KR20180089510A - CD32b를 표적화하는 항체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

CD32b를 표적화하는 항체 및 그의 사용 방법 Download PDF

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스테판 유어트
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앨런 해리스
이사벨 이스나디
매튜 존 마이어
니콜라스 윌슨
팡민 슈
하이후이 루
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노파르티스 아게
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    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
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    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

본 발명은 인간 CD32b에 선택적으로 결합하는 단리된 항체 및 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 방법, 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법이 또한 본원에 제공된다.

Description

CD32b를 표적화하는 항체 및 그의 사용 방법
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 출원되고 그 전문이 본원에 참조로 포함된 서열 목록을 함유한다. 2016년 12월 15일에 생성된 상기 ASCII 카피는 PAT057036-WO-PCT_SL.txt로 명명되고 467,216 바이트 크기이다.
발명의 분야
본 발명은 인간 CD32b에 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편, 및 그의 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.
Fc 감마 수용체 (FcγR)는 IgG에 결합하고 이들은 많은 면역 세포에 의해 발현되고, 이는 이들이 선천성 면역과 체액성 면역 사이의 연결로서 작용하도록 한다. 활성 FcγR은 그의 세포내 부분 내에 직접 또는 연관된 신호전달 단위 예컨대 동종이량체 공통 γ 쇄의 세포질 도메인 내에 면역-수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 이들 ITAM 모티프는 수용체가 항원-항체 복합체에 의해 가교된 경우에 인산화된다. 활성 FcγR은 수용체가 항원-항체 복합체에 의해 가교된 경우에 인산화되는 면역-수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유하거나 또는 이와 연관된다. 활성화 시, 이들 수용체는 식세포작용 및 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 포함하는 면역 반응을 매개한다 (Nimmerjahn and Ravetch, Nature Rev. Immunol. 2008: 8(1) 34-47). CD32b는 유일한 억제 FcγR이고 세포내 면역-수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. CD32b는 수지상 세포 및 대식세포를 포함하는 면역 세포에 의해 발현되고 (Nimmerjahn and Ravetch, Nature Rev. Immunol. 2008: 8(1) 34-47) B 세포 상에서 발현되는 유일한 FcγR이다 (Amigorena et al., Eur. J. Immunol. 1989:19(8) 1379-1385). CD32b 및 ITIM 인산화의 활성화는 활성 FcγR 기능의 억제를 일으키거나 (Smith and Clatworthy, Nat. Rev. Immunol. 2010: (5) 328-343) 또는, B 세포 수용체에 가교된 경우에, B 세포 기능을 감소시킨다 (Horton et al., J. Immunol. 2011: 186(7):4223-4233). 그의 억제 역할과 일치하게, Fc 의존성 활성/ADCC 작용 방식을 갖는 치료 항체는 WT 마우스에서 보다 CD32b 녹아웃 마우스에서 더 강건한 항종양 반응을 갖는다 (Clynes et al., Nat. Med. 2000: 6(4):443-6). 추가적으로, CD32b 기능을 손상시키는 다형성은 자가면역의 발생과 연관된다 (Floto et al., Nat. Med. 2005: 11(10) 1056-1058).
CD32b는 유사한 세포외 도메인을 갖지만 내재화에 대한 그의 성향을 좌우하는 상이한 세포내 도메인을 갖는 2종의 스플라이스 변이체, CD32b1 및 CD32b2로서 발현된다. 전장 변이체, CD32b1 (유니프롯KB(UniProtKB) P31944-1)은 림프계 세포 상에서 발현되고 내재화를 방지하는 세포내 신호 서열을 갖는다. 골수 세포 상에서 발현되는 CD32b2 (유니프롯KB P31944-2)는 이 신호 서열이 결여되고 따라서 내재화에 보다 감수성이다 (Brooks et al., J. Exp. Med. 1989: 170(4) 1369-1385).
B 세포 성숙 전반에 걸쳐 발현되는 것에 더하여, CD32b는 이들 세포의 악성 대응 부분 상에서 고도로 발현되는 것으로 발견된다. 구체적으로, CD32b는 CLL, NHL, 다발성 골수종을 포함하는 B 세포 림프종 상에서 발현되는 것으로 발견되고, CD32b는 이들 적응증 (예를 들어 문헌 [Rankin et al., Blood 2006: 108(7) 2384-2391]) 및 전신 경쇄 아밀로이드증을 포함하는 다른 것 (Zhou et al., Blood 2008: 111(7) 3403-3406)에 대한 치료 표적으로서 제안되었다.
종양 세포 상의 CD32b의 발현은 리툭시맙 함유 치료 요법으로부터의 감소된 임상 이익과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다 (Lim et al., Blood 2011: 118(9) 2530-2540). 또한, CD32b 발현은 생체내에서 알렘투주맙에 대한 저항성이 발생할 시 B 세포 백혈병 모델에서 증가되고 CD32b의 녹다운은 백혈병 세포를 알렘투주맙 매개된 ADCC 활성에 대해 재감작화시키는 것으로 발견되었다 (Pallasch et al., Cell 2014: 156(3) 590-602). 종합하면, 이들 데이터는 Fc 의존성 (예를 들어 ADCC 매개) 항종양 활성을 갖는 항체에 대한 저항성의 메카니즘으로서 CD32b에 대한 역할을 지지한다. 이 메카니즘은 잘 이해되지는 않지만 여러 가설이 존재한다. 문헌 [Lim et al. (Blood 2011: 118(9) 2530-2540) 및 Vaughan et al. (Blood 2014: 123(5) 669-677)]은 림프종 세포를 사용하여 CD32b가 CD20 결합된 리툭시맙의 Fc에 결합함으로써 3부 복합체가 내재화되도록 하고 결과적으로 림프종 세포 표면을 코팅하는 CD20 결합된 리툭시맙을 감소시킨다는 것을 입증하였다. 림프종 세포 상의 CD32b가, 예를 들어, 시스 상의 CD20 결합된 리툭시맙의 Fc 영역과 맞물려, 리툭시맙 Fc를 효과적으로 차폐한다는 것이 또한 제안되었다. 리툭시맙 Fc 차폐의 예상된 결과는 트랜스 상의 이펙터 세포 상의 활성 FcγR과 맞물릴 기회의 감소이다 (Vaughan et al. Blood 2014: 123(5) 669-677). FcγR이 이러한 방식으로 기능할 수 있다는 증거는 단순 포진 바이러스 감염 동안에 입증되었고, 여기서 바이러스에 의해 코딩된 FcγR은 감염된 세포에 의해 발현되는 바이러스 항원에 결합된 항체의 Fc 영역과 맞물려 이를 항체-의존성 세포성 세포독성으로부터 보호한다 (Van Vliet et al., Immunology 1992: 77(1) 109-115). 상기 약술된 메카니즘 둘 다에서, CD32b는 치료 mAb Fc, 예를 들어 리툭시맙과 이펙터 세포 상의 활성 FcγR 사이의 상호작용을 효과적으로 감소시켜 감소된 면역 반응/ADCC 활성을 일으킨다.
본 발명은
(a) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1, 4, 7, 53, 56, 59, 105, 108, 111, 157, 160, 163, 209, 212, 215, 261, 264, 267, 313, 316, 319, 365, 368, 371, 417, 420, 423, 469, 472, 475, 521, 524, 527, 547, 550, 553, 573, 576, 579, 625, 628, 및 631 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열식별번호: 2, 5, 8, 54, 57, 60, 106, 109, 112, 158, 161, 164, 210, 213, 216, 262, 265, 268, 314, 317, 320, 366, 369, 372, 418, 421; 424, 470, 473, 476, 522, 525, 528, 548, 551, 554, 574, 577, 580, 626, 629, 및 632 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열식별번호: 3, 6, 9, 55, 58, 61, 107, 110, 113, 159, 162, 165, 211, 214, 217, 263, 266, 269, 315, 318, 321, 367, 370, 373, 419, 422, 425, 471, 474, 477, 523, 526, 529, 549, 552, 555, 575, 578, 581, 627, 630, 및 633 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열식별번호: 14, 17, 20, 66, 69, 72, 118, 121, 124, 170, 173, 176, 222, 225, 228, 274, 277, 280, 326, 329, 332, 378, 381, 384, 430, 433, 436, 482, 485, 488, 534, 537, 540, 560, 563, 566, 586, 589, 592, 638, 641, 644 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열식별번호: 15, 18, 21, 67, 70, 73, 119, 122, 125, 171, 174, 177, 223, 226, 229, 275, 278, 281, 327, 330, 333, 379, 382, 385, 431, 434, 437, 483, 486, 489, 535, 538, 541, 561, 564, 567, 587, 590, 593, 639, 642, 및 645 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열식별번호: 16, 19, 22, 68, 71, 74, 120, 123, 126, 172, 175, 178, 224, 227, 230, 276, 279, 282, 328, 331, 334, 380, 383, 386, 432, 435, 438, 484, 487, 490, 536, 539, 542, 562, 565, 568, 588, 591, 594, 640, 643, 및 646 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 인간 CD32b에 선택적으로 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본 출원은 서열식별번호: 10, 62, 114, 166, 218, 270, 322, 374, 426, 478, 530, 556, 582, 및 634 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 23, 75, 127, 179, 231, 283, 335, 387, 439, 491, 543, 569, 595, 및 647 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 개시하며, 여기서 항체는 인간 CD32b에 선택적으로 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본 출원은 서열식별번호: 12, 64, 116, 168, 220, 272, 324, 376, 428, 480, 584, 및 636 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 25, 77, 129, 181, 233, 285, 337, 389, 441, 493, 597, 및 649 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편을 개시하며, 여기서 항체는 인간 CD32b에 선택적으로 결합한다.
본 출원은 서열식별번호: 38, 90, 142, 194, 246, 298, 350, 402, 454, 506, 532, 558, 610, 및 662 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 51, 103, 155, 207, 259, 311, 363, 415, 467, 519, 545, 571, 623, 및 675 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 추가로 개시하며, 여기서 항체는 인간 CD32b에 선택적으로 결합한다.
추가 실시양태에서, 본 출원은
(a) 각각 서열식별번호: 1, 2, 및 3의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 14, 15, 및 16의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(b) 각각 서열식별번호: 4, 5, 및 6의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 17, 18, 및 19의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(c) 각각 서열식별번호: 7, 8, 및 9의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 20, 21, 및 22의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(d) 각각 서열식별번호: 53, 54, 및 55의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 66, 67, 및 68의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(e) 각각 서열식별번호: 56, 57, 및 58의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 69, 70, 및 71의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(f) 각각 서열식별번호: 59, 60, 및 61의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 72, 73, 및 74의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(g) 각각 서열식별번호: 105, 106, 및 107의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 118, 119, 120의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(h) 각각 서열식별번호: 108, 109, 및 110의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 121, 122, 123의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(i) 각각 서열식별번호: 111, 112, 및 113의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 124, 125, 126의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(j) 각각 서열식별번호: 157, 158, 및 159의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 170, 171, 172의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(k) 각각 서열식별번호: 160, 161, 및 162의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 173, 174, 175의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(l) 각각 서열식별번호: 163, 164, 및 165의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 176, 177, 178의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(m) 각각 서열식별번호: 209, 210, 및 211의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 222, 223, 및 224의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(n) 각각 서열식별번호: 212, 213, 및 214의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 225, 226, 및 227의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(o) 각각 서열식별번호: 215, 216, 및 217의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 228, 229, 및 230의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(p) 각각 서열식별번호: 261, 262, 및 263의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 274, 275, 및 276의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(q) 각각 서열식별번호: 264, 265, 및 266의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 277, 278, 및 279의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(r) 각각 서열식별번호: 267, 268, 및 269의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 280, 281, 및 282의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(s) 각각 서열식별번호: 313, 314, 및 315의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 326, 327, 및 328의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(t) 각각 서열식별번호: 316, 317, 및 318의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 329, 330, 및 331의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(u) 각각 서열식별번호: 319, 320, 및 321의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 332, 333, 및 334의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(v) 각각 서열식별번호: 365, 366, 및 367의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 378, 379, 및 380의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(w) 각각 서열식별번호: 368, 369, 및 370의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 381, 382, 및 383의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(x) 각각 서열식별번호: 371, 372, 및 373의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 384, 385, 및 386의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(y) 각각 서열식별번호: 417, 418, 및 419의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 430, 431, 및 432의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(z) 각각 서열식별번호: 420, 421, 및 422의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 433, 434, 및 435의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(aa) 각각 서열식별번호: 423, 424, 및 425의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 436, 437, 및 438의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(bb) 각각 서열식별번호: 469, 470, 및 471의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 482, 483, 및 484의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(cc) 각각 서열식별번호: 472, 473, 및 474의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 485, 486, 및 487의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(dd) 각각 서열식별번호: 475, 476, 및 477의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 488, 489, 및 490의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(ee) 각각 서열식별번호: 521, 522, 및 523의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 534, 535, 및 536의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(ff) 각각 서열식별번호: 524, 525, 및 526의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 537, 538, 및 539의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(gg) 각각 서열식별번호: 527, 528, 및 529의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 540, 541, 및 542의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(hh) 각각 서열식별번호: 547, 548, 및 549의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 560, 561, 및 562의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(ii) 각각 서열식별번호: 550, 551, 및 552의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 563, 564, 및 565의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(jj) 각각 서열식별번호: 553, 554, 및 555의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 566, 567, 및 568의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(kk) 각각 서열식별번호: 573, 574, 및 575의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 586, 587, 및 588의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(ll) 각각 서열식별번호: 576, 577, 및 578의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 589, 590, 및 591의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(mm) 각각 서열식별번호: 579, 580, 및 581의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 592, 593, 및 594의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(nn) 각각 서열식별번호: 625, 626, 및 627의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 638, 639, 및 640의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
(oo) 각각 서열식별번호: 628, 629, 및 630의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 641, 642, 및 643의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열; 또는
(pp) 각각 서열식별번호: 631, 632, 및 633의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 644, 645, 및 646의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열
을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 개시한다.
추가 실시양태에서, 본 출원은
(a) 서열식별번호: 10의 VH 서열 및 서열식별번호: 23의 VL 서열;
(b) 서열식별번호: 62의 VH 서열 및 서열식별번호: 75의 VL 서열;
(c) 서열식별번호: 114의 VH 서열 및 서열식별번호: 127의 VL 서열;
(d) 서열식별번호: 166의 VH 서열 및 서열식별번호: 179의 VL 서열;
(e) 서열식별번호: 218의 VH 서열 및 서열식별번호: 231의 VL 서열;
(f) 서열식별번호: 270의 VH 서열 및 서열식별번호: 283의 VL 서열;
(g) 서열식별번호: 322의 VH 서열 및 서열식별번호: 335의 VL 서열;
(h) 서열식별번호: 374의 VH 서열 및 서열식별번호: 387의 VL 서열;
(i) 서열식별번호: 426의 VH 서열 및 서열식별번호: 439의 VL 서열;
(j) 서열식별번호: 478의 VH 서열 및 서열식별번호: 491의 VL 서열;
(k) 서열식별번호: 530의 VH 서열 및 서열식별번호: 543의 VL 서열;
(l) 서열식별번호: 556의 VH 서열 및 서열식별번호: 569의 VL 서열;
(m) 서열식별번호: 582의 VH 서열 및 서열식별번호: 595의 VL 서열; 또는
(n) 서열식별번호: 634의 VH 서열 및 서열식별번호: 647의 VL 서열
을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 개시한다.
또 다른 실시양태에서, 본 출원은
(a) 서열식별번호: 12의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 25의 경쇄 서열;
(b) 서열식별번호: 64의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 77의 경쇄 서열;
(c) 서열식별번호: 116의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 129의 경쇄 서열;
(d) 서열식별번호: 168의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 181의 경쇄 서열;
(e) 서열식별번호: 220의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 233의 경쇄 서열;
(f) 서열식별번호: 272의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 285의 경쇄 서열;
(g) 서열식별번호: 324의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 337의 경쇄 서열;
(h) 서열식별번호: 376의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 389의 경쇄 서열;
(i) 서열식별번호: 428의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 441의 경쇄 서열;
(j) 서열식별번호: 480의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 493의 경쇄 서열;
(k) 서열식별번호: 584의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 597의 경쇄 서열; 또는
(l) 서열식별번호: 636의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 649의 경쇄 서열
을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 개시한다.
한 실시양태에서, 본 출원은
(a) 서열식별번호: 38의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 51의 경쇄 서열;
(b) 서열식별번호: 90의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 103의 경쇄 서열;
(c) 서열식별번호: 142의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 155의 경쇄 서열;
(d) 서열식별번호: 194의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 207의 경쇄 서열;
(e) 서열식별번호: 246의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 259의 경쇄 서열;
(f) 서열식별번호: 298의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 311의 경쇄 서열;
(g) 서열식별번호: 350의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 363의 경쇄 서열;
(h) 서열식별번호: 402의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 415의 경쇄 서열;
(i) 서열식별번호: 454의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 467의 경쇄 서열;
(j) 서열식별번호: 506의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 519의 경쇄 서열;
(k) 서열식별번호: 532의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 545의 경쇄 서열;
(l) 서열식별번호: 558의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 571의 경쇄 서열;
(m) 서열식별번호: 610의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 623의 경쇄 서열; 또는
(n) 서열식별번호: 662의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 675의 경쇄 서열
을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 개시한다.
본 출원은 또한
(a) 서열식별번호: 157, 160, 또는 163으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
(b) 서열식별번호: 158, 161, 또는 164로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
(c) 서열식별번호: 159, 315, 367, 419, 471, 523, 549, 575, 또는 627로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
(d) 서열식별번호: 170, 173, 또는 176으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
(e) 서열식별번호: 171, 174, 또는 177로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
(f) 서열식별번호: 172의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 개시한다.
추가 실시양태에서, 본 출원은
(a) 서열식별번호: 157, 160, 또는 163으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
(b) 서열식별번호: 158, 161, 또는 164로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
(c) 아미노산 서열 EQX1PX2X3GX4GGX5PX6EAMDV (서열식별번호: 683)를 포함하며, 여기서 X1은 D 또는 S이고, X2는 E 또는 S이고, X3은 Y, F, A, 또는 S이고; X4는 Y 또는 F이고; X5는 F 또는 Y이고, X6은 Y 또는 F인 HCDR3;
(d) 서열식별번호: 170, 173, 또는 176으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
(e) 서열식별번호: 171, 174, 또는 177로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
(f) 서열식별번호: 172의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 출원은
(a) 서열식별번호: 157, 160, 또는 163으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
(b) 서열식별번호: 158, 161, 또는 164로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
(c) 서열식별번호: 159, 315, 367, 또는 419의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
(d) 서열식별번호: 170, 173, 또는 176으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
(e) 서열식별번호: 171, 174, 또는 177로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
(f) 서열식별번호: 172의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 개시한다.
또 다른 실시양태에서, 본 출원은
(a) 서열식별번호: 417로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
(b) 서열식별번호: 418로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
(c) 서열식별번호: 419의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
(d) 서열식별번호: 430으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
(e) 서열식별번호: 431로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
(f) 서열식별번호: 432의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 개시한다.
본 출원의 한 실시양태에서,
(a) 서열식별번호: 417로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
(b) 서열식별번호: 418로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
(c) 서열식별번호: 419의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
(d) 서열식별번호: 430으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
(e) 서열식별번호: 431로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
(f) 서열식별번호: 432의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
을 포함하는 비-푸코실화(afucosylated) 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다.
추가 실시양태에서, 본 출원은 서열식별번호: 426의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열식별번호: 441의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 비-푸코실화 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 출원은 서열식별번호: 428의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 441의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 비-푸코실화 항체 또는 항원-결합 단편을 개시한다.
본 출원은 또한 서열식별번호: 10, 62, 114, 166, 218, 270, 322, 374, 426, 478, 530, 556, 582, 및 634로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 23, 75, 127, 179, 231, 283, 335, 387, 439, 491, 543, 569, 595, 및 647로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며; 여기서 항체는 인간 CD32b 단백질에 특이적으로 결합한다.
본 출원은 서열식별번호: 12, 38, 64, 90, 116, 142, 168, 194, 220, 246, 272, 298, 324, 350, 376, 402, 428, 454, 480, 506, 532, 558, 584, 610, 636, 및 662로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 25, 51, 77, 103, 129, 155, 181, 207, 233, 259, 285, 311, 337, 363, 389, 415, 441, 467, 493, 519, 545, 571, 597, 623, 649, 및 675로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 추가로 제공하며; 여기서 항체는 인간 CD32b 단백질에 특이적으로 결합한다.
본 출원은 상기 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 일부 실시양태에서, 항체가 비-푸코실화된 것을 제공한다. 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 부분은 ADCC 활성을 증진시키도록 변형된다.
본원에 기재된 모든 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 CD32a에 비해 인간 CD32b에 선택적으로 결합한다.
본 출원에 개시된 일부 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 IgG이다. 다른 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 키메라, 인간화 또는 완전 인간이다.
한 실시양태에서, 본 출원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 대한 인간 CD32b의 결합을 억제한다.
추가 실시양태에서, 본원에 개시된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 면역접합체의 성분이다.
본 출원의 일부 실시양태에서, 다가 항체는 본원에 개시된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중 어느 것을 포함한다. 추가 실시양태에서, 다가 항체는 이중특이적 항체이다.
본원에 개시된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 다가 항체를 세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 1종 이상의 추가의 항체와 조합하여 포함하는 조성물이 또한 본원에 개시된다. 세포 표면 항원 및 CD32b는 B 세포 상에서 공동-발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 항원은 CD20, CD38, CD52, CS1/SLAMF7, CD56, CD138, KiR, CD19, CD40, Thy-1, Ly-6, CD49, Fas, Cd95, APO-1, EGFR, HER2, CXCR4, HLA 분자, GM1, CD22, CD23, CD80, CD74, 또는 DRD로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 추가의 항체는 리툭시맙, 엘로투주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 다라투무맙, 및 알렘투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 다가 항체, 또는 본원에 개시된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 다가 항체를 포함하는 조성물은 추가의 치료 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료 화합물은 면역조정제이다. 한 실시양태에서, 면역조정제는 IL15이다. 또 다른 실시양태에서, 면역조정제는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83 리간드, 및 STING로부터 선택된 공동자극 분자의 효능제이다. 또 다른 실시양태에서, 면역조정제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR 베타, 및 IDO로부터 선택된 표적의 억제제 분자이다. 추가 실시양태에서, 추가의 치료 화합물은 오파투무맙, 이브루티닙, 벨리노스타트, 로미뎁신, 브렌툭시맙 베도틴, 오비누투주맙, 프랄라트렉세이트, 펜토스타틴, 덱사메타손, 이델라리십, 익사조밉, 리포솜 독소루비신, 포말리도미드, 파노비노스타트, 엘로투주맙, 다라투무맙, 알렘투주맙, 탈리도미드, 및 레날리도미드로부터 선택된다.
본 출원은 또한 본원에 개시된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 다가 항체, 또는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 다가 항체를 포함하는 조성물, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 출원은 CD32b의 Fc 결합 도메인 내에서 CD32b에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 개시한다. 일부 실시양태에서, 항체는 CD32b의 아미노산 잔기 107-123 (VLRCHSWKDKPLVKVTF) 내에서 결합한다. 다른 실시양태에서, 항체는 B-세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 종양 항원에 결합하는 제2 항체의 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 대한 CD32b 결합을 방지하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 항체는 CD20, CD38, CD52, CS1/SLAMF7, CD56, CD138, KiR, CD19, CD40, Thy-1, Ly-6, CD49, Fas, Cd95, APO-1, EGFR, HER2, CXCR4, HLA 분자, GM1, CD22, CD23, CD80, CD74, 또는 DRD로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원에 결합한다. 특정한 실시양태에서, 제2 항체는 CD20, CD38, CS1/SLAMF7 및 CD52로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원에 결합한다. 추가 실시양태에서, 제2 항체는 리툭시맙, 엘로투주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 다라투무맙, 및 알렘투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CD32b의 Fc 결합 도메인 내에서 CD32b에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에 개시된 바와 같은 항체이다.
또 다른 실시양태에서, 본 출원은 CD32b에 특이적으로 결합하고, B-세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 종양 항원에 결합하는 제2 항체에 의해 매개되는 CD32b 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM) 신호전달을 억제하거나 또는 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 개시한다. B-세포는 정상 B-세포 또는 악성 B-세포일 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 출원은 CD32b의 Fc 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 것을 포함하는, B-세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 종양 항원에 결합하는 치료 항체의 투여에 의해 유도되는 CD32b ITIM 신호전달을 억제하거나 또는 감소시키는 방법을 개시한다. 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 ITIM 신호전달을 자극시키지 않는다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 치료 항체는 CD20, CD38, CD52, CS1/SLAMF7, CD56, CD138, KiR, CD19, CD40, Thy-1, Ly-6, CD49, Fas, Cd95, APO-1, EGFR, HER2, CXCR4, HLA 분자, GM1, CD22, CD23, CD80, CD74, 또는 DRD로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원에 결합한다. 본 방법의 다른 실시양태에서, 치료 항체는 리툭시맙, 엘로투주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 다라투무맙, 및 알렘투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 출원은 또한 CD32b-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 다가 항체, 또는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 다가 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 CD32b-관련 상태를 치료하는 방법을 제공한다. CD32b-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 CD32b-관련 상태를 치료하는 데 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 다가 항체, 또는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 다가 항체를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. CD32b-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 CD32b-관련 상태를 치료하기 위한, 또는 CD32b-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 CD32b-관련 상태의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 다가 항체, 또는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 다가 항체를 포함하는 조성물의 용도가 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, CD32b-관련 상태는 B 세포 악성종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 미만성 대 B 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 소림프구성 림프종, 미만성 소분할 세포 림프종, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 여포성 림프종, 또는 전신 경쇄 아밀로이드증으로부터 선택된다.
본 출원은 또한 세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 항체를 사용하는 치료에 저항성 또는 불응성인 환자를 치료하는 방법을 개시하며, 항체를 본원에 개시된 단리된 항-CD32b 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 다가 항체 중 어느 하나와 함께 공-투여하는 것을 포함한다. 본 출원은 또한 세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 항체를 항-Cd32b 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 공-투여하는 것을 포함하는, 세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 항체를 사용하는 치료에 저항성 또는 불응성인 환자의 치료를 위한, 본원에 개시된 단리된 항-CD32b 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 다가 항체 중 어느 하나의 용도를 개시한다. 본 출원은 세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 항체를 항-Cd32b 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 공-투여하는 것을 포함하는, 세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 항체를 사용하는 치료에 저항성 또는 불응성인 환자의 치료를 위한 본원에 개시된 단리된 항-CD32b 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 다가 항체를 추가로 개시한다.
본 출원은 또한 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산뿐만 아니라 핵산을 포함하는 벡터, 및 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생산하는 방법이 추가로 제공되며, 방법은 항체를 코딩하는 핵산을 발현하는 숙주 세포를 배양하고; 배양물로부터 항체를 수집하는 것을 포함한다.
본 출원은 또한 표 1에 열거된 CDR을 포함하는 인간 CD32b 항체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
도 1은 항체 NOV1216의 전기영동도를 도시한다. IgG 내의 포유동물 발현된 NOV1216의 모세관 구역 전기영동 (CZE) 분석은 항체가 3종의 우세한 종, 비변형됨, +80 달톤, 및 +160 달톤으로서 존재한다는 것을 밝혀냈다.
도 2는 모세관 구역 전기영동에 의한 8종의 CD32b-결합 CDR-H3 돌연변이 항체의 전기영동도를 도시한다.
도 3은 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같은, CD32b 또는 CD32a를 발현하는 CHO 세포에 대한 CD32b-결합 항체의 패널의 결합 검정으로부터의 결과를 도시하는 일련의 그래프이다.
도 4는 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같은, 인간 CD16 및 CD64의 변이체를 발현하는 CHO 세포에 대한 CD32b-결합 항체의 패널의 결합 검정으로부터의 결과를 도시하는 일련의 그래프이다.
도 5는 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같은, 인간 B 세포에 대한 CD32b-결합 항체의 패널의 결합 검정으로부터의 결과를 도시하는 일련의 그래프이다.
도 6는 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같은, BJAB 세포에 대한 CD32b-결합 항체의 패널의 결합 검정으로부터의 결과를 도시하는 일련의 그래프이다.
도 7a 및 도 7b는 CD32b-결합 항체의 결합 에피토프를 특징화하도록 설계된 WT 및 돌연변이체 CD32b 단백질의 일련의 3D 모델을 도시한다.
도 8a-도 8c는 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같은, 항체의 결합 에피토프를 특징화하도록 설계된 WT 및 돌연변이체 CD32b 단백질을 발현하는 CHO 세포에 대한 CD32b-결합 항체의 패널의 결합 특징을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 9는 다양한 CD32b 발현, CD32a 발현, 또는 CD32b 또는 CD32a 발현 없음을 특징으로 하는 세포주에 대한 CD32b-결합 항체의 패널의 결합 특징을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 10은 다양한 CD32b 발현, CD32a 발현, 또는 CD32b 또는 CD32a 발현 없음을 특징으로 하는 세포주에 대한 CDR-H3 돌연변이체 CD32b-결합 항체의 패널의 결합 특징을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 11a 및 도 11b는 1차 NK 세포 ADCC 검정에서 야생형 Fc 영역 (Fc WT)을 갖는 CD32b-결합 항체의 패널의 활성을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 12는 면역손상 마우스에서의 확립된, 파종성 외투 세포 림프종 Jeko1 이종이식편에 대한 Fc WT CD32b-결합 항체의 패널의 생체내 항종양 활성을 도시하는 그래프이다.
도 13은 면역손상 마우스에서의 확립된 Daudi 이종이식편에 대한 Fc WT CD32b-결합 항체 NOV1216의 용량-반응성, 생체내 항종양 활성을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 14a-도 14d는 표적 세포로서 Daudi 및 Jeko1을 사용하는 1차 NK 세포 ADCC 검정 및 CD16a 활성화 리포터 검정에서 Fc WT, 증진된 ADCC (eADCC) Fc 돌연변이체, 비-푸코실화, 또는 N297A Fc 돌연변이체 CD32b-결합 항체의 활성을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 15는 표적 세포로서 Jeko1을 사용하는 1차 NK 세포 ADCC 검정에서 Fc WT, eADCC Fc 돌연변이체, 및 N297A Fc 돌연변이체 버전 CD32b-결합 항체의 활성을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 16은 다양한 CD32b 발현을 나타내는 표적 세포를 사용하는 CD16a 리포터 검정에서 CD32b-결합 항체 NOV1216의 Fc WT, eADCC Fc 돌연변이체, 및 N297A Fc 돌연변이체 버전의 활성을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 17은 다양한 CD32b 발현을 나타내는 표적 세포를 사용하는 CD16a 리포터 검정에서 비-푸코실화 CD32b-결합 CDR-H3 돌연변이 항체의 활성을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 18은 1차 NK 세포 ADCC 검정에서 비-푸코실화 CD32b-결합 CDR-H3 돌연변이 항체의 활성을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 19는 1차 NK 세포 ADCC 검정에서 비-푸코실화 CD32b-결합 CDR-H3 돌연변이 항체의 활성을 도시하는 그래프이다.
도 20은 확립된 Daudi 이종이식편에 대한 CD32b-결합 항체 NOV1216의 Fc WT, N297A, 및 eADCC Fc 돌연변이체 버전의 생체내 항종양 활성을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 21은 확립된 Daudi 이종이식편에 대한 비-푸코실화 CDR-H3 돌연변이체 CD32b-결합 항체의 생체내 항종양 활성을 도시하는 그래프이다.
도 22는 CD16a 활성화 검정에서 Fc 침묵 CD32b-결합 항체 NOV1216 N297A와 조합된 경우의 리툭시맙 및 오비누투주맙의 활성을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 23은 CD16 활성화 검정에서 Fc 침묵 CD32b-결합 CDR-H3 돌연변이 항체와 조합된 경우의 리툭시맙 활성의 개선을 도시하는 그래프이다.
도 24는 확립된 Daudi 이종이식편을 보유하는 마우스에서의 CD32b-결합 항체 NOV1216 eADCC Fc 돌연변이체와 조합된 리툭시맙 또는 오비누투주맙의 생체내 항종양 활성을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 25는 CD16a 활성화 검정에서 Fc 침묵 CD32b-결합 CDR-H3 돌연변이체 NOV2108 N297A와 조합된 경우의 다라투무맙 활성의 개선을 도시하는 그래프이다.
도 26은 야생형 클론 10 항체와 비교하여, 인간 대식세포에 의한 Daudi 표적 세포 사멸을 매개하는 야생형 및 비-푸코실화 NOV1216 및 CDR-H3 돌연변이체 NOV2108의 능력을 도시하는 그래프이다.
도 27은 1차 인간 B 세포에서의 기초 및 가교된 항-IgM 자극된 CD32b ITIM 인산화에 대한 CD32b-결합 항체 2B6 및 NOV1216의 영향을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 28은 1차 인간 B 세포, Daudi 세포, 및 Karpas422 세포에서의 리툭시맙 자극된 CD32b ITIM 인산화를 조정하는 비-푸코실화 CD32b-결합 항체 NOV1216의 능력을 도시하는 그래프이다.
도 29는 유동 세포측정법에 의해 평가된 바와 같은, 1차 환자 다발성 골수종 샘플, 형질 B 세포, 및 2종의 확립된 세포주 상의 CD32b의 발현을 도시하는 그래프이다.
도 30은 야생형 클론 10 항체와 비교하여, 인간 NK 세포에 의한 Daudi 표적 세포 사멸을 매개하는 항체 NOV2108의 Fc 침묵, Fc 야생형, 및 비-푸코실화 버전의 능력을 도시하는 그래프이다.
도 31은 WT huCD32b 및 huCD32b 돌연변이체에 대한 NOV1216 및 NOV2108의 결합을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 32는 CD32b 항체 NOV2108의 추정 결합 부위를 맵핑하는 중수소 교환 실험에서 결정된 바와 같은 인간 CD32b 구축물 (aa1-175) (서열식별번호: 682)에 대한 펩티드 적용범위 맵을 도시한다. 차트 상의 각각의 막대는 중수소 흡수가 모니터링된 펩티드를 나타낸다.
도 33은 아미노산 1 내지 175에 대한 인간 CD32b 및 Ab NOV2108 Fab 복합체에 대한 중수소 흡수의 차이를 도시하는 그래프이다.
도 34는 인간 CD32b 결정 구조 상에 맵핑된, Ab NOV2108 Fab의 결합 시 인간 CD32b 상의 중수소 교환 보호 부위를 도시한다.
도 35는 KARPAS422 세포를 사용하는 검정에서 NOV2108의 CDC 활성을 도시하는 그래프이다.
도 36은 유동 세포측정법에 의한 세포 표면 CD32b 발현 분석을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 37은 표적 세포로서의 대식세포와 비교하여 NK 세포에 의한 NOV2108 Ab-매개 ADCC에 대한 Daudi 세포의 감수성을 도시하는 그래프이다.
도 38은 4시간에 걸쳐 셀 트래커(Cell tracker) 그린 표지된 대식세포에 의해 포식된 세포의 정량화를 도시하는 그래프이다. 시간 프레임당 웰당 4개의 위치의 반복을 평균을 구하였다.
도 39a-도 39c는 전혈 검정에서 B 세포, 단핵구, 및 과립구에 대한 Ab NOV2108 (WT 및 비-푸코실화)의 효과를 도시하는 일련의 그래프이다. 비-푸코실화 NOV2108은 B-세포 사멸을 증진시키고 단핵구 및 과립구의 생존율을 유지한다.
도 40은 1차 NK 세포에 의한 다발성 골수종 (MM) 세포주 Karpas620의 NOV2108 매개 용해를 도시하는 그래프이다.
도 41은 PBMC의 레날리도미드 (LEN) 처리가 NOV1216의 ADCC 활성을 증진시킨다는 것을 도시하는 그래프이다. 이러한 증진은 T 세포가 PBMC로부터 고갈된 경우에 극적으로 감소되었다.
도 42는 KMS-12-BM 다발성 골수종 세포주 상의 CD32b 발현의 FACS 평가를 도시하는 그래프이다.
도 43은 CD32b 낮은 KMS-12-BM MM 피하 이종이식편을 보유하는 마우스에서의 Fc 증진된 항-CD32b mAb와 HDAC 억제제 파노비노스타트의 조합과 연관된 생체내 항종양 활성을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 44는 피하 Daudi 이종이식편을 보유하는 누드 마우스에게 정맥내로 투여된 비-푸코실화 NOV2108의 용량 의존성 항종양 활성을 도시하는 그래프이다.
도 45는 KARPAS620 MM 세포주의 피하 이종이식편을 보유하는 누드 마우스에서의 비-푸코실화 NOV2108의 항종양 활성을 도시하는 그래프이다.
도 46은 누드 마우스의 피하로 생착된 Daudi 이종이식편에서의 F4/80 양성에 대한 정맥내 eADCC Fc 돌연변이체 NOV2108 투여의 영향을 도시하는 그래프이다.
본 발명은 인간 CD32b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편, 및 제약 조성물, 이러한 항체 및 조성물의 제조 방법, 및 사용 방법을 제공한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 "CD32A" 또는 "CD32a"는 인간 CD32a 단백질을 의미하고, 또한 인간 FCγ 수용체 2A 또는 FCγR2A 또는 FCGR2a 또는 FCGR2A로 지칭된다. H131 및 R131 (신호 서열 없이 언급되는 경우) 또는 H167 및 R167 (신호 서열과 함께 언급되는 경우)로 공지된 2종의 변이체가 존재한다. H167 변이체의 아미노산 서열은 수탁 번호 유니프롯KB P12318 하에 기탁되어 있고 하기 제시되어 있다.
Figure pct00001
본원에 사용된 "CD32B" 또는 "CD32b"는 인간 CD32b 단백질을 의미하고, 또한 인간 FCγ 수용체 2B 또는 FCγR2B 또는 FCGR2b 또는 FCGR2B로 지칭된다. CD32b 변이체 1에 대한 아미노산 서열은 수탁 번호 유니프롯KB P31994-1 하에 기탁되어 있고 하기 제시되어 있다.
Figure pct00002
CD32b 변이체 2에 대한 아미노산 서열은 수탁 번호 유니프롯KB P31994-2 하에 기탁되어 있고 하기 제시되어 있다.
Figure pct00003
CD32b에 결합하는 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 CD32b 단백질에 결합한다. 본원에 사용된 "huCD32b"는 인간 CD32b 단백질 또는 그의 단편을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항체" 등은 그의 전체 항체 및 임의의 항원-결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄를 포함한다. 자연 발생 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해지는 보다 보존된 영역이 사이에 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭해지는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 단편", "그의 항원-결합 단편", "항원 결합 부분" 등은 주어진 항원 (예를 들어, CD32b)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb) 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 이들이 단일 단백질 쇄가 될 수 있게 하는 인공 펩티드 링커에 의해 연결될 수 있으며 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍형성되어 1가 분자를 형성한다 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426; 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조). 이러한 단일 쇄 항체는 1개 이상의 항체의 "항원 결합 부분"을 포함한다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
항원 결합 부분은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136] 참조). 항체의 항원 결합 부분은 폴리펩티드 예컨대 피브로넥틴 유형 III (Fn3)에 기초한 스캐폴드에 그라프팅될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기재하는 미국 특허 번호 6,703,199 참조).
항원 결합 부분은 한 쌍의 탠덤 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 단일 쇄 분자 내로 혼입될 수 있고, 이는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성한다 (문헌 [Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8 (10):1057-1062]; 및 미국 특허 번호 5,641,870).
본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서의 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체의 가변 영역 "아암"은 수많은 부위에서 약한 비-공유 결합력을 통해 항원과 상호작용하고; 상호작용이 보다 많을수록, 친화도가 보다 강해진다.
본원에 사용된 용어 "결합력"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도의 유익한 척도를 지칭한다. 이는 3가지 주요 인자: 항체 에피토프 친화도; 항원 및 항체 둘 다의 원자가; 및 상호작용 부분의 구조적 배열에 의해 제어된다. 결과적으로 이들 인자는 항체의 특이성, 즉, 특정한 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합할 가능성을 정의한다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 것뿐만 아니라 나중에 변형되는 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기에 결합된 알파 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "결합 특이성"은 1개의 항원 결정기와 반응하고 상이한 항원 결정기와는 반응하지 않는 개별 항체 결합 부위의 능력을 지칭한다. 항체의 결합 부위는 분자의 Fab 부분에 위치하고 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역으로부터 구축된다. 항체의 결합 친화도는 단일 항원 결정기와 항체 상의 단일 결합 부위 사이의 반응의 강도이다. 이는 항원 결정기와 항체의 결합 부위 사이에 작동하는 인력 및 척력의 합이다.
