HUT69942A - Treatment of autoimmun diseases by oral administration of autoantigenes - Google Patents

Description

A találmány a 07/460.852 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli találmány folytatása, melyet 1990. február 21-én jegyeztek be, ami a PCT/US88/02139 sorozatszámú találmány folytatása, melyet 1988. június 24-én jegyeztek be, ami a 065.734 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli találmány folytatása, melyet 1987. június 24-én jegyeztek be, amiket itt teljes egészükben referenciaként említünk meg.

A jelen találmány tárgya autoimmun betegségek kezelése, elsősorban a T-sejt által közvetített, vagy T-sejt-függő autoimmun betegségeké. A jelen találmány az ilyen autoimmun betegségek profilaktikus és terápiás kezelése céljából autoantigénekkel vagy ezek fragmentumaival illetve analógjaival történő kezelést alkalmaz.

I. Az autoimmun betegségek általános ismertetése

Az autoimmun betegségeket az abnormális immunválaszok okozzák, így például a normál szövetek ellen irányuló sejtek vagy antitestek. Számos eljárást fejlesztettek ki az autoimmun betegségek elnyomására, ezek közül legjelentősebbek az immunválaszt nem-specifikusan okozó drogok voltak. Az immunológiai tolerancia indukálásának eljárását az autoimmun válaszokat elnyomó antigénekkel történő orális kezeléssel először Wells ismertette 1911-ben. Wells, H., J. Infect. Dis. 9:147(1911). A nehézkes reagálás t

s orális indukálását számos a T-sejttől nem függő antitestre mutatták már be. Ngan, J. és társai, J. Immunoi. 120:861 (1978), Gautam, S. és társai, J. Immunoi. 135:2975 (1985), Titus, R. és társai, Int. Arch. Allergy Appl. Immun. 65:323 (1981). Az antigének által irányított perifériális immuntoleranciát orális úton, ami számos kísérleti autoimmun betegség esetén hatásos immunregulátor terápiás lehetőség, már többen ismertették (Higgins, P. J. és társai, J. Immunoi. 140:440 (1988); Lider, 0. és társai, J. Immunoi. 142:748-752 (1989); Nussenblatt, R. B. és társai, J. Immunoi. 144:1689 (1990); Nagler-Anderson, C. és társai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7443-7446 (1986); Thompson, H. S. G. és társai, Clin. Exp. Immunoi. 64:581-586 (1986)).

II. A kísérleti allergiás enkefalomielitisz

A kutatók már számos állati modellen tanulmányozták az autoimmun betegségek elnyomásának lehetőségeit. A kísérleti allergiás enkefalomielitisz (EAE) egy a T-sejt által közvetített autoimmun betegség, mely a mielin alapú fehérje (MBP) ellen irányul, és amit számos állatfajnál mint a többszörös szklerózis modelljét tanulmányoztak. Lásd Alvord, E. és társai, Experimental Allergic Encephalomyelitis - - A Useful Model Fór Multiple Sclerosis (Allan R. Liss, New York, 1984). Megmutatták, hogy az EAE-ből meggyógyult patkányokban a Ts jelen van. Swierkosz, J. és társai, J. Immunoi. 119:1501 (1977). Továbbá bemutatták, hogy a T-sejt • · « · r y .· ···. ·· ···· ··· ·· szupresszor felelős az EAE-re mutatott válaszadás elmaradásra, ami egyes egértörzseknél megfigyelhető meg. Lando, Z. és társai, Natúré 287:551 (1980).

Számos eljárást alkalmaztak az EAE antigén-specifikus szupressziójának indukálására. így például a nem-teljes Freund-féle adjuvánsban emulzifikált MBP-vel történő immunizációt, amit Lando, Z. és társai, Natúré 126:1526 (1981) mutattak be, és az MBP-hez kapcsolt limfoid sejtek intravénás injekcióját, amit Sriram, S. és társai, Cell Immunoi. 75:378 (1983) mutattak be.

Alvord és társai három cikket írtak az alábbi folyóiratban: Annals of Neurology, Vol. 6, pp 461-468, 468473, és 474-482 (1979). Ezek közül az elsőben és a másodikban az EAE majmokban történő elnyomását mutatták be MBP-vel történő parenterális kezelés útján, nem-specifikus adjunktív faktor, azaz egy antibiotikum vagy egy szteroid alkalmazásával. A harmadik beszámoló a cerebrospinális folyadék jelenlétét mutatja be számos, az MBP-t antigenikusan aktív fehérjévé lebontó proteáz által okozott többszörös szklerózisban szenvedő betegeknél.

Traugott és társai, J. Neurological Science 56:65-73 (1982), valamint Raine és társai, Láb. Investigation 48:275-284 (1983) azt ismertették, hogy a krónikus visszaeső EAE-ben szenvedő tengerimalacok egyik törzse MBP-vel önmagában vagy nem-teljes Freund-féle adjuvánsal (IFA) , illetve a mielin lipid hapténjával - nevezetesen galaktocerebroziddal - készült elegyével történő parenterális kezelése elnyomta az EAE klinikai tüneteit.

• · ·

McKenna és társai, Cell Immun. 81:391-402 (1983), azt ismertették, hogy patkányok előinjekciózása szingenikus lép leukocitákhoz kapcsolt, vagy szingenikus vörösvértestekhez kapcsolt tengerimalac MBP-vel elnyomta a teljes Freund-féle adjuvánsban levő tengerimalac MBP-t alkalmazó EAE következő indukcióját. Az elnyomás mértéke megfelelt az alkalmazott MBP mennyiségének.

Strejan és társai, Cell Immun. 84:171-184 (1984) beszámolójukban azt ismertették, hogy a patkányok foszfaditil-szerinbe kapszulázott MBP-vel történő előinjekciózása elnyomta az EAE klinikai tüneteit, ami a teljes Freund-féle adjuvánsban levő tengerimalac MBP-vel injekciózott patkányoknál jelentkezett.

McKenna és társai, Cell Immun. 88:251-259 (1984), egy másik beszámolójukban azt ismertették, hogy a szintetikus C kopolimer I, amit mint a többszörös szklerózis kezelése során alkalmazott anyagot vizsgáltak - mivel az védettséget ad az EAE-vei szemben - MBP-vel nem mutat immunológiai keresztreakciót.

Belik és társai, Vopr. Med. Khim. 24:327-377 (1987) EAE-ben szenvedő tengerimalacok alkalikus mielin fehérje fragmentummal és szintetikus enkefalitogenikus peptiddel történő parenterális kezelését ismertették. Az alkalikus mielin fehérje fragmentummal történő kezelés után az állatok felépültek, szemben a borjú alkalikus mielin fehérje fragmentummal vagy szintetikus enkefalitogenikus peptiddel érzékennyé tett állatokkal.

Az EAE és az EAU korábbi vizsgálatai szerint az MBP • · • · ·· ♦ · ·« ·· • ·· · · · ·· rí ·········· • · · · · ······· ·· ·· vagy az S-Ag dózisainak növelése jobb védettséget adott a betegség során (Higgins, P. J. és társai, J. Immunoi. 140:440 (1988); Nussenblatt, R. B. és társai, J. Immunoi. 144:1689 (1990)), és általában más felfedezők is nagyobb mennyiségű antigén adagolása esetén az orális tolerancia fokozódásáról számoltak be (Mowat, A. M., Immunoi. Today 8:93 (1987)).

Egy beszámoló az EAE elnyomását mutatja be az orálisan toleralizált állatokból származó CD8⁺ T-sejtek adaptív transzferje által (Lider, 0. és társai, J. Immunoi. 142:748-752 (1989)).

Ugyanakkor a szakmai körökben nem ismeretes, hogy az EAE sikeresen kezelhető azután, hogy a beteg állatokban kifejeződött. A szakmai körökben az sem elterjedt, hogy a többszörös szklerózis a betegben történő kifejeződés után is kezelhető. így szükség van a multiple szklerózis elnyomására és kezelésére alkalmas eljárás kialakítására.

III. Az adjuváns artritisz

Az adjuváns artritisz (AA) a gyulladásos ízület betegségének (inflammatory joint disease), elsősorban a reumatoid artitisznek a kísérleti modellje. Az adjuváns artritiszt a Mycobacterium tubercolosis (MT) olajos szuszpenziójának intradermális injekciója indukálja (Pearson, C. M., J. Chronic Dis. 16:863-874 (1963)). Az injekciózást követő 5-10. napon az állatokban súlyos

F » ··· progresszív artritisz alakul ki.

A humán reumatoid artritisz klinikai és hisztopatológiai jellemvonásai összehasonlítása alapján (Jasin, Η. E., Federation Proc. 32:147 (1972) az AA-t az immunrendszer által közvetített izületi betegség mechanizmusának és a szerv-specifikus autoimmun betegség kezelésére alkalmazott eljárás értékelésére alkalmazzák.

Az adjuváns artritisz egy sejt-által közvetített autoimmun betegség, mely sejt populációk által, vagy az MTre specifikus T-sejt kiónok által vihető át (Taurog, J. D. és társai, Cell Immunoi. 75:271 (1983); Cohen, L. R. és társai, Cell Immunoi. 80:198 (1983); Cohen, L. R. és társai, Arthritis and Rhem. 28:841 (1985)). A tanulmányok szerint az adjuváns artritiszben az elsődleges antigén egy 65 kd méretű mikobakteriális eredetű hősokk fehérje (mycobacterial heat shock protein; HSP) (van Edén, W. és társai, Natúré 331:171 (1988). Ez a fehérje a sztreptokokkuszos sejtfal artritiszben is fontosnak tűnik (DeJoy, S. Q. és társai, J. Exp. Med. 170:369 (1989); van den Broek, M. és társai, J. Exp. Med. 170:449 (1989)). Az I. típusú kollagénnel szemben mutatott immunitás a tanulmányok szerint az adjuváns artritiszben is előfordul (Trentham, D. E. és társai, J. Clin. Invest. 66:1109 (1980)).

A kollagén orális és intravénás adagolását követő toleranciát az artritisz egy másik típusa - melyet kollagén által indukált artritisznek (CIA) nevezünk - elnyomja. A II. típusú kollagénnel kezelt DBA egerekben a CIA elnyomása dózis-függő, 0.5 mg mennyiségű, kéthetes periódusban • · • ·· « ·· ·· ·

I ♦··♦·*··♦··· • · · · · · ··«···· ·· ·« «« nyolcszor történő kezelés esetén az elnyomás megfigyelhető, de 3 mg esetén nem (Nagler-Anderson, C. és társai, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 83:7443-7446 (1986)). Hasonló eredményeket kaptak a CIA-val kapcsolatban patkányok esetén is, 2.5 Mg/g és 25 μg/g alkalmazása mellett (Thompson, H. S.

G. és társai, Clin. Exp. Immunoi. 64:581-586 (1986)). Az

i.v. tolerancia kifejezés esetében 1 mg-ot adtak a CIA-nak a DBA egerekben történő elnyomására (Myers, L. K. és társai, J. Exp. Med. 170:1999 (1989)).

A CIA artritisz védettség adoptív transzportjáról számoltak be ClI-vel intravénásán kezelt állatok esetében (Myers, L. K. és társai, J. Immunoi. 143:3976 (1989))., de az orális tolerancia kialakítása nem sikerült (NaglerAnderson, C. és társai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:74437446 (1986); Thompson, H. S. G. és társai, Clin. Exp. Immunoi. 64:581-586 (1986)).

Eddig nem volt ismeretes, hogy a CII orális kezelése elnyomja az AA-t - a humán reumatoid artritisz állatokon létrehozott modelljét, és az, hogy ez az elnyomás a ClI-vel táplált állatokból származó lép T-sejtek által adotívan átvihető.

így merült fel az autoimmun betegségek, elsősorban a T-sejt által közvetített vagy a T-sejttől függő autoimmun betegségek kezelésének igénye.

·····«·<···« • · « · · · ··♦···· ·· ·«

A TALÁLMÁNY ÖSSZEFOGLALÁSA

A jelen találmány a T-sejt által közvetített vagy a Tsejttől függő autoimmun betegségek kezelésére nyújt eljárást olyan esetekben, amikor a kezelés szükségessé válik, így autoantigének, autoantigén fragmentumok, vagy az adott autoimmun betegségre nézve specifikus autoantigénekkel szerkezetileg rokon fragmentumok orális adagolása esetén, az autoimmun betegség hatásos kezeléséhez szükséges mennyiség alkalmazása esetén.

