CN109195987B - 针对IL7受体胞外域的α链的非拮抗性抗体及其在癌症治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对白细胞介素7(IL‑7)受体的α链的胞外域的人源化抗体，尤其是在人细胞上表达的人IL‑7受体(也称为人IL‑7Rα或IL‑7Ra或CD127)，并且其不干扰IL‑7或TSLP信号通路。本发明的抗体对IL‑7受体没有拮抗作用，但仍可能对CD127阳性细胞存在细胞毒活性。在一个具体实施方案中，抗体对IL‑7受体没有激动作用。

Description

针对IL7受体胞外域的α链的非拮抗性抗体及其在癌症治疗中 的应用
本发明涉及针对白细胞介素7(IL-7)受体、尤其是在人细胞上表达的人IL-7受体(也称为人IL-7Rα或IL-7Ra或CD127)的α链的胞外域的人源化抗体，并且其不干扰IL-7或TSLP信号传导途径。
本发明的抗体对IL-7受体没有拮抗作用，但仍可能对CD127阳性细胞存在细胞毒活性。在一个具体实施方案中，抗体对IL-7受体没有激动作用。
作为一个例子，本发明提供一种抗体，其识别包含表6的SEQ ID No55的序列的人CD127表位。
因此，本发明的抗体适用于治疗癌症，所述癌症与在耐受条件下阻断免疫系统的CD127阳性细胞增殖或CD127阳性细胞浸润相关。
本发明还涉及抗体片段，特别是这些抗体的抗原结合片段，或包含此类抗体或此类片段作为组分、用于制备治疗剂(特别是免疫治疗剂)的分子。
IL-7R信号传导。IL-7与IL-7R的结合触发了几种信号传导途径的激活，包括Janus激酶(JAK)-1和-3、信号转导和转录激活因子5(STAT5)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-k)。据报道，STAT1和STAT3途径被激活，但它们似乎不是主要途径。STAT5途径的激活是诱导抗凋亡蛋白Bcl-2和防止促凋亡蛋白Bax进入线粒体并因此使胸腺发育T细胞前体存活所必需的。PI3-k途径的激活导致促凋亡蛋白Bad的磷酸化作用和细胞质保留。
本发明中使用的“CD127阳性细胞”表示在其细胞表面表达CD127的细胞，特别是表达人CD127的人细胞。在大多数情况下，CD127阳性细胞在形成IL-7R(IL-7R阳性细胞)的复合物中和/或在形成TSLPR(TSLPR阳性细胞)的复合物中表达CD127。CD127由各种细胞表达，包括由记忆T细胞和初始T细胞表达。CD127尤其由效应T细胞(Teff)表达，包括静息T细胞和记忆T细胞，以及由未成熟B细胞表达，并且也通过静息天然调节T细胞(天然Treg)表达，尽管水平相当低。IL-7Rα对于促进淋巴细胞的胸腺细胞分化和克隆扩增至关重要。
最近几项研究强调了IL7-CD127途径对初始T细胞稳态的重要性，表明常规CD4+T细胞上膜结合的IL-7Rα的表达水平与健康个体和HIV感染患者以及多发性硬化症(MS)患者中新近胸腺移植(RTE)-CD4+T细胞的频率相关(Albuquerque等，2007)(Broux等，2010)。
本发明公开的拮抗剂特性可以特别是对IL-7(尤其是人IL-7)诱导的IL-7R信号传导的拮抗作用。如实施例中所述，通过测量STAT5磷酸化的抑制，可以识别由IL-7诱导的IL-7R信号传导的拮抗剂。IL7诱导的STAT5磷酸化是IL7R活化的标志物，并且预期拮抗IL7-IL7R相互作用的抗体会降低IL7诱导的STAT5的磷酸化。
胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是上皮细胞细胞因子，其在淋巴细胞生成中具有活性，并且特别参与免疫系统细胞发育的调节，所述调节特别影响所述细胞的成熟。人TSLP(登录号AF338732)是一种影响树突细胞极化、促进T细胞和B细胞增殖和分化的因子，已被证明在皮肤和肺部疾病中发挥作用(He和Geha，2010)。
因此，已显示TSLP与人和小鼠中的各种病理学相关，包括气道炎性疾病和过敏性皮炎(Ying等，2008)(Jariwala等，2011)。此外，已显示TSLP与肠道免疫和炎症的调节相关(Taylor等，2009)。已显示，TSLP信号传导途径在分子水平上与IL-7诱导的信号传导不同(Rochman等，2010)。
在一个具体实施方案中，由于抗体的细胞毒性作用(可能但不仅仅是通过ADCC(抗体依赖性细胞毒性)和可选地通过CDC(补体依赖性细胞毒性))，本发明涉及本文定义的抗体用于消除淋巴细胞亚群，或表达CD127的其他细胞群，特别是人CD127(包括正常或病理性T和B淋巴细胞、NK细胞、树突细胞和其他细胞类型，包括上皮细胞)的应用。因此，本发明涉及抗体在治疗病理状况中的应用，所述病理状况涉及人类患者免疫应答的改变，导致例如血液癌症中涉及CD127阳性细胞的显性致耐受状态以及恶性CD127阳性细胞的破坏。
因此，本发明提供了适用于病状例如由以下疾病诱发的那些的手段(当这些病状与CD127阳性细胞相关时)：自身免疫疾病、移植物排斥、过敏性疾病、呼吸道疾病、慢性病毒感染、淋巴瘤、白血病或其他癌症疾病，包括由实体瘤引起的那些(例如乳腺癌)(例如Ujiie等，OncoImmunology 4：6，e1009285；2015年6月中所描述)。初始T细胞是移植的器官和组织的急性排斥的部分原因。这些细胞可以通过目前的免疫抑制药物(神经钙调蛋白抑制剂)和阻断共刺激的单克隆抗体(抗粘连，CD80/86抑制剂)来控制。记忆T细胞也是移植排斥的原因。由于获得性免疫史(主要是以前对病毒的反应)，记忆T细胞在人体内积聚。已经表明，记忆T细胞可以被异体抗原重新激活，这是“异源免疫”的结果，这是我们的抗病毒防御与异体抗原的交叉反应(Adams等，2003)。异源免疫代表了对耐受诱导的有效屏障，这是因为与初始T细胞相比，记忆T细胞被编程为快速激活，同时对共刺激信号的需求减少。记忆T细胞也可能参与慢性排斥反应。除了它们在器官和组织移植中的作用外，初始和记忆T细胞也是许多自身免疫疾病的共同原因。这是溃疡性结肠炎(Shinohara等，2011)、类风湿性关节炎，牛皮癣或移植物抗宿主病的情况。
此外，已经显示，几种恶性细胞显示IL-7R。这是Sezary皮肤淋巴瘤(其中60％)或儿童急性淋巴细胞白血病的情况，其中约15％的病例在CD127中发生功能获得性突变，使这些肿瘤部分依赖IL-7(Shochat等，2011)。
消耗T淋巴细胞已经成为一种显著的免疫抑制方法，以抵消同种异体移植排斥反应或对抗自身免疫。然而，总T细胞消耗可能不利于诱导免疫耐受。
在不修饰Treg细胞的情况下，靶向T细胞亚群或选择性活化的(效应)T细胞可构成促致耐受性方法(pro-tolerogenic approach)(Haudebourg等，2009)。因此，CD127可以被认为是单克隆抗体(Mab)的潜在有吸引力的治疗靶点，该单克隆抗体旨在调节免疫应答，因为这种单克隆抗体可能具有耗尽效应子但不能调节淋巴细胞的潜力。因此，据推测，它们可能通过拮抗IL-7对IL7-R的接近从而限制T和B细胞功能和生长，在移植、自身免疫(Michel等，2008)和恶性肿瘤中显示出疗效。
使用针对CD127+细胞的单克隆抗体而不干扰IL-7和TSLP途径的疗法，通过消除/中和初始T细胞和记忆T细胞同时保留Treg细胞或通过消除CD127阳性恶性细胞，可以实现该目标。
在这种情况下，WO2010/017468中公开了针对IL-7Rα有拮抗特性的针对IL-7Rα的单克隆抗体，并且在WO2011/094259中公开了它们的人源化形式，以治疗多发性硬化症等自身免疫疾病。据说所描述的抗体是IL-7与其受体结合的拮抗剂，并且有效对抗TH17和TH1细胞的扩增和存活(据说需要IL-7与其CD127受体的相互作用)。类似地，关于WO2011/104687或WO2013/056984中报道的抗CD127抗体(其预期用于治疗糖尿病、狼疮、类风湿性关节炎和其他自身免疫疾病)，尚未讨论它们与TSLP诱导的信号传导的相互作用的可能影响。
在一篇出版物中(Racape等，2009)，作者分析了IL-7受体α作为移植中潜在治疗靶点的关注点。在讨论了IL-7Rα在各种T细胞和IL-7应答细胞上的表达后，作者测定了靶向表达IL-7Rα的记忆T细胞是否可以延长小鼠中同种异体移植物的存活率，并得出结论，靶向IL-7或IL-7Rα将有利地保留Treg细胞。在这些角度中，作者指出，在治疗中靶向IL-7或IL-7Rα可能对表达CD127的细胞的存活具有不同的后果，并可能引起不同类型的淋巴球减少症。从概念的角度来看，还提出了针对IL-7Rα的抗体的影响的问题，该影响取决于它们是否会阻断或中和细胞毒性抗体。然而，作者没有表明已经获得并测定了这样的抗体，而是表达了进一步研究以评估假设相关性的必要性。考虑到免疫相关疾病和其他涉及IL-7/IL-7Rα的疾病(例如不同类型的癌症，包括一些乳腺癌)的现有治疗方法的缺点，仍然需要其他候选药物，尤其是需要对更具选择性的靶标有效的候选物，以在人类患者中控制例如调节免疫激活。
这种抗体在用于一线治疗放射疗法、化疗、免疫疗法的癌症治疗的组合方法中可以是有效的，特别是对于诸如抗-CTLA4或抗-PDL1或抗-Sirpalpha抗体的检查点抑制剂。
本发明人满足了这一需求，即提供了如下的抗体，所述抗体具有识别和消除效应T细胞能力，同时保留能够在移植中诱导耐受性的调节性T细胞，并且已显示出消除恶性CD127+白血病细胞的能力。
国际专利申请WO2013056984公开了针对人IL7-R的α链的胞外域的抗体，其具有拮抗活性和细胞毒活性，以消耗淋巴细胞亚群或表达CD127的其他细胞群。所公开的MD707-3抗体包含VH和VL链(表6中的序列56和57)，其用于衍生本发明的抗体。MD707-3抗体是IL7-R的拮抗剂，特别抑制IL7诱导的Stat5的磷酸化。相反，衍生自MD707-3的本发明的人源化抗体令人惊讶地不是IL7-R拮抗剂，同时保持与CD127的胞外域的良好结合以及介导对表达CD127的细胞的细胞毒性作用的可能性。此外，如本文图3.b所示，MD707-3抗体是TSLPR拮抗剂，而由其衍生的人源化抗体(本文称为Effi3)则不是。
本发明人提供了适用于本文的手段，因为本发明人获得了针对IL-7Ra且不干扰TSLP途径的单克隆抗体，这与本发明人在本发明抗体的亲本MD707-3抗体中所观察到的相反。MD707-3显示出TSLP拮抗剂特性并增强树突细胞的成熟，其特征在于CD80和CD86的细胞表面的表达(数据未显示)。本发明的抗体构成用于评价靶向CD127+细胞的治疗益处的新产品，所述CD127+细胞具有消耗作用并且不拮抗或不激活IL7途径或TSLP途径。
因此，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其(i)特异性地将受体α链的胞外域与IL-7(称为CD127)结合，特别是由人CD127阳性细胞表达的IL-7受体的α链，并且可选地表现出对表达CD127(CD127+细胞)的人T细胞的细胞毒活性，以及(ii)不是IL7-R或TSLP-R拮抗剂，特别地不是人IL-7或人TSLP拮抗剂，特别是不抑制由IL7诱导的STAT5磷酸化和/或不抑制由TSLP刺激的血液衍生的人树突细胞产生的TARC(胸腺和激活调节的趋化因子，也称为CCL17)。
表述“特异性结合”或任何等同表述是指本发明的抗体或抗原结合片段与CD127相互作用并与CD127(优选人CD127)结合的能力，而它们与其他分子(特别是其他蛋白质)不结合或者结合亲和力明显较弱。结合和结合特异性可以通过SPR(表面等离子体共振，例如Biacore)、ELISA或Western印迹分析来测定。在一个具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或抗原结合片段的嵌合分子靶向并结合CD127作为分离蛋白，其解离常数(Kd)低于5E-10M，特别是低于3E-10M。
尽管在每个公开的实施方案中没有具体说明，但当这些分子是人分子(例如CD127、IL-7、TSLP......)时，抗体及其抗原结合片段的定义性质或特征以及使用这些抗体或其抗原结合片段制备的产品的定义性质或特征是特别地针对所引用的分子定义的。
本发明特别提供了抗体(称为Effi3)的两种变体，其包含：
-命名为Effi3-VH3或VH3或Effi3-VHvar3或VHvar3的重链可变域(表6中的SEQIDNo2的序列，或包含信号肽的SEQ ID No8的序列)，其包含命名为VH3-CDR1、VH3-CDR2、VH3-CDR3的CDR或具有Effi3-VH3、Effi3-VHvar3或VHvar3前缀的等同名称；和
-对于命名为Effi3-VH3VL3的变体，命名为Effi3-VL3或VH3或Effi3-VLvar3或VLvar3的轻链可变域(表6中的SEQ ID No4的序列，或包含信号肽的SEQ ID No10的序列)，其包含命名为VL3-CDR1、VL3-CDR2、VL3-CDR3的CDR或具有Effi3-VL3、Effi3-VLvar3或VLvar3前缀的等同名称；或
-对于命名为Effi3-VH3VL4的变体，命名为Effi3-VL4或VH3或Effi3-VLvar4或VLvar4的轻链可变域(表6中的SEQ ID No6的序列，或包含信号肽的SEQ ID No12的序列)，其包含命名为VL4-CDR1、VL4-CDR2、VL4-CDR3的CDR或具有Effi3-VL4、Effi3-VLvar4或VLvar4前缀的等同名称。
由于VL-CDR2和VL-CDR3对于VL3和VL4轻链是相同的，因此它们分别被无差别地命名为VL3-CDR2、VL4-CDR2或VL3/4-CDR2和VL3-CDR3、VL4-CDR3或VL3/4-CDR3。
特别地，Effi3抗体的重链和轻链分别提供有恒定域IgG1m E333A(SEQ ID No28的序列)和CLkappa(SEQ ID No34的序列)。
本发明的抗体是人源化的。因此，除了本文公开的CDR序列中的取代之外，通过相对大鼠MD707-3抗体进行氨基酸残基的取代，在其VH和/或VL序列的骨架残基中修饰本发明的抗体，特别地，这些残基被修饰以更接近地匹配天然存在的人抗体。可以根据已知技术通过表面重塑或通过CDR移植进行人源化。实施例部分公开了取代的例子。通过用人氨基酸残基取代啮齿动物残基尤其可以实现表面重塑。以维持原始抗体的骨架结构以及CDR呈递的方式进行取代，从而使得表面重塑的抗体中的骨架和CDR相互作用能够保持与抗原接触的表面的天然构象，从而保持抗原结合亲和力。
相对于MD707-3大鼠抗体(其序列公开为重链的SEQ ID No56和轻链的SEQ IDNo57，从而为取代的氨基酸残基的位置提供参考)，在本发明抗体中引入CDR内的以下取代：VH-CDR1中的S30T和VH-CDR2中的E64D，这两个取代限定了Effi3-VH3的CDR；VL-CDR2中的L59R和VL-CDR2中的A60D，这两个取代限定了Effi3-VL3的CDR。除了Effi3-VL3链的取代之外，Effi4-VL4链的CDR在VL-CDR1中有另外的S28D取代。
在特别优选的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含以下或由以下组成：
-本文公开的VH3重链的CDR为表6中SEQ ID No2的序列的重链，特别是分别具有SEQ ID No14、16和18的序列的VH3-CDR1、VH3-CDR2和VH3-CDR3的重链，见表6；和
