CN105315364A - 胶原蛋白vi疫苗预防动脉粥样硬化 - Google Patents

Abstract

本发明公开了氨基酸组成为SEQ？ID？NO.1—SEQ？ID？NO.7中任一种多肽，以及该多肽作为动脉粥样硬化相关抗原，可用于制备治疗动脉粥样硬化的疫苗。本发明利用一种新的多肽，特别是胶原蛋白VI的COL6A5(SEQ？ID？NO.1)、COL6A6(SEQ？ID？NO.2)片段作为抗原，免疫受试对象，从而达到治疗动脉粥样硬化的效果，对临床预防动脉粥样硬化具有重要意义。

Description

胶原蛋白VI疫苗预防动脉粥样硬化

技术领域

本发明涉及医学领域，特别是涉及一种胶原蛋白肽段预防和治疗动脉粥样硬化的应用。

背景技术

动脉粥样硬化是一种慢性、渐进性的动脉疾病，主要临床表现为血管中脂质沉积后血液流通受阻，进而部分或全部中断，最终引起中风、心肌梗死等生命危象。存在于血液中的脂类则是能量储存以及某些组织激素合成所必需的成分，当血液中的脂肪含量增加时，血流速度减慢，动脉壁上脂肪条纹逐渐形成，进而促使脂肪和胆固醇沉积并依附在平滑的动脉内膜上形成小结。小结下长出纤维化的瘢痕组织，加促钙沉积且逐渐演变为无法祛除的白垩状坚硬薄膜(即动脉粥样硬化斑块)。这层永久薄膜会阻碍动脉的正常扩张和收缩，从而减缓动脉内血流速度，逐渐形成血块，妨碍或阻止血液流经动脉。虽然该病的确切病因尚未确定，但是高血压，高脂血症，糖尿病以及吸烟史均已被证实为重要的致病因素。

近年来人们发现动脉粥样硬化同时还是一种多因素作用的自身免疫性疾病，它是由脂代谢失衡引起的一个慢性炎症性血管疾病，这个炎症反应是经过人体免疫系统精细调节的；免疫反应的初衷是要加速清除引起炎症反应的例如氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)、死亡细胞碎片及其毒性产物、暴露的血管基质蛋白(matrix)降解产物等，然而激活的免疫网络失衡、免疫耐受被打破，使得免疫反应成为促进动脉硬化的(pro-atherogenic)炎症反应，因此动脉粥样硬化已经被认为是一个自身免疫性疾病；随着免疫反应的保护作用被逐渐揭示，应用疫苗和抗体治疗已经在动物实验中得到证实。

Palinski等第一个应用氧化LDL免疫高脂血症的兔子动物模型。最初的目的是想看看ox-LDL激活免疫系统是否会加重疾病的发展，与预期恰恰相反的是，ox-LDL免疫的动物实际上是部分地得到了保护。这个观察的结果被后续的许多不同的动物模型实验证实，从而得到一个诱人的可能，就是用氧化LDL的抗原来制作动脉硬化的疫苗。然而，由于ox-LDL是一个复杂的分子颗粒，有许多的抗原成分，难以标准化操作，同时它还含有有害的抗原，因而氧化LDL本身不是一个好的疫苗选择。于是最近几年的大量努力工作就是试图从氧化LDL上找到真正能够诱导动脉保护免疫反应的抗原。

另一类氧化LDL的抗原是用蛋白水解醛(MDA)修饰的ApoB-100的肽段。ApoB-100是唯一与LDL始终联系在一起的蛋白。这些抗原有它的优势就是对氧化LDL的特异性，因为它们有独一无二的氨基酸顺序。抗原被MHC-II分子提呈通常是以12-18个氨基酸链的形式。Fredrikson等将ApoB-100等分为20个氨基酸为基本单位的多肽文库(共计302个多肽)，人工合成并通过动脉粥样硬化病人的血清，ELISA筛选相关肽段，阳性肽段制备疫苗免疫ApoE^-/-小鼠后发现，p45(661-680)可明显降低斑块面积达50％左右，同时在残存的斑块上巨噬细胞的数量降低，胶原蛋白的表达提高。免疫使得特异性的IgG显著增高，但对IgM的作用很小。IgG的表达同时由IgG2a转变为IgG1，提示由Th1向Th2转变。