Az ilyen autoimmun betegségek klinikai és hisztológiai hatásait a találmány szerinti eljárás dózis-függő módon nyomja el. A szupresszió továbbá akkor tapasztalható, amikor az autoantigén adagolása az autoimmun betegség előtt, vagy utána történik.

A találmány szerinti eljárás során a T-sejt függő autoimmun betegségeket az antigén betegséget nem indukáló, vagy azt indukáló fragmentumainak orális adagolása elnyomja, így az antigének orális adagolása hatásos, egyszerű eljárás, mely által az autoimmun betegség természetes immunszabályozása oldódik meg.

A találmány továbbá eljárást nyújt az EAE és a szklerózis multiple kezelésére és elnyomására, mely eljárás során a mielin alapú fehérjék speciális fragmentumainak enterális adagolása történik.

A találmány továbbá az adjuváns artritisz és a reumatoid artritisz kezelésének és elnyomásának eljárását • · · 4 4 · ν · · • ö · 4 ·«· ««* ·« • · ♦ · · · ····««· · · ·· ·« biztosítja, melynek során a II. típusú kollagén (CII) enterális adagolása az autoimmun betegség előtt vagy után történik.

AZ ÁBRÁK RÖVID ISMERTETÉSE

1. ábra:

A proliferatív válasz orálisan indukált szupressziójára nézve specifikus antigén Lewis patkányokban. Az állatokat a -7., a -5., és a -2. napon 100 pg MBP CFA-ban készült oldatával immunizálták. Az immunizálás után kilenc nappal a nyirokcsomókat eltávolítotuk, és a 3. példa eljárásának alkalmazásával megmértük a MBP-re, a BSA-ra, és a PPD-re (mindegyik 50 pg/ml) adott proliferatív választ.

2. ábra:

Az adjuváns artritisz orálisan indukált elnyomása, joint swelling eljárással mérve.

3. ábra:

Eljárás a patkány EAE csökkenés indukálására.

4. ábra:

A nyiroksejt burjánzás orálisan indukált szupressziójának elnyomása SJL egerekben. Az állatokat 400 pg MBP-vel etettük két héten keresztül hét alkalommal, és 400 pg MBP CFA-ban készült oldatával (0.6 mg/ml M. tubercolosis). A stimulációs • e • ·· ♦ *· ·· · ·····*·····» * · · · a · ···»·· a * «4 index az MBP-vel indukált burjánzás mértéke elosztva a háttérrel.

5. ábra:

A popliteális nyirokcsomó sejtek (PLNC) válaszának antigénspecifikus szupressziója mielin alapú fehérjével (MBP) táplált patkányokból kapott lép-, és bélfodor-nyirokcsomó sejtek (LNC) által. Az eredményeket mint a PLNC szupresszió %-át mutatjuk be MBP-re (körök) és Mycobacterium tubercolosisra (négyszögek) nézve. A zárt körök és a zárt négyszögek a lépsejtek válaszát szemléltetik. A nyitott körök és a nyitott négyszögek a bélfodor-nyirokcsomó sejtek válaszát szemléltetik.

6. ábra:

IgG MBP-re adott válaszainak specifikus szupressziója MBP orális alkalmazása után. A patkányokat intervallumokban véreztettük, és a szérumot anti-OVA (6.A ábra, nyitott négyszögek) antitestekre, vagy anti-MBP (6.B ábra, nyitott négyszögek) antitestekre nézve vizsgáltuk. Ezt a szérumot összehasonlítottuk a nem-táplált állatokból kapott szérummal (zárt jelek). Az eredményeket az ELISA 0.D.492 +- S.D. alapján fejeztük ki.

7. ábra:

A -7., a -5., és a -2. napon MT-vel (A) vagy ClI-vel (B) táplált Lewis patkányok. Az állatokat ezután az AA indukció céljából intradermálisan 10 mg/ml MT-t tartalmazó CFA-val ··(· · • · * ··«·«» • ·«·· V··· · « I ·*♦··»1 «·>·«* 4« ·«·4 injekcióztuk a 0. napon a farkuk tövében. A 13. nap kezdetén megvizsgáltuk az állatokban az AA klinikai jeleit, és egyénileg megjelöltük őket; az artrititsz jel az egyes csoportokból származó 5-10 patkány esetében az egyes időpontopkban kapott átlagos artrititsz jel.

8. ábra:

Csak pufferrel (kontroll), vagy a jelölt különböző dózisú ClI-vel táplált Lewis patkányok a -7., a -5., és a -2. napon. Az állatokat 10 mg/ml MT-t tartalmazó CFA-val intradermálisan injekcióztuk a farkuk tövében. Egy hónappal később az állatokat 20 μg ClI-vel (A) vagy 10 μg MT-vel (B) kezeltük. Az injekciózás előtt, és 48 órával utána megmértük a fül vastagságát. A kezelt állatokat a kontroll állatokkal összehasonlítottuk, ns = nem szignifikáns.

9. ábra:

A Lewis patkányokat a -7., a -5., és a -2. napon különböző dózisú MT-vel tápláltuk, és a 0. napon a farkuk tövénél 0.1 ml CFA injekciót adtunk be. A nyirokcsomókat (draining lymph nodes) kilenc nappal később összegyűjtöttük, és a proliferatív választ megmértük.

10. ábra:

Lewis patkányokat 10 mg/ml MT-t tartalmazó CFA intradermális injekciójával artritiszre indukáltunk. Az artritisz kezdeti jeleit a betegség indukálása után 13-14 nappal észleltük. A 17. napon az állatokat a betegség súlyossága sszerint két • · csoportra osztottuk. A kontroll csoportot nem kezeltük, míg a másik csoport orálisan 3 μς ClI-t kapott hetente háromszor, kétnapos intervallumokban. Az egyes csoportokban az állatokat az artritiszre nézve megjelöltük a 34. napig. Az eredményeket mint fő artritisz jel +- standard hiba fejeztük ki.

A TALÁLMÁNY ELŐNYÖS KIVITELEZÉSE

Definíciók

A leírás során számos az immunológiában gyakran alkalmazott kifejezést használtunk. A leírás és az igénypontok pontos érthetősége céljából ismertetjük az alábbi definíciókat.

Autoimmun betegség. Az autoimmun betegség az állat beleértve a humán egyedeket is - immunrendszerének hibás működése, amikor az immunrendszer nem tud különbséget tenni az állatban levő idegen anyagok és az állatot normálisan alkotó anyagok között.

Autoantigén. Az autoantigén olyan anyag, mely normálisan megtalálható az állatban abnormális helyzetben, például autoimmun betegség esetén, az állat limfocitáin vagy antitestjein keresztül magának az állatnak a részét alkotja, és így mint idegen anyag az immunregulátor rendszeren keresztül támad.

Biológiailag aktív fragmentum. A biológiailag aktív • · • 4·· 4 · 4 · 4 · ·· * ··«··· 4444··· *· 4 · ·· fragmentum(ok) kifejezés egy autoantigénre vonatkozik, beleértve az autoantigén részleges aminosav szekvenciáját, mely mint teljes hosszúságú autoantigén, azonos biológiai válasz indukálására képes, azaz képes elnyomni vagy kizárni a T-sejt által közvetített vagy a T-sejttől függő autoimmun választ az orális bevitel esetén.

Analóg. Egy autoantigén analógja kifejezésen olyan vegyületeket értünk, melyek az autoantigénnel szerkezetileg rokonok, és így az autoantigénnel azonos biológiai aktivitással rendelkeznek, azaz képesek elnyomni vagy kizárni a T-sejt által közvetített vagy a T-sejttől függő autoimmun választ az orális bevitel esetén. A kifejezésbe azok az aminosav szekvenciák is beletartoznak, melyek az autoantigén aminosav szekvenciájától egy vagy több aminosavban eltérnek (miközben az autoantigénnel alapvetően azonos biológiai aktivitásukat megtartják), éppúgy mint azok a kémiai vegyületek, melyek azon tulajdonságukban, hogy a betegség tüneteit elnyomják, vagy azt enyhítő képességükkel az autoantigének biológiai aktivitását utánozzák. Ezek a vegyületek a célszerv szövetei lehetnek, mely az autoimmun betegség esetén a támadás helye.

Állat. Az állat kifejezés minden immunregulátor rendszerrel rendelkező életformát átfog, így az autoimmun betegségekre hajlama lehet, a kifejezésbe a humán alanyokat is beleértjük.

Kezelés. A kezelés kifejezésen az említett autoimmun betegségek megakadályozásának profilaktikus mérését, illetve az említett autoimmun betegségek után a tünetek elnyomását vagy vagy enyhítését értjük.

Adagolás. Az antigén bevitele vagy adagolása kifejezés lényege, hogy az ilyen autoantigénnel való kezelés igénye esetén az autoantigént vagy annak biológiailag aktív fragmentumát illetve biológiailag aktív analógjait biztosítjuk olyan módon, hogy az autoantigén terápiásán hatásos mennyiségét tartjuk annyi ideig, ameddig a kívánt hatást elérjük. Előnyös esetben az autoantigént szájon át visszük be a beteg gyomortraktusába. Ugyanakkor az orális alkalmazás esetén a feltalálók nem korlátozták a kezelést a szájon át történő adagolásra, így az autoantigén adagolása a beteg gyomrába vagy emésztőrendszerébe is történhet.

II. típusú kollagén. A II. típusú kollagén (CII) az a kollagén típus, mely többek között a porcban, az intervertebrális (csigolyaközi) porckorongban, és az üvegtestben található meg. A II. típusú kollagén három al(II) láncot ((01(11))3) tartalmaz.

A szakmai körökben jól ismert tény, hogy a kollagén a szálas fehérjék közé tartozik, melyet számos szerkezetileg és genetikailag eltérő típusra oszthatunk (Stryrer, L. Biochemistry, 2nd Edition, W. H. Freeman & Co., 1981, pp 184-199). Az I. típusú kollagén a leginkább elterjedt forma, mely többek között a bőrben, az ínban, a szaruhártyában, és a csontokban található meg, és az al(I) kollagén két alegységét, illetve egy ettől eltérő szekvencia egy alegységét tartalmazza. Más kollagén típusok, így a II. típusú kollagén három azonosítható alegységet vagy láncot tartalmaznak, melyek mindegyike körülbelül 1000 aminosavból • · áll. A III. típusú kollagén többek között a véredényekben, a kardiovaszkuláris rendszerben, és a fetális bőrben található, és három al(III) láncot ([α1(ΙΙΙ)]₃) tartalmaz. A

IV. típusú kollagén többek között az alapi membránokban helyezkedik el, és három al(IV) láncot ([al(IV)]₃) tartalmaz.

A jelen találmány a T-sejt által közvetített, vagy a T-sejttől nem függő autoimmun betegségek kezeléséhez kapcsolódik az említett autoimmun betegségekre specifikus autoantigénekkel, ezek biológiailag aktív fragmentumaival, illetve analógjaival történő kezeléseken keresztül.

A találmány a betegségek széles skálájának kezelésére alkalmas, és a betegség előtt vagy után alkalmazható; a szóbanforgó betegségeket együttesen autoimmun betegségnek nevezzük, beleértve - korlátozások nélkül - a multiple szklerózist, a miaszténia graviszt, a reumatoid artritiszt, a diabétesz mellituszt, a szisztémás lupusz eritematozuszt, az autoimmun tiroiditiszt, az autoimmun hemolitikus anémiát, és a kontakt szenzitiv betegséget, amit például beültetett anyag - így szömörce (poison ivy) - okozhat.

így a találmány szerint az autoimmun válasz - például a multiple szklerózis - az MBP-vel vagy ennek biológiailag aktív komponensével kezelhető. Tehát a találmány eljárása szerint az autoimmun válasz, így a multiple szklerózis a ClI-vel, illetve ennek biológiailag aktív részeivel kezelhető.

