CN101838323B - 一种抗血小板溶栓素及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，具体提供一种抗血小板溶栓素。本发明所述抗血小板溶栓素由α链、β链两条肽链组成，α链氨基酸序列如SEQID NO.1所示，β链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其比活力大于每毫克蛋白1000个活力单位。主要通过介导血小板聚集关键成分的血小板膜糖蛋白GPIb蛋白，通过阻断其与血浆vWF结合，阻止血小板粘附在血管内皮细胞壁上，从而抑制血小板聚集。本发明还提供所述抗血小板溶栓素的纯化方法，该方法特异性强、得率高、周期短。经药理、毒理、药效、药代试验表明，本发明所述抗血小板溶栓素是一种安全、高效的抑制血小板聚集药物，具有广泛的临床应用前景。

Description

一种抗血小板溶栓素及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗血小板溶栓素及其制备方法。

背景技术

随着人口老龄化和不良饮食习惯等危险因素的增加，心脑血管疾病的发病率和死亡率日趋上升，每年因心脑血管疾病死亡的人口，接近世界总死亡人口的1/4，严重影响人类的期望寿命和生存质量。

心脑血管性疾病的预防和治疗，一直是医学和药学的研究热点。抗血栓药物大体上分为抗凝药物、溶栓药物、抑制血小板聚集药物三种。抗凝药物多为凝血酶类的抑制剂，由于其不能直接溶栓和抗凝效果的非特异性，极易产生出血副作用或其他毒性；溶栓药物的溶栓效果迅速、直接，缺点在于血浆半衰期短，长时间使用往往引起出血，且溶栓后发生再梗的几率较高。血小板聚集是所有血栓形成的最后步骤，抑制血小板聚集可以最有效地抑制血栓的发生并预防再梗的形成，且对凝血系统影响小，出血副作用小，因此抑制血小板聚集的药物具有良好的发展前景。

抑制血小板聚集的药物主要作用于血小板膜糖蛋白(GP)，GP是介导血小板聚集的关键成份，也成为抗血栓药物的重要靶分子。例如，1995年美国FDA批准上市的Abciximab(阿昔单抗)就是血小板膜糖蛋白GP II b/IIIα的单克隆抗体，能有效抑制血小板的聚集，展示了抗血小板聚集药物在抗栓治疗和溶栓后预防再梗形成方面效果好、副作用小的优点。

近几年，随着对凝血过程中血小板作用的分子机理研究的深入，人们发现另一个十分看好的药物靶标血小板膜糖蛋白GPIb。GPIb是血小板表面最主要的糖蛋白之一，与GP II b/III α介导的粘附机理不同，它通常只介导在高剪切力作用下的粘附。GPIb与血浆或血管内皮细胞的vWF在高剪切力条件下相互作用，降低了血小板的流速。GPIb与vWF特异性结合，使血小板粘附到血管壁上，同时激活了其它受体的反应，包括激活GP II b/IIIα受体，使之与纤维蛋白原的结合，导致血小板聚集，从而引起血栓的形成。因此，通过阻断GPIb与血浆vWF结合，可阻止血小板粘附在血管内皮细胞壁上，抑制血小板聚集。由于这种作用不涉及凝血酶类及任何其他凝血因子，对血液凝固的过程没有直接影响，安全性高，因而发展成为特异性更好的抗血栓药物的新方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过介导血小板聚集关键成分的血小板膜糖蛋白GPIb蛋白的安全高效的新型抗血栓药物，其采用的技术方案如下：

一种抗血小板溶栓素，具有如下之一：

(a)由α链、β链两条肽链组成，α链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸且具有抗血小板聚集活性的由(a)衍生的蛋白质。

本领域技术人员熟知，本发明所述抗血小板溶栓素可在溶栓活性不受影响的条件下对其氨基酸序列进行改进，如将一个或几个氨基酸分别突变、缺失或往添加一个或几个氨基酸有时不影响蛋白质的活性，甚至一些氨基酸改变可能使溶栓特性优化，本领域的技术人员可以用标准做法来达到此目的。

更优选地，(b)中的蛋白质与(a)中的蛋白质的氨基酸序列至少有95％的一致性。

本发明所述抗血小板溶栓素比活力大于每毫克蛋白1000个活力单位。1个活力单位是指在体外测定血小板聚集时，能使350μl富血小板血浆(PRP)在15μl瑞斯托霉素(60mg/ml)诱导下的血小板聚集抑制百分率达到100±5时所需抗血小板溶栓素量。。

本发明所述抗血小板溶栓素因其在等电聚集时出现多种空间异构体，不具备单一等电点。

本发明所述抗血小板溶栓素与由保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC-C200970的杂交瘤细胞株1B9分泌的单克隆抗体特异性结合。

本发明所述抗血小板溶栓素经非还原SDS-PAGE电泳显示为一条带，还原SDS-PAGE电泳显示为两条带，分别称之为α链、β链，分子量分别为16000±5000、17000±5000道尔顿。