2개의 물질 사이의 특이적 결합은 적어도 1 X 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, 1013 M-1, 또는 1014 M-1의 평형 상수 (KA 또는 KA)를 갖는 결합을 의미한다. 어구 항원에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하다" (예를 들어, CD32b-결합 항체)는 단백질 및 다른 생물제제의 불균질 집단에서 동족 항원 (예를 들어, 인간 CD32b 단백질)의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 본 발명의 CD32b-결합 항체는 비-특이적 항원 (예를 들어, CD32a)에 결합하는 것보다 더 큰 친화도로 CD32b에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "키메라 항체" (또는 그의 항원-결합 단편)는 (a) 항원 결합 부위 (가변 영역)가 상이하거나 또는 변경된 부류, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예를 들어, 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 불변 영역, 또는 그의 부분이 변경, 대체 또는 교환되거나; 또는 (b) 가변 영역, 또는 그의 부분이 상이하거나 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 대체 또는 교환된 항체 분자 (또는 그의 항원-결합 단편)이다. 예를 들어, 마우스 항체는 그의 불변 영역을 인간 이뮤노글로불린으로부터의 불변 영역으로 대체함으로써 변형될 수 있다. 인간 불변 영역으로의 대체로 인해, 키메라 항체는 원래의 마우스 항체와 비교하여 인간에서 감소된 항원성을 가지면서 항원을 인식하는 데 있어서의 그의 특이성을 보유할 수 있다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정한 핵산 서열에 대해, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에, 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축중성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 명시되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변경시키지 않으면서 임의의 기재된 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 일종인 "침묵 변이"이다. 본원에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 통상의 기술자는 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 기재된 각각의 서열에 내포된다.
폴리펩티드 서열의 경우에, "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 일으키는, 폴리펩티드 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자에 부가적인 것이고 이를 배제하지 않는다. 하기 8개의 군은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조). 한 실시양태에서, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치지 않거나 또는 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "차단하다"는 상호작용 또는 과정을 정지시키거나 또는 방지하는 것, 예를 들어, 리간드-의존성 또는 리간드-비의존성 신호전달을 정지시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "인식하다"는 그의 입체형태적 에피토프를 발견하고 이와 상호작용 (예를 들어, 결합)하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭한다.
용어 "교차-차단하다", "교차-차단된", "교차-차단하는", "경쟁하다", "교차 경쟁하다" 및 관련 용어는 본원에서 표준 경쟁적 결합 검정에서 CD32b에 대한 다른 항체 또는 결합체의 결합을 방해하는 항체 또는 다른 결합체의 능력을 의미하는 데 상호교환가능하게 사용된다.
항체 또는 다른 결합체가 또 다른 항체 또는 결합 분자의 CD32b에 대한 결합을 방해할 수 있는 능력 또는 정도, 및 이로써 본 발명에 따라 교차-차단하는 것으로 언급될 수 있는지의 여부는 표준 경쟁 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 하나의 적합한 검정은 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어(Biacore) 기술 (예를 들어 비아코어 3000 기기 (비아코어, 스웨덴 웁살라)를 사용하는 것에 의함)의 사용을 수반한다. 교차-차단을 측정하기 위한 또 다른 검정은 ELISA-기반 접근법을 사용한다. 기술이 실질적으로 유사한 결과를 생성할 것으로 예상되지만, 비아코어 기술에 의한 측정은 확정적인 것으로 간주된다.
용어 "중화시키다"는 항체가, 그의 표적에 결합 시, 표적의 활성, 수준 또는 안정성을 감소시키는 것; 예를 들어, CD32b 항체가, CD32b에 결합 시 CD32b의 활성, 수준 또는 안정성, 예컨대 항체의 Fc 부분이 맞물림에서의 그의 역할을 적어도 부분적으로 감소시킴으로써 CD32b를 중화시키는 것을 의미한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 분자의 화학적으로 활성인 표면 기 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄로 이루어지고 통상적으로 특정한 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비입체형태적 에피토프는 전자에 대한 결합은 변성 용매의 존재 하에 상실되지만 후자에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
용어 "에피토프"는 이뮤노글로불린에 특이적으로 결합하거나 또는 달리 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 분자의 화학적 활성 표면 기 예컨대 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄로 이루어지고 특정한 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체형태적"일 수 있다.
용어 "선형 에피토프"는 단백질과 상호작용 분자 (예컨대 항체) 사이의 상호작용의 모든 지점이 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 발생하는 (연속적) 에피토프를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 IgG 항체에 대한 "고친화도"는 표적 항원, 예를 들어, CD32b에 대해 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M, 또는 10-11 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화도" 결합은 다른 항체 이소형에 대해 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 10-7 M 이하, 또는 10-8 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체" (또는 그의 항원-결합 단편)는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체 (및 그의 항원-결합 단편)를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어, 인간 배선 서열, 또는 인간 배선 서열의 돌연변이된 버전으로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체 및 그의 항원-결합 단편은 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물" (또는 그의 항원-결합 단편)은 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 동일한 유전자 공급원으로부터 유래된, 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체 등을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이 용어는 또한 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 포함한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
용어 "인간 모노클로날 항체" (또는 그의 항원-결합 단편)는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체 (및 그의 항원-결합 단편)를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어, 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 어구 "재조합 인간 항체" (또는 그의 항원-결합 단편)는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체 (및 그의 항원-결합 단편), 예컨대 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어, 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 모두 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는, 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용된 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용될 수 있고 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에 사용된 "인간화" 항체 (또는 그의 항원-결합 단편)는 인간에서 덜 면역원성이면서 비-인간 항체의 반응성을 보유하는 항체 (또는 그의 항원-결합 단편)이다. 이는, 예를 들어, 비-인간 CDR 영역을 보유하고 항체의 나머지 부분을 그의 인간 대응부 (즉, 불변 영역뿐만 아니라 가변 영역의 프레임워크 부분)로 대체함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; 및 Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994]을 참조한다. 인간 조작 기술의 다른 예는 미국 특허 번호 5,766,886에 개시된 조마(Xoma) 기술을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다. 2개의 서열은, 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정 시에 비교 윈도우, 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대한 상응하도록 비교하고 정렬할 때, 2개의 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율 (즉, 명시된 영역에 걸쳐, 또는, 명시되지 않은 경우에, 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 임의로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성)을 갖는 경우에 "실질적으로 동일하다". 임의로, 동일성은 적어도 약 50개의 뉴클레오티드 (또는 10개의 아미노산) 길이인 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 100 내지 500개 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 20, 50, 200개 또는 그 초과의 아미노산) 길이인 영역에 걸쳐 존재한다. 임의로, 동일성은 적어도 50개의 뉴클레오티드 (또는 10개의 아미노산) 길이인 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 100 내지 500 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 20, 50, 200개 또는 그 초과의 아미노산) 길이인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 1개의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우에 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여, 참조 서열 대비 시험 서열에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
본원에 사용된 "비교 윈도우"는 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후에 서열이 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교될 수 있는, 20 내지 600개, 통상적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 통상적으로 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 어느 하나의 절편에 대한 언급을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, 문헌 [Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 2개의 예는 각각 문헌 ([Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; 및 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990])에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공중 이용가능하다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드와 정렬된 경우에 일부 양의 값의 역치 점수 T에 매칭되거나 또는 이를 만족시키는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 점수화 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 워드 점수 역치로 지칭된다 (Altschul et al., 상기 문헌). 이들 초기 이웃 워드 히트는 이를 함유하는 보다 긴 HSP를 발견하는 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장된다. 누적 점수는, 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M (매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우에, 점수화 매트릭스가 누적 점수를 계산하는 데 사용된다. 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 누적 점수가 1개 이상의 음으로 점수화된 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 이하로 떨어지거나; 또는 어느 한 쪽의 서열의 말단에 도달한 경우에 각각의 방향으로의 워드 히트의 연장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드길이 (N) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우에, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이 3, 및 기대값 (E) 10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참조) 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된 문헌 [E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (www.gcg.com에서 이용가능함) 내로 혼입된 문헌 [Needleman and Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
상기 나타낸 서열 동일성의 백분율 이외에, 2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 하기 기재된 바와 같은 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차-반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 전형적으로, 예를 들어, 2개의 펩티드가 단지 보존적 치환에 의해 상이한 경우에 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 2개의 분자 또는 그의 상보체가 하기 기재된 바와 같은 엄격한 조건 하에 서로 혼성화된다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 동일한 프라이머가 서열을 증폭시키는 데 사용될 수 있다는 것이다.
본원에 사용된 용어 "단리된 항체" (또는 그의 항원-결합 단편)는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체 (예를 들어, CD32b에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 CD32b 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음) (또는 그의 항원-결합 단편)를 지칭한다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류 (예를 들어, IgM, IgE, IgG 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다. 이소형은 또한 Fc 기능을 변경시키는, 예를 들어, 이펙터 기능 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 증진시키거나 또는 감소시키는 변형이 이루어진, 이들 부류 중 하나의 변형된 버전을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Kassoc", "Ka" 또는 "Kon"은 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 것으로 의도되는 반면, 본원에 사용된 용어 "Kdis", "Kd", 또는 "Koff"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하는 것으로 의도된다. 한 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비 (즉 Kd/Ka)로부터 수득되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되고, 몰 농도 (M)로서 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것, 또는 바이오센서 시스템 예컨대 비아코어® 시스템을 사용하는 것이다. 해리 상수가 약 10-9 M 미만인 경우에, 용액 평형 동역학적 배제 KD 측정 (MSD-SET)은 항체의 KD를 결정하는 바람직한 방법이다 (예를 들어, 문헌 [Friquet,B., Chaffotte,A.F., Djavadi-Ohaniance,L., and Goldberg,M.E. (1985). Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. J Immnunol Meth 77, 305-319] 참조; 본원에 참조로 포함됨).
본원에 사용된 용어 "IC50"은 시험관내 또는 생체내 검정에서 최대 반응의 50%, 즉, 최대 반응과 기준선 사이의 중간인 억제 반응을 유도하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 농도를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" (또는 그의 항원-결합 단편) 또는 "모노클로날 항체 (또는 그의 항원-결합 단편) 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자 (또는 그의 항원-결합 단편)의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
용어 "이펙터 기능"은 항원-결합 도메인 이외의 항체의 도메인을 통한 결합에 의해 매개되는, 통상적으로 이펙터 분자의 결합에 의해 매개되는 항체 분자의 활성을 지칭한다. 이펙터 기능은, 예를 들어, 보체의 C1 성분의 항체에 대한 결합에 의해 매개되는 보체-매개 이펙터 기능을 포함한다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극시키고 또한 자가면역 과민반응에 수반될 수 있다. 이펙터 기능은 또한 항체의 불변 도메인의 Fc 수용체 (FcR)에 대한 결합 시 촉발될 수 있는 Fc 수용체 (FcR)-매개 이펙터 기능을 포함한다. 항체의 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 결합은 항체-코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해 (항체-의존성 세포-매개 세포독성, 또는 ADCC로 불림), 염증 매개체의 방출, 태반 전달 및 이뮤노글로불린 생산의 제어를 포함하는, 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발한다. 항체의 이펙터 기능은 이펙터 분자 예컨대 Fc 수용체 또는 보체 성분에 대한 항체의 친화도를 변경, 예를 들어, 증진시키거나 또는 감소시킴으로써 변경될 수 있다. 결합 친화도는 일반적으로 이펙터 분자 결합 부위를 변형시킴으로써 달라질 것이고, 이 경우에 관심 부위를 위치시키고 적합한 방식으로 부위의 적어도 일부를 변형시키는 것이 적절하다. 이펙터 분자에 대한 항체 상의 결합 부위에서의 변경은 전체 결합 친화도를 유의하게 변경시킬 필요는 없지만 비-생산적 결합에서와 같이 이펙터 메카니즘을 비효율적으로 만드는 상호작용의 기하구조를 변경시킬 수 있다는 것이 또한 고려된다. 이펙터 기능이 또한 이펙터 분자 결합에 직접적으로 수반되지는 않지만, 달리 이펙터 기능의 수행에 수반되는 부위를 변형시킴으로써 변경될 수 있다는 것이 추가로 고려된다.
용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환가능하게 사용되고 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 용어는 합성, 자연 발생, 및 비-자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포괄한다. 이러한 유사체의 예는, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환) 및 상보적 서열뿐만 아니라 명백하게 나타낸 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 하기 상술된 바와 같이, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).
용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 절편 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 전형적으로, 이는 전사되는 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열은 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극시키거나 또는 조정하는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사되는 서열에 물리적으로 인접하고, 즉, 이들은 시스-작용성이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는 이들이 전사를 증진시키는 코딩 서열에 물리적으로 인접하거나 또는 근접하여 위치할 필요가 없다.
본원에 사용된 용어 "최적화된"은 뉴클레오티드 서열이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어, 피키아(Pichia) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 또한 "모" 서열로 공지된 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래의 코딩된 아미노산 서열을 완전히 또는 가능한 많이 보유하도록 조작된다. 본원에서 최적화된 서열은 포유동물 세포에서 바람직한 코돈을 갖도록 조작된 바 있다. 그러나, 다른 진핵 세포 또는 원핵 세포에서의 이들 서열의 최적화된 발현이 또한 본원에서 고려된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열이 또한 최적화된 것으로 지칭된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 데 상호교환가능하게 사용된다. 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체인 아미노산 중합체에 적용된다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 폴리펩티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체를 함축적으로 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체" (또는 그의 항원-결합 단편)는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체 (및 그의 항원-결합 단편), 예컨대 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 한 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어가 특정한 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도된다는 것이 이해되어야 한다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은, 실제로, 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 여전히 포함된다.
용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 및 파충류를 포함한다. 나타낸 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "치료하다", "치료된", "치료하는", 및 "치료"는 증상을 완화시키거나 또는 질환, 상태, 또는 장애의 추가의 발생을 정지시키거나 또는 억제시키면서 질환의 증상, 합병증, 또는 생화학적 적응증의 발병을 방지하거나 또는 지연시키기 위한 조성물 또는 항체의 투여를 포함한다. 치료는 예방적 (질환의 발병을 방지하거나 또는 지연시키거나, 또는 그의 임상 또는 준임상 증상의 징후를 방지하기 위함) 또는 질환의 징후 후에 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다. 치료는 본원에 기재된 치료적 조치에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 "치료"의 방법은 이러한 치료의 부재 하에 예상되는 것을 넘어 대상체의 건강 또는 생존을 연장시키기 위해, 섬유화 질환 또는 상태 중 하나 이상의 증상을 치유하거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 또는 이를 호전시키기 위해 대상체에게 CD32b 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, "치료"는 대상체에서 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과 만큼의, 질환 증상의 완화를 포함한다.
용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 하나의 유형은 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 또 다른 유형은 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈으로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문에 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 하는, 발현 벡터의 이러한 다른 형태, 예컨대 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
CD32b 항체 및 그의 항원-결합 단편
본 발명은 인간 CD32b에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32a 단백질보다 인간 CD32b 단백질에 더 높은 친화도로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. CD32a에 비한 CD32b에 대한 선택성은 단핵구 및 호중구를 포함하는 CD32a 양성 면역 세포에 대한 결합은 결여되면서 CD32b 양성 B-세포 악성종양 및 B-세포에 대한 선택적 결합을 보장하는 데 바람직하다.
본 발명의 항체는 실시예를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 단리된 인간 및 인간화 모노클로날 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
이러한 항-인간 CD32b 항체의 예는 그의 서열이 표 1에 열거된 항체 NOV0281, NOV0308, NOV0563, NOV1216, NOV1218, NOV1219, NOV2106, NOV2107, NOV2108, NOV2109, NOV2110, NOV2111, NOV2112, 및 NOV2113 (야생형 Fc 영역을 갖거나 또는 Fc 영역에서 N297A 돌연변이를 함유하는 항체를 포함함)이다. 본원에 기재된 항체의 생성 및 특징에 관한 추가의 세부사항은 실시예에 제공된다.
본 발명은 CD32b (예를 들어, 인간 CD32b 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 표 1에 열거된 VH 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 CD32b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 표 1에 열거된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함한다. 특히, 본 발명은 CD32b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 표 1에 열거된 VH CDR 중 어느 것의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 VH CDR을 포함한다 (또는 대안적으로, 이로 이루어진다).
본 발명은 또한 CD32b에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열) 내의 약 10개 이하의 아미노산이 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임). 본 발명은 또한 CD32b에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열) 내의 10개 이하의 아미노산이 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임).
본 발명은 또한 CD32b에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열) 내의 약 20개 이하의 아미노산이 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임). 본 발명은 또한 CD32b에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열) 내의 20개 이하의 아미노산이 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임).
본 발명은 CD32b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 CD32b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함한다. 특히, 본 발명은 CD32b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL CDR 중 어느 것의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3개 또는 그 초과의 VL CDR을 포함한다 (또는 대안적으로, 이로 이루어진다).
본 발명은 또한 CD32b에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열) 내의 약 10개 이하의 아미노산이 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임). 본 발명은 또한 CD32b에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열) 내의 10개 이하의 아미노산이 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임).
본 발명은 또한 CD32b에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열) 내의 약 20개 이하의 아미노산이 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임). 본 발명은 또한 CD32b에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열) 내의 20개 이하의 아미노산이 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 첨가, 치환 또는 결실임).
본 발명의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편은 CDR 영역에서 돌연변이되었지만, 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 적어도 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편은 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 CDR 영역에서 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 CD32b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편의 VH, VL, 전장 중쇄, 및 전장 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 발현에 대해 최적화될 수 있다 (예를 들어, 표 1은 항체 NOV0281, NOV0308, NOV0563, NOV1216, NOV1218, NOV1219, NOV2106, NOV2107, NOV2108, NOV2109, NOV2110, NOV2111, NOV2112, 및 NOV2113의 중쇄 (야생형 Fc 영역을 갖거나 또는 Fc 영역에서 N297A 돌연변이를 함유하는 항체에 대한 서열을 포함함) 및 경쇄에 대한 핵산 서열 예를 나타냄).
본 출원의 텍스트 전반에 걸쳐, 본 명세서의 텍스트 (예를 들어, 표 1)와 서열 목록 사이에 불일치가 있을 수 있으며, 본 명세서의 텍스트가 우선할 것이다.
표 1. 본 발명의 CD32b 항체의 예
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본 발명의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편은 아미노산 또는 아미노산을 코딩하는 핵산이 돌연변이되었지만, 표 1에 기재된 서열에 대해 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95 퍼센트 동일성을 갖는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 이는 실질적으로 동일한 치료 활성을 보유하면서, 표 1에 기재된 서열에 도시된 가변 영역과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 가변 영역에서 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 1, 2, 및 3의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 14, 15, 및 16의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 4, 5, 및 6의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 17, 18, 및 19의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 7, 8, 및 9의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 20, 21, 및 22의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 53, 54, 및 55의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 66, 67, 및 68의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 56, 57, 및 58의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 69, 70, 및 71의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 59, 60, 및 61의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 72, 73, 및 74의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 105, 106, 및 107의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 118, 119, 120의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 108, 109, 및 110의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 121, 122, 123의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 111, 112, 및 113의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 124, 125, 126의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 157, 158, 및 159의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 170, 171, 172의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 160, 161, 및 162의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 173, 174, 175의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 163, 164, 및 165의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 176, 177, 178의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 209, 210, 및 211의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 222, 223, 및 224의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 212, 213, 및 214의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 225, 226, 및 227의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 215, 216, 및 217의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 228, 229, 및 230의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 261, 262, 및 263의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 274, 275, 및 276의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 264, 265, 및 266의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 277, 278, 및 279의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 267, 268, 및 269의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 280, 281, 및 282의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 313, 314, 및 315의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 326, 327, 및 328의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 316, 317, 및 318의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 329, 330, 및 331의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 319, 320, 및 321의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 332, 333, 및 334의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 365, 366, 및 367의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 378, 379, 및 380의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 368, 369, 및 370의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 381, 382, 및 383의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 371, 372, 및 373의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 384, 385, 및 386의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 417, 418, 및 419의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 430, 431, 및 432의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 420, 421, 및 422의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 433, 434, 및 435의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 423, 424, 및 425의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 436, 437, 및 438의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 469, 470, 및 471의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 482, 483, 및 484의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 472, 473, 및 474의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 485, 486, 및 487의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 475, 476, 및 477의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 488, 489, 및 490의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 521, 522, 및 523의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 534, 535, 및 536의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 524, 525, 및 526의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 537, 538, 및 539의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 527, 528, 및 529의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 540, 541, 및 542의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 547, 548, 및 549의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 560, 561, 및 562의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 550, 551, 및 552의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 563, 564, 및 565의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 553, 554, 및 555의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 566, 567, 및 568의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 573, 574, 및 575의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 586, 587, 및 588의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 576, 577, 및 578의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 589, 590, 및 591의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 579, 580, 및 581의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 592, 593, 및 594의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 625, 626, 및 627의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 638, 639, 및 640의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 628, 629, 및 630의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 641, 642, 및 643의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 각각 서열식별번호: 631, 632, 및 633의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 644, 645, 및 646의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 10의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 23의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 62의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 75의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 114의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 127의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 166의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 179의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 218의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 231의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 270의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 283의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 322의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 335의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 374의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 387의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 426의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 439의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 478의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 491의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 530의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 543의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 556의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 569의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 582의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 595의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 634의 VH 아미노산 서열 및 서열식별번호: 647의 VL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 12의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 25의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 38의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 51의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 64의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 77의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 90의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 103의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 116의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 129의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 142의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 155의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 168의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 181의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 194의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 207의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 220의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 233의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 246의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 259의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 272의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 285의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 298의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 311의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 324의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 337의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 350의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 363의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 376의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 389의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 402의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 415의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 428의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 441의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 454의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 467의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 480의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 493의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 506의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 519의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 532의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 545의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 558의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 571의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 584의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 597의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 610의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 623의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 636의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 649의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD32b에 결합하고 서열식별번호: 662의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 675의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
각각의 이들 항체가 CD32b에 결합할 수 있기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄, 및 전장 중쇄 서열 (아미노산 서열 및 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매칭"되어 본 발명의 다른 CD32b-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 CD32b-결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 결합 검정 (예를 들어, ELISA, 및 실시예 섹션에 기재된 다른 검정)을 사용하여 시험될 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH/VL 쌍형성으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍형성으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 VH/VL 쌍형성으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍형성으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표 1에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 그의 조합을 포함하는 CD32b-결합 항체를 제공한다. CDR 영역은 카바트 시스템(Kabat system) (Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)을 사용하거나, 또는 코티아 시스템(Chothia system) (Chothia et al. 1987 J. Mol. Biol. 196: 901-917; 및 Al-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 927-948)을 사용하여 서술된다. CDR 영역을 서술하는 다른 방법이 대안적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 카바트 및 코티아 둘 다의 CDR 정의는 CDR이 인간 VH에서의 아미노산 잔기 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3) 및 인간 VL에서의 아미노산 잔기 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), 및 89-97 (LCDR3) 중 일부 또는 모두를 포함할 수 있도록 조합될 수 있다.
각각의 이들 항체가 CD32b에 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공된다는 것을 고려하면, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있다 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있지만, 각각의 항체는 본 발명의 다른 CD32b-결합 결합 분자를 생성하기 위해 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유해야만 한다). 이러한 "혼합 및 매칭"된 CD32b-결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 결합 검정 및 실시예에 기재된 것 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 시험될 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 1개 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 제시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 돌연변이시킴으로써 신규 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
따라서, 본 발명은 서열식별번호: 1, 4, 7, 53, 56, 59, 105, 108, 111, 157, 160, 163, 209, 212, 215, 261, 264, 267, 313, 316, 319, 365, 368, 371, 417, 420, 423, 469, 472, 475, 521, 524, 527, 547, 550, 553, 573, 576, 579, 625, 628, 및 631 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 2, 5, 8, 54, 57, 60, 106, 109, 112, 158, 161, 164, 210, 213, 216, 262, 265, 268, 314, 317, 320, 366, 369, 372, 418, 421; 424, 470, 473, 476, 522, 525, 528, 548, 551, 554, 574, 577, 580, 626, 629, 및 632 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 3, 6, 9, 55, 58, 61, 107, 110, 113, 159, 162, 165, 211, 214, 217, 263, 266, 269, 315, 318, 321, 367, 370, 373, 419, 422, 425, 471, 474, 477, 523, 526, 529, 549, 552, 555, 575, 578, 581, 627, 630, 및 633 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 14, 17, 20, 66, 69, 72, 118, 121, 124, 170, 173, 176, 222, 225, 228, 274, 277, 280, 326, 329, 332, 378, 381, 384, 430, 433, 436, 482, 485, 488, 534, 537, 540, 560, 563, 566, 586, 589, 592, 638, 641, 644 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 15, 18, 21, 67, 70, 73, 119, 122, 125, 171, 174, 177, 223, 226, 229, 275, 278, 281, 327, 330, 333, 379, 382, 385, 431, 434, 437, 483, 486, 489, 535, 538, 541, 561, 564, 567, 587, 590, 593, 639, 642, 및 645 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 16, 19, 22, 68, 71, 74, 120, 123, 126, 172, 175, 178, 224, 227, 230, 276, 279, 282, 328, 331, 334, 380, 383, 386, 432, 435, 438, 484, 487, 490, 536, 539, 542, 562, 565, 568, 588, 591, 594, 640, 643, 및 646 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공하며; 여기서 항체는 CD32b에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 또한 서열식별번호: 10, 62, 114, 166, 218, 270, 322, 374, 426, 478, 530, 556, 582, 및 634 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 23, 75, 127, 179, 231, 283, 335, 387, 439, 491, 543, 569, 595, 및 647 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다.
본 발명은 또한 서열식별번호: 12, 38, 64, 90, 116, 142, 168, 194, 220, 246, 272, 298, 324, 350, 376, 402, 428, 454, 480, 506, 532, 558, 584, 610, 636, 및 662 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 25, 51, 77, 103, 129, 155, 181, 207, 233, 259, 285, 311, 337, 363, 389, 415, 441, 467, 493, 519, 545, 571, 597, 623, 649, 및 675 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다.
한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 표 1에 기재되어 있는 항체이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV0281이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV0281_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV0308이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV0308_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV0563이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV0563_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV1216이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV1216_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV1218이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV1218_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV1219이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV1219_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2106이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV02106_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2107이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2107_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2108이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2108_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2109이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2109_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2110_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2111_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2112이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2112_N297A이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2113이다. 한 실시양태에서, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체는 NOV2113_N297A이다.
본원에 개시된 CD32b-결합 항체, 또는 그의 항원 결합 단편의 일부 실시양태에서, 항체는 야생형 (WT) Fc 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 비-푸코실화된다. 다른 실시양태에서, 항체는 항체의 ADCC 활성을 증진시키는 (eADCC) 돌연변이를 포함하는 변형된 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 Fc 영역의 ADCC 활성을 침묵시키는 돌연변이 (Fc 침묵 돌연변이체)를 포함하는 변형된 Fc 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, CD32b-결합 항체는 WT Fc를 포함하는 비-푸코실화 NOV2108이다. 구체적 실시양태에서, CD32b-결합 항체는 각각 서열식별번호: 417, 418, 및 419의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 각각 서열식별번호: 430, 431, 및 432의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하며, 여기서 항체는 비-푸코실화된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, CD32b-결합 항체는 서열식별번호: 426의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 439의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하며, 여기서 항체는 비-푸코실화된다. 또 다른 실시양태에서, CD32b-결합 항체는 서열식별번호: 428의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 441의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, 여기서 항체는 비-푸코실화된다.
본원에 사용된 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 수득된 경우에 특정한 배선 서열"의 생성물"이거나 또는 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화시키거나 또는 파지 상에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 또는 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고 인간 항체의 서열에 가장 근접한 (즉, 최대 % 동일성) 서열인 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 또는 "그로부터 유래된" 인간 항체는 배선 서열과 비교하여, 예를 들어, 자연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적 도입으로 인한 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, VH 또는 VL 프레임워크 영역에서, 선택된 인간 항체는 전형적으로 아미노산 서열에서 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 뮤린 배선 서열)과 비교할 때 인간 항체를 인간의 것으로서 확인하는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 항체는 아미노산 서열에서 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 재조합 인간 항체는 VH 또는 VL 프레임워크 영역에서 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
상동 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 표 1에 기재된 서열에 상동인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 항체는 CD32b에 결합하고, 표 1에 기재된 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 (또는 그의 기능적 항원-결합 단편)를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 10, 62, 114, 166, 218, 270, 322, 374, 426, 478, 530, 556, 582, 및 634로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 23, 75, 127, 179, 231, 283, 335, 387, 439, 491, 543, 569, 595, 및 647로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 항체는 인간 CD32b 단백질에 특이적으로 결합한다.
한 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 표 1에 제시된 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 한 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고는 동일할 수 있다. 표 1에 기재된 것의 VH 및 VL 영역에 대해 높은 (즉, 80% 이상) 동일성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는 각각 서열식별번호: 10, 62, 114, 166, 218, 270, 322, 374, 426, 478, 530, 556, 582, 또는 634; 및 23, 75, 127, 179, 231, 283, 335, 387, 439, 491, 543, 569, 595, 또는 647을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어 코딩된 변경된 항체를 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능에 대해 시험하는 것에 의해 수득될 수 있다.
한 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 아미노산 서열은 표 1에 제시된 서열과 50% 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 각각 서열식별번호: 12, 38, 64, 90, 116, 142, 168, 194, 220, 246, 272, 298, 324, 350, 376, 402, 428, 454, 480, 506, 532, 558, 584, 610, 636, 및 662 중 어느 것의 전장 중쇄; 및 서열식별번호: 25, 51, 77, 103, 129, 155, 181, 207, 233, 259, 285, 311, 337, 363, 389, 415, 441, 467, 493, 519, 545, 571, 597, 623, 649, 및 675 중 어느 것의 전장 경쇄에 대해 높은 (즉, 80% 이상) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는 각각 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어 코딩된 변경된 항체를 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능에 대해 시험하는 것에 의해 수득될 수 있다.
한 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시된 서열과 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
한 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 영역은 표 1에 제시된 서열과 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
본원에 사용된, 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성은 동일한 위치의 수/위치의 총수 X 100과 같음). 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적 실시예에 기재된 바와 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 추가로, 예를 들어, 관련 서열을 확인하기 위해 공중 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다
보존적 변형을 갖는 항체
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지며, 여기서 이들 CDR 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체에 기초하여 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 갖고, 항체는 본 발명의 CD32b-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 기능적 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1은 서열식별번호: 1, 4, 7, 53, 56, 59, 105, 108, 111, 157, 160, 163, 209, 212, 215, 261, 264, 267, 313, 316, 319, 365, 368, 371, 417, 420, 423, 469, 472, 475, 521, 524, 527, 547, 550, 553, 573, 576, 579, 625, 628, 및 631 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 중쇄 가변 영역 CDR2는 서열식별번호: 2, 5, 8, 54, 57, 60, 106, 109, 112, 158, 161, 164, 210, 213, 216, 262, 265, 268, 314, 317, 320, 366, 369, 372, 418, 421; 424, 470, 473, 476, 522, 525, 528, 548, 551, 554, 574, 577, 580, 626, 629, 및 632 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 중쇄 가변 영역 CDR3은 서열식별번호: 3, 6, 9, 55, 58, 61, 107, 110, 113, 159, 162, 165, 211, 214, 217, 263, 266, 269, 315, 318, 321, 367, 370, 373, 419, 422, 425, 471, 474, 477, 523, 526, 529, 549, 552, 555, 575, 578, 581, 627, 630, 및 633 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1은 서열식별번호: 14, 17, 20, 66, 69, 72, 118, 121, 124, 170, 173, 176, 222, 225, 228, 274, 277, 280, 326, 329, 332, 378, 381, 384, 430, 433, 436, 482, 485, 488, 534, 537, 540, 560, 563, 566, 586, 589, 592, 638, 641, 644 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR2는 서열식별번호: 15, 18, 21, 67, 70, 73, 119, 122, 125, 171, 174, 177, 223, 226, 229, 275, 278, 281, 327, 330, 333, 379, 382, 385, 431, 434, 437, 483, 486, 489, 535, 538, 541, 561, 564, 567, 587, 590, 593, 639, 642, 및 645 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR3은 서열식별번호: 16, 19, 22, 68, 71, 74, 120, 123, 126, 172, 175, 178, 224, 227, 230, 276, 279, 282, 328, 331, 334, 380, 383, 386, 432, 435, 438, 484, 487, 490, 536, 539, 542, 562, 565, 568, 588, 591, 594, 640, 643, 및 646 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD32b에 특이적으로 결합하고 항체 결합된, CD32b 양성 표적 세포의 대식세포 및 NK 세포 사멸 둘 다를 매개한다.
한 실시양태에서, 포유동물 세포에서의 발현에 대해 최적화된 본 발명의 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 가지며, 여기서 이들 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체에 기초하여 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 갖고, 항체는 본 발명의 CD32b-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 포유동물 세포에서의 발현에 대해 최적화된 단리된 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 10, 62, 114, 166, 218, 270, 322, 374, 426, 478, 530, 556, 582, 및 6342 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 23, 75, 127, 179, 231, 283, 335, 387, 439, 491, 543, 569, 595, 및 647 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함하고; 여기서 항체는 CD32b에 특이적으로 결합하고 항체 결합된, CD32b 양성 표적 세포의 대식세포 및 NK 세포 사멸 둘 다를 매개한다.
한 실시양태에서, 포유동물 세포에서의 발현에 대해 최적화된 본 발명의 항체는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 가지며, 여기서 이들 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체에 기초하여 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 갖고, 항체는 본 발명의 CD32b-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 포함하는, 포유동물 세포에서의 발현에 대해 최적화된 단리된 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서 전장 중쇄는 서열식별번호: 12, 38, 64, 90, 116, 142, 168, 194, 220, 246, 272, 298, 324, 350, 376, 402, 428, 454, 480, 506, 532, 558, 584, 610, 636, 및 662 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함하고; 전장 경쇄는 서열식별번호: 25, 51, 77, 103, 129, 155, 181, 207, 233, 259, 285, 311, 337, 363, 389, 415, 441, 467, 493, 519, 545, 571, 597, 623, 649, 및 675 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형을 포함하고; 여기서 항체는 CD32b에 특이적으로 결합하고 항체 결합된, CD32b 양성 표적 세포의 대식세포 및 NK 세포 사멸 둘 다를 매개한다.
동일한 에피토프에 결합하는 항체
본 발명은 표 1에 열거된 CD32b-결합 항체가 결합하는 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 추가의 항체는 따라서 CD32b 결합 검정에서 본 발명의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편과 교차-경쟁하는 (예를 들어, 통계학적으로 유의한 방식으로 그의 결합을 경쟁적으로 억제하는) 그의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 CD32b 단백질에 대한 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 CD32b에 대한 결합에 대해 그러한 항체와 경쟁할 수 있다는 것을 입증하고; 이러한 항체는, 비제한적 이론에 따라, CD32B 상의 그가 경쟁하는 항체와 동일한 또는 관련된 (예를 들어, 구조적으로 유사한 또는 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, CD32B 상의 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조되고 단리될 수 있다.
항원 상의 목적하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어, 본 발명에 기재된 기술을 사용하여 그러한 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것이 가능하다. 대안적으로, 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특징화는 목적하는 에피토프에 대한 정보를 규명할 수 있다. 이 정보로부터, 이어서 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 이를 달성하기 위한 접근법은 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 예를 들어, 항원에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체를 찾기 위한 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다. 그의 교차-경쟁에 기초한 "비닝" 항체에 대한 고처리량 과정이 국제 특허 출원 번호 WO 2003/48731에 기재되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 실제로 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 것은 에피토프일 수 있다. 에피토프는 항체가 결합하는 잔기를 포함할 수 있다.
일반적으로, 특정한 표적 항원에 대해 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
에피토프를 포함하는 주어진 폴리펩티드의 영역은 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 수의 에피토프 매핑 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 고체 지지체 상에서 단백질 분자의 부분에 상응하는 펩티드인 다수의 펩티드를 동시에 합성하고, 펩티드가 여전히 지지체에 부착되어 있는 동안 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 공지되고, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,708,871; 문헌 [Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715]에 기재되어 있다. 유사하게, 입체형태적 에피토프는, 예를 들어, 수소/중수소 교환, X선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명에서와 같이 아미노산 CD32b의 공간 입체형태를 결정함으로써 용이하게 확인된다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols, 상기 문헌]을 참조한다. 단백질의 항원 영역은 또한 표준 항원성 및 소수친수성 플롯, 예컨대, 예를 들어, 옥스포드 몰레큘라 그룹(Oxford Molecular Group)으로부터 입수가능한 오미가(Omiga) 버전 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 것을 사용하여 확인될 수 있다. 이 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일을 결정하기 위해 호프/우즈(Hopp/Woods) 방법, 문헌 [Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828]; 및 소수친수성 플롯을 위해 카이트-둘리틀(Kyte-Doolittle) 기술, 문헌 [Kyte et al., (1982) J.MoI. Biol. 157:105-132]을 사용한다.
조작 및 변형된 항체
본 발명의 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있는 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 본원에 제시된 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상을 갖는 항체를 사용하여 추가로 제조될 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역 내 및/또는 1개 이상의 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키도록 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 하나의 유형은 CDR 그라프팅이다. 항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 우세하게 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 특정 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, [Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열 또는 재배열된 항체 서열을 포함하는 공중 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷 상의 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 입수가능함)뿐만 아니라, 각각의 내용이 본원에 참조로 명백하게 포함된 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열 및 재배열된 항체 서열은 "IMGT" 데이터베이스 (인터넷 상의 www.imgt.org에서 입수가능함; 각각의 내용이 본원에 참조로 명백하게 포함된 문헌 [Lefranc, M.P. et al., 1999 Nucleic Acids Res. 27:209-212] 참조)에서 찾아볼 수 있다
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체 및 그의 항원-결합 단편에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스 서열 및/또는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 프레임워크 서열이 유래된 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 배선 서열과 비교하여 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
가변 영역 변형의 또 다른 유형은, "친화도 성숙"으로 공지된, VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 이에 의해 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선시키는 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이(들)를 도입하도록 수행될 수 있고 항체 결합에 대한 효과, 또는 다른 관심 기능적 특성은 본원에 기재되고 실시예에 제공된 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
대안적 프레임워크 또는 스캐폴드로의 항원-결합 도메인 그라프팅
생성된 폴리펩티드가 CD32b에 특이적으로 결합하는 적어도 1개의 결합 영역을 포함하는 한, 매우 다양한 항체/이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 이뮤노글로불린의 5가지 주요 이디오타입, 그의 항원-결합 단편을 포함하고, 바람직하게는 인간화 측면을 갖는 다른 동물 종의 이뮤노글로불린을 포함한다. 이와 관련하여 단일 중쇄 항체 예컨대 낙타류에서 확인된 것이 특히 관심대상이다. 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 계속하여 발견되고 개발되고 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 그라프팅될 수 있는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-이뮤노글로불린 기반 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 공지된 또는 향후 비-이뮤노글로불린 프레임워크 및 스캐폴드는 이들이 표적 CD32b 단백질에 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 사용될 수 있다. 공지된 비-이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 피브로넥틴 (컴파운드 테라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 매사추세츠주 월섬), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd.), 매사추세츠주 캠브리지, 및 아블링스 엔브이(Ablynx nv), 벨기에 츠뷔나아르드), 리포칼린 (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이징), 소형 모듈 면역제약 (트루비온 파마슈티칼스 인크.(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 워싱턴주 시애틀), 맥시바디 (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰), 단백질 A (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴), 및 아필린 ((감마-결정질 또는 유비퀴틴) (실 프로테인스 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
피브로넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 유형 III의 제10 모듈 (10 Fn3 도메인))에 기초한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 그 자체가 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포되는 7 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 베타 가닥을 서로 연결하고 용매 노출된 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각각의 가장자리에 적어도 3개의 이러한 루프가 있으며, 여기서 가장자리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (미국 특허 번호 6,818,418 참조). 이들 피브로넥틴-기반 스캐폴드는 이뮤노글로불린이 아니지만, 전체 폴드는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄의 가변 영역인 최소의 기능적 항체 단편의 것과 밀접하게 관련된다. 이러한 구조로 인해, 비-이뮤노글로불린 항체는 속성 및 친화도가 항체의 것과 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이들 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙의 과정과 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링 전략에 사용될 수 있다. 이들 피브로넥틴-기반 분자는 분자의 루프 영역이 표준 클로닝 기술을 사용하여 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
안키린 기술은 상이한 표적에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 보유하기 위해 스캐폴드로서 안키린 유래 반복 모듈을 갖는 단백질을 사용하는 것에 기초한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행 알파-헬릭스 및 베타-턴으로 이루어진 33개의 아미노산 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.
아비머는 단백질 예컨대 LRP-1을 함유하는 천연 A-도메인으로부터 유래된다. 이들 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용에 사용되고 인간에서 250종 초과의 단백질은 구조적으로 A-도메인에 기초한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 다수의 상이한 "A-도메인" 단량체 (2-10개)로 이루어진다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 기재된 방법론을 사용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머가 생성될 수 있다.
아피바디 친화성 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 1개의 스캐폴드에 기초한 3-헬릭스 다발로 구성된 소형의 단순 단백질이다. 단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 이 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 이루어지며, 그 중 13개는 무작위화되어 다수의 리간드 변이체를 갖는 아피바디 라이브러리를 생성한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,831,012 참조). 아피바디 분자는 항체를 모방하고, 이들은 150 kDa인 항체의 분자량과 비교하여 6 kDa의 분자량을 갖는다. 그의 작은 크기에도 불구하고, 아피바디의 분자의 결합 부위는 항체의 것과 유사하다.