• · • ·

A jelen találmány alapja annak felfedezése és igazolása, hogy az MBP orális és enterális adagolása hatásos a krónikus és akut egyfázisú EAE elnyomására. Rendkívül előnyös esetben ez az adagolás szájon át történhet. Az EAEnek az MBP enterális adagolásával történő elnyomása a betegség kifejeződése után nem várt eredményt nyújt.

A jelen találmány alapja továbbá az a felfedezés, hogy a II. típusú kollagén enterális adagolása az adjuvant artritisz elnyomására hatásos. Az adjuvant artritisz II. típusú kollagénnel történő elnyomása rendkívül meglepő, mivel az MT-nél nem várt mértékben hatásosabb az adjuvant artritisz elnyomására, így az adagolás szájon át történik.

Az EAE és az adjuvant artritisz enterálisan indukált toleranciája dózisfüggő, és a betegségnek mint a klinikai, és a hisztológiai tünetei nagy mértékben csökkennek. Mivel például egy nem odaillő antigén, például egy szarvasmarha szérum albumin (BSA), vagy egymásik antigén, például kollagén vagy S antigén (a kísérleti autoimmun uveitisz antigénje) nem befolyásolja az EAE-t, azt mondhatjuk, hogy az EAE-vel szemben mutatott orálisan indukált tolerancia az MBP-re - arra az antigénre, melyre a betegséget közvetítő T-sejtek érzékenyek - specifikus.

Továbbá az MBP-vel orálisan kezelt patkányoknál ez az MBP-re adott immunválaszok elnyomását indukálja. így például a nyirok-sejtek proliferációja és az anti-MBP antitestek termelése egyaránt csökken. A betegség elnyomásáért, és az antigén-specifikus in vitro celluláris immunválaszok elnyomásáért felelős sejtek T-sejt eredetűek, és a CD8+ T ·« ·« · limfocitákra nézve elnyomóak/citotoxikusak.

így a multiple szklerózis szemléltetésére az EAE állati modell alkalmazása és az AA szemléltetésére az állati modell alkalmazása segítségével az autoantigénekkel - így például MBP-vel illetve ClI-vel - történő kezelés egyszerű eljárás, mely hatásos a specifikus autoimmun betegségek és az autoantigénekre adott egyes immunválaszok elnyomására, és a betegség kifejlődése után a betegség kifejlődésének elnyomására.

Az autoantigént, fragmentumát, illetve analógját orálisan általában napi 1000 mg mennyiségben alkalmazzuk, egyszeri vagy többszöri dózisban. Az autoantigént, fragmentumát, illetve analógját előnyös esetben napi 25-850 mg mennyiségben alkalmazzuk. A pontos dózis magától az autoantigéntől, a beteg korától, nemétől, és fizikai állapotától függ, valamint a többi kezeléstől. Ezeket a készítményeket a kezelés igényének felmerülése esetén adagolhatjuk, így a betegség enyhíthető, csillapítható, csökkenthető, visszafordítható, illetve a betegség mértéke csökkenthető. Az említett készítményekkel való kezelésre alkalmas állatok az autoimmun betegség kialakulására eleve fogékonyak, így ezekben az esetekben megakadályozható maga a betegség, vagy veszélye lecsökkenthető.

Amennyiben az autoantigént, fragmentumát, illetve analógját orálisan adagoljuk, az más tápanyag-formákkal is elegyíthető, és szilárd, szemiszilárd, szuszpenzió, valamint emulzió formájában szerelhető ki. Az említett autoantigéneket gyógyszerészetileg elfogadott sókkal, • ·· « ·· ·« · • · · · ··· ·· · ·· • « · · · · ···*··· ·· ·· ·· hordozókkal, ízesítőkkel, és hasonlókai elegyíthetjük.

Az adott autoantigént az ilyen autoantigént igénylő betegség esetében más további megfelelő autoantigénnel elegyítve adagolhatjuk. így például az egynél több forrásból vagy fajból származó a II. típusú kollagének alkalmazhatók. A találmány szerinti autoantigéneket megfelelő gyógyszerészeti hordozóval elegyítve is alkalmazhatjuk. Az ilyen autoantigéneket minden formában alkalmazhatjuk, mely a humán alany, vagy az állat autoimmun betegségét megelőző, csillapító, vagy gátló módon befolyásolja, vagy az autoimmun betegség körülményeit javítja.

A találmány szerinti autoantigéneket - amennyiben az adott dózis forma nem teszi tönkre az autoantigén biológiai aktivitását - orálisan tabletták, kapszulák, porok, vagy folyadékok formájában alkalmazhatjuk.

A találmány szerinti autoantigének készítményei orális adagolás esetén vizes, vagy nem-vizes oldatok, szuszpenziók, illetve emulziók lehetnek. Nem-vizes oldószerek például a propilén-glikol, a polietilén-glikol, a növényi olaj, a hal olaj, és az injekciózható szerves észterek. Vizes hordozók lehetnek a víz, a víz-alkohol oldatok, emulziók, szuszpenziók, beleértve a sóoldatot, és a parenterális egészségügyi hordozókat, így a nátrium-klorid oldatot, a Ringer-féle dextróz oldatot, a dextróz plusz nátrium-klorid oldatot, a laktózt tartalmazó Ringer-féle oldatot, vagy a rögzített olajokat (fixed oil).

Amennyiben az autoantigént, fragmentumát, illetve analógját orálisan adagoljuk, az szilárd, szemiszilárd, • · · · · · ··♦ ··· ·· • · · · • · « · · · szuszpenzió, valamint emulzió formájában történhet, és minden gyógyszerészetileg elfogadott hordozóval - beleértve a vizet, a szuszpendáló szereket, és az emulzifikáló szereket - elegyíthető.

A találmány szerinti autoantigéneket szivattyúval is adagolhatjuk, vagy hosszan tartó-kibocsátást (sustainedreleased) biztosító formában, amennyiben megelőző kezelést alkalmazunk olyan alanynál, melynél az autoimmun betegség kialakulásának megakadályozása a cél, vagy amennyiben egy már kialakult autoimmun betegség enyhítése, vagy késleltetése a cél.

A találmány szerinti autoantigéneket tartalmazó készítményeket, melyeket a találmány szerinti eljárásokban alkalmazhatunk, ismert módszerekkel állíthatjuk elő. így például az autoantigéneket, mint gyógyszerészeti készítményeket, hagyományos elegyítéssel, granulálással, drazsé gyártással, feloldással, liofilezéssel, illetve hasonló eljárásokkal állíthatjuk elő. Ezek a készítmények az akut, és a krónikus autoimmun betegségek kezelésére alkalmasak.

Ezeknek a készítményeknek a kisebb hatékonyságú változatait alkalmazhatjuk az enyhe, a krónikus, vagy az akut rendellenességek kezelésére.

Ezek a természetes eredetű szennyeződést nem tartalmazó autoantigének természetes vagy rekombináns forrásokból hagyományos jól ismert körülmények mellett izolálhatók, így például a fehérjék izolálásánál alkalmazott extrakcióval, csapadékképzéssel, kromatográfiával, affinitás • · · ·· «·«··· • · · ··· «·· ·· • · · · · ··«· ·· «« ·· kromatográfiával, elektroforézissel, és hasonlókkal.

így az adott autoantigén antigenikus doménjét ismert eljárásokkal azonosíthatjuk - anélkül, hogy indokoklatlan kísérleteket kellene végrehajtanunk, és az így kapott domének a találmány eljárása során előnyösen alkalmazhatók. A natív autoantigének, vagy a rekombináns eljárásokkal előállított autoantigének származékai például teljes hosszúságú fehérjék általánosan ismert proteázokkal történő proteolitikus hasításával hasíthatok, így például tripszinnel, kimotripszinnel, és szubtilinnel. Aktinnal derivatizált gyantát alkalmazó affinitás kromatográfiás vizsgálatot is alkalmazhatunk az említett fragmentumok autoimmun betegség elnyomó képességének méréssel történő meghatározására.

Amennyiben az autoimmun betegséget elnyomó aktivitással rendelkező vegyületek vagy ezek fragmentumai előállítása a cél, ezeket a komponenseket vagy fragmentumokat szintén jól ismert eljárásokkal azonosíthatjuk.

Az említett fragmentumokat, továbbá a más ismert antiautogenikus doménnal mutatott homológiájuk alapján azonosíthatjuk, amikor előre várható, hogy a funkció a homológiát fogja követni.

így például a találmány szerinti eljárás során alkalmazható autoantigéneket az autoantigének azon képessége alapján azonosíthatjuk, hogy az autoimmun betegségben szenvedő betegekben elnyomják az autoantigén-indukált autoimmun betegséget az említett autoantigének adagolása során. A találmány szerinti eljárás során az autoimmun • · · · «·· ·«· · · • · · · · · ·«···· · · <· ·· betegséget a betegség tüneteinek megjelenése előtt vagy után az autoantigénekkel történő ilyen kezelés alkalmazásával elnyomhatjuk.

A találmány általános ismertetése után a kivitelezés módját az alábbi példákkal szemléltetjük. A példák a találmányt semmilyen módon nem korlátozzák.

PÉLDÁK

A. Eljárások

Állatok: 150-220 g tömegű (6-8 hetes) nőstény patkányokat vizsgáltunk, melyek a Charles River Laboratory-ból (Wilmington, MA), vagy a Harlan Sprague Dawley-ból (Inc., Indianapolis, IN) származtak.

Az állatok immuniozálása: A patkányokat a talppárna hátsó felén 50 μg tengerimalac MBP-vel immunizáltuk, melyet teljes Freund-féle adjuvánsban emulzifikáltunk (CFA). Egyes kísérletekben az emulzifikált antigénekhez 50 μg ovalbumint (ÓVA) (Sigma) adtunk, majd az injekciózást hasonlóképpen végeztük. Az EAE-t a végtag paralízise alapján jellemeztük, és az alábbiak szerint osztályoztuk: 0) nincs betegség; 1) csökkent aktivitás, ernyedt farok; 2) enyhe paralízis, bizonytalan járásmód; 3) mérsékelt paraparézis, a végtagok félrehajlása; 4) tetraplégia.

Az orális tolerancia indukálása: A patkányokat • · · Λ · · · · · • ··« ··· · · 9 · · • ······ ······« ·· ·· ·· háromnapos intervallumokban napi öt alkalommal MBP-vel vagy szarvasmarha szérum albuminnal (BSA) tápláltuk, 1 mg mennyiség 1 ml PBS-ben való feloldásával (8 mg NaCl, 0.2 mg KC1, 1.44 mg Na₂HPO₄, 0.24 mg KH₂PO₄ 1000 ml desztillált vízben), műanyag csővel fedett 23-as méretű tűvel.

Proliferációs mérés: Az immunizálás után az állatokat megöltük és a popliteális nyirokcsomókat eltávolítottuk. A nyirokcsomókat rozsdamentes acélhálón nyomtuk keresztül, így egysejtű szuszpenziót hoztunk létre. A 10nyirokcsomó sejt (LNC) teljes mennyiségét a táplált patkányokból származó besugárzott (2000 rád) vagy sértetlen LNC fent említett mennyiségével négyszeres mennyiségben, 96 lyukú lemezen (Costar) tenyésztettük. 20 μΐ mennyiségű 50 μΐ/ml MBP-t, és Mycobacterium tubercolosist (Mt) adtunk a tenyészethez. A tenyészetet 80 órán keresztül inkubáltuk, a tenyésztés utolsó 16 órájában 1 μύί Éh] TdR/lyuk mennyiséggel pulzáltuk. A sejteket automata sejt-gyűjtő alkalmazásával öszegyűjtöttük, és standard folyadékszcintillációs számlálóban megszámoltuk.

A legjobb LNC (PLNC) proliferáció százalékos mennyiségét az alábbi képlettel határoztuk meg:

• · · ·' · · « • · · «

·· ·

cpm (a táplált patkányokból származó be nem sugárzott LNC + PLNC + antigén %-os szupresszió = 100 x 1 - ------------------------------cpm (a nem-táplált patkányokból származó be nem sugárzott LNC + PLNC + antigén

Proliferációs közeg: Minden kísérletben Gibco RPMI-t alkalmaztunk. A közeget 2 x 10”⁵ M 2-merkaptoetanol, 1 % nátrium-piruvát, 1 % penicillin és sztreptomicin, 1 % nemesszenciális aminosav, és 1 % autológ szérum hozzáadása után sterilre szűrtük.