所述抗血小板溶栓素的双向电泳结果见图6，经双向电泳即等电聚集电泳和还原SDS-PAGE电泳后得到六个条带，其中α链和β链对应各有三个条带，六个条带经质谱做ID鉴定后表明，其分别为两个亚基的异构体形式，即该蛋白在等电聚集条件下因其结构方面的特异性，会产生异构体，从而导致双向电泳时会出现六个条带，不具备单一等电点。

本发明还提供所述抗血小板溶栓素的纯化方法，包括以下步骤：

步骤1：将尖吻蝮蛇粗毒溶解于缓冲液中，离心取上清；

步骤2：将步骤1所得上清液过DEAE阴离子交换层析柱进行层析，取经体外抗血小板活性检测对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集具有抑制作用的洗脱组分备用；

步骤3：将保藏编号为CCTCC-C200970杂交瘤细胞株1B9分泌的单克隆抗体与亲和层析载体偶联，制备免疫亲和层析柱；

步骤4：用步骤3中制备的免疫亲和层析柱层析纯化步骤2中所得洗脱组分，以洗脱缓冲液洗脱，收集取经体外抗血小板活性检测对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集具有抑制作用的洗脱组分，即为本发明所述抗血小板溶栓素。

本发明所述纯化方法应用现代免疫学原理，结合抗原抗体特异性反应与亲和层析技术，从尖吻蝮蛇粗毒中分离纯化抗血小板溶栓素。该方法首先制备初纯的抗血小板溶栓素，以该初纯物为抗原，制备针对其的特异性单克隆抗体，再与适宜的亲和层析载体偶联，制备成抗体亲和层析柱，使用偶联得到的抗体亲和层析柱，即可对原料粗毒经初步纯化得到的有相应活性的粗溶液进行免疫亲和层析，制备高纯的抗血小板溶栓素。

作为优选，步骤1所述缓冲液为pH 7.0～9.0的0.01～0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。

作为优选，步骤1所述离心为4000r/min分别离心两次，每次离心15min。

作为优选，步骤2用pH 6.0～9.0的0.01～0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和0.05～0.6mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱。

作为优选，步骤3所述亲和层析柱载体为Sepharose 4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶或羧甲基葡聚糖凝胶。

步骤3所述杂交瘤于2009年12月23日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-C200970的杂交瘤细胞株1B9。

在具体实施方式中，详细描述了步骤3所述杂交瘤的筛选过程。

作为优选，步骤4所述洗脱缓冲液为pH 2.0～4.0、0.01～0.03MGly-HCl缓冲液。

本发明还提供所述抗血小板溶栓素在制备治疗血管栓塞性疾病药物上的应用。

本发明所述抗血小板溶栓素可应用于血管栓塞性疾病，包括心、脑梗塞性疾病如脑梗塞、急性ST段抬高的心肌梗死、非ST段抬高的急性冠状动脉综合征；肺血栓栓塞症(PTE)；静脉血栓症；外周血管栓塞性疾病如闭塞性周围动脉粥样硬化、静脉动脉化术后血管再栓塞；以及经皮冠状动脉介入(PCI)的抗栓治疗和治疗手术后或创伤后的静脉血栓形成。

本发明还提供一种用于治疗血管栓塞性疾病的药物组合物，由所述的抗血小板溶栓素与药学上可接受的辅料组成。

本发明还提供所述药物组合物的注射剂，包含抗血小板溶栓素以及药学上可接受的赋形剂、稳定剂。

作为优选，本发明所述抗血小板溶栓素的注射剂型，按照每毫升含有10个活力单位的抗血小板聚集活性，常规加工直接或间接加入药学上可接受的赋形剂、稳定剂制成注射剂。

更优选地，每毫升含有至少10μg的抗血小板溶栓素。

本发明还提供所述药物组合物的注射剂的配方，即每ml包含抗血小板溶栓素16-24μg、右旋糖酐32-48mg、海藻糖1.6-2.4mg，余量为水。

本发明所述抗血小板溶栓素作用于介导血小板聚集关键成分的血小板膜糖蛋白GPIb蛋白，通过阻断其与血浆vWF结合，阻止血小板粘附在血管内皮细胞壁上，从而抑制血小板聚集。经药效学试验表明，与其它抗血小板聚集的药物相比，作用部位较为专一，出血倾向相对较小，且抗血小板作用较持久。

本发明所述抗血小板溶栓素采用瑞斯托霉素诱导的血小板聚集法进行活性测定，其对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集具有明显抑制作用，并呈现剂量依赖关系，而对ADP、II型胶原诱导的血小板聚集作用不明显。

本发明所述抗血小板溶栓素经动物药效学试验表明，对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集作用效果明显，出血作用小；在不稳定性心绞痛血栓模型中，可明显缩短凝血酶时间和活化部分凝血活酶时间，显著地抑制血小板聚集，可明显降低循环性的血流下降的频率和幅度，临床可用于不稳定性心绞痛治疗。