안티칼린은 피에리스 프로테오랩 아게 사에 의해 개발된 제품이다. 이들은 화학적으로 감수성 또는 불용성 화합물의 생리학적 수송 또는 저장에 통상적으로 수반되는 소형의 강건한 단백질의 광범위한 집단인 리포칼린으로부터 유래된다. 여러 천연 리포칼린은 인간 조직 또는 체액에서 발생한다. 단백질 구조는 초가변 루프가 경질 프레임워크의 상부에 존재하는 이뮤노글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 그의 재조합 단편과 대조적으로, 리포칼린은 160 내지 180개의 아미노산 잔기를 갖는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 단일 이뮤노글로불린 도메인보다 단지 약간 더 크다. 결합 포켓을 구성하는 4개의 루프의 세트는 현저한 구조적 가소성을 제시하고 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서 결합 부위는 상이한 형상의 규정된 표적 분자를 고친화도 및 특이성으로 인식하기 위해 독점적 방법으로 재성형될 수 있다. 리포칼린 패밀리 중 하나의 단백질인 피에리스 브라시카에(Pieris Brassicae)의 빌린-결합 단백질 (BBP)은 4개의 루프의 세트를 돌연변이유발시킴으로써 안티칼린을 개발하는 데 사용된 바 있다. 안티칼린을 기재하는 특허 출원의 하나의 예는 PCT 공개 번호 WO 199916873이다.
아필린 분자는 단백질 및 소분자에 대한 특이적 친화도를 위해 설계된 소형의 비-이뮤노글로불린 단백질이다. 새로운 아필린 분자는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선택될 수 있고, 이들 각각은 상이한 인간 유래 스캐폴드 단백질에 기초한다. 아필린 분자는 이뮤노글로불린 단백질에 대해 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. 현재, 2개의 아필린 스캐폴드가 사용되며, 이 중 하나는 감마 결정질인 인간 구조적 안구 수정체 단백질이고 다른 하나는 "유비퀴틴" 슈퍼패밀리 단백질이다. 인간 스캐폴드 둘 다는 매우 소형이고, 고온 안정성을 나타내고 pH 변화 및 변성제에 거의 저항성이다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 결정질 유래 단백질의 예는 WO200104144에 기재되어 있고 "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO2004106368에 기재되어 있다.
단백질 에피토프 모방체 (PEM)는 단백질-단백질 상호작용에 수반되는 주요 2차 구조인 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간 크기의, 시클릭, 펩티드-유사 분자 (MW 1-2 kDa)이다.
인간 CD32B-결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 인간공학 기술이 비-인간 항체를 조작된 인간 항체로 전환시키는 데 사용된다. 미국 특허 공개 번호 20050008625는 비인간 항체의 것과 비교하여 동일한 결합 특징을 유지하거나 또는 보다 우수한 결합 특징을 제공하면서 항체에서 비인간 항체 가변 영역을 인간 가변 영역으로 대체하는 생체내 방법을 기재한다. 방법은 비-인간 참조 항체의 가변 영역의 완전 인간 항체로의 에피토프 유도된 대체에 의존한다. 생성된 인간 항체는 일반적으로 참조 비인간 항체와 구조적으로 관련되지 않지만, 참조 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 간략하게, 일련의 에피토프-유도된 상보성 대체 접근법은 시험 항체의 항원에 대한 결합에 반응하는 리포터 시스템의 존재 하에 제한된 양의 항원에 대한 결합에 대해 "경쟁자"와 참조 항체의 다양한 하이브리드의 라이브러리 ("시험 항체") 사이의 세포내 경쟁을 설정함으로써 가능하게 된다. 경쟁자는 참조 항체 또는 그의 유도체 예컨대 단일-쇄 Fv 단편일 수 있다. 경쟁자는 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는, 항원의 천연 또는 인공 리간드일 수 있다. 경쟁자의 유일한 요건은 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것, 및 항원 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 것이다. 시험 항체는 비인간 참조 항체로부터의 공통적인 1개의 항원-결합 V-영역, 및 다양한 공급원 예컨대 인간 항체의 레퍼토리 라이브러리로부터 무작위로 선택된 다른 V-영역을 갖는다. 참조 항체로부터의 공통 V-영역은 가이드로서 역할을 하고, 시험 항체를 항원 상의 동일한 에피토프 상에 동일한 배향으로 위치시켜, 선택이 참조 항체에 대해 가장 높은 항원-결합 충실도를 향해 편향되도록 한다.
많은 유형의 리포터 시스템이 시험 항체와 항원 사이의 목적하는 상호작용을 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상보적 리포터 단편은 단편 상보성에 의한 리포터 활성화가 단지 시험 항체가 항원에 결합하는 경우에만 발생하도록 각각 항원 및 시험 항체에 연결될 수 있다. 시험 항체- 및 항원-리포터 단편 융합체가 경쟁자와 공동-발현되는 경우에, 리포터 활성화는 경쟁자와 경쟁하는 시험 항체의 능력에 의존하게 되고, 이는 항원에 대한 시험 항체의 친화도에 비례한다. 사용될 수 있는 다른 리포터 시스템은 미국 출원 일련 번호 10/208,730 (공개 번호 20030198971)에 개시된 바와 같은 자가-억제 리포터 재활성화 시스템 (RAIR)의 재활성화제, 또는 미국 특허 출원 일련 번호 10/076,845 (공개 번호 20030157579)에 개시된 경쟁적 활성화 시스템을 포함한다.
일련의 에피토프-유도된 상보성 대체 시스템에 의해, 경쟁자, 항원, 및 리포터 성분과 함께 단일 시험 항체를 발현하는 세포를 확인하는 선택이 이루어진다. 이들 세포에서, 각각의 시험 항체는 제한된 양의 항원에 대한 결합에 대해 경쟁자와 일-대-일로 경쟁한다. 리포터의 활성은 시험 항체에 결합된 항원의 양에 비례하며, 이는 다시 항원에 대한 시험 항체의 친화도 및 시험 항체의 안정성에 비례한다. 시험 항체는 처음에 시험 항체로서 발현되는 경우에 참조 항체의 것에 비한 그의 활성에 기초하여 선택된다. 선택의 제1 라운드의 결과는 "하이브리드" 항체의 세트이고, 이들 각각은 참조 항체로부터의 동일한 비-인간 V-영역 및 라이브러리로부터의 인간 V-영역으로 구성되고, 이들 각각은 항원 상의 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 제1 라운드에서 선택된 하이브리드 하나 이상이 참조 항체의 것과 대등하거나 또는 그보다 더 높은 항원에 대한 친화도를 가질 것이다.
제2 V-영역 대체 단계에서, 제1 단계에서 선택된 인간 V-영역은 나머지 비-인간 참조 항체 V-영역의 동족 인간 V-영역의 다양한 라이브러리로의 인간 대체의 선택을 위한 가이드로서 사용된다. 제1 라운드에서 선택된 하이브리드 항체는 또한 제2 라운드의 선택을 위한 경쟁자로서 사용될 수 있다. 제2 라운드의 선택의 결과는 참조 항체와 구조적으로 상이하지만 동일한 항원에 대한 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 완전 인간 항체의 세트이다. 선택된 인간 항체 중 일부는 참조 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 이들 선택된 인간 항체 중에서, 하나 이상은 참조 항체의 것과 대등하거나 또는 그보다 더 높은 친화도로 동일한 에피토프에 결합한다.
또한, 인간 CD32b-결합 항체는 또한 인간 항체를 통상적으로 생산하는 회사, 예를 들어, 칼로바이오스, 인크.(KaloBios, Inc.) (캘리포니아주 마운틴 뷰)로부터 상업적으로 입수될 수 있다.
낙타류 항체
신세계 구성원 예컨대 라마 종 (라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 포함하는 낙타 및 단봉낙타 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius)) 패밀리의 구성원으로부터 수득된 항체 단백질은 크기, 구조적 복잡성 및 인간 대상체에 대한 항원성에 대해 특징화되었다. 자연에서 발견된 바와 같은 이 패밀리의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체는 경쇄가 결여되고, 따라서 다른 동물로부터의 항체의 경우에 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4개의 쇄 4차 구조와 구조적으로 구별된다. PCT/EP93/02214 (1994년 3월 3일에 공개된 WO 94/04678)를 참조한다.
VHH로 확인된 소형의 단일 가변 도메인인 낙타류 항체의 영역은 "낙타류 나노바디"로 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 생성하는, 표적에 대해 고친화도를 갖는 소형의 단백질을 생산하도록 유전자 조작함으로써 수득될 수 있다. 1998년 6월 2일에 허여된 미국 특허 번호 5,759,808을 참조하고; 또한 문헌 [Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; 및 Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타류 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는, 예를 들어, 아블링스, 벨기에 겐트로부터 상업적으로 입수가능하다. 비-인간 기원의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편과 같이, 낙타류 항체의 아미노산 서열은 인간 서열과 보다 밀접하게 유사한 서열을 수득하도록 재조합적으로 변경될 수 있고, 즉, 나노바디는 "인간화"일 수 있다. 따라서 인간에 대한 낙타류 항체의 자연적으로 낮은 항원성은 추가로 감소될 수 있다.
낙타류 나노바디는 인간 IgG 분자량의 대략 1/10의 분자량을 갖고, 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 갖는다. 소형 크기의 하나의 결과는 보다 큰 항체 단백질의 경우에 기능적으로 보이지 않는 항원 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력이고, 즉, 낙타류 나노바디는 전형적인 면역학적 기술을 사용하여 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서 소형 크기의 또 다른 결과는 낙타류 나노바디가 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈새에서의 특이적 부위에 대한 결합의 결과로서 억제할 수 있고, 따라서 전형적인 항체의 기능보다 전형적인 저분자량 약물의 기능과 더 근접하게 유사한 능력을 제공할 수 있다는 것이다.
저분자량 및 조밀한 크기는 추가로 극도로 열안정성이고, 극도의 pH 및 단백질분해적 소화에 대해 안정하고, 낮은 항원성인 낙타류 나노바디를 생성한다. 또 다른 결과는 낙타류 나노바디가 순환계로부터 조직 내로 용이하게 이동하고, 심지어 혈액-뇌 장벽을 가로지르고 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 또한 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 약물 수송을 추가로 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일에 공개된 미국 특허 출원 20040161738을 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이들 특색은 큰 치료 잠재력을 나타낸다. 추가로, 이들 분자는 원핵 세포 예컨대 이. 콜라이(E. coli)에서 완전히 발현될 수 있고 박테리오파지와의 융합 단백질로서 발현되고 기능적이다.
따라서, 본 발명의 특색은 CD32b에 대해 고친화도를 갖는 낙타류 항체 또는 나노바디이다. 본원의 한 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 낙타류 동물에서 자연적으로 생산되고, 즉, 다른 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 사용하여 CD32b 또는 그의 펩티드 단편으로 면역화시킨 후의 낙타류에 의해 생산된다. 대안적으로, CD32b-결합 낙타류 나노바디는 조작되고, 즉, 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 CD32b를 사용하는 패닝 절차를 사용하여 적절하게 돌연변이유발된 낙타류 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지의 라이브러리로부터의 선택에 의해 생산된다. 조작된 나노바디는 추가로 수용자 대상체에서 45분 내지 2주 반감기를 갖도록 유전자 조작함으로써 맞춤화될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214에 기재된 바와 같이, 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열에 그라프팅함으로써 수득된다.
이중특이적 분자 및 다가 항체
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CD32b-결합 항체, 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특색으로 한다. 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 영역은 유도체화되거나 또는 또 다른 기능적 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결되어 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 유도체화되거나 또는 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고; 이러한 다중특이적 분자는 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 의해 포괄되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 이중특이적 분자를 생성하도록 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 또는 다른 것에 의함) 1종 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결될 수 있다.
따라서, 본 발명은 CD32b에 대한 적어도 1개의 제1 결합 특이체 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이체를 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한 CD32b의 또 다른 에피토프이다.
추가적으로, 이중특이적 분자가 다중특이적인 본 발명의 경우에, 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프 이외에도 제3 결합 특이체를 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 적어도 1종의 항체, 또는, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 쇄 Fv를 포함하는 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner et al.)에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 임의의 그의 최소 단편 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있다.
디아바디는 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인 사이에 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되는 2가의, 이중특이적 분자이다. VH 및 VL 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위를 생성한다 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poijak et al., 1994 Structure 2:1121-1123] 참조). 디아바디는 동일한 세포 내에 구조 VHA-VLB 및 VHB-VLA (VH-VL 배위), 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA (VL-VH 배위)를 갖는 2개의 폴리펩티드 쇄를 발현시킴으로써 생산될 수 있다. 이들 중 대부분은 박테리아에서 가용성 형태로 발현될 수 있다. 단일 쇄 디아바디 (scDb)는 대략 15개의 아미노산 잔기의 링커로 2개의 디아바디-형성 폴리펩티드 쇄를 연결함으로써 생산된다 (문헌 [Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36] 참조). scDb는 박테리아에서 가용성, 활성 단량체 형태로 발현될 수 있다 (문헌 [Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21] 참조). 디아바디는 Fc에 융합되어 "디-디아바디"를 생성할 수 있다 (문헌 [Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65)] 참조).
본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이체는 개별적으로 생성되고 이어서 서로 접합될 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에, 다양한 커플링제 또는 가교제는 공유 접합에 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-5-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스 (2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83, 및 Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 접합제는 둘 다 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.) (일리노이주 록포드)로부터 입수가능한 SATA 및 술포-SMCC이다.
결합 특이체가 항체인 경우에, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합에 의해 접합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 둘 다의 결합 특이체는 동일한 벡터 내에 코딩되고 동일한 숙주 세포에서 발현되고 조립될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 분자가 mAb X mAb, mAb X Fab, Fab X F(ab')2 또는 리간드 X Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 1개의 단일 쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자의 그의 특이적 표적에 대한 결합은, 예를 들어, 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (REA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 확인될 수 있다. 각각의 이들 검정은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용함으로써 특정한 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CD32b에 결합하는 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 적어도 2개의 동일한 또는 상이한 항원-결합 부분을 포함하는 다가 화합물을 제공한다. 항원-결합 부분은 단백질 융합 또는 공유 또는 비-공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 연결 방법은 이중특이적 분자에 대해 기재된 바 있다. 4가 화합물은 예를 들어 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편과 가교시킴으로써 수득될 수 있다.
삼량체화 도메인은 예를 들어 특허 EP 1 012 280B1 (Borean)에 기재되어 있다. 오량체화 모듈은 예를 들어 PCT/EP97/05897에 기재되어 있다.
연장된 반감기를 갖는 항체
본 발명은 연장된 생체내 반감기를 갖는, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다
많은 인자가 단백질의 생체내 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 신장 여과, 간에서의 대사, 단백질분해 효소 (프로테아제)에 의한 분해, 및 면역원성 반응 (예를 들어, 항체에 의한 단백질 중화 및 대식세포 및 수지상 세포에 의한 흡수). 다양한 전략을 사용하여 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 반감기를 연장할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), reCODE PEG, 항체 스캐폴드, 폴리시알산 (PSA), 히드록시에틸 전분 (HES), 알부민-결합 리간드, 및 탄수화물 쉴드에 대한 화학적 연결; 혈청 단백질, 예컨대 알부민, IgG, FcRn, 및 트렌스페린에 결합하는 단백질에 대한 유전자 융합; 혈청 단백질, 예컨대 나노바디, Fab, DARPin, 아비머, 아피바디, 및 안티칼린에 결합하는 다른 결합 모이어티에 대한 (유전학적 또는 화학적) 커플링; rPEG, 알부민, 알부민의 도메인, 알부민-결합 단백질, 및 Fc에 대한 유전자 융합; 또는 나노담체, 느린 방출 제제, 또는 의료 기기 내로의 혼입에 의한다.
항체의 생체내 혈청 순환을 연장하기 위해, 불활성 중합체 분자 예컨대 고분자량 PEG는 다중기능적 링커를 사용하거나 또는 사용하지 않고 항체 또는 그의 단편에, 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위-특이적 접합을 통해 또는 리신 잔기에 존재하는 엡실론-아미노 기를 통해 부착될 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해, 항체, 그의 항원-결합 단편은 전형적으로 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응한다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용된 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하도록 의도된다. 한 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비-글리코실화 항체이다. 최소한의 생물학적 활성의 손실을 일으키는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 것이다. 접합의 정도가 SDS-PAGE 및 질량 분광측정법에 의해 면밀히 모니터링되어 PEG 분자의 항체에 대한 적절한 접합을 보장할 수 있다. 미반응 PEG는 크기-배제 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화된 항체는 관련 기술분야의 통상에 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 본원에 기재된 면역검정에 의해 결합 활성뿐만 아니라 생체내 효능에 대해 시험될 수 있다. 단백질을 PEG화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.
다른 변형된 PEG화 기술은 tRNA 신테타제 및 tRNA를 포함하는 재구성된 시스템을 통해 화학적으로 명시된 측쇄를 생합성 단백질 내로 혼입시키는 화학적으로 직교 지시된 조작 기술의 재구성 (ReCODE PEG)을 포함한다. 이러한 기술은 이. 콜라이, 효모, 및 포유동물 세포에서 30개 초과의 새로운 아미노산을 생합성 단백질 내로 혼입할 수 있게 한다. tRNA는 앰버 코돈이 위치한 임의의 부위에 비천연 아미노산을 혼입시켜, 정지 코돈으로부터의 앰버가 화학적으로 명시된 아미노산의 혼입을 신호전달하는 것으로 전환되게 한다.
재조합 PEG화 기술 (rPEG)은 또한 혈청 반감기 연장에 사용될 수 있다. 이 기술은 300-600개의 아미노산 비구조화 단백질 꼬리를 기존 제약 단백질에 유전적으로 융합시키는 것을 수반한다. 이러한 비구조화 단백질 쇄의 겉보기 분자량은 그의 실제 분자량보다 약 15배 더 크기 때문에, 단백질의 혈청 반감기는 크게 증가한다. 화학적 접합 및 재정제를 필요로 하는 전통적인 PEG화와 대조적으로, 제조 방법은 크게 단순화되고 생성물은 균질하다.
폴리시알화는 천연 중합체 폴리시알산 (PSA)을 활성 수명을 연장하고 치료 펩티드 및 단백질의 안정성을 개선시키는 데 사용하는 또 다른 기술이다. PSA는 시알산 (당)의 중합체이다. 단백질 및 치료 펩티드 약물 전달에 사용되는 경우에, 폴리시알산은 접합에 대한 보호성 미세환경을 제공한다. 이는 순환 중인 치료 단백질의 활성 수명을 증가시키고 면역계에 의해 인식되는 것을 방지한다. PSA 중합체는 인간 신체에서 자연적으로 발견된다. 이는 특정 박테리아에 의해 채택되어 수백만년에 걸쳐 그의 벽을 이것으로 코팅하도록 진화되었다. 이들 천연 폴리시알릴화 박테리아는 이어서 분자 모방에 의해 신체의 방어 시스템을 이겨낼 수 있었다. 자연의 궁극적인 은폐 기술인 PSA는 이러한 박테리아로부터 대량으로 미리 결정된 물리적 특징을 갖는 것으로 용이하게 생산될 수 있다. 박테리아 PSA는 인간 신체에서 PSA와 화학적으로 동일하기 때문에 심지어 단백질에 커플링된 경우에 완전히 비-면역원성이다.
또 다른 기술은 항체에 연결된 히드록시에틸 전분 ("HES") 유도체의 사용을 포함한다. HES는 찰옥수수 전분으로부터 유래된 변형된 천연 중합체이고 신체의 효소에 의해 대사될 수 있다. HES 용액은 통상적으로 투여되어 결핍된 혈액량을 대체하고 혈액의 레올로지 특성을 개선시킨다. 항체의 HES화는 분자의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 신장 클리어런스를 감소시킴으로써 순환 반감기의 연장을 가능하게 하여, 증가된 생물학적 활성을 일으킨다. 상이한 파라미터, 예컨대 HES의 분자량을 변경시킴으로써, 광범위한 HES 항체 접합체는 맞춤화될 수 있다.
증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 또한 1개 이상의 아미노산 변형 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인, 또는 그의 FcRn 결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편)에 도입하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 98/23289; 국제 공개 번호 WO 97/34631; 및 미국 특허 번호 6,277,375를 참조한다.
추가로, 항체는 항체 또는 항체 단편을 생체내에서 보다 안정적이게 하거나 또는 보다 긴 생체내 반감기를 갖도록 하기 위해 알부민에 접합될 수 있다. 이 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되며, 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 93/15199, WO 93/15200, 및 WO 01/77137; 및 유럽 특허 번호 EP 413,622를 참조한다.
반감기를 증가시키는 전략은 나노바디, 피브로넥틴-기반 결합제, 및 증가된 생체내 반감기가 목적되는 다른 항체 또는 단백질에 특히 유용하다.
항체 접합체
본 발명은 이종 단백질 또는 폴리펩티드 (또는 그의 항원-결합 단편, 바람직하게는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개의 아미노산의 폴리펩티드)에 재조합적으로 융합되거나 또는 화학적으로 접합되어 (공유 및 비-공유 접합 둘 다 포함) 융합 단백질을 생성하는, CD32b에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 또는 VL CDR) 및 이종 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 항체 또는 항체 단편에 융합시키거나 또는 접합시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 및 5,112,946; 유럽 특허 번호 EP 307,434 및 EP 367,166; 국제 공개 번호 WO 96/04388 및 WO 91/06570; 문헌 [Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; 및 Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341]을 참조한다.
추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링, 및/또는 코돈-셔플링 (집합적으로 "DNA 셔플링"으로 지칭됨)의 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 활성을 변경시키는 데 (예를 들어, 보다 높은 친화도 및 보다 낮은 해리율을 갖는 항체 및 그의 항원-결합 단편) 사용될 수 있다. 일반적으로, 미국 특허 번호 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, 및 5,837,458; 문헌 [Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; 및 Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2):308-313] (각각의 이들 특허 및 공개는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 항체 및 그의 항원-결합 단편, 또는 코딩된 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 재조합 전의 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 방법에 의한 무작위 돌연변이유발에 적용됨으로써 변경될 수 있다. CD32b에 특이적으로 결합하는 항체, 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 이종 분자의 1종 이상의 성분, 모티프, 절편, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
더욱이, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 마커 서열, 예컨대 정제를 용이하게 하는 펩티드에 융합될 수 있다. 한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 특히 헥사-히스티딘 펩티드 (서열식별번호: 684), 예컨대 pQE 벡터 (퀴아젠, 인크.(QIAGEN, Inc.), 91311 캘리포니아주 채츠워스 에톤 애비뉴 9259)에서 제공되는 태그이고, 이들 중 다수가 상업적으로 입수가능하다. 문헌 [Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘 (서열식별번호: 684)은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌 ("HA") 태그 (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), 및 "플래그" 태그를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD32b 결합 항체 및 그의 항원-결합 단편은 진단제 또는 검출가능한 작용제에 접합될 수 있다. 이러한 항체는 특정한 요법의 효능을 결정하는 것과 같은 임상 시험 절차의 일부로서 질환 또는 장애의 개시, 발생, 진행 및/또는 중증도를 모니터링하거나 또는 예후하는 데 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 항체를, 다양한 효소, 예컨대, 비제한적으로, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제; 보결분자단, 예컨대, 비제한적으로, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광 물질, 예컨대, 비제한적으로, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 발광 물질, 예컨대, 비제한적으로, 루미놀; 생물발광 물질, 예컨대 비제한적으로, 루시페라제, 루시페린, 및 에쿼린; 방사성 물질, 예컨대, 비제한적으로, 아이오딘 (131I, 125I, 123I, 및 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115In, 113In, 112In, 및 111In), 테크네튬 (99Tc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데넘 (99Mo), 크세논 (133Xe), 플루오린 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149 Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 및 117Tin; 및 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 검출가능한 물질에 커플링시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명은 추가로 치료 모이어티에 접합된 항체 및 그의 항원-결합 단편의 사용을 포괄한다. 항체, 그의 항원-결합 단편은 치료 모이어티 예컨대 세포독소, 예를 들어, 세포증식억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예를 들어 알파-방출체에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 작용제를 포함한다.
추가로, 항체, 그의 항원-결합 단편은 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 치료 모이어티 또는 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 치료 모이어티 또는 약물 모이어티는 전형적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 독소 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아폽토시스제, 항혈관신생제; 또는 생물학적 반응 조절제 예컨대, 예를 들어, 림포카인을 포함할 수 있다.
더욱이, 항체는 치료 모이어티 예컨대 방사성 금속 이온, 예컨대 알파-방출자 예컨대 213Bi 또는 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방사선금속 이온을 폴리펩티드에 접합시키는 데 유용한 마크로시클릭 킬레이트화제에 접합될 수 있다. 한 실시양태에서, 마크로시클릭 킬레이트화제는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 통상적으로 관련 기술분야에 공지되어 있고 문헌 [Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4 (10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4):553-7; 및 Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26 (8):943-50]에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]을 참조한다.
항체는 또한 면역검정 또는 표적 항원의 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체의 생산 방법
항체를 코딩하는 핵산
본 발명은 상기 기재된 CD32b-결합 항체 쇄의 절편 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는, 실질적으로 정제된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 중 일부는 서열식별번호: 10, 62, 114, 166, 218, 270, 322, 374, 426, 478, 530, 556, 582, 또는 634 중 어느 것에 제시된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 서열식별번호: 23, 75, 127, 179, 231, 283, 335, 387, 439, 491, 543, 569, 595, 또는 647 중 어느 것에 제시된 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 핵산 분자는 표 1에서 확인된 것이다. 본 발명의 일부 다른 핵산 분자는 표 1에서 확인된 것의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 65, 80%, 95%, 또는 99%) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적절한 발현 벡터로부터 발현된 경우에, 이들 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 CD32b 항원 결합 능력을 나타낼 수 있다.
또한, 표 1에 제시된 CD32b-결합 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 적어도 1개의 CDR 영역 및 통상적으로 3개의 모든 CDR 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 제공된다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 표 1에 제시된 CD32b-결합 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 서열의 모두 또는 실질적으로 모두를 코딩한다. 코드의 축중성으로 인해, 다양한 핵산 서열은 각각의 이뮤노글로불린 아미노산 서열을 코딩할 것이다.
본 발명의 핵산 분자는 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 다를 코딩할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열 중 일부는 서열식별번호: 12, 38, 64, 90, 116, 142, 168, 194, 220, 246, 272, 298, 324, 350, 376, 402, 428, 454, 480, 506, 532, 558, 584, 610, 636, 또는 662 중 어느 것에 제시된 성숙 중쇄 가변 영역 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 90%, 또는 99%) 성숙 중쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 핵산 서열 중 일부는 서열식별번호: 25, 51, 77, 103, 129, 155, 181, 207, 233, 259, 285, 311, 337, 363, 389, 415, 441, 467, 493, 519, 545, 571, 597, 623, 649, 및 675 중 어느 것에 제시된 성숙 경쇄 가변 영역 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 90%, 또는 99%) 성숙 경쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 신생 고체-상 DNA 합성 또는 CD32b-결합 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 기존 서열 (예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 PCR 돌연변이유발에 의해 생산될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌 [Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌 [Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 번호 4,458,066의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 돌연변이를 폴리뉴클레오티드 서열에 도입하는 것은, 예를 들어, 문헌 [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
상기 기재된 CD32b-결합 항체를 생산하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 또한 본 발명에 제공된다. 다양한 발현 벡터가 CD32b-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 바이러스-기반 및 비-바이러스 발현 벡터 둘 다가 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 전형적으로 단백질 또는 RNA를 발현하기 위한 발현 카세트를 갖는 에피솜 벡터, 및 인간 인공 염색체 (예를 들어, 문헌 [Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997] 참조)를 포함한다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간) 세포에서 CD32b-결합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 유용한 비-바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C, (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 샌디에고), MPSV 벡터, 및 다른 단백질을 발현하기 위한 관련 기술분야에 공지된 수많은 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관 바이러스, 포진 바이러스를 기반으로 하는 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바르 바이러스를 기반으로 하는 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트 바이러스 (SFV)를 포함한다. 문헌 [Brent et al., 상기문헌; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; 및 Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992]을 참조한다.
발현 벡터의 선택은 벡터가 발현되도록 의도되는 숙주 세포에 의존한다. 전형적으로, 발현 벡터는 CD32b-결합 항체 쇄, 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)을 함유한다. 한 실시양태에서, 유도성 프로모터는 유도 조건 하인 경우를 제외하고 삽입된 서열의 발현을 방지하는 데 사용된다. 유도성 프로모터는, 예를 들어, 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 보다 우수하게 허용되는 코딩 서열에 대한 집단으로 편향되지 않으면서 비유도 조건 하에서 확장될 수 있다. 프로모터에 더하여, CD32b-결합 항체 쇄, 항원-결합 단편의 효율적인 발현을 위해 다른 조절 요소가 또한 요구되거나 바람직할 수 있다. 이들 요소는 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현의 효율은 사용상 세포계에 적절한 인핸서의 포함에 의해 증진될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
발현 벡터는 또한 분비 신호 서열 위치를 제공하여 삽입된 CD32b-결합 항체 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 갖는 융합 단백질을 형성할 수 있다. 보다 종종, 삽입된 CD32b-결합 항체 서열은 벡터에 포함되기 전에 신호 서열에 연결된다. CD32b-결합 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열을 수용하는 데 사용되는 벡터는 때때로 또한 불변 영역 또는 그의 일부를 코딩한다. 이러한 벡터는 불변 영역과의 융합 단백질로서의 가변 영역의 발현을 허용함으로써 무손상 항체 및 그의 항원-결합 단편의 생산을 유도한다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 인간의 것이다.
CD32b-결합 항체 쇄를 보유하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현하는 데 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스(bacilli), 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 엔테로박테리아세아에(enterobacteriaceae), 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용성인 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 임의로 오퍼레이터 서열과 함께 전형적으로 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 본 발명의 CD32b-결합 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 조합된 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포가 본 발명의 CD32b-결합 폴리펩티드를 발현하고 생산하는데 사용된다. 예를 들어, 이들은 내인성 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 사멸 또는 정상적인 또는 비정상적인 불멸 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함하는, 무손상 이뮤노글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되었다. 폴리펩티드를 발현하기 위한 포유동물 조직 세포 배양물의 사용은, 예를 들어, 문헌 [Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에서 전체적으로 논의된다. 포유동물 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터, 및 인핸서 (예를 들어, 문헌 [Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 통상적으로 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적, 및/또는 조정가능하거나 또는 조절가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라시클린-유도성 CMV 프로모터 (예컨대, 인간 극초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 관련 기술분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 통상적으로 원핵 세포에 대해 사용되는 반면에, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다. (일반적으로, [Sambrook, et al., 상기 문헌] 참조). 다른 방법은, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개 형질전환, 주사 및 미세주사, 탄도적 방법, 비로솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 포진 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합 (Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), 작용제-증진된 DNA 흡수, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 종종 바람직할 것이다. 예를 들어, CD32b-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 안정하게 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선택 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 벡터의 도입에 이어, 세포는 1-2일 동안 풍부화 배지에서 성장되도록 한 후에 선택 배지로 전환될 수 있다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것이고, 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포가 선택 배지에서 성장하게 한다. 안정하게 형질감염된 내성 세포는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체의 생성
모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론 예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 많은 기술 예를 들어, B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환이 사용될 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간화 모노클로날 항체이다. 본 발명의 키메라 또는 인간화 항체 및 그의 항원-결합 단편은 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득되고 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 뮤린 가변 영역은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6180370 (Queen et al.)을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. CD32b에 대해 지시된 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하고, 이는 본원에서 집합적으로 "인간 Ig 마우스"로 지칭된다.
HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 뮤 및 카파 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (뮤 및 감마) 및 카파 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 K의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 부류 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나서 고친화도의 인간 IgG-카파 모노클로날을 생성한다 (상기 문헌 [Lonberg, N. et al., 1994]; 문헌 [Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 검토됨). HuMAb 마우스의 제조 및 사용, 및 이러한 마우스에 의해 보유되는 게놈 변형은 추가로 문헌 [Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; 및 Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851]에 기재되어 있으며, 이들 모두의 내용은 그 전문이 구체적으로 본원에 참조로 포함된다. 추가로, 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; (모두 Lonberg and Kay); 미국 특허 번호 5,545,807 (Surani et al.); PCT 공개 번호 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962, (모두 Lonberg and Kay); 및 PCT 공개 번호 WO 01/14424 (Korman et al.)를 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모솜 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되는 이러한 마우스는 PCT 공개 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세히 기재되어 있다.
또한 추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스제닉 동물 시스템이 관련 기술분야에서 이용가능하고 본 발명의 CD32b-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse) (아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))로 지칭되는 대안적 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.
더욱이, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 관련 기술분야에서 이용가능하고 본 발명의 CD32b-결합 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜 둘 다를 보유하는 마우스가 사용될 수 있고; 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 소가 관련 기술분야에 기재되었고 (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894) 이는 본 발명의 CD32b-결합 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하는 이러한 파지 디스플레이 방법은 관련 기술분야에 확립되거나 또는 하기 실시예에 기재되어 있다. 예를 들어: 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner et al.); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (Dower et al.); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths et al.)을 참조한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화 시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 발명의 조작된 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형을 가한 것을 포함한다. 전형적으로 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 항체는 항체가 유래된 배선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배위로 되돌리기 위해, 체세포 돌연변이는, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발에 의해 배선 서열로 "복귀돌연변이"될 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이"된 항체는 또한 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포-에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 프레임워크 영역 내 또는 심지어는 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로도 지칭되고 미국 특허 공개 번호 20030153043 (Carr et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 더하여 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는, 전형적으로 항체의 1개 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 항체의 1개 이상의 기능적 특성을 다시 변경시키기 위해 화학적으로 변형되거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 그의 글리코실화가 변경되도록 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시양태가 하기 추가로 상세히 기재되어 있다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 것이다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역이 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가되거나 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가시키거나 또는 감소시키도록 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같은 하기 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 얻은 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경시키기 위해 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다 Winter et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 1개 이상의 아미노산이 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소된 또는 폐지된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/거나 Fc-감마 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이 접근법은, 예를 들어, PCT 공개 WO 00/42072 (Presta) 및 문헌 [Lazar et al., 2006 PNAS 103(110): 4005-4010]에 추가로 기재되어 있다. 더욱이, 인간 IgG1 상의 Fc-감마 RI, Fc-감마 RII, Fc-감마 RIII 및 FcRn에 대한 결합 부위가 맵핑되었고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재된 바 있다 (문헌 [Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화는 변형된다. 예를 들어, 비-글리코실화 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는, 예를 들어, 항체의 "항원"에 대한 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내의 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 일으키는 1개 이상의 아미노산 치환이 이루어져 그 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항체의 항원에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 글리코실화 유형을 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 또는 비-푸코실화 항체, 또는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현함으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재된 바 있고 본 발명의 재조합 항체를 발현하여 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 감소된 능력을 갖는 변이체 CHO 세포주, LecI3 세포를 기재하며, 그러한 숙주 세포 내에서 발현된 항체의 저푸코실화를 또한 일으킨다 (또한, 문헌 [Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342 (Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타 (1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 이러한 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내고 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 일으킨다 (또한 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 문헌 [Von Horsten et al. in 2010 Glycobiology 20(12):1607-18]은 또한 CHO 세포에서의 항체와 이종 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로스 리덕타제의 공동-발현에 의해 비푸코실화(non-fucosylated) 항체를 생산하는 방법을 기재한다.
변경된 항체를 조작하는 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 CD32b-결합 항체는 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 CD32b-결합 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 CD32b-결합 항체의 구조적 특색은 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 적어도 1개의 기능적 특성, 예컨대 인간 CD32b에 결합하고 또한 CD32b의 1개 이상의 기능적 특성을 억제시키는 것을 보유하는 구조적으로 관련된 CD32b-결합 항체를 생성하는 데 사용된다.
예를 들어, 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 1개 이상의 CDR 영역, 또는 그의 돌연변이는 공지된 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어, 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 추가의 재조합-조작된 CD32b-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 이전 섹션에 기재된 것을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에 제공된 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상, 또는 그의 1개 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에 제공된 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상, 또는 그의 1개 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조 (즉, 단백질로서 발현)할 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보는 출발 물질로서 원래 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성하는 데 사용되고 이어서 "제2 세대" 서열(들)은 단백질로서 제조되고 발현된다.
변경된 항체 서열은 또한 US20050255552에 기재된 바와 같은 고정된 CDR3 서열 또는 최소 필수 결합 결정기 및 CDR1 및 CDR2 서열에 대한 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터 항체를 스크리닝하는 데 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예컨대 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술은 변경된 항체 서열을 제조하고 발현하는 데 사용될 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩되는 항체는 인간 CD32b 단백질에 특이적으로 결합하는 것 및/또는 CD32b의 1개 이상의 기능적 특성을 억제하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 본원에 기재된 CD32b-결합 항체의 기능적 특성 중 1개, 일부 또는 모두를 보유하는 것이다.
변경된 항체의 기능적 특성은 관련 기술분야에서 이용가능하고/거나 본원에 기재된 표준 검정, 예컨대 실시예에 제시된 것 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 평가될 수 있다.
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 조작하는 방법의 한 실시양태에서, 돌연변이는 CD32b-결합 항체 코딩 서열의 모두 또는 일부를 따라 무작위적으로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성된 변형된 CD32b-결합 항체는 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 관련 기술분야에 기재된 바 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 02/092780 (Short)은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 어셈블리, 또는 그의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재한다. 대안적으로, PCT 공개 WO 03/074679 (Lazar et al.)는 항체의 생리화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 기재한다.
본 발명의 항체의 특징화
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편은 다양한 기능적 검정에 의해 특징화될 수 있다. 예를 들어, 이는 CD32b를 억제하는 그의 능력에 의해 특징화될 수 있다.
CD32b에 결합하는 항체의 능력은 관심 항체를 직접 표지함으로써 검출될 수 있거나, 또는 항체는 표지되지 않고 관련 기술분야에 공지된 다양한 샌드위치 검정 포맷을 사용하여 결합이 간접적으로 검출될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD32b-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편은 참조 CD32b-결합 항체의 CD32b 폴리펩티드에 대한 결합을 차단하거나 그와 경쟁한다. 이들은 상기 기재된 완전 인간 또는 인간화 CD32b-결합 항체일 수 있다. 이들은 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 인간, 마우스, 키메라 또는 인간화 CD32b-결합 항체일 수 있다. 참조 항체 결합을 차단하거나 또는 그와 경쟁하는 능력은 시험 하의 CD32b-결합 항체가 참조 항체에 의해 정의되는 것과 동일한 또는 유사한 에피토프, 또는 참조 CD32b-결합 항체에 의해 결합되는 에피토프와 충분히 근접한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 이러한 항체는 특히 참조 항체에 대해 확인된 유리한 특성을 공유할 가능성이 있다. 참조 항체를 차단하거나 또는 그와 경쟁하는 능력은, 예를 들어, 경쟁 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 경쟁 결합 검정에 의해, 시험 하의 항체는 참조 항체의 공통 항원, 예컨대 CD32b 폴리펩티드에 대한 특이적 결합을 억제하는 능력에 대해 검사된다. 시험 항체는 과량의 시험 항체가 참조 항체의 결합을 실질적으로 억제하는 경우에 항원에 대한 특이적 결합에 대해 참조 항체와 경쟁한다. 실질적인 억제는 시험 항체가 참조 항체의 특이적 결합을 통상적으로 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 90%만큼 감소시킨다는 것을 의미한다.
특정한 단백질, 본 경우에, CD32b에 대한 결합에 대한 항체와 참조 항체의 경쟁을 평가하는 데 사용될 수 있는 다수의 공지된 경쟁 결합 검정이 있다. 이들은, 예를 들어, 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986] 참조); 고체 상 직접 표지된 검정, 고체 상 직접 표지된 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow & Lane, 상기 문헌] 참조); I-125 표지를 사용하는 고체 상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990); 및 직접 표지된 RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990)를 포함한다. 전형적으로, 이러한 검정은 고체 표면에 결합된 정제된 항원 또는 비표지된 시험 CD32b-결합 항체 및 표지된 참조 항체 중 어느 하나를 지니는 세포의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상적으로, 시험 항체는 과량으로 존재한다. 경쟁 검정 (경쟁 항체)에 의해 확인된 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 입체 장애를 일으키기에 충분히 근접한 인접한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
선택된 CD32b-결합 모노클로날 항체가 고유한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 각각의 항체는 상업적으로 입수가능한 시약 (예를 들어, 피어스, 일리노이주 록포드로부터의 시약)을 사용하여 비오티닐화될 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체 및 비오티닐화된 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁 연구는 CD32b 폴리펩티드 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 비오티닐화된 MAb 결합은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로 검출될 수 있다. 정제된 CD32b-결합 항체의 이소형을 결정하기 위해, 이소형 ELISA가 수행될 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰은 1 μg/ml의 항-인간 IgG로 밤새 4℃에서 코팅될 수 있다. 1% BSA로 차단한 후, 플레이트는 1 μg/ml 이하의 모노클로날 CD32b-결합 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 반응한다. 이어서 웰은 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합된 프로브와 반응할 수 있다. 이어서 플레이트는 발색되고 분석되어 정제된 항체의 이소형이 결정될 수 있다.