Különböző sejthalmazok tisztítása: A lépsejtekből származó CD3, CD4, és CD8 populációk elhasználása céljából negatív szelekciót hajtottunk végre. A Petri csészéket egy éjszakán keresztül 4°C-on 10 ml mennyiségű 1/1000 kecske anti-egér IgG + IgM antitest (Tago) PBS/BSA-ban készült elegyével vontuk be. A lemezeket ezután lemostuk, és 3 % fetális borjú szérum PBS-ben készült elegyével vontuk be 30 perc alatt, 20 °C-on, majd ismét mostuk. A Lewis patkányokból származó LNC-t egér anti-patkány monoklonális antitesttel (Serotec/Bioproducts) festettük a CD3-ra nézve (MRC, OX/38), CD4-ra nézve (W 3/25), vagy CD8-ra nézve (OX/8), 1/100 PBSben hígítva. A sej'teket jégen 30 percig festettük, mostuk, és 15 millió sejt/5 ml PBS/lemez mennyiséggel 4°C-on előre «·· • *·· ·* 4 ·« · » ¹⁴ ·····« ··*···· ·« »· ·· bevont lemezre vittük át. A meg-nem-tapadt sejteket tartalmazó felülúszót 60 perccel később óvatosan felszívtuk, és a sejtek vizsgálata illetve számlálása előtt lecentrifugáltuk. Az eljárás eredményeképpen, a membrán immunofluoreszcenciás vizsgálat alapján, a fluoreszcenciával aktivált sejtszámlálóval megközelítőleg 85-95 %-os tisztaságú sejt populációt kaptunk.

Adoptív átvitel: A donor patkányokat MBP-vel vagy BSA-val tápláltuk napi öt alkalommal 1-1 mg mennyiséggel, 3-4 napos intervallumokban, majd a negyedik napon, az utolsó táplálás után elpusztítottuk. A bélfodorból származó LNC-t, és a lépből származó sejteket összegyűjtöttük, és közvetlenül, vagy 1.5 gg/ml concavalin-A-val (Con-A) (48 órás proliferációs közegben) történő aktiválás után a hasüregbe injektáltuk. Az adoptív átvitel során injektált sejtek számát az alábbi módon határoztuk meg: 120 x 10θ a teljes (aktivált, illetve nem-aktivált) LNC populációra nézve; 60 x 10⁶ a CD3-ban kimerült LNC-re nézve; 80 x 10θ a CD4-ben kimerült populációra nézve;; és 95 x 10^ a CD8-ban kimerült LNC-re nézve. A befogadó Lewis patkányokat a BP/CFA-val négy órával az EAE indukálás után immunizáltuk.

Az antitestek szérum szintje: Az MBP-vel és az OVA-val szemben mutatott antitest titer meghatározására szilárd fázisú enzimhez kötött immunoszorbens mérést (ELISA) alkalmaztunk. A mikrotiter lemezeket lyukanként 0.1 ml mennyiségű 10 μg antigén/ml kétszer desztillált víz eleggyel inkubáltuk 18 órán keresztül, 25°C-on. A lemezeket

PBS/Tween-20 (Bio-Rad) eleggyel, pH 7.5, háromszor mostuk, « · * Λ ··«· · • ··· ·«· tft ·· * · ···»·* ··♦···· ·· *· ·· majd 3 % BSA/PBS elegyben 37°C-on két órát inkubáltuk, kétszer mostuk, és négyszer párhuzamosan 100 μΐ hígított szérumot adtunk hozzá. A lemezeket PBS/Tween-20-al háromszor leöblítettük, majd 100 μΐ/lyuk mennyiségű, 1:1000 higítású (BSA/PBS-ben) peroxidázhoz kötött kecske-anti-patkány IgG antitesttel (Tago, USA) 25°C-on 1 órát inkubáltuk. A színreakciót 30 % H₂O₂-t tartalmazó D-fenilén-diaminnal (0.4 mg/ml foszfát/citrát puffer, pH 5.0) kaptuk. A reakciót 0.4 N H₂SC>4 hozzáadásával állítottuk le, és az OD-t 492 nm-en ELISA readeren olvastuk le.

Az antitest termelés in vitro mérése: Az immunpróbának alávetett naiv patkányokból kapott térdhaj lati és lép eredetű LNC-t 10⁷ sejt/ml petri csésze koncentrációban önmagában vagy a jelzés szerinti más PLNC-vel együtt besugározva (2000 rád) átoltottuk. A tenyészetet inkubátorban három napig a proliferációs közegben tartottuk antigénnel (20 μg/ml) illetve anélkül, majd összegyűjtöttük. A hígított felülúszót alkalmaztuk az IgG antitest in vitro termelésének és kiválasztásának megvizsgálására, és a fenti ELISA teszt alkalmazásával az antitest mennyiségét megmértük.

Az EAE szupresszióért felelős mielin alapú fehérje molekula különböző régióinak azonosítása: Tengerimalac mielin alapú fehérje 1-37 átfedő régióit szintetizáltuk meg szilárd fázisú peptid eljárással. Houghten, R., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 82:5131-5135 (1985). A kapott fragmentumokat orálisan alkalmaztuk, 15 mg teljes mielin alapú fehérjével ekvimoláris koncentrációban. Az adagolás az immunizálás • · * ··«·»· • · · · *·^ M« « · « ···»·· ······· ·· ·· ·« előtti -7., -5., és -2. napon történt. Az állatokat ezután immunpróbának vetettük alá bázikus fehérjét tartalmazó Freund-féle adjuváns alkalmazásával, a leírás szerint.

Annak szemléltetése, hogy a fehérje antigén orális adagolása meghatározza, melyik fragmentum felelős az Immunválasz létrehozásáért: A talpukon Freund-féle adjuvánssal, illetve orálisan immunizált állatoknak teljes mielin alapú fehérjét adtunk. 7-10 nappal későb a lép-, és a nyirokmirigy sejteket eltávolítottuk, és in vitro a mielin alapú fehérje különböző fragmentumaival stimuláltuk.

Kollagének és hatásiavítók: A csirke II. típusú kollagén vízoldható formáját a Genzyme Corporation-tól szereztük be (Boston, MA). A szarvasmarha III. típusú kollagént a Southern Biotechnology Associates-tól szereztük be (Inc., Birmingham, AL), míg az I. típusú kollagén Dr. D. Trentham adománya volt (Beth Israel Hospital, Boston, MA). A Mycobacterium tubercolosis-t és a nem-teljes Freund-féle adjuvánst (IFA) a Difco Laboratories-tól szereztük be (Detroit, MI). A teljes Freund-féle adjuvánst (CFA) az IFA és MT finom porrá elegyítésével állítottuk elő.

Az orális adagolás eljárása: Az állatokat a betegség indukálása előtt 18G ball-point tűvel háromszor feltöltött (a -7., a -5., és a -2. napon) fecskendőben 1 ml térfogatú antigénnel kezeltük orális úton. A kollagéneket kálciumfoszfát pufferben oldottuk fel, míg az MT-t foszfát pufférés fiziológiai sóoldatban (PBS) szuszpendáltuk.

Az artritisz indukálása: Az állatokban az adjuváns artritiszt a farok-tő 10 mg/ml M. tubercolosist tartalmazó • · · «·«··· 4 ··« ··· 4·· ·* r « ···»*· • 4*4 ««« ·· *· 4*

0.1 ml CFA oldattal történő intradermális injekciózásával indukáltuk.

Az artritisz értékelése: Az artritisz előfordulását úgy definiáltuk, mint a betegség indukálása után 35 napon belül az artritiszt klinikailag mutató patkányok számát. Az artritisz számát standard eljárással mértük (Trentham és társai, J. Exp. Med. 146:857 (1977). Az állatok négy mancsát az alábbiak szerint osztályoztuk: 0 = normális, 1 = csak pirosság, 2 = pirosság és duzzanat, 3 = Ízület deformáció.

Az egyes állatoknál az artritisz jelét az mutatta, hogy a fenti tüneteket mind a négy mancsukon észleltük. Az artritisz legerősebb jele egy-egy állaton a teljes vizsgálat alatt a legerőteljesebb jel volt. Az összes vizsgálatot vakon hajtottuk végre, a kezelt csoport ismerete nélkül.

• · ♦ «·«»·· « ··* ··· ··· ·· » · ······ ···· ··» ·· ·· «·

-29Limfocita proliierációs assav: Patkányokat oltottunk

0.1 ml 1 mg/ml MT tartalmú CFA-val a farktőben. 9 nappal később a csapolt nyirokmirigyeket eltávolitottuk és egyszerű sejtszuszpenziót készítettünk. Kétszeri mosás után a sejteket újra szuszpendáltuk RPMI 1640ben, mely 1 % glutamint, 1 % penicillin/streptomycint, 1 % nemesszenciális aminosavakat, 5 % fetal calf szérumot és 5 x 10⁵ 2-merkaptoetanolt tartalmazott. Ezután a sejteket kvadruplikáltan 96 lyukú lapos fenekű lemezre oltottuk 2.5 x 10⁵ sejt/lyuk koncentrációban és különböző koncentrációjú MT-vel tenyésztettük 37 °C-on 5 % CC^-dal 72 óráig. Ezután 1 μCi/lyuk triciált timidint adtunk a tenyészethez. A jelzés után 6 órával a sejteket összegyűjtöttük és a profilerációt a triciált timidin beépülésével mértük, folyadék szcintillációs számlálással.

Késlelteti típusú hiperszenzitivitás (DTH) válaszok: A

DTH válaszokat 30 nappal az immunizálás után mértük. A patkányokat szubkután oltottuk mindkét fülükbe 10 gg MT-vel és 20 μg ClI-vel 50 μΐ PBS-ben. A fül duzzanatát az oltás előtti és 48 órával utáni fülvastagság különbségével mértük mikrométer tolómérővel. A DTH válaszokat nem immunizált és csak ClI-vel táplált állatokban is mértük.

A szuppresszió adoptiv átvitele: Donor patkányokat tápláltunk 3-szor 3 μς ClI-vel 2-3 napos időközönként. 7 nappal az utolsó táplálás után lépjeiket eltávolitottuk és egyszerű sejtszuszpenziót készítettünk. A vörös vérsejtekből 7.26-os pH-jú tris-NH₄Cl lizátumot készítettünk, majd Hank

-30» 4 · 4 « « * ·4

4*4 444 «4*·« • 4 44 *φ ··*♦ ·*4 4ö 444* egyensúlyi sóoldattal (HBSS) kétszer mostuk. Néhány kísérletben a splenocitákat tovább választottuk el T vagy B sejtekben gazdagabb populációkra nylon gyapjú oszlopon. 1 x 10⁸ sejtet oltottunk intraperitoneálisan minden recipiensbe, melyeket ezután aznap, ill. 2 nappal később CFA-val oltottunk az arthritis indukálása céljából. A normál táplálatlan patkányokból nyert splenociták szolgáltak kontrollként.

1. példa

Az MBP és fracrmentiei táplálásának hatása

Az MBP és peptid fragmentjei táplálásának hatását az akut monofázisú EAE-re való fogékonyságra és súlyosságára vizsgáltuk Lewis patkányokban. Az eredmények azt mutatták, hogy a tolerancia indukciójának ez a természetes módja szuppresszálja mind a betegség kifejlődését, mind az MBP-re adott immunválaszt.

