CN106995801A - 抗树鼩cd4分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用 - Google Patents

抗树鼩cd4分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗树鼩CD4分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用，属于分子生物学技术领域。该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TS‑CD4‑38，保藏号为CCTCC NO:C2016221，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。其分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，可用于检测天然树鼩淋巴细胞表面分子CD4，具有较好的灵敏度和特异性。

Description

抗树鼩CD4分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与 应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一个单克隆抗体，具体涉及产生特异性抗树鼩CD4分子抗体的杂交瘤细胞株和抗树鼩CD4分子抗体，以及所述抗体的应用。
背景技术
树鼩（tree shrew, Tupaia belangeri）是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩类的小型动物，形态酷似松鼠，是灵长类动物的近亲。由于树鼩具有体型小，经济易得，易驯养，繁殖能力强，饲养管理成本低、对人类病毒易感等优点，常常用于替代或减少一些非人灵长类动物的使用，所以很早就被用作灵长类目（包括人类）的疾病动物模型。近年来研究发现，在丙型肝炎、乙型肝炎、手足口疾病、肝癌、糖尿病、肿瘤等疾病的研究中得到广泛的应用。
CD4分子作为T细胞受体识别抗原复合物，在机体免疫系统的抗感染免疫中起着重要作用。CD4分子主要表达于辅助性T淋巴细胞(T helpercells, Th)的细胞膜上，其胞外区识别、结合主要组织相容性复合体II类分子，增强T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)与MHC分子结合的稳定性；胞内区增强白细胞CD3转导的活化信号，从而参与并调节免疫系统的活化。CD4阳性淋巴细胞群的数量指标是衡量机体细胞免疫情况的重要指标。
但目前对树鼩CD4分子方面的研究鲜有报道，且无可用的抗体来检测树鼩的CD4分子水平，对树鼩动物模型通过淋巴细胞表面分子检测分析其细胞免疫情况的评价尚属空白，严重阻碍了对树鼩这一动物模型的研究和应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种抗树鼩CD4分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用，本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，可用于检测天然树鼩淋巴细胞表面CD4分子。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种分泌抗树鼩CD4分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TS-CD4-38，保藏号为CCTCC NO:C2016221，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
本发明还提供一种由上述杂交瘤细胞分泌的抗树鼩CD4分子单克隆抗体。
本发明同时提供上述抗树鼩CD4分子单克隆抗体在制备天然树鼩淋巴细胞表面CD4分子检测试剂或试剂盒中的应用。
进一步，本发明提供一种天然树鼩淋巴细胞表面CD4分子的流式细胞分析（flowcytometry）检测试剂盒，所述的试剂盒包括用多甲藻黄素叶绿素蛋白荧光染料（PerCP）标记的抗树鼩CD4分子单克隆抗体。
进一步，本发明提供一种天然树鼩淋巴细胞表面CD4分子的蛋白免疫印迹法（western-blot）检测试剂，所述的试剂包括辣根过氧化物酶HRP标记的抗树鼩CD4分子单克隆抗体。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，可用于检测天然树鼩淋巴细胞表面CD4分子。