本发明所述纯化方法在传统常规阴阳离子交换层析基础上，结合具有高度专一性的免疫亲和层析法，具有高度专一性、高通量、高分辨率的特点，该方法特异性强、得率高、周期短，具有良好的工业应用前景

附图说明

图1为本发明所述抗血小板溶栓素制备工艺中阴离子交换柱层析紫外吸收(280nm)图谱；

图2为本发明所述抗血小板溶栓素制备工艺中阳离子交换柱层析紫外吸收(280nm)图谱；

图3为本发明所述抗血小板溶栓素制备工艺中凝胶S-100柱层析紫外吸收(280nm)图谱；

图4为本发明所述抗血小板溶栓素制备工艺中亲和层析柱层析紫外吸收(280nm)图谱；

图5为本发明中抗血小板溶栓素还原性、非还原性SDS-PAGE及与其抗体杂交后电泳图谱；

泳道1为蛋白分子量Marker，泳道2和泳道3为还原后的抗血小板溶栓素，泳道4为抗血小板溶栓素非还原SDS-PAGE电泳图，泳道5为与抗体杂交后的抗血小板溶栓素。

图6为本发明中抗血小板溶栓素双向电泳图谱；

图7为FACS法测抗血小板溶栓素与血小板表面Gp I b的结合的流式细胞仪检测图；

1.血小板；2.血小板+无关抗体；

3.血小板+Gp I b抗体；4.血小板+无关蛋白+Gp I b抗体；

5.血小板+本发明所述抗血小板溶栓素+Gp I b抗体。

图8为注射高剂量和低剂量抗血小板溶栓素后犬尿排泄曲线图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所作出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。

本发明所述纯化方法在传统常规阴阳离子交换层析基础上，结合具有高度专一性的免疫亲和层析法，具有高度专一性、高通量、高分辨率的特点。

在具体实施方式中，详细描述了免疫亲和层析所用单克隆抗体的制备过程，其过程概述如下：(1)将尖吻蝮蛇蛇毒用pH 7.0～9.0的0.01～0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解，离心去除沉淀。

(2)将上述粗毒分别以才常规阴离子交换DEAE柱和阳离子交换层析CM柱层析纯化，用pH 6.0～9.0的0.01～0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和NaCl溶液线性梯度洗脱，纯化得到具有抑制血小板聚集的初步溶液；

(3)将上述初溶液再以凝胶层析S-100柱纯化，用pH 7.5～8.5、浓度为0.01～0.10mol/L的Tris-HCl缓冲液和NaCl溶液洗脱，纯化得到具有抑制血小板聚集的纯溶液；

(4)以上述所得纯溶液作为抗原，免疫小鼠，取免疫小鼠，取脾细胞悬液和骨髓瘤细胞以1∶5的比例在聚乙二醇作用下按常规法融合，筛选阳性克隆并鉴定，所筛选的杂交瘤分泌的即为针对该物质的特异性单克隆抗体。

实施例1：高纯度抗血小板溶栓素的制备

1、蛇毒粗毒的处理

准确称取购自黄山市徽州毒蛇研究所的尖吻蝮蛇蛇毒5g，用0.02mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液将置4℃冰箱内其溶解，溶解时间6～12h，然后以4000r/min离心，分别离心两次，每次离心15min，收集上清液待用。

2、初步纯化得到用于制备单抗的抗原

(1)阴离子交换层析

取步骤1粗毒溶解离心所得上清液以流速3.0ml/min上样于已平衡的阴离子交换层析DEAE柱中，上样后先以0.02mol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液洗脱不能被层析介质吸附的杂蛋白，洗脱时间360min，洗脱流速3ml/min；然后再以0.02mol/L pH 6.5的Tris-HCl缓冲液加入0.5mol/L的NaCl进行梯度洗脱，洗脱流速5ml/min，收集具有抑制血小板聚集的组分(活性检测方法见后面部分内容)，即抗血小板溶栓素粗溶液，蛋白检测用纯化系统AKTA prime plus自带紫外检测器在280nm处检测，其紫外吸收图谱如图1所示，收集以系统所带分部收集器收集，收集设置为4min/管。

(2)阳离子交换层析

将步骤2中阴离子交换层析所收集的抗血小板溶栓素粗溶液用截留分子量为1万的滤膜进行超滤，浓缩至体积为30～80毫升，转入已煮过的透析袋中，置4℃冰箱内透析6～12h。将透析后所得样品以流速3.0ml/min上样于已平衡的阳离子交换层析CM柱中，上样后先以0.02mol/L pH 6.5的Tris-HCl缓冲液洗脱不能被层析介质吸附的杂蛋白，洗脱时间360min，洗脱流速3ml/min；然后再以0.02mol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液加入0.5mol/L的NaCl进行梯度洗脱，洗脱流速5ml/min，收集具有抑制血小板聚集的组分(活性检测方法见实施例分内容)，即抗血小板溶栓素初品，蛋白检测用纯化系统AKTAprime plus自带紫外检测器在280nm处检测，其紫外吸收图谱如图2所示，收集以系统所带分部收集器收集，收集设置为4min/管。

