CN108727492B - 抗胶原蛋白vi全人抗体消退动脉粥样硬化的免疫治疗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗胶原蛋白VI全人抗体，其互补决定区中的重链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示，且有零个、一个或多个氨基酸被取代，取代后活性不变的序列；和互补决定区中的轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示，且有零个、一个或多个氨基酸被取代，取代后活性不变的序列。所述抗胶原蛋白VI全人抗体可用于治疗动脉粥样硬化。

Description

抗胶原蛋白VI全人抗体消退动脉粥样硬化的免疫治疗

技术领域

本发明涉及医学领域，特别是涉及一种抗胶原蛋白VI全人抗体及其在消退动脉粥样硬化的免疫治疗中的应用。

背景技术

世界卫生组织的报告显示，心脑血管疾病、癌症和传染病是当前人类的三大主要死因，其中死于心脑血管疾病所占的比例最多,每年约有1700万人死于心血管疾病。动脉粥样硬化是急性心肌梗死、缺血性脑卒中等心脑血管疾病的主要病理基础。它是一种慢性、渐进性的动脉血管炎症性疾病，主要累及大中型肌弹力型动脉，主要临床表现为血管中脂质沉积后血液流通受阻，进而部分或全部中断，最终引起中风、主动脉瘤及心肌梗死等生命危象。这种炎症性疾病已经被证明是经过机体免疫系统精细调节的自身免疫性疾病。

天然免疫和获得性免疫均参与了动脉粥样硬化的发展和转归过程。巨噬细胞、树突状细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和肥大细胞等免疫细胞普遍存在于动脉粥样硬化斑块中。目前已相继发现并证实的动脉粥样硬化相关的抗原与抗体包括病原微生物、β2糖蛋白I(β2-glycoprotein I，β2GPI)、热休克蛋白65/60(Heat shock protein 65/60，HSP65/60)、氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein，oxLDL)、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)、载脂蛋白B-100(apolipoprotein B-100，apoB-100)和一些细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白等。

应用动脉粥样硬化相关抗原oxLDL制备的单克隆抗体治疗动脉粥样硬化已经由瑞典的BioInvent生物公司推进到II期临床实验。他们应用的是由Jan Nilsson和GunillaNordin Fredrikson发现的ApoB-100上的保护性肽段(专利号200710195398.9)，经过

的抗体库筛选相应的抗体2DO3和LDO D4,获得降低动脉粥样硬化斑块面积50％以上的治疗效果(专利号：200680040006.5)。

我们利用动脉粥样硬化病人血清筛选NEB公司的12肽库(Ph.D.-12TM PhageDisplay Peptide Library),发现动脉粥样硬化相关抗原胶原蛋白VI(CVI)，并利用相应的肽段制备疫苗免疫ApoE^-/-小鼠，获得抑制动脉粥样硬化斑块50％以上的预防效果(专利申请号：201410270589.7)。

申请人利用动脉粥样硬化病人B细胞构建大容量全人性噬菌体单链抗体库(scFv库)，通过亲和淘选，筛选得到特异性的抗胶原蛋白VI单链抗体(亲和力超过10⁸)，应用分子生物学方法重组构建全长完整的全人性抗体(IgG1)，并于293F细胞中表达纯化后，鉴定其性质功能；并将纯化的全人抗体腹腔注射ApoE^-/-的小鼠，研究其对动脉粥样硬化的作用。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一在于提供一种抗胶原蛋白VI全人抗体。

具体技术方案如下。

一种抗胶原蛋白VI全人抗体，其互补决定区中的重链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，且有零个、一个或多个氨基酸被取代，取代后活性不变的序列；和互补决定区中的轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，且有零个、一个或多个氨基酸被取代，取代后活性不变的序列。

或者是一种抗胶原蛋白VI全人抗体，其互补决定区中的重链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示，且有零个、一个或多个氨基酸被取代，取代后活性不变的序列；和互补决定区中的轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示，且有零个、一个或多个氨基酸被取代，取代后活性不变的序列。

本发明的另一个目的是提供上述抗胶原蛋白VI全人抗体的应用。

具体技术方案如下。

上述抗胶原蛋白VI全人抗体在制备防治动脉粥样硬化的药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种防治动脉粥样硬化的药物。