目前已经发现的动脉粥样硬化相关抗原包括ox-LDL,HSP65/60，β2-glycoproteinI(β2GPI)和纤维连接蛋白(fibronectin)，其中ox-LDL的疫苗和抗体研究已经接近或正在进行临床试验。

胶原蛋白是动物体内最常见的一种蛋白，构成细胞外基质的骨架，已知的胶原蛋白有十余种。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原为间质性或纤维性胶原蛋白，体内含量最为丰富；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原为非纤维性或无定形胶原蛋白，存在于间质和基底膜内。胶原蛋白在核糖体内合成后，经过一系列酶的修饰，形成三螺旋结构的前胶原分子，在分泌出细胞时或稍后，前胶原分子被切去两端的前肽链后形成胶原原纤维，胶原原纤维再通过共价键结合形成胶原纤维。在创伤愈合过程中，伤口处出现大量的成纤维细胞，其功能正是合成和分泌胶原蛋白。COLⅥ是一种细胞外基质蛋白，以纤维网状结存在于结缔组织中，并与基底膜紧密连接，最早发现于人的主动脉内膜，随后又在人和牛的胎盘中分离得到。COLⅠ与COLⅢ是心脏细胞外基质的重要组成部分，为心肌细胞间信号传导提供结构和功能支持，而COLⅥ则与心急梗死后心脏重构与功能变化有关，COLⅥ可以聚集COLⅠ与COLⅢ组成纤维网状结构，进而阻塞冠状动脉左前降支，促进心肌梗死后心室重构，COLⅥ缺失后可以明显增强心脏功能降低心肌梗死后心室重构几率。近来研究表明COLⅥ三条肽链(α1、α2、α3)发生基因突变时，可引起Ullrich先天性肌营养不良(UllrichCongenitalMuscularDystrophy，UCMD)和Bethlem肌病(BethlemMyopathy，BM)的发生，主要临床表现为机体肌张力降低，还会出现皮肤异常瘢痕及毛发角质化。除此之外，COLⅥ的三条新肽链也被发现并定义，即α4、α5和α6。三条肽链N-末端主要为七个VWA(vonWillebrandfactorA)结构域，C-末端则为两或三个VWA结构域和一或两个独特序列，其中α4C-末端还含有一个Kunitz结构域，中间为胶原蛋白三重螺旋结构域。三条肽链在COLⅥα1-/-小鼠体内均无表达，说明三者的聚集需要α1的存在，与α3相似的空间结构则可以替代α3组成α1α2α4、α1α2α5或α1α2α6而发挥作用。虽然三者空间结构类似，但在人体内的分布于具体功能各异，α6在人体内广泛分布，而α5在人体内则主要分布于肺及皮肤，且广泛分布于小鼠体内各器官组织，具体差异性缘由还有待探索；α4已被证实与亚洲人膝关节炎发病相关，α5则分布于真皮乳头层与网状层间血管周围，保持表皮完整性阻止外界抗原通过皮肤渗透体内，其主要与过敏性皮炎发病相关，近来也被定义为COL29A1。

中国专利200710195398.9涉及肽在治疗动脉粥样硬化方面的应用。该中国专利所公开的技术主要是一种被动免疫疗法，利用载脂蛋白B的一个或多个片段经纯化或重组产生的抗体来达到治疗动脉粥样硬化的效果的。

目前，仍未有公开报道胶原蛋白多肽在预防和治疗动脉粥样硬化的应用。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一在于提供一种新的动脉粥样硬化相关抗原多肽。