基于此建立的检测抗体，在流式细胞分析实验中能有效识别树鼩淋巴细胞表面的天然构象的CD4分子，具有较好的灵敏度和特异性。数量为106个的外周血淋巴细胞，使用PerCP标记的上述CD4单克隆抗体可以检测到树鼩淋巴细胞表面CD4+的细胞百分比约为33.8%。
基于此建立的树鼩CD4蛋白的western-blot检测试剂，可用于分析树鼩外周血淋巴细胞表面CD4分子的表达情况，应用HRP标记的上述CD4单克隆抗体，最低可以检测到0.5ug的树鼩淋巴细胞裂解蛋白样品可见清晰的CD4分子免疫印迹条带。
附图说明
图1为HIS标签和树鼩CD4融合蛋白HIS-TSCD4的表达纯化SDS-PAGE电泳图，其中1为蛋白分子量Marker，2为重组蛋白HIS-TSCD4超滤浓缩后的样品；3位重组蛋白HIS-TSCD4洗脱后的样品；
图2为GST标签和树鼩CD4融合蛋白GST-TSCD4的表达纯化SDS-PAGE电泳图，其中1为蛋白分子量Marker，2为表达重组蛋白GST-TSCD4大肠杆菌菌液的超声后的上清；3为经亲和纯化后的重组蛋白GST-TSCD4；
图3为纯化的单克隆抗体MAb-TSCD4-38的SDS-PAGE电泳图，其中1为蛋白分子量Marker，2为ProteinA纯化洗脱的MAb-TSCD4-38；
图4为单克隆抗体MAb-TSCD4-38识别树鼩淋巴细胞内的CD4蛋白的western-blot图，其中1为0.5μg树鼩淋巴细胞裂解蛋白，2为1μg树鼩淋巴细胞裂解蛋白；3为2μg树鼩淋巴细胞裂解蛋白；4为4μg树鼩淋巴细胞裂解蛋白；以β-actin为实验内参。
图5为PerCP标记的单克隆抗体MAb-TSCD4-38识别树鼩淋巴细胞表面CD4分子的流式细胞分析图，其中，a为未加刺激剂培养16小时的淋巴细胞，b为加ConA刺激培养16小时的淋巴细胞；
本发明杂交瘤细胞株TS-CD4-38，已于2016年12月22日保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏号为CCTCC NO:C2016221，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
一、杂交瘤细胞株的建立：
(1.1)原核表达载体pGEX-5X-TSCD4和Pet3.0-TSCD4的构建
为了在大肠杆菌表达系统中表达树鼩的CD4分子蛋白，从树鼩尾静脉采外周血后用淋巴细胞分离液（购买自AXIS-SHIELD）分离得到的淋巴细胞，经TRIZOL(天更)提取RNA经逆转录PCR（购买自宝生物）得到树鼩CD4分子的编码基因片段，用T4连接酶（购买自宝生物）连接到表达载体pGEX-5X-1后，得到GST标签重组蛋白表达质粒pGEX-5X-TSCD4，将树鼩CD4分子基因连接到表达载体pet3.0后得到HIS标签的重组蛋白表达质粒Pet3.0-TSCD4。其中，树鼩CD4分子的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
(1.2)重组蛋白GST-TSCD4和HIS-TSCD4的表达
将质粒pGEX-5X-TSCD4和Pet3.0-TSCD4转化入原核表达宿主菌BL21中，37℃诱导表达3小时后，8000转，离心10分钟收集菌体，用亲和纯化的结合缓冲液悬起后经超声破碎菌体，再次离心，离心条件同上，取上清液做亲和纯化，得到免疫动物用重组蛋白GST-TSCD4（图2）和筛选检测用重组蛋白HIS-TSCD4（图1）。
（1.3）动物免疫：选择8周龄左右的Balb/C健康小鼠（由中国医学科学院医学生物学研究所小动物中心提供），原核表达的带HIS标签的融合蛋白HIS-TSCD4与等体积弗氏完全佐剂（第1次免疫）或弗氏不完全佐剂（第2、3次免疫）完全乳化后（所用佐剂均购买自sigma），经背部皮下多点免疫，每只小鼠免疫蛋白量为100μg。免疫程序为分别于第1天，28天、56天进行免疫，第59天取小鼠脾脏研磨至只剩白色组织后经70目的细胞筛网过滤得到小鼠脾细胞。
（1.4）饲养细胞的制备：选择12周龄左右的Balb/C健康小鼠（由中国医学科学院医学生物学研究所小动物中心提供）断颈处死以后浸泡于体积浓度为75%乙醇消毒5分钟，用无菌的剪刀剪开腹部皮肤后，缓慢剥离，暴露腹膜，用无菌注射器注射10ml预冷的质量浓度为16%的蔗糖溶液进小鼠腹腔，轻柔按摩小鼠腹部5分钟后再用注射器将腹腔内液体抽取出来，此液体中含有大量的小鼠巨噬细胞，离心1000转10分钟后弃上清用培养液悬起然后计数，调整培养液体积，使细胞浓度在105个/ml左右，然后100μl每孔加入96孔板中，置于37℃、5％CO2条件下培养1-2天。