모노클로날 CD32b-결합 항체의 CD32b 폴리펩티드를 발현하는 살아있는 세포에 대한 결합을 입증하기 위해, 유동 세포측정법이 사용될 수 있다. 간략하게, CD32b를 발현하는 세포주 (표준 성장 조건 하에 성장됨)는 0.1% BSA 및 10% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 CD32b-결합 항체와 혼합되고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 세척한 후, 세포는 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응한다. 샘플은 단세포를 게이팅하기 위해, 광 및 측방 산란 특성을 사용하는 FACS캔(FACScan) 기기에 의해 분석될 수 있다. 형광 현미경검사를 사용하는 대안적 검정이 유동 세포측정법 검정(에 더하여 또는 그 대신에) 사용될 수 있다. 세포는 상기 기재된 바와 같이 정확하게 염색되고 형광 현미경검사에 의해 검사될 수 있다. 이 방법은 개별 세포의 가시화를 허용하지만, 항원의 밀도에 따라 감소된 감수성을 가질 수 있다.
본 발명의 CD32b-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편은 웨스턴 블롯팅에 의해 CD32b 폴리펩티드 또는 항원 단편과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간략하게, 정제된 CD32b 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 CD32b를 발현하는 세포로부터의 세포 추출물은 제조되고 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용될 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로스 막으로 옮겨지고, 10% 소 태아 혈청으로 차단되고, 시험될 모노클로날 항체로 프로빙된다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출되고 BCIP/NBT 기질 태블릿 (시그마 켐. 캄파니(Sigma Chem. Co.), 미주리주 세인트 루이스)으로 발색될 수 있다.
기능적 검정의 예는 또한 하기 실시예 섹션에 기재된다.
예방 및 치료 용도
본 발명은 증가된 CD32b 활성 또는 발현과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써, 증가된 CD32b 활성 또는 발현과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본 발명은 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 미만성 대 B 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 소림프구성 림프종, 미만성 소분할 세포 림프종, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종 및 여포성 림프종을 포함하는 B 세포 악성종양뿐만 아니라 전신 경쇄 아밀로이드증을 포함하는 다른 질환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 적응증을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD32b-관련 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써, CD32b-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 개시된 CD32b 결합 항체, 또는 그의 항원-결합 단편이 유용할 수 있는, 공지된 CD32b 관련 질환 또는 장애의 예는 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 미만성 대 B 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 소림프구성 림프종, 미만성 소분할 세포 림프종, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종 및 여포성 림프종을 포함하는 B 세포 악성종양뿐만 아니라 전신 경쇄 아밀로이드증을 포함하는 다른 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 특히, CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 또 다른 항체와 조합되어, 다른 항체의 효능을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD32b 및 세포 표면 항원은 B 세포 상에서 공동-발현된다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 항원은 CD20, CD38, CD52, CS1/SLAMF7, KiR, CD56, CD138, CD19, CD40, Thy-1, Ly-6, CD49, Fas, Cd95, APO-1, EGFR, HER2, CXCR4, HLA 분자, GM1, CD22, CD23, CD80, CD74, 또는 DRD로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 다른 CD32b-결합 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 리툭시맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 다라투무맙, 엘로투주맙, 알렘투주맙, 또는 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원을 표적화하는 임의의 다른 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 조합되어 사용된다. 본 발명의 항-CD32b 항체, 또는 그의 항원-결합 단편이 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 다른 항체의 활성을 증진시킨다는 관찰에 대한 설명은 항-CD32b 항체가 CD32b에 결합하여 CD32b가 세포 표면 항원-결합 항체의 Fc 영역에 결합하는 것을 차단하고, 이는 세포 표면 항원-결합 항체가 면역 이펙터 세포와 결합하고 (예를 들어 ADCC를 통해) 세포 사멸 기능을 매개하는 것을 가능하게 하고, 세포 표면 항원-결합 항체가 세포 내로 내재화되어 (예를 들어 ADCC를 통해) 세포 사멸을 매개하지 않는 것을 잠재적으로 방지한다는 것이다.
또한, 본 발명의 CD32b 결합 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 특히, CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 항체를 사용하는 치료에 저항성 또는 불응성이 된 환자의 질환 진행을 치료, 예를 들어, 예방, 지연 또는 역전시키는 데 사용될 수 있다. CD32b를 본원에 개시된 CD32b-결합 항체, 또는 그의 항원 결합 단편으로 차단시킴으로써, 세포 표면 항원 결합 항체의 효능은 증진되어, 이러한 항체에 대한 저항성은 완전히 또는 부분적으로 역전될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 단리된 항-CD32b 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 것과 같은 치료 방법 또는 절차와 함께 그를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 또한, 단독 또는 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 1종 이상의 항체와 조합된, 본 개시내용의 항-CD32b 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 논의된 바와 같은 또 다른 치료제와 추가로 조합될 수 있다.
예를 들어, 조합 요법은 1종 이상의 추가의 치료제, 예를 들어 1종 이상의 항암제, 세포독성 또는 세포증식억제제, 호르몬 치료, 백신, 및/또는 다른 면역요법과 함께 공동-제제화되고/거나 공-투여되는 본 발명의 조성물을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항체 분자는 수술, 방사선, 동결수술, 및/또는 열요법을 포함하는 다른 치유적 치료 양식과 조합되어 투여된다. 이러한 조합 요법은 유리하게는 투여되는 치료제를 보다 낮은 투여량으로 이용할 수 있고, 따라서 다양한 단독요법과 연관된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다
"와 조합되어"는 이들 전달 방법이 본원에 기재된 범주 내일지라도, 요법 또는 치료제가 동시에 투여되어야 하고/거나 함께 전달하기 위해 제제화되어야 한다는 것을 암시하는 것으로 의도되지 않는다. 항-CD32b 항체 분자는 1종 이상의 다른 추가의 요법 또는 치료제와 공동으로, 그 전에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 항-CD32b 항체 분자 및 다른 작용제 또는 치료 프로토콜은 임의의 순서로 투여될 수 있다. 일반적으로, 각각의 작용제는 그러한 작용제에 대해 결정된 용량 및/또는 시간 스케줄로 투여될 것이다. 추가로, 이 조합에 이용되는 추가의 치료제는 단일 조성물로 함께 투여될 수 있거나 또는 상이한 조성물로 개별적으로 투여될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 일반적으로, 조합되어 이용되는 추가의 치료제는 이들이 개별적으로 이용되는 경우의 수준을 초과하지 않는 수준으로 이용될 것으로 예상된다. 일부 실시양태에서, 조합되어 이용되는 수준은 개별적으로 이용되는 것보다 더 낮을 것이다.
본 개시내용의 항-CD32b 항체, 또는 그의 항원-결합 단편의 예시적인 조합은 이러한 항체를 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 및 만성 림프구성 림프종을 포함하는 혈액 악성종양을 치료하기 위한 표준 관리제인 화합물, 예컨대 오파투무맙, 이브루티닙, 벨리노스타트, 로미뎁신, 브렌툭시맙 베도틴, 오비누투주맙, 프랄라트렉세이트, 펜토스타틴, 덱사메타손, 이델라리십, 익사조밉, 리포솜 독소루비신, 포말리도미드, 파노비노스타트, 엘로투주맙, 다라투무맙, 알렘투주맙, 탈리도미드, 및 레날리도미드와 조합하여 사용하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-CD32b 항체 분자는 공동자극 분자의 조정제, 예를 들어, 효능제와 조합되어 투여된다. 한 실시양태에서, 조정제는 IL15이다. 한 실시양태에서, 공동자극 분자의 효능제는 STING, OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 또는 CD83 리간드의 효능제 (예를 들어, 효능작용 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 가용성 융합체)로부터 선택된다.
예시적인 GITR 효능제는, 예를 들어, GITR 융합 단백질 및 항-GITR 항체 (예를 들어, 2가 항-GITR 항체), 예컨대, 미국 특허 번호 6,111,090, 유럽 특허 번호 090505B1, 미국 특허 번호 8,586,023, PCT 공개 번호 WO 2010/003118 및 2011/090754에 기재된 GITR 융합 단백질, 또는, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,025,962, 유럽 특허 번호 1947183B1, 미국 특허 번호 7,812,135, 미국 특허 번호 8,388,967, 미국 특허 번호 8,591,886, 유럽 특허 번호 EP 1866339, PCT 공개 번호 WO 2011/028683, PCT 공개 번호:WO 2013/039954, PCT 공개 번호 WO2005/007190, PCT 공개 번호 WO 2007/133822, PCT 공개 번호 WO2005/055808, PCT 공개 번호 WO 99/40196, PCT 공개 번호 WO 2001/03720, PCT 공개 번호 WO99/20758, PCT 공개 번호 WO2006/083289, PCT 공개 번호 WO 2005/115451, 미국 특허 번호 7,618,632, 및 PCT 공개 번호 WO 2011/051726에 기재된 항-GITR 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 항-CD32b 항체 분자는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR 베타, 및 IDO (인돌아민-2,3 디옥시게나제)로부터 선택된 억제 (또는 면역 체크포인트) 분자의 억제제와 조합되어 투여된다. 억제 분자의 억제는 DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 억제에 의해 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD32b 분자는 관련 기술분야에 공지된 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 1종 이상의 억제제와 조합되어 투여된다. 억제제는 항체, 그의 항원 결합 단편, 이뮤노어드헤신, 융합 단백질, 또는 올리고펩티드일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 WO2015/112900에 개시된 항체 중 어느 것, MDX-1106, 머크(Merck) 3475 또는 CT-011로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PD-1 억제제는 이뮤노어드헤신 (예를 들어, 불변 영역 (예를 들어, 이뮤노글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 이뮤노어드헤신)이다. 일부 실시양태에서, PD-1 억제제는 AMP-224이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 억제제는 항-PD-L1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 결합 길항제는 YW243.55.S70, MPDL3280A, MEDI-4736, MSB-0010718C, 또는 MDX-1105로부터 선택된다. 또한 BMS-936559로 공지된 MDX-1105는 WO2007/005874에 기재된 항-PD-L1 항체이다. 항체 YW243.55.S70 (중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 각각 서열식별번호: 20 및 21에 제시됨)은 WO 2010/077634에 기재된 항-PD-L1이다.
또한 MDX-1106-04, ONO-4538 또는 BMS-936558로 공지된 MDX-1106은 WO2006/121168에 기재된 항-PD-1 항체이다. 또한 MK-3475 또는 SCH-900475로 공지된 머크 3745는 WO2009/114335에 기재된 항-PD-1 항체이다. 피딜리주맙 (CT-011; 큐어 테크(Cure Tech))은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG1k 모노클로날 항체이다. 피딜리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 모노클로날 항체는 WO2009/101611에 개시되어 있다. 다른 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙이다. 펨브롤리주맙 ((상표명 키트루다(Keytruda) 이전에 람브롤리주맙, 또한 MK-3475로 공지됨)은 예를 들어, 문헌 [Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44]에 개시되어 있다. AMP-224 (B7-DCIg; 암플리뮨(Amplimmune); 예를 들어, WO2010/027827 및 WO2011/066342에 개시됨)는 PD-1과 B7-H1 사이의 상호작용을 차단하는 PD-L2 Fc 융합 가용성 수용체이다. 다른 항-PD-1 항체는 AMP 514 (암플리뮨), 특히, 예를 들어, US 8,609,089, US 2010028330, 및/또는 US 20120114649에 개시된 항-PD-1 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 MDX-1106이다. MDX-1106에 대한 대체 명칭은 MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 또는 니볼루맙을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙 (CAS 등록 번호: 946414-94-4)이다. 니볼루맙 (또한 BMS-936558 또는 MDX1106로 지칭됨; 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb))은 PD-1을 특이적으로 차단하는 완전 인간 IgG4 모노클로날 항체이다. 니볼루맙 (클론 5C4) 및 PD-1에 특이적으로 결합하는 다른 인간 모노클로날 항체는 US 8,008,449 및 WO2006/121168에 개시되어 있다. 람브롤리주맙 (또한 펨브롤리주맙 또는 MK03475로 지칭됨; 머크)은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG4 모노클로날 항체이다. 펨브롤리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 항체는 US 8,354,509 및 WO2009/114335에 개시되어 있다. 다른 항-PD1 항체는 AMP 514 (암플리뮨), 특히, 예를 들어, US 8,609,089, US 2010028330, 및/또는 US 20120114649에 개시된 항-PD1 항체를 포함한다.
MDPL3280A (제넨테크(Genentech) / 로슈(Roche))는 PD-L1에 결합하는 인간 Fc 최적화된 IgG1 모노클로날 항체이다. MDPL3280A 및 PD-L1에 대한 다른 인간 모노클로날 항체는 미국 특허 번호 7,943,743 및 미국 공개 번호 20120039906에 개시되어 있다. 다른 항-PD-L1 결합제는 YW243.55.S70 (중쇄 및 경쇄 가변 영역은 WO2010/077634의 서열식별번호: 20 및 21에 제시됨) 및 MDX-1105 (또한 BMS-936559로 지칭됨, 예를 들어, WO2007/005874에 개시된 항-PD-L1 결합제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 MSB0010718C이다. MSB0010718C (또한 A09-246-2로 지칭됨; 머크 세로노(Merck Serono))는 PD-L1에 결합하는 모노클로날 항체이다. 펨브롤리주맙 및 다른 인간화 항-PD-L1 항체는 WO2013/079174에 개시되어 있다.
AMP-224 (B7-DCIg; 암플리뮨; 예를 들어, WO2010/027827 및 WO2011/066342에 개시됨)는 PD-1과 B7-H1 사이의 상호작용을 차단하는 PD-L2 Fc 융합 가용성 수용체이다.
일부 실시양태에서, 항-LAG-3 항체는 BMS-986016이다. BMS-986016 (또한 BMS986016로 지칭됨; 브리스톨-마이어스 스큅)은 LAG-3에 결합하는 모노클로날 항체이다. BMS-986016 및 다른 인간화 항-LAG-3 항체는 US 2011/0150892, WO2010/019570, 및 WO2014/008218에 개시되어 있다.
한 실시양태에서, 억제제는 가용성 리간드 (예를 들어, CTLA-4-Ig), 또는 CTLA4에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 예시적인 항-CTLA4 항체는 트레멜리무맙 (화이자(Pfizer)로부터 입수가능한 IgG2 모노클로날 항체, 이전에 티실리무맙으로 공지됨, CP-675,206); 및 이필리무맙 (CTLA-4 항체, 또한 MDX-010으로 공지됨, CAS 번호 477202-00-9)을 포함한다.
한 실시양태에서, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, -3 및/또는 -5)의 억제제는 항-CEACAM 항체 분자이다. 암배아성 항원 세포 부착 분자 (CEACAM), 예컨대 CEACAM-1 및 CEACAM-5는, 적어도 부분적으로, 항종양 면역 반응의 억제를 매개하는 것으로 여겨진다 (예를 들어, 문헌 [Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529] 참조). 예를 들어, CEACAM-1은 TIM-3에 대한 이종친화성 리간드로서 및 TIM-3-매개 T 세포 관용 및 소진에서 역할을 하는 것으로서 기재되었다 (예를 들어, WO2014/022332; 문헌 [Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848] 참조). 실시양태에서, CEACAM-1 및 TIM-3의 공동-차단은 이종이식편 결장직장암 모델에서 항종양 면역 반응을 증진시키는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, WO 2014/022332; 문헌 [Huang, et al. (2014), 상기 문헌] 참조). 다른 실시양태에서, CEACAM-1 및 PD-1의 공동-차단은, 예를 들어, WO 2014/059251에 기재된 바와 같은 T 세포 관용을 감소시킨다. 예시적인 항-CEACAM-1 항체는 WO 2010/125571, WO 2013/082366 및 WO 2014/022332에 기재되어 있고, 예를 들어, 예를 들어, US 2004/0047858, US 7,132,255 및 WO 99/052552에 기재된 바와 같은 모노클로날 항체 34B1, 26H7, 및 5F4; 또는 그의 재조합 형태이다. 다른 실시양태에서, 항-CEACAM 항체는, 예를 들어, 문헌 [Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)]에 기재된 바와 같은 CEACAM-5에 결합하거나, 또는, 예를 들어, WO 2013/054331 및 US 2014/0271618에 기재된 바와 같은 CEACAM-1 및 CEACAM-5와 교차반응한다.
항-CD32b 항체 분자 (단독 또는 다른 자극제와 조합됨)와 암에 대한 표준 관리의 예시적인 조합은 적어도 하기를 포함한다.
방사선 요법은 비제한적으로 외부-빔 요법, 내부 방사선 요법, 이식물 방사선, 정위 방사선수술, 전신 방사선 요법, 방사선요법 및 영구적 또는 일시적 간질성 근접요법을 포함하는 여러 방법 중 1종, 또는 방법의 조합을 통해 투여될 수 있다. 용어 "근접요법"은 종양 또는 다른 증식성 조직 질환 부위에서 또는 그 근처에서 신체에 삽입된 공간적으로 제한된 방사성 물질에 의해 전달되는 방사선 요법을 지칭한다. 용어는 비제한적으로 방사성 동위원소 (예를 들어, At-211, I-131, I-125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P-32, 및 Lu의 방사성 동위원소)에 대한 노출을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 세포 컨디셔너로 사용하기에 적합한 방사선원은 고체 및 액체 둘 다를 포함한다. 비제한적 예로서, 방사선원은 방사성핵종, 예컨대 고체 공급원으로서의 I-125, I-131, Yb-169, Ir-192, 고체 공급원으로서의 I-125, 또는 광자, 베타 입자, 감마 방사선, 또는 다른 치료 광선을 방출하는 다른 방사성핵종일 수 있다. 방사성 물질은 또한 방사성핵종(들)의 임의의 용액, 예를 들어, I-125 또는 I-131의 용액으로부터 만들어진 유체일 수 있거나, 또는 방사성 유체는 작은 입자의 고체 방사성핵종, 예컨대 Au-198, Y-90을 함유하는 적합한 유체의 슬러리를 사용하여 생산될 수 있다. 더욱이, 방사성핵종(들)은 겔 또는 방사성 마이크로 구체로 구현될 수 있다.
단독 또는 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 항체와 조합된, 및/또는 면역조정제 (예를 들어, 항-PD1, 항-LAG3, 항-PD-L1 또는 항-TIM-3 항체 분자)와 조합된, 항-CD32b 항체 분자는 수술; 방사선 요법 (예를 들어, 방사선 분야가 설계되는 3차원, 입체조형 방사선 요법을 수반하는 외부-빔 요법, 국부 방사선 (예를 들어, 미리 선택된 표적 또는 기관에 대해 지시된 방사선), 또는 초점식 방사선)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 암을 치료하기 위한 기존 양식 중 1종 이상과 조합되어 사용될 수 있다. 초점식 방사선은 정위 방사선수술, 분할 정위 방사선수술, 및 강도-조정식 방사선 요법으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 초점식 방사선은, 예를 들어, WO 2012/177624에 기재된 바와 같은 입자 빔 (양성자), 코발트-60 (광자), 및 선형 가속기 (X선)로 이루어진 군으로부터 선택된 방사선원을 가질 수 있다.
통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 표 1에 기재된 것을 포함하는 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 수반하는 조합 요법은 상기 기재된 작용제의 다수의 부류를 수반하는 조합 요법을 포함할 수 있다. 본 발명의 치료제가 또 다른 작용제 또는 작용제들과 함께 투여되는 경우에, 2가지 (또는 그 초과)는 임의의 순서로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 항체는 또한 1종 이상의 다른 작용제 또는 방법을 사용한 요법을 받는 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, 결합 분자는 외과적 치료와 함께 투여된다. 조합 요법은 부가적일 수 있거나, 또는 이는 상승작용적 결과를 생성할 수 있다.
진단 용도
한 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, 혈청, 세포, 조직)과 관련하여 또는 질환 또는 장애를 앓고 있는 개체로부터, CD32b 및/또는 핵산 발현뿐만 아니라 CD32b 기능을 결정하는 진단 검정을 포괄한다.
진단 검정, 예컨대 경쟁적 검정은 시험 샘플 분석물과 공통 결합 파트너 상의 제한된 수의 결합 부위에 대해 경쟁하는 표지된 유사체 ("트레이서")의 능력에 의존한다. 일반적으로 경쟁 전 또는 후에 결합 파트너는 불용화되고 이어서 결합 파트너에 결합된 트레이서 및 분석물은 미결합 트레이서 및 분석물로부터 분리된다다. 이 분리는 경사분리 (결합 파트너가 사전불용화된 경우) 또는 원심분리 (결합 파트너가 경쟁적 반응 후에 침전된 경우)에 의해 달성된다. 시험 샘플 분석물의 양은 마커 물질의 양에 의해 측정 시 결합된 트레이서의 양에 반비례한다. 기지의 양의 분석물을 사용한 용량-반응 곡선은 시험 샘플에 존재하는 분석물의 양을 정량적으로 결정하기 위해, 시험 결과에 의해 생성 및 비교된다. 이들 검정은 검출가능한 마커로서 효소가 사용되는 경우에 ELISA 시스템으로 불린다. 이 형태의 검정에서, 항체와 CD32b-결합 항체 사이의 경쟁적 결합은 결합된 CD32b, 바람직하게는 본 발명의 CD32b 에피토프를 생성하고, 이는 혈청 샘플 중 중화 항체를 포함하는 혈청 샘플 중 항체의 척도이다.
검정의 유의한 이점은 중화 항체 (즉, CD32b, 특히 에피토프의 결합을 방해하는 것)의 직접 측정이 이루어진다는 것이다. 특히 ELISA 시험 형태의 이러한 검정은 임상 환경 및 상용 혈액 스크리닝에 상당한 용도를 갖는다.
CD32b와 연관된 장애를 갖는 환자의 임상 진단 또는 모니터링에서, 정상 대상체로부터의 상응하는 생물학적 샘플에서의 수준과 비교하여, 상승된 수준의 CD32b 단백질 또는 mRNA의 검출은 CD32b와 연관된 장애를 갖는 환자를 나타낸다.
생체내 진단 또는 영상화가 US2006/0067935에 기재되어 있다. 간략하게, 이들 방법은 일반적으로 환자에게 비-침습 방법에 의해 검출가능한 마커 또는 표지에 작동가능하게 부착된 CD32b 결합 분자의 진단 유효량을 투여하거나 또는 도입하는 것을 포함한다. 항체-마커 접합체는 CD32b에 국재화하고 이에 결합하기에 충분한 시간이 허용된다. 이어서 환자는 검출 장치에 노출되어 검출가능한 마커를 확인하고, 따라서 환자의 조직 내에서 CD32b 결합 분자의 위치의 영상을 형성한다. CD32b 결합 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 존재는 항체-마커가 조직의 성분에 결합하는지 여부를 결정함으로써 검출된다. 정상 개체와 비교하여 CD32b 단백질 또는 단백질의 조합에서의 증가된 수준의 검출은 CD32b와 연관된 장애에 대한 소인 및/또는 그의 발병을 나타낼 수 있다. 본 발명의 이들 측면은 또한 조직 영상화 방법 및 조합 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 진단 검정, 예후 검정, 약리유전체학, 및 임상 시험 모니터링이 예후 (예측) 목적으로 사용되어 개체를 예방적으로 치료하는 예측 의학의 분야에 관한 것이다.
본 발명은 또한 개체가 CD32b의 조절이상과 연관된 장애가 발생할 위험에 있는지 여부를 결정하기 위한 예후 (또는 예측) 검정을 제공한다. 예를 들어, CD32b 유전자 내에서의 돌연변이는 생물학적 샘플에서 검정될 수 있다. 이러한 검정은 예후 또는 예측 목적에 사용되어, CD32b, 핵산 발현 또는 활성을 특징으로 하거나 또는 이와 연관된 장애의 발병 전에 개체를 예방적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 개체에서 CD32b 핵산 발현 또는 CD32b 활성을 결정하여 그러한 개체에게 적절한 치료제 또는 예방제를 선택하는 방법을 제공한다 (본원에서 "약리유전체학"으로 지칭됨). 약리유전체학은 개체의 유전자형 (예를 들어, 특정한 작용제에 반응하는 개체의 능력을 결정하기 위해 검사된 개체의 유전자형)에 기초하여 개체의 치료적 또는 예방적 치료를 위한 작용제 (예를 들어, 약물)의 선택을 허용한다.
본 발명의 또 다른 측면은 임상 시험에서 CD32b의 발현 또는 활성에 대한 작용제 (예를 들어, 약물)의 영향을 모니터링하는 방법을 제공한다.
제약 조성물
본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, CD32b-결합 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 조성물은 추가적으로 CD32b-연관 질환 (예를 들어, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 미만성 대 B 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 소림프구성 림프종, 미만성 소분할 세포 림프종, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종 및 여포성 림프종을 포함하는 B 세포 악성종양뿐만 아니라 전신 경쇄 아밀로이드증을 포함하는 다른 질환)을 치료하거나 또는 예방하는 데 적합한 1종 이상의 다른 치료제를 함유할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 조성물을 증진 또는 안정화시키거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 한다. 제약상 허용되는 담체는 생리학상 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라진다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하일 수 있거나, 또는 표적 부위에 근접하게 투여될 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
조성물은 무균 및 유체이어야 한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것은 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 일어날 수 있다
본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지되고 상용적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 및 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 제약 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에 제조된다. 전형적으로, CD32b-결합 항체의 치료 유효 용량 또는 효과적인 용량이 본 발명의 제약 조성물에 사용된다. CD32b-결합 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제제화된다. 투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간의 경과에 따라 투여될 수 있거나 또는 용량이 치료 상황의 위급성에 의해 지시된 바에 따라 비례하여 감소되거나 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합화된 물리적 이산 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 특정한 환자에게 독성이 아니면서 특정한 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정한 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용된 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력을 포함하는 다양한 약동학적 인자, 및 유사 인자에 의존한다.
의사 또는 수의사는 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 용량을 목적하는 치료 효과를 달성하는 데 요구되는 것보다 더 낮은 수준에서 시작하고, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 서서히 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 알레르기성 염증성 장애의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 또는 동물인지의 여부, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부를 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 달라진다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하도록 적정될 필요가 있다. 항체를 사용한 전신 투여의 경우에, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 및 보다 통상적으로 0.01 내지 15 mg/kg의 범위이다. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 1개월 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다.
항체는 통상적으로 다수회 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 CD32b-결합 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 나타나는 바에 따라 불규칙적일 수 있다. 전신 투여의 일부 방법에서, 투여량은 1-1000 μg/ml 및 일부 방법에서 25-500 μg/mL의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다. 대안적으로, 항체는 지속 방출 제제로서 투여될 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화 항체는 키메라 항체 및 비인간 항체의 반감기보다 더 긴 반감기를 나타낸다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방 용도에서, 상대적으로 낮은 투여량이 상대적으로 덜 빈번한 간격으로 장기간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 여생 동안 계속해서 치료를 받는다. 치료 용도에서, 질환의 진행이 감소되거나 또는 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 나타낼 때까지 상대적으로 짧은 간격의 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방 요법이 투여될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 그의 범주를 제한하지는 않는다. 본 발명의 다른 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이고 첨부된 청구범위에 의해 포괄된다.
실시예 1: CD32b 항체의 확인
모르포시스(Morphosys) HuCAL 플라티눔(HuCAL PLATINUM)® 파지 라이브러리 패닝으로부터의 항체
인간 CD32b (인간 FCGR2B, 유니프롯KB P31994 아미노산 43-222 (서열식별번호: 680), APP 및 avi-태그 포함)를 특이적으로 인식하지만 인간 CD32a-R (인간 FCGR2A, 유니프롯KB P12318 변이체 H167R, 아미노산 34-218 (서열식별번호: 681), APP 및 avi-태그 포함)은 그렇지 않은 항체의 선택을 위해 모르포시스 HuCAL 플라티눔® 라이브러리를 사용하였다. 파지미드 라이브러리는 HuCAL® 개념 (Knappik et al., 2000, J Mol Biol 296: 57-86)에 기초하고 파지 표면 상에 Fab를 디스플레이하기 위해 시스디스플레이(CysDisplay)TM 기술을 사용한다 (WO01/05950). 결과적으로 인간 CD32b 특이적 항체를 생성하는 패닝 전략을 액체 상 패닝 전략을 사용하여 선택하였다.
인간 CD32b에 대한 액체 상 패닝
항원 선택 공정을 비오티닐화 인간 CD32b를 사용하여 3 라운드에 걸쳐 수행하였다. 파지 용액을 차단 시약으로 차단한 후, 뉴트라비딘 코팅된 웰 상의 가능한 뉴트라비딘 결합제의 용액을 고갈시켰다. 구출된 파지를 비오티닐화 인간 CD32b와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후, 파지-항원 복합체를 뉴트라비딘 코팅된 웰 상에서 포획하였다. 미결합 파지를 PBST (0.05% 트윈으로 보충된 PBS)에 이어서 PBS를 사용하여 세척하였다. 특이적으로 결합된 파지의 용리를 위해, 25 mM DTT (디티오트레이톨)를 실온에서 10분 (min) 동안 첨가하였다. DTT 용리액을 이. 콜라이 (에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)) TG-F+ 세포의 감염에 사용하였다. 감염 후, 박테리아를 원심분리하고 펠릿을 100 ml 2YT (효모 - 트립톤) 배지/Cam (클로람페니콜)/1% 글루코스 중에 재현탁시키고 37℃에서 밤새 인큐베이션하고 220rpm에서 진탕시켰다. 밤샘 배양물을 파지 구출, 선택된 클론의 폴리클로날 증폭, 및 후속 라운드에 사용되는 파지 생산에 사용하였다. 액체 상 패닝의 제2 및 제3 라운드를 보다 엄격한 세척 조건을 제외하고는 제1 라운드의 프로토콜에 따라 수행하였다.
제4 분석용 패닝 라운드를 인간 CD32a-R에 결합하지 않는, 인간 CD32b 특이적 항체를 선택하기 위해 수행하였다. 이 라운드는 인간 CD32b에 대한 제3 라운드 패닝의 산출물에 기초하고 모든 3종의 상이한 단백질에 대해 수행되었다. 이 제4 분석용 라운드의 산출물은 전형적인 ELISA 스크리닝보다는 차세대 서열분석 (NGS) 분석을 거쳤다.
ELISA 스크리닝
ELISA 스크리닝을 사용하여, 인간 CD32b에 특이적으로 결합하고 인간 CD32a-R에는 그렇지 않은 단일 Fab 클론을 확인하였다. Fab 함유 조 이. 콜라이 용해물을 사용하여 Fab를 시험한다.
인간 CD32b 항원 결합 Fab 단편의 확인을 위해, 맥시소르프(Maxisorp)™ (눈크) 384 웰 플레이트를 10ug/ml 뉴트라비딘으로 코팅한 후, 비오티닐화 항원: 인간 CD32b 및 인간 CD32a-R을 첨가하였다. 플레이트를 슈퍼블록(Superblock)으로 차단한 후, Fab-함유 이. 콜라이 용해물을 첨가하였다. Fab의 결합을 AP-접합된 염소 항-인간 Fab 특이적 항체 (Fab 포맷) (잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research))에 의해 검출하였다. 아토포스(AttoPhos) 기질을 첨가하고 535 nm에서의 형광 방출을 430 nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
차세대 서열분석 (NGS) 분석
제4 분석용 패닝 라운드의 DNA를 추출하고 HCDR3 영역을 2회 연속 PCR 반응으로 증폭시켰다. PCR 반응을 또한 사용하여 일루미나(Illumina) 어댑터 서열을 PCR 단편의 3' 및 5' 말단에 부가하였다. 추가적으로, 서열분석 반응을 위한 샘플을 다중화하기 위해 일루미나 인덱스를 하나의 어댑터 영역에 첨가하였다.
FastQ 포맷의 미가공 데이터를 사용하여 아미노산 서열을 추출하고, 서열을 정렬하고 개별 서열의 출현을 계수하였다. 상이한 패닝 전략으로부터 유래한 개별 클론의 출현을 비교하여, 목적하는 결합 프로파일 (인간 CD32b 상에서 풍부화되고 인간 CD32a-R 상에서 고갈됨)을 갖는 클론이 확인될 수 있다.
관심 있는 클론을 어셈블리 PCR에 의해 폴리클로날 산출물 풀로부터 단리시켰다. 경쇄 및 중쇄에 플랭킹하는 프라이머뿐만 아니라 HCDR3 특이적 프라이머를 사용하여 목적하는 클론을 회수하였다.
IgG로의 전환 및 IgG 발현
CAP-T 세포에서 전장 IgG를 발현시키기 위해, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 도메인 단편을 디스플레이 벡터 (pMORPHx30)로부터 인간 IgG1에 대해 적절한 pMorph®_hIg 벡터 내로 서브클로닝하였다. 세포 배양물 상청액을 형질감염후 7일에 수거하였다. 멸균 여과 후, 용액을 액체 취급 스테이션을 사용하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 적용하였다. 샘플을 50 nM 시트레이트, 140 nM NaOH 중에서 용리시키고 pH를 1M 트리스 완충제로 중화시키고 멸균 여과하였다 (0.2 μm 세공 크기). 단백질 농도를 280 nm에서의 UV-분광광도측정법에 의해 결정하고 IgG의 순도를 변성, 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 분석하였다.
패닝 전략 및 스크리닝의 개요
전형적인 파지 디스플레이 패닝에 이은 ELISA 스크리닝에 더하여, 제4 분석용 패닝 라운드를 후속 NGS 분석과 함께 사용하는 신규 접근법을 수행하였다. 전형적인 접근법을 사용하여, 2종의 항체를 확인하였다: NOV0281 및 NOV0308. 신규 NGS 분석 접근법을 사용하여, 3종의 추가의 항체를 확인하였다: NOV0563, NOV0627 및 NOV0628 (하기 논의됨).
실시예 2: NOV0627 및 NOV0628의 조작
NOV0628의 프레임워크 영역을 가장 가까운 인간 배선 (VH3-23 및 V람다-3j)에 배선화시켰다. 또한 CDR-H2 내의 잠재적 아스파르테이트 이성질화 부위 (SYDGSE)를 DG로부터 DA로 변화시켜 항체 NOV1218을 수득하고 DG로부터 EG로 변화시켜 항체 NOV1219를 수득하였다.
NOV0627의 프레임워크 영역을 가장 가까운 인간 배선 (VH1-69 및 V람다-3j)에 배선화시켜 항체 NOV1216을 수득하였다. IgG 내의 포유동물 발현된 NOV1216의 모세관 구역 전기영동 (CZE) 분석은 항체가 3종의 우세한 종, 비변형됨, +80 달톤, 및 +160 달톤으로서 존재한다는 것을 밝혀냈다 (도 1, 표 2). CZE 분석을 비코팅된 융합된-실리카 모세관을 갖는 베크만 쿨터(Beckman Coulter) PA800 증진된 기기 상에서 수행하였다. 총 모세관 길이는 50 μm의 내부 직경을 갖는 40 cm이고 유입구로부터 검출기까지의 모세관 길이는 30 cm이다. 전기영동 러닝 완충제는 2 mM 트리에틸렌테트라민 및 0.03% 폴리소르베이트 20을 포함하는 400 mM 6-아미노카프로산/아세트산 (pH 5.7)으로 이루어진다. 1 mg/mL의 샘플을 오토샘플러에서 15℃에서 유지하고 0.5 psi에서 12초 동안 주입하였다. 분리를 25℃에서 30분 동안 20 kV의 분리 전압에서 수행하였다. 검출은 214 nm에서의 UV 흡광도에 의하였다. 주입 사이에, 모세관을 전기영동 러닝 완충제로 20 psi에서 3분 동안 플러싱하였다.
표 2: NOV1216의 CZE 분석의 개요.
Figure pct00069
IgG 포맷의 포유동물 발현된 NOV1216의 질량 분광측정법 분석은 CDR-H3 내의 4개의 티로신 (EQDPEYGYGGYPYEAMDV, 서열식별번호: 159) 중 1개가 황산화를 통한 번역후 변형에 감수성이라는 것을 밝혀냈다. 이는 +80 및 +160 달톤 종의 공급원인 것으로 가정되었다. CDR-H3 내의 특정한 잔기를 돌연변이시킴으로써 PTM을 제거하기 위한 노력을 개시하였다. 티로신 황산화를 위한 공통 인식 서열은 없지만, 산성 또는 소형 아미노산에 의해 플랭킹된 티로신은 보다 황산화하려는 경향이 있다는 보고가 존재한다 (Nedumpully-Govindan et al., 2014, Bioinformatics 30:2302-2309). 표 3은 생성된 CDR-H3 돌연변이체의 개관을 제공한다. 간략하게, 산성 및 소형 아미노산에 의해 플랭킹된 첫 번째 티로신은 페닐알라닌 (NOV2106), 알라닌 (NOV2107) 및 세린 (NOV2108)에 의해 교환되었고, 두 번째 내지 네 번째 티로신은 페닐알라닌 (NOV2109, 2110, 2111)에 의해 교환되었다. 또한, 첫 번째 티로신 앞의 2개의 산성 아미노산은 세린 (NOV2112 및 2113)으로 교환되었다.
표 3: NOV1216 HCDR3 돌연변이체의 개관
Figure pct00070
표 3에 약술된 CDR-H3 돌연변이체의 모세관 구역 전기영동은 도 2 및 표 4에 요약되어 있다. 첫 번째 티로신의 페닐알라닌 (NOV2106), 알라닌 (NOV2107) 또는 세린 (NOV2108)으로의 치환은 황산화 사건을 성공적으로 방지하고 +80 및 +160 달톤 변형이 결여된 IgG1 항체를 생성하였다. 나머지 CDR-H3 돌연변이체는 NOV1216과 일치하는 방식으로 +80 및 +160 달톤 종을 보유하였고, 이는 단지 CDR-H3 내의 첫 번째 티로신만이 변형된다는 가설을 지지한다. 마찬가지로, 첫 번째 티로신 앞의 두 번째 산성 아미노산의 돌연변이 (NOV1213)는 +80 및 +160 종을 해결하지 못하였다. 첫 번째 티로신 앞의 첫 번째 산성 아미노산의 돌연변이 (NOV1212)는 티로신 황산화를 방지하지 않았지만, 이는 +160 Da만큼 변형된 분획을 감소시켰다 (도 2, 표 4).
표 4: huCD32b-결합 항체의 모세관 구역 전기영동 분석의 개요.
Figure pct00071
실시예 3: 비-푸코실화 IgG 항체의 생산
비-푸코실화 IgG 항체를 글리맥스(GlymaxX) 기술 (프로바이오젠 아게(Probiogen AG), 베를린)을 적용함으로써 생산하였다. 요약하면, HEK293T 세포를 항체의 경쇄 및 중쇄 둘 다를 코딩하는 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 동시에 효소 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로스 리덕타제 ("RMD", "편향 효소", 프로바이오젠 아게, 베를린에 의해 제공됨)를 코딩하는 발현 플라스미드를 세포 내로 공동-형질감염시켰다. 성공적으로 형질감염된 세포에서의 효소의 활성은 푸코스 신생 합성 경로의 억제로 이어진다. 효소 및 IgG 유전자 둘 다를 발현하는 세포는 비-푸코실화 IgG 단백질을 생산한다. 폴리에틸렌이민을 형질감염 시약으로서 사용하였다. 세포 배양물 상청액을 원심분리에 의해 수거하고 IgG 단백질을 단백질 A 및 폴리싱을 위한 정제용 크기 배제 (맙셀렉트 슈어(MabSelect SURE), 지이 헬스케어(GE Healthcare) 및 하이로드(HiLoad) 26/600 슈퍼덱스(Superdex) 200 pg)를 사용하는 표준 크로마토그래피 방법에 의해 정제하였다. IgG의 순도를 변성, 환원 및 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 및 HP-SEC에 의해 천연 상태로 분석하였다. 코어 푸코스가 없는 N-글리칸 구조를 보유하는 중쇄의 백분율을 질량 분광측정법에 의해 결정하였다.
비-푸코실화 IgG 항체를 또한 CHO 세포에 의해 생산하였다. CHO 세포를 아미노산, 비타민 및 미량 원소가 풍부한 화학적으로 규정된 배지 (10nM MTX를 포함하는 배양 배지)를 함유하는 진탕기에서 배양하였다. 배치 배양을 37℃의 온도에서 수행하고 진탕시켰다. 배치 배양 공정의 14일 후, 배치 배양물의 샘플을 수집하여 바이-셀(Vi-Cell) 세포 생존율 분석기 (베크만 쿨터)를 사용하여 생존 세포 밀도 및 생존율을 결정하고 세포 배양 배지 중 단백질 역가를 결정하였다. 배치의 종료 시 (제14일), 배양 공정을 정지시켰다. 진탕-플라스크로부터의 조건화 배지 (30ml 배양물)를 수거하고 0.22 μm 스테리플립(Steriflip) 필터를 사용하여 여과하였다.
