CN108753734A

CN108753734A - 抗树鼩cd8分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用

Info

Publication number: CN108753734A
Application number: CN201810502966.3A
Authority: CN
Inventors: 董少忠; 张雪梅; 吴忠香; 徐婧雯; 朱文兵; 蒋曦; 宋杰; 李慧
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2038-05-23
Also published as: CN108753734B

Abstract

本发明涉及一种抗树鼩CD8分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用，属于分子生物学技术领域。该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TSCD8α‑C16，保藏号为CCTCC NO：C201877，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，可用于检测天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子，具有较好的灵敏度和特异性。

Description

抗树鼩CD8分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一个单克隆抗体，具体涉及产生特异性抗树鼩CD8分子抗体的杂交瘤细胞株和抗树鼩CD8分子抗体，以及所述抗体的应用。

背景技术

树鼩（tree shrew, Tupaia belangeri）是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩类的小型动物，形态酷似松鼠，是灵长类动物的近亲。由于树鼩具有体型小，经济易得，易驯养，繁殖能力强，饲养管理成本低、对人类病毒易感等优点，常常用于替代或减少一些非人灵长类动物的使用，所以很早就被用作灵长类目（包括人类）的疾病动物模型。近年来研究发现，在丙型肝炎、乙型肝炎、手足口疾病、肝癌、糖尿病、肿瘤等疾病的研究中得到广泛的应用。

CD8分子作为TCR的辅受体参与对MHC分子递呈抗原的识别，CD8⁺T细胞能识别MHCⅠ类分子递呈的抗原，CD8⁺T细胞与MHC分子的相互作用能加强MHC分子和TCR之间结合的亲和力。CD8分子在哺乳动物免疫防御中起重要作用，CD8⁺T细胞的数量指标是衡量机体细胞免疫情况的重要指标。

但目前对树鼩CD8分子方面的研究鲜有报道，且无可用的抗体来检测树鼩的CD8分子水平，对树鼩动物模型通过淋巴细胞表面分子检测分析其细胞免疫情况的评价尚属空白，严重阻碍了树鼩这一动物模型的研究和应用。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种抗树鼩CD8分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用，本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，可用于检测天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种分泌抗树鼩CD8分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TSCD8α-C16，保藏号为CCTCC NO：C201877，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

本发明还提供一种由上述的杂交瘤细胞分泌的抗树鼩CD8分子单克隆抗体。

本发明同时提供上述抗树鼩CD8分子单克隆抗体在制备天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子检测试剂或试剂盒中的应用。

进一步，本发明提供一种天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子的flow cytometry检测试剂，所述的试剂包括用Cy5.5荧光素标记的抗树鼩CD8分子单克隆抗体。

进一步，本发明提供一种天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子的western-blot检测试剂，所述的试剂包括辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗树鼩CD8分子单克隆抗体。

本发明单克隆抗体除了能特异性识别淋巴细胞中的CD8分子，也可以识别树鼩脾脏中的CD8分子，这种作用证明此单抗可识别树鼩体内不同的组织中的CD8分子。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，可用于检测天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子。

基于此建立的检测抗体，在流式细胞分析实验中能有效识别树鼩淋巴细胞表面的天然构象的CD8分子，具有较好的灵敏度和特异性。数量为10⁶个的外周血淋巴细胞，使用Cy5.5标记的上述CD8单克隆抗体可以检测到树鼩淋巴细胞表面CD8⁺的细胞百分比约为24.6%。

基于此建立的树鼩CD8蛋白的western-blot检测试剂，可用于分析树鼩脾脏CD8分子的表达情况，应用上述CD8单克隆抗体，可以检测到10 µg的树鼩脾脏裂解蛋白样品中清晰的CD8分子免疫印迹条带。该单抗存在抗体交叉反应，除了识别树鼩CD8分子，还可以识别小鼠和猴外周血PBMC中的CD8分子，具体参见图3。