具体技术方案如下。

氨基酸组成为SEQIDNO.1—SEQIDNO.7中任一种的动脉粥样硬化相关抗原多肽。

本发明需要解决的技术问题之二在于提供一种多肽在制备动脉粥样硬化的抗原中的应用。

具体技术方案如下。

氨基酸组成为SEQIDNO.1—SEQIDNO.7中任一种的多肽在制备动脉粥样硬化的抗原中的应用。

本发明需要解决的技术问题之二在于提供一种多肽在制备动脉粥样硬化的疫苗中的应用。

具体技术方案如下。

氨基酸组成为SEQIDNO.1—SEQIDNO.7中任一种的多肽在制备动脉粥样硬化的疫苗中的应用。

本发明的需要解决的技术问题之四在于提供一种治疗动脉粥样硬化的疫苗。

具体技术方案如下：

一种治疗动脉粥样硬化的疫苗，其多肽抗原片段为SEQIDNO.1—SEQIDNO.7中任一种。

在其中一个实施例中，所述多肽抗原片段的偶联载体为mcKLH和EDC。

在其中一个实施例中，所述多肽抗原片段为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2。

本发明经过大量的研究、实验筛选到胶原蛋白VI的COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL6A4、COL6A5、COL6A6和COL6A7等七个相关蛋白肽段，并应用COL6A5、COL6A6肽段免疫ApoE^-/-小鼠，得到降低动脉粥样硬化斑块面积50％的效果。流式细胞仪检测显示，疫苗免疫降低小鼠脾脏抗原提呈细胞(Dc细胞)的活化(MHCII)，增强B细胞的激活(CD86)，降低T细胞数量(CD3)，提高Treg细胞比例(CD4+CD25+Foxp3+)，降低CD4T细胞活性(CD28)，和CD4/CD8比例下降，提示COL6A6疫苗降低了高血脂引起的机体免疫反应，降低了动脉粥样硬化斑块形成。

本发明利用一种新的多肽，特别是胶原蛋白VI的COL6A5、COL6A6片段作为抗原，免疫受试对象，从而达到治疗动脉粥样硬化的效果，对临床预防动脉粥样硬化具有重要意义。

附图说明

图1为实施例1中多肽亲和差异性检测结果示意图；*:vsblankpeptidegroup,p

0.05；#:vsnormalpeptidegroup,p0.05.A:COL6A1；B:COL6A2；C:COL6A3；D:COL6A4；E:COL6A5；F:COL6A6；G:COL6A7；

图2为胶原蛋白VI肽段免疫ApoE-/-小鼠预防动脉粥样硬化结果示意图；

图3为胶原蛋白VI肽段抑制抗原提呈细胞激活结果示意图；

图4为胶原蛋白VI肽段促进B细胞激活结果示意图；

图5为胶原蛋白VI肽段降低T细胞水平结果示意图；

图6为胶原蛋白VI肽段降低CD4+T细胞活化结果示意图；

图7为胶原蛋白VI肽段降低CD4+T细胞比例结果示意图。

具体实施方式

本发明发现的与动脉粥样硬化相关联的第五个蛋白：抗原蛋白-胶原蛋白VI(CollagenVI,COL6)，在增厚的血管壁上大量存在。研究表明，即使增厚的管壁基底膜结构消失，弥散分布的胶原蛋白VI却依然存在。暴露的基质蛋白(matrixproteins)募集血小板、激活CD4T细胞，诱发炎症反应，而激活的T细胞反过来又限制胶原蛋白的成熟，影响斑块的稳定、影响纤维帽的形成。巨噬细胞和Mast细胞释放的一系列基质蛋白酶(matrixmelalloproteinases,MMPs)和半胱氨酸蛋白酶(cysteineproteases)大量降解暴露的基质蛋白，被降解的基质蛋白再被抗原提呈细胞吞噬、提呈给T细胞，激活免疫反应。应用基质蛋白fibronectin免疫ApoE^-/-小鼠获得降低斑块面积50％的预防效果，因而基质蛋白参与动脉粥样硬化炎症免疫反应，与动脉粥样硬化发生发展密切相关。