具体技术方案如下。

一种防治动脉粥样硬化的药物，其活性成份包括有上述抗胶原蛋白VI全人抗体。

以胶原蛋白VI为靶标对构建的动脉粥样硬化噬菌体抗体库进行富集和筛选，得到一批特异性结合胶原蛋白VI的噬菌体抗体单克隆，其中6Ab、14Ab全人完整抗体表达量高、特异性强(亲和力超过10⁸)，进行下一步细胞功能实验，发现6Ab和14Ab均能够抑制氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的CD14⁺单核巨噬细胞凋亡，14Ab能抑制单核细胞释放MCP-1，而6Ab则无此功能。6Ab和14Ab均能够影响oxLDL诱导的单核细胞分化和巨噬细胞分化，其中包括减少oxLDL诱导的CD14⁺⁺CD16^-经典型单核细胞和CD14⁺⁺CD16⁺中间型单核细胞，增加CD14^-CD16⁺旁路型单核细胞，其中6Ab较14Ab的效果显著；两株抗体均能抑制oxLDL诱导的CD68⁺CCR2⁺M1型巨噬细胞分化，均能增加CD163⁺CD206⁺M2型巨噬细胞分化，其中6Ab较14Ab的效果显著。动物实验证明，6Ab和14Ab均能减少ApoE^-/-小鼠的主动脉斑块面积，其中6Ab较14Ab的效果更好。所述筛选到的抗胶原蛋白VI全人抗体(6Ab和14Ab)，可以用于制备防治动脉粥样硬化的药物。

附图说明

图1中 6Ab和14Ab能减少ApoE-/-小鼠的主动脉斑块面积，其中，图1A为动脉粥样硬化斑块油红O染色的例图，图1B是斑块面积统计学结果。

图2中 6Ab和14Ab降低oxLDL诱导的CD14阳性单核巨噬细胞凋亡，其中，图2A是流式细胞分析的例图，图2B是凋亡细胞统计学结果。

图3中 14Ab显著减少oxLDL诱导的中间型单核细胞的分化，而6Ab逆转oxLDL诱导旁路型单核细胞分化减少的效果，其中，图3A是单核细胞分型流式细胞分析例图，图3B是经典型细胞统计结果，图3C是中间型细胞统计结果，图3D是旁路型细胞统计结果。

图4 中14Ab减低oxLDL诱导的M1型巨噬细胞分化，其中，图4A是M1型巨噬细胞流式细胞分析例图，图4B是M1型巨噬细胞统计学结果。

图5 中6Ab和14Ab提高M2型巨噬细胞的表达，其中，图5A是M2型巨噬细胞流式细胞分析例图，图5B是M2型巨噬细胞统计学结果。

图6中 6Ab和14Ab能够促进CD14阳性单核巨噬细胞的吞噬功能，其中，图6A是流式细胞分析吞噬的凋亡细胞例图，图6B是CD14阳性单核巨噬细胞吞噬凋亡细胞功能的统计学结果。

具体实施方式

抗体(Ab)的重链和轻链可变区(V区)内的高变区(HVR区)构成抗体分子的抗原(Ag)结合点,因为抗原结合点是与抗原表位结构相互补的,所以高变区又称为抗体分子的互补决定区(complementarity-determining region,CDR)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的高变区各有3个亚区，即如下表中重链的H1、H2、H3和轻链的L1、L2、L3，各三个亚区。VH和VL的这三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位，即如上所述的CDR。H1，H2，H3分别代表重链的CDR1、CDR2、CDR3；L1、L2、L3分别代表轻链的CDR1、CDR2、CDR3。

其中，本发明的一个实施例中，代号为6Ab的抗胶原蛋白VI全人抗体，其互补决定区中的重链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的序列，互补决定区中的轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示；代号为14Ab的抗胶原蛋白VI全人抗体，其互补决定区中的重链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示的序列，互补决定区中的轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQID NO.12所示；代号为64Ab是对胶原蛋白VI失去结合能力的人源抗体，其互补决定区中的重链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示的序列，互补决定区中的轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.18所示，我们用来做为同型对照组。具体如表1所示。

表1：各抗体的CDR序列:

本领域的技术人员人员，可以根据其掌握的常识，对上述代号为6Ab和14Ab的抗胶原蛋白VI全人抗体进行适当的改变，例如其互补决定区中的重链的H1，H2，H3中，可以有一个或多个氨基酸被取代，但活性不发生变化；或者互补决定区中的轻链的L1、L2、L3中，也可以有一个或多个氨基酸被取代，但活性不变，即根据6Ab或14Ab的H1，H2，H3和L1、L2、L3做适当的氨基酸取代，但活性不变的抗胶原蛋白VI全人抗体；上述这种经过常规技术改变的依然具有活性的抗胶原蛋白VI全人抗体，也属于本发明的保护范围之内。

在一个实施例里，还涉及了上述抗胶原蛋白VI全人抗体(6Ab和14Ab或相应的抗体)在制备防治动脉粥样硬化的药物应用。

在一个实施例里，涉及了一种防治动脉粥样硬化的药物，其活性成份包括有上述抗胶原蛋白VI全人抗体(6Ab、14Ab或相应的抗体)。

本发明中所述重组抗体6Ab和14Ab能有效减少主动脉斑块面积，其机制可能是两株抗体能够通过降低血管损伤部位oxLDL的毒性效果，使吞噬oxLDL的巨噬细胞凋亡坏死减少，保证其吞噬功能以清除血管斑块中的脂肪组织。另一方面，CVI单克隆抗体能够诱导单核细胞和巨噬细胞向吞噬功能较高的CD14^-CD16⁺旁路型单核细胞和CD163⁺CD206⁺M2型巨噬细胞分化，抑制炎性功能较强的CD14⁺⁺CD16^-经典型单核细胞和CD14⁺⁺CD16⁺中间型单核细胞，以及CD68⁺CCR2⁺M1型巨噬细胞分化，从而增强了免疫系统清除血管斑块脂肪组织的功能，并降低脂代谢失衡引起的血管炎症反应。

实验材料和方法

一、主要实验仪器

流式细胞仪：BD,FACSVerse,美国

多光谱微孔板阅读器：Molecular Devices,SpectraMax M5，美国

倒置显微镜：Optec，重庆，中国

正置显微镜：Carl Zeiss，德国

二、主要试剂与材料

1.实验动物：ApoE^-/-小鼠(C57BL/6背景)购买于北京大学医学部动物实验中心。所有饲养及实验皆依照《南方医科大学实验动物管理办法(试行)》和《南方医科大学动物实验伦理审查指南(试行)》原则进行。所有老鼠均可自由进食饮水；空调保持20-25℃，相对湿度为50％～60％。采用人工控制室内照明，保持12h光照(8：00～20:00)和12h黑暗(20:00～次日8:00)交替循环，动物饲养笼具、饮水瓶定期清洁、消毒。

2.70um的细胞滤器：BD，美国

3.流式相关抗体CD14-PE抗体、CD16-FITC抗体、CD206(MMR)-APC/Cy7抗体、CD163-PerCP/Cy5.5抗体、CD192(CCR2)-PE/Cy7抗体和CD68-PE抗体均购于Biolegend公司；Histopaque-1077淋巴细胞分离液购于Sigma；LS柱子、磁力架和CD14磁珠购于MiltenyiBiotec公司；固定破膜液购于eBioscience公司；RPMI1640、EDTA、PBS缓冲液、胎牛血清和Annexin V凋亡试剂盒购于invitrogen公司；BSA购于Genview公司；CellTrace Far Red和CellTrace CFSE购于Life Technologies公司。

根据上述表1中6Ab、14Ab的重链的H1、H2、H3和轻链的L1、L2、L3，各三个亚区，制备时可参照如下全人完整抗体6Ab、14Ab的表达序列。

6Ab重链完整序列：

ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACAATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCGCTCAGGATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGATGA(SEQ ID NO.19)

6Ab轻链完整序列：

ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCAGCCATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGAAACAGCCAGGAAAGCGTGACAGAGCAGGATTCCAAGGATTCCACATACAGCCTGAGCAGCACACTGACACTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACACACCAGGGACTGTCCTCCCCTGTGACAAAGAGCTTCAACAGAGGAGAATGCTGA(SEQ ID NO.20)

14Ab重链完整序列：

ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCCATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGAGTATTACTGTGCCCAAACTCTAACTGGGTATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO.21)

14Ab轻链完整序列：

ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGAAACAGCCAGGAAAGCGTGACAGAGCAGGATTCCAAGGATTCCACATACAGCCTGAGCAGCACACTGACACTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACACACCAGGGACTGTCCTCCCCTGTGACAAAGAGCTTCAACAGAGGAGAATGCTGA(SEQ ID NO.22)