-本文公开的VL3或VL4轻链的CDR分别为SEQ ID No No4和6的序列的轻链，特别是分别具有SEQ ID No20、22和24的序列的VL3-CDR1、VL3-CDR2和VL3-CDR3的轻链，或分别具有SEQ ID No26、22和24的序列的VL4-CDR1、VL3-CDR2和VL3-CDR3的轻链。
在一个具体实施方案中，抗体或抗原结合片段另外在VH-CDR3(重链的CDR3)中具有V101T和/或V102T取代。
在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段另外在VH-CDR3(重链的CDR3)中的位置V101和/或V102处没有取代或者没有V101或V102取代。
在本发明的一个具体实施方案中，人源化抗体的特征在于，相对于MD707-3 VH和VL序列(所示残基由取代产生，MD707-3的原始大鼠残基公开在例如实施例中的表1～4中)，在其VH和/或VL链中存在下述一个或几个额外的氨基酸残基取代，其位置是在链的骨架区中Kabat编号识别的位置：
-在VH序列中：在第3位的残基Q、第15位的残基G、第16位的残基G、第21位的残基T、第80位的残基T、第87位的残基S、第91位的残基E、第95位的残基T、第118位的残基L，和/或
-在VL序列中：在第7位的残基S、第9位的残基S、第11位的残基L、第12位的残基P、第18位的残基P、第47位的残基Q、第50位的残基K、第68位的残基S、第73位的残基G、第82位的残基R、第85位的残基A、第90位的残基T。
在特定实施方案中，本发明的抗体在VL-CDR1中具有S28D取代(即VL4的VL-CDR1具有SEQ ID No26的序列)，该抗体至少具有如上所述的E73G骨架取代。
在特别优选的实施方案中，本发明的抗体在重链中具有如上所述的所有骨架残基取代。在特别优选的实施方案中，本发明的抗体在轻链中具有如上所述的所有骨架残基取代，或者，具有如上所述的所有骨架残基取代，但对于73位的G，其作为E残基保留。在一个具体实施方案中，抗体或其抗原片段具有序列为SEQ ID No20的VL3-CDR1，并且在73位具有保留的E残基。
在特别优选的实施方案中，本发明的抗体具有(或抗原结合片段包含)：
-具有VH3序列(即SEQ ID No2的序列)的重链；和
-具有VL3序列(SEQ ID No4的序列)或VL4序列(SEQ ID No6的序列)的轻链。
与所谓的“人源化位置”相关的这些特征可以与本发明抗体定义的任何或所有实施方案组合。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的抗体或其针对IL-7受体中存在的CD127分子的抗原结合片段还具有对人细胞(特别是表达所述受体的人T细胞，在一个优选的实施方案中，是肿瘤T细胞)具有细胞毒性的特性。
在本发明的一个具体实施方案中，当抗体或其抗原结合片段与TSLP-受体(也称为CCRF2；登录号AF338733)组合作为TSLP的受体时，其靶向并结合相同的IL7-Rα链(RecheP.A.等，2001)。
本发明抗体的“抗原结合片段”是抗体的一部分，即，对应于本发明抗体结构的一部分的分子，其表现出对人IL-7的IL-7受体的α链的抗原结合能力，可能以其天然形式；与相应的四链抗体的抗原结合特异性相比，这种片段尤其对所述抗原表现出相同或基本相同的抗原结合特异性。有利地，抗原结合片段具有与相应的4-链抗体相似的结合亲和力。然而，相对于相应的4-链抗体具有降低的抗原结合亲和力的抗原结合片段也包括在本发明内。可以通过测量抗体和所考虑的片段的亲和力来确定抗原结合能力。这些抗原结合片段也可称为抗体的功能片段。抗体的抗原结合片段是包含它的被称为CDR(互补决定区)的高变域或其部分的片段，该高变域包括抗原的识别位点，即人IL-7的IL-7Ra，从而限定抗原识别特异性。四链免疫球蛋白的每条轻链和重链(分别为VL和VH)具有三个CDR，分别称为VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3和VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3。
因此，本发明涉及本发明的抗体片段，其分别包含VL3或VL4和VH3的VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3和VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3中的所有CDR或由其组成。
技术人员将能够通过参考这方面的标准定义来确定抗体的各个区域/结构域的位置，包括参考编号系统(Martin，2001)抗体可变区的蛋白质序列和结构分析：抗体工程实验室手册，编辑：Duebel,S和Kontermann,R，Springer-Verlag，海德堡或参考Kabat的编号系统(免疫学蛋白质序列，第4版，美国卫生与人类服务部，NIH，1987)或通过用IMGT“collierde perle”算法(http://www.imgt.org/IMGTindex/Colliers.html)。在这方面，对于本发明序列的定义，应注意，区域/结构域的界定可以从一个参考系统变化到另一个。因此，本发明中定义的区域/结构域包括显示长度变化+/-10％的序列，并且抗体全长序列内相关序列的定位可以变化+/-10％。
在本发明的一个具体实施方案中，人源化抗体或其抗原结合片段具有本文定义的CDR序列(即VH3和VL3或VL4的CDR序列，可能在VH-CDR3中具有额外的V101T和/或V102T取代)，并且在其骨架区中，在根据Kabat编号确定的位置，还包含一个或几个以下氨基酸残基：
-在VH序列中：在第3位的残基Q、第15位的残基G、第16位的残基G、第21位的残基T、第80位的残基T、第87位的残基S、第91位的残基E、第95位的残基T、第118位的残基L，
-在VL序列中：在第7位的残基S、第9位的残基S、第11位的残基L、第12位的残基P、第18位的残基P、第47位的残基Q、第50位的残基K、第68位的残基S、第73位的残基G或残基E(特别是残基E)、第82位的残基R、第85位的残基A、第90位的残基T。
还可以从如SEQ ID No56(VH)和SEQ ID No57(VL)公开的重链和轻链的MD707可变域的序列中检索上述残基在抗体的骨架中或其抗原结合片段中的位置。
在另一个实施方案中，人源化抗体或其抗原结合片段具有本文定义的CDR序列(即VH3和VL3或VL4的CDR序列)，并且在其骨架区域中，在根据Kabat编号确定的位置，进一步包括一个或几个下列氨基酸残基，特别是所有这些氨基酸残基：
-在VH序列中：在第3位的残基Q、第15位的残基G、第16位的残基G、第21位的残基T、第80位的残基T、第87位的残基S、第91位的残基E、第95位的残基T、第118位的残基L，
-在VL序列中：在第7位的残基S、第9位的残基S、第11位的残基L、第12位的残基P、第18位的残基P、第47位的残基Q、第50位的残基K、在第68位的残基S、在第73位的残基G或残基E(特别是残基E)、第82位的残基R、第85位的残基A、第90位的残基T。
在特定实施方案中，其中人源化抗体或其抗原结合片段在第28位(在VL-CDR1中，如在VL4-CDR1中)包含D残基，所述抗体或片段在第73位包含G残基(在VL骨架残基中)。
在特定实施方案中，其中人源化抗体或其抗原结合片段在第28位(在VL-CDR1中，如在VL3-CDR1中)包含S残基，所述抗体或片段在第73位包含E残基(在VL骨架残基中)。
在特别优选的实施方案中，抗体或其抗原结合片段在其重链中的指定骨架位置具有所有上述残基。在特别优选的实施方案中，抗体或其抗原结合片段在其轻链中的指定骨架位置具有所有上述残基，或在指定骨架位置具有所有上述残基，但在其轻链的第73位具有E残基。
基于四链免疫球蛋白的结构，因此可以通过与现有数据库和现有技术(Martin，2001)中的抗体序列进行比较来定义抗原结合片段，特别是通过比较这些序列中功能结构域的位置，注意到骨架和恒定域的位置对于各种类型的抗体，特别是对于IgG，特别是对于哺乳动物IgG而言，有明确的定义。这种比较还涉及与抗体的三维结构有关的数据。
为了说明本发明具体实施方案的目的，含有包含所述抗体的CDR的可变域的抗体的抗原结合片段包括Fv、dsFv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2，参考在Kabat(NIH1987)，MartinA.C.R.等和Roitt I.等(基础与应用免疫学MEDSI/McGraw-Hill)中的明确定义。Fv片段由通过疏水相互作用结合在一起的抗体的VL和VH结构域组成；在dsFv片段中，VH：VL异二聚体通过二硫键稳定；在scFv片段中，VL和VH结构域通过柔性肽接头彼此连接，从而形成单链蛋白质。Fab片段是可通过木瓜蛋白酶消化抗体获得的单体片段；它们包含整个L链，以及H链的VH-CH1片段，通过二硫键结合在一起。F(ab')2片段可以通过胃蛋白酶消化铰链二硫化物以下的抗体产生；它包含两个Fab'片段，另外还包含免疫球蛋白分子的一部分铰链区。通过切割铰链区中的二硫键，可以由F(ab')2片段获得Fab'片段。F(ab')2片段是二价的，即它们包含两个抗原结合位点，如天然免疫球蛋白分子；另一方面，Fv(构成Fab的可变部分的VHVL调节剂)、dsFv、scFv、Fab和Fab'片段是单价的，即它们包含单个抗原结合位点(参见Chan和Carter，2010)。
因此，本发明涉及包含本文公开的序列的抗原结合片段，其在抗原识别方面是单价或二价片段，并且为如下：
-Fv片段，其由通过疏水相互作用结合在一起的VL和VH链组成；
-dsFv片段，其中VH：VL异二聚体通过二硫键稳定；
-scFv片段，其中VL和VH链通过柔性肽接头彼此连接，从而形成单链蛋白质；
-Fab片段，其是单体片段，包含通过二硫键结合在一起的整个L链、和H链的VH-CH1片段；
-Fab'片段；
-F(ab')2片段，其包含两个Fab'片段，另外还包含抗体铰链区的一部分。
本发明的这些基本的抗原结合片段可以组合在一起以获得多价抗原结合片段，例如双抗体、三抗体或四抗体。这些多价抗原结合片段也是本发明的一部分。
开发治疗性抗体的一些研究已经导致设计Fc区以优化抗体性质，从而允许产生更适合于它们所需的药理学活性的分子(Strohl，2009)。抗体的Fc区介导其血清半衰期和效应子功能，例如补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。位于CH2与CH3结构域之间的界面处的几个突变，如T250Q/M428L(Hinton等，2004)和M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(Vaccaro等，2005)，已经显示提高了对FcRn的结合亲和力和体内IgG1的半衰期。然而，增加的FcRn结合和改善的半衰期之间并不总是直接关系(Datta-Mannan等，2007)。提高治疗性抗体功效的一种方法是增加其血清持久性，从而允许更高的循环水平、更低的频率施用和减少的剂量。可能需要工程化Fc区来降低或增加抗体的效应子功能。对于靶向细胞表面分子的抗体，特别是免疫细胞上的那些，需要消除效应子功能。相反，对于用于肿瘤学用途的抗体，增加的效应子功能可以改善治疗活性。四种人IgG同种型以不同的亲和力结合活化Fcγ受体(Fcγ以不，Fcγ以不同的，Fcγ以不同的亲)、抑制性FcγRIIb受体和补体(C1q)的第一组分，产生非常不同的效应子功能(Bruhns等，2009)。IgG与FcγR或C1q的结合取决于位于铰链区和CH2结构域中的残基。CH2结构域的两个区域对FcγRs和C1q的结合是关键的，并在IgG2和IgG4中具有独特序列(Armour等，1999)(Shields等，2001)(Idusogie等，2000)(Steurer等，1995)(Lazar等，2006)(Ryan等，2007)(Richards等，2008)(Labrijn等，2009)。
在特定实施方案中，本发明的抗体具有以下恒定域：
对于重链，IgG1 m-E333A恒定域(表6中SEQ ID No28的序列)或IgG4m-S228P(SEQID No30的序列)或IgG2b(SEQ ID No32的序列)结构域；
对于轻链，CLkappa恒定域(SEQ ID No34的序列)或CLlambda(SEQ ID No36的序列)结构域。
本发明的抗体，特别是人源化抗体可以是单克隆抗体。
表达CD127作为IL-7受体链的人细胞(其是本发明抗体及其片段的靶标)主要是T淋巴细胞，更确切地说是效应T淋巴细胞的亚群，包括初始和记忆T细胞，但不是调节性T细胞，尤其是不是静息天然Treg。记忆T细胞是由抗原引发产生的，主要由其功能特征决定，包括在重新激活和分化成次级效应子和记忆细胞后进行回忆增殖的能力。
根据本发明的一个实施方案，具有“对T细胞的细胞毒活性”或细胞毒性的抗体及其抗原结合片段(细胞毒性抗体)通过杀死这些细胞而导致效应T细胞群耗尽，并因此在给药时减少这些细胞的数量。相反，这些抗体不会改变调节性T细胞的亚群或不会很大程度地改变它，从而允许Treg细胞发挥其功能。
根据本发明的一个具体实施方案，细胞毒性抗体显示抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。当特异性细胞毒性优于5％时，抗体ADCC潜力被认为是阳性的。
在具体的实施方案中，本发明的抗体包含具有人IgG1恒定域、具有E333A突变，即SEQ ID No28的序列(在表6中)的重链。在具体的实施方案中，本发明的抗体包含具有人IgG1的CLkappa恒定域、具有SEQ ID No34的序列的轻链。
在具体的实施方案中，本发明的抗体具有本文公开的重链，其为具有SEQ ID No42序列的Effi3_VH3_IgG1m(E333A)。在具体的实施方案中，本发明的抗体具有本文公开的轻链，其为具有SEQ ID No50序列的Effi3_VL3_ClKappa，或具有本文公开的轻链，其为具有SEQ ID No48序列的Effi3_VL4_Clkappa。
ADCC性质可以在ADCC测定中评估，例如实施例中描述的测试。当抗体是大鼠抗体时，ADCC测定中使用的效应细胞是大鼠的LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)细胞。当抗体人源化时，ADCC测定可以在人NK细胞上进行。
根据另一个实施方案，本发明框架内的抗体或其抗原结合片段不是IL7的拮抗剂和/或不是TSLPR的拮抗剂。“IL-7R的拮抗剂”是指本发明的抗体或其抗原结合片段(其靶向IL7-Rα)具有阻止CD127细胞(尤其是人效应T细胞，特别是人记忆T细胞)上表达的IL-7受体对其结合配偶体IL-7的可及性的作用，而抗体或片段本身不会触发IL7-R受体的信号传导。相同的定义类似地适用于“TSLPR的拮抗剂”，其与TSLPR结合，阻止配体的结合，并且本身不触发信号传导。根据本发明的一个具体实施方案，本发明框架内的抗体或其抗原结合片段不是“CD127的拮抗剂”，这意味着它既不是IL-7的拮抗剂也不是TSLP的拮抗剂。在这方面，关于IL-7和TSLP的非拮抗作用可以定义为下文提供的任何实施方案的组合，作为不是IL-7R拮抗剂或不是TSLP拮抗剂的定义的具体实施方案。与现有技术的抗体相反，由于不是IL-7受体的拮抗剂，本发明的抗体或其功能片段不会因预防IL-7依赖性胸腺T细胞的产生而导致强烈的淋巴细胞减少。在实施例中描述了测量本发明的抗体或其功能片段的拮抗剂性质的试验。在特定的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段是CD127的拮抗剂。在特定的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段是IL7-R的拮抗剂。在特定实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段是TSLPR的拮抗剂。
