JPH05508662A - 自己抗体の経口投与による自己免疫性疾患の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 自己抗体の経口投与による自己免疫疾患の治療本出願は、１９９０年２月２１日 にファイルされた米国出願番号Ｑ　７／４６０．８５２の一部継続であり、その 米国出願は、１９８８年６月２４日にファイルされたＰＣＴ／ＵＳ８ｇ１０２１ ３９の国内段階であり、そのＰＣＴ出願は、１９８７年６月２４日にファイルさ れた米国出願番号０６５，７３４の一部継続出願である。それらはすべてｔ考文 献として、ここに挙げである。

発明の分野 本発明は、自己免疫性疾患、特にＴ細胞仲介またはＴ細胞依存性の自己免疫疾患 の治療分野に関する。特に、本発明は、そのような自己免疫性疾患の予防上、治 療上の処理のための、自己抗体、あるいはその断片（ｆ　ｒａｇｍｅｎ　ｔ）ま た！、一般的な自己免疫性疾患 自己免疫疾患は、正常な組織に対する抗体または細胞の応答を含む、異常な免疫 応答によって起こる。自己免疫疾患を抑制するために、多くの方法が発達してき ているが、注目すべき薬品のほとんどが免疫応答を非特異的に抑制するものであ る。自己免疫応答抑制のために、抗体を経口投与することにより免疫耐性を誘起 する方法は、ウェルズによって最初に提唱された（Ｗｅｌｌｓ、Ｂ、、　Ｊ、Ｉ ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　９．１４７（１９１１））。しかし、いくつかのＴｌｌ 胞依存性抗体について、経口誘導の非応答性も示されている（Ｎｇａｎ、Ｊ、、 　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍ−ｕｎｏｌ、　１３５．２９７５（１９８５）、　 Ｔｉｔｕｓ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔ、Ａｒｅｈ、ＡＩｌｅｒｇｙ　Ａｐ ｐｌ、ｌｍ５ｕｎ、、６５．３２３（１９８１））、また、経口経路による抗原 誘引の予防的免疫耐性が、いくつかの実験的自己免疫性疾患において、免疫調節 器治療工のアプローチとして働くことが示されている（Ｈ４ｇｇｉｎｓ、Ｐ、Ｊ 、、ａｔ　ａｌ、、１４０．　４４０（１９８ｇ）、Ｌｉｄｅｒ、Ｑ、、ｅｔ　 ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｗｕｉｎｏｌ、、１４２．　７４１１−７T２（１９ ８９）、Ｂｉｔａｒ、Ｄ、Ｍ、、ｌ！ｔ　ａｌ、、　Ｃａ１１．　Ｉ＋＋ｍｕｎ ｏ１．、　１１２．　３８４（１９１１＋１）、　Ｎｕｓｓ■獅ｂ撃≠狽煤AＲ ｌＢ。

、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、１ｍ＋＋ｕｎｏ１．．　１４４．　１６８９（１９ｑＯ） 、Ｎａｇｌｅｒ−＾ｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｃ，、１ｍ１．、Ｐ窒盾■B Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ、８３．７４４３−７４４６（１９８６） 、Ｔｂｏｙａｐｓｏｎ、’ａ、Ｓ、Ｑ、、ａｔｉ１．．Ｃ１Pｎ、Ｅｘ ｐ、Ｉｍｗｕｎｏｌ、、６４．　５１１１−５８６（１９＋ｔ５））。

Ｉｌ、実験的なアレルギー柱層を髄炎 科学者は、種々の動物モデルにおいて、自己免疫性疾患を抑制する方法もまた研 究した。実験的アレルギー柱層を髄炎（ＥＡＥ）は、ミニリン塩基性タンパク（ ＭＢＰ）ｉこ対するＴ細胞仲介自己免疫性疾患であり、数種のは乳類における多 発性脳硬化症のモデルとして研究されている。Ｅ、アルポード（Ａｌｗｏｒｄ） ら著、「実験的アレルギー柱層を髄炎−−多発柱層硬化症の有用なモデルｊ　（ Ａ１１ａｎ　Ｒ，ＬＩｓｓ、ニネーヨーク、１９８４）参照、ＥＡＥの免疫調節 は、サプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）に、少なくとも部分的に依存していることが知 られている。Ｔｓは、ＥＡＥから回復したラットに存在していることが示されて いる（Ｓｗｉｅｒｋｏｓｚ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉ＋＋ｍｕｎｏ１． 、１１９．１５０１（１９７〕））。さらに、数種のマウス系統によって示され たＥＡＥに対する非応答性が、サプレッサーＴ細胞によることが示されている（ Ｌａｎｄｏ、Ｚ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８７．５５１（１９ ８０））。

様々な方法が、ＥＡＥの抗原特異的抑制を誘発するために採用されている。例え ば、Ｌａｎｄｏ、Ｚ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。１２８．１ ５２８（１９８１）に示されているような、不完全フロインドアジュバント中に 乳化されたＭＢＰの免疫化や、　５ｔｉｒａ■、Ｓ、、ｓｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ １．ｉｍｍｕｎｏｌ、、フ５．３７ｇ（１９８３）に示されているように、ＭＢ Ｆが結合したリンパ様細胞の静脈内注射が用いられている。

アルポードらの３櫂の論文が、Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｎｅｕｌｏｇｙの第６＠（ １９７９年）、４６１−４６８．４６ｇ−４７３，４７４−４１３２頁に各々報 告されている。これらの論文のうち、第１と第２のものは、例えば抗生物質やス テロイドのような非特異的付加成分と共に投与したときのみの、ＭＢＰの非経口 的投与による猿のＥＡＥの抑制について開示している。東３の論文は、ＭＢＰを 抗原的に活性なペプチド断片に変性させる数種のプロテアーゼが、多発性脳硬化 症虫者の脳を髄液中に存在することを開示している。

トララボブト（Ｔｒａｕｇｏ　ｔ　ｔ）ら、（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｅａｌ　 ５ｃｉｅｎｃｅ、　５６．６５−７３（１９１１２））、及びレイネ（Ｒｅ　ｉ 　ｎｅ）　ら、（Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、　４８．　２７５−１ １４（１９８３））の論文は、ＭＢＥの単独、あるいは不完全７０インドアジ− パント（ＩＦＡ）中、またはミニリンの脂質ハブテン、即ちガラクトセレブロシ ドと組み合わせた非経口的投与による、慢性的ｌこ再発するＥＡＥにかかったモ ルモットの系統の治療が、ＥＡＥの臨床的症状を抑制することを示している。

さらに、Ｔ、ケナ（ＭｃＫｅｎｎａ）ら、（Ｃｅ１１．Ｉｍｍｕｎ、、　８Ｌ、 　３９１−４０２（１９８３））は、不完全フロイントアジ−パント中のモルモ ットＭＢＥを用いて、同系の肺臓白血球または同系の赤血球に結合したモルモッ トＭＢＰをラットに前もって注射することが、ＥＡＥの引き続く誘導を抑制する ことを示している。抑制の度合は、投与したＭＢＰの量に正に相関している。

ストレーシャン（ＳｔｒｅＪａｎ）ら、（ＣｅＪｌ、Ｉｎ５ｕｎ、、　８４．１ ）１−１８４４１９８４））の報告は、ナスファチジルセリンリボンームとカプ セル化したモルモγ）ＭＢＰをラットに前もって注射することが、完全フロイン トアジ−パント中のモルモットＭＢＰを注射したラットに発現する臨床的徴候や 症状を抑制することを開示している。

マツケナの別の論文（Ｃｅ１１．ＩＩｍｕｎ、、　８８．２５１−２５９（１９ ８４））は、サプレッサーＴ　ＩＪンパ球の生成を阻害する試薬であるンクロホ スホアミドで前処理した場合、彼らの１９８３年の報告に開示されているモルモ ットＭＢＰ白血球複合体の注射の抑制効果がなくなることを示している。

クランスナー（Ｋｒａｎｓｎｅｒ）ら、（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、　３６．９２− ９４（１９８６））の報告は、動物をＥＡＥから守ることから、多発性脳硬化症 の治療として試験されていた、合成Ｃ共重合体１が、ＭＢＰと免疫的交差反応性 を表さないことを開示している。

さらに、ベリブク（Ｂｅｌｉｋ）ら＜Ｖｏｐｒ、　Ｍｅｄ、にｈａｔ、　２４． ３７２−３７７（Ｉｆｆ７ｇ））は、「アルカリミニリンタンパク質断片」と、 「合成起脳炎ペプチド」を、ＥＡＥとともにモルモットに非経口的に投与するこ とを開示している。「アルカリミニリンタンパク質断片」を、ウシの「アルカリ ミニリンタンパク質断片」または「合成起脳炎ペプチド」で感作された動物に投 与した後、動物は回復した。

ＥＡＥとＥＡＵの以前の研究は、ＭＢＦまたはＳ−Ａｇの投与量の増加が、より 良い疾患防御に結び付くことを示しており（旧ｇｇｉｎｓ、Ｐ、Ｊ、、　ａｔ　 ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍ謹ａｒ＋ｏ１、、　１４０．　４４０（１９ｇ＋１）、Ｎｕ ｓｓｅｎｂｌａｔｔ、Ｒ，Ｂ、、　ａｔ　ｉｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４ ４．　１６８X（１９９Ｇ） ）、また、一般的に、実験者は、より多くの抗体量を与えることが、経口耐性を 増進することを報告しているＣＭｏｖａｔ、Ａ、Ｍ、、ｎｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａ ｙ、８．９３（１９８）））。

ある報告は、経口的に耐性のある動物から、ＣＤ８＋Ｔ細胞を養子移入すること により、ＥＡＥが抑制されることを示唆している（ＬＪｄｅｒ、Ｏ，、ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２．７４８〜７５２（１９８９））。

しかし、この技術において、苦しんでいる動物にＥＡＥ自体が発現した後にＥＸ Ｅをうまく治療することは、まだ知られていない。また、この技術において、を 者に多発性脳硬化症自体が発現した後に多発性脳硬化症をうま（治療することも また、まだ知られていない。従って、多発性脳硬化症を抑制し、治療する方法の ６Ｗ性は、いまだに存在している。

ＩＩｌ、アジ１バント関節炎 アジ島バンド関節炎（Ａｄｊｕｖａｎｔ　ａｒｔｈｒｌｔｌｓ）（ＡＡ）は、炎 症性関節疾患の実験的モデル、特にすニーマチ性関節炎のモデルである。アジ品 バンド関節炎は、結核ＩＩ（ＭＴ）の油中の懸濁液を皮下注射することにより誘 起される（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃ，Ｍ、、　Ｊ、Ｃｂｒｏｎｊｃ　Ｄｉｓ、、　ｉ ｔ　１１６３−８７４（１９６３））。注射の後１０〜１５ａの間に、動物は重 篤で進行性の関節炎になる。

それは、臨床的にも組織病理学的にも特徴がヒトのすニーマチ性関節炎に似てい るため（Ｊａｓｉｎ、Ｈ，Ｅ、、　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃ、、　３２ ．１４７（１９７２））、ＡＡは、免疫媒介炎症性関節疾患の機構の実験や、組 織特異的自己免疫性疾患の治療法の実験に用いられてきた。

アジ１バンド関節炎は、細胞媒介自己免疫性疾患であり、細胞群またはＴ細胞の ＭＴ特異的クローンによりて転移される（Ｔａｕｒｏｇ、Ｊ、Ｄ、、　ｅｔ　ａ Ｊ、、　Ｃｅ１１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）５．　２７Ｈ１９８３）、Ｔａｕｒｏ ｇ、Ｊ、Ｄ、、ａｔ　ａｌ、、Ｃａ１１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、８０．１９８（Ｎｕ ）、Ｃｏｈｅｎ、Ｌ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、Ａｒｔｈｒｉｔｓ　ａｎｄ　Ｒｂｅ ｍ、、　２（δａｔ（ｔ９δ５））。研究によると、アノユバンド関節炎の主要 な自己抗原はａｓ−ｋｄｔコバクチリア熱衝撃タンノイク質（Ｈ３Ｐ）であるこ とが示唆されている（ｖａｎ　Ｅｄｅｎｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ 、３３１．１７１（１９８Ｂ））。このタンパク質は、連鎖球菌細胞壁関節炎に おいて重要であることが明らかにされている（Ｄｅｊｏｙ、Ｓ、Ｑ、、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　ｌ）０゜３６９（１９８９）、　ｖａｎ　 ｄａｎ　Ｂｒｏａｋ、Ｍ、、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　１７ ０．３６９（１９＋１９＞）。アジｘノイント関節炎には、タイプＩＩコラーゲ ンに対する免疫性があることが示されている（Ｔｒｅｎｔｈｉ■、Ｄ。

Ｅ、、ａｔａｌ、、Ｊ、ＣｌＩｎ、夏ｎｖａｓｔ、、６８．１１０９（１９８０ ））。

コラーゲンの経口及び静脈内投与に伴う耐性化が、コラーゲン誘引関節炎（ＣＩ Ａ）と名付けられた他の型の関節炎を抑制することが示されている。タイプ■■ コラーゲン（ＣＩＩ）の経口投与によるＤＢＡマウスのＣＩＡの抑制は、投与量 に依存しており、３ｍｇでなく０．５ｍｇを２週間にわたって８回与えたとき、 抑制が観察された（Ｔｏｇｌｅｒ−＾ｎｄｅｒｓｏｎ、ｃ、、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、＾ｃｉｄ、ｓｃｉ、［ＩｓＡ、８３、７４４３−７４４ ８（１９８６））。同様の結果は、ラットのＣＩＡについても報告され、ＣＩＩ を２．５μｇ／ｇ与えた方が２５μｇ／ｇ与えた場合より大きな抑制が見られた （Ｔｈｏ＋＋ｐ＊ｏｎ、Ｈ，Ｓ、Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、 Ｉｓｍｕｎｏｌ、、　６４．５ａｔ−５８６（１９８８j）。１゜ Ｖ、耐性の点から見ると、ＤＢＡマウスのＣＩＡを抑制するために、１ｍｇが与 えられる（Ｍｙｅｒｓ、Ｌ、！、、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、 　１７０．１９９９（１９８９））。

ＣＩＡ関節炎に対する阻害の養子移入が、ＣＩＩを静脈内処理した動物に対して は報告されているが（Ｍｙｅｒｓ、Ｌ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、、　１４３．３９）６（１９８９））、経口耐性についてではない（Ｎ ａｇｌａｒ−＾ｎｄａｒｓｏｎ、Ｃ，，ａｔ　ｉｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｅ＋。