(3)凝胶层析

将步骤2中阳离子交换层析所收集的抗血小板溶栓素初品溶液用截留分子量为1万的滤膜进行超滤，浓缩至体积为30～80毫升，再以millopore ultra系列离心超滤管与4℃下低温离心超滤浓缩，浓缩体积到5～15ml。将浓缩后所得样品以流速1.0ml/min上样于已平衡的凝胶层析S-100柱中，以0.02mol/L pH 7.6的Tris-HCl缓冲液加入0.15mol/L的NaCl进行洗脱，洗脱流速0.3ml/min，收集具有抑制血小板聚集的组分，检测方法同上，蛋白检测用纯化系统AKTA prime plus自带紫外检测器在280nm处检测，其紫外吸收图谱如图3所示，收集以系统所带分部收集器收集，收集设置为10min/管，所得样品即为抗血小板溶栓素初纯溶液。

3、抗血小板溶栓素特异性单抗的制备

(1)抗原鉴定

上述步骤2中凝胶层析所得到的抗血小板溶栓素初纯溶液经SDS-PAGE电泳鉴定，其纯度不低于85％，显示为一条主带，活性检测有抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集作用后，方可用于制备单抗。

(2)抗原的动物免疫：选用6-12周龄Balb/c小鼠免疫抗原，分为三次免疫，即第一次以每支小鼠0.1mg(约0.2ml)加等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔免疫，2-4周后加强免疫，量减半，改用不完全佐剂，第三次冲击免疫在融合前3天进行，每只小鼠0.03mg，融合成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，并以间接ELISA法检测血清中抗体效价。

(3)杂交瘤细胞株建立：取免疫小鼠脾细胞悬液和骨髓瘤细胞以1∶5的比例在聚乙二醇作用下按常规法融合。以间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清，筛选阳性克隆后，再进行亚克隆化，并进行扩增冻存。经过3次有限稀释克隆化，将分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化鉴定之，建立的杂交瘤细胞株已于2009年12月23日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-C200970，分类命名为杂交瘤细胞株1B9。

(4)单克隆抗体的制备与纯化：上述所得的杂交瘤细胞株以无血清培养基在体外进行增量培养，获得的培养液过以ProteinA偶联的亲和层析柱，亲和层析纯化得到抗抗血小板溶栓素的特异性单克隆抗体。

4、抗血小板溶栓素特异性单克隆抗体亲和层析柱的制备

上述纯化得到的抗血小板溶栓素单克隆抗体以0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液于4℃透析过夜后，加10ml CNBr-Sepharose 4B到10ml抗体溶液中，放在摇床或振荡器上，4℃轻轻振摇过夜。再加入1ml 2mol/L乙醇胺溶液封闭CNBr-Sepharose 4B残余的活性基团，4℃继续振摇1小时。将偶联好抗体的Sepharose 4B柱装到适当的层析柱中。用0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液洗柱，接着用两倍柱体积0.1mol/L、pH6.5、含1mol/L的NaCl柠檬酸钠缓冲液洗脱，最后用两倍柱体积的PBS洗。凝胶在使用和保存时，须始终保持在液面以下，不得干燥。

5、高纯度抗血小板溶栓素的制备

将上述步骤2中经阴离子交换层析得到的抗血小板溶栓素粗溶液用亲和层析平衡缓冲液(0.02M Tris-HCl缓冲液，pH 7.8、含0.25M NaCl)透析，上抗体亲和层析柱，用上述亲和层析平衡缓冲液平衡至洗脱液洗脱曲线在紫外检测上显示为基线后，用pH 4.0、0.02M Gly-HCl缓冲液亲和层析洗脱液洗脱，收集活性峰即为高纯度抗血小板溶栓素。

实施例2：本发明所述抗血小板溶栓素的药效评价

1、活性测定

抗血小板溶栓素一个活力单位定义为：能使瑞斯托霉素诱导的血小板聚集的抑制百分率达到100±5时的抗血小板溶栓素的量。

其效价测定方法采用血小板聚集法，具体如下：

(1)富血小板血浆PRP和贫血小板血浆PPP的来源：取血小板数正常的献血员的抗凝血，抗凝剂为3.8％枸橼酸钠，与全血的比例为1∶9。以800r/min离心5min，吸取上清液，得到富血小板血浆(PRP)，再以3500r/min离心10min，吸取上清液，得到贫血小板血浆(PPP)，将PRP的血小板数调至(150～200)×10⁹。

(2)空白管测定：取硅化比浊管，将空白管置于37℃测量孔中，精密加入贫血小板血浆(PPP)0.5ml，调血小板聚集率为100％。取硅化比浊管，将测量管置于37℃测量孔中，精密加入富血小板血浆0.5ml，再加入一枚搅拌子，调血小板聚集率为0，同时计时，在37℃孵育3分钟，然后加入瑞斯托霉素(Ristocetin)0.025ml，立即记录聚集曲线，读取5分钟内的聚集曲线。