在特定的实施方案中，抗体及其抗原结合片段在施用时不会降低TSLP刺激的树突细胞产生的TARC。在特定的实施方案中，特别是在实施例部分中公开的条件下，在存在浓度为5μg/mL以上的抗体(或存在等效浓度的抗原结合片段)时，TSLP刺激的树突细胞中产生的TARC的减少不超过20％，优选不超过10％，甚至更优选不超过5％，和/或在存在浓度为25μg/mL以上的抗体(或存在等效浓度的抗原结合片段)时，TARC的减少不超过80％，优选不超过50％，更优选不超过25％，甚至更优选不超过10％。
在特定实施方案中，抗体或其抗原结合片段不抑制IL-7诱导的IL7-R的STAT-5信号传导。在特定的实施方案中，特别是在实施例部分中公开的条件下，在存在浓度为0.1μg/mL以上(优选浓度为0.5μg/mL以上)的抗体(或存在等效浓度的抗原结合片段)时，IL-7刺激的细胞中的STAT-5磷酸化的降低不超过30％，优选不超过25％，甚至更优选不超过20％，和/或在存在浓度为1μg/mL以上的抗体(或存在等效浓度的抗原结合片段)时，STAT-5磷酸化的减少不超过50％，优选不超过35％，甚至更优选不超过20％，和/或在存在浓度为5μg/mL以上(优选浓度为10μg/mL以上)的抗体(或存在等效浓度的抗原结合片段)时，STAT-5磷酸化的减少不超过90％，优选不超过70％，更优选不超过50％，甚至更优选不超过20％。
针对IL7-受体(或TSLPR)、特别是CD127的胞外域的抗体可以作为IL7-R(或TSLPR)的激动剂，即，它们可能与配体的结合竞争，而它们的结合可能导致在没有配体的情况下，激活IL7-R(或TSLPR)的全部或部分信号传导途径，和/或在配体存在下提高激活。在特定实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段不是CD127的激动剂。在特定实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段不是IL7-R的激动剂。在特定实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段不是TSLPR的激动剂。在一个具体实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段既不是IL-7途径的激动剂，也不是TSLPR途径的激动剂。
在特定实施方案中，抗体及其抗原结合片段在施用时不增加TSLP刺激的树突细胞产生的TARC。在特定实施方案中，特别是在实施例部分中公开的条件下，在存在浓度为0.2μg/mL以上的抗体(优选浓度为1μg/mL以上，更优选25μg/mL以上)(或存在等效浓度的抗原结合片段)时，TSLP刺激的树突细胞中产生的TARC的增加不超过60％，更优选不超过50％。在特定实施方案中，在不存在TSLP的情况下，本发明的抗体和抗原结合片段不诱导细胞中TARC的产生，特别是在存在上述浓度的抗体或抗原结合片段且不存在TSLP的情况下，TARC的产生为存在TSLP且不存在抗体或抗原结合片段的情况下的35％以下，优选20％以下，更优选10％以下。
在特定实施方案中，抗体或其抗原结合片段不增加IL-7诱导的IL7-R的STAT-5信号传导。在特定的实施方案中，特别是在实施例部分中公开的条件下，在存在浓度为0.1μg/mL以上的抗体(优选浓度为1μg/mL以上，更优选10μg/mL以上)(或存在等效浓度的抗原结合片段)时，IL-7刺激的细胞中的STAT-5磷酸化的增加不超过20％，优选不超过10％，甚至更优选不超过5％。在特定的实施方案中，在不存在IL-7且存在上述浓度的抗体或抗原结合片段时，STAT-5的磷酸化为存在IL-7和抗体(或抗原结合片段)时所述磷酸化的20％以下，优选10％以下，甚至更优选5％以下。
具有对CD127阳性细胞的细胞毒性和拮抗剂性质的现有技术的抗体，其能够实现这些特性对效应T细胞(尤其是记忆T细胞)的消耗的累积效应，从而能够实现更强的消耗(CD127+细胞池的耗尽)和相应的靶T细胞数量的减少。本发明的抗体诱导更少地消耗CD127T细胞，该CD127 T细胞不诱导在某些情况下可能是不利影响的淋巴细胞减少。
本发明还提供了编码本发明抗体(和片段)的多核苷酸。这些多核苷酸特别地在表6中公开。它们可以作为分离的多核苷酸提供。技术人员将认识到，由于遗传密码的简并性，与明确公开的这些不同的多核苷酸序列可编码相同的氨基酸序列；这些多核苷酸序列也包括在本发明中。
在一个具体实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID No13、15、17、19、21和23的序列，或SEQ ID No13、15、17、25、21和23的序列，特别地，其包含SEQ ID No1和3的序列或SEQ IDNo1和5的序列，特别地，其包含SEQ ID No41和47的序列或SEQ ID No41和49的序列。
在一个具体实施方案中，本发明涉及包含本发明多核苷酸的载体。该载体可以是适合细胞转染的质粒，或者可以是适于细胞转导的载体，例如病毒载体。
抗体或其抗原结合片段尤其可以通过DNA合成获得。特别是可以合成所需抗体的cDNA并在合适的载体中克隆所述cDNA。抗体(或抗原结合片段)的合成，克隆和表达可以根据本领域常用的方法进行，并且技术人员容易获得。
本发明的抗体或其抗原结合片段特别有利地针对人T细胞表达的CD127分子产生，可能是以天然多肽或重组分子形式的免疫产生。优选地，针对包含具有序列ESGYAQNGDLEDAELDDYSFSCYSQLE(表6中的ID No55)的表位(或针对由该表位组成)的多肽产生抗体。
免疫可以根据以下实施例中公开的方案进行：重组CD127 Fc嵌合体(10975-H03H中国生物，北京，中国)用于免疫大鼠，例如购自比利时鲁汶大学的LOU/C IgkIA品种的大鼠。根据上述方法(Chassoux等，Immunology 1988 65 623-628)，通过将脾单核细胞与LOU大鼠免疫细胞瘤IR983F(非分泌性和氮杂鸟嘌呤抗性细胞系)融合而获得杂交瘤。首先根据分泌的单克隆抗体与重组CD127分子(CD127 Fc嵌合体；10975-H03H，中国生物，北京，中国)结合的能力筛选杂交瘤。然后根据单克隆抗体与人T细胞表达的CD127结合的能力筛选杂交瘤。
根据本发明的“杂交瘤细胞”是由抗体产生细胞(B淋巴细胞)和融合配偶体的融合而产生的细胞，所述抗体产生细胞来自预先用所选的免疫原免疫的动物，所述融合配偶体是能够为所得融合细胞提供永生性的骨髓瘤细胞。
骨髓瘤细胞和产生抗体的细胞(B细胞，例如脾细胞)可以是相同的起源，并且是真核细胞，特别是同一动物的哺乳动物细胞。它们可以是不同来源的，因此产生异源杂交瘤。在不能产生免疫球蛋白的细胞中选择骨髓瘤细胞如LOU大鼠免疫细胞瘤IR983F、非分泌性和氮杂鸟嘌呤抗性细胞系，以使制备的杂交瘤仅分泌具有所需特异性的单克隆抗体。可以使用适于促进ADCC的其他细胞，例如下文中描述的通过在重组细胞中表达而制备抗体的那些细胞来代替大鼠免疫细胞瘤。这种细胞有利地是具有低的或没有岩藻糖基化能力的细胞。适用于实施本发明的杂交瘤的制备根据常规技术进行。在本申请的实施例中详细描述了实施方案，其中特定公开的特征可以适用于用作融合配偶体的其他细胞。本发明中公开的特定杂交瘤是根据布达佩斯条约的规定于2011年9月28日在CNCM(国家微生物培养物保藏中心，巴黎，法国)以No I-4532保藏的MD707-3。所述杂交瘤使得能够产生根据本发明修饰的命名为MD707-3的大鼠抗体，以提供人源化抗体Effi3。
抗体的抗原结合片段可以从抗体开始获得，尤其是通过使用酶消化，根据包括木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化的熟知技术，或使用任何合适的裂解技术(cleavage technique)来获得。它们可以在通过与编码所述片段的氨基酸序列的核酸序列重组而修饰的宿主细胞中表达，或者可以合成，尤其是化学合成。
因此，本发明的抗体(包括修饰的抗体和抗体的抗原结合片段)也可以通过经典的基因工程技术制备，例如由Sambrook等人描述的那些技术。[分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，(1989)，以及更新版本]。
根据本发明，与IL-7Ra蛋白的“结合”是指抗原-抗体类型的相互作用并且包括抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”特性，其中特异性结合是指抗体或抗原结合片段与IL-7Ra蛋白结合，并且不与其他蛋白质(例如，常见的细胞因子受体γ链)结合或以明显较弱的亲和力结合。结合特异性和结合可以根据实施例中公开的试验进行测定，特别是可以通过ELISA或蛋白质印迹分析进行测定。
因此，本发明涉及如上公开的VH和VL多肽的形式，其包括信号肽或不包括信号肽。在细胞中制备多肽期间可能需要信号肽。
由于治疗性抗体的最重要特性是活性，故重要的是在表面重塑和去免疫期间提出的取代不影响抗体的亲和力或稳定性。过去20年来收集了如下方面的大量信息：CDR的人源化和移植(Jones等，1986)(Ewert等，2003)、抗体的生物物理特性(Ewert等，2003)、CDR环的构象(Chothia和Lesk，1987)(Al-Lazikani等，1997)(North等，2011)和骨架(Vargas-Madrazo和Paz-García，2003)(Honegger等，2009)，随着蛋白质建模(Desmet等，2002)(Almagro等，2014)的进展，使得可以预测具有保留的结合亲和力和稳定性的抗体人源化和去免疫化。然而，通常仍然需要测试具有修饰序列的抗体的所需特性。本文公开了抗体(或抗原结合片段)特征的测试，特别是在实施例部分中。
本文公开的例如Effi3_VH3VL3和Effi3_VH3VL4的特定序列在很大程度上是人源化的，并且通常认为不需要进一步的人源化，而恢复一些取代以恢复原始大鼠残基通常不会被认为是有利的，至少对于寻求人源化抗体，特别是对于人类给药不会被认为是有利的。在特定的实施方案中，抗体是人源化的和/或去免疫的。在特定实施方案中，抗体或抗原结合片段适合于施用于人，并且特别是由于存在非人序列而不会在人中诱导不利的免疫反应，或者不会以临床上不可接受的水平诱导这种反应。
技术人员将意识到，如果相对于表6中公开的序列，通过取代变体结构域来寻求特征的任何改进，预期只有有限数量的取代可提供这种改善同时保留其它特征(所述取代是否具有恢复大鼠MD707-3序列的原始氨基酸的作用)。因此，少量变体需要被测试，并且可以使用本文的方法和本领域技术人员已知的方法容易地测试抗体的重要特征，特别是与CD127的胞外域的结合，可选的与IL-7和/或TLSP的竞争，对CD127、IL7-R和/或TSLPR的拮抗作用，可选的对这些受体的激动剂作用，对STAT-5磷酸化和/或TARC产生的影响和可选的细胞毒性，特别是ADCC介导的作用。这些变体序列包含在本发明中并且特别包括：
-具有VH3和VL3或VL4的CDR序列的变体，并且其中相对于所述序列的取代限于骨架残基，特别是相对于所述序列，其中小于20％(或小于25个残基)，优选小于10％(或小于12个残基)，更优选小于5％(或小于6个残基)，甚至更优选3个或2个或1个骨架残基被取代；
-相对于VH3和VL3或VL4的CDR，变体在它们的每个CDR中的取代不超过2个，优选不超过1个，优选其中至少3个，更优选至少4个，甚至更优选5个CDR未被修饰(修饰的CDR各自具有2个以下，优选仅一个取代)；这些变体可选地另外在骨架残基中具有取代，具有上述优选限制；
-变体在VH-CDR3中具有V101T和/或V102T取代，和可选的在CDR和/或骨架残基中具有另外的取代，具有上述优选限制；
-不具有V101T或V102T取代的变体，特别是不具有V101和V102取代的变体。
其中优选的变体在VL-CDR1(即具有VL3的VL-CDR1，具有SEQ ID No20的序列)中第28位具有S残基以及在VL骨架序列(如在具有SEQ ID No4序列的VL3)的第73位具有E残基，或者，在VL-CDR1(即具有VL4的VL-CDR1，具有SEQ ID No26的序列)中第28位具有D残基以及在VL骨架序列(如在具有SEQ ID No6序列的VL4)的第73位具有G残基。
本发明还涉及包含如本文所定义的抗体或其片段的嵌合分子，其中所述嵌合分子是：
-嵌合蛋白，特别是人工蛋白，其保留所述抗体或抗原结合片段的抗原结合能力，并且是抗原结合抗体模拟物，或
-具有多个功能域的复合分子，其共同提供对所述分子的识别、结合、锚定、信号传导功能，特别是嵌合抗原受体(CAR)，其在重组分子(特别是融合蛋白)中相关联地包含如下：(i)胞外域，其源自如本文所定义的所述抗体或抗原结合片段的scFv片段，或者是这样的scFv片段，(ii)用于锚定到细胞膜中的跨膜结构域和(iii)包含至少一个细胞内信号传导结构域的内结构域。
在一个具体实施方案中，嵌合分子是CAR分子，其包含至少2个，有利地至少3个信号传导结构域，其中信号传导结构域共同实现以下性质中的至少一个：
-启动T细胞活化，例如由CD3δ细胞质结构域提供
-T细胞介导的细胞毒性，
-放大T细胞活化信号或所述信号的共刺激，例如由衍生自受体例如4-1BB、CD28或ICOS或OX40的共刺激元件提供。
本发明还涉及包含本文公开的抗体或其抗原结合片段或包含如本文定义的嵌合分子的细胞，其中抗体或其抗原结合片段作为胞外域暴露于细胞表面。细胞可以有利地是T细胞，例如患者的自体T细胞或同种异体T细胞。
包含在嵌合分子中的信号传导结构域可以有利地衍生自CD3δ或来自Fc受体Y链。
本发明还涉及这些嵌合分子如模拟物或CAR分子在用于靶向CD127+T细胞(特别是肿瘤CD127+T细胞)中的应用。
本发明还涉及嵌合抗原受体(CAR)的方法或制备，其包括以下步骤：
a.提供编码抗体或其抗原结合片段(特别是scFv片段)的多核苷酸，
b.将a)的多核苷酸在其C-末端与这样的多核苷酸重组：从N到C末端编码跨膜结构域和至少一个(特别是两个)细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域适用于向细胞(特别是T细胞，尤其是人T细胞)提供刺激信号，
c.在细胞中(特别是在T细胞中，尤其是在人T细胞中)表达b)中获得的重组分子，
d.可选地，在与表达人CD127的细胞接触后，按性质选择产生的嵌合抗原受体。