ＵＳＡ、　８３．７４４３−７４４６（１９１１６）、Ｔｈｏｍｐ＠ｏｎ、［１ ，Ｓ、Ｇ、、ａｔ　ａｌ、、Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、Ｉ＋ｎｕｎ盾P．、　６４ 、　５８１−５８６（１９８６））。

しかしながら、ヒトのりニーマチ性関節炎の動物モデルで、ＣＩＩの経口投与が ＡＡを抑制すること、そして、この抑制が肺臓のＴ細胞によってＣ１ｌを与えら れた動物から養子移入され得ることは、まだ知られていな０゜従って、自己免疫 性疾患の治療、特にＴ細胞仲介あるいはＴ細胞依存性の自己免疫性疾患の治療の 必要性が存在している。

発明の要旨 本発明は、そのような治療を必要とする患者に、Ｔ細胞仲介あるいはＴ細胞依存 性の自己免疫性疾患の治療方法を提供する。その治療方法は、自己抗原、自己抗 原の断片、特定の自己免疫性疾患に特異的な自己抗原と構造的に関連している類 似体を、そのような患者に、自己免疫性疾患の治療に有効な量を経口投与するこ とからなる。

そのような自己免疫性疾患の、臨床的及び組織学的影響の両方が、本発明の方法 による投与量依存の手法で抑制される。さらに、そのような抑制は、自己抗原の 投与が自己免疫性疾患の発現の前であろうと後であろうと発揮される。

本発明の方法によると、Ｔ細胞依存性自己免疫性疾患は、非疾患誘起性及び疾患 誘起性の自己抗原断片の経口投与によっても抑制される。従って、自己抗原の経 口投与は、それによって自己免疫性疾患は自然に免疫調節される、効果的で簡単 な方法を意味している。

本発明のさらなる面では、ＥＡＥ及び多発性脳硬化症の治療及び抑制方法を提供 する。その方法は、そのような治療を必要とする患者に、ミニリン塩基性タンパ ク質の特異的断片の経腸投与を提供し、自己免疫性疾患の発現の前または後で有 効である。

本発明のさらなる面では、アジ島パント関節炎及びす１−マチ性関節炎の治療及 び抑制方法を提供する。その方法は、タイプ■■フラーゲン（Ｃ１ｌ）を、その ような治療を必要とする患者に経腸投与し、自己免疫性疾患の発現の前または後 で有効である 図面の簡単な説明 図１ニルイスラブド（Ｌｅｗｊｓ　ｒ＠ｔ）における増殖応答の、経口的に誘起 された抑制の抗原特異性。動物は、７．５．２日前に５００μｇのＭＢＰまたは ＢＳＡを与えた後、ＣＦＡ中の１００μｇのＭＢＰで免疫化し、その日を０日と した。免疫化の９日後に、リンパ節を取り出し、ＭＢＰ、ＢＳＡ及びＰＰＤ　（ すべて５０μｇ／ｍｌ）に対する増殖応答を、実施例３で述べるように量定した 刺激指標−（試験ｃｐｍ）／（対照ｃｐｍ）図２：関節部の腫れによって測定し た、経口的に誘起された抑制。

図３　：　ＥＡＥの再発誘起の実験 図４：ＳＪＬマウスにおけるリンパ様細胞増殖の、経口的に誘起された抑制。

動物は、２週間にわたって４００μｇのＭＢＰを７回与えた後、ＣＦＡ　（０， ６ｍ　ｇ　／　ｍ　１結核ｓり中の４００μｇのＭＢＰで免疫化させた。刺激指 標は、ＭＢＰ誘起増殖をバックグラウンドで割った崗である。

図５＝ミニリン塩基性タンパク質（ＭＯＰ）を与えたラットから得られた肺臓及 び腸間膜リンパ節細胞（ＬＮＧ）による、膝窩排出リン／（節細胞（ＰＬＮＣ） の抗体特異的抑制。結果は、ＭＢＰに対する（丸印）、結核菌に対する（四角形 印）、抑制パーセントで表した。黒丸印と黒四角形印は、肺臓細胞の応答を表し 、白丸印と白四角形印は、腸間膜リンパ節細胞の応答を表している。

図６：経口ＭＢＰ投与後の、ＭＢＰに対するＩｇＧ応答の特異的抑制。ラットは 、間欠的に出血させ、血清を抗ＯＶＡ　（図６Ａ、白丸印）、抗ＭＢＰ　（図６ Ｂ、黒丸印）抗体を試験した。これらの血清は、非投与で攻撃された動物（黒印 ）と比較した。結果は、ＥＬＩＳＡ　Ｏ，Ｉ）、４９２レベル士標準偏差で示し た０図７＝ルイスラツトは、７．５．２日前にＭＴ　（Ａ）または（ＩＩ（Ｂ） を与えた。その後、動物に、１０ｍｇ／ｍｌのＭＴを含むＣＦＡを尾の根本に皮 下注射し、その日をＡＡ誘起の０日とした。最初の１３日に、動物はＡＡの臨床 的徴候を検査し、個々に記録した。「関節炎評点」は、各々の時点における各々 のグループの５−１Ｏの個々のラットからの平均の関節炎評点（４つの足の合計 ）を表している。

図８＝ルイスラフトは、７．５．２日前に緩衝液のみ（対照）または示したよう な種々の投与量のＣ１ｌを与えた。その後、動物に、１０ｍｇ／ｍＪのＭＴを含 むＣＦＡを尾の根本に皮下注射した。−ケ月後、動物は２０μｇのＣＩＩ（Ａ） または１０μｇのＭＴ（Ｂ）で攻撃した。注射前と注射後４８時間に耳の厚さを 測定した。Ｐ値は投与動物と対照の比較であり、ｎｓは重大でないことを意味す る。

図９ニルイスラブドは、７．５．２日前に種々の投与量のＭＴ与えた後、尾の根 本へのＯ，１ｍｌのＣＦＡで免疫化して、その日を０日とした。排出りンｔ４節 を、９日後に回収して、増殖応答を計測した。

図１０＝ルイスラツトは、ｌｏｎｇ／ｍｌのＭＴを含むＣＦＡの皮下注射により 関節炎を引き起こした。最初の徴候は、疾患誘起後１３−１４日に現れた。１７ 日９に、動物を疾患の重さに応じて２つのグループに分けた。対照グループは治 療しないでおき、一方、治療グループには、１週間に３回、１日おきに３μｇの Ｃ−を経口で与えた。両方のグループの動物を、３４日自家で、関節炎につ（１ て記録した。データは、実際の関節炎評点士標準誤差として示した。

好ましい具体例の説明 ！、定義 以下の説明においては、免疫学で用いられる多くの用語が広範に使用されている 。明細書及び特許請求の範囲の明確で首尾一貫した理解を提供するため、そのよ うな用語が与えられた見方を含めて、以下の定義を提供する。

自己免疫性疾患 自己免疫性応答は、ヒトを含めた動物の免疫機序の機能不全であり、その免疫組 織が、その動物の外部の基質と、その動物の正常な成分の一部分である基質との 識別を誤っている。

自己抗原 「自己抗原」は、自己免疫性疾患の様な異常な状態にある動物に通常見られる物 質であり、その動物のリンパ球や抗体によって、それがその動物自身の一部分生 物学的活性断片 自己抗原の「生物学的活性断片」という用語は、自己抗原の、ある一部のアミノ 酸配列を含んでおり、その部分的アミノ酸配列は、全ての長さの自己抗原と同様 の生物学的応答、即ち、経口的導入でＴ細胞仲介あるいはＴ細胞依存性の自己免 疫性応答を抑制したり除いたりする能力を誘起することができる。

類似体 自己抗原の「類似体」という用語は、自己抗原と同様の生物学的活性、即ち、自 己抗原の投与でＴ細胞仲介あるいはＴ細胞依存性と同じまたは等価の自己免疫性 応答を除いたり抑制したりする能力を持つように、自己抗原と構造的に関連した 化合物を含んでいる。そのように、この用語は、自己抗原のアミノ酸配列と、１ 以上のアミノ酸が異なる、（しかし自己抗原と等価の生物学的活性は維持してい る）アミノ酸配列を、疾患の症状を抑制したり緩和したりする能力で、自己抗原 の生物学的活性をまねた化合物と同様に含んでいる。そのような化合物は、自己 免疫製疾患の攻撃部位である目的の器官からの組織からなっていても良い。

動物 「動物」という用語は、免疫調節機序を育し、従って自己免疫性疾患に感受性が あり、ヒトを含むすべての生物形感を包含している。

治療 「治療」という用語は、そのような自己免疫性疾患を防ぐための予防的処理と、 そのような自己免疫性疾患の攻撃の後に、症状を抑制したり緩和したりすること も同様に含むことを意味する。

投与 そのような自己抗原による治療を必要としている患者への、自己抗原の「導入」 あるいは「投与」という用語によって、自己抗原、その生物学的に活性な断片、 生物学的に活性な類似体を、そのような患者に、意図された有益な効果を提供す るのｌこ充分な時間の長さに、そのような自己抗体の治療的有効性を保持する手 法で供給することを意味している。好ましい具体＃Ｉ！においては、自己抗体は 、そのような患者に、経口経路で胃に導入される。しかし、「経口」という用語 によって、出願人は、投与を経口で供給されることに限定するのではな（、その ような抗原を、機番の胃や消化器官に供給する任意の投与を意味している。

タイプＩＩコラーゲン タイプｘｒコラーゲン（Ｃ１ｌ）は、アリア間（ｉｎｔｅｒ　ａｌｌａ）、軟骨 、椎間板、及び硝子体に見られるコラーゲンの型である。タイプＩＩコラーゲン は、３本のＣ１（ＩＩ）饋（［Ｃ１（ＩＩ）ｌａ）を有する。

この分野で知られているように、線維状タンパク質の系統であり、多くの構造的 、遺伝学的に興なった型に分類されている（Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ、、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ、２ｎｄ　Ｅｄｉｔｌｏｎ、　Ｗ、Ｈ，ＦｒｅｅｍＲｎ　＆　Ｇ ｏ、、　１０１．　ｐｐｌ＆４−１９９）。タイプ■コラーゲンは、最も普通の 形管であり、アリア間、皮膚、慶、角膜、及び骨に見られ、Ｃ１（Ｉ）コラーゲ ンの２つのサブユニットと、Ｃ２と呼ばれ興なった配列を持つ１つのサブユニッ トからなる。タイプＩＩフラーゲンを含む他の蟹のコラーゲンは、各々が１００ ０のアミノ酸からなる、３つの同一のサブユニットまたは鎖からなっている。

タイプＩＩＩフラーゲンは、アリア間、血管内、心臓及び血管系、及び胎児の皮 膚に見られ、３本のαＨｚ）１１（［α（ＩＩＩ）３３）を含有する。タイプＩ Ｖコラーゲンは、アリア間、基部膜に極在し、３本のα（ＩＶ）Ｍ（［α（ＩＶ ）］３）を含有する。

本発明は、そのような自己免疫性疾患に特異的な自己抗原、その自己抗原と同様 に生物学的に活性な断片、そしてその類似体を、経口投与することによる、Ｔ細 胞仲介またはＴ細胞依存性自己免疫性疾患に関する。

本発明が主に使用されるのは、大きな範ちゅうの疾患の治療である。それは、そ の疾患の攻撃に先立って及び／又は後に使用され、その疾患は、集合的に自己免 疫性疾患と呼ばれるような疾患であり、多発性脳硬化症、重症筋無力症、す１一 ナチ性関節炎、糖尿病、及び特に若年性糖尿病、全身性狼そう紅斑症、自己免疫 性甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、例えばｐｏｉｓｏｎ　ｉｖｙのような植物 体ｆこよって生じる接触感受性疾患を含むが、それらに限られるものではない。

従って、本発明の方法によれば、多発性脳硬化症の下敷になっている自己免疫性 応答は、ＭＢＰあるいはその生物学的活性部分の投与によって治療される。また 、本発明の方法によれば、リューマチ性関節炎の下敷になっている自己免疫性応 答は、ＣＩＩあるいはその生物学的活性部分の投与によって治療される。

本発明は、ＭＢＰの経口あるいは経腸投与が、慢性及び急性の単相性ＥＡＥを抑 制するための有効な手段であることの発見と確認に基づいている。非常に好適な 具体例では、そのような投与は経口である。疾患が発現した後のＭＢＰＬｖ＆！ 腸投与によるＥＡＥの抑制は、予想できない。

本発明は、さらに、タイプＩＩコラーゲンの経腸投与が、アジ１バント関節炎の 抑制の有効な方法であることの発見にも基づいている。タイプＩＩコラーゲンに よるアジュバント関節炎の抑制は、特に驚異的である。なぜならタイプＩＩコラ ーゲンは、アジュバント関節炎の抑制に、ＭＴより予期しないほど大きな効果を 有しているからである。好適な具体例では、そのような投与は経口である。

ＥＡＥ及びアジュバント関節炎の両方における経腸的に誘起された耐性は、投与 量に依存しており、疾患の臨床的、組織学的徴候は分断されて減少する。例えば 、つ／血清アルブミン（ＢＳＡ）のような無関係な抗原あるいはコラーゲンや［ Ｓ］抗原（実験的自己免疫性葡萄膜炎を含む自己免疫）のような他の抗原の経口 投与は、ＥＡＥＩこ対する感受性に何も影響せず、経口的に誘起されるＥＡＥに 対する耐性は、ＭＡＰに特異的であり、疾患を媒介するＴ細胞に対する抗原が検 さらに、ラットに対するＭＢＰの経口投与は、ＭＢＰに対する免疫応答の抑制を 誘起する。例えば、リンパ細胞増殖と、抗ＭＢＰ抗体の生成は、ともに減少する 。疾患の抑制と、抗原特異的な細胞のインビトロの応答の抑制の両方に感応でき る細胞は、Ｔｌｌ胞起源であり、サプレッサー／細胞障害性ＣＤ８＋リンパ球で 従って、下記で述べるように、多発性脳硬化症のＥＡＥｌｌＴ物モデルを用いる こと、ＡＡの動物モデルを用いることは、各々ＭＢＰやＣ１ｌのような自己抗原 を投与する簡単な方法であり、本発明によって教えられているように、特定の自 己免疫性疾患の進行や抗原に対するある免疫応答、そしてそのような疾患自体が 患者で発現した後の疾患の進行抑制するための有効な治療である。