附图说明

图1为树鼩CD8α重组蛋白GST-TSCD8α的表达SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白分子量Marker，1为pGEX-5X-TSCD8α诱导表达前总蛋白，2为pGEX-5X-TSCD8α诱导表达后超声上清总蛋白；

图2为单克隆抗体MAb-TSCD8α-C16识别重组蛋白GST-TSCD8α的western-blot图，其中M为蛋白分子量Marker，1为GST-TSCD8α纯化蛋白样品

图3为单克隆抗体MAb-TSCD8α-C16识别天然CD8蛋白的western-blot图，其中1为10 µg树鼩脾脏裂解蛋白样品，2为10 µg小鼠PBMC裂解蛋白；3为10 µg猴PBMC裂解蛋白。

图4为Cy5.5标记的单克隆抗体MAb-TSCD8-C16识别树鼩淋巴细胞表面CD8分子的流式细胞分析图，其中，a为外周血单个核细胞（PBMC）阴性对照；b为PBMC刺激后的CD8⁺的淋巴细胞。

本发明杂交瘤细胞株TSCD8α-C16，已于2018年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏号为CCTCC NO：C201877，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明除非另有说明，否则百分号代表体积百分数，比例代表体积比。

一、杂交瘤细胞株的建立：

（1.1）原核表达载体pGEX-5X-TSCD8α的构建

根据European Nucleotide Archive上发表的树鼩CD8α序列（ELV10794.1），及表达载体pGEX-5X-1的多克隆位点，设计包含EcoR I和Xho I 酶切位点的引物（CD8a F和CD8a R）用以扩增树鼩CD8α序列。从树鼩尾静脉采集外周血后，用淋巴细胞分离液（购买自AXIS-SHIELD）分离得到PBMC，经TRIZOL(天根)提取总RNA，并经逆转录PCR（购买自宝生物）得到树鼩CD8α分子的编码基因片段，用T4连接酶（购买自宝生物）连接到表达载体pGEX-5X-1后，送华大基因测序鉴定正确，得到GST标签重组蛋白表达质粒pGEX-5X-TSCD8α。其中树鼩CD8α分子的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

CD8a F: ccggaattctgctcctggctctaccagc；（SEQ ID NO.2）

CD8a R: ccgctcgagtcacctagggcatttgcaga。（SEQ ID NO.3）

（1.2）重组蛋白GST-TSCD8α的表达和纯化

将质粒pGEX-5X-TSCD8α转化入原核表达宿主菌BL21进行重组蛋白诱导表达，由于常规诱导表达条件不能获得以可溶形式存在的GST-TSCD8α，经过多次条件摸索，确定了LB培养基加1%葡萄糖，IPTG终浓度1 mM，20℃诱导表达3小时的培养条件，可以获得以可溶形式存在的重组蛋白GST-TSCD8α。以上述条件诱导表达后的菌液经8000转离心10分钟弃上清收集菌体，用亲和纯化的结合缓冲液（亲和纯化的结合缓冲液配方如下：NaCl 8.2 g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄-12H₂O 3.58 g， KH₂PO₄ 0.25 g， DTT 1.54 g，pH7.3，蒸馏水定容至1 L，0.45 µm滤膜过滤，4 ℃保存，DTT购自sigma，其余试剂为国产分析纯试剂）重悬菌体并进行超声破碎，超声破碎后以12000转离心20分钟，上清液即含有重组蛋白GST-TSCD8α，取上清液做SDS-PAGE电泳进行鉴定（图1），其余上清液经Glutathione Sepharose 4 Fast Flow（购自GE）进行亲和纯化，得到纯化重组蛋白GST-TSCD8α。

（1.3）动物免疫：选择8周龄左右的BALB/c健康小鼠，使用树鼩CD8α抗原多肽片段与等体积弗氏完全佐剂（第1次免疫）或弗氏不完全佐剂（第2、3次免疫）完全乳化后（所用佐剂均购买自sigma），经背部皮下多点免疫，免疫程序为分别于第1天，28天、56天进行免疫，第59天取小鼠脾脏研磨至只剩白色组织后经70目的细胞筛网过滤得到小鼠脾细胞。