在嵌合分子中，本发明特别涉及抗原结合抗体模拟物，即具有模拟抗体的结合抗原能力的人工蛋白质。这些蛋白质包括affitins和anticalins。Affitins是具有选择性结合抗原能力的人工蛋白质。它们在结构上衍生自在Sulfolobus acidocaldarius中发现的DNA结合蛋白Sac7d，其是属于古菌属领域的微生物。通过随机化Sac7d结合表面上的氨基酸，例如，通过产生对应于Sac7d结合界面的11个残基的随机取代的变体，可以产生亲和素库并使得到的蛋白质库经历多轮核糖体展示，亲和力可以针对各种靶标，例如肽、蛋白质、病毒和细菌。Affitins是抗体模拟物，正在开发作为生物技术的工具。它们还被用作各种酶的特异性抑制剂(Krehenbrink等，J.mol.Biol.，383：5,2008)。本领域技术人员可以使用本领域已知的方法，特别是如专利申请WO2008068637和上述引用的公开物中公开的方法(特别是噬菌体展示和/或核糖体展示库的产生以及使用本文公开的抗原对其进行的筛选)，容易地开发具有所需结合特性的亲和素。Anticalin是人工蛋白质，其能够与抗原结合，或与蛋白质结合或与小分子结合。它们是衍生自人脂质运载蛋白(天然结合蛋白家族)的抗体模拟物。Anticalin约小8倍，大小约180个氨基酸，质量约20kDa(Skerra，Febs J.，275：11，2008)。已经发展了Anticalin噬菌体展示库，其允许筛选和选择，特别是具有特异性结合特性的anticalin。本领域技术人员可以使用本领域已知的方法，特别是如EP专利EP1270725B1，美国专利US8536307B2，(Schlehuber和Skerra，Biophys.Chem.，96：2-3，2002)和上述引用的公开物中所公开的(特别是噬菌体展示和/或核糖体展示库的产生以及使用本文公开的抗原对其进行的筛选)，容易地开发具有所需结合特性的亲和素。Anticalin和affitins都可以在包含细菌表达系统的许多表达系统中产生。因此，本发明提供了具有本文所述抗体特征(特别是关于结合CD127、对IL7和/或TSLP信号传导途径无影响，所有这些都是作为本发明的大分子所预期的)的affitins、anticalins和其他类似的抗体模拟物。
本发明还涉及制备本发明抗体的方法，包括如下步骤：针对具有SEQ ID No55序列的多肽免疫非人动物(特别是非人哺乳动物)，以及特别地，从所述免疫的非人动物中收集所得血清，以获得针对所述多肽的抗体。
在本发明抗体的制备方法的一个具体实施方案中，可以进行另外的步骤以评估制备的抗体的性质。步骤尤其可以包括以下彼此独立地执行的步骤：
a.测试(例如，根据实施例中标题为“通过细胞荧光测定法进行IL7R结合测定”和“通过ELISA评估抗h-CD127 Mabs的rCD127识别”的部分中描述的方法)抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物与CD127的胞外域结合的能力，特别是与包含具有SEQ ID No55序列的表位(或由其组成)的多肽结合的能力，
b.测试(例如，根据实施例中标题为“Phospho Stat5活性测定”的部分中描述的方法)抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物对IL-7信号传导途径的影响，
c.测试(例如，根据实施例中标题为“TARC分泌测定”的部分中描述的方法)抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物对TSLP信号传导途径的影响，
d.测试(例如，根据实施例中标题为“抗体依赖性细胞毒性”的部分中描述的方法)抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物的细胞毒活性，特别是ADCC活性；
制备本发明的抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物的方法可以进一步包括以下步骤：选择特异性结合CD127的胞外域的抗体、该抗体的抗原结合片段或模拟物，其表现出至少一种下列特性：
-它不是CD127的拮抗剂，并且它在表达IL7-R的细胞中不抑制IL-7诱导的STAT5的磷酸化，和/或
-它在表达TSLP-R的细胞中不抑制TSLP刺激的TARC分泌，和/或
-它不是CD127的激动剂，和/或
-它在表达IL7-R的细胞中不增加IL-7诱导的STAT5的磷酸化，和/或
-它在表达TSLP-R的细胞中不增加TSLP刺激的TARC分泌。
该方法的一个具体实施方案提供了抗体或其抗原结合片段或模拟物，其特异性结合CD127的胞外域，并且不是CD127的拮抗剂，在表达IL7-R的细胞中不抑制IL-7诱导的STAT5磷酸化，在表达TSLP-R的细胞中不抑制TSLP刺激的TARC的分泌，并且不是CD127的激动剂，和/或在表达IL7-R的细胞中不增加IL-7诱导的STAT5的磷酸化，并且在表达TSLP-R的细胞中不增加TSLP刺激的TARC分泌。
本发明的另一个目的是一种包含抗体或其抗原结合片段或嵌合分子的药物组合物，根据本发明，使用药物载体，其中所述药物组合物可选地还包含不同的活性成分。
本发明还涉及包含根据本文提供的定义的抗体或其抗原结合片段或嵌合分子或细胞或多核苷酸作为活性成分的组合物或药物组合物，当给药人类患者时，该组合物或药物组合物存在于如下制剂中：该制剂适用于控制人CD127阳性细胞(特别是人CD127阳性效应细胞)存活或扩增，尤其是CD127+记忆T细胞(特别是CD127+和CD8+的记忆T细胞，或CD127+和CD4+细胞的记忆T细胞)的存活或扩增。
本发明的组合物可以进一步包含具有治疗性免疫调节剂作用(特别是对涉及过敏或自身免疫的细胞)的另外的化合物。为了说明的目的，目标免疫调节剂是靶向T细胞的其他单克隆抗体，例如抗CD3、抗ICOS或抗CD28抗体或重组蛋白或靶向辅助细胞的抗体，例如CTLA4Ig或抗CD40抗体。
根据另一个实施方案，本发明的组合物可以进一步包含可用于本发明的免疫治疗剂，其选自治疗性疫苗(DNA、RNA或肽疫苗)、免疫检查点阻断剂或激活剂或免疫缀合物如抗体-药物缀合物。
可以将癌症疫苗从关注的生物现象中提取到有效治疗剂的免疫治疗剂包括：增加初始T细胞的数量和库的T细胞生长因子、增加树突细胞(DC)数量的生长因子、激活DC和其他抗原呈递细胞(APC)的激动剂、允许和增大癌症疫苗的佐剂、激活和刺激T细胞的激动剂、T细胞检查点阻断的抑制剂、增加免疫T细胞生长和存活的T细胞生长因子，以及抑制、阻断或中和癌细胞和免疫细胞衍生的免疫抑制细胞因子的药剂。
许多靶标和免疫检查点阻断剂或激活剂在本领域中是已知的。在本发明的上下文中，靶标的例子，特别是可用的免疫检查点阻断剂或活化剂是抗PDL1、抗PD1、抗CTLA4、抗CD137、抗Her2、抗EGFR、抗CD20、抗CD19、抗CD52、抗CD-137、抗CD2、抗CD28、抗CD40、HVEM、BTLA、CD160、TIGIT、TIM-1/3、LAG-3、2B4和OX40。
因此，本发明涉及组合治疗手段，其包含如下物质作为活性成分：
-如本文所定义的抗体或其抗原结合片段、嵌合分子、细胞或多核苷酸，
-至少一种选自化学治疗剂、放射治疗剂、外科手术剂、免疫治疗剂、益生菌和抗生素的其他治疗剂，
其中所述活性成分配制用于分开、同时或组合治疗，特别是用于组合或顺序使用。
本发明在一个实施方案中涉及一种组合产品，其适合于施予有此需要的人类患者，并且包含如下物质作为活性成分：(i)如本文所定义的抗体或其抗原结合片段、嵌合分子、细胞或多核苷酸，以及(ii)另外的免疫治疗剂，特别是涉及T细胞的免疫治疗剂，例如带有本文定义的CAR分子或靶向细胞受体或抗原(例如CD19、CD20、CD52或Her2)的CAR分子的T细胞。在一个具体实施方案中，使用的抗体是IgG1抗体并用作细胞毒剂。
本发明还涉及如本文定义或说明的抗体或其抗原结合片段或嵌合分子或细胞或多核苷酸，其用作有需要的患者的组合或附加治疗方案中的活性成分。
根据本发明的抗体或其抗原结合片段或嵌合分子或细胞或多核苷酸，本文定义的药物组合物或组合物特别提出用于人类患者，用于治疗受免疫应答(尤其是记忆T细胞应答)影响的病理状况。因此，本发明人提出本发明的抗体或其抗原结合片段、嵌合分子、如本文所定义的药物组合物或组合物，可用于治疗自身免疫性或过敏性疾病(特别是过敏性皮肤病)、肠道疾病或移植排斥，或用于治疗白血病如急性淋巴细胞白血病(如T-ALL)，或淋巴瘤如霍奇金淋巴瘤，或治疗与CD127+细胞相关的癌症如乳腺癌、肾癌、膀胱癌、肺癌、胰腺癌，或用于治疗T细胞皮肤淋巴瘤，如Sezary淋巴瘤，或用于治疗急性淋巴细胞白血病，其具有IL7-R/TSLP途径的增益突变、间皮瘤。
鉴于它们在靶向CD127阳性细胞和细胞毒性活性中的特定活性，本发明的抗体或其抗原结合片段特别适用于治疗呼吸系统疾病，如哮喘、囊性纤维化、嗜酸性粒细胞性咳嗽、支气管炎、结节病、肺纤维化、鼻炎、鼻窦炎；慢性病毒感染，如因艾滋病毒、乳头状瘤病毒、肝炎病毒的感染；过敏性疾病如过敏性哮喘、过敏性鼻窦炎、过敏性结膜炎、特应性皮炎、食物过敏、淋巴瘤或白血病(例如pre-B ALL)；和涉及Th2型有害响应的自身免疫性疾病，例如狼疮、牛皮癣、干燥综合征、溃疡性结肠炎、类风湿性多关节炎1型糖尿病。
根据本发明的组合物或组合治疗手段还适用于治疗患有涉及CD127+细胞的疾病的患者，例如上面引用的疾病。特别地，根据本发明的组合物或组合治疗手段适用于治疗呈现CD127阳性肿瘤细胞的癌症的患者，特别是CD127+细胞构成预后不良的标志物的癌症，例如肺癌或间皮瘤的患者。
“治疗”或“治疗处理”意指所进行的给药步骤导致有此需要的动物或人类患者的临床状况改善，这些患者患有与IL-7和TSLP途径相关的疾病，即，涉及CD127阳性细胞的增殖或积累，或响应TSLP的细胞的分化/成熟/增殖。这种治疗旨在通过消除或减轻与这些细胞的存在相关的疾病相关的症状，来改善动物或人类患者的临床状态，即，涉及CD127阳性细胞的增殖和/或积累，或响应TSLP的细胞的分化/成熟/增殖，和/或在优选的实施方案中，根据本发明的治疗能够使其恢复健康。
本发明还涉及如本文所定义的抗CD127抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物在诊断测试中的应用，特别是在个体化医疗的诊断测试中，更具体地在伴随诊断测试中的应用。
本发明还涉及体外或离体诊断方法，特别是适用于个性化医疗的诊断方法，更具体地，在伴随诊断中的诊断方法，其中本发明的抗CD127抗体或其抗原结合片段或其抗原结合模拟物用于检测预先从受试者获得的样品中的CD127+细胞并且可选地用于定量CD127的表达。
在一个具体实施方案中，本发明还涉及本发明的抗CD127抗体或其抗原结合片段或其抗原结合模拟物在制备适用于诊断测试的药物中的应用，特别是用于个性化医疗或伴随诊断测试中的应用。
在本发明的另一个方面，本发明的抗CD127抗体或其抗原结合片段或其抗原结合模拟物用于体外或离体测定预先从受试者获得的样品中CD127+细胞的存在的方法中。
在一个具体实施方案中，该方法包括使用本发明的抗人CD127抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，在所述受试者的生物样品中体外测定CD127的表达和/或表达水平。
在另一个实施方案中，该方法包括确定CD127作为生物标志物的存在，所述生物标志物预测受试者对治疗的反应，特别是被诊断患有癌症的受试者的反应，其中所述方法包括：
-特别地用本发明的抗CD127抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，确定受试者的肿瘤样品中CD127的表达水平，和
-将CD127的表达水平与代表无应答受试者群体中CD127表达水平的值进行比较，
其中，受试者的肿瘤样品中CD127的较高表达水平代表对治疗有反应的受试者。
根据该方法，对表达水平的测定可以包括定量样品细胞上的CD127分子。
从下面的实施例和附图中可以明显看出本发明的其他特征和性质。
附图说明
附图的简要说明
图1
通过Facs和ELISA进行Effi3对CD127的结合测定。A.显示CD127阳性细胞相对于Effi3染色的剂量反应的百分比。B.Effi3结合活性。A.结合活性测定，在夹心ELISA上测试抗CD127抗体：MD707-3(起始线(start line))、Effi3变体VH3VL3(三角线)和Effi3变体VH3VL4(方形线)。
图2
在不同温度下通过ELISA随时间的稳定性测定：该图显示了Effi3抗体从D0到28的吸光度，该抗体在室温(RT)(三角线)、4℃(方形线)、37℃(十字线)，-80℃(凝视线(stareline))下存储或在-80℃下解冻3次(棒状线)。
图3
IL7或TSLP刺激后Effi3与CD127结合的影响。A.MD707-3 mAb(黑方块)的剂量反应中IL-7诱导的pSTAT5+T淋巴细胞的抑制，Effi3mAb(空方块)对IL7依赖性P-STAT5没有影响。B.抗人CD127抗体对产生TSLP诱导的TARC的影响。通过ELISA定量用15ng/ml TSLP和不同浓度的抗人CD127抗体培养24小时的人血CD1C+树突细胞上清液中产生的TARC：MD707-3、Effi3或抗TSLP抗体作为抑制的阳性对照。
图4
Effi3变体(MD707-3的人源化克隆)在不同浓度和在效应子与靶细胞之间的不同比率下的细胞毒性研究。与NK人一起孵育后作为在51Cr标记的LAL-T DND41(CD127+)人T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞系上的Effi3 H3L3和Effi3 H3L4的效应子(E)细胞在不同比率(E：T＝30：1；10：1和3：1)下的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。通过51Cr释放确定特异性细胞毒性的百分比。
图5
人CD127氨基酸序列：粗体氨基酸是由Effi3抗体识别的线性表位序列。
图6
具有IgG1m同种型的Effi3 VH3的氨基酸(aa)序列：灰色aa：信号肽，粗体和斜体aa：CDR1、CDR2和CDR3；下划线aa：IgG1m恒定区；更深的粗体aa：人源化aa。
图7
具有CLkappa恒定区的Effi3VL4的氨基酸(aa)序列：灰色aa：信号肽，粗体和斜体aa：CDR1、CDR2和CDR3；下划线aa：CLkappa恒定区；更深的粗体aa：人源化aa。
实施例/材料和方法/结果
人源化
通过如上所述的生物信息方法(in silico methods)中的去免疫和表面重塑来将MD707-3克隆人源化。
抗体MD707-3由轻链(表6中的SEQ ID No57的序列)和重链(表6中的SEQ ID No56的序列)组成。对MD707-3的结构域含量的分析显示它是Fv，可能来自全长IgG1抗体。分离可变结构域并用kabat CDR定义和编号注释。生成比较MD707-3可变结构域与人类种系的序列比对。基于整体序列同一性，匹配界面位置和类似分类的CDR区域位置，鉴定每条链的种系家族。发现MD707-3与轻链种系KK2-A3和重VH3-3-73相似。构建了亲本和去免疫序列的结构模型。
表1.表面重塑残基
Figure GDA0003320093270000241
Figure GDA0003320093270000251
表2.去免疫取代
Figure GDA0003320093270000252
Figure GDA0003320093270000253
Figure GDA0003320093270000261
已经提出了总共四个表面重塑/去免疫的轻链和四个表面重塑/去免疫的重链。设计了15种变体，并建议在体外表达和表征。
表3.在VH/VL界面中的保留位置
Figure GDA0003320093270000262