Az EAE szuppressziójának orális indukciója céljából Lewis patkányokat tápláltunk tengerimalac agyból nyert MBPvel (Diebler, G., és társai, Prep. Biochem. 2:139 (1972), 20G golyós heggyel felszerelt fecskendővel. A kontroll állatokat azonos mennyiségű marha szérum albuminnal (BSA) vagy sóoldattal önmagában tápláltuk. Az EAE-t 200 μ-g Mycobacterium tuberculosist tartalmazó komplett Freund-féle adjuvánsban (CFA) emulzifikált 50 μg MBP-vel indukáltuk, a

-31• 4 ? 4 · « ·· · ·4» » · · 4 · 4 · · 44 · · · · 4» ····♦·· 4 * 4 4· · hátsó talpakban történő immunizálással. A betegséget a hátsó végtag paralízissel és burjánzással jellemeztük általában az immunizálás utáni 12 és 15 napok között és a 16. napon a patkányok minden esetben meggyógyultak. Az első kísérletsorozatok során a táplálások számának és az MBP dózisának a hatását vizsgáltuk a betegség kifejeződésére nézve. A patkányokat különböző mennyiségű MBP-vel tápláltuk egyszer az immunizálás előtti 7. napon (-7. nap) és 3-szor a -14., -7. és a 0. napon. Az eredmények (1. táblázat) azt mutatják, hogy a patkányok MBP-vel való táplálása szuppresszálja az EAE-t, és hogy az orálisan indukált szuppresszió dózis-függő. Többszörös 500 μg-os táplálás a betegség teljes szuppresszióját eredményezte és sokkal hatásosabb volt, mint az ugyanilyen dózisú egyszeres táplálás. Az EAE klinikai megjelenésén felül, a patkányokban a betegség szövettani bizonyítékait is vizsgáltuk. 16 nappal az immunizálás után a patkányokat leöltük, az agyukat eltávolitottuk és formaiin oldatban fixáltuk. A fixáló oldat 100 ml 70 %-os etanolból, 10 ml 37 %-os formalinból és 5 ml jégecetből állt. Minden patkányból paraffinba ágyazott szövetmintát készítettünk és azt hematoxylinnel és eozinnal festettük. A perivasculáris gyulladást okozó gócpontokat elfogadott eljárással határoztuk meg a tárgylemezeken (Sobel, R., és társai, J. Immunoi. 132:2393 (1984)). Az 1.táblázatban látható, hogy a patkányok 500 μg MBP-vel való táplálása a -14., -7. és 0. napokon, jelentős csökkenést okozott az agyban levő gyulladásos elváltozások számában. Mérsékelt csökkenés jelentkezett a 100 μg-mal táplált • ·

-32állatok esetében, és a 25 μg MBP-vel táplált patkányoknál nem tapasztaltuk a gyulladás szignifikáns csökkenését.

2. példa

Az antigén előzetes kitételének hatása a szuppresszióra

A második kísérletsorozat az MBP táplálásának hatását vizsgálta az MBP-vel való immunizálás előtt és azt követően, annak meghatározására, hogy az orálisan indukált szuppresszió hatásosságát befolyásolja-e, ha előtte az antigén hatásának teszik ki. Ezekben a kísérletekben 500 gg MBP-t tápláltak 3-szór a betegség aktív indukciója előtt és és után (immunizálás MBP-vel). Az eredmények (2. táblázat) azt mutatják, hogy a betegség klinikai kifejeződését szuppresszálja az állatok MBP-vel való táplálása az érzékenyítés előtt vagy után; a hatás sokkal kifejezettebb, ha az antigént az immunizálás előtt tápláljuk. Ellenben, a szövettani vizsgálatok jelentős csökkenést mutattak a perivasculáris infiltrációban patkányokban, melyeket MBP-vel tápláltunk az MBP-re történő érzékenyítés előtt és után. A betegség nagyobb, mint 60 %-os szuppressziója jelentkezett, amikor a patkányokat 3-szór tápláltuk az immunizálás utáni +5. vagy +7. naptól (adatokat nem ábrázoltunk).

Továbbá, kísérleteket végeztünk, melyekben patkányokat tápláltunk 100 μg MBP-vel az MBP-vel történő immunizálás előtt és után különböző időpontokban. A III. táblázatban • ·

-33látható, hogy a betegség szuppressziója jelentkezett az immunizálás előtti vagy utáni egyszeri táplálás esetén.

3. példa

Az MBP orális adagolásának hatása az MBP-re adott celluláris és hormonális válaszra

Szintén vizsgáltuk az MBP orális adagolásának hatását az MBP-re adott celluláris és humorális válaszra. Tanulmányoztuk az MBP-re adott proliferatív választ különböző adagú MBP-vel való táplálás után, és az azt követő, az immunizálás utáni különböző időpontú táplálások után. Az immunizálás után 10 nappal a patkányokat leöltük és a csapolt (térdhajlati) nyirokmirigyekből egyszerű sejt szuszpenziót készítettünk. A sejteket mikrolyukakban (microwell) tenyésztettük 4 napig, az utolsó 24 órára ³Htimidint adagoltunk. 0.2 ml 4 x 10 sejtet tartalmazó RPMI 1640-t, mely 2 % glutamint, 1 % penicillin/streptomycint, 5 x 10 “⁵ M 2-merkaptoetanolt és 5 % fetal calf szérumot tartalmazott, adtunk minden mikrolyukhoz, és 50 pg/ml MBP-t adagoltunk. A lyukakat 1 pCi triciált timidinnel jeleztük, üveggyapot szűrőkre multiharvesterrel összegyűjtöttük, és standard folyadék szcintillációs technikával számláltuk.

Az eredmények azt mutatják (I. és II. táblázat), hogy az MBP-vel való táplálás jelentős (75-92 %) csökkenést okozott az MBP-re adott proliferatív válaszban. A • «

-34proliferáció szuppressziója, eltérően a betegség szuppressziójától, minden vizsgált dózisban és táplálási rendben jelentkezett, beleértve az immunizálás utáni táplálást is. Az MBP-re adott proliferativ válasz orálisan indukált szuppressziója antigén-specifikus, amint az az 1. ábrán látható. Az MBP-vel való táplálás nem szuppresszálja a tisztított fehérje származékra (PPD) adott proliferativ választ, mely egy az M. tuberculosisból származó antigén, mely proliferativ választ indukál a CFA-val való immunizálás következtében. Egy irreleváns antigén, így a BSA, táplálása nem befolyásolja a PPD-re adott proliferativ választ és csak enyhén szuppresszálja az MBP-re adott proliferativ választ.

4. példa

MBP táplálásának hatása az MBP elleni antitest termelésére

Megvizsgáltuk az MBP táplálásának hatását az MBP elleni antitest termelésére. MBP-vel táplált patkányokat immunizáltuk és az immunizálást követő 16. napon szívpunkcióval vért vettünk tőlük. A szérumban levő anti-MBP antitest szintjét ELISA-val vizsgáltuk. 0.1 ml MBP oldatot (0.05 mg/ml PBS-ben) adtunk mikrolyukanként és 3 óra hosszat 37 °C-on inkubáltuk azokat. A lyukakat 0.05 % Tween-t tartalmazó PBS-sel (PBST) mostuk és egy éjszakán át 5 % BSA/PBS, pH=9.0, oldattal blokkoltuk 4 °C-on. PBST-vel való mosás után hígított patkányszérumot adtunk hozzá és 3 órán • · • · · · ··· ··· · · • · · · · · · ······· · · ·· ··

-35át szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd a PBST-vel való mosás után második antitestet (peroxidázzal konjugált kecske anti-patkány) adagoltunk, és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Szubsztrátot adtunk hozzá és a reakciót 0.1 M NaFl-val leállítottuk. A lemezeket 450 nm-en olvastuk le Titertek multiscan készülékkel. A csak CFA-val immunizált patkányok szérumának AbS4₅Q értékeit is meghatároztuk, és ezt minden értékből háttérként levontuk.

Eltérően a proliferativ válaszok szuppressziójától, melyek látszólag az összes vizsgált dózis és táplálási rend mellett jelentkeztek, az antitest termelés szuppresszióját csak a legmagasabb vizsgált dózis mellett tapasztaltuk (500 μg) a -14., -7., és 0. napokon (66 %szuppresszió, I.

táblázat). Figyelemre méltó a szuppresszió hiánya a -7., -5. és -2. napokon 500 pg MBP-vel táplált patkányokban (II.

táblázat), ami azt sugallja, hogy az azonos dózisú MBP-vel történő táplálás időbeni sorrendje lényeges az antitest termelés szuppressziójában.

··♦ ······ • ··· · · · * · · ·· • · · · · · ······· · · · · ··

I. Táblázat

A táplálási dózis hatása az orálisan indukált EAE szuppresszióra Lewis patkányokban

Immunválasz MBP-re

EAE indukciója ( %-os inhibíció) ^aKlinikai ^Szövettani ^cProliferáció ^Antitest betegség pontszám

Immunizált

kontrollok	19/22	9.2+/-5.8
Táplálás
napja -7
25 μg	3/5	NA	75.6+/-2	NA
100 μς	2/5e*	NA	88.9	NA
500 μg	3/10 ***	NA	88.9+/-2	NA
Táplálás
napja -14, -7,	0
25 μg	3/5	7.2+/-5.2	82.1	-48+/-
100 μg	2/5 *	3.2+/-1.9	80.8+/-5	14+/-49
500 μς	0/10 ***	0.2+/-0.4	87.2+/-1	66 + /-

(a) A patkányokat különböző dózisú MBP-vel tápláltuk a jelölt napokon és 50 μg MBP/CFA-val (200 μg M. tuberculosis) • 9 · 9 • · · · · • 9 9 9 9 ······· ·· ·· ··

-37immunizáltuk a 0. napon. A megbetegedett patkányok számát per az immunizált patkányok számát jelölt-k. Az immnunizált kontrollokat BSA-val vagy sóoldattal tápláltuk.

(b) Az immunizálás utáni 16. napon a patkányokat leölt-k, agyukat eltávolitottuk és fixáltuk. Az állatban levő perivasculáris gyulladás gócpontjainak átlagos számát +/- s.d. jelöltük. NA = nincs adat.

(c) Az MBP-re adott proliferativ válaszokat mértük csapolt nyirokmirigy sejtekben 10 nappal a patkányok immunizálása után. 0.2 ml 4 x 10* sejtet tartalmazó RPMI 1640-t, mely 2 % glutamint, 1 % penicillin/streptomycint, 5 χ 10~⁵ M 2-merkaptoetanolt és 5 % fetal calf szérumot tartalmazott, adtunk minden mikrolyukhoz, és

0 gg/ml MBP-t adagoltunk. A lyukakat 1 μΟί. triciált timidinnel jeleztük, üveggyapot szűrőkre multiharvesterrel összegyűjtöttük és standard folyadék szcintillációs technikával számláltuk. Az MBP-re adott proliferativ válasz %-os inhibícióját jelöltük a kontroll csoportra vonatkoztatva. Az immunizált kontrollok átlagos stimulációs indexe (MBP-stimulált cpm/háttér cpm) 6.0 volt (29888 cpm/4960 cpm).

(d) A patkányokat a 16. napon leöltük és szívpunkcióval vért vettünk tőlük. A szérumot 1/15625-re PBS-sel hígítottuk, és az anti-MBP antitest szintet ELISA-val mértük. 0.1 ml MBP oldatot (0.05 mg/ml PBS-ben) adtunk mikrolyukanként és 3 óra hosszat 37 °C-on inkubáltuk. A lyukakat 0.05 % Tween-t tartalmazó PBS-sel (PBST) mostuk és egy éjszakán át 5 % BSA/PBS, pH=9.0, oldattal • · · · · · · · ·· ·· ··· ····· _ ············ * » · · · · · ······· · · · · ··

-38blokkoltuk 4 °C-on. PBST-vel való mosás után hígított patkányszérumot adtunk hozzá és 3 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd PBST-vel való mosás után második antitestet (peroxidázzal konjugált kecske anti-patkány) adagoltunk, és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Szubsztrátot adtunk hozzá, és a reakciót 0.1 M NaFl-val leállítottuk. A lemezeket 450 nm-en olvastuk le Titertek multiscan készülékkel. A csak CFA-val immunizált patkányok szérumának Abs^g értékeit is meghatároztuk és ezt minden értékből háttérként vontuk le. Az antitest-szint %-os csökkenését jelöltük, melyet a peroxidáz szubsztrát abszorbanciájának 450 nm-en való mérésével határoztunk meg, az immunizált kontrollokra vonatkoztatva. (Az immunizált kontrollok átlagos abszorbanciája A^^g, a hátteret levonva 0.148 volt.) (e) A csoportokat a legkisebb négyzetek módszerével hasonlítottuk össze egy szabadsági fokkal: * p < .05, ** p < 0.1, *** p < .001.