三、溶液配制

1.0.83％NH4Cl即红细胞裂解液：称取0.83g NH4Cl溶于100ml的去离子水中，0.22um滤膜过滤去菌，4℃保存。

2.油红O母液：0.5g油红粉末溶于溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至100ml，滤纸过滤，4℃避光保存。

3.油红O工作液：油红O母液与双蒸水以3:2的比例混匀，用前滤纸过滤，2h内使用。

四、实验方法

1.动物处理

ApoE^-/-小鼠，40只，随机分为4组：PBS空白对照组；64Ab阴性对照组；22Ab；14Ab。从4～6周龄开始喂高脂饲料(0.15％胆固醇，21％脂肪)至24周，换正常饲料喂养。在第25周各组腹腔注射0.5ml(2mg/ml)对应的抗体，PBS组注射0.5ml的PBS，每周一次，共三周(即25W、26W、27W)(见表4-1)。

在第29周，禁食不禁水12h。用10％水合氯醛0.04ml/10g体重腹腔注射麻醉药。采用眼球摘除法，从眼眶静脉丛采集血液标本1ml，室温静置1h后，1000g室温离心20分钟，取上层血清分装50ul/管，于-80℃保存。取血后采用脊椎脱臼处死小鼠，打开胸腔腹腔并剪断一侧髂动脉后，用注射器往小鼠左心室内注入PBS，充分冲洗掉血管中的血液，再注入固定液冲洗血管。分离小鼠主动脉根部至腹主动脉分叉处的主动脉，剥离去掉血管外周的脂肪组织，纵向剪开主动脉，暴露主动脉内膜。将主动脉内膜向上贴于载玻片上，于4％多聚甲醛中固定24h。

表2实验设计和分组处理

Table 2 Experimental Design and Treatment Groups

*Weeks of age

2、油红O染色

70％酒精漂洗固定好的动脉，然后侵入油红O工作液中染色10min，再70％酒精漂洗2min，蒸馏水漂洗2次，甘油明胶封片。数码相机微距镜头拍照，用Image pro plus软件计算斑块面积。

3、脾细胞的流式分析

(1)取脾，剔除筋膜，剪碎脾组织。于70um滤器上，用5ml注射器胶头研磨脾，PBS冲洗后，室温，1000rmp离心5分钟。

(2)弃上清，加6ml红细胞裂解液重悬，室温孵育6分钟，补加3ml含0.5％BSA的PBS缓冲液，室温1000rmp离心5分钟。

(3)弃上清，加2ml PBS重悬。再次过滤细胞，去除团块。

(4)取少量细胞稀释并计数。将所有小鼠脾细胞都稀释为2.8X 10⁷个/ml。

(5)每个EP管取35ul细胞，约1X10⁶个细胞。每管加入5ul稀释的FcR BlockingReagent，4℃孵育10分钟。

(6)加入提前以1:4稀释好的流式抗体10ul(T细胞组：CD4-FITC、CD8a-Percp、CD25-PE、Foxp3-APC、CD28-PECy7；抗原提呈细胞组：B220-Percp、MHCII-PE、CD86-FITC(CD80-FITC)CD11c-APC)，4℃孵育30分钟。

(7)加1ml PBS，4℃1000rmp离心5分钟。

(8)弃上清，抗原提呈细胞组只需要染细胞表面分子标志，加500ul含0.5％BSA的PBS缓冲液，准备上机。

(9)T淋巴细胞组加入0.5ml 1x Fix/Perm buffer，涡旋振荡3S，4℃避光孵育40分钟。

(10)补加0.5ml 1x Perm/Wash Buffer，4℃350g离心6分钟。

(11)弃上清，加入FcR Blocking Reagent 4℃孵育10分钟。

(12)加入Foxp3抗体，4℃孵育30min。

(13)加1ml 1x Perm/Wash Buffer，颠倒混匀后，4℃350g离心6分钟。

(14)弃上清，加500ul PBS重悬，准备流式上机。

oxLDL的制备

从南方医院获得废弃血清，往血清中加入溴化钠至过饱和，放入冰箱4℃过夜，往超速离心管加入3ml血清，再加入PBS至满，用超速离心机60000转4℃离心6.5h，用注射器吸取离心后上层的淡黄色条带，即低密度脂蛋白LDL，装进透析膜，用PBS缓冲液4℃冰箱过夜透析去除LDL中含有的溴化钠，将透析好的LDL转至离心管，按每升加入5μmol的硫酸铜氧化LDL,放入37℃水浴锅24h进行氧化反应，反应完用含终浓度为200μmol/L的EDTA的PBS缓冲液透析24h去除Cu2+。用BCA法测定oxLDL浓度,采用TBARS法鉴定LDL的氧化修饰程度。