IgG 단백질을 단백질 A 및 폴리싱을 위한 정제용 크기 배제 (맙셀렉트 슈어, 지이 헬스케어 및 하이로드 26/600 슈퍼덱스 200 pg)를 사용하는 표준 크로마토그래피 방법에 의해 정제하였다. IgG의 순도를 변성, 환원 및 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 및 HP-SEC에 의해 천연 상태로 분석하였다. 코어 푸코스가 없는 N-글리칸 구조를 보유하는 중쇄의 백분율을 질량 분광측정법에 의해 결정하였다.
실시예 4. huCD32a 또는 huCD32b 변이체를 발현하는 CHO 세포에 대한 huCD32b-결합 항체의 결합
HuCD32b 및 huCD32a는 고도의 서열 상동성을 갖는다. huCD32b-결합 항체의 특이성을 평가하기 위해, 그의 결합을 유동 세포측정법에 의해 WT huCD32a 변이체 (즉 huCD32aH131 또는 huCD32aR131) 또는 WT 인간 CD32b1을 발현하는 안정한 CHO 세포주를 사용하여 평가하였다. CHO 세포를 2 mM EDTA를 함유하는 PBS로 탈착시킨 후 수집하고 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 PBS 중에서 1회 세척하고 FACS 완충제 (2%BSA, 2 mM EDTA 및 0.1% NaN3을 함유하는 PBS1x) 중에 현탁시키고, 계수하고 ml당 0.25x106개의 세포로 현탁시켰다. 이어서, 50'000개 세포/웰 (200 μl)을 V-바닥 96 웰 플레이트에 분배하였다. 플레이트를 1600 rpm에서 5분 동안 회전시키고 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 지시된 농도의 huCD32b-결합 항체 (모두 인간 IgG1 [N297A] 스캐폴드 상)를 함유하는 50 μl의 FACS 완충제 중에 현탁시키고 4℃에서 30분 인큐베이션하였다. FACS 완충제로 3회 연속 세척한 후, 세포를 F(ab')2 항-인간 F(ab')2-PE (잭슨 이뮤노리서치#109-116-097)의 1/100 희석물을 함유하는 50 μl FACS 완충제 중에 현탁시키고 4℃에서 추가로 30분 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 200 μl FACS 완충제 중에 현탁시키고 FACS 칸토(Canto) II 상에서 획득하였다 (살아있는 세포 게이트에서의 5000개의 세포의 획득). 기하 평균 형광 (PE 채널에서의 GMFI)을 각각의 항체의 결합 강도의 척도로서 사용하였다. 도 3은 huCD32b와 huCD32a 변이체 사이의 상이한 정도의 구별을 나타내는 huCD32b-결합 항체의 예를 나타낸다. 모든 huCD32b-결합 항체는 huCD32a 변이체보다 huCD32b에 대해 더 강건한 결합을 갖는다.
실시예 5. HuCD16 변이체 및 HuCD64를 발현하는 CHO 세포에 대한 HuCD32b-결합 항체의 결합
huCD32b 특이적 항체의 결합을 유동 세포측정법에 의해 저친화도 인간 CD16 변이체 (즉 huCD16a 또는 huCD16b 변이체) 및 고친화도 huCD64 (FcγRI)를 발현하는 안정한 CHO 세포주를 사용하여 평가하였다. huCD16a 변이체로 형질감염된 CHO 세포를 또한 표면 발현을 허용하기 위해 공통 Fcγ 쇄로 형질감염시켰다. CHO 세포를 2 mM EDTA를 함유하는 PBS로 탈착시킨 후 수집하고 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 PBS 중에서 1회 세척하고 FACS 완충제 (2%BSA, 2 mM EDTA 및 0.1% NaN3을 함유하는 PBS1x) 중에 현탁시키고, 계수하고 ml당 0.25x106개의 세포로 현탁시켰다. 이어서, 50'000개 세포/웰 (200μl)을 V-바닥 96 웰 플레이트에 분배하였다. 플레이트를 1600 rpm에서 5분 동안 회전시키고 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 지시된 농도의 huCD32b-결합 항체 (모두 인간 IgG1 [N297A] 스캐폴드 상)를 함유하는 50 μl의 FACS 완충제 중에 현탁시키고 4℃에서 30분 인큐베이션하였다. FACS 완충제로 3회 연속 세척한 후, 세포를 F(ab')2 항-인간 F(ab')2-PE (잭슨 이뮤노리서치#109-116-097)의 1/100 희석물을 함유하는 50 μl FACS 완충제 중에 현탁시키고 4℃에서 추가로 30분 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 200 μl FACS 완충제 중에 현탁시키고 FACS 칸토 II 상에서 획득하였다 (살아있는 세포 게이트에서의 5000개의 세포의 획득). 기하 평균 형광 (PE 채널에서의 GMFI)을 각각의 항체의 결합 강도의 척도로서 사용하였다. 시험된 모든 huCD32b-결합 항체는 huCD16 변이체를 발현하는 CHO 세포에 대한 반응성을 나타내지 않았고 고친화도 huCD64 수용체에 대한 부분 용량 의존성 결합을 나타냈다 (도 4). huCD64 수용체에 대한 용량-의존성 결합은 이것이 Ab의 에피토프 특이성과 무관하게 발생하고 CHO-huCD64 세포의 인간 IgG1과의 사전-인큐베이션에 의해 차단되었기 때문에 (데이터는 제시되지 않음) huCD64의 고친화도 Fc 결합 도메인에 대한 시험된 항체의 Fc 부분의 결합을 통해 발생했을 가능성이 있다.
실시예 6: 인간 1차 B 세포에 대한 인간 CD32b-결합 항체의 결합
CD32b는 B 세포 상에서 발현되는 유일한 Fc 수용체이다. 1차 인간 B 세포에 대한 huCD32b 특이적 항체의 결합을 음성적 선택에 의해 백혈구 연층으로부터 단리된 정제된 B 세포 상에서 유동 세포측정법에 의해 공급업체의 지침에 따라 인간 B 세포 풍부화 키트 (스템셀 테크놀로지스(STEMCELL Technologies) #19054)를 사용하여 평가하였다. 정제된 B 세포를 FACS 완충제 (2%BSA, 2 mM EDTA를 함유하는 PBS1x) 중에 현탁시키고, 계수하고 ml당 0.5x106개의 세포로 현탁시켰다. 이어서, 100'000개 세포/웰 (200 μl)을 V-바닥 96 웰 플레이트에 분배하였다. 플레이트를 1500 rpm에서 5분 동안 회전시키고 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 지시된 농도의 비오티닐화 huCD32b-결합 항체 (모두 인간 IgG1 [N297A] 스캐폴드 상)를 함유하는 50 μl의 FACS 완충제 중에 현탁시키고 4℃에서 20분 인큐베이션하였다. 항체의 비오티닐화를 공급업체의 지침에 따라 이노바 바이오사이언시스(Innova Biosciences)로부터의 라이트닝-링크(Lightning-Link) 비오틴 접합 키트 (유형 A) (카탈로그 번호 704-0010)를 사용하여 수행하였다. FACS 완충제로 2회 연속 세척한 후, 세포를 스트렙타비딘-PE (인비트로젠 S21388)의 1/500 희석물 및 1μl의 APC-접합된 항-huCD20 Ab (바이오레전드(Biolegend) 302310으로부터의 클론 2H7)를 함유하는 50 μl FACS 완충제 중에 현탁시키고 4℃에서 추가로 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 200 μl FACS 완충제 중에 현탁시키고 FACS 포르테사(Fortessa) 상에서 획득하였다. CD20+ B 세포 게이트에서의 기하 평균 형광 (PE 채널에서의 GMFI)을 각각의 항체의 결합 강도의 척도로서 사용하였다. 모든 huCD32b-결합 항체는 인간 B 세포에 대한 강건한 결합을 입증하였고, NOV1216, NOV0281, 및 NOV0308은 가장 큰 결합 친화도 (각각 1.4, 5.4, 및 8.7 nM; 도 5)를 갖는다.
실시예 7: 인간 BJAB 세포에 대한 huCD32b-결합 항체의 결합
BJAB 세포주에 대한 huCD32b 특이적 항체의 결합을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. BJAB 세포를 수집하고 FACS 완충제 (2%BSA, 2 mM EDTA를 함유하는 PBS1x) 중에 현탁시키고, 계수하고 ml당 0.25x106개의 세포로 현탁시켰다. 이어서, 50'000개 세포/웰 (200μl)을 V-바닥 96 웰 플레이트에 분배하였다. 플레이트를 1500 rpm에서 5분 동안 회전시키고 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 지시된 농도의 비오티닐화 huCD32b-결합 항체 (모두 인간 IgG1 [N297A] 스캐폴드 상)를 함유하는 50 μl의 FACS 완충제 중에 현탁시키고 4℃에서 20분 인큐베이션하였다. 항체의 비오티닐화를 공급업체의 지침에 따라 이노바 바이오사이언시스로부터의 라이트닝-링크 비오틴 접합 키트 (유형 A) (카탈로그 번호 704-0010)를 사용하여 수행하였다. FACS 완충제로 2회 연속 세척한 후, 세포를 스트렙타비딘-PE (인비트로젠 S21388)의 1/500 희석물을 함유하는 50 μl FACS 완충제 중에 현탁시키고 4℃에서 추가로 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 200 μl FACS 완충제 중에 현탁시키고 FACS 포르테사 상에서 획득하였다. 기하 평균 형광 (PE 채널에서의 GMFI)을 각각의 항체의 결합 강도의 척도로서 사용하였다. 모든 huCD32b-결합 항체는 모 BJAB 세포에 대한 강건한 결합을 입증하였고, NOV1216, NOV0281, NOV0308, 및 NOV0563은 가장 큰 결합 친화도를 갖는다 (도 6).
실시예 8: 항-인간 CD32b-결합 항체에 의한 에피토프 인식.
a) FACS 결합에 의한 에피토프 분석
항-CD32b 항체의 결합 에피토프를 특징화하는 데 사용된 WT 및 돌연변이체 huCD32b 형질감염된 CHO 세포의 개요
WT 인간 CD32b 또는 하기 논의된 아미노산 돌연변이를 포괄하는 CD32b를 발현하는 안정한 CHO 세포주를 Flp-In™ 기술을 사용하여 생성하였다. 안정한 세포 형질감염체를 히그로마이신 B를 사용하여 선택하였다. 인간 CD32b의 3D 모델 구조에서 흑색으로 강조된 잔기는 huCD32b와 huCD32a 사이에서 상이한 아미노산을 강조한다 (도 7a). EDI103, EDI104, EDI105, EDI106 및 EDI107 CHO 세포는 지시된 아미노산을 인간 CD32a의 상응하는 아미노산으로 복귀시키는 특정한 아미노산 돌연변이를 갖는 huCD32b를 발현한다. 각각의 세포주에서의 변형된 아미노산은 상응하는 3D 구조 상에서 빈 원에 의해 강조되고 (Sondermann et al., The EMBO Journal (1999) 18, 1095-1103) 각각의 세포주에 대해 명시되어 있다. 이들 상이한 huCD32b 변이체에 대한 huCD32b-결합 항체의 결합의 평가는 항체에 의해 인식되는 주요 에피토프 영역의 확인을 가능하게 한다. huCD32b 구조의 좌측 부분은 에피토프 I로 정의되었고 huCD32b의 Fc 결합 도메인에 상응한다. 우측은 에피토프 II로 정의되었고 Fc 결합에 수반되지 않는다. EDI103, EDI104 및 EDI105 돌연변이체에서, 에피토프 II는 이를 huCD32a와 동일하게 함으로써 파괴되었다 (도 7a). EDI106 및 EDI107 돌연변이체에서, huCD32b의 에피토프 I는 이를 huCD32a와 동일하게 함으로써 파괴되었다 (도 7b).
항-huCD32b-결합 항체에 의해 인식되는 결합 에피토프를 특징화하도록 설계된 FACS 결합 실험
huCD32b 특이적 항체의 결합 에피토프를 유동 세포측정법에 의해 WT 인간 CD32b 또는 특정한 huCD32b 잔기를 CD32a의 상응하는 아미노산으로 복귀시킴으로써 Fc 결합 도메인 (에피토프 I) 또는 CD32b 분자의 반대쪽 말단 (에피토프 II) 내의 huCD32b와 huCD32a 사이에서 상이한 아미노산이 제거된 돌연변이체 CD32b 변이체를 발현하는 안정한 CHO 세포주를 사용하여 평가하였다. EDI103, EDI104 및 EDI105 CHO 변이체는 huCD32a와 동일한 에피토프 2 아미노산을 갖는 huCD32b 돌연변이체를 발현하는 한편, EDI106 및 EDI107은 인간 CD32a와 동일한 에피토프 I 아미노산을 갖는 huCD32b를 발현한다 (도 7a). CHO 세포를 2 mM EDTA를 함유하는 PBS로 탈착시킨 후 수집하고 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 PBS 중에서 1회 세척하고 FACS 완충제 (2% BSA, 2 mM EDTA 및 0.1% NaN3을 함유하는 PBS1x) 중에 현탁시키고, 계수하고 ml당 0.25x106개의 세포로 현탁시켰다. 이어서, 50'000개 세포/웰 (200μl)을 V-바닥 96 웰 플레이트에 분배하였다. 플레이트를 1600 rpm에서 5분 동안 회전시키고 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 지시된 농도의 huCD32b-결합 항체 (모두 인간 IgG1 [N297A] 스캐폴드 상)를 함유하는 50 μl의 FACS 완충제 중에 현탁시키고 4℃에서 30분 인큐베이션하였다. FACS 완충제로 3회 연속 세척한 후, 세포를 F(ab')2 항-인간 F(ab')2-PE (잭슨 이뮤노리서치#109-116-097)의 1/100 희석물을 함유하는 50 μl FACS 완충제 중에 현탁시키고 4℃에서 추가로 30분 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 200 μl FACS 완충제 중에 현탁시키고 FACS 칸토 II 상에서 획득하였다 (살아있는 세포 게이트에서의 5000개의 세포의 획득). 기하 평균 형광 (PE 채널에서의 GMFI)을 각각의 항체의 결합 강도의 척도로서 사용하였다. 도 8은 특정한 huCD32b-돌연변이체를 발현하는 CHO 세포에 대한 감소된 결합에 기초하여 상이한 결합 에피토프를 디스플레이하는 huCD32b-결합 항체의 예를 보여준다. NOV0281 및 NOV1216은 에피토프 I 결핍 EDI106 및 EDI107 huCD32b 돌연변이체에 대해 감소된 결합을 나타냈고, 이는 이들 항체가 주로 에피토프 I (즉 Fc 결합 도메인 영역)를 인식한다는 것을 나타낸다 (도 8a, 도 8b). 항체 NOV0563은 시험된 모든 huCD32b CHO 변이체에 대해 유사한 결합을 나타냈고, 이는 이러한 항체가 에피토프 I 및 에피토프 II에 의해 커버된 영역 사이의 또는 대안적으로 여기서 에피토프 III로 정의된, huCD32b와 huCD32a 사이의 또 다른 단일 아미노산 차이를 포괄하는 3D huCD32b 구조 뒤의 추가의 영역 내의 에피토프를 인식한다는 것을 시사한다 (도 8c). 도 8a, 도 8b, 및 도 8c의 결합 데이터의 개요가 표 5A에 제시되어 있다.
표 5A. 파괴된 에피토프 1 (Fc 결합 도메인) 또는 에피토프 II를 갖는 huCD32b를 발현하는 CHO 세포에 대한 huCD32b-결합 항체 결합의 개요.
Figure pct00072
NOV2108은 CD32b Fc 결합 도메인 (에피토프 I)을 인식한다.
huCD32b 특이적 항체 NOV2108 및 NOV1216의 결합 에피토프를 유동 세포측정법에 의해 WT 인간 CD32a, CD32b 또는 특정한 huCD32b 잔기를 CD32a의 상응하는 아미노산으로 복귀시킴으로써 Fc 결합 도메인 (에피토프 I) 또는 CD32b 분자의 반대쪽 말단 (에피토프 II) 내의 huCD32b와 huCD32a 사이에서 상이한 아미노산이 제거된 돌연변이체 CD32b 변이체를 발현하는 안정한 CHO 세포주를 사용하여 평가하였다. EDI103 및 EDI105 돌연변이체에서, 에피토프 II는 이를 huCD32a와 동일하게 함으로써 파괴되었다 (도 7a). EDI106 및 EDI107 돌연변이체에서, huCD32b의 에피토프 I는 이를 huCD32a와 동일하게 함으로써 파괴되었다 (도 7b). 부착 CHO 세포주를 DMEM (론자(Lonza) 카탈로그 번호:12-604F), 10% FBS (세라다임(Seradigm) 제품 번호 1500-500, 로트 # 112B15), 600μg/ml 히그로마이신 B (라이프 테크(Life Tech) 10687-010)에서 성장시켰다. 전면성장 세포를 PBS (론자 카탈로그 번호 17-516F)로 헹구고 배양물 중에서 0.25% 트립신 (깁코(Gibco) 25200-056)으로 처리함으로써 수거하였다. 탈착시킨 후 세포를 펠릿화하고, PBS 중에서 1회 세척하고, FACS 완충제 (2% FBS를 함유하는 PBS1x) 중에 재현탁시켰다. 각각의 세포주를 2x106개 세포/ml로 재현탁시킨 후, 96 웰 u-바닥 플레이트 (팔콘(Falcon) 351177)에 100 μl/웰로 분취하였다. 플레이트를 1200 rpm에서 5분 동안 회전 침강시키고 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 지시된 농도의 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647-표지된 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes) A20186) huCD32b-반응성 항체 (모두 인간 IgG1 [N297A] 스캐폴드 상)를 함유하는 100 μl의 FACS 완충제 중에 재현탁시키고 4℃에서 30분 인큐베이션하였다. 도 31의 경우, 100ug/ml에서 시작하는 4 포인트, 1:10 연속 희석물을 알렉사플루오르 647-표지된 NOV1216 및 알렉사플루오르 647-표지된 NOV2108에 대해 제조하였다. 각각의 CHO 세포주를 개별적으로 도면에 나타내어진 바와 같은 1종의 항체와 함께 인큐베이션하였다. FACS 완충제로 3회 연속 세척한 후, 세포를 100 μl FACS 완충제 중에 현탁시켰다. 최종 세척 후, 세포를 100 μl FACS 완충제 중에 재현탁시키고 FACS 칸토 II 상에서 획득하였다 (살아있는 세포 게이트에서의 5000개의 세포의 획득). 기하 평균 형광 강도 (AF647 채널에서의 GMFI)를 각각의 항체의 결합 강도의 척도로서 사용하였다.
NOV2108 및 NOV1216은 에피토프 I 결핍 EDI106 및 EDI107 huCD32b 돌연변이체에 대해 감소된 결합을 나타냈고 (도 31), 이는 이들 항체가 에피토프 I (즉 Fc 결합 도메인)를 인식한다는 것을 나타낸다. 항체 둘 다는 WT CD32b 및 에피토프 II 결핍 EDI103 및 105 huCD32b 돌연변이체에 대해 유사한 결합을 나타냈고, 이는 에피토프 II가 2종의 항체의 결합에 요구되지 않는다는 것을 나타낸다. 결합 데이터의 개요가 표 5B에 요약되어 있다.
표 5B. 파괴된 에피토프 1 (Fc 결합 도메인) 또는 에피토프 II를 갖는 huCD32b를 발현하는 CHO 세포에 대한 huCD32b 반응성 항체 결합의 개요.
Figure pct00073
b) 수소-중수소 교환에 의한 huCD32b 상의 NOV2108의 에피토프 맵핑
질량 분광측정법 (MS)과 조합된 수소-중수소 교환 (HDx) (Woods VL, Hamuro Y (2001) High Resolution, High-Throughput Amide Deuterium Exchange-Mass Spectrometry (DXMS) Determination of Protein Binding Site Structure and Dynamics: Utility in Pharmaceutical Design. J. Cell. Biochem. Supp.; 84(37): 89-98)을 사용하여 인간 CD32b (aa1-175) (서열식별번호: 682) 상의 Fab 항체 NOV2108의 추정 결합 부위를 맵핑하였다. HDx에서, 단백질의 교환가능한 아미드 수소는 중수소에 의해 대체된다. 이 공정은 단백질 구조/역학 및 용매 접근성에 감수성이고, 따라서, 리간드 결합 시 중수소 흡수의 감소를 겪는 위치를 보고할 수 있다. 중수소 흡수에서의 변화는 직접 결합 및 알로스테릭 사건 둘 다에 감수성이다.
HDx-MS 실험을 문헌 [(Chalmers MJ, Busby SA, Pascal BD, He Y, Hendrickson CL, Marshall AG, Griffin PR (2006), Probing protein Ligand Interactions by Automated Hydrogen/deuterium Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem.; 78(4): 1005-1014)]에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였다. 이들 실험에서, 인간 CD32b (aa1-175)의 중수소 흡수를 Fab 포맷의 항체 NOV2108의 부재 및 존재 하에 측정하였다. 항체의 결합 시 중수소 흡수의 감소를 나타내는 인간 CD32b (aa1-175) 내의 영역은 에피토프에 수반될 가능성이 있지만; 측정의 성질로 인해 직접적인 결합 부위로부터 먼 변화 (알로스테릭 효과)를 검출하는 것이 또한 가능하다. 통상적으로, 가장 많은 보호량을 갖는 영역이 직접적인 결합에 수반되지만 이는 항상 그렇지는 않을 수 있다. 알로스테릭 효과로부터 직접적인 결합 사건을 서술하기 위해, 직교 측정 (예를 들어 X선 결정학, 알라닌 돌연변이유발 등)이 요구된다.
인간 CD32b (aa1-175) 에피토프 맵핑 실험을 LEAP 오토샘플러, 나노액퀴티(nanoACQUITY) UPLC 시스템, 및 시냅트(Synapt) G2 질량 분광계를 포함하는 워터스(Waters) HDx-MS 플랫폼 상에서 수행하였다. 인간 CD32b (aa1-175)의 단백질 백본을 중수소로 표지하는 데 사용된 중수소 완충제는 125 mM PBS, 150 mM NaCl, pH 7.2였고; 용액 중 중수소의 전체 백분율은 95%였다. 항체의 부재 하의 인간 CD32b (aa1-175) 중수소 표지 실험의 경우, 175 pmol의 인간 CD32b (aa1-175), 9 μl의 부피를 100 μl의 중수소 완충제를 사용하여 4℃에서 25분 동안 희석하였다. 이어서, 표지 반응물을 100 μl의 냉각 켄칭 완충제로 2℃에서 5분 동안 켄칭하고, 이어서 자동화 펩신 소화 및 펩티드 분석을 위해 LC-MS 시스템 상으로 주입하였다. NOV2108의 존재 하의 인간 CD32b (aa1-175) 중수소 표지 실험의 경우, 175 pmol의 인간 CD32b (aa1-175)를 Fab 포맷의 210 pmol NOV2108 항체, 9 μl의 총 부피와 혼합하였다. 이어서, 용액을 100 μl의 중수소 완충제를 사용하여 4℃에서 25분 동안 희석하였다. 이어서, 표지 반응물을 100 μl의 냉각 켄칭 완충제로 2℃에서 5분 동안 켄칭하고, 이어서 자동화 펩신 소화 및 펩티드 분석을 위해 LC-MS 시스템 상으로 주입하였다.
모든 실험은 최소 3회의 분석 삼중물을 사용하여 수행된다. 모든 중수소 교환 실험을 0.5M TCEP 및 3M 우레아 (pH = 2.5)를 사용하여 켄칭하였다. 켄칭한 후, 항원을 UPLC 시스템 내로 주입하고, 여기서 이를 12℃에서 온-라인 펩신 소화시키고, 이어서 워터스 CSH C18 1 x 100 mm 칼럼 (1℃에서 유지됨) 상에서 40 uL/분의 유량으로 신속한 8분 2 - 35% 아세토니트릴 구배에 적용하였다.
인간 CD32b (aa1-175)의 경우 서열의 94%를 도 32에 나타내어진 바와 같이 중수소 교환 실험에 의해 모니터링하였다. 이 도면에서 각각의 막대는 모든 중수소 교환 실험에서 모니터링된 펩티드를 나타낸다.
항체 NOV2108 Fab 결합 및 미결합 상태 사이의 차별적 실험을 위해, 2가지 상태 사이의 중수소 흡수에서의 차이를 조사하는 것이 유익하다. 도 33에서 음의 값은 인간 CD32b-항체 복합체가 인간 CD32b에 비해 더 적은 중수소 흡수를 겪는다는 것을 나타낸다. 중수소 흡수의 감소는 교환가능한 중수소로부터의 영역의 보호 또는 수소 결합 네트워크의 안정화로 인한 것일 수 있다. 대조적으로, 양의 값은 복합체가 인간 CD32b에 비해 더 많은 중수소 흡수를 겪는다는 것을 나타낸다. 중수소 흡수의 증가는 수소 결합 네트워크의 탈안정화 (즉 단백질의 국부 언폴딩)로 인한 것일 수 있다. 이들 실험에서 본 발명자들은 CD32b에 대한 NOV2108 Fab의 결합으로 인한 어떠한 유의한 탈안정화도 관찰하지 않았다.
2가지 상이한 상태, 예컨대 미결합 인간 CD32b와 항체 NOV2108과 복합체화된 인간 CD32b 사이의 중수소 교환에서의 차별적 변화를 검사하는 경우에, 방법을 이용하여 변화가 유의한지 여부를 결정한다. 한 방법에서 (Houde et al., J Pharm Sci 100(6):2071-2086 (2011)), 차이가 0.5 Da 초과인 한 (도 33에 파선에 의해 나타내어짐), 차이는 유의한 것으로 간주된다. 이전에 언급된 방법을 사용함으로써, Ab NOV2108 Fab의 결합 시, 단일 영역, aa107-123 (VLRCHSWKDKPLVKVTF (서열식별번호: 685))은 유의하게 보호되어 진다. 이전에 공개된 데이터는 여러 잔기가 Fc 결합에 중요하다는 것을 시사한다: aa112-119(SWKDKPLV (서열식별번호: 686)) 및 aa133-138(SRSDPNF (서열식별번호: 687)) (Hulett MD, Witort E, Brinkworth RI, McKenzie IF, and Hogarth PM. (1995), Multiple Regions of Human FcgRII (CD32) Contribute to the Binding of IgG. The J. Bio Chem.; 36 (270): 21188-21194). 영역 aa112-119(SWKDKPLV (서열식별번호: 686))는 본 발명자들의 HDx-MS 실험에서 NOV2108 결합에 의해 보호된다. 133-138(SRSDPNF (서열식별번호: 687))에 상응하는 영역은 본 발명자들의 HDx-MS 실험에서 모니터링될 수 없다; 이 영역은 C'/E 루프에 상응한다. 도 34에서, Ab NOV2108에 의해 보호되는 영역 (흑색)이 공개된 인간 CD32b 결정 구조 상에 맵핑된다 (Sondermann P., Huber R. and Jacob U. (1999), Crystal structure of the soluble form of the human fcgamma-receptor IIb: a new member of the immunoglobulin superfamily at 1.7 Å resolution. The EMBO J.; 5(18):1095-1103). 이 영역은 B/C 루프 구조뿐만 아니라 B+C β-시트를 포함한다. 이들 데이터는 NOV2108이 CD32b Fc 결합 도메인에 결합한다는 것을 나타내는 기능적 검정으로부터의 관찰을 지지한다.
실시예 9: 다양한 인간 CD32b 발현을 특징으로 하는 세포에 대한 인간 CD32b-결합 항체 결합의 결정.
다양한 수준의 CD32b 발현을 특징으로 하는 세포에 대한 항-CD32b 항체 결합을 결정하기 위해, FACS 분석을 huCD32b를 내재적으로 발현하는 KARPAS422 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 06101702) 인간 암 세포주; BJAB (DSMZ; ACC 757)에 대해 수행하였다. CD32b 및 CD23a를 발현하는 안정한 CHO 세포주뿐만 아니라, CD32b 및 CD32a 둘 다가 결여된 라모스(RAMOS) 세포를 또한 평가하였다. 부착 CHO 세포주의 경우, 배양물 중에서 0.25% 트립신 (깁코 25200-056)으로 세포를 처리함으로써 세포를 현탁시켰다. 세포가 리프팅되면, 이들을 세척하고 MACs 완충제 (BSA 스톡 (밀테니 바이오텍(Miltenyi biotec) 130-091-376)을 포함하는 밀테니 바이오텍 130-091-222)로 재현탁시켰다. 세포주 (Karpas422, BJAB, 라모스) 현탁을 위해, 11x106개의 세포를 회전 침강시키고, 세척하고 MACs 완충제로 재현탁시켰다. 모든 세포주를 4x106개 세포/ml로 재현탁시킨 후, 96 웰 둥근 바닥 플레이트 (코스타(Costar) 29442-066)에 50 μl/웰로 분취하였다. 알렉사-647 표지된 (몰레큘라 프로브스 A20186) N297A 항체의 7포인트, 1:3 연속 희석물을 25 μl로 제조하여 각각의 웰에 첨가하였다. 비-표적화 IgG1 [N297A 스캐폴드] 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 얼음 상에서 30분 동안 항체 (모두 인간 IgG1 [N297A] 스캐폴드 상)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척한 다음, 7AAD (이바이오사이언스(eBioscience) 00-6993-50)를 포함하는 100 μl MACs 완충제 중에 10 μl/ml로 재현탁시키고, BD FACs 칸토 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)) 상에서 분석하였다. 모든 CD32b 양성 세포주의 경우, CD32b-결합 항체의 결합은 용량 의존성이었다 (도 9). 항체는 CD32b 음성 라모스 또는 CHO_CD32a 세포주에 대한 제한된 결합을 입증하였다. 예상된 바와 같이, 비-표적화 이소형 대조군 항체는 세포에 결합하지 않았다.
실시예 10: 다양한 인간 CD32b 발현, CD32a 발현을 특징으로 하거나, 또는 어떠한 Fc감마 수용체도 특징으로 하지 않는 세포에 대한 CDR-H3 돌연변이체 인간 CD32b-결합 항체 결합의 결정
세포에 대한 CDR-H3 돌연변이체 항-CD32b 항체의 결합을 결정하기 위해, FACS 분석을 huCD32b를 내재적으로 발현하는 KARPAS422 (시그마 알드리치 06101702), DAUDI (ATCC; CCL-213), 및 모 BJAB (DSMZ; ACC 757) 인간 암 세포주뿐만 아니라 CD32b를 발현하는 안정한 BJAB 및 CHO 세포주에 대해 수행하였다. CD32a를 발현하는 안정한 CHO 세포주뿐만 아니라, CD32b 및 CD32a 둘 다가 결여된 모 CHO 세포를 또한 평가하였다.
KARPAS422, DAUDI 및 BJAB 세포주의 경우, 11x106개의 세포를 회전 침강시키고, 세척하고 MACs 완충제 (BSA 스톡 (밀테니 바이오텍 130-091-376)을 포함하는 밀테니 바이오텍 130-091-222)로 재현탁시켰다. 부착 CHO 세포주의 경우, 배양물 중에서 0.25% 트립신 (깁코 25200-056)으로 세포를 처리함으로써 세포를 현탁시켰다. 세포가 리프팅되면, 이들을 세척한 다음, MACs 완충제 (BSA 스톡 (밀테니 바이오텍 130-091-376)을 포함하는 밀테니 바이오텍 130-091-222)로 재현탁시켰다. 모든 세포주를 4x106개 세포/ml로 재현탁시킨 후, 96 웰 둥근 바닥 플레이트 (코스타 29442-066)에 50 μl/웰로 분취하였다. 알렉사-647 표지된 (몰레큘라 프로브스 A20186) 항체 (모두 인간 IgG1 [N297A] 스캐폴드 상)의 8 포인트, 1:3 연속 희석물을 25 μl로 제조하여 각각의 웰에 첨가하였다. 비-표적화 항체 (인간 IgG1 [N297A] 스캐폴드)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 얼음 상에서 30분 동안 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 세척하고, 7AAD (이바이오사이언스 00-6993-50)를 포함하는 MACs 완충제 중에 10 μl/ml로 재현탁시키고, 노보사이트(Novoctye) 3000 (ACEA 바이오사이언스(ACEA Biosciences) 2010011) 상에서 분석하였다. 샘플당 신호의 기하 평균을 위즐(Weasel) 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 모든 인간 CD32b 양성 세포주의 경우, HCD-R3 돌연변이체 NOV2107 및 NOV2108은 모 항체 NOV1216과 유사한 가장 강건한 결합을 나타냈다 (도 10). 시험된 모든 항체의 경우, 인간 CD32b를 발현하는 세포에 비해, 인간 CD32a 형질감염된 CHO 세포에 대해 단지 최소 결합만이 관찰되었고 CD32a/CD32b 널(null) CHO 모 세포에 대한 결합은 관찰되지 않거나 매우 최소 결합이 관찰되었다. 이들 데이터는 인간 CD32b에 대한 항체의 특이성을 입증한다.
실시예 11: Fc WT 항-CD32b 항체에 의해 매개되는 Jeko-1 및 KARPAS422 암 세포주에 대한 1차 NK 세포 구동된, 특이적 ADCC 활성의 평가
Fc 야생형 항-CD32b 항체 (인간 IgG1)를 1차 NK 세포 기반 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 검정에서 그의 활성에 대해 평가하였다. 간략하게, PBMC를 공여자의 혈액으로부터 피콜 구배를 통해 단리시켰다. 이어서, NK 세포를 밀테니 비드 (카탈로그# 130-092-657)를 사용하여 음성적으로 선택하였다. 이들 이펙터 세포를 10 ng/ml Il-2 (페프로테크(Peprotech) 카탈로그# 200-02)로 밤새 자극시켰다. 다음날, Jeko-1 및 Karpas422 세포를 칼세인 아세톡시-메틸 에스테르 (칼세인-AM; 몰레큘라 프로브스 카탈로그# C3100MP)로 염색하고, 2회 세척하고, 웰당 10,000개의 세포의 농도로 96-웰 U-바닥 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 이어서, 세포를 20분 동안 상기 언급된 항체의 연속 희석물과 함께 사전-인큐베이션한 후, 이펙터 세포를 3:1의 이펙터 대 표적 비로 첨가하였다. 공동-인큐베이션 후, 마이크로타이터 플레이트를 원심분리하고 상청액 유체의 분취물을 또 다른 마이크로타이터 플레이트 (코닝 코스타(Corning Costar), 카탈로그 # 3904)로 옮기고 용액 중 유리 칼세인의 농도를 형광 계수기 (엔비전(Envision), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))로 결정하였다.
표적 세포의 항체 특이적 용해를 계산하기 위해, 항체 또는 이펙터 세포가 없는 표적 세포의 병행 인큐베이션이 기준선 대조군 (자발적 방출)으로서 사용된 한편, 양성 대조군 또는 최대 방출은 단지 1% 트리톤-X 100 용액만을 사용한 표적 세포의 용해에 의해 결정되었다. 퍼센트 특이적 용해를 이 방정식을 사용하여 계산하였다: (샘플 - 자발적) / (최대 방출-자발적) *100%.
모든 Fc 야생형 항-CD32b 항체는 도 11a 및 도 11b에 도시된 바와 같이 평가된 암 세포주 둘 다의 농도 의존성 특이적 세포 용해를 입증하였다. Ab NOV1216은 프로파일링된 다른 항체에 비해 Jeko1에 대해 현저하게 증가된 활성을 입증하였다 (도 11a). KARPAS422 세포주에 대해, NOV1216, NOV0281, NOV0308 및 NOV0563은 거의 유사한 활성을 나타냈으며, NOV1216이 약간 더 활성이었다 (도 11b). 예상된 바와 같이, 비-표적화 IgG1 Fc 야생형 음성 대조군 항체는 이들 검정에서 활성이 아니었다.
실시예 12: 확립된, 파종성 Jeko1 이종이식편에서의 Fc wt 인간 CD32b-결합 항체의 생체내 항종양 활성.
5종의 Fc WT 인간 IgG1 CD32b-결합 항체의 항종양 활성을 확립된 외투 세포 림프종 Jeko1 파종성 이종이식편을 보유하는 SCID.베이지 마우스에서 평가하였다. 암컷 SCID.베이지 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 루시페라제 발현을 유도하는 구성적으로 활성인 프로모터로 안정하게 형질감염된 1x106개의 Jeko1 세포를 정맥내로 (i.v.) 주사하였다. 세포를 PBS 중에 현탁시키고 마우스에게 0.2 ml의 최종 부피의 세포 현탁액을 i.v. 접종하였다. 골수 공간 (예를 들어, 뒷쪽 대퇴골, 척추, 아래턱; 데이터는 제시되지 않음)으로 크게 제한되고 상대 광 단위 (RLU)로 표현된 전신 종양 부담을 마우스에게 10 ml/kg 루시페린 (15 mg/ml)을 복강내로 (i.p.) 주사함으로써 평가하고 루시페린 투여 후 10분에 시작하여 제노겐(Xenogen) IVIS-200 광학 생체내 영상화 시스템 (퍼킨 엘머)으로 영상화하였다. 배경 RLU를 루시페린이 투여되지 않은 마우스를 영상화함으로써 평가하였다.
마우스를 영상화하고 세포 접종후 제10일에 1.2x106 RLU의 평균 종양 부담에서 연구에 등록시켰다. 5개의 군 (n = 5 /군) 중 1개에 무작위로 할당한 후, 마우스에게 PBS, NOV0281, NOV1216, NOV0308, 또는 NOV0563의 단일 5 mg/kg i.v. 주사를 투여하였다. 마우스를 칭량하고 매주 2회 영상화하여 체중 및 전신 종양 부담의 변화를 평가하였다.
종양 부담을 세포 이식후 제22일 (처리 투여후 제10일)에 평가하고, 퍼센트 T/C (비-표적화 IgG1 처리된 마우스의 델타 RLU를 처리된 마우스의 델타 RLU로 나눔)로 표현하였다. 예상된 바와 같이, 종양 부담은 비-표적화 음성 대조군 항체의 투여 후 급속하게 증가하였다. 모든 CD32b-결합 항체는 단일 정맥내 주사 후 종양 성장을 제어하는 데 효과적이었고, NOV1216 및 NOV0563이 가장 활성이었다 (각각 3 및 2% T/C) (도 12).
실시예 13: 확립된 Daudi 이종이식편을 보유하는 마우스에서의 Fc WT NOV1216의 용량 반응 생체내 효능 연구
Fc WT NOV1216의 생체내 활성을 추가로 평가하기 위해, 용량 반응 효능 연구를 확립된 버킷 림프종 Daudi 이종이식편을 보유하는 마우스에서 수행하였다. 암컷 누드 마우스에게 PBS로 희석된 50% 페놀 레드-무함유 매트리겔 (비디 바이오사이언시스) 중에 현탁시킨 5x106개의 Daudi 세포 (100 μl 주사 부피)를 피하로 이식하였다. 마우스를 이식후 제18일에 140 mm3의 평균 종양 부피에서 연구에 등록시켰다. 5개의 실험군 (n = 6/군) 중 1개에 무작위로 할당한 후, 마우스에게 하기 중 하나의 정맥내 주사를 매주 투여하였다: PBS, Fc 침묵 NOV1216 N297A (20 mg/kg qw*12) 또는 Fc WT NOV1216 (5, 10, 또는 20 mg/kg qw*12). 종양 부담을 세포 이식후 제35일 및 처리 투여후 제18일에 평가하고, 퍼센트 T/C (PBS 처리된 마우스의 델타 종양 부피를 처리된 마우스의 델타 종양 부피로 나눔)로 표현하였다. 800 mm3에 도달한 종양으로 정의된 종점까지의 시간을 또한 평가하였다.
용량 의존성 항종양 활성 및 종점까지의 시간을 Fc WT NOV1216을 사용하여 관찰하였다. 최고 용량은 가장 강건한 항종양 활성 (이식후 제35일에서 4%T/C) 및 최장의 종점까지의 시간을 입증하였다 (도 13). Fc 침묵 NOV1216 N297A 항체는 종양 부피 및 종점까지의 시간에 대해 매우 제한된 효과를 가졌다. 이들 데이터는 NOV1216이 누드 마우스의 확립된 버킷 림프종 Daudi 이종이식편에 대해 강건하고 지속적인 Fc 의존성 항종양 활성을 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 14: 리포터 검정 또는 1차 NK 세포 구동된 세포 용해에서의 CD16a 활성화에 대한 Fc 변형의 평가
비-푸코실화 (상기 실시예 3에 기재된 바와 같은 코어 푸코스가 결여된 N-글리칸 구조를 갖는 항체를 생산함) 또는 Fc 조작 (eADCC Fc 돌연변이 S239D/A330L/I332E)에 의해 NOV1216 ADCC 기능을 증진시키는 능력을 시험관내에서 조사하였다. Fc 활성을 Jurkat-NFAT 리포터 검정 및 1차 NK 세포 ADCC 검정에서 평가하였다.