(3)样品管测定：取硅化比浊管，将测量管置于37℃测量孔中，精密加入富血小板血浆0.5ml，各种稀释倍数的注射用抗血小板溶栓素样品溶液0.025ml，再加入一枚搅拌子，调血小板聚集率为0，同时计时，在37℃孵育3分钟，然后精密加入Ristocetin 0.025ml，立即记录聚集曲线，读取5分钟内的聚集率线。

(4)样品抑制率及相应活性单位的计算

计算样品抑制率：

血小板聚集的抑制率＝(对照管的最大聚集率-测量管的最大聚集率)/对照管的最大聚集率。

以所测定的半数抑制率时对应蛋白含量与其浓度关系，即可算出其比活力(即每毫克蛋白含有多少活力单位)，本发明所述抗血小板溶栓素比活力大于每毫克蛋白1000单位以上。

2、纯度鉴定

SDS-PAGE电泳如图5所示，显示为一条带，分子量为35000～40000道尔顿；等电点电泳显示为一条带，等电点为5.5～6.5。

3、神经毒、出血毒、内毒素检测

抗血小板溶栓素出血毒检验标准：取本发明所述抗血小板溶栓素用氯化钠注射液制成每1ml中含20单位的溶液，取体重为18～22g的小白鼠5只，背部皮下注射器0.2ml，注射后24小时处死动物，剥皮观察，小鼠背部未见出血现象。实测三批样品均符合规定。

抗血小板溶栓素神经毒检验标准：取取本发明所述抗血小板溶栓素适量，用氯化钠注射液制成每毫升中含有20单位溶液，取体重300～500g鸽子3只，剂量按每公斤注射0.5ml，静脉给药，观察24小时，动物不得出现抽搐、死亡，如3只中有一只出现抽搐或死亡，应另取5只复试，均未出现死亡。

抗血小板溶栓素内毒素检测标准：取本品，依中国药典2005年版二部附录XIE检查，每单位样品中内毒素含量不高于20EU。

实施例3：高纯度抗血小板溶栓素原料药含量检测方法

为检测血清中抗血小板溶栓素含量，以便用于药代动力学试验，建立了一套采用双抗体夹心法检测抗血小板溶栓素原料药含量的方法，该方法检测灵敏度能够达到1ng/ml。

具体检测方法如下：

1、包被一个单抗：用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液将本发明实施例1中所制备的单抗作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜或保持18-24小时。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟(简称洗涤，下同)。

2、加样：加入待检样品或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空白孔，阴性和阳性孔对照。37℃孵育1小时，洗涤。

3、加HRP标记的另一个单抗：将已作适当稀释的HRP标记的另一个自行制备的抗血小板溶栓素单抗，加于酶标板中，每孔0.1ml，37℃孵育30～60分钟，洗涤。

4、底物显色：于上述各反应孔中加入临时配制的或OPD底物应溶液0.1ml，于37℃下反应10～30分钟，再加2M H2SO4 0.05ml以终止反应。

6、结果判定：上述酶标板置于酶标仪上于450nm处测OD值。根据相应已知浓度对照品的OD值与浓度关系，绘制标准曲线。再由待测样品所测OD值，代入标准曲线中，求得相应样品中抗血小板溶栓素浓度。本方法检测灵敏度能够达到1ng/ml。

实施例4：注射用抗血小板溶栓素制备方法

注射制剂配方如下：

抗血小板溶栓素                 10±2mg

右旋糖酐                       20±4g

海藻糖                         1±0.2g

补水至                         500ml

总体积                         500ml

按照0.5ml/支分装，共分装1000支。

在局部百级洁净区内将按照配方将本发明前述实施例制备并经各项检测合格的抗血小板溶栓素原料药与右旋糖酐等辅料准确称量在配液容器内，加注射用水充分溶解或稀释，使右旋糖苷浓度为1％，搅拌混匀后，得到制剂中间体；除菌过滤，其中过滤前后应对除菌过滤系统进行完整性测试。然后，将过滤后的中间体按装量装入西林瓶中，在分装过程中应进行至少4次装量检查，保证每一只瓶内装入的药量准确。最后，将装入药品的西林瓶冻干，然后抽真空，在真空状态下缓慢升温至35～40℃，保持一定时间，再降至室温后取出。压塞、轧盖得成品。成品经检验，符合注射用抗血小板溶栓素质量标准后，入库存放。

实施例5：抗血小板溶栓素与GPIb蛋白的结合力测定

本实验采用流式细胞仪法测定抗血小板溶栓素与GPIb蛋白的结合，方法如下：

(1)GPIb蛋白的纯化：取新鲜受试者血液，制备富血小板血清(PRP)，用草酸铵溶液和Triton X-100制备出血小板膜糖蛋白混合溶液。将GPIb单抗用固体双功能试剂DMP共价偶联于Sepharose 4B-ProteinA胶上，亲和纯化GPIb。