一般に、自己抗原、断片、あるいは類似体は、１日に１からｘｏｏｏｍｚの量を 経口的に導入され、それは、単独投与形態あるいは複数投与形態で投与されてよ い。好ましくは、自己抗原、断片、あるいは類似体は、１日に２５から８５０ｍ ｇ投与される。当業者には理解されている様に、投与量は、患者の年齢、性別、 体調と同様に、同時に行われている治療によって計算される。そのような製剤を 、そのような自己免疫性疾患の治療を必要としている動物に投与し、疾患の重篤 度を改善し、除去し、緩和し、回復し、減少させてよい。そのような製剤を、そ の自己免疫性疾患が進行するように前処理した動物に投与し、そのような疾豐の 攻撃を阻害し、あるいはそのような疾患が発現したとき、その重篤度を減少する ようにしてもよい。

自己抗原、断片、あるいは類似が経口的に投与される場合、それは、他の食物形 管に混合してもよいし、固体、半固体、ｗＩｆＩＩ液、乳化液形態で使用しても よい。そのような自己抗原は、製薬上許容されている塩、キャリア、芳香剤、等 と混合してもよい。

抗原は、そのような抗原を必要としている患者への投与のために、他の適当な抗 原と組み合わせて投与してもよい。たとえば、１つ以上の組織原または橿からの タイプＩｆコラーゲンを使用してもよい。本発明の自己抗原は、そのような抗原 を必要としている患者への投与のために、適当な薬理学的キャリアと組み合わせ て投与してもよい。そのような抗原は、ヒト及び動物の自己免疫性疾患の予防的 、緩和的、予防の、あるいは状況回復する効果を持つ任意の形態で投与すること ができる。

本発明の自己抗原は、経口投与用の、錠剤、カプセル剤、粉体小包、液状溶液の ような投与形態で、そのような投与形態にすることによって、自己抗原の生物学 的活性が破壊されない限り、採用されることができる。

経口投与のための、本発明の自己抗原は、乾燥粉体、食品材料、水性あるいは非 水性溶媒、懸濁液あるいは乳化液として提供される抗原を含む。非水性溶媒の例 は、プロピレノグリコール、ポリエチレングリフール、野菜油、魚油、及び注射 可能な有機エステルである。水性キャリアは、水、水−アルコール溶液、懸濁液 または乳化液を含み、それらは、塩化ナトリウム溶液、リンガ−のデキストロー ス溶液、塩化ナトリウム及びデキストロース溶液、リンガ−の乳糖含有溶液、ま たは固定油を含む、塩水や緩衝した医学的経口賦豐剤を含んでいる。

自己抗原、断片、あるいは類似体が経腸的に投与される場合、それは、固体、半 固体、懸濁液、乳化液の形管で導入されてよく、水、懸濁剤、乳化剤を含む製薬 上許容されたキャリアをホストとして混合してもよい。

本発明の抗原は、特に、患者の自己免疫性疾患の進行を阻害するように予防的測 定として投与されたり、すでに確立された自己免疫性疾患を改善したり遅延させ たりするように投与されるとき、ポンプによって、あるいは放出が維持された形 態で投与してもよい。

本発明の自己抗原を含み、本発明の方法で有用な製薬組成物は、それ自体知られ ている方法で作製される。例えば、抗原は、従来の混合、顆粒化、糖衣粒作製、 溶解、凍結乾燥、または類似の方法による製薬組成物として提供されてよい。

そのような組成物は、中にそしてそれ自体に、慢性あるいは急性の自己免疫性疾 患の抑制に有用性が見られる。

さらに、そのような組成物の低い潜在能力版は、軽い、慢性、あるいは急性の自 己免疫性病気の取扱いに有用である。

実貫的に自然汚染物のない自己抗原は、自然あるいは組換え体の原料から、従来 この分野でその上うなタンパク質を単離するのに用いられたことが知られている 条件や技術、即ち抽出、沈澱、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ ラフィー、電気泳動等によって単離し、精製することができる。

当業者は、過度の実験をすることな（、この分野で知られている技術を用いて自 己抗原の抗原ドメインを同定することができ、そのようなドメインは、本発明の 方法において好適である。例えば、元の自己抗体の誘導体、あるいは、組換えで 生成した自己抗体の誘導体は、全長タンパクを通常のプロテアーゼ、例えばトリ プシン、キモトリプシン、サブチリジン、でタンパク質切断することにより作製 できる。アクチン誘導樹脂のアフィニティークロマトグラフィーは、自己免疫性 疾患抑制能力のために、そのようなフラグメントの検定に使用してよい。

自己免疫性疾患抑制活性を有する化合物や断片を同定したい場合は、そのような 化合物や断片は、その分野で知られている技術により同定することができる。

さらに、そのような断片は、機能が相同性（ｈｏｍｏｔｏｇｙ）に従うと予想さ れる他の知られた自己免疫性ドメインに対する相同性によって同定してもよい例 えば、本発明の方法で有用な自己抗原は、自己免疫性疾患に悩まされているある いは前もって処理された患者に対し、そのような抗原を投与したときに自己抗原 誘起の自己免疫性疾患を抑制する、その自己抗原の能力によって、同定してもよ い。本発明の方法においては、自己免疫性疾患は、疾患の徴候が現れる前あるい は現れた後に、抗原を投与することにより、自己免疫性疾患が抑制される。

今まで本発明を一般的に説明したが、引き続（実施例は、本発明を実施する上に おいて使用される材料及び方法をさらに説明する。本発明は、実施例に限られる ものではない。

一宜鳳五 Ａ、方法 Ｍ：　体重１５０〜２２０ｇ　（年令６〜８週間）の雌のルイスラブドまたはラ イスターフアース（Ｗｉｓｔｅｒ　Ｆｕｒｔｈ）ラットを、ウィルミントン。

ＭＡのチャールズリバー研究所、あるいはインディアナポリス、ＩＮのハーラン スブレイジデ二−レー社から入手し、すべての実験において使用した。

艶血ユ免疫止：　ラットを、その両後足において、完全７０イントアジ二バント （ＣＦＡ）に乳化した５０μｇのモルモットＭＢＰで、免疫化した。いくつかの 実験では、５０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）（シグマ社）を乳化抗原に添加 して、同じように注入した。ＥＡＥは、手足の麻痺によって特徴付け、次のよう に評点した。０）病気でない：　ｌ）手足の末端の活性が減ってきている：２） 軽い麻痺、不安定な足取り：　３）手足のさらに広い範囲において中程度の麻痺 ：　４）四肢の麻痺。

緑豆り裏１旦延簾：　ラットに、ＭＢＰあるいはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） を、３日の間隔５回、ＰＢＳ　（Ｈ２０１０００ｍｌ中、８ｇｍＮａＣ１，０， ２ｇｍＫｃ１，１．４４ｇｍＮａ２ＨＰＯ４，０，２４ｇｍＫＨ２ＰＯ４）１ｍ ｌ中１ｍｇずつ、プラスチリクチ１−ブ被覆した２３ゲージ針を便って与えた。

！！Ｌｕｉ：　免疫処理の後９日後に、ラットを犠牲にし、それらの膝窩リンパ 節を取り出した。圧力をかけてリンパ節をステンレス嫡メツシュに通すことによ って、単一細胞懸濁液を用意した。総数１０５のリンパ節細胞（ＬＮＧ）を、指 定された数の照射（２０００ラド）ＬＮＧ、あるいは投与ラットから誘導された 未処理ＬＮＧとともに培養したものを、丸底の９６ウエルプレート（コースタ− ）で４つ用意した。ＭＢＰと結核Ｉｆ（Ｍｔ）を５０μｇ／ｍｌ、容積２０μｌ の培養液に添加した。培養液は８０時間温１し、培養の最後の１６時間は、１μ ＣＩ　［３Ｈ］　ＴｄＲ／ウェルで標識した。それから、培養液を自動細胞収集 容器で収集し、標準液体シンチレーシ豐ン計数管で読み取つた。

開始ＬＮＣ（ＰＬＮＣ）増殖の抑制パーセントは、次式によって計算した。

ｃｐｓ（投与ラットからの照射ＬｌＩＣ＋ＰＬＩＩＣ＋抗原）％抑制−１ｏｏ　 １− ｃｐ■（未処理ラットからの照射ＬｌｌＣ＋　ＰＬＮＣ抗原）皇ｔｕ：　すべて の実験においてＲＰＭＩ　（ギブコ製）を使用した。培地は、２Ｘ１０′５Ｍ２ −メルカプトエタノール、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリンとストレ プトマイシン、１％非必須アミノ酸および１％自家血清を添加した後、無菌濾過 した。

凰ユｌ鳳思群ｍし　膵臓細胞からのＣＤ３．ＣＤ４．ＣＤ８群の喪失のために、 負の選択をした。ペトリ皿を、Ｐ　Ｂ　Ｓ／Ｂ　Ｓ　Ａ中１０ｍ１の１／１００ ０やぎ抗マウスＩ　ｇＧ＋Ｉ　ｇＭ抗体（タボｍｌ）で、１昼夜４℃でコーティ ングした。それから、皿を洗って、ＰＢＳ中３％のウシ胎児血清で、３０分２０ ℃でコーティングし、再び洗つた。ルイスＬＮＣは、ＰＢＳ中１／Ｚｏｏに希釈 されたＣＤ！（ＭＩｔＣ，ＯＸ／３８）、ＣＤ４（Ｗ３／２５）あるいはＣＤ８ （ＯＸ／８）用のマウス抗ラットの単クローン抗体（セロチック／バイオプロダ クツ製）で染色した。細胞は、氷上で３０分染色し、洗った後、−皿当り５ｍ１ ＰＢＳ中１５００万細胞を、４℃で、予めプレコートされたベトリ皿に播種した 。非粘着性の細胞を含む上澄みを、６０分後に穏やかに吸引し、細胞検査および 計数の前に２度遠心分離した。この実験は、膜免疫蛍光法を実施することによっ て、蛍光標示式細胞分取器で検査したところ、約８５〜９５％の純度の細胞群を 得た。

！玉免疫圧λ！鳳：　提供側ラットには、ＭＢＡかＢＳＡのいずれかを、１ｍｇ ずつ５回、３〜４日の間隔で投与し、最後の投与の４日後、犠牲にした。腸間膜 のＬＮＣと膵臓細胞を収集して、直ちに、あるいはコンカバリン−Ａ（Ｃｏｎ− Ａ）で活性化した後、増殖培地中１．５μｇ／ｍｌを、４８時間で腹膜内に注入 した。養子免疫移入実験で注入された細胞数は、次の通りであった；活性あるイ ハ不活性を含む全ＬＮＣ群が１２０ｘ１０８；　ＣＤ３を喪失したＬＮｃが６゜ Ｘ　１０８．ＣＤ４を喪失した群が８０ｘｌＯ’；ＣＤ８を喪失し？−ＬＮＧが ９５×１０６であった。受容側ルイスラフトには、４時間後に、ＥＡＥ誘導のた めに、Ｂ　Ｆ’／ＣＦ　Ａで免疫処理を施した。

底生ｍ二／Ｌ＝：　ＭＢＰとＯＶＡに対する抗体力価を決定するために、固相酵 素結合免疫吸収剤検査法（ＥＬＩＳＡ）を採用した。微滴定用の皿を、１０μｇ 抗原／ｍ＋のウェル当り０．１　ｍ　ｌで湿質したものを、蒸留水中に２つ用意 した。皿は、１８時間２５℃で湿質した。ＰＢＳ／トゥイージー２０（バイオラ ド１１）、ｐＨ７，５’ｔ’３回洗った後、皿を３％ＢＳＡ／ＰＢＳｔ’２時間 ３７℃で湿質し、２回洗い、１００μｍの希釈血清を４倍量になるように加えた 。皿を２時間３７℃で湿質した。ＰＢＳ／）ウィーン−２０で３回リンスした後 、皿を、！％ＢＳＡ／ＰＢＳｔ’ｌ　：　１００Ｏに希釈された１００ｇ１／つ 、ルのヘルオキシダーゼー結合やぎ抗うットｘｇｃ；抗体（タボ製、ＵＳＡ＞で 、１時間２５℃で湿質した。彩色反応は、３０％Ｈ２Ｏ２を含むＤ−７エニレン ジアミン（０，４ｍｇ　／　ｍ　１リン酸塩）クエン酸緩衝液、ｐＨ５，０）に 浸すことによって得られた。

反応は、０．４Ｎ　Ｈ２ｓｏ４を添加することによって停止し、ＥＬＩＳＡｉｌ ！み取り器でＯＤ４９２ｎｍを読み取った。

の　：　膝裏と膵臓のＬＮＧは、投与された純粋でかつ免疫性テストに使われた ラットから得られ、ベトリ皿に１ｍｌ当り１０？細胞の濃度で単独に播種され、 あるいは他のＰＬＮＧとともに指示通りに照射（２ＱＯＯラド）された。培養液 を、抗原有り（２０μｇ／ｍ　＋　）あるいは無しで、増殖培地中で、３日間恒 温器内に保持し、その後収集した。生体外での生成とＩｇＧ抗体の分泌を実験す るために、希釈上澄みを使用し、前述した通りにして、ＥＬＩＳＡテスト法を泪 いて抗体生成の測定を行った。

な　のミニリン　ンパク　のＥＡＥ　に　る　の６：　１〜３７ｇ域のモルモッ トミニリン埴基性タンパク質の重複断片を、固相ペプチド技術、Ｈｏｕｇｈｔｅ ｎ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υＳＡ　８２：５１３１〜 ５１３５　（１９８５）を用いて合成した。そして、これらの断片を、全ミニリ ン塩基性タンパク質の１５　ｍ　ｇに等しいモル濃度になるように経口投与した 。それらは、免疫化より−７，−５そして一２日前に投与した。そして、既に確 立されている方法にしたがって７０インドアジ１バンドの塩基性タンパク質で、 動物の免疫性テストを行い、そして評点した。

ンパ　ルートが　の　に　の ｔ五二より１瀝［動物には、全ミニリン塩基性タンパク質を与え、その足にフロ イントアジュバントで免疫処理を施すか、あるいは経口投与のいずれかを行った 。その後７〜ｌＯ日で、肺臓とリンパ節細胞を取り出し、生体外にて再び、ミニ リン塩基性タンパク質分子の異なる断片で、刺激を与えた。