本发明中所合成的α5与α6肽段均位于其N-末端，24肽中所筛选12肽序列前端均含有一个信号肽插入裂解位点。两条多肽序列在人和小鼠同源性高，只有一个氨基酸改变，避免多肽免疫动物模型时自身免疫排斥反应的影响。免疫注射则借鉴于成熟的抗体制备方法，第六周初始免疫，三周后加强免疫，免疫剂量依据国外成功范例控制在每只50μg以上。

实施例1：ELISA检测合成多肽亲和差异性

用PH7.4(20ug/ml)的PBS溶液稀释天然或经修饰的合成肽，然后加入微孔滴定板的小孔中(NuncMaxisorp,Nunc,Roskilde,丹麦)，在4℃下孵化过夜。用含有0.05％Tween-20的PBS溶液清洗滴定板，然后在温室下，用含有Superblock的TBS溶液(Pierce,Rockfor,IL)封闭所述经包被的板5分钟，随后孵化人类血浆样品，用含有0.05％的Tween-20的TBS(TBS-T)以1:100的比例稀释所收集到的人血浆样品，AHP或NHP血浆，并将其加入反应板中，在室温下孵化2小时，然后在4℃下孵化过夜。洗板后，用生物素标记的兔抗鼠Ig抗体(DakoA/S,Glostrup,丹麦)检测沉积的抗所述肽的抗体，所述兔抗鼠抗体用TBS-T溶液进行适当的稀释，在室温下，继续孵化2小时；然后，洗板，用碱性磷酸酶结合的抗生蛋白链菌素(Sigma)检测结合的生物素标记的抗体，在室温下孵化2小时。用磷酸酶底物试剂盒(Pierce)进行显色反应，在室温下孵化1小时后，在405nm处测量吸光度。将不同肽的吸光度值进行比较。

结果见下表和图1。

表1

表2

表3

表4

*vsblankpeptidegroup，p0.05；^#vsnormalpeptidegroup，p0.05.

由人类血浆中的抗体所识别的胶原蛋白VI(CollagenVI,COL6)序列参见下面序列表。

结果表明所有合成多肽与病人血浆的亲和性均高于正常人血浆亲和性，且存在显著性差异，说明所有合成多肽均与血浆中的IgG结合，且病人血浆中结合的IgG含量明显高于正常人，而且其中胶原蛋白Ⅵ的两条多肽(COL6A5和COL6A6，即SEQIDNO.1和SEQIDNO.2)亲和性比值可以达到2倍以上，即在动脉粥样硬化的发病过程中，可以结合这两条多肽的IgG明显增多，达到正常人含量的2倍，进一步表明胶原蛋白Ⅵ与动脉粥样硬化的发病过程密切相关，且表达量增多，其IgG也随之增加。

所有上述的7个肽序列均代表了免疫反应的靶目标，所述免疫反应在动脉粥样硬化和缺血性心血管疾病的发生中可能起着重要的作用。因此，这些肽可以用于ELISA检测中，以确定抗体水平与发生心血管疾病的危险之间的关系。由于合成多肽长度较短，其免疫原性较弱，体外实验不能较好的与血清中的IgG完全结合，检测差异性时不能达到较高数值，但COL6A5和COL6A6两条多肽的亲和差异性较其他五条多肽具有更显著的效果。为了进一步证实这两条多肽是否真正的与疾病的发病相关，我们将通过制备多肽抗原免疫动物疾病模型并观察其相关性和预防效果。

实施例2：偶联抗原蛋白浓度测定

2.1.合成多肽抗原制备

(1)将2mg载体蛋白(mcKLH)溶解于200ul超纯水中，终浓度为10mg/ml，溶解过程中切勿振荡和加热以防止载体蛋白沉淀。

(2)最大溶解2mg合成多肽于450ulEDC偶联缓冲液(0.1MMES，0.9MNaCI，0.2g/LNaN₃，pH4.7)中，混合液中可加入低于30％(v/v)DMSO促进合成多肽的溶解，但高浓度DMSO可导致载体蛋白变性。