人外周血分离PBMC

广州血站中心提供健康人外周血(已加入抗凝剂)，将外周血以等体积加在淋巴细胞分离液上层，400g离心30min后取上层和中层分界处的白膜层，即单个核细胞群，加入PBS缓冲液(含0.5％BSA和2Mm EDTA)，250g离心10min，去上清，加入25ml PBS缓冲液洗涤细胞，离心后去上清即可获得PBMC。

CD14+单核细胞的分离和实验分组

计数上述获得的PBMC，300g离心10min，将上清完全去除，每10 7个细胞加入80μlPBS缓冲液(含0.5％BSA和2Mm EDTA)重悬细胞，并加入20μl CD14磁珠混合均匀置于2-8℃避光孵育15min，每10 7个细胞加入1-2ml PBS缓冲液洗去未结合的磁珠，离心后每10 8个细胞用500μl PBS缓冲液重悬，将细胞重悬液加入LS分离柱，用3ml PBS缓冲液洗涤柱子3次，收集吸附在LS柱子上面的CD14阳性的单核细胞，用培养基洗涤细胞一次，去除PBS缓冲液后用10％完全培养基重悬单核细胞，每孔150μl 2x10 6个细胞种在48孔板。新鲜分离的单核细胞分别接受FBS、oxLDL、64Ab+oxLDL、6Ab+oxLDL和14Ab+oxLDL刺激，并于37℃培养箱内培养48h后进行各项指标检测。

细胞凋亡检测

收集刺激处理后细胞，用冰冷的PBS清洗，准备1x annexin-binding buffer和100μg/ml的PI工作液，离心细胞，去上清，用100ul 1x annexin-binding buffer重悬细胞(每管约10 6个/ml细胞)，加入5μl annexin V和1μl 100μg/ml的PI工作液到100μl的细胞重悬液中。室温孵育15min，加400μl 1x annexin-binding buffer，轻柔混匀，放于冰上保存，尽快用流式细胞仪检测，annexin V阳性细胞为凋亡细胞。

单核细胞分型检测

收集刺激处理后的细胞，用冰冷的PBS清洗，弃上清后用100μl预冷的PBS缓冲液重悬细胞，每个样品加入5μl CD14-PE和5μl CD16-FITC抗体置冰上避光染色20min，加入1mlPBS缓冲液洗两次，去除非特异性结合抗体，用200μl PBS缓冲液重悬后即可用流式细胞仪检测，其中，CD14++CD16-为经典型单核细胞，CD14++CD16+为中间型单核细胞，CD14-/+CD16+为旁路型单核细胞。

巨噬细胞分型检测：收集刺激处理后的细胞，用冰冷的PBS清洗，弃上清后用预冷的PBS缓冲液洗一次，弃上清后用100μl预冷的PBS缓冲液重悬细胞，每个样品加入各5μl的CD206(MMR)-APC/Cy7、CD163-PerCP/Cy5.5和CD192(CCR2)-PE/Cy7冰上避光染色20min，加入1ml PBS缓冲液清洗两次，去除非特异性结合，用100μl PBS缓冲液震荡重悬细胞后加入100μl固定液，震荡混匀，室温避光固定细胞20-60min，加100μl破膜缓冲液，400-600g室温离心5min，去上清，用破膜缓冲液清洗2遍后，加CD68-PE室温避光孵育20-60min，加2ml 1x破膜缓冲液重悬，400-600g室温离心5min，离心清洗2遍后，用500μl PBS缓冲液重悬，尽快用流式细胞仪检测，其中，CD163+CD206+为M2型巨噬细胞，CD68+CCR2+为M1型巨噬细胞。