（1.5）小鼠脾细胞和SP2/0细胞的融合：取处于对数生长期的SP2/0细胞(购自ATCC)与步骤（1.3）得到的小鼠脾细胞按照1∶10的细胞数量比例混和，通过聚乙二醇(PEG)（购买自sigma）法以获得杂交瘤细胞。之后将杂交瘤细胞加入步骤（1.4）得到的含有饲养细胞的96 孔板中，使用含有1×HAT（购买自sigma）、20%（V/V）胎牛血清的1640培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养。
（1.6）杂交瘤细胞株的筛选：将步骤（1.5）获得的杂交瘤细胞经含1×HAT、20%（V/V）胎牛血清（购买自Biological Industries，BI）的1640培养基(购买自Corning)培养10天，换含1×HT（购买自sigma）、20%（V/V）胎牛血清的1640培养基培养5天后，换成含20%（V/V）胎牛血清的1640普通培养基培养。取杂交瘤细胞上清用包被了原核表达重组蛋白GST-TSCD4蛋白的ELISA板检测抗体效价。以未融合SP2/0细胞培养上清为阴性对照，选取检测OD值高于阴性6倍的细胞孔进行下一步的亚克隆。
（1.7）选取步骤（1.6）中96孔板上生长状态良好且检测OD值高于阴性6倍的细胞孔，将每孔的细胞吸取至加样槽，用含20%（V/V）胎牛血清的1640培养基稀释至20ml后，均匀加至一个96孔板，每孔200μl，37℃，5％CO2条件下培养5天后再次检测，再次选取OD值高于阴性6倍且细胞生长状态良好的细胞孔，分克隆至另一个96孔板，如此重复三至四轮，直至整个96孔板的OD都为高于阴性孔6倍。选取细胞生长状态好的一个孔的细胞逐步扩大培养，并液氮冻存。
二、单克隆抗体腹水的大量制备：
将步骤（1.7）扩大培养得到的阳性（OD值高于阴性6倍）克隆细胞腹腔注射入预先用石蜡油致敏过的10周龄Balb/C健康小鼠，每只小鼠注射细胞量为106-107个，10-14天后收取腹水，检测效价>1:3200的腹水样品分装冻存。
三、抗体的纯化：
将上述步骤二所得的小鼠腹水经proteinA柱（购买自全式金）纯化，得到小鼠抗树鼩CD4的单克隆抗体MAb-TSCD4-38（图3），所得单克隆抗体用超滤离心管浓缩至1mg/ml，分装冻存备用。
四、单克隆抗体的标记：
将上述步骤四得到的纯化浓缩后的小鼠抗树鼩CD4的单克隆抗体MAb-TSCD4-38用标记试剂盒Lightning-Link PerCP（购买自Innova Biosciences）按照说明书操作，标记上荧光染料PerCP，反应结束后加入等体积的甘油，混匀后分装-20℃保存。
将上述步骤四得到的纯化浓缩后的小鼠抗树鼩CD4的单克隆抗体MAb-TSCD4-38按照HRP 标记抗体试剂盒（Proteintech）说明书操作，标记上辣根过氧化物酶HRP，反应结束后加入等体积的甘油，混匀后分装-20℃保存。
五、本发明产品组分及其特征：
以原核表达系统表达的带HIS标签的树鼩CD4蛋白（HIS-TSCD4）免疫小鼠后，获取分泌特异性CD4单克隆抗体MAb-TSCD4-38阳性的细胞株TS-CD4-38，能特异性识别天然的树鼩淋巴细胞表面CD4分子。
所述抗体应用包括荧光染料PerCP标记的单克隆抗体MAb-TSCD4-38，主要应用于流式细胞分析。
所述抗体应用还包括辣根过氧化物酶HRP标记的的单克隆抗体MAb-TSCD4-38，主要应用于免疫组化和western-blot的检测。
其中，应用方法如下：
①流式细胞检测方法：
．每份取100μL从外周血分离得到的单细胞悬液，约1×106个细胞；
．样品：取一份细胞加入4 μL浓度为0.5μg/μl的用荧光染料PerCP标记好的抗树鼩CD4分子单克隆抗体；
空白：取一份细胞不加用荧光染料PerCP标记的抗树鼩CD4分子单克隆抗体；
．室温下避光反应1-2小时；
4．每份加入1mL PBS，轻柔洗涤细胞一次，2000rpm/min离心10min，弃上清；
．每份加入300μL PBS重悬细胞，即可用流式细胞仪检测分析。
6. 结果见图5，数量为106个的外周血淋巴细胞，使用PerCP标记的上述CD4单克隆抗体可以检测到树鼩淋巴细胞表面CD4+的细胞百分比约为33.8%。
②树鼩CD4的蛋白免疫印迹Werstern-blot 检测的使用方法如下：
1.样品处理 上样与电泳