表4.确定CDR规范分类的位置
Figure GDA0003320093270000263
抗人CD127 Mab的核苷酸和氨基酸序列
使用RACE PCR技术对Effi3克隆的VH和VL区域进行测序。简而言之，总RNA被提取、逆转录，并使用dATP和末端转移酶在分子的3'末端使得到的cDNA多聚腺苷酸化。使用oligodT锚定引物和Herculease酶(Stratagene)进行第一次35个循环的PCR反应。使用巢式PCR锚定引物进行第二次35个循环的PCR。然后将得到的PCR产物TA克隆到大肠杆菌中，并在氨苄青霉素上选择后，通过限制酶谱分析和被测序的插入cDNA来筛选得到的菌落。
将人源化Effi3变体克隆到pFuse-CHiG或pFuse-CLIg质粒中
pFuseCHIg-hG1e4表达质粒中VH Effi3人源化突变序列的克隆
pFuseCHIg-hG1e4表达质粒(Invivogen)含有人IgG1的CH1+铰链+CH2+CH3恒定域，其被修饰以改善ADCC和CDC细胞毒性作用。首先，仅通过Genscript合成人源化MD707变体WT、VH3和VH4(最人源化的抗体)的序列，插入具有EcoRV 5'和3'末端的克隆载体(pUC57)中，并在ATG之前添加Kozak序列(GCCACC)，送至我们(4μg冻干)，并重悬于20μl的H2O中。用EcoRV限制酶消化每个质粒以提取插入的VH(400bp)。
将纯化的插入物连接到在EcoRV中打开的表达质粒pFuseCHIg-hG1e4表达质粒中并去磷酸化。通过不含Midiprep-内毒素(Macherey-Nagel)的转染步骤，扩增和纯化在人恒定域前以正确方向插入VH片段的阳性克隆。
pFuseCLIg-hk表达质粒中VL Effi3人源化突变序列的克隆
pFuseCLIg-hk表达质粒(Invivogen)含有人IgG1的CLkappa恒定域。首先，仅通过Genscript合成人源化MD707变体VLwt、VL3和VL4的序列，插入具有BsiWI 5'和3'末端的克隆载体(pUC57)中，并在ATG之前添加Kozak序列(GCCACC)，送至我们(4μg冻干)，并重悬于20μl的H2O中。用BsiWI限制酶消化每个质粒以提取插入的VL(400bp)。将纯化的插入物连接到在BsiWI中打开的表达质粒pFuseCLIg-hk表达质粒中并去磷酸化。通过不含Midiprep-内毒素(Macherey-Nagel)的转染步骤，扩增和纯化在人恒定域前以正确方向插入VH片段的阳性克隆。
人源化Effi3(VH3或VH4和VL3或VL4)变体在哺乳动物细胞中的共转染
转染前一日：将COS以100000细胞/孔接种在P12平板中，培养基用完全培养基(DMEM SVF10％(胎牛血清)+PS 1％+谷氨酸1％)，并在37℃、5％的CO2下温育。
转染当日：COS细胞必须达到50％至90％的汇合度。将它们用PBS洗涤并在完全培养基中保存500μl。将0.6μg的VH变体+0.4μg的VL变体在200μl的OptiMEM培养基中混合，并加入1μl的Plus试剂(Invitrogen)(在室温下温育15分钟)。在混合物中加入3.5μl的脂质转染胺(lipofectamine)LTX(Invitrogen)+100μl，并在室温下温育25分钟。将整个混合物一滴一滴地沉积在COS细胞上，并在37％、5％的CO2下温育48小时。48小时后，收获上清液并离心(1500rpm，10分钟，4℃)。对于夹心ELISA，将驴抗人IgG(Fc特异性)抗体以1.2μg/ml包被在P96孔板上，并加入稀释的上清液以测量标准范围函数的浓度。温育和洗涤后，加入小鼠抗人轻链(kappa特异性)和过氧化物酶标记的抗小鼠抗体，并通过常规方法显示。对于活性ELISA测定，将重组hCD127(中国生物，北京，中国；参考号10975-H08H)以1μg/ml固定在塑料上，并加入稀释的上清液以测量结合。温育和洗涤后，加入小鼠抗人轻链(kappa特异性)和过氧化物酶标记的抗小鼠抗体，并通过常规方法显示。作为转染的阳性对照，孔用1μg的DNA用GFP-pcDNA3.1(1μg/μl)转染。在收获所有上清液之前，用荧光显微镜观察该GFP-孔的肉眼对照以检查阳性。经典地，我们获得的COS细胞的转染细胞在大约10％和25％之间。
在COS细胞上进行了两次实验，最后一次实验在CHO细胞上进行(没有Plus试剂)。
用人源化变体转染上清液中分泌的Effi3变体的表征
在共转染的每个上清液中，根据人IvIgG标准，通过夹心ELISA测定(抗hFc抗体/抗hkappa抗体)测量分泌的MD707-3(VH+VL)的浓度。通过活性ELISA测定(CD127Fc重组蛋白/抗hkappa抗体)与纯化的嵌合MD707-3标准品的活性比较，测定每次共转染中MD707-3的CD127上的结合。仅用质粒VH或VL的阴性对照没有抗CD127活性。
结果显示(数据未显示)，对于轻链，VLvar3和VLvar4与VLwt相比不诱导结合活性的改变。然而，对于重链，VHvar4(最人源化的)改变了Effi7h在CD127蛋白上的结合，因为该链的ED50活性与其他链VHvar3或VHwt相比非常差。VHvar3突变未改变其与受体的结合。
最后，最人源化的组合(VHvar4+VLvar4)完全丧失其结合活性。然而，保持其结合活性的最人源化序列是VHvar3+VLvar3。
两个保留的Effi3变体，即保持其结合活性的最人源化序列，是：
·SEQ ID No2的VHvar3+VLvar3序列和SEQ ID No4序列(或者对于信号序列，SEQID No8和10的序列)。该抗体在本文中称为VH3VL3
·SEQ ID No2的VHvar3+VLvar4序列和SEQ ID No6序列(或者对于信号序列，SEQID No8和12的序列)。该抗体在本文中称为VH3VL4
通过细胞荧光测定法进行IL7R结合测定
为了测量抗IL7R对人PBMC的结合，将抗体与人PBMC在4℃温育30分钟，洗涤，然后在4℃用不与Effi7抗体交叉反应的APC标记的抗CD3(克隆HIT3a，BD Bioscience公司，参考号555342)和PE标记的抗CD127(克隆hIL7R-M21，BD Bioscience公司，参考号557938)染色30分钟。样品在CD3+细胞上在BD LSR II细胞荧光仪上分析并门控。
通过ELISA评估rCD127对抗h-CD127 Mab的识别
通过ELISA(酶联免疫吸附测定)评价抗hCD127抗体的结合活性。对于ELISA测定，将重组hCD127(中国生物，北京，中国；参考号10975-H08H)以1μg/ml固定在塑料上，并加入纯化的抗体以测量结合。温育和洗涤后，加入过氧化物酶标记的小鼠抗大鼠κ链(AbdSerotec)并通过常规方法显示。
如图1B所示，通过ELISA测量的Effi3抗体的结合活性很高，Effi3 H3L4和Effi3H3L3抗hCD127抗体的ED50＝4ng/mL，MD707-3嵌合抗体的ED50为3.4ng/ml。
稳定性测定
将人源化Effi3抗体(克隆VH3VL4)在4℃、37℃、-80℃或室温下温育28天。通过ELISA测定法测试结合活性，将重组hCD127(中国生物，北京，中国；参考号10975-H08H)以1μg/ml固定在塑料上，并加入稀释的上清液以测量结合。温育和洗涤后，加入小鼠抗人轻链(kappa特异性)和过氧化物酶标记的驴抗小鼠抗体，并通过常规方法显示。增加Mab的剂量以测量结合。温育和洗涤后，加入过氧化物酶标记的小鼠抗大鼠κ链(AbdSerotec)并通过常规方法显示。
结果如图2显示，纯化的Effi3随时间和在不同的储存温度后是稳定的。
Phospho Stat5活性测定
由来自健康志愿者的聚蔗糖梯度(ficoll gradient)收获的人外周血单核细胞(PBMC)在具有不同浓度的目标抗体的无血清培养基中室温下温育15分钟，然后与0.1或5ng/ml的重组人IL-7(rhIL-7；AbD Serotec参考号PHP046)一起在37℃温育15分钟。分析未用rhIL-7处理的PBMC作为背景信号，而将无抗体的IL-7处理的细胞设定为阴性对照。然后，快速冷冻PBMC并用FACS缓冲液洗涤以终止反应。然后用冷的Cytofix/Cytoperm溶液(BDBioscience，参考号554722)温育细胞15分钟，用Perm/Wash缓冲液(Bd Bioscience)洗涤两次，并用抗人CD3 FITC抗体(Bd Bioscience，参考号557694)在冰上染色30分钟。然后用Perm/Wash缓冲液洗涤PBMC两次，并在BD Perm Buffer III(Bd Bioscience，参考号558050)中透化30分钟。然后将细胞在FACS缓冲液(和/或含有1％BSA和0.1％叠氮化物的PBS)中洗涤两次，并在室温下与抗人pSTAT5 Alexa 647抗体(BD Bioscience，参考号612599)一起温育30分钟。在BD CANTO II FACS仪器上分析样品。如图3A所示，衍生自MD707-3抗体的Effi3抗体(变体VH3VL4)与亲本抗体MD707-3相比没有更多的STAT5磷酸化的抑制活性。
TARC分泌测定
用来自健康志愿者(Etablissement
Figure GDA0003320093270000301
du Sang，南斯，法国)的血液的CD1c(BDCA-1)+树突细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)分离髓样树突细胞(DC)。在含有10％胎牛血清、1％丙酮酸盐、1％Hepes、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的RPMI中培养髓样树突细胞。在单独的TSLP(15ng/ml)、LPS(1μg/ml)或培养基的存在下，以不同浓度添加不同的人CD127抗体(MD707-3，Effi3-VH3VL4)或抗TSLP抗体，将细胞以5.104个细胞/孔接种在96孔平板中。在培养24小时后，收集上清液并通过ELISA测定(R&D系统，明尼阿波里斯市，USA)分析TARC的产生。
在不存在抗体或存在MD707-3或Effi3或商业抗TSLPR抗体(R&D系统，参考编号AF981)(0.2、1、5或25μg/ml)时，通过如上所述测量所述产生来评价对TSLP诱导的TARC产生的抑制。如图3B所示，与其亲本抗体MD707-3和阳性对照抗TSLP抗体相比，Effi3不再抑制TSLP诱导的TARC的产生。
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
抗人CD127 Mab ADCC的ADCC是指，抗体与靶细胞上表达的表位的结合以及表达Fc受体的效应免疫细胞(基本上是NK细胞和活化的淋巴细胞)的随后的Fc依赖性募集，导致主要通过基于颗粒酶/穿孔素的机制杀死靶细胞。
为了以其原始(大鼠)形式使用抗体，效应细胞是在组织培养瓶(Corning GlassWorks，康宁，纽约)中用1000UI/ml的IL-2(罗氏，巴塞尔，瑞士)培养的脾细胞产生的大鼠淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞。
当抗体人源化时，效应细胞是通过使用磁珠(NK分离试剂盒，Miltenyi Biotec，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)用AutoMACS细胞分选仪器进行阴性选择而从外周血单核细胞分离的新鲜原代人NK细胞。将NK细胞在37℃、5％的CO2下在RPMI 1640培养基(LifeTechnologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚)中温育过夜，该培养基补充有10％FBS(LifeTechnologies)、100IU/ml青霉素(Life Technologies)、0.1mg/ml链霉素(LifeTechnologies)、2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)和150IU/ml的人IL-2(罗氏，巴塞尔，瑞士)。
靶细胞用100μCi(3.7MBq)的51Cr(PerkinElmer)在37℃标记1小时，并用培养基洗涤三次。将靶细胞与稀释的抗体或与赋形剂(培养基)在室温下温育15分钟，并将10000个细胞置于U形底的96孔板中。以指定的E：T(效应细胞：靶细胞)细胞比率(终体积：200μl)加入效应T细胞，在37℃温育4小时。然后收获总共25μl的上清液并在γ计数器(PackardInstrument)中计数。通过51Cr释放测定特异性细胞毒性的百分比。
图4显示的结果显示，Effi3的H3L4和H3L3变体抗体以剂量依赖性的方式诱导ADCC。
使用肽微阵列进行抗体分析
肽技术PepStarTM肽微阵列包含衍生自抗原或其他来源的纯化合成肽，其化学选择性地且共价地固定在玻璃表面上。在玻璃表面和抗原衍生的肽序列之间插入优化的亲水接头部分，以避免由空间位阻引起的假阴性。由于技术原因，所有肽都含有C-末端甘氨酸。在由52种肽组成的肽文库上进行样品的分析实验。肽的完整列表如下所示：
表5.肽微阵列测定中所用的肽的列表
Figure GDA0003320093270000311
Figure GDA0003320093270000321
使用Multiwell-format在微阵列载玻片上温育总共9个样品。对于N13B2抗体和其他样品，应用4种不同浓度(10、1、0.1和0.01μg/ml)。平行进行一次阴性对照温育(仅二级抗体)。将人和小鼠IgG蛋白与每组肽一起共固定，以用作测定的对照组。使用两个载玻片平行进行所有温育。通过单独应用荧光标记的检测抗体，将各载玻片上的两个肽-微型阵列用作温育对照组，以评估与肽的假阳性结合。在洗涤和干燥载玻片后，用高分辨率激光扫描仪在635nm扫描它们，以获得荧光强度的图像。量化图像以产生每种肽的平均像素值。用Cy5以1μg/ml标记二抗抗大鼠IgG(JIR 212-175-082)。缓冲液和溶液：使用的缓冲液是TBS缓冲液，包括0.05％Tween20(JPT)和测定缓冲液T20(Pierce，SuperBlock TBS T20，#37536)。使用肽微阵列(JPT Peptide Technologies GmbH，柏林，德国；批号#2668，Multi-Well温育室，Axon Genepix Scanner 4200AL，Spot-recognition软件GenePix和Microsoft Excel)进行采集和分析。
图5呈现的结果显示了Effi3抗体在CD127上识别的线性表位的序列。
下表(表6)公开了本文所述的序列。“Nb”代表每个序列的SEQ ID NO；“类型”公开了序列的性质，DNA或氨基酸序列(PRT)，以及“len”代表序列的长度。
Figure GDA0003320093270000322
Figure GDA0003320093270000331
Figure GDA0003320093270000341
Figure GDA0003320093270000351
Figure GDA0003320093270000361
参考文献
Adams,A.B.,Pearson,T.C.,和Larsen,C.P.(2003).Heterologous immunity:anoverlooked barrier to tolerance.Immunol.Rev.196,147–160.