）　−　ン　アジ１バント：　可溶性形態のニワトリのタイプＩ＋コラーゲンを 、ボストン、ＭＡのゲンザイムコーボレーシ■ンから入手した。ウシのタイプ目 １フラーゲンは、バーミントン、ＡＬのサインバイオテクノロジーアソンエイツ 株式会社から購入し、また、タイプＩコラーゲンは、ボストン、ＭＡのベス　イ スラエル病院のり、トレンタン博士から寄贈された。結核菌と不完全７０インド アジユバント（ＩＦＡ）は、デトロイト、Ｍｌのディフッ研究所から購入した。

完全７０イントアジニバン）（ＣＦＡ）は、微粉にＩＦＡとＭＴ基賀を混合する ことによって準備した。

１ユＵ襄に　抗原は、疾患を誘発する前に３回（−７，−５，−２日）、１８Ｇ ボールペン針を備えたシリンジを通して、容積１ｍｌを経口投与した。コラーゲ ンは、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，６）に溶解したのに対し、ＭＴは、投与 用のリン酸緩衝塩類液（ＰＢＳ）に懸濁させた。

匝証±二区主：　１０ｍｇ／ｍｌの結ＷＳＷを含むＣＦＡＯ，１ｍｌで、尾の付 は根に皮下注射することで、動物にアジ１バント関節炎を誘発した。

阻監免ユ匠ｉ；　関節炎の発生は、疾患誘発後３５日以内に関節炎の臨床的証明 がなされたラットの数で評価した。関節炎の程度は、標準方法（Ｔｒｅｎｔｂａ ｍ、Ｄ、Ｅ、ｅｔ　ｍｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４６：８５７　（１９７７ ））にしたがって等級付けした。４本の足のそれぞれは、次のように等級付けし た・０＝平常、ｉ＝単に赤色、２；赤色＋軽い腸れ、３ｓ＝ひどい腫れ、４：関 節部の変形。それぞれの動物の関節炎の点数は、４本の手足の各点数の合計とじ た。最大の関節炎点数は、疾敬の進行中において、個々の動物の最高点数である 。

すべての評価は、扱ったグループの知識なしに盲状態で実施した。

＋７ｔｔｔ））　：　ラットには、Ｉｍｇ／ｍｔＭｒを含むＣＦＡを０．１ｍｌ 、尾の付は根に注入した。９日後、排出リンパ節を取り出し、単一細胞懸濁液を 用意した。２回洗った後、１％グルタミン、１％ペニシリン／ストレブトフイン ン、１％非必須アミノ酸、５％ウシ胎児血清勢よび５×１０づＭ２−メルカプト エタノールを含むＲＰＭＩ１６４０で、細胞を再び懸濁させた。その後、濃度２ ．５Ｘ１０５細胞数／ウエルのものを４つ、９６ウ工ル平底皿に播種し、５％Ｃ Ｏ２で３７℃でＭＴの濃度を種々に変えて７２時間培養した。その後、トリチウ ム化チミジンをＩａｃ＋／ウェルで培養液に添加した。細胞は、標識後６時間で 収集し、増殖は、液体ンンチレーシ１ン計数機によって測定したとおり、トリチ ウム化チミジン結合によって決定した。

：　ＤＴＨ応答は、免疫化の後３０日後に測定した。ラットには、５０μｌ　Ｐ ＢＳ中２０μｇのＣＩｌのＭＴＩＯμｇを、両耳に皮下注射した。耳の腫れは、 マイクロメータ測径器を用いて、注射前と注射後４８時間で測定した耳の厚さの 違いから判った。また、ＤＴＨ応答は、非免疫化の動物とＣ１ｌのみを与えられ た動物において実施した。

の　：　提供者側ラットには、２〜３日の間隔で、Ｃ１１３８ｇずつを３回投与 した。最後の投与をしてから７日後、彼らの肺臓を取り出し、単一細胞懸濁液を 用意した。トリス−ＮＨａＣｌ、ｐＨ７，２６で赤血球を溶解した後、スプレ／ サイトを、ハンクス液（ＨＢＳＳ）で２回洗った。い（つかの実験においては、 スプレ／サイトは、ナイロンウールカラムを使うことによって、ＴあるいはＢ細 胞に分離させた。Ｉ　Ｘ　Ｉ　０８の１ｌＩｌ胞を、各受容体に１１！膜内注射 した。

受容体には、同日あるいは２日後のいずれかに、関節炎を引き起こすために、Ｃ ＦＡを注射した。また、対照標準用として、投与されていない通常のラットから のスプレ／サイトを用いた。

一二 急性の単−位相性ＥＡＥへの感受性と重篤性に対するＭＢＰとそのペプチド断片 の投与の効果を、ルイスラフトで研究した。その結果は、寛容誘導の自然ルート が、疾患の進行とＭＢＰへの免疫応答の両方を抑制することを示している。

ＥＡＥの経口誘導抑制のために、ルイスラフトに、モルモットの脳（ＤｉａｂＩ ｅｒ、Ｇ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｅｐ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２：１３９　（１９７ ２））から精製したＭＢＰを、２０Ｇボールペン針付きのシリンジを使って投与 した。対照標準用の動物には、等量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）あるいは塩 類液を投与した。ＥＡＥは、２００μｇの結核−を含む完全フａインドアジュバ ント（ＣＦＡ）に乳化されたＭＢＰ５０μｇを後ろ足に注射することによって免 疫化した。疾患は、免疫化の後通常１２から１５日の間に、後ろ手足の麻痺と失 禁によって特徴付け、すべての場合において、ラットは１６日で回復した。第１ の実験では、投与の回数とＭＢＰの用量が疾患の発現に与える効果について調査 した。ラットには、免疫化（０日）の７日前（−７）に１回、あるいは−１４、 −７および０の３＠のいずれかに、覆々の童のＭＯＰを与えた。結果（表１）は 、ラットに投与したＭＢＰｉｆｉＥＡＥを抑制することと、経口誘導抑制が用型 依存性であることを証明するものであった。ａＯＯμｇの投与を複数回行うこと は、結果として、疾患を完全に抑制し、この用量で一回の投与をするよりさらに 効果的であった。ＥＡＥの臨床的発現に加えて、ラットの疾患の組織学的証拠を 調査した。免疫の後１６日で、ラットを犠牲にし、脳を取り除いてホルマリン溶 液に固定した。固定液は、１００ｍ１の７０％ヱタ／−ル、１０１ｎｌの３７％ ホルマリンおよび５ｍｌの氷酢酸の溶液とした。パラフィン固定組織のスライド を、各ラットかう用意し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。血管周辺の炎 症の病巣を、既に確立されている手順（Ｓｏｂｅｌ、Ｒ，、ｅｔ　ｓ＋１．、Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｔ、１３２：２３９３　（１９８４））にしたがって、遺伝暗号 スライド上７定量化した。表１に示したように、−１４、−７および０日に５０ ０μｇＭＢＰを投与したラットは、脳の炎症数に明らかな減少を引き起こしてい た。中程度の減少は、１００μｇ投与の動物で見られ、またあまり顕著でない炎 症の減少は、２５μｇＭＢＰを投与したラットにおいて見られた。

実施例２ Ｌ１２　に　てお　こ　が　に　ぼ ｊＦ＋２の実験では、経口誘導抑制が、抗原に前身て晒してお（ことによって影 響を受けるか否かを決定するために、ＭＢＰで免疫化する前あるいは後でＭＢＰ を投与することの効果を調査した。これらの実験のために、動物には、５００μ ｇのＭＢＦを、疾患の能動誘導（ＭＢＦでの免疫化）の前あるいは後のいずれか に、３回投与した。結果（表２）は、動物に感作の前あるいは後にＭＢＰを与え たかどうかで、疾もの臨床発現が抑制されることを証明しており、その効果は、 抗原が免疫化の前に投与されている場合に、より完全なものとなる。しかしなが ら、組織学的調査によれば、ＭＢＦへの感作の前あるいは後のいずれかにＭＢＰ を与えられたラットにおいて、血管周辺の湿潤物の劇的な減少が示された。また 、ラットに、免疫化の後＋５あるいは＋７日から３＠の投与を開始した場合ｊこ 、疾患の６０％以上の抑制が起こった（データは示されていない）。

さらに、ＭＢＰで免疫化する前と後に、ラットに１００μｇのＭＢＰを種々回数 を変えて与え、実験を行った。表３に示すように、疾患の抑制は、免疫化の前あ るいは後に１回だけ投与した場合に見られた。

実施例３ ＭＢＰの　口　がＭＢＰに　る　およびホルモン　の　に五泣策 ＭＢＰの経口投与が、ＭＢＰに対する細胞性およびホルモン性の免疫応答に与え る効果について調べた。ＭＢＦに対する増殖応答は、ＭＢＰの種々異なる用量を ラットに与えた後、またさらに免疫化に関して種々異なる回数与えた後、調査し た。免疫化の１０日後に、ラットを犠牲にし、排出（膝裏の）リンパ節の単一細 胞懸濁液を用意した。ｍ胞を、４μ間ミクロウェルで培養し、最後の２４時間で 、３Ｈ−チミン／を添加した。２％グルタミン、１％ペニンジン／ストレプトマ イ／ン、５ｘｌＱ−５Ｍの２−メルカプトエタノールおよび５％ウシ胎児血清を 含むＲＰＭ１１６４０中に４Ｘ１０５の細胞を含有する０、２ｍｌを１、各ミク ロウェルに添加し、ＭＢＰを５０μｇ／ｍ＋添加した。ウェルを、ｌμＣｉトリ チウム化チミジンで標識し、マルチハーベスタ−を使ってファイバーグラスフィ ルター上に収集し、標準液体／ンチレーン璽ン技術にしたがって計測した。

結果（表１および２）は、ＭＢＰ投与が、ＭＢＰに対する増殖応答に著しい減少 （７５から９２％）を引き起こすことを示している。増殖の抑制は、疾患の抑制 と違って、すべての用量で起こり、また免疫化後の投与も含めて、テストした摂 生投与でも起こった。ＭＢＰに対する増殖応答の経口誘導抑制は、表１に示すよ うに、抗原特異性である。特に、ＭＢＦ投与は、精製したタンパク質誘導体（Ｐ ＰＤ）、すなわちＣＦＡで免疫化した結果としての増殖応答を誘導する結核菌か ら引き起こされた抗原に対する増殖応答は抑制しない。不適切な抗原、すなわち ８ＳＡを投与することは、ＰＰＤｊ二対する増殖応答に影響を与えず、ＭＯＰに 対する増殖応答をわずかに抑制するだけである。

実施例４ ＭＢＰ　がＭＢＰに・　に　え ＭＢＰ投与が、ＭＢＰに対する抗体生成に与える効果について調べた。ＭＢＰを 投与されたラットを免疫化し、免疫化の後１６日後に心臓を穿刺することによっ て、血液を採取した。血清中の抗ＭＢＰ抗体のレベルを、ＥＬＩＳＡによって測 定した。ミクロウェル当り、０．１ｍｌのＭＢＰ＃液（ＰＢＳ中に０．０５ｒｎ ｇ／　ｍ　１　）を加え、３７℃で３時間温室した。つ墨ルを、０．０５％トウ ィーンを含むＰｕｓ　（ＰＢＳＴ）で洗い、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ、ｐＨ９，０ で、４℃で−Ｊｉ［ブロックした。ＰＢＳＴでウェルを洗浄した後、希釈したラ ットの血清を加え、室温にて３時間温室し、ＰＢＳＴで２度目の洗浄をした後、 抗体（やぎ抗うγト結合ベルオ牛ンダーゼ）を、室温にて１時間添加した。基質 を加え、０゜１ＭのＮａＦｌで反応を停止した。プレートは、タイターチックマ ルチスキャンで４５０μｍで読み取つた。また、ＣＦＡだｌすで免疫化したラッ トからの血清についても、ＡｂＳ４５０を決定し、それをバックグラウンドとし て、すべての値から差し引いた。

実質的にすべての用量と、テストしたすべての摂生投与において見られた増殖応 答の抑制とは違って、抗体生成の抑制は、動物が、−１４、−７および０日に、 テストした最大用量を投与した場合にのみ見られた（６６％抑制、表１）。記す べきことに、−７、−５および一２日に５００μｇのＭＢＰを投与したラット（ 表２）において抑制が欠落したことは、同じ用量のＭＯＰを投与している時間的 流れが、抗体応答の抑制にとって重要であることを示唆している。

表１ ルイスラフトにおけるＥＡＥの経口誘導抑制に与える投与用量の効果１人旦！！ ４３　Ｍｓｐに対する免疫応答パーセント ・直困ｎ腹鬼　ｂ鮭監ｉ且圧点　ｃ！！Ｌ！　’区庄免疫化対照　１９／２２　 ９．２±５．８　−　−投与日　−７ ２５μｇ　３１５　ＮＤ　７５．６±２　ＮＤＩ００μｇ　２１５ｄ　ＮＤ　８ ８．９　Ｎ０５００８ｇ　３／１０””　ＮＤ　８８．９±２　ＮＤ投与日　− １４，−７，０ ２５μｇ　３１５　７．２±５．２　８２．１　−４８±７２１００μｇ　２１ ５＊　３．１１．９　８０．８±５　１４±４９ＳＯＯμｇ　Ｑ　／　ｌ　Ｑ− Ｑ　、　２±０．４　８７．２±１　６６±３９（ａ）ラットには、措示された 日に種々の用量のＭＢＰを投与し、０日にＣＦＡ中５０μｇＭＢＰ　（２００ｇ ｇ結核ｍ＞で免疫化した。免疫化した全体数のうち疾患になったラットの数を示 した。免疫化対照は、ＢＳＡあるいは塩類液を投与した。