在收集的淋巴细胞蛋白样品或是重组蛋白样品按比例中加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液[250Mm Tris-HCl（pH6.8），10％（W/V） SDS，0.5％（W/V）BPB，50％（V/V）甘油，5％（W/V）β-巯基乙醇]，95℃加热5分钟，以充分变性蛋白。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。80V 25分钟，150V 60分钟电泳。
2. 转膜(Transfer)
使用半干转膜装置(BIO-RAD)，设定转膜电流为100mA，转膜时间为45分钟，按照转膜仪的说明书，将电泳后的蛋白转印至PVDF膜（购买自Millipore）上。
3. 封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把转膜完成的PVDF膜放置到预先准备好的5%（W/V）脱脂奶粉的TBS[20mM Tris-HCl，500 mM NaCl（pH7.5）]中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
将HRP标记的MAb-TSCD4-38（500μg/ml）按照1:1000体积比用TBS稀释，和封闭完成后的PVDF膜在侧摆摇床上缓慢摇动室温孵育一小时。
5. 洗膜
弃一抗稀释液，将一抗孵育好的膜置于洗膜盒（购买自Millipore）内,加入10ml洗膜液TBST[20mM Tris-HCl，500 mM NaCl（pH7.5）, 0.01%Tween-20(V/V）]10ml，在侧摆摇床上摇动，10分钟后换新的TBST，重复4次；
6. 蛋白检测(Detection of proteins)
按照说明书加入ECL（购买自Millipore）试剂，在暗室压片，经显影液定影液进行洗片。结果如图4，最低可以检测到0.5ug的树鼩淋巴细胞裂解蛋白样品可见清晰的CD4分子免疫印迹条带。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO.1
aaggaggtcg tactgagcag agcaggggac actgtggatt tgccgtgcac ggcttctgag 60
aagaagtacg cgttcttcaa ttggaaatac ccgaaccaga ccaagatcct ggggaaccag 120
agccccatct ccacgtggac tataggtctc tcctggctag caaagaaggt tgaatctaaa 180
aaaggccagt gggaacacgg gtccttcccc ctggtcatca aggaggctga ggtgaaagac 240
tccgggactt acatctgtga agtggagggc gcgaagaaag aggtggagtt gctggtgttc 300
cgactgaccg ccagcgcaga ccgggtgctg cagggccaga gcctgaccct gaccttggag 360
agcccggttg gcagtaaccc tttagtgcag tggaagagtc cagggaacag aaaccaaaac 420
accggcaagg ccttcacggt gacccagatg gggacccagg aaagtggcac ctggacgtgc 480
accgtctccc aggaccagag gaccctggtg ttcaagaaaa acatcgtcat gctgggtttc 540
cagaaggcct cgatgacact ctataagaaa gagggagagc gggtggacct ctccttccct 600
ctcaccttcg aggacgaaca cctgcgtggg gagctgcggt ggcaggcaga gcggcccccc 660
tcctccgagt cctgggtctc cttctccgta caggccaagg aggtgactgt gcaggggtcc 720
ctcccggatc tcaagctcca gatggccaaa agcctcccac tcagcatcac cctgccccag 780
gcccacctgc ggcacgccgg ctccgggaag ctgaccttga ctctcggcaa ggggcagctg 840
cagcaggacg tgaaccttgt ggtgatggca gtgactcagc tccagagtaa gctgacctgc 900
gaggtgctgg gccccacgct ccccacgctg acgctgagct ggaagctgaa gaatgagtca 960
aaggtctcaa agcaggagaa ggcggtgtgg ctgctggacc ccgaggcagg gatgtgggag 1020