巨噬细胞吞噬凋亡细胞实验：去除各刺激组中悬浮的细胞并收集贴壁的巨噬细胞，用PBS缓冲液清洗一次，加CellTrace Far Red(1:1000)染液到各组巨噬细胞，同时收集oxLDL诱导的凋亡细胞并用PBS缓冲液洗一次，加CellTrace CFSE(1:1000)染液到凋亡细胞，轻柔混匀细胞，均在37℃细胞培养箱避光孵育20min，加10％完全培养基混匀，在37℃细胞培养箱孵育5min，离心细胞并去除上清，用新鲜预暖10％的完全培养基重悬细胞，将染了CellTrace CFSE的凋亡细胞加入染了CellTrace Far Red的各组巨噬细胞，在37℃细胞培养箱孵育1-2h，收集各组细胞，尽快用流式细胞仪检测，其中，CellTrace Far Red和CellTrace CFSE双阳性的为吞噬了凋亡细胞的巨噬细胞。

统计学分析：统计采用SPSS软件处理。所有资料均为定量资料，以“均数±标准差”表示，显著性检验采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有显著性，其中，*:p<0.05；**:p<0.01；***:p<0.001。

本发明实验采用6Ab、14Ab和64Ab。其中6Ab、14Ab为抗胶原蛋白VI的全人全长抗体；64Ab是不与胶原蛋白VI结合的对照全人抗体，我们用来做为同型对照组。具体动物实验结果参见图1。

实验结果

1、6Ab、14Ab能减少ApoE-/-小鼠的主动脉斑块面积

分离小鼠主动脉根部至腹主动脉分叉处的主动脉，剥离去掉血管外周的脂肪组织，纵向剪开主动脉，暴露主动脉内膜。经油红O染色后，用Image pro plus软件计算斑块面积。各组斑块面积差异具有统计学意义。其中6号抗体较对照抗体组降低60％，14号抗体较PBS组降低45％(图1)。

2、6Ab和14Ab降低oxLDL诱导的CD14+单核巨噬细胞凋亡

人全血细胞经硫酸铵溶液去除红细胞后，淋巴细胞分离液离心提取白细胞，并经CD14阳性磁珠纯化CD14+单核巨噬细胞，与oxLDL共孵育诱导细胞凋亡。CVI抗体及对照抗体抑制凋亡细胞的效果经PI/Annexin V流式细胞仪检测结果见图2。

3、14Ab显著减少oxLDL诱导的中间型单核细胞的分化，而6Ab逆转oxLDL诱导旁路型单核细胞分化减少的效果。

CD14阳性细胞如图2方法制备。流式细胞仪方法检测oxLDL诱导的单核细胞分化，其中中间型单核细胞(CD14⁺⁺CD16⁺)大量增加，而旁路型单核细胞(CD14^-/+CD16⁺)显著下降。6Ab和14Ab对其影响的趋势相同，但是6Ab逆转旁路型单核细胞下降和14Ab逆转中间型单核细胞增加，分别具有统计学意义(图3)。

4、14Ab减低oxLDL诱导的M1型巨噬细胞分化，6Ab、14Ab提高M2型巨噬细胞的表达。

oxLDL诱导CD14阳性细胞向M1型巨噬细胞(CD68⁺CCR2⁺)分化,14Ab具有显著的抑制作用。而6Ab尽管没有显著的抑制M1细胞的分化，但是它跟14Ab一样能够大大促进M2型巨噬细胞(CD163⁺CD206⁺)的分化(图4和图5)。

5、6Ab和14Ab能够促进CD14阳性单核巨噬细胞的吞噬功能

oxLDL诱导的凋亡细胞经CFSE标记后，与CD14阳性细胞共孵育，流式细胞仪检测发现6Ab和14Ab可以大大加强单核巨噬细胞的吞噬功能(图6)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州文瑞生物科技有限公司

<120> 抗胶原蛋白VI全人抗体消退动脉粥样硬化的免疫治疗

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 6Ab H1

<400> 1

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 6Ab H2

<400> 2

Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 6Ab H3

<400> 3

Ala Arg Val Ala Gln Asp Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 6Ab L1

<400> 4

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 6Ab L2

<400> 5

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro

1 5 10

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 6Ab L3

<400> 6

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 14Ab H1

<400> 7

Gly Gly Thr Phe Ser Ser His Ala Ile Ser Trp Val

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 14Ab H2

<400> 8

Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 14Ab H3

<400> 9

Ala Gln Thr Leu Thr Gly Tyr Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 14Ab L1