··· ·«···· ♦ ··· ··· · · * · * • · · · · · ·····♦· ·· · · ··

II. táblázat

Az MBP immunizálás előtti és utáni táplálásának hatása patkányokban az EAE kifejlődésére

Immunválasz MBP-re

EAE indukciója ( %-os inhibíció)

(a)Klinikai	(b)Szövettani (c)Proliferáció	(d) An
betegség	pontszám
Immunizált
kontrollok 23/26	21.6+/-5.1

500 μg MBP-vel	NA	34
táplálás napja -7,-5,-2, + 2,+5,+7	0/5(e)*“ 0.2+/-0.4
-7,-5,-2	0/17*** 0	92.6	15
+ 2,+5,+7	4/10** 1.4+/-2.3	91.5+/-3	15

(a) A patkányokat 500 μς MBP-vel tápláltuk a jelölt napokon, és gg MBP/CFA-val immunizáltuk a 0. napon. Az immunizált kontrollokat BSA-val vagy sóoldattal tápláltuk.

(b) Ld. I. táblázat.

» · • · (c) Ld. I. táblázat. Az immunizált kontrollok átlagos stimulációs indexe 9.4 volt (82247 cpm/8718 cpm).

(d) Ld. I. táblázat. Az immunizált kontrollok átlagos abszorbanciája A₄₅₀ 0.403 volt a hátteret levonva.

(e) Ld. I. táblázat.

III. táblázat

Az EAE orálisan indukált szuppressziőia Lewis patkányokban

Táplálási terv	Beteg / összes patkányok
semmi	11/16
-14, -7, 0, +7	0/13
-14	1/5
-7	0/5
0	1/5
+7	1/5

A patkányokat 100 pg MBP-vel tápláltuk a jelzett napokon (az immunizálás 0. napjára vonatkoztatva), és 50 μg MBP/CFA-val immunizáltuk (0.5 mg/ml M. tuberculosis).

« · 4

-415. példa

Az orálisan indukált EAE elleni védelem tartóssága

További kísérleteket végeztünk az orálisan indukált EAE elleni védelem tartósságának meghatározására. A -7, -5 és -2 napokon 500 μg MBP-vel való táplálás után a patkányokat különböző időtartamig immunizáltuk az utolsó táplálás után. Az EAE teljesen szuppresszálva volt a patkányokban négy hétig a táplálás után és a nyolcadik hétig az MBP-vel táplált patkányok 50 %-a újra fogékony volt a betegségre. A IV. táblázatban közölt eredmények azt mutatják, hogy a betegség toleranciája az utolsó táplálás után legalább négy hétig marad fenn, míg a betegség indukciójára való fogékonyság a táplálást követő nyolc hétig merül fel.

♦ 4

-42IV. táblázat

Lewis patkányok orálisan indukált toleranciájának tartóssága

Beteg/összes patkány

Kontroll

9/14

Táplált

Immunizálás napja

0/4 + 14

0/4 +28

0/3 + 56

4/8

A patkányokat 500 μς MBP-vel tápláltuk a -7, -5 és -2 napokon és gg MBP/CFA-val immunizáltuk a jelzett napokon. A kontroll patkányokat (BSA-val táplált) hasonlóképpen immunizáltuk.

6. példa

Az MBP fraqmentjeinek hatása az EAE kifejlődésére

Ismert, hogy a tengeri malac MBP enkefalitogenikus régiója patkányban specifikus dekapeptid szekvencia, mely a 75-84-es maradéknál helyezkedik el, mely önmagában képes az EAE • · ♦ *«···· « ··« «·· ··· ·· • « ···*·· ······· ·· ·· ·«

-43indukciójára, míg a molekula más részei nem enkefalitogenikusak (Hashim, G. , Myelin: Chemistry and Biology, Alán R. Liss, N. Y. (1980). Továbbá, beszámoltak arról, hogy más antigénekben különálló szuppresszor determinánsok léteznek, az immunogén determinánsoktól eltérő helyeken (Yowell, R., és társai, Natúré 279:70 (1979). Ezért megvizsgálták, hogy az MBP enkefalitogenikus és nem-enkefalitogenikus fragmentjei képesek-e az EAE elkerülésére orális adagoláson keresztül. Korlátozott pepszin emésztéssel tengeri malac MBP fragmenteket állítottak elő és oszlop kromatográfiásan szétválasztották (Whitaker, J., és társai, J. Bioi. Chem. 250:9106 (1975). A három különböző fragmenttel patkányokat tápláltak, majd az állatokat teljes MBPvel immunizálták. Azt találták, hogy mind a betegség-indukáló (44-89-es fragment) és a nem-enkefalitogenikus (1-37 és 90-170 fragmentek) peptidek patkányokba táplálva szuppresszálták az EAE-t, a nem-enkefalitogenikus fragmentek sokkal hatásosabbak voltak a betegség szuppressziójában, mint az enkefalitogenikus fragment (V. táblázat). Egy, az enkefalitogenikus szekvenciában (75-84-es maradék) egyetlen aminosav szubsztitúcióban különböző dekapeptidet (S79) szintetizáltak és arról számoltak be, hogy ez CFA-val patkányokba oltva szuppressziót indukál (Kardys, E., és társai, J. Immunoi. 127:862 (1981)). S79-et (Ala-Gln-Gly-His-Arg-Pro-Gln-Asp-Glu-Gly) állatokba táplálva, szintén az EAE szuppresszióját tapasztaltuk (V. táblázat). A marha MBP, mely a tengeri malac MBP-től számos részben különbözik, beleértve az enkefalitogenikus szekvenciát és nem enkefalitogenikus patkányokban a tengeri malac MBP-nek megfelelő dózisban (Holoshitz, J., és társai, J. Immunoi. 131:2810 (1983)), • · 1 <· « · * · · • ··· ««· ··· ·· * ·····« ·····«· ·· ·· · ·

-44szintén szuppresszálja a betegséget, immunizálás előtti táplálással.

V. táblázat

Enkefalitogenikus és nem-enkefalitocrenikus fracrmentek táplálásának hatása az EAE kifejlődésére Lewis patkányokban

EAE klinikai eset

Immunizált kontrollok	19/25 0/9 (a)* * *
MBP	1- 37 fragment(109 μg)
MBP	44- 89 fragment(135 μg)	3/11 **
MBP	90-170 fragment(235 μg)	0/4 * *
S79	peptid (30 μg)	1/8 ***
Marha MBP (500 μg)	0/10 ***

Lewis patkányokat tápláltunk a jelzett mennyiségű MBP fragmentekkel vagy peptidekkel (500 Mg teljes tengeri malac MBPvel ekvimoláris) a -7., -5. és -2. napokon és a 0. napon 50 μς tengeri malac MBP/CFA-val immunizáltunk. Az összes immunizált patkány számából a megbetegedett patkányok számát ábrázoltuk, (a) A csoportokat az immunizált kontroliokkal a legkisebb négyzetek módszerével hasonlítottuk össze: ** p < .01, *** p <.001.

« «4* • <*·«»·· • · * ·♦· ··· · * • · « · « • ·· ♦ · · « « ·

7. példa

Adjuváns indukált arthritisz szuppressziója Mycobacteria táplálással

Adjuváns arthritiszt indukáltunk nőstény Lewis patkányokban

0.1 ml 10 mg/ml komplett Freund-féle adjuvánssal való immunizálással faroktőben. Az állatokat 2.0 mg Mycobacteria tuberculosissal foszfát pufferolt sóoldattal tápláltuk az immunizálás előtti -7., -5. és -2. napokon, a 0. napon és az immunizálást követő +7., +14. napokon. Az arthritisz mennyiségi értékelése az ízületi duzzanat mérésével történt az immunizálást követő 3 héten át (VI. táblázat és 2. ábra). A következő tanulmányok jelzik, hogy míg a 2. ábrán mutatott eredmények véletlenszerűek, a legtöbb esetben az állatok Mycobacteria tuberculosissal való táplálása nem szuppresszálta az adjuváns arthritiszt. Ezért a Mycobacteria tuberculosis adagolás adjuváns arthritisz szuppresszáló képessége nagymértékben változó. Ennek a változatosságnak oka ismeretlen.

VI. táblázat ízületi duzzanat írom) a 21. napon

Kontroll	7.61	+/-	1.4
Mvcobacteria táplálás
napi ai
-7, -5, -2	5.61	+/-	1.1
-7, -5, -2, +7, +14	6.07	+ /-	0.9

ízületi duzzanat = az ízület vastagsága a mérés napján * p < 0.01 összehasonlítva a kontroliokkal (4 állat/csoportra jellemző kísérlet)

8. példa

Az EAE adoptiv átvitel modellje SJL egérben

Az adoptiv visszaeső EAE megvalósítható, reprodukálható modelljét hoztuk létre SJL egérben. A modellt Mokhtarian-tól vettük át, Mokhtarian, és társai, Natúré 309:356 (1984). Ezt az eljárást a 3. ábrán grafikusan ábrázoltuk. Röviden, donor állatokat immunizáltunk 400 pg MBP és 30 μg M. tuberculosis CFAban emulziójával. Tíz nappal ezután a csapolt nyirokmirigyeket eltávolítottuk és 50 pg MBP-vel tenyésztettük, alaposan mostuk, « ···

-47és 4-6 χ 10⁷ életképes sejtet oltottunk intravénásán a recipiens nőstény állatokba. Az állatokat klinikai EAE-re pontoztuk standard skálával és patologikusán pontoztuk standard Η & E szövettani analízissel (Brown, A., és társai, Láb. Invest. 45:278 (1981), Lublin, F., és társai, J. Immunoi. 126:819 (1981) és Bemard, C. , és társai, Eur. J. Immunoi. 16:655 (1976)). Az állatokat az átvitel után legalább 100 napig figyeltük, így a visszaesések számát meg tudtuk határozni.

9. példa

A proliferativ válaszok orálisan indukált szuppressziója SLJ egérben

400 μg MBP táplálása két héten át minden második nap (összesen 7 különálló táplálás) a 400 μg MBP/CFA-val (0.6 mg/ml M. tuberculosis) történő immunizálás előtt szuppresszálja a nyirokmirigy sejtek proliferációját az MBP immunizálásra adott válaszban. Az eredmények a 4. ábrán láthatók. Az ábrán a kontroll eredményeket a táplálási eredményekkel szemben ábrázoltuk az MBP-indukált proliferáció/háttér (stimulációs index) függvényében.

A találmány nem korlátozódik a jelen alkalmazás fent leírt módjaira és megtestesítéseire. Körülfog minden módosítást, melyek az autoimmun betegségek szuppresszióját eredményezik a jelen találmány szerint. Az igénypontokban megfogalmazott védelmi terület magában foglalja ezeket az ekvivalenciákat.

• 4· • 4···· ν 4 ···44 «4«4 •* V 4 *»··« • 4· ····

10. példa

Az EAE kifejlődésével szembeni protektiv rezisztencia adoptiv átvitele MBP-vel táplált donor patkányokból naiv szingenikus recipiens patkányokba

Donor patkányokat tápláltunk ötször 1 mg MBP-vel, ill. BSAval 3-4 napos időközönként, és az utolsó táplálás utáni 4. napon leéltük őket. A bélfodor nyirokmirigy sejteket (LNC) és lépsejteket összegyűjtöttük és intraperitoneálisan beoltottuk rögtön, ill. 1.5 μg/ml concavalin-A-val (Con-A) történő aktiválás után proliferációs közegbe 48 órára. Az adoptiv átviteli kísérletekben a beoltott sejtek száma a következő volt: 120 x 10θ teljes LNC populáció, aktivált, ill. nem aktivált; 60 x 10CD3 kimerített LNC; 80 x 10⁶ CD4 kimerített populáció; és 95 x 10 ⁶ CD8 kimerített LNC. Recipiens Lewis patkányokat immunizáltunk MBP/CFA-val 4 órával később EAE indukció céljából. Az EAE kifejlődésével szembeni rezisztencia átvitelének képessége táplált donor patkányokból naiv szingenikus patkányokba a VII. táblázatban látható. Az EAE-vel szembeni védelem átvitele sikertelen volt táplálatlan patkányokból, ill. BSA-val táplált donor patkányokból nyert LNC-vel. Ellenben, az MBP-vel táplált donorokból nyert lépsejtek úgymint a bélfodor nyirokmirigy sejtek (MES), képesek voltak a recipiensekben indukált EAE-vel szembeni relatív védelem átvitelére, a betegség 50 %-os, ill. 57 %-os szuppresszióját mutatva. A betegség átlagos maximális komolysága • · ·

-49is jelentősen csökkent az MBP-vel táplált patkányokból nyert lépsejteket, ill. bélfodor nyirokmirigy sejteket befogadókban. Ezek az eredmények bizonyítják, hogy az EAE indukció orális toleranciája celluláris eredetű és a védelemért felelős sejtek koncentráltan találhatók mind a bélfodor nyirokmirigyekben mind a lépben.