（ｂ）ラットは、免疫化の後１６日後に犠牲にし、脳を取り出して固定した。動 物当りの血管周辺の炎症の平均数を示した。ＮＤは、決定していないということ である。

（ｃ）ＭＢＰに対する増殖応答は、ラットを免疫化した後１０日後に、排出リン パ節細胞について測定した。２％グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイ シン、５Ｘ１０′５Ｍの２−メルカプトエタノールおよび５％ウシ胎児血清を含 む（１，２ｍｌを、各ミクククエルに添加し、ＭＢＦを５０μｇ／ｍ１添加した 。ウェルを、１μＣｉトリチウム化チミジンで標識し、マルチハーベスタ−を使 ってファイバーグラスフィルター上に収集し、標準液体シンチレータ１ン技術に よって計測した。免疫制御基に関するＭＢＰへの増殖応答の抑制パーセントを示 した、免疫化対照の平均的刺激の指標（ＭＢＦ刺激ｃｐｍ／パックグラウンドｃ ｐｍ）は、６．０　（２９８８８ｃｐｍ／４９６０ｃｐｍ）であった。

（ｃりラットは、１６日後に犠牲にし、心臓穿刺によって血液を採取した。血清 を、１／１５６２５に希釈し、抗ＭＢＰ抗体レベルを、ＥＬＩＳＡによって決定 した。ミクロウェル当り、ＭＢＰ溶液（ＰＢＳ中０．０５ｍｇ／ｍ＋）０．１ｍ ｌを添加し、３７℃でａ時間湿質した。ウェルを０．０５％トウィーンを含むＰ ＢＳ　（ＰＢＳＴ）で洗い、ＰＢＳ中５％ＢＳＡ、ｐＨ９，０で、４℃にて一昼 夜ブロックした。ＰＢＳＴでウェルを洗った後、希釈したラットの血清を添加し 、室温で３時間温室し、ＰＢＳＴで２度目の洗浄をした後、抗体（ペルオキシダ ーゼ結合やぎ抗ラット）を室温にて１時間加えた。さらに基質を加え、タイター チックマルチスキャンで４５０＊ｍを読み取った。また、ＣＦＡでのみ免疫化し たラットからの血清についても、ｆｉＬｂ３４！ＸＪを決定し、すべての値から 、バックグラウンドとして差し引いた。ベルオキシダーゼ基質の４５０＊ｍでの 吸光度によって測定したように、免疫制御に関して、抗体レベルのパーセント減 少を示した（差し引かれたバックグラウンドでの免疫制御のＡａにおける吸収は 、Ｏ，１４８であった。）。

（ｅ）グループを一自由度のカイ二乗分析によって比較した。＊ｐ＜、０５．韓 ｐ＜０．１、綱体ｐ＜、ＯＯｌ。

表２ の１　い（′　の−トへの　の′−に　ｒＷ区導　ＭＢＰに対する免疫応答 ユと：」二ｆ 唯１刀五、ｔ　ｂ！Ｌｌｌｊηｍ　１厘　電差免疫化対照　２３／２６　２１． ６±５．１　−　−５００μｇＭＢＰの投与日 −７，−５，−２，＋２．＋５．＋７０１５−０．２±０．４　ＮＤ　３４−７ ．−５．−２　０７１７”ｉ’ｌ’　０　９２．６　１５＋２、＋５．＋７　４ 　／　ｌ　Ｑ本１　１．４ｆ２．３　９１．５　±３　１５（ａ）ラットには、 指示された日に５ｏｏμｇのＭＢＰを与え、０日にＣＦＡ中５０μｇＭＢＰで免 疫化した。免疫化対照は、ＢＳＡあるいは塩ｌｌｉ液を投与した（ｂ）表１参照 （Ｃ）表１ｆ￥照。免疫化対照の平均的刺激指標は、９．４　（ｓ２２４７ｃｐ ｍ／８７１８　ｃ　ｐｍ）でありた。

（ｄ）表１参照。バックグラウンドとして減じた免疫化対照のＡ　４５０での平 均吸収は、０．４０３であった。

（ｅ）表ｉｌｌ照。

表３ ルイスラフトにおするＥＡＥの　ロ ー１４．−７．０．＋７　０７１３ ＋７　１７５ ラツトには、指示された日（免疫化の日を０日として）に、１００μｇのＭ？Ｂ を与え、ＣＦＡ　（，５ｍｇ／ｍ１．結核！１）とともにｓｏｐｇのＭＢＰで免 疫実施例５ に　の ＥＡＥに抗する経口誘導保護の持続を決定するために、さらに実験を行った。

５００μｇのＭＢＰで−７、−５および一２日に投与した後、ラットを、最後の 給餌後に種々の長さの時間経過後とに免疫化した。ＥＡＥは、投与後４週間まで 、ラット内で完全に抑制されていた。８週間では、ＭＢＰを与えられたラットの ５０％が、疾患に抵抗していた。表４に示したように、結果は、最後の投与の徒 歩なくとも４週間は、疾患に対する耐性が維持され、投与の後８４間で、疾患の 誘発に感応が現われ始めることを示唆している。

表４ ルイスラットの　口　の ＃疾患のラット／全体 対照　９／１４ 投与 免疫化日ＯＯ／４ ＋５６　４／８ ラツトには、−７、−５および一２日にｓｏｏａｇのＭＢＦを与え、ＣＦＡ中５ ０μｇのＭＯＰで指示された日に免疫化した。対照標準用ラット（ＢＳＡ投与し ている）も、同様に免疫化した。

実施例６ ＥＡＥの　′−に　ぼ　ＭＢＰ　の うｑト内のモルモットＭＢＰの起脳炎領域が、７５〜８４残基に位置する特異的 デカペプチドンーケンスであり、それ自身ＥＡＥを誘導できるが、分子の他の領 域は非脳炎誘発性であることが知られている（Ｈａｓｈｉｍ、Ｇ、、ＭｙｅｌＩ ｎ：Ｃｈｅｍｊｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、 Ｎ、Ｙ、（１９８０））。さらに、他の抗原については、明白な抑制決定因子が 、免疫決定因子とは異なった部位に存在していることが報告されている（Ｙ。

Ｗｅｌｌ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７９ニア０　（１９７９） ）。

したがって、ＭＢＦの脳炎誘発性断片および非脳炎誘発性断片の両方が、経口投 与を経てＥＡＥを阻害することができるかどうかをＨ斎してきた。モルモットＭ ＢＰの断片は、限界ペプシン消化によって生成し、カラムクロマトグラフィーに よりて分離される（Ｗｈｌ　ｔａｋｅｒ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｍ、２５０　：　９１０６　：　（１９７５））＊　３つの異なる断片を 、ラットに与え、それから、全ＭＢＰで動物を免疫化した。疾患誘導（４４〜８ ９断片）と非脳炎誘発性（１〜３７断片と９０〜１７０断片）のペプチドの両方 とも、ラットに投与した場合において、ＥＡＥを抑制し、さらに非脳炎誘発性断 片の方が、脳炎誘発性断片よりも疾患を抑制する効果の大きいということが見い 出された（表５）。単一アミノ酸置換によって脳炎誘発性シーケンス（７５〜８ ４残基）とは異なったデカペプチド（３７９）を合成し、ラットにＣＦＡ　（Ｋ ａｒｄｙｓ、Ｅ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２７：８６２　（１ ９８１））を注射した時に抑制効果を誘発することが報告されている。Ｓ７９　 （Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｈｌｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓｐ−Ｇｌ 　ｕ−Ｇｌｙ）は、動物に与え、またＥＡＥを抑制することが見い出された（ｊ Ｅ５）。つ／のＭＢＰは、脳炎誘発性シーケンスを含むいくつかの部位において モルモ、）ＭＢＰ、！：はＢなるが、モルモットＭＢＰの脳炎誘発用量でも、ラ ットの場合には脳炎誘発性ではない（Ｈｏｌｏｓｈｌｔｚ、Ｉｔ、ｅｔ　ａｌ、 、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３１：２ｇｌ０　（１９８３））。また、免疫化の前 に、動物に投与をすると、抑制される。

表５ ゛　およ　がルイスラ　トにおけ　ＥＡＥの　に匡を肱！ 旦ｆｌ狂＆現 免疫化対照　１９／２５ ＭＢＦ断片１〜３７　Ｃ１０９ｔ＃）　０／９＠ｍＭＯＦ断片４４〜８９　（１ ３５μｇ）　３／１１ＭＭＢＦ断片９０−１７０　（２３５μｇ）　Ｏ／４林ペ ジペプチド３フ９０μｇ）　１／８梱呻ウンＭＢＰ　（５００ｇｇ）　Ｏ／１０ 刺休ルイスラ、トには、指示された童のＭＢＰ断片あるいはペプチド（全モルモ ットＭＢＰ５００μｇに等モル）を、−７、−５および一２日前に投与し、０日 に、ＣＦＡとともに５０μｇのモルモットＭＢＰで免疫化した。免疫化された総 数のうち疾患になったラットの数を示しである。（ａ）グループは、カイ二乗分 析によって免疫化制御と比較される。：林ｐ＜、０１．朝呻ｐ＜、００１゜実施 例７ ミコバクテリア　によ　アジュバント　；の尾の付Ｉｆ根に１０ｍｇ／ａｒｒの 完全フロイントアジ１バント０．１ｍｌで免疫化することによって、雌のルイス ラブドに、ア′）ＪＬバンド関節炎を誘導した。免疫化０日より前−７、−５お よび一２日と、免疫化の後＋７および＋１４日に、リン酸緩衝塩１［液中２．０ ｍｇの結核菌を、動物に与えた。免疫化の後３週間の関節の腫れを測定すること によって、関節炎を定量化したく表４および図２）。次の研究では、図２に示し たような結果は時々得られるものであるが、多くの例では結核菌をを動物に与え ることによってアジ二バント関節炎が抑制されるものではないことを示した。し たがって、結核菌の投与でアジ１パント関節炎を抑制する能力は、非常に変異的 なものなのである。この斐具性の理由はまだ判っていない２１日口の関節部の腫 れ（ｍｍ） 対照　７．６１±１４ ミコバクテ１ア −７，−５，−２５，６１±１．１＊ −７，−５，−２，＋７．＋１４　６．０７±０４９＊関節部の腫れとは、測定 日における関節部の厚さである。

本ｐ＜０．０１制御に比較して（４動物／グループの代表的実験）実施例８ マ　スに　１　の　モ　ル 実施できかつ再現できる養子移入再発ＥＡＥモデルは、ＳＪＬマウスで確立した 。このモデルの実験は、Ｍｏｋｈｔａｒｉａｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ３ ０９　：　３５８　（１９８４）から採用した。この実験は、図３に図示されて いる。簡単に言えば、提供側の動物は、ＣＦＡ中４００μｇのＭＢＰと３０μｇ の結核菌を含むエマルジ冒ンで免疫化した。その１０日後に、排出リンパ節細胞 を取り出して、５０μｇ　／　ｍ　ＩのＭＢＦと４日間培養し、大量に洗った後 、４〜６×１０７の生存細胞を雌の受容側動物に静脈注射した。動物には、標準 スケールを使って、臨床ＥＡＥ用の評点を行い、標準Ｈ＆Ｅ組織学的分析法（Ｂ 　ｒ　ｏｗｎ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｌｓｂ　Ｉｎｖｅｓｔ、４５：２７８（１ ９８１）、Ｌｕｂｌｌｎ、ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２６： ８１９　（１９８１）、Ｂｅｒｎａｒｄ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、１６：６５５　（１９７６））を用いて病理学的評点を行った。動 物は、移入微少なくとも１００日間監視し、再発の数を決定できるようにした。

実施例９ マ　スにお書　の ＣＦＡ中４００ｊｊｇのＭＢＰ　（０，６ｍｇ／ｍ１結核ｍ）で免疫化する前の ２週間、１日おきに（全部で７回の投与）、４００μｇのＭＢＰを投与して、Ｍ ＢＰ免疫化に対する応答におけるリンパ節細胞の増殖を抑制した。結果を、図４ に示す。この図には、バブフグラウンドによって割ったＭＢＰ誘導増殖（刺激指 標）の関数として、対照の結果対投与の結果が描かれている。

本発明は、この応用における方法および具体例と、前述したような具体例に限定 されるのではない。本発明は、本発明によって教示されたような自己免疫疾患の 抑制を生じさせるような任意の変更を含んでいる。これらの等価体は、特許請求 の範囲で定義されている保護範囲内に含まれるものである。

実施例１０ Ｍ　Ｐ　た　トか゛　口　の　轡　トへの　にの 提供側うｙトには、３〜４日の間隔で１ｍｇを５回、ＭＢＰあるいはＢＳＡのい ずれかを投与し、最後の投与から４日後に犠牲にした。腸間膜リンパ節細胞（Ｌ ＮＧ）と肺臓細胞を収集して、すぐにあるいはフンカナバリン−Ａ（Ｃｏｎ−Ａ ）で活性化した後のいずれかに、４８時間にわたり増殖媒体中１，５μｇ／ｍｌ を腸膜内に注射した。養子免疫移入実験のために注射された細胞数は、次の通り であった：活性化したものもしていないものも含めた全ＬＮＣ群が１２０Ｘ１０ ８；　ＣＤ３を喪失したＬＮＣが６０ｘ１０６；　ＣＤ４を喪失したＷが８０Ｘ ｌＯ［１；ＣＤ８を喪失したＬＮＣが９５Ｘ１０ｅ。受容側のルイスラットは、 ＥＡＥの誘導後４時間後に、ＭＢＰ／ＣＦＡで免疫化した。投与した提供側ラッ トから純粋な同系の受容側ラットへのＥＡＥ発展に対する養子免疫移入実験の能 力は、表７に示した通りである。投与していないラットあるいはウシ血清アルブ ミン（ＢＳＡ）投与ラットから得られたＬＮＧは、ＥＡＨに対する移入保護に失 敗した。

しかし、ＭＯＰ投与提供者から得られた肺臓細胞あるいは腸間膜（ＭＥＳ）リン パ節細胞は両方とも、受容者において誘導されたＥＡＥに対する相対的移入保護 の能力がある。実際、それぞれ５０％および５７％の疾患抑制が証明されている 。また疾患の最高の重篤性は、ＭＢＰ投与提供側ラットから得られた肺臓細胞あ るいは腸間膜リンパ節細胞のいずれかの受容者においてもまた顕著に低下された 。これらの結果は、ＥＡＥＩ！導に対する経口寛容が細胞起源であること、また 保護に関与する細胞が腸間膜リンパ節と肺臓の両方に集中して存在していること が見い出されたことを証明するものである。

