JP5054426B2 - 抗β−1,3−グルカン・モノクローナル抗体 - Google Patents
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実施例1:抗BGモノクローナル抗体の作製
DBA/2マウスに,complete freund adjuvantと共にCSBGを皮下投与して免疫し、追加免疫を行った後、抗BG抗体価をCSBG固相化ELISAプレート用いチェックした。抗体価の上昇したマウスの脾臓中の抗体産生細胞とミエローマ(骨髄腫細胞:X63)を細胞融合させ、ハイブリドーマ作製した。HAT選択培地による培養を行い、オリゴクローナルな抗体産生細胞を得た。得られたオリゴクローナル抗体産生細胞を96 well plateに、1,2,3 cells/wellになるように撒き、限界希釈を行った。得られた陽性クローンをさらに,0.3,0.5,1 cells/wellになるように撒き2回目の限界希釈を行った。抗BGモノクローナル抗体産生細胞のスクリーニングはCSBG固相化ELISA法により行い、抗BGモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ1A5を得た。このハイブリドーマを共雑タンパクの少ないハイブリドーマメディウムで培養し、インテグラセルラインにて高密度培養を行った。
実施例2:抗BGモノクローナル抗体の精製
Candida細胞壁粒子状β-グルカン(OX-CA)をPBSにて2回洗浄し、精製担体として用いた。0.5M NaCl下、抗BGモノクローナル抗体産生ハイブリドーマBG1A5の培養上清とOX-CAを一夜反応させた。PBSにて2回洗浄後、OX-CAに結合した抗BGモノクローナル抗体を0.2M glycine-HCl buffer (pH 2.7)で溶出し、1M tris-HCl buffer (pH 9.0)で中和した。得られた抗BGモノクローナル抗体をSpectra/Por(MW cut off :20000)で透析し、HiTrap IgM Purification カラム(GE Healthcare Bio-Science AB)を用い、さらに精製調製した。
実施例3:抗BGモノクローナル抗体(BG1A5)の反応特異性
抗BGモノクローナル抗体(BG1A5)の反応特異性を検討するため、様々な抗原やBGを固相化したELISA plateを用い、抗BGモノクローナル抗体(BG1A5)の希釈系列を作製し、反応性を検討した。BGとしては、Candida細胞壁由来のCSBG(β-1.6-グルカンと1,3-グルカンを構成成分とするBG)、Agaricus brasiliensis由来AgHWE(β-1.6-グルカンを主成分とするBG)、Aspergillus細胞壁由来ASBG (β-1.3-グルカンを主成分とするBG)、Grifola frondosa由来GRN(1分岐1,3-グルカン)、Yeast-mannanを使用した。
さらに、高次構造に対する反応特異性を検討するためにCSBG-OH、CSBG-autoclave、SPG、SPG-OH、SPG-autoclaveによる競合ELISA法を検討した。抗BGモノクローナル抗体(BG1A5)はCSBG添加で抑制され、いずれのSPGにおいても抑制されなかった。
実施例4:抗BGモノクローナル抗体(BG1A5)の真菌細胞への結合
抗BGモノクローナル抗体(BG1A5)が病原性真菌(Candida albicans (CA)、 Aspergillus spp.)細胞壁に結合するか否かを検討するため、蛍光標識抗体を用い共焦点顕微鏡により観察した。
実施例5:脾臓細胞IFN-γ産生に対する抗BGモノクローナル抗体(BG1A5)の効果
Candida細胞壁由来BG(OX-CA、CSBG)刺激ICRマウス脾臓細胞のサイトカイン(IFN-γ)産生に対する抗BGモノクローナル抗体(BG1A5)の影響を検討した。
実施例6:抗BGモノクローナル抗体(BG1A5)の血中クリアランス
ICRマウスに抗BGモノクローナル抗体(1A5)(100μg/マウス)を腹腔内投与および静脈内投与し、投与後1、2、4、8、24、48、72時間に尾静脈より採血した。得られたサンプルの抗体価をCSBG固相化ELISA法にて測定した。
Claims (4)
- Candida細胞壁から精製したβ-グルカン(CSBG)で免疫したマウス脾臓に由来するハイブリドーマBG1A5(FERM AP-21284)から産生され、β-1,3-グルカンに高い反応性を有し、β-グルカン刺激による脾臓細胞のINF-γ産生を修飾することを特徴とする抗β-1,3-グルカン・モノクローナル抗体。
- 請求項1記載の抗β-1,3-グルカン・モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマBG1A5(FERM AP-21284)。
- 請求項1記載の抗β-1,3-グルカン・モノクローナル抗体を含むβ-1,3-グルカンの測定試薬。
- 請求項1記載の抗β-1,3-グルカン・モノクローナル抗体を有効成分とするβ-1,3-グルカン関連疾患の治療薬。
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