树鼩CD8α抗原多肽片段：Lys Pro Pro Arg Asp Gly Phe Arg Ile Ala Asp GlyVal Asp（SEQ ID NO.4）

本发明使用抗原多肽进行免疫，现有的免疫原多为原核表达的重组蛋白。使用抗原多肽免疫使得免疫的特异性提高，因为抗原多肽是针对树鼩CD8分子分析后挑选出的多肽序列，使用多肽片段对小鼠进行免疫针对性更强，避免了之前选择原核表达重组蛋白作为免疫原带来的问题——重组蛋白所带标签蛋白带来的免疫干扰，本发明降低了由重组蛋白免疫时标签蛋白带来的抗原非特异性所造成的后续杂交瘤细胞株分泌抗体筛选过程的复杂性，抗原多肽免疫则使后续杂交瘤细胞株分泌抗体筛选过程更加简单.

（1.4）小鼠脾细胞和SP2/0细胞的融合：细胞融合前2天，选择12周龄的健康BALB/c小鼠，取其腹腔巨噬细胞制备饲养层细胞，使细胞浓度在10⁵个/mL左右，加入96孔板，每孔100μL，置于37℃、5％CO₂条件下培养备用。融合当天取步骤（1.3）免疫后的小鼠脾细胞和处于对数生长期的SP2/0细胞(购自ATCC)，按照10∶1的细胞数量比例进行混和，通过45%聚乙二醇(PEG)（购买自sigma）进行细胞融合，将融合后的杂交瘤细胞加入已含有饲养层细胞的96孔板中，使用含有1×HAT完全培养基（1×HAT（购买自sigma）、20%（V/V）胎牛血清、1640培养基(购买自Corning)），在37℃、5％CO₂条件下培养。

（1.5）杂交瘤细胞株的筛选：将步骤（1.4）获得的杂交瘤细胞在含有1×HAT的条件下培养10-14天，每隔4天更换一半量的1×HAT的完全培养基。在12天左右取培养上清进行间接ELISA以初次筛选能特异性分泌抗树鼩CD8分子的杂交瘤细胞。具体步骤如下：纯化后的重组蛋白GST-TSCD8α包被酶标板，取培养上清作为一抗，SP2/0细胞培养上清为阴性对照，二抗为HRP标记山羊抗小鼠IgG（1:6000）（购自Thermo），显色终止后，酶标仪检测450 nm吸光度值（A450值），以高于阴性对照A450值2.1倍以上的孔为阳性细胞孔，并进行下一步的亚克隆。

（1.6）选取步骤（1.5）中筛选得到的阳性细胞孔，将每孔的细胞吸取至加样槽，用1×HT完全培养基[1×HT（购买自sigma）、20%（V/V）胎牛血清、1640培养基(购买自Corning)]稀释至20mL后，均匀加至一个新的96孔板，每孔200μL，37℃、5％CO₂条件下培养5天后再次进行间接ELISA检测，再次选取高于阴性对照A450值2.1倍以上的孔，且细胞生长状态良好的细胞孔，分克隆至另一个96孔板，并换1×HAT完全培养基培养，如此重复三至四轮，直至整个96孔板的检测OD值均高于阴性孔OD值至少2.1倍，选取一孔生长状态好的细胞，用普通完全培养基[20%（V/V）胎牛血清、1640培养基(购买自Corning)]逐步扩大培养，并液氮冻存。

二、单克隆抗体腹水的大量制备及抗体的纯化：

将步骤（1.6）扩大培养得到的阳性（检测OD值高于阴性OD值至少2.1倍）克隆细胞腹腔注射入预先用石蜡油致敏过的10周龄BALB/c健康小鼠，每只小鼠注射细胞量为10⁶-10⁷个，10-14天后收取腹水，检测效价>1:3200的腹水样品分装冻存或进行纯化。