VII. táblázat

EAE-vel szembeni védelem adoptiv átvitele táplált, ill.

kezeletlen donor patkányokból nyert LNC-vei

Patkányok	Donorok			EAE a recipiensekben
Táplált anyag	LNC forrás	Esetszám	Átl.	,max	. komolyság
	SPC		6/7	2.5	+/-	0.3
	bélfodor	LNC	5/5	2.6	+/-	0.4
BSA	SPC		4/4	2.4	+/-	0.2
	bélfodor	LNC	5/5	2.6	+/-	0.3
MBP	SPC		4/8 *	1.6	+/-	0.2 *
	bélfodor	LNC	4/7 *	1.7	+/-	0.2 *

Lewis patkányokat tápláltunk MBP-vel, ill. BSA-val ötször 1 mg-os adagokban 3 napos időközönként, ill. nem tápláltunk. A patkányokat ezután leöltük, a lépjeiket és a bélfodor • «

-50nyirokmirigyeiket eltávolítottuk. Az LNC-t összegyűjtöttük és 48 órán át aktiváltuk Con-A jelenlétében. A limfoblasztokat összegyűjtöttük, háromszor mostuk, és naiv szingenikus patkányokba oltottuk intraperitoneálisan. A recipiens patkányokat 4 órával később MBP/CFA-val immunizáltuk EAE indukció céljából. A betegséget naponta pontoztuk a 10. naptól kezdve (* Az eredmények statisztikailag szignifikánsak, p < 0.05).

• ·

11. példa

A nyirokmiriqy sejtek alpopulációjának azonosítása, melyek az EAE elleni rezisztenciát közvetítik

MBP-vel táplált donor patkányokból származó, Con-A-val aktivált lépsejteket (SPC) vittünk át naiv szingenikus patkányokba a T sejtek, segítő T limfociták (CD4) és szupreszor/citotoxikus T limfociták (CD8) kimerítése előtt és után. A lépsejtekből származó CD3, CD4 és CD8 populációk kimerítésére a negatív kiválasztást használtuk. Petri csészéket vontunk be egy éjszakán keresztül 4 °C-on 10 ml 1/1000 kecske anti-egér IgG + IgM antitestekkel (Tago), PBS/BSA-ban. Ezután a lemezeket mostuk és 3 % fetális marha szérummal PBS-ben vontuk be 30 percig 20 °C-on, majd újra mostuk. Lewis LNC-t festettünk egér anti-patkány monoklonális antitestekkel (Serotec/Bioproducts), CD3- (MRC, OX/38), CD4- (W3/25) és CD8-ra (OX/8), 1/100-as hígításban PBS-ben. A sejteket 30 percig festettük jégen, mostuk, és az előre bevont Petri csészékre oltottuk 4 °C-on, 15 millió sejt/5 ml PBS/lemez sűrűségben. A nem-tapadó sejteket tartalmazó felülúszót 60 perccel később óvatosan eltávolítottuk és kétszer centrifugáltuk a sejtek vizsgálata és számlálása előtt. Az előirat szerint kb 85-95 %-os tisztaságú sejtpopulációk állíthatók elő, membrán immunofluoreszcenciával vizsgálva fluoreszcencia aktivált sejt osztályozóban. Az eredményeket a VIII. táblázatban • · » «

-52közöljük. Az eredmények azt mutatják, hogy az SPC képes az EAE elleni védelem átvitelére (50 %), míg a T sejt által kimerített SPC elvesztette az átvevő patkányok védelmének képességét (2-es csoport). Tehát úgy tűnik, hogy a védelem átvitelére képes lépsejtek T limfociták. De a CD8 sejtek (4-es csoport) kimerítése a védelem átvitelének hiányát eredményezi, míg CD4+ által kimerített SPC szignifikáns képességet mutatott a patkányok EAE-vel szembeni védelmére. Ezzel tehát bizonyítottá vált, hogy az antigénspecifikus T limfociták, melyek az MBP orális adagolásakor termelődtek és melyek a betegség kialakulásával szembeni rezisztenciát közvetették, a szuppresszor/citotoxikus alegységhez tartoztak.

VIII. táblázat

EAE elleni védelem adoptiv átvitele az SPC kimerített populációja esetén.

Csoport MBP-vel táplált EAE az átvevő donorokból szárm. patkányokban

	SPC	Valószínűség	Átl.max.pontosság
1	teljes populáció	2/4	1.7	+/- 0.2 *
2	kimerített CD3	6/6	2.6	+/- 0.4 *
3	kimerített CD4	2/6*	1.2	+/- 0.2 *
4	kimerített CD8	6/7	2.2	+/- 0.3

-53A donor patkányokat MBP-vel tápláltuk és az I. táblázatnál leírtak szerint kezeltük. A Con-A által aktivált SPC-t naiv recipiens patkányokba oltottuk bizonyos alpopulációk kimerítése előtt (1-es csoport), illetve után (2-4 csoportok). A CD3, CD4 és CD8 limfociták kimerítése monoklonális IgG antitestek SPC-hez való kapcsolásával és ezt követő mosással történt. A recipiens patkányokat MBP/CFA-val immunizáltuk és az EAE-t a 10. naptól feljegyeztük. ( * Az eredmények statisztikusan szignifikánsak, p<0.05).

12. példa

Anti-MBP T-selt válaszok in vitro szuppressziója MBP-vel táplált patkányok nyirokmiriqy sejtjeinek adagolásával

Patkányokat immunizáltunk MBP/CFA-val és kilenc nappal később az első térdhajlat nyirokmirigyeit (PLNC) összegyűjtöttük. Egyszerű sejtszuszpenziót készítettünk a nyirokmirigyek rozsdamentes acél hálón való átnyomásával. Kvadriplikált tenyésztéseket végeztünk a táplált patkányokból származó összes 10⁵ számú LNC-vel a jelölt számban, besugárzott (2000 Rád), illetve intakt LNC-vel kör alapú 96-lyukú lemezeken (Costar). MBP-t és 20 μΐ 50 μg/mles Mycobacterium tuberculosist adtunk a tenyészethez. A tenyészeteket 80 óra hosszat inkubáltuk majd a tenyésztés utolsó 16 órájában 1 μΟ. Tdr/lyuk tríciummal ráztuk. A ·· » • ·

-54tenyészeteket automatikus sejtgyűjtőben összegyűjtöttük és standard folyadékszcintillációs számlálóban megmértük.

Az első LNC (PLNC) proliferáció százalékos szuppresszióját a következő képlettel számoltuk:

100 * 1 - [cpm (besugárzott LNC táplált patkányból + PLNC + antigén)] % Szuppresszió = -------------------------------------------cpm (besugárzott LNC kezeletlen patkányból + PLNC antigén)]

A PLNC-t együtt tenyésztettük besugárzott SPC-vel, illetve bélfodor LNC-vel, melyet naiv vagy MBP-vel táplált patkányokból nyertünk MBP, illetve Mycobacterium tuberculosis jelenlétében. Az MBP-vel táplált donor patkányokból nyert LNC-t az utolsó táplálás után különböző napokon vizsgáltuk. Az eredmények az 5. ábrán láthatók.

Látható, hogy a kísérleti időn belül a táplált patkányokból nyert LNC nem befolyásolja a Mycobacterium tuberculosisra adott PLNC választ. Mindamellett mind az SPC, mind a táplált patkányokból nyert bélfodor LNC képes volt elnyomni a PLNC proliferációt az MBP javára. A PLNC válasz antigénspecifikus szuppressziója nagyobb volt SPC esetében, mint bélfodor LNC-vel. A szuppresszió egyértelmű az MBP-vel való táplálás utáni 5. naptól a 36. napig, jelezvén, hogy a szuppresszió indukciója a táplálás után hamarosan elérhető és viszonylag hosszú ideig fenntartható.

Tehát úgy tűnik, hogy az EAE indukciót toleráló patkányokból nyert LNC antigénspecifikus limfocitákból áll,

-55melyek képesek a táplálásra használt antigénre adott celluláris immunválasz szuppressziójára.

13. példa

PLNC anti-MBP válasz szuppressziója MBP-vel táplált patkányokból nyert besugárzott SPC és alpopulációinak jelenlétében

A szuppresszióért felelős SPC alpopulációjának vizsgálatához szükséges SPC-t MBP-vel táplált patkányokból nyertük 20 nappal az utolsó táplálás után, kimerítettük bizonyos limfocita populációkra, besugároztuk és kevertük MBP/CFA-val immunizált patkányokból nyert PLNC-vel MBP-vel együtt. Térdhaj lati és lép LNC-t petri csészékre oltottuk 10⁷ sejt/ml koncentrációban önmagában, illetve besugárzott (2000 Rád) más PLNC-vel együtt, ahogy jeleztük. A tenyészeteket proliferációs közegben inkubátorban tartottuk antigénnel, illetve anélkül (20 gg/ml) 3 napig, majd összegyűjtöttük. A hígított felülúszót használtuk az IgG antitest in vitro termelődésének és szekréciójának vizsgálatához és az antitest termelődésének ELISA teszttel való méréséhez. Mikrotiter lemezeket inkubáltunk 10 gg antigén/ml kétszer desztillált vizes oldatával 0.1 ml/lyuk mennyiségben. A lemezeket 18 óra hosszat inkubáltuk 25 °Con. PBS/tween-20-szal (Bio-Rad), pH=7.5, történő 3-szori mosás után a lemezeket 3 % BSA/PBS oldattal inkubáltuk 2 óra ··*

-56hosszat 37 °C-on, kétszer mostuk, majd 100 μΐ hígított szérumot adtunk hozzá kvadruplikációban. A lemezeket 2 óra hosszat inkubáltuk 37 °C-on. PBS/tween-20-szal való 3-szori öblítés után a lemezeket 100 μΐ/lyuk peroxidázzal konjugált kecske anti-patkány IgG antitest (Tago, USA) 1:1000 hígitású 1% BSA/PBS oldatával inkubáltuk 1 óra hosszat 25 °C-on. 30 % ^H2°2^_t tartalmazó D-feniléndiaminnal (0.4 mg/ml foszfát citrát puffer, pH=5.0) színreakciót kaptunk. A reakciót 0.4 N H2SO4 hozzáadásával állítottuk le és az OD-t ELISA leolvasóval olvastuk le 492 nm-en. A IX. táblázatban közölt eredmények a PLNC antigén proliferáció százalékos szuppresszióját ábrázolják MBP-vel táplált patkányokból nyert SPC jelenlétében, összehasonlítva MBP-re adott válaszukkal kezeletlen patkányokból nyert SPC jelenlétében. Kimutattuk, hogy az MBP-vel táplált patkányokból nyert SPC (1.csoport) szuppresszálja a PLNC MBP válaszát (70 %). A T sejtek (2.csoport) vagy a szuppresszor/citotoxikus T limfociták (3.csoport) kimerítése megszünteti a szuppressziót. Mindamellett a segítő T limfociták (CD4, 4.csoport) kimerítése erősíti a PLNC anti-MBP proliferáció válaszának inhibícióját. A CD4 által kimerített SPC hígítása a szuppresszió csökkenését eredményezte 96 %-ról (1:1) 18 %-ra (1:100 SPC:PLNC aránynál).