表７ た　たは　の　アトか′　゛れたＬＮ　いてＥＡＥにの なし　ＳＰＣ６／７　２．５±０．３ Ｍｅｓ、ＬＮＣ５１５２，６±０．４ ＢＳＡ　ＳＰＣ４／４　２．４±０２ Ｍｅｓ、ＬＮＣ５１５２，６±０．３ ＭＢＰ　ＳＰＣ４／８”　Ｌ、Ｓ±０．２本Ｍｅｓ、ＬＮＣ４／７”　１．７± ０．２＊ルイスラブドには、ＭＢＰあるいはＢＳＡのいずれかを、３日の間隔で 、１回の投与当り１ｍｇずつ５回投与し、または未処理のまま保持した。その後 、ラットを犠牲にし、それらの肺臓と腸間膜リンパ節を取り除いた。ＬＮＧを収 集し、Ｃｏｎ−Ａの存在下で４８時間活性化した。リン／ず芽球を集めて、３回 洗い、そして純粋な同系のラットに腹膜内注射した。受容側ラットは、ＥＡＥ誘 導のために、４時間後にＭＢＰ／ＣＦＡで免疫性テストした。疾患は、１０日目 跡ら毎日評点したく喫果は、統計学的に有意である。ｐ＜０．０５）。

実施例１１ ＥＡＥに　る　Ｉ　ンパ　の口 ＭＢＰ投与提供側うｙトから得たＣｏｎ−Ａ活性化肺臓細胞（ＳＰＣ）を、Ｔ細 胞、ヘルパー７９７１球（ＣＤ４）またはサプレッサー／細胞障害性Ｔ、リン／ ｆ　球（ＣＤ８）が喪失される前または後のどちらかに、純粋な同系ラットに移 植した。肺臓細胞からの、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８群の喪失のために、負の 選択を用いた。ベトリ皿を、−晩学４℃で、ＰＢＳ／ＰＳＡ中の１０ｍ１の１７ １０００ヤギの抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（Ｔａｇｏ）でコートした。その後 ブレートを洗浄し、ＰＨ３中の３％ウシ胎児血清を、２０℃で３０分間コートし 、再び洗浄した。ルイスＬＮＣを、ＰＨ３中で１／１００に希釈したＣＤ３　（ ＭＲＣ。

Ｏｘ／３ｇ）　、ＣＤ４　（Ｗ３／２５）またはＣＤ８　（ＯＸ／８）Ｉｃ対す るマウス抗ラットモノクローナル抗体（セロテブク／ノクイオプロダクト製）で 染色した。

細胞は、３０分間氷上で染色し、洗浄して、前コートしたベトリ皿に、１５．０ ｏｏ、ｏｏｏ細胞１５ｍＩＰＢＳ／プレート、４℃で播種した。非付着細胞を含 む上澄み液を、６０分後金やかに吸引し、細胞試験と計数を行なう前に２回速（ 、−した。この実験で、膜免疫蛍光法の試験による蛍光標示式細胞分取機におＣ する試験で、細胞群が約８５−９５％純度を生み出した。結果を表８に示した。

結果は、ＳＰＣは、ＥＡＥに対する移入阻害ができるが（５０％発現）、一方、 ＳＰＣを喪失したＴ細胞は、受容側う、トを防御する能力を失うこと（グループ ２）を示している。したがって、移入阻害できる肺臓細胞は、Ｔリンパ球である ように見える。しかし、ＣＤ８細胞の喪失（グループ４）は、移入阻害につなが らず、一方、ＣＤＪ＋を喪失したＳＰＣは、ＥＡＥに対してラットを防御するか なりの能力を示した。従って、ＭＢＰの経口投与後に生成され、疾患誘起に対す る抵抗を仲介する、抗原特異性１９７８球が、サブレフサ−／細胞陣害性すブセ １トであることは明かである。

表８ ＳＰＣの喪失した群を用いた、ＥＡＥに対する阻害の養子移入り゛ドア°　ＭＢ Ｐ投与提供側から　受容側ラットのＥＡＥ取り出したＳＰＣ発現　平均最大重篤 度１　全群　２７４　１．７±０６２＊ ２　ＣＤ３喪失　６／６　２．６±０．４＊３　ＣＤ４喪失　２／６＄　１．２ ±０．２＊４　ＣＤ８喪失　６／７　２．２±０．３提供側う１トは、ＭＢＦ’ を投与され、表１の凡例に示したように処理した。Ｃｏｎ−Ａ活性化ＳＰＣは、 純粋な受容側ラットに、ある亜群の喪失前（グループ１）、または後（グループ ２−４）に注射した。ＣＤ３．ＣＤ４．またはＣＤ８リンパ球の喪失は、モノク ローナルＩｇＧのＳＰＣへの力ｌブリングとパニング（ｐａｎｎＩｎｇ）によつ て行った。受容側ラットは、Ｍ　Ｂ　Ｐ　／　ＣＦ　Ａで免疫化し＋ＥＡＥは１ ０日から記録した（亭結果は、８１的に有意義である、Ｅ）＜０．０５）。

実施例１２ ＭＢＰ　ラ　トか゛のＩンバ　によ　インビトロでの　ＭＢＰ−７区３ｐ」引乳 ラットはＭＢＰ／ＣＦＡで免疫化し、それらの主要な膝高排出リンパ＠（ＰＬＮ Ｃ）を、９日後に取り出した。そのリンパ節を、ステンレス・メツシュを圧通さ せることにより、単−細胞懸Ｉｌｌ液を作製した。合計１０５のＬＮＧを、表示 した数の照射をした、あるいは投与ラットから導いた未処理のＬＮＧとともに、 丸底９６ウエルプレート（コースタ−）４つで培養した。ＭＢＰと結核菌の５０ μｇ／ｍＩを、容積２０μｍの培地に加えた。その培地は８０時間培養し、培養 の最終１６時間にＩＢＣｌ　［３Ｈ３ＴｄＲ／ｗｅｌ　ＩでＩｔ！Ｉした。培地 は、自動細胞収集器で収集し、標準液体シンチレーシ１ン計数機で読み取った。

感作ＬＮＣ（ＰＬＮＣ）の増殖の抑制比率は、次式によつて計算した。

ｃｐｍ（投与ラットからの照射ＬＮＣ＋ＰＬＮＣ十抗原）ＰＬＮＧは、照射ｓｐ ｃ、または純粋なあるいはＭＢＰ投与ラットからの腸間膜ＬＮＧとともに、ＭＢ Ｐまたは結核菌存在下で培養した。最後の投与後、異なった日に、ＭＢＰ投与提 供側ラットから得られたＬＮＧを試験した。結果を図５に示した。実験の時１％ ｆ１７レームとともに、投与ラットから得られたＬＮＧが、結核ｓＩ！ご応答す るＰＬＮＧに影響しなくなったことがわかる。しかし、投与ラットから得られた ＳＰＣと腸間膜ＬＮＣの両方が、ＭＢＰに対するＰＬＮＧ増殖を抑制できた。Ｐ ＬＮＧ応答の抗原特異的抑制は、腸間１１１ＬＮＣよりもＳＰＣを使用した方が 大きかった。抑制は、最後のＭＢＰ投与後５日から３６日に明確に現れており、 抑制の誘起は投与のすぐ後に達成され、比較的長期にわたって維持されることを 示している。

従って、ＥＡＥ誘起に対する耐性を与えられたラットから得られたＬＮＧは、抗 原特異的リンパ球であり、それは、投与に用いられた抗体にのみ対する細胞性免 疫応答を抑制することができる。

実施例１３ Ｐ　トか′　゛れた　の　の　の の 抑制に関与するＳＰＣの亜群を試験するために、最終の投与から２０６１後のＭ ＢＰ投与ラットから得たＳＰＣを、ある替ンパ球群を喪失させ、照射し、ＭＢＰ ／ＣＦＡ免疫化ラットからＭＢＰとともに得られたＰＬＮＧと混合した。膝裏及 び肺臓ＬＮＧを、１０７細胞／ｍｌベトリ皿の濃度で、単独あるいは他の標識し たＰＮＬＣとともに照射（２０Ｑ　ＯＲａ　ｄ　ｓ）　して、播種した。培地は 、増殖媒体中に、抗体く２０μｇ／ｍｌ）とともに又は抗体無しで、３日間恒温 器内に維持し、その後取り入れた。希釈された上澄み液は、ＩｇＧ抗体のインビ トロ生成と分泌の試験に使用し、ＥＬＩＳＡ試験を用いて抗体生成を測定した。

微量滴定プレートは、２度蒸留水中で、１０μｇ抗体／ｍｌの、Ｏ，１ｍｌ／ウ ェルで培養した。プレートは、２５℃で１８時間培養した。ＰＢＳ／トウィーン −２０（バイオラド製）、ｐＨ７，５で３回洗浄の後、プレートを３％ＢＳＡ／ ＰＢＳで２時間、３７℃で培養し、２回洗浄の後、ｉｏｏμｌの希釈血清を４回 加えた。

プレートは、２時間、３７℃で培養した。Ｐ８Ｓ／トウイーン−２０で３回リン スした後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１：１０００に希釈した過酸化物接合ヤギ抗う ットＩｇＧ抗体（タボ製、ＵＳＡ）の、１００μｍ／ウェルで、１時間２５℃で 培養した。発色反応は、３０％のＨ２Ｏ２を含む、Ｄ−７二二レンジアミン（０ ゜４　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌリン酸クエン酸緩衝液、ＤＨ５，０）に晒すことによ り得た。その反応は、０．４ＮのＨ２ＳＯ４を加えることにより停止させ、ＯＤ ４９２ｎｍをＥＬ　Ｉ　Ｓ　Ａ　ＩＪ−グーで読み取った。表９に示した結果は 、ＭＢＰ投与ラットから得られたＳＰＣ存在下でのＰＬＮＧによる抗体増殖抑制 の比率を、未処理ラットから得たＳＰＣ存在下でのＭＢＰに対するそれらの応答 に比較して示している。ＭＢＦ投与ラットから得たｓｐｃ　（グループ１）は、 ＭＢＰに対するＰＬＮＧの応答を抑制することを示している（７０％）。Ｔ細胞 の喪失（グループ２）あるいはサプレッサー／細胞障害性Ｔりンバ球の喪失（グ ループ３）は、抑制効果をなくしている。しかし、ヘルパーＴリンパ球の喪失（ ＣＤ４、グループ４）は、ＰＬＮＣの抗ＭＢＰ増殖応答の阻害を促進している。

ＣＤ４喪失ＳＰＣを希釈することは、抑制を９６％（１：１比率〉から１８％（ ＳＰＣ：ＰＬＮＣの比率がｌ：１００）に減少させる。

これらの結果は、疾患抑制とインビトロの抗原特異的細胞性応答の両方に関与す る細胞がＴ細胞起源のものであり、それはサブレ１サ一／細胞障害性ＴＩ／パ球 であるということを示唆している。

表９ ＭＢＰ投与ラットから得られた、照射ＳＰＣとその亜群存在下での、ＰＬＮＧの 抗ＭＢＦ応答の抑制 ＭＢＰ投与ラット　ＳＰＣ：ＰＬＮＣＭＢＰに対するり゛ルーフ°　から得たＳ ＰＣ比率　ＰＬＮＣ応答の抑制％ｌ　全Ｗ　１：１　７０ ２　ＣＤ３喪失　１：１　−１３ ３　ＣＤ８喪失　１：１　−３０ ４　ＣＤ４喪失　１：１　９６ ＣＤ４喪失　１：１０　３２ ＣＤ４喪失　１　：５０　３５ ＣＤ４喪失　１：１００　１８ ＭＢＰ投与ルイスラブドから肺臓を取り出した後、細胞を取り出し、照射し、Ｍ ＢＰ／ＣＦＡ免疫化同系ラットから取り出したレスポンダ−ＰＬＮＧとともに播 種した。ＳＰＣは、未処理の細胞として、あるいは、カップリングやパニングに 適当なモノクローナル抗体を用いてＣＤ３．ＣＤ４またはＣＤ８喪失リンパ球と して使用した。結果は、ＭＢＰに対するＰＬＮＣ応答抑制の比率で示し、それは 、非投与ラットから取り出した照射ＳＰＣの存在下でのＰＬＮＧ応答に対する相 対値である。

実施例１４ ＭＢＰに　口　に　れた　ＭＢＰのＩ　のルイスラフトを、ＭＢＰを投与または 未処理のままにした後、ＣＦＡ中で乳化したオボアルブミン（ＯＶ　Ａ）に混合 したＭＢＰで攻撃した。ラットは種々の時間間隔で出血させ、血清を抗ＯＶＡま たは抗ＭＢＰ抗体で試験した。図６ａに示すように、０／Ａに対するＸｇＧ血清 レベルは、ＭＢＰ投与ラットでは影響されないが、一方、ＭＢＰ投与ラットにお けるＭＢＰに対するＩｇＧ血清レベルは減少した（６ｂ）。

実施例１５ インビトロ　の　に　のａ ルイスラフトを、ＭＢＰを投与または未処理のままにした後、ＭＢＰ＋ＯＶＡ／ ＣＦＡで免疫化した。ＰＬＮを１２日後に取り出し、そのＰＬＮをＭＢＰまたは ＯＶＡ存在下で３日間培養した。その上澄み液を回収し、ｌ：２０に希釈してＩ ｇＧ含有量を測定した。表１Ｏに示したように、投与ラットから得たＰＬＮＧ（ グループ２）で、インビトロでＭＢＰとともに培養したものは、ＭＢＰに対する ＩｇＧ生成という面では、未処理ラットから得たＦ’ＬＮＧ　（グループ１１４ ５％抑制）に比較して、応答が劣っている。同じラットから得たＰＬＮＧにおけ る抗ＯＶＡＩｇＱ生成の産生は、影響を受けない（グループ４対５）。さらに、 ＭＢＰ投与され、免疫化されたラットから得た照射ＰＬＮＧと、ＭＢＰとともに 培養された免疫化ラットのＰＬＮＧ混合は、後に抗体生成を減少させるが（グル ープ３．３５％抑制）、一方、ＯＶＡに対する抗体力価は影響されなｔ＼（グル ープ６）。さらに、ＣＤａ＋細胞を取り除くことは、抗ＭＢＰ抗体の抑制をなく し、ＣＤ８＋細胞が、養子移入や増殖応答のようなかたちで、抑制に関与して（ Ｘることを示している。