<400> 10

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 14Ab L2

<400> 11

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro

1 5 10

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 14Ab L3

<400> 12

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 64Ab H2

<400> 13

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 64Ab H2

<400> 14

Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr

1 5 10

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 64Ab H3

<400> 15

Val Lys Asp Pro Phe Trp Ser Gly Tyr Arg Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> 64Ab L1

<400> 16

Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln

1 5 10

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 64Ab L2

<400> 17

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro

1 5 10

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 64Ab L3

<400> 18

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 19

<211> 1407

<212> DNA

<213> 6Ab重链完整序列

<400> 19

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattcccag 60

gtgcagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg ggtcctcggt gaaggtctcc 120

tgcaaggctt ctggaggcac cttcagcagc tatgctatca gctgggtgcg acaggcccct 180

ggacaagggc ttgagtggat gggagggatc atccctatct ttggtacagc aaactacgca 240

cagaagttcc agggcagagt cacaattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg 300

gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agtcgctcag 360

gatgatgctt ttgatatctg gggccagggg acaatggtca ccgtctcctc agcgtcgacc 420

aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480

gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacctg tgacggtgtc gtggaactca 540

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600

tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660

aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380

ctctccctgt ctccgggtaa atgatga 1407

<210> 20

<211> 699

<212> DNA

<213> 6Ab轻链完整序列

<400> 20

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattcagcc 60

atccggttga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 120

acttgccggg caagtcagag cattagcagc tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg 180

aaagccccta agctcctgat ctatgctgca tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg 240

ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa 300

gattttgcaa cttactactg tcaacagagt tacagtaccc tcactttcgg cggagggacc 360

aagctggaaa tcaaacgtac ggtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 420

gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctaccccaga 480

gaagccaaag tgcagtggaa ggtggacaac gccctgcaga gcggaaacag ccaggaaagc 540

gtgacagagc aggattccaa ggattccaca tacagcctga gcagcacact gacactgtcc 600

aaggccgact acgagaagca caaggtgtac gcctgcgaag tgacacacca gggactgtcc 660

tcccctgtga caaagagctt caacagagga gaatgctga 699

<210> 21

<211> 1407

<212> DNA

<213> 14Ab重链完整序列

<400> 21

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattcccag 60

gtgcagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg ggtcctcggt gaaggtctcc 120

tgcaaggctt ctggaggcac cttcagcagc catgctatca gctgggtgcg acaggcccct 180

ggacaagggc ttgagtggat gggagggatc atccctatct ttggtacagc aaactacgca 240

cagaagttcc agggcagagt cacgattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg 300

gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgagtatt actgtgccca aactctaact 360

gggtatgatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ttcagcgtcg 420

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac ctgtgacggt gtcgtggaac 540

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380

agcctctccc tgtctccggg taaatga 1407

<210> 22

<211> 702

<212> DNA

<213> 14Ab轻链完整序列

<400> 22

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattcagac 60

atccagatga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 120

acttgccggg caagtcagag cattagcagc tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg 180

aaagccccta agctcctgat ctatgctgca tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg 240

ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa 300

gattttgcaa cttactactg tcaacagagt tacagtaccc ctccgacgtt cggccaaggg 360

accaagctgg aaatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420

gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctacccc 480

agagaagcca aagtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agagcggaaa cagccaggaa 540

agcgtgacag agcaggattc caaggattcc acatacagcc tgagcagcac actgacactg 600

tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgacaca ccagggactg 660

tcctcccctg tgacaaagag cttcaacaga ggagaatgct ga 702

Claims (6)

1.一种抗胶原蛋白VI全人抗体，其特征在于，其互补决定区中的重链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；和互补决定区中的轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的抗胶原蛋白VI全人抗体，其特征在于，所述抗胶原蛋白VI全人抗体的重链表达序列如SEQ ID NO.19所示，轻链表达序列如SEQ ID NO.20所示。

3.一种抗胶原蛋白VI全人抗体，其特征在于，其互补决定区中的重链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；和互补决定区中的轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12所示。

4.根据权利要求3所述的抗胶原蛋白VI全人抗体，其特征在于，所述抗胶原蛋白VI全人抗体的重链表达序列如SEQ ID NO.21所示，轻链表达序列如SEQ ID NO.22所示。

5.权利要求1-4任一项所述的抗胶原蛋白VI全人抗体在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。

6.一种治疗动脉粥样硬化的药物，其特征在于，其活性成份包括有权利要求1-4任一项所述的抗胶原蛋白VI全人抗体。

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