将上述小鼠腹水经proteinA柱（购买自全式金）纯化，得到小鼠抗树鼩CD8的单克隆抗体MAb-TSCD8α-C16，所得单克隆抗体用超滤离心管浓缩至1mg/mL，分装冻存备用。

三、单克隆抗体的标记：

将步骤二得到的纯化浓缩后单克隆抗体MAb-TSCD8α-C16按照标记试剂盒Lightning-Link® Rapid Cy5.5 Conjugation Kit（Innova Biosciences）按照说明书操作，标记上荧光染料Cy5.5，反应结束后加入等量体积的甘油，混匀后分装-20℃保存。

五、本发明产品组分及其特征：

以合成的树鼩CD8α抗原多肽片段（KPPRDGFRIADGVD）免疫小鼠后获取分泌特异性CD8单克隆抗体MAb-TSCD8α-C16阳性的细胞株TSCD8α-C16，能特异性识别天然的树鼩CD8分子。

所述抗体应用包括荧光染料Cy5.5标记的单克隆抗体MAb-TSCD8α-C16，主要应用于流式细胞分析。

所述抗体应用还包括单克隆抗体MAb-TSCD8α-C16应用于蛋白免疫印迹western-blot的检测。

其中，应用方法如下：

①流式细胞检测方法：

1. 树鼩经尾静脉采血，用淋巴细胞分离液Lymphoprep分离树鼩外周血中的PBMC，PBMC用PBS洗涤后细胞计数，调整细胞浓度为1×10⁷个/mL。每份取100 μL树鼩PBMC单细胞悬液，约1×10⁶个细胞；

2. 阴性：取一份细胞不加刺激剂，培养17小时后，不加抗体；

样品：取一份细胞加入刺激剂PMA 100 ng/mL和lonomycin 2 μg/mL，培养17小时后，加入4 μL Cy5.5标记的单克隆抗体MAb-TSCD8α-C16；

3. 室温下避光反应1-2小时；

4. 每份加入1 mL PBS，轻柔洗涤细胞一次，2000 rpm/min离心10 min，弃上清；

5. 每份加入300 μL PBS重悬细胞，即可上流式细胞仪检测分析。

6. 结果见图4，使用Cy5.5标记的上述CD8单克隆抗体可以检测到数量为10⁶个的树鼩淋巴细胞表面CD8⁺的细胞百分比约为24.6%。

②树鼩CD8的蛋白免疫印迹Werstern-blot 检测的使用方法如下：

1. 样品处理、上样与电泳

树鼩脾脏、小鼠PBMC和猴PBMC经RIPA蛋白裂解液处理后提取总蛋白，在树鼩脾脏裂解蛋白样品、小鼠PBMC裂解蛋白样品、猴PBMC裂解蛋白样品和GST-TSCD8α纯化蛋白样品中，按比例加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液[250Mm Tris-HCl（pH6.8），10％（W/V）SDS，0.5％（W/V）BPB，50％（V/V）甘油，5％（W/V）β-巯基乙醇]（加入样品后终浓度为1×），95℃加热5分钟，以充分变性蛋白。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。80V 30分钟，150V 50分钟电泳。

2. 转膜

使用半干转膜装置(BIO-RAD)，设定转膜电流为100mA，转膜时间为45分钟，按照转膜仪的说明书，将电泳后的蛋白转印至PVDF膜（购买自Millipore）上。

3. 封闭

转膜完毕后，立即把转膜完成的PVDF膜放置到预先准备好的5%（W/V）脱脂奶粉的TBS[20mM Tris-HCl，500 mM NaCl（pH7.5）]中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。

4. 一抗孵育

将MAb-TSCD8α-C16用TBS按照1:500比例稀释，小鼠β-actin单克隆抗体按照1:4000比例稀释，和封闭完成后的PVDF膜室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时或4℃过夜。

5. 洗膜

弃一抗稀释液，将一抗孵育好的PVDF膜置于洗膜盒（购买自Millipore）内，加入10mL洗膜液TBST[20mM Tris-HCl，500 mM NaCl（pH7.5），0.01%Tween-20(V/V）]10mL，在侧摆摇床上摇动，5分钟后换新的TBST，重复3次；