の　レベル レスポンダ−モジル−タ　インビトロ　Ｏ，Ｄ、４１２　ＩｇＧ生成９’＆−７ °　細胞　細胞　刺激物　値±Ｓ、　Ｄ、　抑制％１　免疫化　−−ＭＢＰ　０ ．５６±０．０８　−−２　ＭＢＦ投与　−−ＭＢＰ　０１３１±０．０１　４ ５と免疫化 ３　免疫化　ＭＢＰ投与　ＭＢＰ　０．３６±０．０４　３５と免疫化 ４　免疫化　ＭＢＰ投与　ＭＢＰ　Ｏ，５５ｆＯ，０４０と免疫化 ＣＤ８＋ 喪失 ５　免疫化　−−ＯＶＡ　Ｏ，１７±０．０３　−−６　ＭＢＰ投与　−−ＯＶ Ａ　０．１＋±０．０２　０と免疫化 ７　免疫化　ＭＢＰ投与　ＯＶＡ　Ｏ，２１＋０．０４　０と免疫化 う、トは、ＭＢＰ＋ＯＶＡとＣＦＡで免疫化した（ＭＢＰの５回目の投与後数３ 日）。１２日後、それらのＰＬＮＣを取り出し、Ｍａｒ　（グループ１−４）ま たはＯＶＡ　（グループ５−７）とともに、３日間培養した。いくつかのグルー プでは、ＭＢＰ投与し、照射したラットから得た照射ＰＬＮＣを、照射し、免疫 化したＰＬＮＧとともに、ＭＢＰ存在下（グループ３）またはＯＶＡ存在下（グ ループ７）で培養した。これらの刺激物の上澄み液を回収し、希釈して、ＥＬＩ ＳＡによりＩｇＧレベルを同定した。

実施例１５ のペプチドの　−Ａ　い　・こ 二回足 モルモットのミニリン塩基性タンパク質のアミノ酸１−３７断片の重複断片苓、 固相ペプチド技術を用いて合成した。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ’ｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ、　８２．　５１３１−５１３５　（１９８ ５）。これらの断片の、１５ｇの全ミニリン塩基性タンパク質と同当量を経口投 与した。それらは、免疫化の７日、５日及び２日前に投与した。動物は、７０イ ンドアジ１バント塩基性タンパク質で、確立された方法に従って攻撃し、記録し た。

動物の、死亡率、疾患の有無、疾患の重篤度について記録した。表１１に示すよ うに、６／６の対照動物は、死亡率３／６の病気になった。重複ペプチド断片を 受けた動物においては、断片１−１Ｏを除く全ての断片で、死亡率が低下した。

疾病の重篤度の面から見た場合、アミノ酸５−２０の間の分子領域が、疾病の最 も顕著な減少を示した。これらの結果は、それ自体がサブレブンゲニフク断片で あるアミノ酸領域１−３７において、分子に特異的な領域は、経口投与した際、 その抑制が大きくまたは小さくなることを示している。

ＭＢＰ　ＦＡに　れたＥＡＥ 断片　疾病の誘起　平均最大評点　死亡率対照（ＰＢＳ）　６／６　３．８　３ ／６ｌ−ｔＯｓ１５　３．８　４１５ ５−１５　４１５　２．　１　１７５ １１−２０　４１５　２゜０　０１５ １ｆ１＋−２５４１５２，６０１５ ２１−３０５１５３，Ｏ１１５ ２６−３６４／６　２．６　１／６ ３１−３７　５／６　３．３　０フロ モルモットのミニリン塩基性タン１＜り質の１−３７領域の重複断片を、固相ペ プチド技術を用いて合成した。これらの断片は、１５ｍｇの全ミニリン塩基性タ ンパク質と同モル濃度で、経口投与した。それらは、免疫化の７日、５日、及び ２日前に投与した。動物は、フロイントアジエＩインド塩基性タンノ櫂り質で、 確立された方法に従って攻撃し、記録した。

実施例１６ ンパク　の　口　が　が　゛　るこ　の９Ｉ＋足においてフロインドアジユバン トで免疫化された動物、または、経口投与された動物に、全ミニリン塩基性タン パク質を与えた。その後７ｂら１０日後に、肺臓及びリンパ節細胞を取り出し、 インビトロで、塩基性タンパク質分子の異なった断片で再刺激した。

表１２に示すように、ミニリン塩基性タンパク質を、７０インドアジ１バント中 で、末端投与した場合、主要な応答は、増殖によって測られるように、４４−８ ９の起脳炎領域に対してである。しかし、表１３に見られるように、経口投与し た場合、主要な応答は、非起脳炎抑制剤決定因子である断片１−３７に対してで ある。

表１２ 全ＭＢＰで免疫化されたＬｅｗｌｓラットにおけるＭＢＰ断片に対する増殖１分 当りの計数　刺激指標 バックグラウンド　３，２９２　−− 全ＭＢＰ　１０．１４２　３．１ ＭＢＰ断片１−３７　３．３６０　１．０ＭＢＰ断片４４−８９　１０．０５４ 　３．０動物は、後ろ足において、ＣＦＡ中の５０μｇのＭＢＰで免疫化した。

１０Ｅ後、リンパ節細胞を取り出し、インビトロで、ｌＯμｇのＭＢＰまたは同 モル量のＭＢＦ断片で刺激した。

表１３ ＭＢＦを経口投与したルイスラブドにおけるＭＢＰ断片に対する増殖ＬＮＣの起 源　全ＭＢＰ　１−３７　４４−８９３　ＰＣ５，１０±ＩＪ　５．０５ｆ１． ８　２．４１±０．９腸間膜Ｌ　Ｎ　Ｃ８，６１±１．９　９４８ｆ１．５　３ ．５３±０８顆部　４．５８＋１．３　６．４２±０．９　２．Ｓｌ上０．６動 物は、１　ｍ　ｇの全ＭＢＰを３回投与し、投与から１６日に種々の器官から細 胞を取り出し、増殖を測定した。結果は、単独で培養した細胞との比較で、ｃｐ ｍＸｌｏ−３の変化として表した。

実施例１７ アジ１バント　゛に　たは　イブ！Ｉコラーゲン　のアジ１バント関節炎（ＡＡ ）は結核ＩＩ　（ＭＴ）を含むＣＦＡによって誘発されるので、この問題に関す る研究はまず、種々な投与量のＭＴを動物に投与することから始めた。しかし、 ３μｇ、３０μｇ、３００μｇ、または３ｍｇのＭＴを免疫化に先立つ−７，− ５，および−２日に投与するという広範な投与範囲にわたって、関節長脚の出現 率、発病日、または最大関節炎評点によって測定するとき、予期に反して疾患の 抑制は全（観察されなかった。動物を３μｇで前処理したときの代表的なデータ をＩＩ！７Ａに示す。

ＡＡを保有するラットにおけるコラーゲンに対する自己免疫性発現についての研 究報告（Ｔｒｅｎｔｈａｍ、Ｄ、Ｅ、　、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、６６ ．１１０９　（１９８０））に基づいて、ＡＡに対するタイプ■！コラーゲンの 経口投与の効果を試験した。図７Ｂおよび表１４に示すように、Ｃ１ｌを前投与 したラットは、その最も著しい効果がＣ１ｌの３μｇまたは３０μｇ投与群に見 られるように、投与量に依存してＡＡを著しく抑制した。ききには、３００ｕＨ においても抑制が見られた。３μｇまたは３０μｇを投与した動物においては、 関節長脚の発生率が減少し、また、最大関節炎評点により測定するさき、症状が 緩和された。さらに、３μｇのＣＩＩを投与した動物では、発病日も遅延された 。ＣＩＩの経口投与が実験的な自己免疫疾患に対する非選択的抑制効果をもつか どうかを測定するために、全（同一の投与範囲のＣＩＩを、ＣＦＡ中のミニリン 塩基性タンパク質で免疫化した動物に投与し、実験的な自己免疫疾患を社長（Ｅ ＡＥ）を誘発させた（Ｈｊ　１ｇｉ　ｎｓ、Ｐ、Ｊ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１ ４０，４４０（１９１ｆ１ｇ））。Ｃ１ｌを投与した後、ＥＡＥの発現には全く 効果がないことが観察された。

表１４ アジ１バント関節炎に対するコラーゲンＩ！の投与効果対照　４０７４０　１！ 、ＩｆＯ，！　９．１±１．Ｚ（バッファのみ） ＣＩｒ　０．３μｇ　１９／２０　１２．６±０．２　９．６±１．４ＣＩＩ　 ３μｇ　２６７９６＠　ＩＳ、１１．１”　５．１＋０．９０ＣＩＩ３０Ｊ１ｇ ３０／４０”１１．７ｆ０．４６．２ｆ０．７”ＣＩ　Ｉ　３００ａｚ　３９／ ４０　１１１土０．３　７．７±０．９ＣＩ　Ｉ　１ｍｇ　１！／２０　１２． ４±Ｏ，’ｌ　９．Ｏ±１．６ルイスラフトに、バッファ液（対照グループ）か 、もしくは種々な投与量のＣＩＩのいずれかを投与した。投与は、−７、−５、 および−２目跡に３回行った。

そして、ＯＢに、アジ１バント関節炎を誘発させるために、１ｍｇのＭＴを含む ＣＦＡを尾の基部に皮下注射した。関節炎は、１２日目跡ら３１日目跡で、２〜 ３日毎に評定した。ｐ−値は、対照グループ＜ｐｓｓ投与）に対するＣ１ｌ投与 グループを表す。ｎｓ−重大でない。

・ｐ＜０．００１対　対照 ｂｐ＜０．０５　対　対照 口ｐ＜０．０１　対　対照 実施例１８ プ　コ　−　ン Ｃ１ｌとＭＴとの双方に対する免疫性がＡＡに現れることが報告されている（Ｔ ｒｅｎ　ｔｈｈａｍ、Ｄ、Ｅ、、Ｊ、ＣＩ　Ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、６６．１１０ ９（１９８０））。ＤＴＨ（ｆｆｌム簾正圧）反応は、インビボにおいて、ＭＴ とＣＩＩとの双方に反応性のＴ細胞にＣＩＩを供給するときの効果を測定して行 った。図８Ａに示すように、ＣＡで免疫化された動物は、Ｃ１ｌに対してＤＴＨ を現すが、ただし、ＭＴに対するＤＴＨはど顕著ではない（図８Ｂ）。さらに、 ＣＩＩの経口投与は、ＡＡを保有する動物におけるＣＩＩに対するＤＴＨ反応を 減少させる一方、ＭＴに対するＤＴＨ反応には何ら効果がない。ＣＩＩによって ＤＴＨを抑制する投与量の応答範囲は、Ｃ１ｌによって疾患を抑制する場合と同 一である。即ち、最も顕著な抑＄１は、３μｇないし３０μｇでみられる。注目 すべきことに、引き続（免疫化を行わずに３μｇだけを投与した動物には、Ｃ１ ｌに対する感作性かまった（ない。次に、抗体を経口投与した後の、ＭＴに対す る細胞性免疫反応の抑制を試験した。図９に示すように、３μｇないし３０μｇ のＭＴを投与した動物において、ＭＴに対する増殖的な反応は抑えられている。

同様な抑制作用は、ＤＴＨｆｆｊｅ：による測定の際にも認められた。

実施例１８ １す立位立上±１　れたう１トか゛のＴ　の　によ　アジ１パント　゛ 既に述べたように、ミニリン塩基性タンパク質の経口投与に伴うＥＡＥの抑制は 、投与動物からの肺臓子細胞によって養子移入させることができる（Ｌｉｄｅｒ 、ｏ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４２．７４Ｂ−７５２（１９８９））ｏそして、 同様な結果は、自己免疫性ブドウ膜炎モデルにおいても得られている。表１５に 示すように、ＡＡに対する保護作用は、ＣＩＩに経口的に耐性化されたラットか ら得られた胛ＩＩＴ細胞によって、無感染ラットに養子移入された。−２日目に 肺臓細胞が移入されたとき、またＢ細胞に対して肺臓子細胞が移入されたとき、 保護作用はさらに顕著になった。

表１５ アジュバント関節炎に対する非軟骨質コラーゲンの投与効果−一皿処里一一−− 鼠り久良−−良底旦一　ｌ太皿鳳衰圧轟対照　２０／２Ｇ　ｔｚ、ａ±０．７　 ９．７±１．９（バブ７アのみ） ＣＩ　３　ＩＩ　ｆ　９／１６ａ　１６．ｉ３．６　５．２＋２．５ｂＣＩ　３ ０μｇ　１Ｂ／２０　１４．０±１．５　４．２±０．６ＣＣＩ［Ｉ　３ｕｔ　 １Ｂ／２０　１４．４＋０．５ｂ　７．２＋２．０Ｃ１ｌｌ　３０μｇ　１Ｂ／ ２０　１４．５±０．６ｂ　６．３±０．フルイスラアトに、種々な投与量のＣ ＩまたはＣＩＩ［を投与した。投与は、−７、−５、および−２日目に３回行っ た（対照動物はバ１ファのみを投与）。ｐ−値は対照グループに対する投与グル ープを表す。ｎｓ−重大でない。

・ｐ＜０．０１　対　対照 ｂｐ＜０．０４　対　対照 口ｐ＜０．００１対　対照 実施例１９ の　の　に　の ＣＩＩの投与が、すでに発現したＡＡを改善し得るかどうかを測定するために、 動物に、発病後にＣ１ｌを投与した。ＣＦＡで疾患を誘発した後、１３〜１４日 目に、目跡炎の初兆が現れた。１７日目に動物を、疾患の重篤度を揃えて２グル ープに分けた。対照グループを無処置のまま残し、一方、処置グループには、１ 日おきに週３回、３μｇのＣＨＩを経口投与した。両グループの動物について、 ３４日目まで関節炎の評定を行った。図１０に示すように、ＣＩＩで処置された 動物は関節炎が緩和され、対照グループより速やかに快復した。

実施例２０ −　コ　−　ンの ＣＩＩの分子構造が、他のコラーゲン、例えばタイプＩ（ＣＩ）やタイプｌ１１ （Ｃ１ｌｌ）コラーゲンにきわめて近似しているとはいえ、これらのコラーゲン 類の分布は全く翼なっている（Ｓｅｙｅｒ、Ｊ、Ｍ、、ほか、［ｎ：ＴｅｘｔＢ ｏｏｋ　ｏｆ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｒｏｇｙ、第３版、（Ｋｅｌｆｙ、ほか。