(2)将5μl 2mg/ml抗血小板溶栓素与35μl TEN缓冲液于37℃温育20min；

(3)上述反应体系中再加入20μl鼠抗GPIb一抗，阴性对照在上述反应体系中加入20μl一个鼠源无关单抗(即非GPIb单抗)；

(4)室温静置30mi后，1500g离心10min，弃上清；

(5)TEN洗两次；加入40μl GPIb蛋白后，再加10μl FITC标记的羊抗鼠二抗；

(6)室温避光30min后，1500g离心10min，弃上清，TEN洗两次；

(7)500μl PBS悬浮后，以流式细胞仪检测。

结果如图7所示，1.血小板；2.血小板+无关抗体；3.血小板+Gp I b抗体；4.血小板+无关蛋白+Gp I b抗体；5.血小板+本发明所述抗血小板溶栓素+Gp Ib抗体。

从图中可以看出，只有血小板和血小板加无关抗体时，几乎没有荧光；使用GPIb单抗时有荧光产生，而血小板先与抗血小板溶栓素孵育以后再加GPIb单抗，荧光减弱，血小板与无关蛋白孵育后加GPIb单抗荧光未减弱。

因此，可推断抗血小板溶栓素阻断了GPIb单抗与血小板的结合，即抗血小板溶栓素通过与GPIb结合，从而阻断了GPIb蛋白与其单抗的结合。

通过FACS法测定抗血小板溶栓素与GPIb结合实验表明抗血小板溶栓素竞争性地抑制GPIb单克隆抗体与血小板膜上GPIb受体结合，属于GPIb结合蛋白，通过竞争性地阻断vWF与GPIb的结合，使血小板不能通过vWF粘附于受损而暴露的血管壁的胶原上，从而抑制血小板粘附，防止了血栓的形成。即抗血小板溶栓素为一种以GPIb为靶标的、特异性很好的抗血小板聚集的新型多肽类药物，与其它抗血小板聚集的药物相比，本物质作用部位较为专一，出血倾向相对较小，且抗血小板作用较持久。

实施例6、抗血小板溶栓素的药动学参数及排泄规律测定.

将比格(Beagle)犬背位固定在手术台上，不麻醉，预先将导尿用的导管浸泡在石蜡油中，将导尿管插入膀胱，并将导尿袋固定以收集尿液。插好导尿管后，将犬放笼内，限制犬头的活动范围，防止其咬断导尿管。每5小时收集尿液1次，粪便则采用随时收集的办法。

高剂量和低剂量组分别经耳缘静脉注射30μg/kg和10μg/kg抗血小板溶栓素，高剂量组于注射后第5，10，30，60，120，240，480，720，960，1440，2160min由大隐静脉取血1.5--2ml，低剂量组于注射后第5，10，30，60，120，240，480，720，960，1440min采血，每次取血后补足等量生理盐水，对照组每次同时抽血检查。

将各试管离心(3000rpm，5min)分别取血清0.2ml转移于另一试管中待测，其余盛Eppendorf管中-20℃贮存。

用ELISA方法测定标本中药物浓度，其分析方法与标准曲线建立的方法一致，只是在测定标准曲线的同时测定末知样品。

血清和尿液标本直接用样品测定，粪便标本则取30克新鲜粪便标本加30毫升生理盐水搅匀，离心3000rpm，20min后取上清测定。

实验结果：静注APT后血液中药物浓度的测定，见表1-4。

表1 高剂量样品检测结果

表2 标准曲线

APT浓度	0	7.8	15.6	31.3	62.5	125	250	500	1000
										OD值	2.430	2.429	2.188	1.885	1.609	1.417	1.138	0.960	0.784

以对数浓度与OD值作标准曲线，其线性回归方程为：Y＝-0.7943X+3.0966

r＝-0.9967，测得OD值，查反对数求出药物浓度。

表3 低剂量样品检测结果

将上述表中数据用SPSS10.0统计软件和DAS ver1.0(Drug AndStatistics for Windows)软件计算APT动力学参数，结果如下表所示。

表4 药物代谢动力学智能分析最佳计算结果

参数	单位	剂量：10ug/kg	剂量：30ug/kg
				A	ug/L	69.197	217.689
alpha	L/min	0.031	0.017
				B	L/min	58.486	138.369
Beta	L/min	0.002	0.001
				Vd	L/kg	0.161	0.192
T1/2α	min	22.581	39.629
				T1/2β	min	451.014	487.941
K21	L/min	0.015	0.008
				K10	L/min	0.003	0.003
K12	L/min	0.014	0.008
				AUC	ug/L*min	40309.7	109851.
CL(s)	L/min*kg	0.000483	0.000576

由表中可以看出，静脉注射后，t1/2β分别为488min(高剂量)和451min(低剂量)；AUC分别109851μg/L*min和40309μg/L*min，基本上与剂量成正比。

各犬每隔5小时收集1次尿液，测出每5h的尿液APT浓度后，乘以该时间段的尿量，得出各犬每5h的APT排泄量。用该排泄量除于每犬的总注药量，计算出排泄的百分比，按高剂量和低剂量组计算出累积百分比作图，见图8。