(3)将上述两种溶液混合，同时溶解10mgEDC于1mL超纯水中，并迅速吸取50ul液体加入多肽载体蛋白混合液中，室温孵育2h进行偶联。如若载体蛋白为BSA时，可直接溶解10mgEDC于混合液中并轻轻混匀。

(4)0.84g纯化缓冲盐溶解于10ml超纯水配制透析缓冲液(0.083MNa₃PO₄，0.9MNaCl，0.1MSorbitol，pH7.2)，4℃贮存，另缓冲液中需同时加入偶联缓冲液中相同浓度DMSO。

(5)将脱盐柱置于新鲜收集管中，1000g离心2min去掉残余液体，加入1ml透析缓冲液再次1000g离心2min，重复三次，彻底去除残余液体。

(6)更换收集管，脱盐柱树脂中心缓慢加入偶联后溶液，1000g离心2min，收集液体，过滤除菌，-20℃贮存。

2.2BCA测定合成抗原蛋白浓度

(1)取0.8ml蛋白标准配置液加入到蛋白标准品(20mgBSA)中，配制成25mg/ml蛋白标准品，-20℃贮存。取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。

(2)按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

(3)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板中，同时取合成抗原2ul加到96孔板中，均加标准品稀释液补足至20ul。

(4)各孔加入200ulBCA工作液，37℃放置30min，测定各孔吸光值，并根据标准曲线计算出合成抗原的蛋白浓度。

COL6A5和COL6A6两条多肽采用EDC交联剂分别与mcKLH载体进行偶联，并透析后过滤除菌，获得高抗原免疫性多肽。蛋白浓度测定抗原多肽分别为3.43mg/ml和3.46mg/ml，测定结果均显示在测量范围内。

实施例3：胶原蛋白VI多肽抗原免疫动物疾病模型以及检测

3.1多肽抗原免疫动物模型

取40只ApoE^-/-雄性小鼠均分为4组，普通饲料喂食。在6至7周周龄时，对ApoE^-/-小鼠进行分别腹腔注射100ul生理盐水、佐剂、COL6A5(SEQIDNO.1)合成多肽抗原及COL6A6(SEQIDNO.2)合成多肽抗原，从而进行初次免疫，3周后，进行腹膜内注射以加强免疫。从免疫一开始，就持续给予小鼠高胆固醇饮食，直到25周被处死。在处死小鼠时，4组小鼠的各组之间在体重上没有显著区别。

动物实验方案得到了南方医科大学南方医院实验动物伦理委员会的同意和批准。所有的动物都饲养在南方医科大学的动物实验室中，并以12小时白天/黑夜为周期进行饲养。所有动物都可以自由地饮水和饮食。在处死动物时，给动物吸入乙醚进行麻醉。在处死前，进行眼眶后取血。

3.2多肽免疫效果鉴定及免疫学指标的测定

动脉粥样硬化面积测定：将浓度为0.8g/ml的鸡蛋白蛋白(Sigma)水溶液与甘油以1:1的比例相混合。然后，加入叠氮钠，使叠氮钠的最终浓度达到0.2％。将降主动脉和腹主动脉周围的组织和脂肪清除干净后，将左锁骨下动脉至肾主动脉的动脉部分小心地切除下来，然后在Hisochoice(Amresco)中进行固定，过夜。然后，小心地纵向打开动脉，将有空腔的一面放在用鸡蛋白蛋白溶液进行新鲜涂覆的载玻片上。当白蛋白溶液变干后，用油红0对动脉进行染色，然后用计算机辅助的组织形态测定技术评价动脉粥样硬化的程度，测量标本中被动脉粥样硬化斑块覆盖的面积。

血清Th1、Th2细胞因子Luminex检测：用德国默克密理博Milliplex多因子检测试剂盒检测血清样本中TNF-alpha、IFN-gamma、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-6、IL-17、IL-21、IL-23、MCP-1等细胞因子。