tgtctgctga gtaacgggga ccaggtcctg ttgacatcca agtttgaagt ctcggcccga 1080
ctggtcaccc agagctggca aaccacactg atcgtggcgg tgggagccgc ggcgggcctg 1140
ctgtgtatcg gtctctgcgc tttctgctgc gtcaagtgcc ggcaccgacg gcgccaggca 1200
gagcggatgt ctcagatcaa gaggctcctc agtgagaaga agacctgcca gtgctcccac 1260
aggtttcaga agacatgtag tctcatgtga 1290
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 抗树鼩CD4分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaggaggtcg tactgagcag agcaggggac actgtggatt tgccgtgcac ggcttctgag 60
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tccgggactt acatctgtga agtggagggc gcgaagaaag aggtggagtt gctggtgttc 300
cgactgaccg ccagcgcaga ccgggtgctg cagggccaga gcctgaccct gaccttggag 360
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accggcaagg ccttcacggt gacccagatg gggacccagg aaagtggcac ctggacgtgc 480
accgtctccc aggaccagag gaccctggtg ttcaagaaaa acatcgtcat gctgggtttc 540
cagaaggcct cgatgacact ctataagaaa gagggagagc gggtggacct ctccttccct 600
ctcaccttcg aggacgaaca cctgcgtggg gagctgcggt ggcaggcaga gcggcccccc 660
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tgtctgctga gtaacgggga ccaggtcctg ttgacatcca agtttgaagt ctcggcccga 1080
ctggtcaccc agagctggca aaccacactg atcgtggcgg tgggagccgc ggcgggcctg 1140
ctgtgtatcg gtctctgcgc tttctgctgc gtcaagtgcc ggcaccgacg gcgccaggca 1200
gagcggatgt ctcagatcaa gaggctcctc agtgagaaga agacctgcca gtgctcccac 1260
aggtttcaga agacatgtag tctcatgtga 1290

Claims (5)

1.一种分泌抗树鼩CD4分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TS-CD4-38，保藏号为CCTCC NO:C2016221，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗树鼩CD4分子单克隆抗体。
3.权利要求2所述的抗树鼩CD4分子单克隆抗体在制备天然树鼩淋巴细胞表面CD4分子检测试剂或试剂盒中的应用。
4.一种天然树鼩淋巴细胞表面CD4分子的flow cytometry检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括用荧光染料PerCP标记的抗树鼩CD4分子单克隆抗体。
5.一种天然树鼩淋巴细胞表面CD4分子的western-blot检测试剂，其特征在于，所述的试剂包括辣根过氧化物酶标记的抗树鼩CD4分子单克隆抗体。
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田巍威等: "树鼩CD4 全长编码序列的克隆及分子特征分析", 《动物学研究》 *

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