实施例7抗血小板溶栓素对犬不稳定性心绞痛血栓模型的影响

试验方法参见Folts(1982)，Folts et al.(1976)and Bertha andFolts(1984)。用戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉狗，插入有囊气管插管，用呼吸机通入室内空气。左右前肢头静脉分别插管灌注戊巴比妥钠(0.1mg/kg)进行全身麻醉和APT的给药。右股动脉插管检测血压。在左侧第五肋间开胸暴露心脏，悬挂于心包支架中。暴露1.5cm的左旋支冠状动脉并分离周围组织。将电磁流量探头置于冠状动脉上，测量冠脉平均血流。并测量II导联心电图和心率。经过30分钟的稳定后，用止血钳轻度地挤压使左旋支冠状动脉损伤。将一支硬制柱形压缩器置于左旋支冠状动脉损伤部位，通过形成富血小板血栓使动脉血流逐渐下降。当血流降至0时，轻幅震荡缩窄器机械地移走血小板以恢复血流。如此重复的减少血流随后机械地恢复血流的形式称为循环性的血流下降。重复进行外加的内皮损伤或压缩器选择直到循环性血流下降达到稳定。经过60分钟的可重复循环性血流下降控制期后(t＝-60至0分钟)，抗栓作用通过给药前和给药后30、60、120、240分钟的CFR频率和CFR幅度的比较来进行评估。

出血时间的测定

在给药前和给药后15min用自动弹簧承载装置(Simplate R，Organon Teknika)在上唇内表面测定模板出血时间，直至观察到滤纸上出血的停止。

分别于用药前、用药后30min、60min、120min和240min各取血8ml，以3.8％枸橼酸钠抗凝(全血与抗凝剂之比为9∶1)，将血样在500rpm离心3分钟得到富血小板血浆；在3000rpm离心15分钟得到贫血小板血浆。用贫血小板血浆稀释富血小板血浆将其血小板计数调至150,000-250,00/μl(留取1ml贫血小板血浆测定TT、PT、APTT)。测量对RistocetinA co₄引起的血小板聚集的影响。

凝血酶时间TT、凝血酶原时间PT和活化部分凝血活酶时间APTT测定

按试剂盒说明书所提供的方法进行，分别取取37℃预温待测血浆0.2ml，加入37℃预温的相应试剂溶液，混匀，放入MPG-3E-多能双通道血液凝聚仪中测定凝固时间。统计学数据处理，结果用

表示，计量资料采用t检验。

结果：

对家犬出血时间(s)的影响结果如表5所示，与用药前相比较，所给剂量均可明显缩短出血时间。

对循环性的血流下降(CFR)的影响

在稳定的循环性血流减少中，冠脉血流达到0时可观察到暂时性的血压和ST-段的升高。APT 12ug.kg^-1剂量显著地抑制了循环性血流减少频率的发生结果见表6。

表5 对犬出血时间(s)的影响 $(\stackrel{\‾}{X}\±S,n=8)$

组别

剂量(ug.kg-1)

用药前

15min

30min

60min

120min

240min

APT

12

4575±1323

58.13±12.93

110.0±24.92**

98.63±23.17**

60.75±10.93*

55.38±14.47

用药前比较P＜0.05，^**P＜0.01。

表6 APT对犬冠状动脉血栓形成的影响

与给药前比较：^**P＜0.01；^*P＜0.05。

对Ristocetin A co₄作为诱导剂引起的血小板聚集的影响，APT能显著地抑制血小板聚集，12ug.kg^-1剂量的抑制作用持续了120分钟以上。结果见表7。

表7 APT对犬体外RA诱导血小板聚集的抑制作用(n＝8)