血清Ig检测：用美国ImmunologyConsultantsLaboratory,Inc公司生产的IgG、IgM、IgE、IgG1、IgG2a等进行ELISA检测。

血脂测定：用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测血清中游离胆固醇、结合胆固醇、游离脂肪酸、结合脂肪酸、总胆固醇、总脂肪酸的含量。各组之间在统计学上没有显著性差异。

脾细胞FACS分析：用德国美天旎(MiltenyiBiotec)公司生产的CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD220、CD11c、CD80、CD86、MHCI、MHCII、Foxp3等抗体进行流式细胞学分析。

免疫组织化学和组织形态学：主动脉窦的切片用MOMA-2抗体(Serotec)按照标准程序进行免疫组织化学染色。用三色染色法评价胶原含量，用油红0染色评价斑块的大小，用标准的染色程序评价脂质含量。进行计算机辅助的形态测定分析从而进行如前所诉的组织形态学测定。

ELISA抗体滴度的测量：为了测定用肽进行免疫后的抗体反应，进行了ELISA检测。对加强免疫后两周的血样以及处死时血样进行了检测，测定了其中的抗免疫肽的抗体滴度。用PH7.4的PBS(20ug/ml)稀释合成肽，然后将其加入微孔滴定板的小孔中(Nunc,MaxiSorp,Nunc,Roskilde,丹麦)进行包被，在4℃下孵化过夜。用含有0.05％Tween-20的PBS(PBS-T)洗板，然后在温室下，用含有Superblock的TBS溶液(Pierce,Rockfor,IL)封闭所述经包被的板5分钟，随后加入用含有0.05％Tween-20的TBS(TBS-T)以1:100的比例稀释所收集到的血浆池，并加入反应板中，在室温下孵化2小时，然后在4℃下孵化过夜。洗板后，用生物素标记的兔抗鼠Ig抗体(DakoA/S,Glostrup,丹麦)检测沉积的针对所述肽的抗体，所述兔抗鼠抗体用TBS-T进行适当地稀释，在室温下，继续孵化2小时；然后，洗板，用碱性磷酸酶结合的抗生蛋白链菌素(Sigma)检测结合的生物素标记的抗体，在室温下孵化2小时。用磷酸酶底物试剂盒(Pierce)进行显色反应，在室温下孵化1小时后，在405nm处测量吸光度。

实验结果(参见图2至图7)显示，应用COL6A5(图中代号为A5)、COL6A6(图中代号为A6)肽段免疫ApoE^-/-小鼠，得到降低动脉粥样硬化斑块面积50％的效果(见实验结果)。流式细胞仪检测显示，疫苗免疫降低小鼠脾脏抗原提呈细胞(Dc细胞)的活化(MHCII)，增强B细胞的激活(CD86)，降低T细胞数量(CD3)，提高Treg细胞比例(CD4+CD25+Foxp3+)，降低CD4T细胞活性(CD28)，和CD4/CD8比例下降，提示COL6A6疫苗降低了高血脂引起的机体免疫反应，降低了动脉粥样硬化斑块形成。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.氨基酸组成为SEQIDNO.1—SEQIDNO.7中任一种的动脉粥样硬化相关抗原多肽。

2.氨基酸组成为SEQIDNO.1—SEQIDNO.7中任一种的多肽在制备动脉粥样硬化的抗原中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多肽为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2。

4.氨基酸组成为SEQIDNO.1—SEQIDNO.7中任一种的抗原多肽在制备动脉粥样硬化的疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗原多肽为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2。

6.一种治疗动脉粥样硬化的疫苗，其特征在于，所述疫苗的多肽抗原为SEQIDNO.1—SEQIDNO.7中任一种。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述多肽抗原为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2。

8.根据权利要求6或7所述的疫苗，其特征在于，所述多肽抗原的偶联载体为mcKLH和EDC。