Albuquerque,A.S.,
Figure GDA0003320093270000371
C.S.,Foxall,R.B.,Soares,R.S.,Victorino,R.M.M.,和Sousa,A.E.(2007).循环IL-7的增加率和IL-7Rα表达的丧失在HIV-1和HIV-2感染中不同：两种具有相似的超免疫激活但结果不同的淋巴细胞减少性疾病(Rate ofincrease in circulating IL-7and loss of IL-7Ralpha expression differ in HIV-1and HIV-2infections:two lymphopenic diseases with similar hyperimmuneactivation but distinct outcomes.)，J.Immunol.Baltim.Md 1950年，178,3252–3259.
Al-Lazikani,B.,Lesk,A.M.,和Chothia,C.(1997).免疫球蛋白规范结构的标准构象(Standard conformations for the canonical structures ofimmunoglobulins.)，J.Mol.Biol.273,927–948.
Almagro,J.C.,Teplyakov,A.,Luo,J.,Sweet,R.W.,Kodangattil,S.,Hernandez-Guzman,F.,和Gilliland,G.L.(2014).第二抗体建模评估(AMA-II)(Second antibodymodeling assessment(AMA-II).)，Proteins 82,1553–1562.
Armour,K.L.,Clark,M.R.,Hadley,A.G.,和Williamson,L.M.(1999).缺乏Fcγ受体I结合和单核细胞触发活性的重组人IgG分子(Recombinant human IgG moleculeslacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities.)，Eur.J.Immunol.29,2613–2624.
Broux,B.,Hellings,N.,Venken,K.,Rummens,J.-L.,Hensen,K.,VanWijmeersch,B.,和Stinissen,P.(2010).多发性硬化相关白细胞介素-7受体α基因的单倍型4影响近期胸腺移民的频率(Haplotype 4of the multiple sclerosis-associatedinterleukin-7receptor alpha gene influences the frequency of recent thymicemigrants.)，Genes Immun.11,326–333.
Bruhns,P.,Iannascoli,B.,England,P.,Mancardi,D.A.,Fernandez,N.,Jorieux,S.,和
Figure GDA0003320093270000372
M.(2009).人Fcγ受体及其多态性变体对人IgG亚类的特异性和亲和力(Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and theirpolymorphic variants for human IgG subclasses.)，Blood 113,3716–3725.
Chan,A.C.,和Carter,P.J.(2010).用于自身免疫和炎症的治疗性抗体(Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation.)，Nat.Rev.Immunol.10,301–316.
Chothia,C.,和Lesk,A.M.(1987).免疫球蛋白高变区的典型结构(Canonicalstructures for the hypervariable regions of immunoglobulins.)，J.Mol.Biol.196,901–917.
Datta-Mannan,A.,Witcher,D.R.,Tang,Y.,Watkins,J.,Jiang,W.,和Wroblewski,V.J.(2007).具有与新生儿Fc受体的差异结合特性的人源化IgG1变体：与小鼠和灵长类动物的药代动力学的关系(Humanized IgG1 variants with differentialbinding properties to the neonatal Fc receptor:relationship topharmacokinetics in mice and primates.)，Drug Metab.Dispos.Biol.Fate Chem.35,86–94.
Desmet,J.,Spriet,J.,和Lasters,I.(2002).快速准确的侧链拓扑和能量提炼(FASTER)作为蛋白质结构优化的新方法(Fast and accurate side-chain topology andenergy refinement(FASTER)as a new method for protein structureoptimization.)，Proteins 48,31–43.
Ewert,S.,Honegger,A.,和Plückthun,A.(2003).用可推广的方法改进基于结构的免疫球蛋白VH结构域的生物物理特性(Structure-based improvement of thebiophysical properties of immunoglobulin VH domains with a generalizableapproach.)，Biochemistry(Mosc.)42,1517–1528.
Haudebourg,T.,Poirier,N.,和Vanhove,B.(2009).在器官移植中消耗T细胞亚群(Depleting T-cell subpopulations in organ transplantation.)，Transpl.Int.Off.J.Eur.Soc.Organ Transplant.22,509–518.
Hinton,P.R.,Johlfs,M.G.,Xiong,J.M.,Hanestad,K.,Ong,K.C.,Bullock,C.,Keller,S.,Tang,M.T.,Tso,J.Y.,Vásquez,M.等(2004).设计的在灵长类动物中具有更长血清半衰期的人IgG抗体(Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates.)，J.Biol.Chem.279,6213–6216.
Honegger,A.,Malebranche,A.D.,
Figure GDA0003320093270000381
D.,和Plückthun,A.(2009).框架核心残基对免疫球蛋白重链可变结构域的生物物理特性的影响(The influence of theframework core residues on the biophysical properties of immunoglobulin heavychain variable domains.)，Protein Eng.Des.Sel.PEDS 22,121–134.
Idusogie,E.E.,Presta,L.G.,Gazzano-Santoro,H.,Totpal,K.,Wong,P.Y.,Ultsch,M.,Meng,Y.G.,和Mulkerrin,M.G.(2000).在利妥昔单抗上定位C1q结合位点，利妥昔单抗是具有人IgG1 Fc的嵌合抗体(Mapping of the C1q binding site on rituxan,achimeric antibody with a human IgG1 Fc.)，J.Immunol.Baltim.Md 1950 164,4178–4184.
Jariwala,S.P.,Abrams,E.,Benson,A.,Fodeman,J.,和Zheng,T.(2011).胸腺基质淋巴细胞生成素在特应性皮炎免疫发病机制中的作用(The role of thymic stromallymphopoietin in the immunopathogenesis of atopic dermatitis.)，Clin.Exp.Allergy J.Br.Soc.Allergy Clin.Immunol.41,1515–1520.
Jones,P.T.,Dear,P.H.,Foote,J.,Neuberger,M.S.,和Winter,G.(1986).将人抗体中的互补决定区替换为来自小鼠的互补决定区(Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse.)，Nature 321,522–525.
Labrijn,A.F.,Buijsse,A.O.,van den Bremer,E.T.J.,Verwilligen,A.Y.W.,Bleeker,W.K.,Thorpe,S.J.,Killestein,J.,Polman,C.H.,Aalberse,R.C.,Schuurman,J.等(2009).治疗性IgG4抗体在体内与内源性人IgG4进行Fab臂交换(Therapeutic IgG4antibodies engage in Fab-arm exchange with endogenous human IgG4 in vivo.)，Nat.Biotechnol.27,767–771.
Lazar,G.A.,Dang,W.,Karki,S.,Vafa,O.,Peng,J.S.,Hyun,L.,Chan,C.,Chung,H.S.,Eivazi,A.,Yoder,S.C.等(2006).具有增强的效应功能的工程化抗体Fc变体(Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function.)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103,4005–4010.
Martin,A.C.R.(2001).在抗体工程中，抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.InAntibody Engineering,)，D.R.Kontermann,和D.S.Dübel,eds.(Springer BerlinHeidelberg),422–439页.
Michel,L.,Berthelot,L.,Pettré,S.,Wiertlewski,S.,Lefrère,F.,Braudeau,C.,Brouard,S.,Soulillou,J.-P.,和Laplaud,D.-A.(2008).当从分析中排除表达IL-7受体α链的细胞时，具有复发缓解型多发性硬化的患者具有正常的Treg功能(Patients withrelapsing-remitting multiple sclerosis have normal Treg function when cellsexpressing IL-7receptor alpha-chain are excluded from the analysis.)，J.Clin.Invest.118,3411–3419.
North,B.,Lehmann,A.,和Dunbrack,R.L.(2011).抗体CDR环构象的新族(A newclustering of antibody CDR loop conformations.)，J.Mol.Biol.406,228–256.
Racapé,M.,Vanhove,B.,Soulillou,J.-P.,和Brouard,S.(2009).白细胞介素7受体α作为移植的潜在治疗靶点(Interleukin 7receptor alpha as a potentialtherapeutic target in transplantation.)，Arch.Immunol.Ther.Exp.(Warsz.)57,253–261.
Richards,J.O.,Karki,S.,Lazar,G.A.,Chen,H.,Dang,W.,和Desjarlais,J.R.(2008).抗体与FcγRIIa结合的优化增强了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用(Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophagephagocytosis of tumor cells.)，Mol.Cancer Ther.7,2517–2527.
Rochman,Y.,Kashyap,M.,Robinson,G.W.,Sakamoto,K.,Gomez-Rodriguez,J.,Wagner,K.-U.,和Leonard,W.J.(2010).通过激酶JAK1和JAK2的胸腺基质淋巴细胞生成素介导的STAT5磷酸化揭示了与IL-7诱导的信号传导的关键差异(Thymic stromallymphopoietin-mediated STAT5 phosphorylation via kinases JAK1 and JAK2reveals a key difference from IL-7-induced signaling.)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107,19455–19460.
Ryan,M.C.,Hering,M.,Peckham,D.,McDonagh,C.F.,Brown,L.,Kim,K.M.,Meyer,D.L.,Zabinski,R.F.,Grewal,I.S.,和Carter,P.J.(2007).B细胞成熟抗原在恶性浆细胞上的抗体靶向性(Antibody targeting of B-cell maturation antigen on malignantplasma cells.)，Mol.Cancer Ther.6,3009–3018.
Shields,R.L.,Namenuk,A.K.,Hong,K.,Meng,Y.G.,Rae,J.,Briggs,J.,Xie,D.,Lai,J.,Stadlen,A.,Li,B.等(2001).用于FcγRI，FcγRII，FcγRIII和FcRn的人IgG1上的结合位点的高分辨率定点以及具有改善的与FcγR的结合的IgG1变体的设计(Highresolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI,Fc gammaRII,Fc gamma RIII,and FcRn and design of IgG1 variants with improved bindingto the Fc gamma R.)，J.Biol.Chem.276,6591–6604.
Shinohara,T.,Nemoto,Y.,Kanai,T.,Kameyama,K.,Okamoto,R.,Tsuchiya,K.,Nakamura,T.,Totsuka,T.,Ikuta,K.,和Watanabe,M.(2011).在大肠致病性记忆CD4+T细胞上增加的IL-7受体α表达可能参与慢性结肠炎的发展和持续存在(Upregulated IL-7receptorαexpression on colitogenic memory CD4+T cells may participate in thedevelopment and persistence of chronic colitis.)，J.Immunol.Baltim.Md 1950186,2623–2632.
Steurer,W.,Nickerson,P.W.,Steele,A.W.,Steiger,J.,Zheng,X.X.,和Strom,T.B.(1995).用鼠CTLA4/Fc离体涂覆胰岛细胞同种异体移植物促进移植物耐受性(Ex vivocoating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotes grafttolerance.)，J.Immunol.Baltim.Md 1950 155,1165–1174.
Strohl,W.R.(2009).优化Fc介导的单克隆抗体效应子功能(Optimization ofFc-mediated effector functions of monoclonal antibodies.)，Curr.Opin.Biotechnol.20,685–691.
Taylor,B.C.,Zaph,C.,Troy,A.E.,Du,Y.,Guild,K.J.,Comeau,M.R.,和Artis,D.(2009).TSLP在蠕虫感染和结肠炎的小鼠模型中调节肠道免疫和炎症(TSLP regulatesintestinal immunity and inflammation in mouse models of helminth infectionand colitis.)，J.Exp.Med.206,655–667.
Vargas-Madrazo,E.,和Paz-García,E.(2003).改进的VH-VL免疫球蛋白结构域的关联模型：在一些界面残基的包装中VH和VL之间的不对称性(An improved model ofassociation for VH-VL immunoglobulin domains:asymmetries between VH and VL inthe packing of some interface residues.)，J.Mol.Recognit.JMR 16,113–120.
Ying,S.,O’Connor,B.,Ratoff,J.,Meng,Q.,Fang,C.,Cousins,D.,Zhang,G.,Gu,S.,Gao,Z.,Shamji,B.等(2008).患有重症哮喘和慢性阻塞性肺病的患者中胸腺基质淋巴细胞生成素和趋化因子的表达及细胞来源(Expression and cellular provenance ofthymic stromal lymphopoietin and chemokines in patients with severe asthmaand chronic obstructive pulmonary disease.)，J.Immunol.Baltim.Md 1950 181,2790–2798.