Jurkat-NFAT 리포터 시스템에서 인간 CD16a를 활성화시키는 Fc WT, 비-푸코실화, 및 Fc 변형된 (eADCC 또는 N297A) CD32b-결합 NOV1216의 능력
Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용하여 CD32b 양성 표적 세포에 결합하고 Jurkat-NFAT v158 리포터 세포 상의 CD16a를 후속적으로 활성화시키는 CD32b-결합 항체의 능력을 평가하였다. 가변량의 CD32b 발현을 갖는 표적 세포주 (DAUDI; ATCC CCL-213 및 Jeko-1; DSMZ ACC533)를 사용하였다. NOV1216 Fc WT 및 다중 Fc 조작 전략을 사용한 버전을 이 검정에서 프로파일링하였다. 이들은 NOV1216의 Fc 증진된 (비-푸코실화 및 eADCC Fc 돌연변이) 및 Fc 침묵 (N297A) 버전을 포함하였다. 세포주를 수집하고, PBS (깁코 14190-144) 중에서 세척하고, 0.5x106개 세포/ml로 검정 배지 (RPMI 글루타맥스(Glutamax) (61870-036) + 10% FBS (깁코 26140-079)) 중에 재현탁시키고, 30 μl/웰을 96 웰 백색 플레이트 (코스타 #3917)로 분취하였다. Jurkat NFAT v158 리포터 세포주를 수집하고, PBS 중에서 세척하고, 3x106개 세포/ml로 검정 배지 중에 재현탁시키고, 30 μl/웰로 분취하여 6:1의 최종 이펙터 대 표적 비를 생성하였다. 각각의 항체 (Fc 야생형, N297A, 또는 eADCC Fc 돌연변이체)의 7 포인트 1:10 연속 희석물을 삼중으로 제조하였다. 대조군 웰은 Jurkat NFAT v158 리포터 세포 단독, Jurkat NFAT v158 리포터 세포주 및 항체, 또는 Jurkat NFAT v158 리포터 세포주 및 CD32b 양성 표적 세포주를 포함하였다. 브라이트 글로(Bright Glo) (프로메가(Promega) #E2620)를 적절한 음성 대조군 웰을 제외하고 각각의 웰 (60 μl/웰)에 첨가하고 플레이트를 엔비전 (퍼킨 엘머) 상에서 후속적으로 판독하였다. 생성된 발광 신호를 세포주 내의 각각의 항체에 대한 가장 높은 신호에 대해 정규화한다. 이 가장 높은 신호를 "100"으로 지정하고 세포주 내의 모든 다른 항체 신호를 이에 대해 정규화하였다. Daudi 및 Jeko-1 표적 세포주 둘 다에서, 비-푸코실화 및 eADCC Fc 돌연변이체 NOV1216은 유사한 CD16a 활성화를 가져왔고, 이는 Fc WT NOV1216에 의해 관찰된 것보다 컸다 (도 14a, 도 14b). 예상된 바와 같이, Fc 침묵 NOV1216 N297A는 이 리포터 검정에서 CD16a를 활성화시키지 않았다.
CD32b 양성 표적 세포에 대한 1차 NK 세포 구동된 ADCC 활성을 도출하는 Fc WT 및 Fc 변형된 (비-푸코실화 또는 N297A) CD32b-결합 NOV1216의 능력
CD32b 항체의 Fc 의존성, ADCC 활성을 CD32b 양성 표적 세포를 사멸시키는 단리된 인간 자연 킬러 세포의 능력에 의해 측정하였다. 이 검정에 사용된 CD32b 표적 세포는 DAUDI (ATCC CCL-213) 및 Jeko-1 (DSMZ ACC533)이었다. 간략하게, PBMC를 류코팩(Leukopak) (헤마케어(HemaCare) 카탈로그# PB001F-3)으로부터 피콜 구배 (지이 헬스케어 17-1440-02)를 통해 단리시켰다. 이어서, NK 세포를 밀테니 비드 (카탈로그# 130-092-657)를 사용하여 음성적으로 선택한 다음, 기본 배지 (RPMI/10%FBS/1% 항유사분열/항생제)에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, CD32b 양성 표적 세포를 칼세인 아세톡시-메틸 에스테르 (칼세인-AM; 몰레큘라 프로브스 카탈로그# C3100MP)로 염색하고, 2회 세척하고, 웰당 10,000개의 세포의 농도로 96-웰 U-바닥 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 이어서, 세포를 20분 동안 항체의 연속 희석물과 함께 사전-인큐베이션한 후, 이펙터 세포를 20:1의 이펙터 대 표적 비로 첨가하였다. 4.0시간 공동-인큐베이션 후, 마이크로타이터 플레이트를 원심분리하고 상청액 유체의 분취물을 또 다른 마이크로타이터 플레이트 (코닝 코스타, 카탈로그 # 3904)로 옮기고 용액 중 유리 칼세인의 농도를 엔비전 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)로 결정하였다.
표적 세포의 항체 특이적 용해를 계산하기 위해, 항체 또는 이펙터 세포가 없는 표적 세포의 병행 인큐베이션이 기준선 대조군 (자발적 방출)으로서 사용된 한편, 양성 대조군 또는 최대 방출은 단지 1% 트리톤-X 100 용액만을 사용한 표적 세포의 용해에 의해 결정되었다. 퍼센트 특이적 용해를 이 방정식을 사용하여 계산하였다: (샘플 - 자발적) / (최대 방출-자발적) *100%. 평가된 세포주 둘 다에서, NOV1216의 비-푸코실화 버전은 Fc WT 버전보다 더 활성이었다 (도 14c, 도 14d). 예상된 바와 같이, NOV1216의 Fc 침묵 N297A 버전은 활성이 아니었다.
CD32b 양성 Jeko-1 세포에 대한 1차 NK 세포 구동된 ADCC 활성을 도출하는 Fc WT 및 Fc 변형된 (eADCC Fc 돌연변이체 또는 N297A) CD32b-결합 항체의 능력
세 번째 실험에서, CD32b 항체의 패널의 Fc 의존성, ADCC 활성을 CD32b 양성 Jeko-1 세포 (DSMZ ACC533)를 사멸시키는 단리된 인간 자연 킬러 세포의 능력에 의해 측정하였다. 간략하게, PBMC를 류코팩 (헤마케어 카탈로그# PB001F-3)으로부터 피콜 구배 (지이 헬스케어 17-1440-02)를 통해 단리시켰다. 이어서, NK 세포를 밀테니 비드 (카탈로그# 130-092-657)를 사용하여 음성적으로 선택하였다. 이들 이펙터 세포를 10 ng/ml Il-2 (페프로테크# 200-02)로 밤새 자극시켰다. 다음날, Jeko-1 세포를 칼세인 아세톡시-메틸 에스테르 (칼세인-AM; 몰레큘라 프로브스 카탈로그# C3100MP)로 염색하고, 2회 세척하고, 웰당 10,000개의 세포의 농도로 96-웰 U-바닥 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 이어서, 세포를 20분 동안 항체의 연속 희석물과 함께 사전-인큐베이션한 후, 이펙터 세포를 3:1의 이펙터 대 표적 비로 첨가하였다. 공동-인큐베이션 후, 마이크로타이터 플레이트를 원심분리하고 상청액 유체의 분취물을 또 다른 마이크로타이터 플레이트 (코닝 코스타, 카탈로그 # 3904)로 옮기고 용액 중 유리 칼세인의 농도를 엔비전 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)로 결정하였다.
표적 세포의 항체 특이적 용해를 계산하기 위해, 항체 또는 이펙터 세포가 없는 표적 세포의 병행 인큐베이션이 기준선 대조군 (자발적 방출)으로서 사용된 한편, 양성 대조군 또는 최대 방출은 단지 1% 트리톤-X 100 용액만을 사용한 표적 세포의 용해에 의해 결정되었다. 퍼센트 특이적 용해를 이 방정식을 사용하여 계산하였다: (샘플 - 자발적) / (최대 방출-자발적) *100%. 프로파일링된 각각의 항체 (NOV0281, NOV1216, 및 NOV1218)의 경우에, eADCC Fc 변형은 Fc WT IgG1의 것에 비해 ADCC 활성을 증가시켰다 (도 15). 예상된 바와 같이, 항체의 Fc 침묵 N297A 버전은 이 검정에서 최소한으로 활성이었다.
실시예 15: 다양한 인간 CD32b 발현을 특징으로 하는 표적 세포를 사용하는 리포터 검정에서의 CD16a를 활성화시키는 NOV1216의 Fc WT, eADCC FC 돌연변이체, 및 N297A 버전의 평가
Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용하여 다양한 인간 CD32b 발현을 특징으로 하는 표적 세포주의 패널로 Jurkat-NFAT v158 리포터 세포 상의 CD16a를 활성화시키는 CD32b-결합 항체의 능력을 평가하였다. CD32b 양성 표적 세포주는 하기와 같았다: Lama-84 (DSMZ ACC168), Jeko-1 (DSMZ ACC 553), Karpas-620 (DSMZ ACC 514), MOLP-2 (DSMZ ACC 607), 및 Raji (ATCC CCL-86). CD32b 음성 라모스 세포주 (ATCC CRL-1596)는 음성 대조군으로서 사용되었다. NOV1216의 Fc WT, eADCC Fc 돌연변이체 (S239D/A330L/I332E), 및 N297A 버전을 이 실험에서 프로파일링하였다.
간략하게, 세포주를 수집하고, PBS (깁코 14190-144) 중에서 세척하고, 0.5x106개 세포/ml로 검정 배지 (RPMI 글루타맥스 (61870-036) + 10% FBS (깁코 26140-079)) 중에 재현탁시키고, 30 μl/웰을 96 웰 백색 플레이트 (코스타 #3917)로 분취하였다. Jurkat NFAT v158 리포터 세포주를 수집하고, PBS 중에서 세척하고, 3x106개 세포/ml로 검정 배지 중에 재현탁시키고, 30 μl/웰로 분취하여 6:1의 최종 이펙터 대 표적 비를 생성하였다. 각각의 항체 (Fc 야생형, N297A, 또는 eADCC Fc 돌연변이체)의 7 포인트 1:10 연속 희석물을 삼중으로 제조하였다. 대조군 웰은 Jurkat NFAT v158 리포터 세포 단독, Jurkat NFAT v158 리포터 세포주 및 항체, 또는 Jurkat NFAT v158 리포터 세포주 및 CD32b 양성 표적 세포주를 포함하였다. 브라이트 글로 (프로메가 #E2620)를 적절한 음성 대조군 웰을 제외하고 각각의 웰에 60 μl/웰로 첨가하고 플레이트를 엔비전 (퍼킨 엘머) 상에서 후속적으로 판독하였다. 생성된 발광 신호를 세포주 내의 각각의 항체에 대한 가장 높은 신호에 대해 정규화한다. 이 가장 높은 신호를 "100"으로 지정하고 세포주 내의 모든 다른 항체 신호를 이에 대해 정규화하였다. NOV1216의 Fc WT 및 eADCC Fc 돌연변이체 버전 둘 다는 이 검정에서 CD16a의 활성화를 도출하였고, 후자의 Fc 증진된 버전은 보다 강건한 신호를 생성하였다 (도 16). 이는 CD32b 음성 라모스 세포주를 제외하고 프로파일링된 모든 세포주에 걸쳐 관찰되었다. 예상된 바와 같이, Fc 침묵 NOV1216 N297A는 이 리포터 검정에서 CD16a를 활성화시키지 않았다.
실시예 16: 다양한 인간 CD32b 발현을 특징으로 하는 표적 세포를 사용하는 리포터 검정에서의 CD16a를 활성화시키는 비-푸코실화 CDR-H3 돌연변이체 CD32b-결합 항체의 평가.
Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용하여 다양한 인간 CD32b 발현을 특징으로 하는 표적 세포주의 패널로 Jurkat-NFAT v158 리포터 세포 상의 CD16a를 활성화시키는 비-푸코실화 (afuc) CD32b-결합 CDR-H3 항체의 능력을 평가하였다. CD32b 양성 표적 세포주는 하기와 같았다: Daudi (ATCC CCL-213), 모 BJAB (DSMZ, ACC 757), 및 KARPAS422 (시그마 알드리치 06101702) 및 안정한 BJAB 세포 (인간 CD32b 발현).
간략하게, 세포주를 수집하고, PBS (깁코 14190-144) 중에서 세척하고, 0.5x106개 세포/ml로 검정 배지 (RPMI 글루타맥스 (61870-036) + 10% FBS (깁코 26140-079)) 중에 재현탁시키고, 30 μl/웰을 96 웰 백색 플레이트 (코스타 #3917)로 분취하였다. Jurkat NFAT v158 리포터 세포주를 수집하고, PBS 중에서 세척하고, 3x106개 세포/ml로 검정 배지 중에 재현탁시키고, 30 μl/웰로 분취하여 6:1의 최종 이펙터 대 표적 비를 생성하였다. 각각의 비-푸코실화 항체 (NOV1216, NOV2106, NOV2107, NOV2108)의 5 포인트 1:10 연속 희석물을 삼중으로 제조하였다. 대조군 웰은 Jurkat NFAT v158 리포터 세포 단독, Jurkat NFAT v158 리포터 세포주 및 항체, 또는 Jurkat NFAT v158 리포터 세포주 및 CD32b 양성 표적 세포주를 포함하였다. 브라이트 글로 (프로메가 #E2620; 60 μl)를 적절한 음성 대조군 웰을 제외하고 모든 웰에 첨가하고, 플레이트를 엔비전 (퍼킨 엘머) 상에서 후속적으로 판독하였다. 모든 3종의 비-푸코실화 CD32b-결합 CDR-H3 돌연변이체 (NOV2106, NOV2107, NOV2108) 및 비-푸코실화 NOV1216은 CD16a를 강력하게 활성화시켰다 (도 17). 강건한 CD16a 활성화가 각각의 3종의 CD32b 양성 세포주에 걸쳐 관찰되었다. 예상된 바와 같이, NOV1216의 N297A Fc 침묵 버전은 이 리포터 검정에서 CD16a를 활성화시키지 않았다.
실시예 17: 1차 NK 세포 검정에서의 비-푸코실화 CDR-H3 돌연변이 항체 ADCC 활성의 평가.
1차 NK 세포 ADCC 검정에서의 비-푸코실화 NOV1216 및 CDR-H3 돌연변이체 NOV2106, NOV2107, 및 NOV2108의 활성
1차 NK 세포 ADCC 검정을 이용하여 비-푸코실화 CDR-H3 돌연변이체 및 비-푸코실화 NOV1216의 Fc 의존성 활성을 평가하였다. CD32b 양성 Daudi (ATCC CCL-213) 및 KARPAS422 (시그마 알드리치 06101702) 세포는 표적 세포로서 사용되었다.
간략하게, PBMC를 류코팩 (헤마케어 카탈로그# PB001F-3)으로부터 피콜 구배를 통해 단리시켰다. 이어서, NK 세포를 밀테니 비드 (카탈로그# 130-092-657)를 사용하여 음성적으로 선택한 다음, 기본 배지 (RPMI/10%FBS/1% 항유사분열/항생제)에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, Daudi 및 Karpas 422 세포를 칼세인 아세톡시-메틸 에스테르 (칼세인-AM; 몰레큘라 프로브스 카탈로그# C3100MP)로 염색하고, 2회 세척하고, 웰당 10,000개의 세포의 농도로 96-웰 U-바닥 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 이어서, 세포를 20분 동안 항체의 연속 희석물과 함께 사전-인큐베이션한 후, 이펙터 세포를 20:1의 이펙터 대 표적 비로 첨가하였다. 공동-인큐베이션 후, 마이크로타이터 플레이트를 원심분리하고 상청액 유체의 분취물을 또 다른 마이크로타이터 플레이트 (코닝 코스타, 카탈로그 # 3904)로 옮기고 용액 중 유리 칼세인의 농도를 형광 계수기 (엔비전, 퍼킨 엘머)로 결정하였다.
표적 세포의 항체 특이적 용해를 계산하기 위해, 항체 또는 이펙터 세포가 없는 표적 세포의 병행 인큐베이션이 기준선 대조군 (자발적 방출)으로서 사용된 한편, 양성 대조군 또는 최대 방출은 단지 1% 트리톤-X 100 용액만을 사용한 표적 세포의 용해에 의해 결정되었다. 퍼센트 특이적 용해를 이 방정식을 사용하여 계산하였다: (샘플 - 자발적) / (최대 방출-자발적) *100%. 모든 3종의 비-푸코실화 CDR-H3 돌연변이 항체 (NOV2106, NOV2107, 및 NOV2108) 및 비-푸코실화 NOV1216은 Daudi 및 Karpas422 표적 세포주 둘 다의 강건한 특이적 세포 용해를 입증하였다 (도 18). 예상된 바와 같이, 비-표적화 비-푸코실화 항체는 이 검정에서 활성이 아니었다.
1차 NK 세포 ADCC 검정에서의 비-푸코실화 NOV1216 및 CDR-H3 돌연변이체 NOV2107 및 NOV2108의 활성
추가의 실험에서, 1차 NK 세포 ADCC 검정을 이용하여 비-푸코실화 CDR-H3 돌연변이 항체 및 비-푸코실화 NOV1216의 Fc 의존성 활성을 평가하였다. CD32b 양성 Daudi (ATCC CCL-213) 세포는 표적 세포로서 사용되었다.
간략하게, PBMC를 아웃소싱된 류코팩 (헤마케어 카탈로그# PB001F-3)으로부터 피콜 구배를 통해 단리시켰다. 이어서, NK 세포를 밀테니 비드 (카탈로그# 130-092-657)를 사용하여 음성적으로 선택하고 100pg/ml IL-2 (페프로테크 # 200-02)로 밤새 자극시켰다. 다음날, Daudi 및 Karpas 422 세포를 칼세인 아세톡시-메틸 에스테르 (칼세인-AM; 몰레큘라 프로브스 카탈로그# C3100MP)로 염색하고, 2회 세척하고, 웰당 10,000개의 세포의 농도로 96-웰 U-바닥 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 이어서, 세포를 20분 동안 항체의 연속 희석물과 함께 사전-인큐베이션한 후, 이펙터 세포를 3:1의 이펙터 대 표적 비로 첨가하였다. 공동-인큐베이션 후, 마이크로타이터 플레이트를 원심분리하고 상청액 유체의 분취물을 또 다른 마이크로타이터 플레이트 (코닝 코스타, 카탈로그 # 3904)로 옮기고 용액 중 유리 칼세인의 농도를 형광 계수기 (엔비전, 퍼킨 엘머)로 결정하였다.
표적 세포의 항체 특이적 용해를 계산하기 위해, 항체 또는 이펙터 세포가 없는 표적 세포의 병행 인큐베이션이 기준선 대조군 (자발적 방출)으로서 사용된 한편, 양성 대조군 또는 최대 방출은 단지 1% 트리톤-X 100 용액만을 사용한 표적 세포의 용해에 의해 결정되었다. 퍼센트 특이적 용해를 이 방정식을 사용하여 계산하였다: (샘플 - 자발적) / (최대 방출-자발적) *100%. 비-푸코실화 CDR-H3 돌연변이 항체, NOV2107 및 NOV2108 둘 다뿐만 아니라 비-푸코실화 NOV1216은 Daudi 표적 세포의 강건한 특이적 세포 용해를 입증하였다 (도 19).
실시예 18: DAUDI 이종이식편 모델에 대한 NOV1216의 Fc WT, eADCC Fc 돌연변이체, 및 N297A 버전의 생체내 활성.
NOV1216 생체내 활성에 대한 eADCC Fc 돌연변이 (S239D/A330L/I332E)의 효과를 조사하기 위해, 효능 연구를 확립된 버킷 림프종 Daudi 이종이식편을 보유하는 마우스에서 수행하였다. 암컷 누드 마우스에게 PBS로 희석된 50% 페놀 레드-무함유 매트리겔 (비디 바이오사이언시스) 중에 현탁시킨 5x106개의 Daudi 세포 (100 μl 주사 부피)를 피하로 이식하였다. 마우스를 이식후 제18일에 140 mm3의 평균 종양 부피에서 연구에 등록시켰다. 4개의 실험군 (n = 6/군) 중 1개에 무작위로 할당한 후, 마우스에게 하기 중 하나의 정맥내 주사를 매주 투여하였다: PBS, Fc 침묵 NOV1216 N297A (20 mg/kg qw*12), Fc WT NOV1216 (10 mg/kg qw*12), 또는 NOV1216 eADCC Fc 돌연변이체 (10 mg/kg qw*3). 종양 부담을 세포 이식후 제35일 및 처리 투여후 제18일에 평가하고, 퍼센트 T/C (PBS 처리된 마우스의 델타 종양 부피를 처리된 마우스의 델타 종양 부피로 나눔)로 표현하였다. 800 mm3에 도달한 종양으로 정의된 종점까지의 시간을 또한 평가하였다.
시험관내 관찰과 일치하게, eADCC Fc 돌연변이를 보유하는 NOV1216은 세포 이식후 제34일에서의 보다 작은 종양 부피 및 종점까지의 시간에 의해 설명된 바와 같이, 생체내에서 Fc WT NOV1216보다 더 활성이었다 (도 20). Fc 침묵 NOV1216 N297A 항체는 종양 부피 및 종점까지의 시간에 대한 매우 제한된 효과를 가졌다. 이들 데이터는 Fc 증진된 NOV1216 eADCC Fc 돌연변이체가 확립된 생체내 이종이식편 모델에서 Fc wt NOV1216보다 더 활성이라는 것을 입증하였다. 중요하게는, NOV1216 eADCC Fc 돌연변이체의 항종양 반응은 qw*12 투여된 다른 실험군에 비해, 단지 3회 i.v. 용량, 즉 qw*3만을 받았음에도 불구하고 종점까지의 시간이 연장되었다는 사실에 의해 입증된 바와 같이 매우 지속적이었다.
실시예 19: DAUDI 이종이식편에 대한 비-푸코실화 NOV1216 및 비-푸코실화 CDR-H3 돌연변이체의 생체내 항종양 활성
확립된 버킷 림프종 Daudi 이종이식편에서의 다중-용량 효능 연구를 수행하여 CD32b-결합, 비-푸코실화 NOV1216 항체 및 비-푸코실화 CDR-H3 돌연변이 항체, NOV2106, NOV2107 및 NOV2108의 생체내 활성을 평가하였다. 암컷 누드 마우스에게 PBS 중 50% 페놀 레드-무함유 매트리겔 (비디 바이오사이언시스)을 함유하는 현탁액 (100 μl 총 주사 부피) 중 5x106개의 Daudi 세포를 피하로 이식하였다. 마우스를 이식후 제13일에 197 mm3의 평균 종양 부피에서 연구에 등록시켰다. 4개의 군 (n = 6/군) 중 1개에 무작위로 할당한 후, 마우스에게 PBS (10 ml/kg qw*3) 또는 20 mg/kg qw*3의 하기 비-푸코실화 항체 중 하나의 정맥내 주사를 매주 투여하였다: NOV1216, NOV2106, NOV2107, 또는 NOV2108. 모든 4종의 CD32b-결합 항체는 강건한 종양 성장 제어를 가져오는 활성이었다 (도 21).
실시예 20: CD32b를 Fc 침묵 NOV1216 N297A로 차단하는 것은 리포터 검정에서 CD16a를 활성화시키는 리툭시맙 및 오비누투주맙의 능력을 증진시킨다.
연구를 수행하여 Jurkat-NFAT 리포터 검정에서 CD16a를 활성화시키는 리툭시맙 및 오비누투주맙의 능력에 대한 CD20 양성 세포에 의한 인간 CD32b 발현의 영향을 평가하였다. CD16a를 활성화시키는 그의 능력에 대한, Fc 침묵 NOV1216과 리툭시맙 또는 오비누투주맙의 조합의 결과를 또한 평가하였다.
CD32b 음성 모 라모스 세포를 ATCC (CRL-1596)로부터 수득하고 인간 CD32b를 안정하게 발현하는 라모스 세포를 생성하였다. 간략하게, 인간 CD32b를 외재적으로 발현하는 안정한 라모스 세포주의 생성을 위해, 게이트웨이(Gateway) 기술을 사용하여 전장 인간 CD32b1 서열 (유니프롯KB P31994-1)을 게이트웨이 LR 클로나제(Clonase) II 효소 혼합물 (인비트로젠 11791-020)을 사용하여 렌티바이러스 발현 벡터 OPS_v19_pLenti6.3-EF1a-gw 내로 삽입하였다. 바이러스를 생성하기 위해, 이어서 huCD32b1/V19 플라스미드를 TransIT-193 형질감염 시약 (미루스(Mirus) MIR2700) 및 옵티멤(Optimem) 무혈청 배지 (인비트로젠 #11058021) 중에서 패키징 벡터 PCG 및 VSV-G와 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 바이오코트(Biocoat) 콜라겐 코팅된 10cm 플레이트 (BD #356450) 상의 HEK-293T 세포에 첨가하였다. 그 다음날 배지를 DMEM (깁코 11965-092) + 10%FBS (깁코 26140-079) +1X NEAA (깁코 11965-092)로 교환하고 72시간 동안 37℃로 복귀시켰다. 바이러스 수거 시, 상청액을 수집하고, 풀링하고 0.45uM 셀룰로스 아세테이트 필터 (코닝 #430314)를 통해 여과하였다.
안정한 라모스 세포주의 바이러스로의 형질도입을 위해, 1x106개의 세포를 편평 바닥 24 웰 플레이트 (코스타 3526)에 플레이팅하였다. 세포에, 37℃로 가온된 1ml의 CD32b1/V19 바이러스를 8 ug/ml의 폴리브렌 (시그마 H9268)과 함께 첨가하였다. 세포를 2250 rpm에서 실온에서 1.5시간 동안 회전시켰다. 이어서, 바이러스 상청액을 제거하고 3ml의 신선한 배지를 세포에 첨가하였으며, 이어서 이를 6 웰 플레이트 (코스타 3516)로 옮겼다. 세포를 37℃에서 2일 동안 인큐베이션한 후, T25 플라스크로 옮겼다. 세포를 완전히 회수하면, 블라스티시딘을 함유하는 선택 배지를 적용하였다. 최종 안정한 세포주는 유동 세포측정법에 의해 결정된 바와 같이, 비-형질도입된 모 세포주에 비해 높은 수준의 인간 CD32b1을 균일하게 발현하는 풀링된 집단이었다.
세포주가 발생하면, 이들을 수집하고, PBS (깁코 14190-144) 중에서 세척하고, 0.5x106개 세포/ml로 검정 배지 (RPMI 글루타맥스 (61870-036) + 10% FBS (깁코 26140-079)) 중에 재현탁시키고, 30 μl/웰을 96 웰 백색 플레이트 (코스타 #3917)로 분취하였다. Jurkat NFAT v158 리포터 세포주를 수집하고, PBS 중에서 세척하고, 3x106개 세포/ml로 검정 배지 중에 재현탁시키고, 30 μl/웰로 분취하여 6:1의 최종 이펙터 대 표적 비를 생성하였다. 리툭시맙 또는 오비누투주맙의 7 포인트 1:10 연속 희석물을 삼중으로 제조하였다. Fc 침묵 NOV1216 N297A는 기준선 대조군으로서 사용되기 위해 단지 리툭시맙 또는 오비누투주맙만을 함유하는 대조군 웰로부터 배제되거나 또는 30 μg/ml의 리툭시맙 또는 오비누투주맙과 조합되었다. 모든 연속 희석물을 삼중으로 플레이팅하였다. 대조군 웰은 Jurkat NFAT v158 리포터 세포 단독, Jurkat NFAT v158 리포터 세포주 및 항체, 또는 Jurkat NFAT v158 리포터 세포주 및 표적 양성 표적 세포주를 포함하였다. 브라이트 글로 (프로메가 #E2620)를 적절한 음성 대조군 웰을 제외하고 각각의 웰에 60 μl/웰로 첨가하고, 플레이트를 엔비전 (퍼킨 엘머) 상에서 후속적으로 판독하였다.
리툭시맙 및 오비누투주맙 둘 다는 라모스 세포에 효율적으로 결합하고 리포터 세포 상의 CD16a를 활성화시키는 반면에, 이 활성화는 인간 CD32b가 라모스 세포 상에서 과다발현된 경우에 더 약하고, 이는 CD32b가 CD20 표적화된 리툭시맙 (도 22, 상부 패널) 및 오비누투주맙 (도 22, 하부 패널)에 의한 CD16a 활성화를 방해한다는 것을 시사한다. 라모스 huCD32b 세포 단독과 함께 인큐베이션하는 경우에, NOV1216 N297A (Fc 침묵)는 리포터 세포 상의 CD16a를 활성화시킬 수 없었다. 그러나, 리툭시맙 또는 오비누투주맙과 조합된 NOV1216 N297A는 리툭시맙 또는 오비누투주맙 단독과 함께 인큐베이션된 세포에 비해 라모스 huCD32b에 의한 CD16a의 활성화를 증가시켰다. 종합하면, 이들 데이터는 CD32b 및 CD20이 동일한 표적 세포 상에서 공동-발현되는 경우에, NOV1216 N297A가 리툭시맙 및 오비누투주맙에 의한 CD16a 활성화를 증진시킨다는 것을 입증하였다. 증진은 리툭시맙 및 오비누투주맙의 Fc 부분에 대한 CD32b 결합의 차단으로 인한 것으로 여겨진다.
실시예 21: CD32b를 Fc 침묵 NOV1216 N297A 또는 Fc 침묵 N297A CDR-H3 돌연변이 항체로 차단하는 것은 CD16a를 활성화시키는 리툭시맙의 능력을 증진시킨다.
연구를 수행하여 표적 세포주로서 CD20 및 CD32b 양성 BJAB 세포에서 CD16a를 활성화시키는 리툭시맙의 능력에 대한, Fc 침묵 NOV1216 및 Fc 침묵 CDR-H3 돌연변이 항체, NOV2106, NOV2107, 및 NOV2018과 리툭시맙의 조합의 영향을 평가하였다.
BJAB 세포를 (DSMZ; ACC 757)로부터 수득하고 인간 CD32b1 (실시예 20에 약술된 동일한 방법을 사용하여 생산됨)을 안정하게 발현하도록 조작하였다. 간략하게, 세포주를 수집하고, PBS (깁코 14190-144) 중에서 세척하고, 0.5x106개 세포/ml로 검정 배지 (RPMI 글루타맥스 (61870-036) + 10% FBS (깁코 26140-079)) 중에 재현탁시키고, 30 μl/웰을 96 웰 백색 플레이트 (코스타 #3917)로 분취하였다. Jurkat NFAT v158 리포터 세포주를 수집하고, PBS 중에서 세척하고, 3x106개 세포/ml로 검정 배지 중에 재현탁시키고, 30 μl/웰로 분취하여 6:1의 최종 이펙터 대 표적 비를 생성하였다. 리툭시맙의 7 포인트 1:10 연속 희석물을 삼중으로 제조하였다. NOV1216, NOV2106, NOV2107, 또는 NOV2108의 Fc 침묵 N297A 변이체는 기준선 대조군으로서 사용되기 위해 단지 리툭시맙만을 함유하는 대조군 웰로부터 배제되거나 또는 30 μg/ml의 리툭시맙과 조합되었다. 대조군 웰은 Jurkat NFAT v158 리포터 세포 단독, Jurkat NFAT v158 리포터 세포주 및 항체, 또는 Jurkat NFAT v158 리포터 세포주 및 표적 양성 표적 세포주를 포함하였다. 브라이트 글로 (프로메가 #E2620)를 적절한 음성 대조군 웰을 제외하고 각각의 웰에 60 μl/웰로 첨가하고 플레이트를 엔비전 (퍼킨 엘머) 상에서 후속적으로 판독하였다. hCD32b BJAB 세포에 결합된 리툭시맙은 리포터 세포 상의 CD16a를 효율적으로 활성화시켰다. 리툭시맙과 조합된 NOV1216, NOV2106, NOV2107, 또는 NOV2108의 Fc 침묵 N297A 변이체는 리툭시맙 단독과 함께 인큐베이션된 세포에 비해 BJAB huCD32b에 의한 CD16a의 활성화를 증가시켰다 (도 23). 종합하면, 이들 데이터는 CD32b 및 CD20이 동일한 표적 세포 상에서 공동-발현되는 경우에, Fc 침묵, CD32b 표적화 항체가 리툭시맙에 의한 CD16a 활성화를 증진시킨다는 것을 입증하였다. 한 설명은 증진이 리툭시맙의 Fc 부분에 대한 CD32b 결합의 차단으로 인한 것이라는 것이다.
실시예 22: Daudi 이종이식편 모델에서의 단일 작용제로서 또는 리툭시맙 또는 오비누투주맙과 조합된 NOV1216 eADCC Fc 돌연변이체의 생체내 항종양 활성.
상기 기재된 시험관내 발견은 CD32b의 발현이 리툭시맙 (유형 I) 및 오비누투주맙 (유형 II) CD20 표적화된 치료제 및 각각의 이들 CD20 표적화된 치료제와 강건하게 조합된 CD32b 표적화된 Ab 둘 다의 Fc 의존성 활성을 감소시킨다는 것을 입증한다. 생체내에서 이들 관찰을 조사하기 위해, 조합 효능 연구를 확립된 버킷 림프종 Daudi 이종이식편을 보유하는 마우스에서 수행하였다. 암컷 누드 마우스에게 5x106개의 Daudi 세포를 피하로 이식하였다. 세포를 PBS 중 50% 페놀 레드-무함유 매트리겔 (비디 바이오사이언시스)을 함유하는 현탁액 중에 현탁시켰다. 현탁액 중 세포를 함유하는 총 주사 부피는 100 μl였다. 마우스를 이식후 제18일에 201 mm3의 평균 종양 부피에서 연구에 등록시켰다. 6개의 군 (n = 7/군) 중 1개에 무작위로 할당한 후, 마우스에게 리툭시맙, 오비누투주맙, NOV1216 eADCC Fc 돌연변이체 (S239D/A330L/I332E), 리툭시맙 + NOV1216 eADCC Fc 돌연변이체 (각각 10 mg/kg qw), 또는 오비누투주맙 + NOV1216 eADCC Fc 돌연변이체 (각각 10 mg/kg qw)의 정맥내 주사 (10 mg/kg qw)를 매주 투여하였다. 종양 부담을 세포 이식후 제31일 및 처리 투여후 제18일에 평가하고, 퍼센트 T/C (PBS 처리된 마우스의 델타 종양 부피를 처리된 마우스의 델타 종양 부피로 나눔)로 표현하였다. 800 mm3에 도달한 종양으로 정의된 종점까지의 시간을 또한 평가하였다.
처리 개시후 제31일에, 제한된 항종양 활성이 단일 작용제 리툭시맙 또는 오비누투주맙 (각각 69 및 55% T/C)에 의해 관찰된 반면에, NOV1216 eADCC Fc 돌연변이체는 강건한 항종양 활성 (17% T/C)을 입증하였다 (도 24). 이는 종점까지의 시간의 차이로 해석되었다. NOV1216 eADCC Fc 돌연변이체와 리툭시맙 또는 오비누투주맙의 조합은 각각의 단일 작용제에 비해 증가된 종점까지의 시간을 일으켰다 (도 24).
실시예 23: CD32b를 Fc 침묵 N297A CDR-H3 돌연변이 항체 NOV2108로 차단하는 것은 CD16a를 활성화시키는 다라투무맙의 능력을 증진시킨다.
CD38은 다발성 골수종 세포 상에서 발현되고 항-CD38 항체 다라투무맙은 최근에 FDA에 의해 다발성 골수종의 치료를 위해 승인되었다. CD32b 및 CD38이 동일한 세포 상에서 공동-발현되는 경우에, CD32b가 다라투무맙의 Fc에 결합할 수 있고 치료 항체의 내재화 또는 이펙터 세포 상에서 발현되는 FcγR을 활성화시키는 것으로부터의 다라투무맙 Fc의 격리로 이어지는 것이 가능하다. 이 실시예는 NOV2108이 다라투무맙의 Fc에 대한 CD32b의 결합을 차단할 수 있고, 이에 의해 다라투무맙에 의한 CD16a (FcγRIIIa)의 보다 강건한 활성화가 가능하게 되는지 여부를 평가한다.
MM1.S 세포를 ATCC (CRL-2974)로부터 수득하였다. 모 MM1.S 세포 및 인간 CD32b1 (실시예 20에 약술된 동일한 방법을 사용하여 생산됨)을 안정하게 발현하는 MM1.S 세포를 수집하고, PBS (깁코 14190-144) 중에서 세척하고, 검정 배지 (RPMI 글루타맥스 (깁코 61870-036) + 10% FBS (깁코 26140-079)) 중에 재현탁시키고 15,000개 세포/웰로 96 웰 백색 플레이트 (코스타 #3917)로 분취하였다. Jurkat NFAT v158 리포터 세포주를 90,000개 세포/웰로 각각의 웰에 첨가하였다. 10 ug/ml 농도에서 시작하여 다라투무맙의 8 포인트 1:10 연속 희석물을 제조하였다. 다라투무맙 및 NOV2108 조합을 함유하는 각각의 웰에, 포화량의 NOV2108-N297A 항체를 10 ug/ml로 첨가한다. 모든 조건을 삼중으로 플레이팅한다. 대조군 웰은 리포터 세포 단독, 리포터 세포 및 항체, 또는 리포터 세포 및 MM1.S 또는 MM1.S huCD32b 세포를 포함한다. 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 공동-인큐베이션 후, 브라이트라이트 플러스(Britelite plus) (퍼킨 엘머, 카탈로그# 6066769; 70 μl)를 배경 대조군 웰을 제외하고 모든 웰에 첨가하였다. 생성된 발광을 엔비전 (퍼킨 엘머) 상에서 후속적으로 판독한 다음, 프리즘(Prism) 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다. MM1.S 세포에 결합된 다라투무맙은 리포터 세포 상의 CD16a를 효율적으로 활성화시킨 반면에, 이 활성화는 인간 CD32b가 MM1.S 세포 상에서 과다발현된 경우에 더 약하고, 이는 CD32b가 다라투무맙에 의한 CD16a 활성화를 방해한다는 것을 시사한다 (도 25). MM1.S huCD32b 세포 단독과 함께 인큐베이션하는 경우에, NOV2108-N297A (Fc 침묵)는 리포터 세포 상의 CD16a를 활성화시킬 수 없었다. 그러나, 다라투무맙과 조합되어, NOV2108-N297A는 다라투무맙 단독과 함께 인큐베이션된 세포에 비해 MM1.S huCD32b에 의한 CD16a의 활성화를 증가시켰다. 종합하면, 이들 데이터는 CD32b 및 CD38이 동일한 표적 세포 상에서 공동-발현되는 경우에, NOV2108-N297A가 다라투무맙에 의한 CD16a 활성화를 증진시킨다는 것을 입증하였다. 관찰된 증진에 대한 한 설명은 항-CD32b 항체가 다라투무맙의 Fc 부분에 대한 CD32b 결합을 차단하여, Fc 부분이 활성 Fc 감마 수용체 (예를 들어 CD16a)와 상호작용하는 것을 가능하도록 만든다는 것이다.
실시예 24: 야생형 및 Fc 증진된 NOV1216 및 NOV2108은 인간 대식세포에 의한 Daudi 표적 세포 사멸을 효율적으로 매개한다.
대식세포는 항체-매개 종양 세포 클리어런스에 대한 강력한 이펙터 세포로 밝혀졌다 (문헌 [Uchida et al., J Exp Med. 199(12):1659-69 (2004); Pallasch et al., Cell 156(3):590-602 (2014); Overdijk et al., MAbs 7(2):311-21 (2015); Dilillo et al., Cell 161(5):1035-45 (2015)] 참조). 이 실시예는 대식세포에 의한 표적 세포 사멸을 매개하는 항체 NOV1216의 Fc WT, Fc 침묵 N297A 돌연변이체, 및 비-푸코실화 버전; 항체 NOV2108의 Fc WT, Fc 침묵 N297A 돌연변이체, 및 비-푸코실화 버전; 및 WO 2012/022985로부터의 항-CD32b 항체 클론 10의 Fc WT 및 Fc 침묵 N297A 버전의 효능을 평가하였다. 항체 클론 10의 CDR, VH 및 VL 서열은 WO2015/173384로부터의 항체 6G11과 동일한 것으로 보인다.
대식세포-매개 세포 사멸 검정을 수행하여 옵소닌화 CD32b+ 루시페라제화 Daudi 세포를 사멸시키는 인간 단핵구-유래 대식세포 (hMDM)의 능력을 측정하였다. 간략하게, PBMC를 피콜 구배 원심분리를 사용하여 류코팩 (헤마케어, 카탈로그# PB001F-3)으로부터 단리시켰다. 이어서, 단핵구를 밀테니 인간 단핵구 단리 키트 II (카탈로그# 130-091-153)를 사용하여 음성적으로 선택하였다. 단리된 단핵구를 웰당 300,000개의 세포의 농도로 96-웰 편평-바닥 마이크로타이터 플레이트 (코닝, 카탈로그# 3596) 상에 추가로 시딩하고 10 ng/ml M-CSF (페프로테크, 카탈로그# 300-25)로 보충된 완전 대식세포 배지 [(X-VIVO15 (론자, 카탈로그# 04-744Q) + 10% FBS)]에서 7일 동안 배양하였다. 루시페라제화 Daudi 세포를 수거하고 10분 동안 항체의 연속 희석물과 함께 사전-인큐베이션하였다. 상응하는 항체를 포함하는 이들 표적 세포를 10,000개 세포/웰로 hMDM 플레이트로 옮겼다. 항체를 포함하거나 또는 포함하지 않는 표적 세포 (대식세포 없음)를 대조군으로서 포함시켰다. 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 공동-인큐베이션 후, 브라이트라이트 플러스 (퍼킨 엘머, 카탈로그# 6066769; 70 μl)를 배경 대조군 웰 (Daudi 세포 단독)을 제외하고 모든 웰에 첨가하였다. 브라이트라이트를 포함하는 표적 세포는 최대 신호 대조군으로서 사용된 한편, 브라이트라이트가 없는 표적 세포는 배경 대조군으로서 사용되었다. 상청액 유체의 분취물을 또 다른 마이크로타이터 플레이트 (코닝 코스타, 카탈로그 #3917)로 옮기고 발광 신호를 엔비전 (퍼킨 엘머) 상에서 후속적으로 측정하였다. 표적 세포의 퍼센트 사멸을 하기 식을 사용하여 계산하였다: [1- (샘플 - 배경)/최대)] x100%.