ＩＩ）、第２２頁、サウンダース、フィラデルフィア（１９８９））。ＣＩＩは 通常、関節の軟骨部に存在するのに対して、タイプ！およびタイプＩＩＩコラー ゲンは主として骨、皮膚、および他の軟組織中に見いだされる。表１６に示すよ うに、Ｃｔの経口投与は、関節長脚の発生率および症状の重篤度によって測定す る七き、ＣＩ１と同じ投与範囲でＡＡを抑制することがわかった。ＣＩＩＩを投 与した動物については、発病日の遅延は認められたが、症状の重篤度に関しては 何等の効果も認められなかった。無関係なタンパク質抗体、ミニリン塩基性タン パク質の経口投与は、ＡＡを抑制しなかった。

表１５ 経口的にＣｌｌ耐性化されたラットからの肺細胞の養子移入によるアジュバント ｌ１ａＷ１炎の抑制 ｍ　毘入皿ｎ　蔓入旦　農腹久脛　Ｌ太及里旦　楓脆叉匠点実験１ １　通常　肺臓細胞　０　２Ｇ／２０　１３．Ｓ±０．２　１１．２±１．ｓ２ 　ＣＩ！投与　肺臓細胞　０１フ／２０　１４．０±０　６．６±０．９・３　 通常　肺臓細胞　−２２０７２０１３，８±０．２　９．２±１，６４　Ｃ１ｌ 投与　肺臓細胞　−２８／２０ｂ　１５．２±０．７”　２．８±０．５０実験 Ｉ１ １　通常　肺臓細胞　−２２０７２０１３，８±０．２　９．０±２０２　Ｃ１ ｌ投与　肺臓１細胞　−２２０／２０　１３．８±０．２　ａ、ａ±１．１３　 ＣＩＩ投与　肺臓子細胞　−２１８７２０１４，０±０．５　４．０±０４５ｄ 提供体ルイスラフトは、無投与、または３μｇのＣＩＩを２〜３日間隔で３回、 前投与した。最終投与後７日目に肺臓を取り出し、Ｉ　Ｘ　ｉ　０８の肺臓細胞 またはナイロンウール分離のＢ細胞（付着性）またはＴ細胞（非付着性）を、１ ．　ｐ。

注射によって、直ちに、または養子移入の２日後にＡＡ誘発された各受容体に移 入した。

・ｐ＜０．０５．　２グループ　対　ｌグループｂｐ＜ｏ、ｏｏｉ、４グループ 　対　３グループｏｐ＜ｏ、ｏｔ　、４グループ　対　３グループｄｐ＜０．０ ５　、　３グループ　対　１グル一プリンパ球の増殖および上記のＤＴＨ実験は 、ＭＴの経口投与が、臨床的な疾患を阻止せずに、ＭＴに対する細胞性免疫反応 を抑制したことを示した。それにもかかわらず、ＭＴに対する細胞性免疫性は、 経口耐性によって根底から抑制されることはなく、ＭＴ免疫性をより効果的に抑 制するような食餌療法が疾患を抑制すると思われる。この観点からは、ＡＡの抑 制に対する油脂中６５ｋｄ　Ｈ９Ｐの投与による効果（Ｂ１１１ｉｎｇｈａｍ、 Ｍ、Ｅ、Ｊ、、ほか、Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、１７１，３３９　（１９９０））、またはＭＴの皮下または静脈内投与 による効果（Ｌａｒｓｓｏｎ、Ｐ、、ほか、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｌｏｃｈｅｍｌｓ ｔｒｙ、４０，４９　（１９８９）；Ｇｅｒｙ、１．、ほか、Ｉａｔ、Ａｒｃｈ 、Ａｌｌｅｒｇｙ、３１，５７　（１９６７））、が報告されている。

ＣＩＩの経口投与によるＡＡの抑制は、ＣＩＩに対する病理学的な免疫性がＡＡ 中に現れるか、またはＭＴとＣ１ｌとの間に交差反応エピトープがあるか、いず れかであることを示唆している。注目すべきことに、（ＩＩＴＩＩ胞系統がＴ細 胞接種によりてＡＡの改善に少し効果があり（Ｈｏｌｏｓｈｉ　ｔｚ、Ｊ、、ほ か。

５ｃｉｅｎｃｅ、２１９．５６　（１９８３））、また６５にｄ　Ｈ３Ｐによっ てＣＩＡの僅かな抑制が認められた（Ｂ１１１ｊｎｇｈａｍ、Ｍ、Ｅ、Ｊ、、ほ か。

Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１７１．３３９　（１９９０））ことが報告されている。

ある研究者は、Ｃ１ｌの静脈内投与によるＡＡの抑制を報告している（Ｐｈａｄ ｋｅ、に、、　ほか、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、２７．７９７　（１９ ８４）とはいえ、これは常にみられるものではない（Ｃｒｅｍｅｒ、Ｍ、＾、、 ほか。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３１：２９９５　（１９８３））、本発明者らの研究は 、他の研究者がＣＩＩの１．ｖ、投与によるＡＡの抑制効果を明示することがで きなかった（Ｃｒｅｍｅｒ、Ｍ、Ａ、、ほか、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３１．２ ９９５（１９８３））わけは、あまりに大量の投与量、即ち、１ｍｇ、を用いた ことと関係しているであろうことを示唆している。予備的な実験において、ＭＴ とＣＩＩとの間のある櫂の交差反応性が増殖試験によって見いだされているとは いえ、Ｃ１ｌの経口投与によるＡＡの抑制作用がＭＴとＣＨＩとの間の交差反応 に係わっているかどうかはまだ１ｉ［認されていない。チキンタイプＩＩコラー ゲンとＭＴの６５ｋｄ熱衝撃タンパク質のペプチド１８０−１８８との間のアミ ノ酸記列の相同性は見いだされていない。この相同性は、ラットにおける関節炎 を仲介するクローンを／ミニレートするものと報告されているＣＶｔｒｎ　Ｅｄ ｅｎ、Ｗ。

、ほか、Ｎａｔｕｒｅ、３３１．１７１　（１９８８））ａ最近、Ｃ１ｌからの ２６−アミノ酸配列がフラーゲン誘発関節炎を抑制すると報告された（Ｍｙｅｒ ｓ。

Ｌ、　Ｋ、　、ほか、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１７０．１９９９　（１９８９）） ｏしかし、このペプチドと６６ｋｄペプチドとの間には相同配列は存在しない。

ＭＴとＣ１ｌとの双方の大きさに対応して、容易には同定できない交差反応エピ トープが存在することは確かであろう。あるいはまた、ＭＴが、Ｃ１ｌに対する 病理学的免疫応答に導く連鎖欠損を誘発するのかもしれない。

抗体の経口投与の後で実際の抑制効果が発現すること（Ｎｇａｎ、Ｊ、、ほか。

Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、１２０，８６１（１９７１）；ＭａｔｔＪｎｇｌｙ、Ｊ。

Ａ１．ほか、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２５．１０４４　（１９８０）；Ｍａｔｔ 　１ｎｇｌｙ、Ｊ、Ａ、、Ｃｅｌ　１．Ｉｍｒｎｕｎｏｌ、８６．４６　（１９ ８４）；Ｚｈａｎｇ、Ｚ、、ほか、Ｃｅ１１．ｒｍｍｕｎｏｌ、１０４．４２６ 　（１９８７））、および経口的に耐性化された動物からのＣＤＢ中Ｔ細胞の養 子移入によってＥＡＥが抑制できること（Ｌｌｄｅｒ、Ｏ，、ほか、Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、１４２．７４８−７５２　（１９８９）’）は、すでに報告されてい る。

実施例２１ の 治療に用いた薬剤は、マサチュセッッ州ボストンのバイオピュア社製のウシ・ミ ニリン工牛ストりクトである。ウシ・ミニリンは動物に投与するとき無毒性であ り、慢性再発性ＥＡＥの改善に有効である。バイオ１１７社のウシ・ミニリンは 、７１糖傾斜上でシャープレス遠心分離器による密度遠心分離を経て調製され、 ＳＤＳベージ１ｌｆｉ泳動によつて分析されたものである。このミニリンは、マ サチ講セメツ州の地区屠殺場から得たウシ脳から抽出したもので、純度が試験さ れ、また、調製単位毎に、寒天ゲル電気泳動、タンパク質測定、脂質分析、アミ ノ酸測定、および免疫学的反応性について標準化されている。これはまた、細菌 およびウィルスの存在についても試験されている。

このミニリンは、１１００ｆｆ１カプセルとして、多発性脳硬化症の患者に、１ 日３回、総投与量が６００ｍｇ／日となるように投与する。

実施ｆ４２２ ゛の 治療に用いたタイプ！１コラーゲンは、マサチ１セブッ州ボストンのジェンザイ ムコーボレーシ１ンから得られたＣ１ｌ製剤（可溶性チキンタイプＩＩコラーゲ ン）である。この製剤はアジコパント関節炎の改善に有効である。

このＣ１ｌは、自己免疫性関節炎の患者に、１日１０μｇないしＩＱＯｍｇの投 与量で経口投与する。Ｃ１ｌは乾燥形Ｏでまたは液体に溶かして（そして増量し て）、患者が耐性を獲得し得る量が投与される。好ましい実施例では、１日あた り１００μｇから３０ｍｇまでの総投与量が投与される。この投与量は、１日あ たりの総投与量を患者に与えることができるように数回に分けて投与してもよい 。好ましい実施例では、１日あたりの投与回数は３回である。

ここに引用した全ての文献は、参考までに掲げたにすぎない。ここに述べた本発 明は、広くかつ同等な条件、パラメータその他の範囲内で、本発明ｔたはその実 施例の発想または観点を損なうことな〈実施し得るものと理解・されるべきであ る。

φ　対照 ◆投与臼−７，−５，−２ ０ｌ与日−７，−５，−２，＋７．　＋１４図２ 対照　投与 図４ 日数（最終投与後のＬＮＣの取り出し）図６ 図６ 図７ Ａ　。“″に”ｔ６ＤＴＨ Ｂ　ＭＴに対するＤＴＨ 図８ −　八　ＣＰＵ 図９ 図１０ 要約 本発明は、自己抗原、自己抗原の断片、または特別なり己免疫性疾患に特異的な 自己抗原に構造的樟関連した＊似体を、経口投与することによる、ヒトを含む動 物におけるＴ細胞仲介自己免疫性疾患の治療方法に関する。本発明の方法は、予 防的及び治療的手法を含んでいる。

国際調査報告 １＋ｔｌ＊＋ｓｅｍ＠ｍ　Ａｓｍ。ゎａ１ｍ＋＋Ｔ１ｓ、ＰＣＴ／ＵＳ９１１０ ７５＆２Ｔ、Ｔｈａｔ　５ｐｅｃｉｅＩｌｃｏ＋ｎｐｒ１ｓｉｏｎｇ　Ｅｘｐｅ ｒｉｍｅｎｔａｌ＾ｕｔｏｉｍｓｅｕｎｅＥｎｃａｐｈａｌｏｎ＋ｙｅｌｉｔｉ ｓ　ｆＥＡＦｌ　＋ｃｌＩＩｉ＊　２１ＢＩＩＴ、Ｔｈｌ１＋ｔ、　５ｐｅｃｉ ｆｅｓ　ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ　ＡｕＬｏｉ＋＋ｌ＋＋＋ｕｎｅ＾ｒｔｈｒｉｔ ｉｓ　ｆｃｌａｉ＋ａ吹@４−１２ ａｎｄ　１５−］、６Ｌ Ｈｎｏ　ａｄｄｉｔｉｏｎａ）　ｆｅｅ　ｉｓ　ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ｇｅｎｅｒ ｉｃ　ｅｌａｊｍｓ　１．　］３−Ｎ　ａｎｄ１フー１８　ｗｘｌｌ　ｂｅ　５ ｅａｒｃｈｅｄ　ｗ）ｔｈ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　５ｐｅｃｉｅｓ。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．そのような治療を必要としている患者における、Ｔ細胞仲介またはＴ細胞依 存性の自己免疫性疾患の治療方法であって、その方法が、自己抗原、その自己抗 原の生物学的に活性な断片、またはその自己抗原に構造的に関連している類似体 を、前記患者に投与することからなり、その投与は、前記疾患の治療に効果的な 量でなされ、その治療が、前記疾患が前記患者に発現した後に行われることを特 徴とする方法。
2. ２．前記自己免疫性疾患がＥＡＥである、請求項１記載の方法。
3. ３．前記自己免疫性疾患が多発性脳硬化症である、請求項１記載の方法。
4. ４．前記自己免疫性疾患が自己免疫性関節炎である、請求項１記載の方法。
5. ５．前記自己免疫性疾患がリューマチ性関節炎である、請求項１記載の方法。
6. ６．前記自己抗原がタイプＩＩコラーゲンである、請求項１記載の方法。
7. ７．前記関節炎を治療するのに効果的な量が、１日に約１０μｇから１００ｍｇ である、請求項１記載の方法。
8. ８．前記関節炎治療するのに効果的な量が、１日に約１００μｇから３０ｍｇで ある、請求項１記載の方法。
9. ９．そのような治療を必要としている患者における、Ｔ細胞仲介またはＴ細胞依 存性の自己免疫性関節炎の治療方法であって、その方法が、自己抗原、その自己 抗原の生物学的に活性な断片、またはその自己抗原に構造的に関連している類似 体を、前記患者に投与することからなり、その投与は、前記疾患の治療に効果的 な量でなされ、その治療が、前記関節炎が前記患者に発現する前に行われること を特徴とする方法。
10. １０．前記自己免疫性関節炎がリューマチ性関節炎である、請求項９記載の方法 。
11. １１．前記自己免疫性関節炎が助剤関節炎である、請求項９記載の方法。
12. １２．前記自己抗原がタイプＩＩコラーゲンである、請求項９記載の方法。
13. １３．前記患者が、ほ乳類である、請求項９記載の方法。
14. １４．前記ほ乳類が、ヒトである、請求項１３記載の方法。
15. １５．前記関節炎を治療するのに効果的な量が、１日に約１０μｇから１００ｍ ｇである、請求項１３記載の方法。
16. １６．前記関節炎を治療するのに効果的な量が、１日に約１００μｇから３０ｍ ｇである、請求項１３記載の方法。
17. １７．前記自己抗原が、患者に経口的に投与きれる、請求項１または９記載の方 法。
18. １８．前記自己抗原が、患者に経腸的に投与される、請求項１または９記載の方 法。