序列表
<110> OSE免疫疗法
<120> 针对IL7受体胞外域的α链的非拮抗性抗体及其在癌症治疗中的应用
<150> 62/301271
<151> 2016-02-29
<160> 109
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VHvar3
<400> 1
gctgtgcagc tggtcgaatc tggggggggg ctggtccagc ccggcgggtc tctgaaaatc 60
acttgcgccg ctagtgggtt cacctttaca aacgcagcca tgtactgggt ccgacaggct 120
cctggaaagg gcctggagtg ggtggcacgg atcagaacaa aggctaacaa ctacgcaact 180
tactatgccg actcagtgaa gggcaggttc accattagcc gcgacgatag caaatccaca 240
gtctacctgc agatggactc tgtgaagaca gaagatactg ccacctacta ttgtattgtg 300
gtcgtgctga ctactacacg ggattacttt gactattggg gacagggagt gctggtgaca 360
gtgagttca 369
<210> 2
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VHvar3_aa
<400> 2
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Ala
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Val Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ile Val Val Val Leu Thr Thr Thr Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VLvar3
<400> 3
gacatcgtcc tgactcagtc cccctcttcc ctgccagtga cacctggaga gccagcatct 60
atcagttgcc gaagctccca gtcactgctg actgtcaagg gaattaccag cctgtactgg 120
ttcctgcaga agcccggcca gtcccctaaa ctgctgatct atcggatgtc taacagagac 180
agtggggtgc ccgataggtt ctcaggcagc gggtccgaaa ccgactttac actgaaaatt 240
tctcgcgtgg aggctgaaga tgtcggaacc tactattgcg cacagtttct ggaataccct 300
cacactttcg gggcaggcac taagctggag ctgaagcgt 339
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VLvar3_aa
<400> 4
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Val
20 25 30
Lys Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg
<210> 5
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3-VLvar4
<400> 5
gacatcgtgc tgacacagag tccctcctcc ctgccagtga cacctggaga gccagcatct 60
atcagttgcc gaagctccca ggacctgctg actgtcaagg gcattacctc actgtactgg 120
ttcctgcaga agcccgggca gagccctaaa ctgctgatct atcggatgtc taacagagac 180
agtggagtgc ccgataggtt ctcaggcagc gggtccggaa ccgactttac actgaaaatt 240
tctcgcgtgg aggctgaaga tgtcggcacc tactattgcg cacagtttct ggagtatccc 300
cacacctttg gagcaggcac taagctggag ctgaagcgt 339
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3-VLvar4_aa
<400> 6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asp Leu Leu Thr Val
20 25 30
Lys Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg
<210> 7
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VHvar3 (+信号肽)
<400> 7
atgctggtcc tgcagtgggt cctggtcacc gctctgtttc agggggtcca ttgtgctgtg 60
cagctggtcg aatctggggg ggggctggtc cagcccggcg ggtctctgaa aatcacttgc 120
gccgctagtg ggttcacctt tacaaacgca gccatgtact gggtccgaca ggctcctgga 180
aagggcctgg agtgggtggc acggatcaga acaaaggcta acaactacgc aacttactat 240
gccgactcag tgaagggcag gttcaccatt agccgcgacg atagcaaatc cacagtctac 300
ctgcagatgg actctgtgaa gacagaagat actgccacct actattgtat tgtggtcgtg 360
ctgactacta cacgggatta ctttgactat tggggacagg gagtgctggt gacagtgagt 420
tca 423
<210> 8
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VHvar3_aa (+信号肽)
<400> 8
Met Leu Val Leu Gln Trp Val Leu Val Thr Ala Leu Phe Gln Gly Val
1 5 10 15
His Cys Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Lys Ile Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
35 40 45
Asn Ala Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Val Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys
85 90 95
Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Val Lys Thr Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Ile Val Val Val Leu Thr Thr Thr Arg Asp Tyr Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 9
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VLvar3 (+信号肽)
<400> 9
atgaagtttc ctgctcagtt tctgggcctg attgtgctgt gtattcctgg cgctaccgga 60
gacatcgtcc tgactcagtc cccctcttcc ctgccagtga cacctggaga gccagcatct 120
atcagttgcc gaagctccca gtcactgctg actgtcaagg gaattaccag cctgtactgg 180
ttcctgcaga agcccggcca gtcccctaaa ctgctgatct atcggatgtc taacagagac 240
agtggggtgc ccgataggtt ctcaggcagc gggtccgaaa ccgactttac actgaaaatt 300
tctcgcgtgg aggctgaaga tgtcggaacc tactattgcg cacagtttct ggaataccct 360
cacactttcg gggcaggcac taagctggag ctgaagcgt 399
<210> 10
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VLvar3_aa (+信号肽)
<400> 10
Met Lys Phe Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Ile Val Leu Cys Ile Pro
1 5 10 15
Gly Ala Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro
20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Thr Val Lys Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Asp
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Gln Phe Leu Glu Tyr Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Leu Lys Arg
130
<210> 11
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3-VLvar4 (+信号肽)
<400> 11
atgaagttcc ctgctcagtt cctggggctg attgtcctgt gcattcctgg ggcaaccggc 60
gacatcgtgc tgacacagag tccctcctcc ctgccagtga cacctggaga gccagcatct 120
atcagttgcc gaagctccca ggacctgctg actgtcaagg gcattacctc actgtactgg 180
ttcctgcaga agcccgggca gagccctaaa ctgctgatct atcggatgtc taacagagac 240
agtggagtgc ccgataggtt ctcaggcagc gggtccggaa ccgactttac actgaaaatt 300
tctcgcgtgg aggctgaaga tgtcggcacc tactattgcg cacagtttct ggagtatccc 360
cacacctttg gagcaggcac taagctggag ctgaagcgt 399
<210> 12
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3-VLvar4_aa (+信号肽)
<400> 12
Met Lys Phe Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Ile Val Leu Cys Ile Pro
1 5 10 15
Gly Ala Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro
20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asp
35 40 45
Leu Leu Thr Val Lys Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Asp
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Gln Phe Leu Glu Tyr Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Leu Lys Arg
130
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VHvar3_CDR1
<400> 13
ttcaccttta caaacgcagc catgtac 27
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VHvar3_CDR1-aa
<400> 14
Phe Thr Phe Thr Asn Ala Ala Met Tyr
1 5
<210> 15
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VHvar3_CDR2
<400> 15
cggatcagaa caaaggctaa caactacgca acttactatg ccgactcagt gaagggc 57
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VHvar3_CDR2-aa
<400> 16
Arg Ile Arg Thr Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VHvar3_CDR3
<400> 17
gtcgtgctga ctactacacg ggattacttt gactat 36
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VHvar3_CDR3-aa
<400> 18
Val Val Leu Thr Thr Thr Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VLvar3_CDR1
<400> 19
cgaagctccc agtcactgct gactgtcaag ggaattacca gcctgtac 48
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VLvar3-CDR1_aa
<400> 20
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Val Lys Gly Ile Thr Ser Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VLvar3/4_CDR2
<400> 21
cggatgtcta acagagacag t 21
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VLvar3/4_CDR2aa
<400> 22
Arg Met Ser Asn Arg Asp Ser
1 5
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VLvar3/4_CDR3
<400> 23
gcacagtttc tggaataccc tcacact 27
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3 VLvar3/4_CDR3aa
<400> 24
Ala Gln Phe Leu Glu Tyr Pro His Thr
1 5
<210> 25
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3-VLvar4_CDR1
<400> 25
cgaagctccc aggacctgct gactgtcaag ggcattacct cactgtac 48
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3-VLvar4_CDR1_aa
<400> 26
Arg Ser Ser Gln Asp Leu Leu Thr Val Lys Gly Ile Thr Ser Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 27
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG1m (E333A)
<400> 27
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgcgaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993
<210> 28
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG1m (E333A)_aa
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 29
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4m (S228P)
<400> 29
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960
ctctccctgt ctccgggtaa atga 984
<210> 30
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4m (S228P)_aa
<400> 30
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 31
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG2b
<400> 31
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300
aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540
gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600
aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccatgct ggactccgac 840
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960
tccctgtctc cgggtaaatg a 981
<210> 32
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG2b_aa
<400> 32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 33
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CLkappa
<400> 33
acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300
ttcaacaggg gagagtgtta g 321
<210> 34
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CLkappa_aa
<400> 34
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 35
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CLlambda
<400> 35
ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa 60
gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg 120
gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180
caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tatctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240
tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300
gcccctacag aatgttcata g 321
<210> 36
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CLlambda_aa
<400> 36
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 37
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人Fc_IgG1(UniprotP01857)
<400> 37
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 38
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人Fc_IgG4(UniprotP01861)
<400> 38
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
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<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人CD127 aa
<400> 39
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1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp
20 25 30
Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val
35 40 45
Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val
50 55 60
Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val
65 70 75 80
Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr
85 90 95
Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly
100 105 110
Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys
115 120 125
Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn
130 135 140
Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn
165 170 175
Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln
180 185 190
Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile
195 200 205
Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr
210 215 220
Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro
225 230 235 240
Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu
245 250 255
Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val
260 265 270
Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys
275 280 285
Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu
290 295 300
Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val
305 310 315 320
Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu
325 330 335
Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu
340 345 350
Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser
370 375 380
Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val
385 390 395 400
Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro
405 410 415
Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala
420 425 430
Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala
435 440 445
Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
450 455
<210> 40
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 40
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Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu
65 70 75 80
Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu
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100 105 110
Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val
115 120 125
Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met
130 135 140
His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His
145 150 155 160
Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln
165 170 175
Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr
180 185 190
Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr
195 200 205
Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccgctagtg ggttcacctt tacaaacgca gccatgtact gggtccgaca ggctcctgga 180
aagggcctgg agtgggtggc acggatcaga acaaaggcta acaactacgc aacttactat 240
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ctgcagatgg actctgtgaa gacagaagat actgccacct actattgtat tgtggtcgtg 360
ctgactacta cacgggatta ctttgactat tggggacagg gagtgctggt gacagtgagt 420
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 720
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 960
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020
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<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VH3_IgG1m(E333A)_aa
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100 105 110
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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
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145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
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290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
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405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 43
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VH3_IgG4(S228P)
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atgctggtcc tgcagtgggt cctggtcacc gctctgtttc agggggtcca ttgtgctgtg 60
cagctggtcg aatctggggg ggggctggtc cagcccggcg ggtctctgaa aatcacttgc 120
gccgctagtg ggttcacctt tacaaacgca gccatgtact gggtccgaca ggctcctgga 180
aagggcctgg agtgggtggc acggatcaga acaaaggcta acaactacgc aacttactat 240
gccgactcag tgaagggcag gttcaccatt agccgcgacg atagcaaatc cacagtctac 300
ctgcagatgg actctgtgaa gacagaagat actgccacct actattgtat tgtggtcgtg 360
ctgactacta cacgggatta ctttgactat tggggacagg gagtgctggt gacagtgagt 420
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 480
gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag 660
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<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VH3_IgG4(S228P)_aa
<400> 44
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1 5 10 15
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Gly Gly Ser Leu Lys Ile Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
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Asn Ala Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Val Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys
85 90 95
Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Val Lys Thr Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Ile Val Val Val Leu Thr Thr Thr Arg Asp Tyr Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
145 150 155 160
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
210 215 220
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 45
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VH3_IgG2b
<400> 45
atgctggtcc tgcagtgggt cctggtcacc gctctgtttc agggggtcca ttgtgctgtg 60
cagctggtcg aatctggggg ggggctggtc cagcccggcg ggtctctgaa aatcacttgc 120
gccgctagtg ggttcacctt tacaaacgca gccatgtact gggtccgaca ggctcctgga 180
aagggcctgg agtgggtggc acggatcaga acaaaggcta acaactacgc aacttactat 240
gccgactcag tgaagggcag gttcaccatt agccgcgacg atagcaaatc cacagtctac 300
ctgcagatgg actctgtgaa gacagaagat actgccacct actattgtat tgtggtcgtg 360
ctgactacta cacgggatta ctttgactat tggggacagg gagtgctggt gacagtgagt 420
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 480
gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt cggcacccag 660
acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gacagttgag 720
cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accgtcagtc 780
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa cagcacgttc 960
cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 1020
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa 1080
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1200
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccat gctggactcc 1260
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380
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<210> 46
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VH3_IgG2b_aa
<400> 46
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Gly Ser Leu Lys Ile Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
35 40 45
Asn Ala Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Val Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys
85 90 95
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100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Ile Val Val Val Leu Thr Thr Thr Arg Asp Tyr Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
145 150 155 160
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys
210 215 220
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu
225 230 235 240
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 47
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VL4_CLkappa
<400> 47
atgaagttcc ctgctcagtt cctggggctg attgtcctgt gcattcctgg ggcaaccggc 60
gacatcgtgc tgacacagag tccctcctcc ctgccagtga cacctggaga gccagcatct 120
atcagttgcc gaagctccca ggacctgctg actgtcaagg gcattacctc actgtactgg 180
ttcctgcaga agcccgggca gagccctaaa ctgctgatct atcggatgtc taacagagac 240
agtggagtgc ccgataggtt ctcaggcagc gggtccggaa ccgactttac actgaaaatt 300
tctcgcgtgg aggctgaaga tgtcggcacc tactattgcg cacagtttct ggagtatccc 360
cacacctttg gagcaggcac taagctggag ctgaagcgta cggtggctgc accatctgtc 420
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720
<210> 48
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VL4_CLkappa_aa
<400> 48
Met Lys Phe Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Ile Val Leu Cys Ile Pro
1 5 10 15
Gly Ala Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro
20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asp
35 40 45
Leu Leu Thr Val Lys Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Asp
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Gln Phe Leu Glu Tyr Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165 170 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 49
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VL3_Clkappa
<400> 49
atgaagtttc ctgctcagtt tctgggcctg attgtgctgt gtattcctgg cgctaccgga 60
gacatcgtcc tgactcagtc cccctcttcc ctgccagtga cacctggaga gccagcatct 120
atcagttgcc gaagctccca gtcactgctg actgtcaagg gaattaccag cctgtactgg 180
ttcctgcaga agcccggcca gtcccctaaa ctgctgatct atcggatgtc taacagagac 240
agtggggtgc ccgataggtt ctcaggcagc gggtccgaaa ccgactttac actgaaaatt 300
tctcgcgtgg aggctgaaga tgtcggaacc tactattgcg cacagtttct ggaataccct 360
cacactttcg gggcaggcac taagctggag ctgaagcgta cggtggctgc accatctgtc 420