Fc 야생형 (WT) 항체 NOV1216 또는 NOV2108은 Daudi 세포의 강건한 사멸을 매개한 반면에, WT 클론 10 항체는 최소 효과를 나타냈다 (도 26). 비-푸코실화는 NOV1216 또는 NOV2108에 의한 대식세포-매개 표적 세포 사멸을 추가로 증진시켰다. 대식세포-매개 사멸이 이소형 (항-닭 리소자임 항체) 대조군과 함께 인큐베이션된 Daudi 세포 상에서 관찰되지 않았고, 이는 세포 사멸이 Daudi 세포 상에 발현되는 CD32b에 대한 항체의 특이적 결합을 필요로 한다는 것을 나타낸다. 또한, Fc-침묵 (N297A) 돌연변이 항체 (NOV1216, NOV2108 또는 클론 10)는 대식세포에 의한 표적 세포 사멸을 매개하지 않았고, 이는 대식세포 Fcγ 수용체의 활성화가 이 검정에서 세포 사멸에 요구된다는 것을 시사한다.
실시예 25: 1차 인간 B 세포에서의 기초 및 가교된 항-IgM-자극된 pCD32b 수준에 대한 CD32b-결합 항체 2B6 및 NOV1216 (Fc WT 및 Fc 변형됨)의 영향.
가교된 항-IgM은 B 세포를 활성화시키고 후속적으로 CD32b ITIM의 인산화를 가져오는 것으로 공지되어 있다. 일련의 실험을 수행하여 기초 pCD32b 수준 (티로신 292)뿐만 아니라 항-IgM 자극된 pCD32 수준에 대한 다양한 CD32b-결합 항체의 영향을 평가하였다.
간략하게, PBMC를 공여된 인간 전혈로부터 피콜 구배에 의해 단리시켰다. 이어서, B 세포를 밀테니 B 세포 단리 키트 II (밀테니 바이오테크 130-091-151) 및 프로토콜을 사용하여 단리시켰다. B 세포를 RPMI 중 1x106개 세포/웰로 24 웰 플레이트 (코스타 3526)에 플레이팅하였다. 실험에서 웰을 가교된 항-IgM의 부재 또는 존재 하에 pCD32b 수준에 대한 5 nM의 최종 농도의 CD32b-결합 항체, 2B6 (문헌 [Rankin et al., 2006 Blood 108(7):2384-2391] 및 미국 특허 번호 7,521,542 참조) 또는 NOV1216 항체 (Fc WT, eADCC Fc 돌연변이체 (S239D/A330L/I332E), 비-푸코실화, 및 N297A 버전)의 영향을 평가하도록 설정하였다. 대조군 웰은 처리 없음, 가교된 항-IgM 단독, CD32b-결합 항체 단독, 또는 비-푸코실화 비-표적화 항체 단독 (이소형 대조군)을 가졌다. 37℃에서 10분 인큐베이션 후, B 세포를 수거하고 Halt 프로테아제 억제제 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 78430) 및 포스포스톱(Phosphostop) (로슈 04-906-837-001)을 함유하는 Ripa 완충제 (보스톤 바이오프로덕츠(Boston Bioproducts) BP-115)로 용해시켰다. 단백질 용해물을 환원시키고, PVDF 겔 (바이오라드(BioRad) 170-4157) 상에서 러닝시키고, PVDF 막 (바이오라드 567-1084)으로 옮기고, 오디세이 차단 완충제 (리코르(Licor) 927-40000)로 차단하였다. 막을 pCD32b (압캠(Abcam) ab68423) 및 베타 액틴 (압캠 ab8226) 1차 항체에 의해 둘 다 1:25000 희석물로 밤새 프로빙하였다. 4회 세척한 후 (트윈 (TBST)을 포함하는 트리스 완충 염수; 보스톤 바이오프로덕츠 1BB-181X), 2차 항체 (IR800 항-마우스, 리코르 925-32210 및 IR680 항-토끼, 리코르 925-68071)를 오디세이 차단 완충제 중 1:10000 희석물로 첨가하였다. 막을 후속적으로 세척한 다음 (TBST 중에서 4회, 트리스 완충 염수 (보스톤 바이오프로덕츠 BM-30IX) 중에서 1회), 오디세이 CLx 상에서 판독하였다. pCD32b 신호를 베타-액틴에 대해 정규화하고 항-IgM 처리 단독의 비로서 표현하고, 이를 100으로 설정하였다. 예상된 바와 같이, 가교된 항-IgM은 CD32b ITIM 인산화의 증가를 일으켰다 (도 27). 항체 2B6 (Fc wt, N297A, 및 eADCC Fc 돌연변이체, 버전)은 pCD32b 수준의 현저한 증가에 의해 나타내어진 바와 같이, CD32b ITIM의 강력한 효능제였다 (도 27, 좌측 패널). 이는 강건한 pCD32b 효능작용 활성이 결여된 NOV1216 (Fc wt, N297A, eADCC Fc 돌연변이체, 및 비-푸코실화 버전)과 대조적이다 (도 27, 우측 패널). 2B6의 효능작용 활성은 맞물린 Fc에 의존성인 것으로 밝혀졌고, 즉 Fc 침묵 N297A 버전은 CD32b ITIM 인산화를 가져오지 않았다. NOV1216의 모든 버전은 CD32b의 가교된 항-IgM 활성화를 미묘하게 감소시키는 능력을 가졌다 (도 27). 이는 2B6에 의해 관찰되지 않았다.
실시예 26: 1차 B 세포, DAUDI 세포 및 KARPAS422 세포에서의 리툭시맙 자극된 CD32b ITIM을 조정하는 비-푸코실화 CD32b-결합 항체 NOV1216의 능력.
리툭시맙은 인간 B 세포 및 CD20 양성 암 세포주 상에서 CD32b ITIM 인산화를 유발하는 것으로 공지되어 있다. 여러 실험을 수행하여 1차 B 세포 및 CD20 양성 Daudi (ATCC; CCL-213) 및 Karpas422 (시그마 알드리치 06101702) 암 세포주에서의 이러한 pCD32b의 리툭시맙-구동된 증가를 조정하는 비-푸코실화 CD32b-결합 항체 NOV1216의 능력을 조사하였다. 이들 세포에서의 기초 수준의 CD32b ITIM 인산화에 대한 비-푸코실화 NOV1216의 효과를 또한 조사하였다. 간략하게, PBMC를 피콜 분리에 의해 전혈로부터 단리시켰다. 이어서, B 세포를 밀테니 B 세포 단리 키트 II (밀테니 바이오테크 130-091-151) 및 프로토콜을 사용하여 PBMC로부터 단리시켰다. B 세포, Daudi 세포, 및 Karpas422 세포를 RPMI 중 1x106개 세포/웰로 24 웰 플레이트 (코스타 3526)에 플레이팅하였다. 실험 웰의 절반을 리툭시맙 (50 nM)으로 자극시켰다. 비-푸코실화 NOV1216을 50 nM의 최종 농도로 비처리된 또는 리툭시맙 자극된 웰 둘 다에 첨가하였다. 대조군 웰은 비처리, 리툭시맙 단독, 또는 비-푸코실화 NOV1216 단독으로 이루어졌다.
37℃에서 30분 인큐베이션 후, 세포를 수거하고 Halt 프로테아제 억제제 (써모 사이언티픽 78430) 및 포스포스톱 (로슈 04-906-837-001)을 함유하는 Ripa 완충제 (보스톤 바이오프로덕츠 BP-115)로 용해시켰다. 단백질 용해물을 환원시키고, PVDF 겔 (바이오라드 170-4157) 상에서 러닝시키고, PVDF 막 (바이오라드 567-1084)으로 옮기고, 오디세이 차단 완충제 (리코르 927-40000)로 차단하였다. 막을 pCD32b (압캠 ab68423) 및 베타 액틴 (압캠 ab8226) 1차 항체에 의해 둘 다 1:25000 희석물로 밤새 프로빙하였다. 4회 세척한 후 (트윈 (TBST)을 포함하는 트리스 완충 염수; 보스톤 바이오프로덕츠 1BB-181X), 2차 항체 (IR800 항-마우스, 리코르 925-32210 및 IR680 항-토끼, 리코르 925-68071)를 오디세이 차단 완충제 중 1:10000 희석물로 첨가하였다. 막을 후속적으로 세척한 다음 (TBST 중에서 4회, 트리스 완충 염수 (보스톤 바이오프로덕츠 BM-30IX) 중에서 1회), 오디세이 CLx 상에서 판독하였다.
도 28에 보여진 바와 같이, 비-푸코실화 NOV1216은 비처리된 대조군에 비해 CD32b ITIM 인산화에 대한 영향을 거의 내지 전혀 갖지 않았다. 예상된 바와 같이, 이들 세포 집단에의 리툭시맙의 첨가는 pCD32b 수준의 증가에 의해 입증된 바와 같이 CD32b의 강건한 효능작용을 일으켰다. 비-푸코실화 CD32b-결합 NOV1216과 리툭시맙의 공동-인큐베이션은 pCD32b 수준의 리툭시맙-구동된 증가를 현저하게 감소시켰다 (도 28). 이는 1차 B 세포뿐만 아니라 CD20 및 CD32b 양성 Daudi 및 Karpas422 암 세포주에서 관찰되었다.
실시예 27: 1차 환자 다발성 골수종 샘플 및 2종의 확립된 세포주 상의 CD32b 단백질의 발현
CD32b Fc 수용체는 정상 및 악성 형질 세포 둘 다에서 발현된다. 신선한 비처리된 골수 (론자)로부터의 정상 인간 형질 세포 및 다발성 골수종 골수 단핵 세포 환자 샘플 (컨버슨트(Conversant))에 대한 huCD32b 특이적 항체의 결합을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 비처리된 골수를 PBS로 세척한 다음, RBC 용해 완충제 (이바이오사이언스)로 처리하여 임의의 오염 적혈구를 제거하였다. 정상 형질 세포를 제조업체의 지침에 따라 형질 세포 단리 키트 II (밀테니 바이오테크 130-093-628)를 사용하여 골수 단핵 세포로부터 단리시켰다. 다발성 골수종 환자 샘플을 37℃ 수조에서 급속하게 해동하고 미리-가온된 RPMI 배지로 적가 희석하였다. 샘플을 RPMI 배지로 희석한 다음, RBC 용해 완충제 (이바이오사이언스)로 처리하여 임의의 오염 적혈구를 제거하였다. 종양 B 세포주 JeKo-1 (외투 세포 림프종) 및 MOLP-2 (다발성 골수종)를 대조군으로서 사용하여 huCD32b 염색을 평가하였다.
정상 및 악성 형질 세포 샘플을 20% FBS로 보충된 0.5 ml FACS 완충제 (2% BSA, 2 mM EDTA를 함유하는 PBS) 중에 재현탁시키고 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 분배하였다 (웰당 100 ul). 대조군 종양 샘플을 계수하고 웰당 2x105개의 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 분배하였다. 이어서, 샘플을 FITC-CD38, PE-CD138, PE-Cy7-CD45, 및 알렉사플루오르 647-CD32b 클론 2B6 [N297A] 또는 알렉사플루오르 647-hIgG1 이소형 대조군 [N297A]을 함유하는 동등 부피의 2x 항체 칵테일 중에서 염색하였다. 샘플을 얼음 상에서 30분 인큐베이션하였다. FACS 완충제로 2회 연속 세척한 후, 세포를 FACS 완충제 중에서 희석된 7-AAD 염색 용액 중에 재현탁시키고 BD LSR II 유동 세포측정기 상에서 획득하였다. CD45+CD38+CD138+ 게이트에서의 중앙 형광 강도 (알렉사플루오르 647 채널에서의 MFI)를 CD32b 항체에 대한 결합 강도의 척도로서 사용하였다. 정상 형질 세포는 대조군 종양 B 세포주보다 덜 강한 CD32b 염색을 갖는 반면에, 5개의 다발성 골수종 환자 샘플 중 4개는 대조군 종양 B 세포주 및 정상 형질 세포 둘 다보다 더 강한 CD32b 염색을 가졌다 (도 29). 이들 데이터는 CD32b가 다발성 골수종을 포함하는 B 세포 악성종양을 치료하기 위한 바람직한 표적일 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 28: 야생형 및 Fc 증진된 NOV2108은 인간 NK 세포에 의한 Daudi 표적 세포 사멸을 효율적으로 매개한다.
이 실시예에서, 상기 실시예 24에서 논의된 항-CD32b 항체 클론 10 및 NOV2108을 NK 세포에 의한 ADCC를 매개하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 비-푸코실화 (Afuc), 야생형 (WT) 및 N297A (침묵) 포맷의 NOV2108뿐만 아니라 클론 10 (WT 및 N297A)을 DAUDI 세포를 사멸시키는 단리된 인간 자연 킬러 세포를 사용하는 ADCC 검정에서 시험하였다. 간략하게, PBMC를 류코팩 (헤마케어 카탈로그# PB001F-3)으로부터 피콜 구배 (지이 헬스케어 17-1440-02)를 통해 단리시켰다. 이어서, NK 세포를 밀테니 비드 (카탈로그# 130-092-657)를 사용하여 음성적으로 선택한 다음, IL2-함유 배지 (0.1 ng/ml IL-2를 포함하는 RPMI/10%FBS)에서 밤새 인큐베이션하였다. 루시페라제화 Daudi 세포를 웰당 10,000개의 세포의 농도로 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (코닝 코스타, 카탈로그 #3917)에서 20분 동안 항체의 연속 희석물과 함께 사전-인큐베이션하였다. 이어서, NK 세포를 3:1의 이펙터 대 표적 비로 첨가하였다. 2시간 공동-인큐베이션 후, 브라이트라이트 플러스 (퍼킨 엘머, 카탈로그# 6066769; 70 μl)를 배경 대조군 웰 (Daudi 세포 단독)을 제외하고 모든 웰에 첨가하였다. 브라이트라이트를 포함하는 표적 세포 (Ab 또는 NK 없음)는 최대 신호 대조군으로서 사용된 한편, 브라이트라이트가 없는 표적 세포는 배경 대조군으로서 사용되었다. 발광 신호를 엔비전 (퍼킨 엘머) 상에서 후속적으로 측정하였다. 표적 세포의 퍼센트 사멸을 하기 식을 사용하여 계산하였다: [1- (샘플 - 배경)/최대)] x100%. NOV2108-WT는 클론 10-WT Ab보다 더 강력한 ADCC를 매개한 반면에, 비-푸코실화 NOV2108은 Daudi 세포의 추가로 증진된 사멸을 나타냈다 (도 30).
NK- 및 대식세포-매개 사멸 검정 (실시예 24) 둘 다에서, NOV2108 및 동일한 Fc 포맷 (WT)을 갖는 클론 10을 비교하였고, NOV2108-WT는 클론 10-WT보다 이펙터 세포 유형 둘 다에 의한 더 강건한 표적 세포 사멸을 매개하였다. 따라서, NOV2108은 클론 10과 비교하여 개선된 항-CD32b ADCC 항체이다.
실시예 29: GMB 백혈병 모델의 골수에서 알렘투주맙 또는 리툭시맙 저항성을 조정하는 데 있어서의 상이한 Fc 기능 돌연변이를 갖는 항-CD32b 항체의 역할의 평가
문헌 [Leskov et al. in "Rapid generation of human B-cell lymphomas via combined expression of Myc and Bcl2 and their use as a preclinical model for biological therapies,"Oncogene 32(8):1066-72" (Leskov et al., 2013)]은 인간화 마우스에서 발생 중인 B 세포에서 인간 원종양유전자 myc 및 bcl-2 둘 다를 공동-발현시킴으로써 공격성 인간 B 세포 백혈병 모델, GMB를 보고한다. GMB 백혈병 세포는 인간 CD52에 특이적인 인간화 모노클로날 항체인 알렘투주맙에 감수성이며, 이에 따라 NSG 마우스의 비장, 간 및 혈액으로부터 제거되나, 골수에서는 그렇지 않다. 이 모델을 사용함으로써, 대식세포는 불응성 골수 미세환경에서 항체-매개 세포독성의 주요 결정인자인 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 알렘투주맙 요법에 대한 저항성의 한 메카니즘은 골수에서의, 그러나 비장에서는 아닌, 백혈병 세포 상의 CD32b (FcγRIIb)의 상향조절인 것으로 밝혀졌고, 이는 ADCC 활성을 조절하는 특정한 미세환경 인자를 나타낸다 (Pallasch et al. (2014) "Sensitizing protective tumor microenvironments to antibody mediated therapy." Cell 156: 590-162). 더욱이, 알렘투주맙 저항성 GBM 세포에서의 shRNA를 통한 CD32b의 녹다운은 세포를 알렘투주맙-매개 ADCC 사멸에 대해 재감작화시켰다. 이들 데이터는 증가된 CD32b 발현이 알렘투주맙에 대한 저항성의 메카니즘이라는 것을 시사한다. CD32b를 CD32b Fc 결합 도메인을 차단하는 mAb로 표적화하는 것은 shRNA를 통해 CD32b를 고갈시키는 것과 유사한 결과를 가져올 수 있는 것으로 가정된다. 추가적으로, 알렘투주맙 (또는 Fc-의존성 작용 방식을 갖는 다른 mAb)과 항-CD32b mAb의 공-투여는 저항성의 개시를 지연시킬 수 있다.
GMB 백혈병 세포는 대식세포-의존성 방식으로 알렘투주맙-매개 사멸에 감수성이다 (Pallasch et al. 2014). 공개된 연구에서, GMB 백혈병 세포를 인간 면역 세포가 결여된 비-인간화 NSG 마우스 내로 전달하였다. 알렘투주맙은 NSG 마우스의 비장, 간 및 혈액으로부터 GMB 백혈병 세포를 성공적으로 제거하였지만, 골수로부터는 그렇지 않았다.
알렘투주맙 또는 리툭시맙 저항성을 조정하는 데 있어서의 항-CD32b 항체 (NOV1206 WT, Fc 침묵, ADCC 증진됨 (S239D/A330L/I332E Fc 증진된 돌연변이체))의 역할은 항-CD32b 표적화 mAb를 투여하고 생체내에서 알렘투주맙에 대한 백혈병 세포의 감수성의 회복시키기 위한 GMB 생체내 백혈병 모델에서의 CD32b의 표적화에 의한 알렘투주맙 또는 리툭시맙 저항성의 지연 또는 방지를 측정함으로써 GMB 백혈병 모델에서 모니터링될 것이다. 알렘투주맙이 이용가능하지 않은 경우에, 리툭시맙이 대신 사용될 것이며, BM에서 리툭시맙 저항성 GBM 세포가 상향조절된 CD32b 발현을 입증한다는 것을 확인할 것이다.
이 실시예에서, NSG 마우스에게 GMB 백혈병 세포를 접종할 것이고 하기 실험 부문 중 하나에 무작위로 할당할 것이다:
1군: PBS
2군: 문헌 [Pallasch et al.]에서와 같이 투여된 알렘투주맙 (또는 리툭시맙)
3군: 항-CD32b mAb (Fc 침묵 돌연변이 N297A를 가짐) [20 mg/kg i.v. qw]
4군: 항-CD32b mAb (Fc 증진됨 또는 WT Fc) [20 mg/kg i.v. qw]
5군: 항-CD32b mAb (Fc 증진됨 또는 WT Fc) [20 mg/kg i.v. qw] + 알렘투주맙 또는 리툭시맙
6군: 항-CD32b mAb (Fc 침묵 돌연변이 N297A를 가짐) [20 mg/kg i.v. qw] + 알렘투주맙 또는 리툭시맙
7군: 문헌 [Pallasch et al.]에서와 같이 투여된 시클로포스파미드를 포함하는 알렘투주맙 (또는 리툭시맙).
GMB 세포를 알렘투주맙에 저항성일 시 2군의 마우스의 골수로부터 수집하고 FACS에 의해 CD32b 발현에 대해 평가할 것이다 (비처리된 마우스의 시간-매칭된 코호트는 대조군으로서 사용될 것임). 3군은 항-CD32b mAb의 Fc 비의존성, 단일 작용제 활성을 평가하기 위한 대조군일 것이다. 5군 및 6군은 특히 골수 공간에서, GMB 질환 부담 및 반응의 지속성에 대한 CD32b를 Fc WT (또는 FC 증진된) 또는 Fc 침묵 (N297A) mAb로 표적화하는 것의 치료 영향을 밝혀낼 것이다. 6군은 특히 골수에서, CD32b 항체의 Fc 기능의 부재 하에 알렘투주맙 또는 리툭시맙에 대한 반응의 깊이 및 지속성에 대한 CD32b를 CD32b 표적화된 항체 (CDR 특이적 활성)로 차단하는 것의 특이적 영향을 밝혀낼 것이다. 이는 항-CD32b mAb의 Fc 의존성 및 CDR 의존성 (Fc 비의존성) 활성으로부터 유래된 치료 이익을 서술하는 것을 도울 것이다.
NSG 마우스에게 GMB 백혈병 세포를 접종하고 문헌 [Pallasch et al. (2014)]에 기재된 바와 같이 골수에서의 저항성의 개시까지 알렘투주맙 또는 리툭시맙으로 처리할 것이다. 알렘투주맙이 이용가능하지 않은 경우에, 리툭시맙이 대신 사용될 것이며, BM에서 리툭시맙 저항성 세포가 상향조절된 CD32b 발현을 입증한다는 것을 확인할 것이다. 골수에서의 알렘투주맙 또는 리툭시맙 저항성의 개시 시, 마우스를 하기 실험 처리군 중 하나에 무작위로 할당할 것이다. 추가적으로, 이 때 마우스의 코호트를 안락사시키고 골수 공간의 GMB 백혈병 세포를 FACS를 통한 CD32b 발현의 평가를 위해 수집하고 비처리된 마우스의 것과 비교할 것이다. 문헌 [Pallasch]으로부터의 발견에 기초하여, 골수에서의 알렘투주맙 저항성 GMB 세포는 증가된 CD32b 발현을 갖는 것으로 예상된다.
1군: PBS
2군: 알렘투주맙 또는 리툭시맙
3군: 항-CD32b mAb (N297A)
4군: 항-CD32b mAb (Fc 증진됨 또는 WT Fc)
5군: 항-CD32b mAb (Fc 증진됨 또는 WT Fc) + 알렘투주맙
6군: 항-CD32b mAb (N297A) + 알렘투주맙 또는 리툭시맙
7군: 알렘투주맙 또는 리툭시맙 + 시클로포스파미드
1군, 2군, 및 3군은 대조군이고 질환의 경과에 영향을 미칠 것으로 예상되지 않는다. 4군은 알렘투주맙 또는 리툭시맙 저항성 GMB를 Fc 증진된 항-CD32b mAb로 처리하는 것의 치료 이익을 밝혀낼 것이다. 5군 및 6군은 골수 니치(niche)에서 알렘투주맙 또는 리툭시맙 저항성을 역전시키는 Fc WT (또는 Fc 증진된) 및 Fc 침묵 (각각) 항-CD32b mAb의 잠재력을 밝혀낼 것이다. Fc 침묵 돌연변이를 갖는 후자 군은 구체적으로 알렘투주맙 또는 리툭시맙에 대한 GMB 세포의 반응에 대한 CD32b Fc-결합 도메인 차단 (항-CD32b mAb의 CDR 특이적 활성)의 잠재적 효과를 밝혀낼 것이다.
실시예 30: 항-CD32b Ab의 보체 의존성 세포독성 (CDC) 활성의 평가
일련의 시험관내 연구를 수행하여 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 의해 CD32b 양성 세포를 사멸시키는 비-푸코실화 NOV2108의 능력을 평가하였다. CDC 검정에서 KARPAS-422 세포를 상이한 농도의 항체 및 고정 농도의 토끼 보체와 함께 인큐베이션하였다. KARPAS-422 세포의 농도-의존성 사멸을 2시간 후에, 세포내 ATP 농도, 즉 ATP-소모 루시페린-루시페라제 시스템에 의해 생산된 발광을 통해 세포의 생존율을 측정함으로써 분석한다.
KARPAS-422 세포를 수거하고 1.7 x 105개 세포/mL의 농도로 조정하고 50 μl의 현탁액을 백색 편평-바닥 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 모든 웰에 첨가하였다. 이어서, 검정 완충제 중에서 비-푸코실화 NOV2108 (62.8 mg/mL) 및 맙테라(MabThera) (로트#H0165B09, 10 mg/mL)의 8개의 연속 희석물을 U-바닥 마이크로타이터 플레이트에서 삼중으로 제조하여 30,000 ng/mL, 6000 ng/mL, 1200 ng/mL, 240 ng/mL, 48 ng/mL, 10 ng/mL, 2 ng/mL, 및 0.4 ng/mL의 최종 검정 농도를 생성하고 50 μl의 희석물을 KARPAS-422 세포를 함유하는 검정 플레이트로 옮겼다. 최종적으로 검정 완충제 중에서 1:8 희석된 50 μl의 토끼 보체를 검정 플레이트에 첨가하고 플레이트를 플레이트 진탕기 상에서 60초 동안 서서히 요동시켰다.
대조군으로서, 검정 완충제를 샘플과 유사하게 모의-희석하였다. 추가적으로, 샘플 및 보체 없이 세포를 함유하는 블랭크 대조군, 항체가 결여된 음성 대조군 및 항체가 결여되지만 세포의 완전 용해를 위해 1% 트리톤 X-100을 함유하는 양성 대조군을 8중으로 포함시켰다.
37℃, 5% CO2로 2시간 인큐베이션 후, 100 μl의 재구성된 셀타이터글로(CellTiterGlo) 용액을 모든 웰에 첨가하고 플레이트를 처음 15분 동안 서서히 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 발광을 측정하였다.
NOV2108 및 양성 대조군 맙테라는 이 CDC 검정에서 KARPAS-422 세포의 용량 의존성 사멸을 입증하였다 (도 35). 이들 데이터는 비-푸코실화 NOV2108이 보체와 맞물려 CDC에 의해 CD32b 양성 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 입증한다. 예상된 바와 같이 완충제 대조군은 이 실험에서 생존 세포의 수를 감소시키지 않았다.
실시예 31: 대식세포는 CD32b-양성이지만 항-CD32b Ab-매개 용해 (NK 세포에 의함) 또는 식세포작용 (다른 대식세포에 의함)에 보다 저항성이다.
대식세포는 CD32b뿐만 아니라 FcγR 패밀리의 다른 구성원을 발현하는 것으로 공지되어 있다. 대식세포가 항-CD32b 항체에 의해 표적화되고 ADCC 또는 ADCP 메카니즘을 통해 사멸될 수 있는 것이 가능하다.
대식세포는 CD32b를 발현한다.
항-CD32b 항체가 대식세포에 결합하는지 여부가 먼저 결정되었다. 인간 단핵구-유래 대식세포는 실시예 24에 기재된 바와 같이 분화되었다. 96-웰 편평 바닥 플레이트에 부착된 대식세포를 얼음 상에서 30분 동안 0.5 ug/ml 염색 용액 PBS+2% IFS에서의 알렉사플루오르 647-표지된 항-CD32b Ab 2B6 (N297A Fc-침묵 돌연변이체)과 함께 인큐베이션하였다. FACS 완충제로 2회 연속 세척한 후, 세포를 120 μl FACS 완충제 중에 현탁시키고 FACS 포르테사 상에서 획득하였다. Daudi 세포를 양성 대조군으로서 사용하고 동일한 염색 조건 하에 현탁 세포와 같이 염색하였다. 알렉사플루오르647-표지된 항-닭 리소자임 Ab (N297A 돌연변이체)를 IgG 대조군으로서 사용하였다. FACS 히스토그램은 기록된 사건의 수 (y-축)에 대한 MFI로서의 염색의 상대적 수준 (x-축)을 나타낸다. 항-CD23b Ab 2B6에 의한 염색 (실선)은 IgG 대조군의 것 (채워진 점선)과 오버레이된다. 대식세포는 다수의 FcγR, 특히 FcγRI, 고친화도 Fc 수용체에 의해 예상된 바와 같은 IgG 대조군에 대한 배경 결합을 나타냈다 (도 36a). 대식세포에 대한 2B6 결합은 IgG 대조군보다 더 높고, 이는 대식세포가 CD32b 양성이라는 것을 나타낸다. 그러나, 대식세포에 대한 2B6과 IgG 대조군 사이의 이동은 Daudi 세포보다 더 작다 (도 36a, 도 36b).
대식세포는 Daudi보다 NK 세포에 의한 항-CD32b Ab-매개 ADCC에 덜 감수성이다.
다음에, 본 발명자들은 항-CD32b Ab NOV2108 (비-푸코실화)을 사용하는 시험관내 ADCC 검정에서 대식세포 대 Daudi 여부를 비교하였다. NK 세포를 실시예 17에 기재된 바와 같은 상이한 공여자로부터 단리시켰다. 부착 대식세포를 96-웰 편평-바닥 플레이트 (10% FBS를 포함하는 RPMI 중 4 ug/ml, 60 ul/웰)에서 칼세인 AM으로 1시간 동안 표지하였다. 대식세포 또는 Daudi에 대한 표적 세포의 수는 60,000개/웰이었고 120,000개 NK 세포/웰을 2:1의 이펙터: 표적 비를 위해 사용하였다. ADCC 검정을 실시예 17에 기재된 바와 같이 수행하였다. 표적 세포 용해를 2시간 후에 측정하였다. Daudi 세포는 NK 세포에 의해 효율적으로 용해된 반면에, 대식세포는 ADCC에 보다 저항성이었고 (도 37), 낮은 수준의 용해가 단지 보다 높은 농도의 비-푸코실화 NOV2108에서만 관찰되었다.
대식세포는 항-CD32b Ab-매개 ADCP에 저항성이다.
NOV2108은 ADCP 메카니즘을 통한 CD32bpos 세포주 Daudi의 효율적인 사멸 (실시예 24)을 매개할 수 있다. 대식세포가 CD32bpos이기 때문에, 본 발명자들은 대식세포가 항-CD32b Ab의 존재 하에 서로 포식할 수 있는지 여부를 결정하도록 하였다. 본 발명자들은 저속 촬영 공초점 영상화를 사용하여 셀 트래커 염료 (몰레큘라 프로브스)로 표지된 세포의 식세포작용을 가시화하였다. 대식세포 분화를 위해 페트리 디쉬를 사용하여 표면에 대한 세포 부착을 감소시켰다. 이펙터 세포 대식세포를 무혈청 RPMI 배지 중에서 0.2 μM 셀 트래커 그린 (Cat# C7025)으로 10분 동안 표지하였다. 표적 세포 daudi 또는 대식세포를 0.5 uM 셀 트래커 레드 (Cat# C34552)로 10분 동안 표지하였다. 이펙터 대식세포 (녹색)는 영상화 1일 전에 표지하여 8-웰 μ-슬라이드 (아이비디(Ibidi), cat# 80826) 상에 플레이팅한 반면에, 표적 세포는 영상화 직전에 표지하였다.
영상화를 40x/1.30 오일 Ph3 대물 렌즈를 사용하는 자이스(Zeiss) 스피닝 디스크 공초점 현미경 (악시오 옵저버(Axio Observer).Z1) 상에서 수행하였다. Z-스택 영상을 취하여 전체 세포를 영상화하였다 (측방향 해상도 ~0.5 um, 축방향 해상도 ~ 2 um). 레이저 파워를 각각 405 nm (시톡스(SYTOX)® 청색), 488 nm (셀트래커™ 그린 CMFDA 염료), 561nm (셀트래커™ 레드 CMTPX 염료) 및 633nm (항체 표지된 알렉사-647) 레이저에 대해 3.00%, 3.50%, 5.80% 및 4.00%로 설정하였다. 카메라 노출을 각각 405 nm, 488 nm, 561nm, 및 633 nm 채널에 대해 30ms, 40ms, 60ms, 및 35ms 노출로 설정하였다. 현미경 인큐베이터를 사용하여 전체 영상화 시간 동안 5% CO2 하에 37℃에서 세포를 유지하였다. 영상을 4시간에 걸쳐 10분 간격으로 웰당 4개의 위치에 대해 획득하였다. 모든 영상 획득 및 영상 처리를 젠 블루(Zen Blue) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 포식된 세포의 수를 정량화하기 위해 셀트래커™ 레드 CMTPX 표지된 Daudi 세포 또는 대식세포를 최대 240분 동안 (24개의 시점) 프레임 단위로 수동으로 계수하였다. 이어서, 프레임당 포식된 세포의 백분율을 계산하였다. 최종적으로, 웰당 3-4개의 위치의 시점당 백분율을 평균을 구해 처리 웰당 식세포작용의 평균 백분율을 수득하였다. 도 38에 제시된 모든 데이터는 각각의 처리 조건에 대한 웰당 4개의 위치의 반복을 나타낸다.
적색-표지된 Daudi 세포는 녹색 대식세포에 의해 효율적으로 포식되었다 (30분 내에 80% 및 60분에 95%에 도달함). 본 발명자들은 4시간 실험 동안 서로에 의해 포식된 대식세포의 최소한의 수를 검출하였고, 비-푸코실화 NOV2108이 첨가된 웰과 IgG 대조군이 첨가된 웰 사이에 차이는 없었다.
실시예 32: Cd32b에 대한 항-Cd32b Ab의 결합 친화도
바이오센서 상에 공유 고정된 IgG 및 분석물로서 사용되는 huCD32b 수용체를 사용하는 3개의 비의존성 직접적인 결합 검정을 수행하여 huCD32b에 대한 IgG의 결합 친화도를 결정하였다. 동역학적 데이터를 모든 유동 세포에 대한 일련의 분석 희석물의 후속 주사에 의해 획득하였다. 유동 세포 1 (칩 1)은 참조로서 사용되었다.
550 RU의 비-푸코실화 NOV2108 및 Fc 침묵 NOV2108 [N297A]을 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다. 추가적으로, Fc 부분을 통한 CD32b에 대한 결합을 배제하기 위한, 음성 대조군으로서 사용된, 침묵 항-닭-리소자임-hIgG1 [N297A]을 칩 상에 고정시켰다. 러닝 완충제 중 huCD32b-탈글리코의 일련의 희석물, 0.61-5000 nM (일련의 1:2 희석물)을 표면 상에 주입하였다 (유량: 30 μl/분, 회합 시간: 60초, 해리 시간: 120초). 칩 표면을 각각의 분석물 주사 전에 1회의 기본 세척 단계로 재생시켰다 (30 μl/분; 접촉 시간: 30초, 안정화 기간: 250초). 데이터를 비아코어 T200 평가 소프트웨어 버전 1.0을 사용하여 평가하였다. 미가공 데이터를 이중 참조하고, 즉 측정 중인 유동 세포의 반응을 참조 유동 세포의 반응에 대해 보정하고, 제2 단계에서 블랭크 주사의 반응을 차감하였다. 필요한 경우에, 이상치 센소그램을 제거하였다. 센소그램을 1:1 결합 모델을 적용함으로써 피팅하여 동역학적 속도 상수 및 해리 평형 상수를 계산하였다. Rmax를 전반적으로 설정한 반면에, RI는 국부로 피팅하였다. 데이터를 각각의 실행에 대해 개별적으로 처리하였다. 생성된 값을 사용하여 각각의 동역학적 상수의 평균 값 및 표준 편차를 계산하였다.
NOV2108의 Fc 침묵 버전 (N297A)은 18 ± 3 nM의 KD로 CD32b에 결합한다 (표 6 참조). NOV2108 (비-푸코실화 포맷)은 단일 실험에서 16 nM의 KD로 Fc 침묵 NOV2108과 유사한 친화도를 나타냈다. 인간 CD32b에 대한 침묵 항-닭-리소자임 IgG의 상호작용에 대해 관찰된 결합은 없었다. 따라서, Fc 부분을 통한 CD32b에 대한 결합은 배제될 수 있다.
표 6: 항체-CD32b 상호작용의 회합률 상수, 해리율 상수 및 해리 평형 상수.
Figure pct00074
실시예 33: NOV2108의 비-푸코실화는 증진된 B 세포 사멸을 촉진하고 단핵구 및 과립구의 생존율을 유지한다.
인간 전혈에서의 Fc wt 및 비-푸코실화 항-hu CD32b 반응성 mAb NOV2108에 의해 유도된 사멸 선택성의 평가
CD32a/b-양성 면역 세포 하위세트의 사멸을 유도하는 Fc wt 및 비-푸코실화 항-hu CD32b mAb NOV2108의 잠재력을 인간 전혈에서 평가하였다. 다양한 농도의 시험 및 대조군 항체 (매칭된 이소형의 Fc WT 및 비-푸코실화 (afuc))를 24시간 동안 10명의 상이한 건강한 공여자로부터의 헤파린처리된 전혈과 함께 인큐베이션하였다. B 세포, 단핵구 및 과립구의 절대 수를 생존율 염료를 사용하여 사멸 세포의 배제 후 CD19, CD14 및 CD45에 대한 마커 항체로의 자극된 전혈의 면역표현형결정 후에 유동 세포측정기 상에서 측정하였다. 고갈의 백분율을 완충제 대조군으로 측정된 절대 수와 비교하여 시험 항체에 의해 유도된 절대 수의 변화에 기초하여 계산하였다: 100 - (절대 수 (시험 조건*100/절대 수 (완충제)). NOV2108의 비-푸코실화 Fc 변이체는 Fc WT 변이체와 비교하여 전반적으로 더 강한 B 세포 사멸을 유도하였고 (도 39a) 단핵구 (도 39b) 및 과립구 (도 39c)의 생존율에 영향을 미치지 않았다.
실시예 34: Fc WT 및 Fc 변형된 항-CD32b 항체에 의한 Karpas620 암 세포주에 대한 1차 NK 세포 구동된, 특이적 ADCC 활성의 평가
1차 NK 세포 ADCC 검정을 이용하여 CD32b 양성, Karpas620 세포에 대한 CD32b 반응성 항체의 Fc 의존성 활성을 평가하였다. 간략하게, PBMC를 류코팩 (헤마케어 카탈로그# PB001F-3)으로부터 피콜 구배를 통해 단리시켰다. 이어서, NK 세포를 밀테니 비드 (카탈로그# 130-092-657)를 사용하여 음성적으로 선택한 다음, 100pg/ml의 rhIL-2 (페프로테크, 카탈로그#200-02)의 존재 하에 기본 배지 (RPMI/10%FBS/15mM HEPES/1% L-글루타민/1% 페니실린 스트렙토마이신)에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, Karpas620 세포를 칼세인 아세톡시-메틸 에스테르 (칼세인-AM; 몰레큘라 프로브스 카탈로그# C3100MP)로 염색하고, 2회 세척하고, 웰당 10,000개의 세포의 농도로 96-웰 U-바닥 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 이어서, 세포를 20분 동안 항체의 연속 희석물과 함께 사전-인큐베이션한 후, 이펙터 세포를 5:1의 이펙터 대 표적 비로 첨가하였다. 공동-인큐베이션 후, 마이크로타이터 플레이트를 원심분리하고 상청액 유체의 분취물을 또 다른 마이크로타이터 플레이트 (코닝 코스타, 카탈로그 # 3904)로 옮기고 용액 중 유리 칼세인의 농도를 형광 계수기 (엔비전, 퍼킨 엘머)로 결정하였다. 표적 세포 단독 및 1% 트리톤 (시그마, 93443)을 포함하는 표적 세포를 대조군으로서 포함시켰다. 표적 세포 단독은 자발적 방출로서 사용된 한편, 1% 트리톤을 포함하는 표적 세포는 최대 방출로서 사용되었다. 퍼센트 특이적 표적 세포 용해를 하기 식을 사용하여 계산하였다: [(샘플 - 자발적 방출)/(최대 방출-자발적 방출)] x100%.
항-CD32b 항체 NOV2108의 3개의 버전을 시험하였다: Fc WT, 비-푸코실화 (Fc-증진됨) 및 N297A (Fc-침묵). Fc WT NOV2108은 Karpas620 세포에 대한 효율적인 ADCC를 매개하고, 활성은 비-푸코실화 NOV2108에 의해 증진되었다 (도 40). 예상된 바와 같이, NOV2108의 Fc 침묵 N297A 버전은 IgG 이소형만큼 불활성이었고, 이는 NK 세포 활성화 및 MM 세포 용해가 기능적 Fc를 필요로 한다는 것을 확인시켜 준다.