6. 二抗孵育

将HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗用TBS按照1:10000比例稀释，加入一抗孵育后洗涤过的PVDF膜，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育45分钟

7. 洗膜

弃二抗稀释液，将PVDF膜置于洗膜盒内,加入10mL洗膜液TBST 10mL，在侧摆摇床上摇动，10分钟后换新的TBST，重复4次；

8. 蛋白检测

按照说明书加入ECL（购买自Millipore）试剂，在暗室压片，经显影液定影液进行洗片。结果如图2和图3，CD8单克隆抗体可以检测到纯化蛋白样品中的GST-TSCD8α，也可以检测到总蛋白浓度为10 ug的树鼩脾脏裂解蛋白样品中的CD8分子。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

SEQ ID NO.1

tgctcctggc tctaccagcc gctcggcgcc gccgccagcc ccaccctgct cctgtacatc 60

cacaagccgc cccgcgacgg gttcaggatc gccgacgggg tggacgccaa gcggatctcg 120

ggcaagaggc tgcagagcaa cgtgtacagc ctcaccctga gccagttccg cgtggaggac 180

caaggctact acttctgctc cgtcaccggc aactccgtgc tgttcttcag ccccctggtg 240

ccggtgtcgc tgccagcgaa gcccaacacg acgcctgcgc cacggccacc cacgtcgccg 300

ctcaccaccg cgtccctgcc gcagtccacg cgcccggaag cgtgccggcc tggggcaggc 360

agcgcaggcg gcgcgaaggc gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 420

gccggcacct gcgcgatcct tctgctgtcg ctggtcatca ccctcatctg caaccacagg 480

aaccggaggc gtgtctgcaa atgccctagg tga 513

SEQ ID NO.2

ccggaattct gctcctggct ctaccagc 28

SEQ ID NO.3

ccgctcgagt cacctagggc atttgcaga 29

SEQ ID NO.4

Lys Pro Pro Arg Asp Gly Phe Arg Ile Ala Asp Gly Val Asp

1 5 10

序列表

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 抗树鼩CD8分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tgctcctggc tctaccagcc gctcggcgcc gccgccagcc ccaccctgct cctgtacatc 60

cacaagccgc cccgcgacgg gttcaggatc gccgacgggg tggacgccaa gcggatctcg 120

ggcaagaggc tgcagagcaa cgtgtacagc ctcaccctga gccagttccg cgtggaggac 180

caaggctact acttctgctc cgtcaccggc aactccgtgc tgttcttcag ccccctggtg 240

ccggtgtcgc tgccagcgaa gcccaacacg acgcctgcgc cacggccacc cacgtcgccg 300

ctcaccaccg cgtccctgcc gcagtccacg cgcccggaag cgtgccggcc tggggcaggc 360

agcgcaggcg gcgcgaaggc gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 420

gccggcacct gcgcgatcct tctgctgtcg ctggtcatca ccctcatctg caaccacagg 480

aaccggaggc gtgtctgcaa atgccctagg tga 513

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ccggaattct gctcctggct ctaccagc 28

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccgctcgagt cacctagggc atttgcaga 29

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Lys Pro Pro Arg Asp Gly Phe Arg Ile Ala Asp Gly Val Asp

1 5 10

Claims

1.一种分泌抗树鼩CD8分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TSCD8α-C16，保藏号为CCTCC NO：C201877，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗树鼩CD8分子单克隆抗体。

3.权利要求2所述的抗树鼩CD8分子单克隆抗体在制备天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子检测试剂或试剂盒中的应用。

4.一种天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子的flow cytometry检测试剂，其特征在于，所述的试剂包括用Cy5.5荧光素标记的抗树鼩CD8分子单克隆抗体。

5.一种天然树鼩淋巴细胞表面CD8分子的western-blot检测试剂，其特征在于，所述的试剂包括辣根过氧化物酶标记的抗树鼩CD8分子单克隆抗体。