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720
<210> 50
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VL3_CLkappa_aa
<400> 50
Met Lys Phe Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Ile Val Leu Cys Ile Pro
1 5 10 15
Gly Ala Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro
20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Thr Val Lys Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Asp
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Gln Phe Leu Glu Tyr Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165 170 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 51
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VL4_Cllambda
<400> 51
atgaagttcc ctgctcagtt cctggggctg attgtcctgt gcattcctgg ggcaaccggc 60
gacatcgtgc tgacacagag tccctcctcc ctgccagtga cacctggaga gccagcatct 120
atcagttgcc gaagctccca ggacctgctg actgtcaagg gcattacctc actgtactgg 180
ttcctgcaga agcccgggca gagccctaaa ctgctgatct atcggatgtc taacagagac 240
agtggagtgc ccgataggtt ctcaggcagc gggtccggaa ccgactttac actgaaaatt 300
tctcgcgtgg aggctgaaga tgtcggcacc tactattgcg cacagtttct ggagtatccc 360
cacacctttg gagcaggcac taagctggag ctgaagcgtg gtcagcccaa ggctgccccc 420
tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag ccaacaaggc cacactggtg 480
tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg cctggaaggc agatagcagc 540
cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcg 600
gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt cccacagaag ctacagctgc 660
caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg cccctacaga atgttcatag 720
<210> 52
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VL4_CLlambda_aa
<400> 52
Met Lys Phe Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Ile Val Leu Cys Ile Pro
1 5 10 15
Gly Ala Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro
20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asp
35 40 45
Leu Leu Thr Val Lys Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Asp
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Gln Phe Leu Glu Tyr Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu
130 135 140
Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val
145 150 155 160
Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys
165 170 175
Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser
180 185 190
Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr
195 200 205
Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His
210 215 220
Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230 235
<210> 53
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VL3_Cllambda
<400> 53
atgaagtttc ctgctcagtt tctgggcctg attgtgctgt gtattcctgg cgctaccgga 60
gacatcgtcc tgactcagtc cccctcttcc ctgccagtga cacctggaga gccagcatct 120
atcagttgcc gaagctccca gtcactgctg actgtcaagg gaattaccag cctgtactgg 180
ttcctgcaga agcccggcca gtcccctaaa ctgctgatct atcggatgtc taacagagac 240
agtggggtgc ccgataggtt ctcaggcagc gggtccgaaa ccgactttac actgaaaatt 300
tctcgcgtgg aggctgaaga tgtcggaacc tactattgcg cacagtttct ggaataccct 360
cacactttcg gggcaggcac taagctggag ctgaagcgtg gtcagcccaa ggctgccccc 420
tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag ccaacaaggc cacactggtg 480
tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg cctggaaggc agatagcagc 540
cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcg 600
gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt cccacagaag ctacagctgc 660
caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg cccctacaga atgttcatag 720
<210> 54
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Effi3_VL3_CLlambda_aa
<400> 54
Met Lys Phe Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Ile Val Leu Cys Ile Pro
1 5 10 15
Gly Ala Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro
20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Thr Val Lys Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Asp
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Gln Phe Leu Glu Tyr Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu
130 135 140
Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val
145 150 155 160
Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys
165 170 175
Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser
180 185 190
Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr
195 200 205
Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His
210 215 220
Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230 235
<210> 55
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD127肽
<400> 55
Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp
1 5 10 15
Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu
20 25
<210> 56
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MD707-3 VH
<400> 56
Ala Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asp Asn Val Lys Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ile Val Val Val Leu Thr Thr Thr Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 57
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MD707-3 VL
<400> 57
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Val
20 25 30
Lys Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Lys Val Glu Thr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT1
<400> 58
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1 5 10 15
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT2
<400> 59
Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser
1 5 10 15
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT3
<400> 60
Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr
1 5 10 15
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT4
<400> 61
Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu
1 5 10 15
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT5
<400> 62
Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser
1 5 10 15
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT6
<400> 63
Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln His Ser Leu
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT7
<400> 64
Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT8
<400> 65
Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp
1 5 10 15
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT9
<400> 66
His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr
1 5 10 15
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT10
<400> 67
Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe
1 5 10 15
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT11
<400> 68
Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly
1 5 10 15
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT12
<400> 69
Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT13
<400> 70
Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu
1 5 10 15
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT14
<400> 71
Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys
1 5 10 15
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT15
<400> 72
Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile
1 5 10 15
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT16
<400> 73
Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu
1 5 10 15
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT17
<400> 74
Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe
1 5 10 15
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT18
<400> 75
Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly
1 5 10 15
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT19
<400> 76
Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile
1 5 10 15
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT20
<400> 77
Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val
1 5 10 15
<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT21
<400> 78
Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 79
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT22
<400> 79
Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys
1 5 10 15
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT23
<400> 80
Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu
1 5 10 15
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT24
<400> 81
Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val
1 5 10 15
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT25
<400> 82
Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala
1 5 10 15
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT26
<400> 83
Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu
1 5 10 15
<210> 84
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT27
<400> 84
Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 85
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT28
<400> 85
Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala
1 5 10 15
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT29
<400> 86
Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val
1 5 10 15
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT30
<400> 87
Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val Thr Phe Asn
1 5 10 15
<210> 88
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT31
<400> 88
Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu
1 5 10 15
<210> 89
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT32
<400> 89
Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr
1 5 10 15
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT33
<400> 90
Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu
1 5 10 15
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT34
<400> 91
Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met His Asp Val
1 5 10 15
<210> 92
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT35
<400> 92
Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln
1 5 10 15
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT36
<400> 93
Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu
1 5 10 15
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT37
<400> 94
His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr
1 5 10 15
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT38
<400> 95
Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His Val Asn Leu
1 5 10 15
<210> 96
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT39
<400> 96
Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT40
<400> 97
Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15
<210> 98
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PEPT41
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1 5 10 15
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<220>
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Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
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<223> PEPT52
<400> 109
Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp
1 5 10 15

Claims (42)

1.一种人源化抗体或其抗原结合片段，包含以下CDR：
-VH-CDR1，其氨基酸序列是SEQ ID No14的Effi3-VH3-CDR1；
-VH-CDR2，其氨基酸序列是SEQ ID No16的Effi3-VH3-CDR2；
-VH-CDR3，其氨基酸序列是SEQ ID No18的Effi3-VH3-CDR3；
-VL-CDR2，其氨基酸序列是SEQ ID No22的Effi3-VL3-CDR2；
-VL-CDR3，其氨基酸序列是SEQ ID No24的Effi3-VL3-CDR3；
和
-VL-CDR1，其氨基酸序列为SEQ ID No20的Effi3-VL3-CDR1，或其氨基酸序列为SEQ IDNo26的Effi3-VL4-CDR1，
其中，VH链在其骨架中在Kabat编号识别的位置上存在以下氨基酸残基：
-在VH序列中：第3位的残基Q、第15位的残基G、第16位的残基G、第21位的残基T、第80位的残基T、第87位的残基S、第91位的残基E、第95位的残基T和第118位的残基L，
其中，VL链在其骨架中在Kabat编号识别的位置上存在以下氨基酸残基：
-在VL序列中：第7位的残基S、第9位的残基S、第11位的残基L、第12位的残基P、第18位的残基P、第47位的残基Q、第50位的残基K、第68位的残基S、第73位的残基G或残基E、第82位的残基R、第85位的残基A和第90位的残基T；
其中，所述人源化抗体或其抗原结合片段特异性结合人CD127的胞外域，并且不是CD127的拮抗剂。
2.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其具有下列特征中的一个或多个：
-所述人源化抗体或其抗原结合片段在表达IL7-R的细胞中不抑制人IL-7诱导的STAT5磷酸化；
-所述人源化抗体或其抗原结合片段在表达TSLP-R的细胞中不抑制人TSLP刺激的TARC分泌；
-所述人源化抗体或其抗原结合片段不是人CD127的激动剂；
-所述人源化抗体或其抗原结合片段在表达IL7-R的细胞中不增加人IL-7诱导的STAT5磷酸化；
-所述人源化抗体或其抗原结合片段在表达TSLP-R的细胞中不增加人TSLP刺激的TARC分泌。
3.根据权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中：
-重链包含序列SEQ ID No14的VH-CDR1、序列SEQ ID No16的VH-CDR2、序列SEQ IDNo18的VH-CDR3，和
-轻链包含序列SEQ ID No20或26的VL-CDR1、序列SEQ ID No22的VL-CDR2、序列SEQ IDNo24的VL-CDR3。
4.根据权利要求3所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链和轻链，其中，轻链包含SEQ ID No26的VL4-CDR1并且在第73位具有为残基G的氨基酸残基。
5.根据权利要求3所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链和轻链，其中，轻链包含SEQ ID No20的VL3-CDR1并且在第73位具有为残基E的氨基酸残基。
6.根据权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，包含以下或由以下组成：
-重链，其重链可变域为Effi3-VH3，所述Effi3-VH3的氨基酸序列是SEQ ID No 2的序列；和
-轻链，其轻链可变域为Effi3-VL3或Effi3-VL4，所述Effi3-VL3的氨基酸序列是SEQID No 4的序列，所述Effi3-VL4的氨基酸序列是SEQ ID No 6的序列。
7.根据权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其对CD127阳性细胞具有细胞毒活性。
8.根据权利要求7所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述人源化抗体或其抗原结合片段与CD127随后的结合，募集表达Fc受体的效应免疫细胞，所述募集是Fc依赖性的。
9.根据权利要求8所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述CD127阳性细胞为人CD127阳性细胞。
10.根据权利要求8所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，细胞毒活性为ADCC活性。
11.根据权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段是以下片段之一或者包含以下片段之一：
-Fv片段，其由通过疏水相互作用结合在一起的VL和VH链组成；
-dsFv片段，其中VH：VL异二聚体通过二硫键稳定；
-scFv片段，其中VL和VH链通过柔性肽接头彼此连接，从而形成单链蛋白质；
-Fab片段，其是单体片段，包含通过二硫键结合在一起的整个L链、和H链的VH-CH1片段；
-Fab'片段；
-F(ab')2片段，其包含两个Fab'片段，另外还包含抗体铰链区的一部分。
12.根据权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其识别SEQ ID No55序列的表位。
13.根据权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述人源化抗体或其抗原结合片段是单克隆，且包含以下或由以下组成：
-包含IgG1 m-E333A恒定区的重链，所述IgG1 m-E333A恒定区的氨基酸序列是SEQ IDNo28的序列，和
-包含CLkappa恒定区的轻链，所述CLkappa恒定区的氨基酸序列为SEQ IDNo34的序列。
14.根据权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述人源化抗体或其抗原结合片段是单克隆，且包含以下或由以下组成：
-Effi3-VH3-IgG1m-E333A的重链，所述Effi3-VH3-IgG1 m-E333A的氨基酸序列是SEQID No42的序列，和
-Effi3-VL3-CLkappa的轻链或Effi3-VL4-CLkappa的轻链，所述Effi3-VL3-CLkappa的氨基酸序列为SEQ ID No50的序列，所述Effi3-VL4-CLkappa的氨基酸序列为SEQ ID No48的序列。
15.根据权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中，所述人源化抗体或其抗原结合片段是单克隆，且包含以下或由以下组成：
-包含IgG4m-S228P恒定区的重链，或包含IgG2b恒定区的重链，所述IgG4m-S228P恒定区的氨基酸序列为SEQ ID No30的序列，所述IgG2b恒定区的氨基酸序列为SEQ ID No32的序列，和
-包含CLkappa恒定区的轻链，或包含CLlambda恒定区的轻链，所述CLkappa恒定区的氨基酸序列为SEQ ID No34的序列，所述CLlambda恒定区的氨基酸序列是SEQ ID No36的序列。
16.一种多核苷酸，其编码权利要求1-15中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段。
17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是分离的多核苷酸。
18.根据权利要求16或17所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸中编码CDR区的序列由SEQ ID No13、15、17、19、21和23的序列组成，或由SEQ ID No13、15、17、25、21和23的序列组成。
19.根据权利要求16或17所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸由SEQ ID No1和3的序列或SEQ ID No1和5的序列组成。
20.根据权利要求16或17所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸由SEQ ID No41和47的序列或SEQ ID No41和49的序列组成。
21.一种载体，其包含权利要求16～20中任一项所述的多核苷酸作为插入物。
22.一种细胞，其含有权利要求1～15中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，或权利要求16～20中任一项所述的多核苷酸。
23.根据权利要求22所述的细胞，其中，所述细胞是T细胞。
24.一种药物组合物，其含有权利要求1～15中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、权利要求22或23所述的细胞或权利要求16～20中任一项所述的多核苷酸，作为活性成分。
25.一种组合治疗产品，包含以下物质作为活性成分：
-权利要求1～15中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、权利要求22或23所述的细胞或权利要求16～20中任一项所述的多核苷酸，和
-至少一种选自化学治疗剂、放射治疗剂、外科手术剂、免疫治疗剂、益生菌和抗生素的其他治疗剂，
其中，所述活性成分配制用于分开、同时或组合治疗。
26.根据权利要求25所述的组合治疗产品，其中，所述活性成分配制用于组合或顺序使用。
27.根据权利要求25或26所述的组合治疗产品，其适合于施予有此需要的人类患者，并且包含以下物质作为活性成分：(i)权利要求1-15中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、权利要求22或23所述的细胞或权利要求16～20中任一项所述的多核苷酸，和(ii)另外的免疫治疗剂。
28.根据权利要求25或26所述的组合治疗产品，其中，所述免疫治疗剂是涉及T细胞的免疫治疗剂。
29.根据权利要求25或26所述的组合治疗产品，其中，所述免疫治疗剂是带有靶向细胞受体或抗原的CAR分子的T细胞。
30.根据权利要求25或26所述的组合治疗产品，其中，所述免疫治疗剂靶向的所述细胞受体或抗原为CD19、CD20、CD52或Her2。
31.权利要求1～15中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、权利要求22或23所述的细胞或权利要求16～20中任一项所述的多核苷酸在制造用于治疗与CD127+细胞相关的疾病的药物中的应用。
32.权利要求1～15中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、或权利要求16～20中任一项所述的多核苷酸、或权利要求22或23所述的细胞、或权利要求24所述的药物组合物、或权利要求25～30中任一项所述的组合治疗产品在制造用于治疗癌症的药物中的应用。
33.根据权利要求32所述的应用，其中，所述癌症是与CD127+细胞相关的癌症。
34.根据权利要求32或33所述的应用，其中，所述癌症是与CD127阳性细胞增殖和/或CD127阳性细胞浸润相关的癌症。
35.权利要求1～15中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段、或权利要求16～20中任一项所述的多核苷酸、或权利要求22或23所述的细胞用于制造药物中的应用，所述药物用于治疗选自乳腺癌、肾癌、膀胱癌、肺癌、胰腺癌的癌症，或用于治疗T细胞皮肤淋巴瘤，或用于治疗急性淋巴细胞白血病，其具有IL7R/TSLP途径的增益突变和间皮瘤。
36.根据权利要求35所述的应用，其中，所述T细胞皮肤淋巴瘤为Sezary淋巴瘤。
37.权利要求1～15中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段在制备用于体外或离体检测方法的药物中的应用，其中，所述方法用于检测预先从受试者获得的样品中的CD127+细胞。
38.根据权利要求37所述的应用，其中，所述方法包括对CD127的表达进行定量。
39.根据权利要求37或38所述的应用，其中，所述方法适用于个性化医疗。
40.根据权利要求37或38所述的应用，其中，所述方法适用于伴随诊断。
41.抗CD127的权利要求1～15中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段在制备适用于诊断测试的药物中的应用。
42.根据权利要求41所述的应用，其中，所述应用是在制备适用于个性化医疗或伴随诊断测试的药物中的应用。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2955196A1 (en) 2014-06-10 2015-12-16 Effimune Antibodies directed against CD127
EP3676292A1 (en) * 2017-08-29 2020-07-08 OSE Immunotherapeutics Method and preparation for sorting out t effector cells using anti-cd127 antibodies for applications in cell therapy
JP2021518761A (ja) * 2018-05-10 2021-08-05 ニューラクル サイエンス カンパニー リミテッド 配列類似性１９、メンバーａ５抗体を有する抗ファミリー及びその使用方法
US20220273713A1 (en) * 2019-06-28 2022-09-01 The University Of Melbourne Method of inhibiting or activating gamma delta t cells
CN110894237B (zh) * 2019-12-05 2021-08-03 山东省分析测试中心 抗cd127的抗体、分泌该抗体的细胞株及其制备方法和应用
AU2021262748A1 (en) * 2020-04-27 2022-12-01 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting CD127 and use thereof
AU2021275055A1 (en) * 2020-05-18 2023-02-02 Mouhannad Jumaa Composition for the treatment of Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia
CN113501878B (zh) * 2021-02-03 2022-12-02 北京智仁美博生物科技有限公司 针对人tslp的多种抗体及其用途
US20220389104A1 (en) * 2021-05-28 2022-12-08 Ose Immunotherapeutics Method for Treating CD127-Positive Cancers by Administering an Anti-CD127 Agent

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103038254A (zh) * 2010-02-24 2013-04-10 瑞纳神经科学公司 拮抗性抗il-7受体抗体及方法
WO2015189302A1 (en) * 2014-06-10 2015-12-17 Effimune Antibodies directed against cd127

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
ES2686593T3 (es) 2006-05-31 2018-10-18 The Regents Of The University Of California Expresión de CD127 que correlaciona inversamente con FoxP3 y la función supresora de Treg CD4+
ATE542830T1 (de) 2006-12-04 2012-02-15 Pasteur Institut Als gerüst verwendeter ob-fold zur entwicklung neuer spezifischer bindemittel
GB0724051D0 (en) 2007-12-08 2008-01-16 Medical Res Council Mutant proteins and methods for producing them
UY32038A (es) 2008-08-08 2010-03-26 Glaxo Wellcome Mfg Pte Ltd Inmunoblobulinas anti-cd127 y sus usos
WO2010085643A1 (en) 2009-01-22 2010-07-29 University Of Miami Targeting il-7 signaling as a therapy for multiple sclerosis and other il-7 signaling dependent disorders
SG182590A1 (en) 2010-01-28 2012-08-30 Glaxo Group Ltd Cd127 binding proteins
EP2583980A1 (en) * 2011-10-19 2013-04-24 Effimune Antibodies directed against the alpha chain of IL7 receptor - their use for the preparation of drug candidates
US20150297310A1 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Georgia Regents Research Institute, Inc. Methods for selecting a treatment for cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103038254A (zh) * 2010-02-24 2013-04-10 瑞纳神经科学公司 拮抗性抗il-7受体抗体及方法
WO2015189302A1 (en) * 2014-06-10 2015-12-17 Effimune Antibodies directed against cd127

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