실시예 35: 레날리도미드로 사전처리된 PBMC는 NOV1216-afuc의 ADCC 활성을 강화한다.
면역-조정 약물인 레날리도미드 (LEN)는 림프구 기능의 항종양 효과를 조정할 수 있고, 이는 이어서 NK 세포를 활성화시키고 세포독성을 증가시킨다. LEN이 ADCC 활성을 강화할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, PBMC 또는 T 세포 고갈된 PBMC를 이펙터 세포로서 사용하고 Daudi를 표적으로서 사용하였다. 간략하게, PBMC를 류코팩 (헤마케어 카탈로그# PB001F-3)으로부터 피콜 구배를 통해 단리시켰다. T 세포를 CD3 비드 (밀테니, 카탈로그# 130-050-101)를 사용함으로써 PBMC로부터 양성적으로 고갈시켰다. PBMC 또는 T 세포 고갈된 PBMC를 3 μM LEN 또는 동등 부피의 DMSO (모의)가 보충된, 재조합 IL-2가 없는 기본 배지 (RPMI/10%FBS/15mM HEPES/1% L-글루타민/1% 페니실린 스트렙토마이신)에서 72시간 동안 인큐베이션한 후에, NK 세포 단리 및 ADCC 검정 (실시예 17에 기재된 바와 같음)을 수행하였다. LEN으로 사전처리된 PBMC로부터 단리된 NK 세포는 항-CD32b Ab 비-푸코실화 NOV1216의 존재 하에 모의 처리된 PBMC로부터의 NK 세포보다 Daudi 세포에 대한 더 높은 ADCC 활성을 나타냈다 (도 41). 이 데이터는 CD32b+ 림프종 및 골수종의 치료에 있어서의 항-CD32b 항체와 레날리도미드의 조합에 대한 지지를 제공한다.
LEN이 T 세포를 활성화시키고 T 세포에 의한 IL-2 분비를 증가시킬 수 있고, 이는 이어서 NK 세포를 활성화시킨다는 것이 제안되었다. 따라서 본 발명자들은 단리 시 PBMC로부터 T 세포를 고갈시키고 LEN을 사용한 72시간 사전처리를 반복하였다. T-세포 고갈 단독은 모의-처리된 PBMC로부터 단리된 NK 세포에 의한 NOV1216-매개 ADCC 활성에 대한 최소 효과를 가졌다. 단지 NK 세포만을 이펙터 세포로서 ADCC 검정에 사용하였고, 따라서 NK 세포 활성에 대한 LEN의 직접적인 효과는 유의하지 않다. 그러나, PBMC의 LEN 사전처리에 의해 증진된 ADCC 활성은 T 세포를 LEN 처리 전에 고갈시키는 경우에 크게 제거되었고, 이는 LEN에 대한 반응 및 NK 세포의 활성화에 있어서의 T 세포의 중요한 역할을 지지한다.
실시예 36: CD32b 낮은 KMS-12-BM 피하 이종이식편을 보유하는 마우스에서의 항-CD32b eADCC Fc 돌연변이 항체와 HDAC 억제제 파노비노스타트의 조합과 연관된 생체내 활성
이 실시예는 CD32b 낮은 MM 이종이식편 KMS-12-BM을 보유하는 마우스에서의 eADCC Fc 돌연변이체 CD32b 표적화된 항체와 시판 HDAC 억제제 파노비노스타트의 조합의 치료 이익을 조사한다.
KMS-12-BM 세포주 상의 CD32b 발현의 수준을 유동 세포측정법을 통해 2B6 항체를 사용하여 결정하였다. KMS-12-BM 세포를 계수하고 ml당 1x106개의 세포로 FACS 완충제 (2%FBS를 함유하는 PBS1x) 중에 현탁시켰다. 이어서, 200'000개 세포/웰 (200μl)을 U-바닥 96 웰 플레이트에 분배하였다. 플레이트를 1200 rpm에서 5분 동안 회전시키고 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 1ug/ml의 2B6 항체 또는 IgG 대조군을 함유하는 100 μl의 FACS 완충제 중에 현탁시키고 4℃에서 30분 인큐베이션하였다. FACS 완충제로 2회 연속 세척한 후, 세포를 120 μl FACS 완충제 중에 현탁시키고 FACS 포르테사 상에서 획득하였다. FACS 히스토그램은 기록된 사건의 수 (y-축)에 대한 MFI로서의 염색의 상대적 수준 (x-축)을 나타낸다. 항-CD32b mAb에 의한 염색 (실선)은 IgG 대조군의 것 (채워진 점선)과 오버레이된다 (도 42). 이들 데이터는 KMS-12-BM이 CD32b를 거의 발현하지 않는다는 것을 입증한다.
암컷 누드 마우스에게 PBS로 희석된 50% 페놀 레드-무함유 매트리겔 (비디 바이오사이언시스) 중에 현탁시킨 10x106개의 KMS-12-BM 세포 (100 μl 주사 부피)를 피하로 이식하였다. 마우스를 이식후 제7일에 210 mm3의 평균 종양 부피에서 연구에 등록시켰다. 4개의 실험군 (n = 7/군) 중 1개에 무작위로 할당한 후, 마우스에게 하기 처리를 정맥내로 투여하였다: (1) PBS, (2) NOV2108 (eADCC 마우스 IgG2a (S239D/I332E), 10 mg/kg q2w), (3) 파노비노스타트 (14일 사이클에서의 12 mg/kg q2d*5에 이어서 4일 중단), 및 상기 언급된 용량 및 스케줄에서의 (1) + (3)의 조합. 종양 부담 및 체중을 1주에 2회 평가하였다. 800 mm3에 도달한 종양으로 정의된 종점까지의 시간을 또한 평가하였다. NOV2108의 eADCC 마우스 IgG2a 버전을 이용하여 치료 Ab Fc와 마우스 면역 이펙터 세포 상의 FcγR 사이의 최적 상호작용과 연관된 치료 잠재력을 반영하였다.
NOV2108 (eADCC Fc 돌연변이체 마우스 IgG2a) 및 파노비노스타트의 단일 작용제 처리는 평균 종양 부피에 대한 제한된 영향을 가졌다 (도 43). 이들 2종의 처리의 조합은 증가된 항종양 활성을 일으켰다. 구체적으로, 조합 처리는 단일 작용제 군보다 더 유의한 (P < 0.05) 항종양 활성 (퍼센트 종양 부피 변화)을 가져왔다 (제28일은 모든 3개의 실험군이 처리 상에 남아있는 최종 포인트를 나타냄). 조합은 또한 종점 (800 mm3)까지의 시간을 증가시켰다. 이들 데이터는 HDAC 억제제 파노비노스타트가 CD32b 낮은 MM 이종이식편을 CD32b 표적화된 NOV2108 (eADCC Fc 돌연변이체 마우스 IgG2a)에 대해 감작화시켰다는 것을 나타낸다. 데이터는 MM을 갖는 환자에서 항-CD32b 표적화된 항체와 HDAC 억제제, 예를 들어 파노비노스타트의 조합을 시험하는 것에 대한 근거를 제공한다.
실시예 37: DAUDI 이종이식편을 보유하는 누드 마우스에서의 비-푸코실화 항-CD32B 항체 NOV2108의 용량 반응 생체내 활성
생체내 효능 실험을 피하 Daudi 이종이식편을 보유하는 누드 마우스에서 수행하여 비-푸코실화 항-CD32b NOV2108 인간 IgG1의 용량 의존성 항종양 활성을 조사하였다. NOV1216을 또한 이 실험에 eADCC Fc 돌연변이체 (S239D/I332E) 마우스 IgG2a 프레임워크로서 포함시켰다. 암컷 누드 마우스에게 PBS로 희석된 50% 페놀 레드-무함유 매트리겔 (비디 바이오사이언시스) 중에 현탁시킨 5x106개의 Daudi 세포 (100 μl 주사 부피)를 피하로 이식하였다. 마우스를 이식후 제10일에 대략 220 mm3의 평균 종양 부피에서 연구에 등록시켰다. 6개의 실험군 (n = 7/군) 중 1개에 무작위로 할당한 후, 마우스에게 하기 처리를 정맥내로 투여하였다: (1) PBS, (2) 비-표적화 비-푸코실화 이소형 대조군 (30 mg/kg qw), (3) 비-푸코실화 NOV2108 (3 mg/kg qw), (4) 비-푸코실화 NOV2108 (10 mg/kg qw), (5) 비-푸코실화 NOV2108 (30 mg/kg qw), 및 (6) eADCC Fc 돌연변이체 마우스 IgG2a NOV1216 (10 mg/kg q3w). 종양 부피 및 체중을 1주에 2회 평가하였다. NOV1216의 eADCC 마우스 IgG2a 버전을 이용하여 치료 Ab Fc와 마우스 면역 이펙터 세포 상의 FcγR 사이의 최적 상호작용과 연관된 치료 잠재력을 반영하였다.
비-푸코실화 NOV2108은 피하로 생착된 Daudi 이종이식편을 보유하는 마우스에서의 용량 의존성 항종양 활성을 입증하였다 (도 44). NOV1216 eADCC mIgG2a 군으로부터의 한 마리의 마우스는 처리에 대해 반응하는 것에 실패하였고 제28일에 과도한 종양 부피로 인해 연구로부터 제외되었다. 3 mg/kg qw 용량이 투여된 마우스의 종양 성장은 PBS 또는 비-표적화 대조군 항체 (30 mg/kg qw)가 투여된 마우스의 것과 구별가능하지 않았다. 그러나, 10 또는 30 mg/kg qw 투여된 비-푸코실화 NOV2108은 현저한 종양 성장 억제를 가져왔다. eADCC Fc 돌연변이체 마우스 IgG2a로서 투여된, NOV2108의 것과 고도로 유사한 가변 영역을 갖는, NOV1216은 훨씬 더 높은 용량 (30 mg/kg qw)으로 투여된 비-푸코실화 NOV2108에 의해 관찰된 것과 거의 유사한 현저한 항종양 활성을 가져왔다. 이들 데이터는 숙주 면역 이펙터 세포 FcγR과 치료 mAb Fc 영역 사이의 최적 상호작용과 연관된 치료 이익을 강조한다.
실시예 38: KARPAS620 MM 피하 이종이식편을 보유하는 누드 마우스에서의 비푸코실화 NOV2108의 항종양 활성
생체내 효능 실험을 피하 KARPAS620 MM 이종이식편을 보유하는 누드 마우스에서 수행하여 비-푸코실화 항-CD32b NOV2108 인간 IgG1의 용량 의존성 항종양 활성을 조사하였다. 암컷 누드 마우스에게 PBS로 희석된 50% 페놀 레드-무함유 매트리겔 (비디 바이오사이언시스) 중에 현탁시킨 1x107개의 KARPAS620 세포 (100 μl 주사 부피)를 피하로 이식하였다. 마우스를 이식후 제10일에 대략 220 mm3의 평균 종양 부피에서 연구에 등록시켰다. 3개의 실험군 (n = 8/군) 중 1개에 무작위로 할당한 후, 마우스에게 하기 처리를 정맥내로 투여하였다: (1) PBS, (2) 비-푸코실화 NOV2108 (10 mg/kg qw), 및 (3) 비-푸코실화 NOV2108 (30 mg/kg qw). 종양 부피 및 체중을 1주에 2회 평가하였다.
비-푸코실화 NOV2108는 피하로 생착된 KARPAS620 이종이식편을 보유하는 마우스에서 현저한 항종양 활성을 입증하였다 (도 45). 유사한 항종양 활성이 용량 수준 모두에서 관찰되었고, 이는 이것이 달성가능한 최대 항종양 활성일 수 있다는 것을 시사한다. 이들 데이터는 비-푸코실화 NOV2108이 MM을 갖는 환자에서 가질 수 있는 치료 이익에 대한 증거를 제공한다.
실시예 39: DAUDI 이종이식편을 보유하는 누드 마우스에서의 종양내 대식세포 함량에 대한 eADCC Fc 돌연변이체 NOV2108의 정맥내 투여의 영향.
생체내 실험을 피하 Daudi 이종이식편을 보유하는 누드 마우스에서 수행하여 F4/80 IHC 양성에 의해 결정된 바와 같은 종양내 대식세포 함량에 대한 eADCC Fc 돌연변이체 NOV2108 (S239D/A330L/I332E)의 정맥내 투여의 영향을 조사하였다. 암컷 누드 마우스에게 PBS로 희석된 50% 페놀 레드-무함유 매트리겔 (비디 바이오사이언시스) 중에 현탁시킨 5x106개의 Daudi 세포 (100 μl 주사 부피)를 피하로 이식하였다. 마우스를 이식후 제10일에 대략 200 mm3의 평균 종양 부피에서 연구에 등록시켰다. 실험은 2개의 부분으로 이루어졌다. 제1 코호트 (n=3/군)는 (1) PBS, (2) eADCC Fc 돌연변이체 비-표적화 이소형 대조군 10 mg/kg qw*2, 또는 (3) eADCC Fc 돌연변이체 NOV2108 10 mg/kg qw*2를 받았다. 종양을 수집하고 제2 투여후 제3일 (제1 투여후 제10일)에 IHC를 통해 F4/80 면역반응성에 대해 평가하였다. 제2 코호트는 eADCC Fc 돌연변이체 NOV2108의 단일 정맥내 용량을 받았다. 종양을 후속적으로 수집하고 투여후 제7일, 제10일, 제14일, 및 제21일 (시점당 n=3)에 IHC를 통해 F4/80 면역반응성에 대해 평가하였다.
각각의 미리 결정된 시점에, 종양을 즉시 절제하고, 10% 완충 포르말린에 24시간 동안 고정시키고 처리 (상용 조직학적 절차를 사용하여 파라핀에 포매하고; 조직 절편을 3.5um로 절단함)까지 70% EtOH로 옮겼다. 토끼 모노클로날 항-마우스 F4/80 IgG (클론 SP115; 스프링 바이오사이언스(Spring Bioscience))를 사용하였다. 정상 마우스 림프 조직은 양성 대조군으로서 사용되었다.
최적화된 IHC 프로토콜 (벤타나(Ventana) 비오틴-무함유 DAB 검출 시스템; 벤타나 디스커버리(DISCOVERY) XT 바이오마커 플랫폼)은 벤타나 셀 컨디셔닝 #1 항원 회복 시약에 대한 표준 노출을 포함하였다. 1차 항체를 다코 시토메이션(DAKO Cytomation) 항체 희석제 중에 1:200의 농도로 희석하고, 100 μl 부피로 적용하고 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 벤타나 옴니맵(Ventana OmniMap) 사전희석된 HRP-접합된 항-토끼 2차 항체 (Cat #760-4311)와의 후속 인큐베이션을 4분 동안 수행하였다. 이어서, 제2 항체를 크로모맵(ChromoMap) DAB 키트를 사용하여 검출하고 슬라이드를 벤타나 헤마톡실린으로 4분 동안, 이어서 벤타나 블루잉(Ventana Bluing) 시약으로 4분 동안 대조염색하였다. 슬라이드를 증가하는 농도의 에탄올 (95-100%) 중에서, 이어서 크실렌 중에서 탈수시키고, 이어서 커퍼슬립으로 덮었다. 커버슬립으로 덮은 슬라이드를 광 현미경검사에 의해 평가하고 라이카(Leica)/아페리오 스캔스코프(Aperio ScanScope) 슬라이드 스캐너 (캘리포니아주 비스타)에 의해 스캐닝하였다. 이어서, 디지털 영상을 관찰하고 라이카 이슬라이드 매니저/아페리오 스펙트럼으로부터 영상을 실행하는 인디카 랩스 할로(Indica Labs HALO) (뉴멕시코주 코랄레스)에 의해 분석하였다. 대표적인 조직학적 영상을 인디카 랩스 할로 (뉴멕시코주 코랄레스) 내의 도면 메이커 모듈을 사용하여 포획하였다. 염색된 슬라이드의 스캐닝된 영상을 라이카 이슬라이드 매니저/아페리오 스펙트럼 (캘리포니아주 비스타)으로부터 열리는 인디카 랩스 할로 (뉴멕시코주 코랄레스)에서 실행하였다. 데이터는 퍼센트 양성 조직으로서 나타내어진다.
PBS 처리된 대조군에 비해, eADCC Fc 돌연변이체 NOV2108은 10 mg/kg qw*2 투여 요법 후 제3일에 DAUDI 이종이식편에서의 F4/80 면역반응성의 증가를 일으켰다 (도 46). 이 도면에서, 빈 형상은 한 마리의 동물로부터의 데이터를 나타내는 반면에, 채워진 형상은 처리를 나타낸다. 이들 데이터는 eADCC Fc 돌연변이체 NOV2108의 i.v. 투여가 종양내 대식세포 수의 증가를 일으킨다는 것을 나타낸다. 이는 비-표적화 eADCC Fc 돌연변이체 음성 대조군 항체가 투여된 마우스에서 관찰되지 않았고, 이는 Daudi 세포 상의 CD32b에 대한 CDR 매개 결합이 대식세포를 종양으로 동원하는 것을 필요로 한다는 것을 확인시켜 준다. 추가적으로, 단일 10 mg/kg 정맥내 용량으로서 투여된 경우에, eADCC Fc 돌연변이체 NOV2108은 투여후 제7일에 종양내 대식세포 수의 증가를 가져왔다. 종양내 대식세포 함량은 후속 시점에서 저하되었고, 이는 투여후 나중 시점에서 투여전 수준에 가깝다. 이들 데이터는 생체내에서 eADCC Fc 돌연변이체 NOV2108의 Fc 및 CDR 의존성 활성을 매개하는 데 있어서의 마우스 대식세포의 역할을 지지한다. 데이터는 또한 용량 스케줄링을 안내하기 위한 바이오마커로서 종양내 면역 세포 침윤물을 사용하는 것에 대한 근거를 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야에 친숙한 전문가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
달리 나타내지 않는 한, 상세하게 구체적으로 기재되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있고 수행되어 왔다. 참조는 예를 들어 표준 핸드북 및 본원에 언급된 일반적인 배경기술에 대해 및 그에 인용된 추가의 참고문헌에 대해 다시 이루어진다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 인용된 참고문헌은 각각 그 전문이 참조로 포함된다.
본 발명에 대한 청구범위는 비-제한적이고, 하기 제공된다.
특정한 측면 및 청구범위가 본원에 상세하게 개시되어 있지만, 이는 단지 예시의 목적으로 예로서 행해진 것이며, 첨부된 청구범위의 범주, 또는 임의의 상응하는 추후 출원의 청구범위의 주제의 범주와 관련하여 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 특히, 본 발명자들은 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 개시내용의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서, 본 개시내용에 다양한 치환, 변경, 및 변형이 이루어질 수 있다는 것을 고려한다. 핵산 출발 물질, 관심 클론, 또는 라이브러리 유형의 선택은 본원에 기재된 측면의 지식을 갖는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일상적인 문제인 것으로 여겨진다. 다른 측면, 이점, 및 변형이 하기 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험을 넘어서지 않고 이를 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 측면의 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다. 다양한 국가의 특허법에 의한 제한으로 인해 이후 출원되는 상응하는 출원의 청구 범위가 고쳐질 수 있으며, 이를 청구 대상을 포기하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
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Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 217 Glu Ser Ile Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 218 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 218 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Thr His 20 25 30 Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Ala Ser Glu Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Ile Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 219 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 219 caggtgcagc tgctggaatc aggcggcgga ctggtgcagc 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gcctcgagtg gatgggcggt atcatcccgg ctttcggcac tgcgaactac 180 gcccagaaat ttcagggccg ggtgaccatt accgccgatg aaagcaccag caccgcctat 240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgaacag 300 agcccggaat acggttacgg tggttacccg tatgaagcta tggatgtttg gggccaaggc 360 accctggtga ctgttagctc agcctccacc aagggtccat cggtcttccc cctggcaccc 420 tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 480 cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 540 ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 600 agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 660 gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 720 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 780 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 840 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 900 ccgcgggagg agcagtacgc cagcacgtac cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 960 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1020 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1080 ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1140 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1200 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1260 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1320 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 1371 <210> 664 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 664 Ser Gly Asp Asn Ile Pro Gln His Ser Val His 1 5 10 <210> 665 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 665 Asp Asp Thr Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 666 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 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agctacgaac tgacccagcc gctgagcgtg agcgtggccc tgggccagac cgcgaggatt 60 acctgtagcg gcgataacat cccgcagcat tctgttcatt ggtaccagca gaaaccgggc 120 caggcgccgg tgctggtgat ctacgacgac actgaacgtc cgagcggcat cccggaacgt 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcagggc ccaggcgggc 240 gacgaagcgg attattactg ctcttcttgg gactcttcta tggactctgt tgtgtttggc 300 ggcggcacga agttaaccgt ccta 324 <210> 675 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 675 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Pro Gln His Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Ser Ser Met Asp Ser 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly 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attattactg ctcttcttgg gactcttcta tggactctgt tgtgtttggc 300 ggcggcacga agttaaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360 ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 540 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642 <210> 677 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 677 Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp 20 25 30 Ser Gln Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro 35 40 45 Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly 50 55 60 Ala Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn 65 70 75 80 Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn 85 90 95 Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr 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Claims (67)

  1. (a) 서열식별번호: 1, 4, 7, 53, 56, 59, 105, 108, 111, 157, 160, 163, 209, 212, 215, 261, 264, 267, 313, 316, 319, 365, 368, 371, 417, 420, 423, 469, 472, 475, 521, 524, 527, 547, 550, 553, 573, 576, 579, 625, 628, 및 631 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열식별번호: 2, 5, 8, 54, 57, 60, 106, 109, 112, 158, 161, 164, 210, 213, 216, 262, 265, 268, 314, 317, 320, 366, 369, 372, 418, 421; 424, 470, 473, 476, 522, 525, 528, 548, 551, 554, 574, 577, 580, 626, 629, 및 632 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열식별번호: 3, 6, 9, 55, 58, 61, 107, 110, 113, 159, 162, 165, 211, 214, 217, 263, 266, 269, 315, 318, 321, 367, 370, 373, 419, 422, 425, 471, 474, 477, 523, 526, 529, 549, 552, 555, 575, 578, 581, 627, 630, 및 633 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열식별번호: 14, 17, 20, 66, 69, 72, 118, 121, 124, 170, 173, 176, 222, 225, 228, 274, 277, 280, 326, 329, 332, 378, 381, 384, 430, 433, 436, 482, 485, 488, 534, 537, 540, 560, 563, 566, 586, 589, 592, 638, 641, 644 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열식별번호: 15, 18, 21, 67, 70, 73, 119, 122, 125, 171, 174, 177, 223, 226, 229, 275, 278, 281, 327, 330, 333, 379, 382, 385, 431, 434, 437, 483, 486, 489, 535, 538, 541, 561, 564, 567, 587, 590, 593, 639, 642, 및 645 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열식별번호: 16, 19, 22, 68, 71, 74, 120, 123, 126, 172, 175, 178, 224, 227, 230, 276, 279, 282, 328, 331, 334, 380, 383, 386, 432, 435, 438, 484, 487, 490, 536, 539, 542, 562, 565, 568, 588, 591, 594, 640, 643, 및 646 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 항체는 인간 CD32b에 선택적으로 결합하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 10, 62, 114, 166, 218, 270, 322, 374, 426, 478, 530, 556, 582, 및 634 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 23, 75, 127, 179, 231, 283, 335, 387, 439, 491, 543, 569, 595, 및 647 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 12, 64, 116, 168, 220, 272, 324, 376, 428, 480, 584, 및 636 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 25, 77, 129, 181, 233, 285, 337, 389, 441, 493, 597, 및 649 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 38, 90, 142, 194, 246, 298, 350, 402, 454, 506, 532, 558, 610, 및 662 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 51, 103, 155, 207, 259, 311, 363, 415, 467, 519, 545, 571, 623, 및 675 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 항체가
    (a) 각각 서열식별번호: 1, 2, 및 3의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 14, 15, 및 16의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (b) 각각 서열식별번호: 4, 5, 및 6의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 17, 18, 및 19의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (c) 각각 서열식별번호: 7, 8, 및 9의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 20, 21, 및 22의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (d) 각각 서열식별번호: 53, 54, 및 55의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 66, 67, 및 68의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (e) 각각 서열식별번호: 56, 57, 및 58의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 69, 70, 및 71의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (f) 각각 서열식별번호: 59, 60, 및 61의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 72, 73, 및 74의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (g) 각각 서열식별번호: 105, 106, 및 107의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 118, 119, 120의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (h) 각각 서열식별번호: 108, 109, 및 110의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 121, 122, 123의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (i) 각각 서열식별번호: 111, 112, 및 113의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 124, 125, 126의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (j) 각각 서열식별번호: 157, 158, 및 159의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 170, 171, 172의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (k) 각각 서열식별번호: 160, 161, 및 162의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 173, 174, 175의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (l) 각각 서열식별번호: 163, 164, 및 165의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 176, 177, 178의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (m) 각각 서열식별번호: 209, 210, 및 211의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 222, 223, 및 224의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (n) 각각 서열식별번호: 212, 213, 및 214의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 225, 226, 및 227의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (o) 각각 서열식별번호: 215, 216, 및 217의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 228, 229, 및 230의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (p) 각각 서열식별번호: 261, 262, 및 263의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 274, 275, 및 276의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (q) 각각 서열식별번호: 264, 265, 및 266의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 277, 278, 및 279의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (r) 각각 서열식별번호: 267, 268, 및 269의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 280, 281, 및 282의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (s) 각각 서열식별번호: 313, 314, 및 315의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 326, 327, 및 328의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (t) 각각 서열식별번호: 316, 317, 및 318의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 329, 330, 및 331의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (u) 각각 서열식별번호: 319, 320, 및 321의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 332, 333, 및 334의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (v) 각각 서열식별번호: 365, 366, 및 367의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 378, 379, 및 380의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (w) 각각 서열식별번호: 368, 369, 및 370의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 381, 382, 및 383의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (x) 각각 서열식별번호: 371, 372, 및 373의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 384, 385, 및 386의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (y) 각각 서열식별번호: 417, 418, 및 419의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 430, 431, 및 432의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (z) 각각 서열식별번호: 420, 421, 및 422의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 433, 434, 및 435의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (aa) 각각 서열식별번호: 423, 424, 및 425의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 436, 437, 및 438의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (bb) 각각 서열식별번호: 469, 470, 및 471의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 482, 483, 및 484의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (cc) 각각 서열식별번호: 472, 473, 및 474의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 485, 486, 및 487의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (dd) 각각 서열식별번호: 475, 476, 및 477의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 488, 489, 및 490의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (ee) 각각 서열식별번호: 521, 522, 및 523의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 534, 535, 및 536의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (ff) 각각 서열식별번호: 524, 525, 및 526의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 537, 538, 및 539의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (gg) 각각 서열식별번호: 527, 528, 및 529의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 540, 541, 및 542의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (hh) 각각 서열식별번호: 547, 548, 및 549의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 560, 561, 및 562의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (ii) 각각 서열식별번호: 550, 551, 및 552의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 563, 564, 및 565의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (jj) 각각 서열식별번호: 553, 554, 및 555의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 566, 567, 및 568의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (kk) 각각 서열식별번호: 573, 574, 및 575의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 586, 587, 및 588의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (ll) 각각 서열식별번호: 576, 577, 및 578의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 589, 590, 및 591의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (mm) 각각 서열식별번호: 579, 580, 및 581의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 592, 593, 및 594의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (nn) 각각 서열식별번호: 625, 626, 및 627의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 638, 639, 및 640의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (oo) 각각 서열식별번호: 628, 629, 및 630의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 641, 642, 및 643의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열; 또는
    (pp) 각각 서열식별번호: 631, 632, 및 633의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 644, 645, 및 646의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열
    을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서,
    (a) 서열식별번호: 10의 VH 서열 및 서열식별번호: 23의 VL 서열;
    (b) 서열식별번호: 62의 VH 서열 및 서열식별번호: 75의 VL 서열;
    (c) 서열식별번호: 114의 VH 서열 및 서열식별번호: 127의 VL 서열;
    (d) 서열식별번호: 166의 VH 서열 및 서열식별번호: 179의 VL 서열;
    (e) 서열식별번호: 218의 VH 서열 및 서열식별번호: 231의 VL 서열;
    (f) 서열식별번호: 270의 VH 서열 및 서열식별번호: 283의 VL 서열;
    (g) 서열식별번호: 322의 VH 서열 및 서열식별번호: 335의 VL 서열;
    (h) 서열식별번호: 374의 VH 서열 및 서열식별번호: 387의 VL 서열;
    (i) 서열식별번호: 426의 VH 서열 및 서열식별번호: 439의 VL 서열;
    (j) 서열식별번호: 478의 VH 서열 및 서열식별번호: 491의 VL 서열;
    (k) 서열식별번호: 530의 VH 서열 및 서열식별번호: 543의 VL 서열;
    (l) 서열식별번호: 556의 VH 서열 및 서열식별번호: 569의 VL 서열;
    (m) 서열식별번호: 582의 VH 서열 및 서열식별번호: 595의 VL 서열; 또는
    (n) 서열식별번호: 634의 VH 서열 및 서열식별번호: 647의 VL 서열
    을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제1항에 있어서,
    (a) 서열식별번호: 12의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 25의 경쇄 서열;
    (b) 서열식별번호: 64의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 77의 경쇄 서열;
    (c) 서열식별번호: 116의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 129의 경쇄 서열;
    (d) 서열식별번호: 168의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 181의 경쇄 서열;
    (e) 서열식별번호: 220의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 233의 경쇄 서열;
    (f) 서열식별번호: 272의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 285의 경쇄 서열;
    (g) 서열식별번호: 324의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 337의 경쇄 서열;
    (h) 서열식별번호: 376의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 389의 경쇄 서열;
    (i) 서열식별번호: 428의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 441의 경쇄 서열;
    (j) 서열식별번호: 480의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 493의 경쇄 서열;
    (k) 서열식별번호: 584의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 597의 경쇄 서열; 또는
    (l) 서열식별번호: 636의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 649의 경쇄 서열
    을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 제1항에 있어서,
    (a) 서열식별번호: 38의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 51의 경쇄 서열;
    (b) 서열식별번호: 90의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 103의 경쇄 서열;
    (c) 서열식별번호: 142의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 155의 경쇄 서열;
    (d) 서열식별번호: 194의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 207의 경쇄 서열;
    (e) 서열식별번호: 246의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 259의 경쇄 서열;
    (f) 서열식별번호: 298의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 311의 경쇄 서열;
    (g) 서열식별번호: 350의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 363의 경쇄 서열;
    (h) 서열식별번호: 402의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 415의 경쇄 서열;
    (i) 서열식별번호: 454의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 467의 경쇄 서열;
    (j) 서열식별번호: 506의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 519의 경쇄 서열;
    (k) 서열식별번호: 532의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 545의 경쇄 서열;
    (l) 서열식별번호: 558의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 571의 경쇄 서열;
    (m) 서열식별번호: 610의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 623의 경쇄 서열; 또는
    (n) 서열식별번호: 662의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 675의 경쇄 서열
    을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. (a) 서열식별번호: 157, 160, 또는 163으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    (b) 서열식별번호: 158, 161, 또는 164로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
    (c) 서열식별번호: 159, 315, 367, 419, 471, 523, 549, 575, 또는 627로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
    (d) 서열식별번호: 170, 173, 또는 176으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    (e) 서열식별번호: 171, 174, 또는 177로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
    (f) 서열식별번호: 172의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
    을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. (a) 서열식별번호: 157, 160, 또는 163으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    (b) 서열식별번호: 158, 161, 또는 164로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
    (c) 아미노산 서열 EQX1PX2X3GX4GGX5PX6EAMDV (서열식별번호: 683)를 포함하며, 여기서 X1은 D 또는 S이고, X2는 E 또는 S이고, X3은 Y, F, A, 또는 S이고; X4는 Y 또는 F이고; X5는 F 또는 Y이고, X6은 Y 또는 F인 HCDR3;
    (d) 서열식별번호: 170, 173, 또는 176으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    (e) 서열식별번호: 171, 174, 또는 177로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
    (f) 서열식별번호: 172의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
    을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서,
    (a) 서열식별번호: 157, 160, 또는 163으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    (b) 서열식별번호: 158, 161, 또는 164로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
    (c) 서열식별번호: 159, 315, 367, 또는 419의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
    (d) 서열식별번호: 170, 173, 또는 176으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    (e) 서열식별번호: 171, 174, 또는 177로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
    (f) 서열식별번호: 172의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
    을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 제10항에 있어서,
    (a) 서열식별번호: 417로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    (b) 서열식별번호: 418로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
    (c) 서열식별번호: 419의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
    (d) 서열식별번호: 430으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    (e) 서열식별번호: 431로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
    (f) 서열식별번호: 432의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
    을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. (a) 서열식별번호: 417로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    (b) 서열식별번호: 418로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
    (c) 서열식별번호: 419의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
    (d) 서열식별번호: 430으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    (e) 서열식별번호: 431로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
    (f) 서열식별번호: 432의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
    을 포함하는 비-푸코실화 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, 서열식별번호: 426의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열식별번호: 441의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 비-푸코실화 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 제13항에 있어서, 서열식별번호: 428의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 441의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 비-푸코실화 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 서열식별번호: 10, 62, 114, 166, 218, 270, 322, 374, 426, 478, 530, 556, 582, 및 634로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 23, 75, 127, 179, 231, 283, 335, 387, 439, 491, 543, 569, 595, 및 647로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며; 여기서 항체는 인간 CD32b 단백질에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  17. 서열식별번호: 12, 38, 64, 90, 116, 142, 168, 194, 220, 246, 272, 298, 324, 350, 376, 402, 428, 454, 480, 506, 532, 558, 584, 610, 636, 및 662로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 25, 51, 77, 103, 129, 155, 181, 207, 233, 259, 285, 311, 337, 363, 389, 415, 441, 467, 493, 519, 545, 571, 597, 623, 649, 및 675로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며; 여기서 항체는 인간 CD32b 단백질에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  18. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항, 및 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 비-푸코실화된 것인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  19. 제1항 내지 제3항, 제5항, 제6항, 및 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 Fc 부분이 ADCC 활성을 증진시키도록 변형된 것인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD32a에 비해 인간 CD32b에 선택적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 IgG인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라, 인간화 또는 완전 인간인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 대한 인간 CD32b의 결합을 억제하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체의 성분인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  26. 항체의 하나의 아암이 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 중 어느 것을 포함하는 것인 다가 항체.
  27. 제26항에 있어서, 이중특이적 항체인 다가 항체.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제26항 또는 제27항의 다가 항체를 세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 1종 이상의 추가의 항체와 조합하여 포함하는 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 세포 표면 항원 및 CD32b가 B 세포 상에서 공동-발현되는 것인 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 세포 표면 항원이 CD20, CD38, CD52, CS1/SLAMF7, CD56, CD138, KiR, CD19, CD40, Thy-1, Ly-6, CD49, Fas, Cd95, APO-1, EGFR, HER2, CXCR4, HLA 분자, GM1, CD22, CD23, CD80, CD74, 또는 DRD로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  31. 제28항에 있어서, 세포 표면 항원이 CD20, CD38, CS1/SLAMF7 및 CD52로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  32. 제28항에 있어서, 추가의 항체가 리툭시맙, 엘로투주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 다라투무맙, 및 알렘투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  33. 제28항에 있어서, 추가의 치료 화합물을 추가로 포함하는 조성물.
  34. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제26항 또는 제27항의 다가 항체를 추가의 치료 화합물과 조합하여 포함하는 조성물.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 추가의 치료 화합물이 면역조정제인 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 면역조정제가 IL15이거나 또는 면역조정제가 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83 리간드, 및 STING로부터 선택된 공동자극 분자의 효능제인 조성물.
  37. 제35항에 있어서, 면역조정제가 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR 베타, 및 IDO로부터 선택된 표적의 억제제 분자인 조성물.
  38. 제34항에 있어서, 추가의 치료 화합물이 오파투무맙, 이브루티닙, 벨리노스타트, 로미뎁신, 브렌툭시맙 베도틴, 오비누투주맙, 프랄라트렉세이트, 펜토스타틴, 덱사메타손, 이델라리십, 익사조밉, 리포솜 독소루비신, 포말리도미드, 파노비노스타트, 엘로투주맙, 다라투무맙, 알렘투주맙, 탈리도미드, 및 레날리도미드로부터 선택된 것인 조성물.
  39. 제33항에 있어서, 추가의 치료 화합물이 이브루티닙, 벨리노스타트, 로미뎁신, 브렌툭시맙 베도틴, 프랄라트렉세이트, 펜토스타틴, 덱사메타손, 이델라리십, 익사조밉, 리포솜 독소루비신, 포말리도미드, 파노비노스타트, 탈리도미드, 및 레날리도미드로부터 선택된 것인 조성물
  40. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제26항 또는 제27항의 다가 항체, 또는 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조성물, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  41. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제26항 또는 제27항의 다가 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  42. CD32b-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 제26항 또는 제27항의 다가 항체, 또는 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 CD32b-관련 상태를 치료하는 방법.
  43. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, CD32b-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 CD32b-관련 상태를 치료하는 데 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 다가 항체, 또는 조성물.
  44. CD32b-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 CD32b-관련 상태를 치료하기 위한, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 제26항 또는 제27항의 다가 항체, 또는 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  45. CD32b-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 CD32b-관련 상태의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제26항 또는 제27항의 다가 항체, 또는 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, CD32b-관련 상태가 B 세포 악성종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 미만성 대 B 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 소림프구성 림프종, 미만성 소분할 세포 림프종, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 여포성 림프종, 또는 전신 경쇄 아밀로이드증으로부터 선택된 것인 방법, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 용도.
  47. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산.
  48. 제47항의 핵산을 포함하는 벡터.
  49. 제47항의 핵산 또는 제48항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  50. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생산하는 방법이며, 항체를 코딩하는 핵산을 발현하는 숙주 세포를 배양하고; 배양물로부터 항체를 수집하는 것을 포함하는 방법.
  51. 표 1에 열거된 CDR을 포함하는 인간 CD32b 항체에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  52. 세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 항체를 사용하는 치료에 저항성 또는 불응성인 환자를 치료하는 방법이며, 항체를 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 단리된 항-CD32b 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제26항 또는 제27항의 다가 항체 중 어느 하나와 함께 공-투여하는 것을 포함하는 방법.
  53. 세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 항체를 항-Cd32b 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 공-투여하는 것을 포함하는, 세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 항체를 사용하는 치료에 저항성 또는 불응성인 환자의 치료를 위한, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 단리된 항-CD32b 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제26항 또는 제27항의 다가 항체 중 어느 하나의 용도.
  54. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 항체를 항-CD32b 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 공-투여하는 것을 포함하는, 세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 세포 표면 항원에 결합하는 항체를 사용하는 치료에 저항성 또는 불응성인 환자의 치료를 위한 단리된 항-CD32b 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 다가 항체.
  55. CD32b의 Fc 결합 도메인 내에서 CD32b에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  56. 제55항에 있어서, 항체가 CD32b의 아미노산 잔기 107-123 (VLRCHSWKDKPLVKVTF (서열식별번호: 685)) 내에서 결합하는 것인 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
  57. 제55항에 있어서, 항체가 B-세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 종양 항원에 결합하는 제2 항체의 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 대한 CD32b 결합을 방지하거나 또는 감소시키는 것인 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
  58. 제57항에 있어서, 제2 항체가 CD20, CD38, CD52, CS1/SLAMF7, CD56, CD138, KiR, CD19, CD40, Thy-1, Ly-6, CD49, Fas, Cd95, APO-1, EGFR, HER2, CXCR4, HLA 분자, GM1, CD22, CD23, CD80, CD74, 또는 DRD로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원에 결합하는 것인 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
  59. 제57항에 있어서, 제2 항체가 CD20, CD38, CS1/SLAMF7 및 CD52로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원에 결합하는 것인 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
  60. 제57항에 있어서, 제2 항체가 리툭시맙, 엘로투주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 다라투무맙, 및 알렘투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
  61. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
  62. CD32b에 특이적으로 결합하고, B-세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 종양 항원에 결합하는 제2 항체에 의해 매개되는 CD32b 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM) 신호전달을 억제하거나 또는 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  63. CD32b의 Fc 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 것을 포함하는, B-세포 상에서 CD32b와 공동-발현되는 종양 항원에 결합하는 치료 항체의 투여에 의해 유도되는 CD32b ITIM 신호전달을 억제하거나 또는 감소시키는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 ITIM 신호전달을 자극시키지 않는 것인 방법.
  65. 제63항에 있어서, 치료 항체가 CD20, CD38, CD52, CS1/SLAMF7, CD56, CD138, KiR, CD19, CD40, Thy-1, Ly-6, CD49, Fas, Cd95, APO-1, EGFR, HER2, CXCR4, HLA 분자, GM1, CD22, CD23, CD80, CD74, 또는 DRD로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원에 결합하는 것인 방법.
  66. 제63항에 있어서, 치료 항체가 CD20, CD38, CS1/SLAMF7 및 CD52로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원에 결합하는 것인 방법.
  67. 제63항에 있어서, 치료 항체가 리툭시맙, 엘로투주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 다라투무맙, 및 알렘투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
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