血小板聚集率与对照组比较：^**P＜0.01；^*P＜0.05。

对犬TT的影响结果如表8所示，与用药前相比较，可显著缩短TT。

表8 对犬TT(s)的影响 $(\stackrel{\‾}{X}\±S,n=8)$

与用药前比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

对犬PT的影响结果如表9所示，与用药前相比较，12ug.kg^-1剂量对PT无明显影响。

表9 对犬PT(s)的影响 $(\stackrel{\‾}{X}\±S,n=8)$

与用药前比较，无显著性差异，P＞0.05。

对犬APTT的影响结果如表10所示，与用药前相比较，12ug..kg¹可明显缩短APTT。

表10 对犬APTT(s)的影响 $(\stackrel{\‾}{X}\±S,n=8)$

与用药前比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

SEQUENCE LISTING

<110>兆科药业(合肥)有限公司

<120>一种抗血小板溶栓素及其制备方法

<130>MP090838

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>130

<212>PRT

<213>本发明所述抗血小板溶栓素α链序列

<400>1

Asp Val Asp Cys Leu Pro Gly Trp Ser Ala Tyr Asp Gln Ser Cys Tyr

1                 5                       10                    15

Arg Val Phe Lys Leu Leu Lys Thr Trp Asp Asp Ala Glu Lys Phe Cys

              20                     25                     30

Thr Glu Arg Pro Lys Gly Gly His Leu Val Ser Ile Glu Ser Ala Gly

        35                      40                      45

Glu Arg Asp Phe Val Ala Gln Leu Val Ser Glu Asn Lys Gln Thr Asp

    50                      55                      60

Asn Val Trp Leu Gly Leu Lys Ile Gln Ser Lys Gly Gln Gln Cys Ser

65                      70               75                     80

Thr Glu Trp Thr Asp Gly Ser Ser Val Ser Tyr Glu Asn Phe Ser Glu

                  85                       90                   95

Tyr Gln Ser Lys Lys Cys Phe Val Glu Lys Asn Thr Gly Phe Arg Thr

              100                    105                    110

Trp Leu Asn Leu Asn Cys Gly Ser Glu Tyr Ala Phe Val Cys Lys Ser

    115                    120                    125

Pro Pro

130

<210>2

<211>125

<212>PRT

<213>本发明所述抗血小板溶栓素β链序列

<400>2

Gly Phe Cys Cys Pro LeuArg Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr

1                 5                      10                    15

Leu Val Val Lys Glu Lys Lys Thr Trp Asp Asp Ala Glu Lys Phe Cys

              20                      25                     30

Thr Glu Gln Arg Lys Gly Gly His Leu Val Ser Val His Ser Arg Glu

         35                      40                      45

Glu Ala Asp Phe Leu Val His Leu Ala Tyr Pro Ile Leu Asp Leu Ser

    50                      55                      60

Leu Ile Trp Met Gly Leu Ser Asn Met Trp Asn Asp Cys Lys Arg Glu

65                 70                    75                     80

Trp Ser Asp Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Ala Trp Ala Lys Thr Ser

                   85                    90                     95

Asp Cys Leu Ile Gly Lys Thr Asp Asp Asn Gln Trp Leu Asn Met Asp

             100                     105                    110

Cys Ser Lys Lys His Tyr Phe Val Cys Lys Phe Lys Leu

         115                     120                  125

Claims (16)

1.一种抗血小板溶栓素，其特征在于，由α链、β链两条肽链组成，α链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的抗血小板溶栓素，其特征在于，其比活力大于每毫克蛋白1000个活力单位。

3.根据权利要求1所述的抗血小板溶栓素，其特征在于，与由保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC-C200970的杂交瘤细胞株1B9分泌的单克隆抗体特异性结合。

4.根据权利要求1-3任一项所述抗血小板溶栓素的纯化方法，包括以下步骤：

步骤1：将尖吻蝮蛇粗毒溶解于缓冲液中，离心取上清；

步骤2：将步骤1所得上清液过DEAE阴离子交换层析柱进行层析，取经体外抗血小板活性检测对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集具有抑制作用的洗脱组分备用；

步骤3：将保藏编号为CCTCC-C200970杂交瘤细胞株1B9分泌的单克隆抗体与亲和层析载体偶联，制备免疫亲和层析柱；

步骤4：用步骤3中制备的免疫亲和层析柱层析纯化步骤2中所得洗脱组分，以洗脱缓冲液洗脱，收集取经体外抗血小板活性检测对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集具有抑制作用的洗脱组分，即为所述抗血小板溶栓素。

5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤1所述缓冲液为pH 7.0～9.0的0.01～0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。

6.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤1所述离心为4000r/min分别离心两次，每次离心15min。

7.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤2用pH 6.0～9.0的0.01～0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和0.05～0.6mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱。

8.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤3所述亲和层析柱载体为Sepharose 4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶或羧甲基葡聚糖凝胶。

9.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤4所述洗脱缓冲液为pH2.0～4.0、0.01～0.03M Gly-HCl缓冲液。

10.根据权利要求1-3任一项所述抗血小板溶栓素在制备治疗血管栓塞性疾病药物上的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述血管栓塞性疾病包括脑梗塞、急性ST段抬高的心肌梗死、非ST段抬高的急性冠状动脉综合征、肺血栓栓塞症PTE、静脉血栓症、闭塞性周围动脉粥样硬化、静脉动脉化术后血管再栓塞以及经皮冠状动脉介入PCI的血栓形成和治疗手术后或创伤后的静脉血栓形成。

12.一种用于治疗血管栓塞性疾病的药物组合物，由权利要求1至3任一项所述的抗血小板溶栓素与药学上可接受的辅料组成。

13.根据权利要求12所述药物组合物的注射剂，包含抗血小板溶栓素以及药学上可接受的赋形剂、稳定剂。

14.根据权利要求13所述的注射剂，其特征在于，每毫升含有至少10个活力单位的抗血小板溶栓素。

15.根据权利要求13所述的注射剂，其特征在于，每毫升含有至少10μg的抗血小板溶栓素。

16.根据权利要求13-15任一项所述的注射剂，其特征在于，每ml包含抗血小板溶栓素16-24μg、右旋糖酐32-48mg、海藻糖1.6-2.4mg。

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