-IFNAR1-Sequenz verbunden ist, was die Funktion als Typ 1-Interferon (IFN)-Antagonist nicht aufhebt.
Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung als Typ 1-Interferon-Antagonist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Verwendung eines Peptids gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Allotransplantat- oder Xenotransplantatabstoßung, Transplantat-Wirt-Reaktion, Autoimmunkrankheiten, die mit anomaler Produktion von Typ 1-IFN in Zusammenhang stehen, und Immundefektstörungen, die mit Typ 1-IFN-Produktion in Zusammenhang stehen.
Nucleinsäure mit der Fähigkeit zum Exprimieren eines Peptids gemäß Anspruch 1 oder 2 in menschlichen Zellen zur Verwendung als Typ 1-IFN-Antagonist.
Nucleinsäure gemäß Anspruch 6, die ein viraler Vektor oder nicht-viraler Vektor ist, in einer Form zur Verabreichung der Nucleinsäure an menschliche Zellen.