Ezek az eredmények azt tükrözik, hogy a betegség inhibíciójáért és az in vitro antigénspecifikus celluláris válaszért felelős sejtek T sejt eredetűek és ezek szuppresszor/citotoxikus T limfociták.

-57• · · ····<♦ • ··· ··« ··· ·· • · · · · · ···· ··· ·· ·4 ··

IX. táblázat

PLNC anti-MBP válaszának szuppressziója MBP-vel táplált patkányokból nyert besugárzott SPC és alpopulációinak jelenlétében

Csoport	MBP-vel táplált patkány SPC	SPC:PLNC arány	PLNC MBP válasz %-os szuppresszió
1	teljes populáció	1:1	70
2	CD3 kimerített	1:1	-13
3	CD8 kimerített	1:1	-30
4	CD4 kimerített	1:1	96
	fi II	1:10	32
	II II	1:50	35
	II tf	1:100	18

Az MBP-vel táplált Lewis patkányokból a lépeket eltávolítottuk, a sejteket összegyűjtöttük, besugároztuk és leoltottuk MBP/CFA-val immunizált szingenikus patkányokból nyert válasz PLNC-vel együtt. Az SPC-t kezeletlen sejtekként, vagy CD3, CD4 vagy CD8 T limfocitákkal kimerítve használtuk, a kapcsoláshoz felhasználva a megfelelő monoklonális antitesteket és utána kimosva. Az eredményeket a PLNC MBP válasz szuppressziójának százalékában fejeztük ki, és a kezeletlen patkányokból nyert besugárzott SPC jelenlétében kapott PLNC válaszra vonatkoztattuk.

• · · »·· ·♦·

14. példa

Az MBP orális toleranciája által indukált Anti-MBP IqG termelés humorális szuppressziőia

Az MBP-vei táplált vagy kezeletlen Lewis patkányokat immunpróbának vetettük alá MBP-vel, keverve CFA-val emulzifikált ovalbuminnal (ÓVA). A patkányokból ezután különböző időpontokban vérmintákat vettünk, és a szérumot anti-OVA vagy anti-MBP antitestekre vizsgáltuk. A 6a. ábrán látható, hogy az ÓVA elleni IgG szérumszint az MBP-vel táplált patkányokban nem változott, míg az MBP-vel táplált patkányokban az MBP elleni szérum IgG szint csökkent (6b).

15. példa

Az IqG termelés in vitro szuppresszióiáért felelős sejttípusok meghatározása

MBP-vel táplált és nem táplált Lewis patkányokat immunizáltunk MBP+OVA/CFA-val. A PLN-t 12 nappal később távolítottuk el, és a PLNC-t 3 napig tenyésztettük MBP vagy ÓVA jelenlétében, a felülúszókat összegyűjtöttük, l:20-ra hígítottuk, és vizsgáltuk IgG-tartalmukat. Amint a X. táblázatban látható, a táplált patkányokból nyert PLNC a * · ··· ··· » ······ ··«· ·«· ·« ·· ··

-59(2.csoport) in vitro tenyésztve MBP-vel, kisebb választ adott MBP-re IgG termelésben kifejezve, mint a nem táplált patkányokból nyert PLNC (1.csoport, 45 % szuppresszió). Ugyanazokból a patkányokból nyert PLNC-ben az anti-OVA IgG termelés nem változott (4.csoport szemben az 5.csoporttal). Azonfelül az MBP-vel táplált és immunizált patkányokból nyert besugárzott PLNC-nek és az immunizált patkányok PLNCjének, melyet MBP-vel együtt tenyésztettünk, keverése csökkentette az utóbbi antitest termelését (3.csoport, 35 % szuppresszió), míg az ÓVA ellen termelt antitestek titere nem változott (6.csoport). Továbbá, a CD8+ sejtek eltávolítása megszüntette az anti-MBP antitestek szuppresszióját, kimutatva, hogy mind az adoptiv átvitelben és a proliferativ válaszokban a CD8+ sejtek felelősek a szuppresszióért.

-60X.táblázat

IgG szintek a felülúszóban

Csoport Válasz

Modulátor

In vitro

O.D. 492 sej t sej t stimulálás érték +/-S.D.

%-o immunizált

MBP-vel tápl.

és immunizált immunizált

MBP-vel tápl.

és immunizált immunizált immunizált

	MBP
-	MBP
MBP-vel tápl.	MBP
és immunizált
MBP-vel tápl.	MBP

és immunizált,

CD8+ kimerített

ÓVA

ÓVA immunizált MBP-vel tápl. ÓVA és immunizált

0.56+/-0.06

0.31+/-0.01

0.36+/-0.04

0.55+/-0.04

0.17+/-0.03

0.18+/-0.02

0.21+/-0.04 • · · · · · ·*· ··· ·« • · · · · ··· ♦· ·4 ··

-61Α patkányokat MBP+OVA/CFA-val immunizáltuk (kb. 3 nappal az

5. MBP-táplálás után). Húsz nappal később a PLNC-jüket eltávolítottuk és együtt tenyésztettük MBP-vel (1-4. csoportok), vagy OVA-val (5-7. csoportok) 3 napig. Néhány csoportban, az MBP-vel táplált és immunizált patkányokból nyert besugárzott PLNC-t besugároztuk, és együtt tenyésztettük immunizált PLNC-vel MBP jelenlétében (3.csoport), vagy ÓVA jelenlétében (7.csoport). Ezen stimulációk felülúszóit összegyűjtöttük, hígítottuk és ELISA-val mértük az IgG szinteket.

16.példa

Az MBP régió azonosítása, mely hatékonyan szuppresszália az EAEt, felhasználva az MBP átfedő szintetikus polipeptidét

Tengeri malac mielin alapú fehérje 1-37 aminosav fragment átfedő fragmentjeit szintetizáltuk szilárd fázisú peptid technikával. Houghten, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:51315135 (1985) . Ezen fragmenteket adagoltuk orálisan 15 mg teljes mielin alapú fehérjének megfelelő ekvimoláris koncentrációban. Az adagolás az immunizálást megelőző -7, -5, és -2 napokon történt. Az állatokat immunpróbának vetettük alá alapfehérjével Freundféle adjuvánsban, elfogadott módszer szerint, és megjelöltük.

Megvizsgáltuk a betegség jelenlététől és súlyosságától függően az állatok pusztulását. A XI. táblázatból látható, hogy a 6/6 kontroll állatok megbetegedtek, 3/6 mortalitással. Az állatokban, melyek átfedő peptid fragmenteket kaptak, csökkenő

-62mortalitást észleltek minden fragmentnél, kivétel az 1-10 fragmentek. A betegség súlyossága szempontjából a molekula 5. és

20. aminosav közötti része mutatta a betegség kifejezett csökkenését. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az 1-37 aminosav régióban, amely önmagában szuppresszogén fragment, a molekula specifikus részei többé kevésbé szuppresszivek lehetnek orális adagolás esetén.

XI.táblázat

MBP/CFA kapcsolt EAE

Fragment	Betegség esetszám	Átl. max pont	. Mortalitás
Kontroll(PBS)	6/6	3.8	3/6
1-10	5/5	3.8	4/5
5-15	4/5	2.1	1/5
11-20	4/5	2.0	0/5
16-25	4/5	2.6	0/5
21-30	5/5	3.0	1/5
26-36	4/6	2.6	1/6
31-37	5/6	3.3	0/6
Tengerimalac	mielin alapú	fehérje 1-37	régiójának átfedő

fragmentjeit szintetizáltuk szilárd fázisú peptid technikával.

Ezen fragmenteket orálisan adagoltuk 15 mg teljes mielin alapú proteinnek megfelelő ekvimoláris koncentrációban. Az adagolás az

-63• · · ··· «· · • ♦·♦ «·· ··· ·· • · · · · · ·*·*··· ·· ·· ·· immunizálást megelőző -7, -5, és -2 napokon történt. Az állatokat ezután immunpróbának vetettük alá az alapfehérjével Freund-féle adjuvánsban, elfogadott módszer szerint és megjelöltük.

17.példa

Annak bizonyítása, hogy a fehérje antigén orális adagolási módja meghatározza, melyik fraomentre kapunk immunválaszt

Az állatok teljes mielin alapú fehérjét kaptak talpban immunizálva Freund-féle adjuvánssál, vagy orálisan adagolva. 7-10 nappal ezután a lépet és a nyirokmirigyeket eltávolítottuk és in vitro újra-stimuláltuk az alapfehérje molekula különböző fragmentj eivel.

A XII. táblázat szerint, ha mielin alapú fehérjét Freund's adjuvánsban periferálisan adagoltunk, a primer válasz a 44-89 enkefalitogenikus részre jelentkezett, proliierációs mérés szerint. Azonban, a XIII. táblázat szerint, orális adagolás esetén, a primer válasz az 1-37 fragmentre, a nem-enkefalogenikus szuppresszor determinánsra jelentkezett.

-64··· *· · • « · * · * • ··« ··· »·· • · « · ♦»·«·· ·· ·· • · • · • · * ·

XII. táblázat

Proliferáció MBP fragmentekre teljes MBP-vel immunizált Lewis patkányokban

Beütés/perc Stimulációs index

Háttér	3292
Teljes MBP	10142	3.1
MBP fragment 1-37	3360	1.0
MBP fragment44-89	10054	3.0

Az állatokat 50 μς MBP-vel CFA-ban immunizáltuk a hátsó talpukban. Tíz nappal később a nyirokmirigyeket eltávolítottuk és in vitro stimuláltuk 10 μg MBP-vel vagy ekvimoláris MBPfragmentekkel.

-65« · • · • 4 ·

XIII. táblázat

Proliferáció MBP fragmentekre teljes MBP-vel orálisan táplált

Lewis patkányokban

LNC forrás	Teljes MBP	1-37	44-89
SPC	5.10 +/- 1.6	5.05 +/- 1.8	2.41 +/- 0.9
Bélfodor LNC	8.61 +/- 1.9	9.88 +/- 1.5	3.53 +/- 0.8
Nyakcsigolya	4.58 +/- 1.3	6.42 +/- 0.9	2.51 +/- 0.6

Az állatokat 1 mg teljes MBP-vel tápláltuk 3-szor, majd a táplálás után 15 nappal a különböző szervek sejtjeit eltávolitottuk és mértük a proliierációt. Az eredményeket a cpm*103 változásában fejeztük ki, összehasonlítva az önmagukban tenyésztett sejtekkel.

18. példa

Mvcobacterium tuberculosis vagy II. típusú kollagén táplálásának hatása adiuváns artritiszre

Mivel az AA-t M. tuberculosis tartalmú CFA indukálja, a probléma tanulmányozásának kezdeti megközelítéseként az állatokat változó adagú MT-vel tápláltuk. Váratlanul, • · · · « · ♦ « · • «·· ·* _Λ - ·»···· ······· *» · · «·

-66végtag-artritisz esetében a betegség szuppressziója nem jelentkezett a betegség kezdetekor, vagy maximális artritisz jelentkezett széles adagolási tartományban, amelyben 3 Mg, 30 M9> 300 M9 vagy 3 mg MT-t adagoltunk az immunizálást megelőző -7, -5, -2 napokon. A 3 előkezelt állatokra jellemző adatok láthatók a 7A. ábrán.

A patkányokban AA-val kollagénre kifejlődő autoimmunitás felfedezésére alapozva (Trentham, D. E. és társai, J. Clin. Invest. 66:1109 (1980)), a II. típusú kollagén orális adagolásának hatását vizsgáltuk AA-ra. A 7B ábrán és XIV. táblázatban látható, hogy ClI-vel előtáplált patkányok szignifikáns szuppressziót mutattak AA-ra, dózisfüggő módon, a legkifejezettebb hatás a 3 μς, illetve 30 μς ClI-vel táplált csoportokban mutatkozott. Alkalmi szuppresszió mutatkozott 300 MÜ esetén. 3Mg-mal, illetve 30 Mg-mal táplált állatokban a végtag-artritisz gyengébb és a betegség enyhébb volt, maximális artritisz pontban mérve. A betegség kialakulása szintén késett a 3 μg ClI-vel táplált állatokban. Annak meghatározására, vajon a CII orális adagolásának van-e nem-specifikus szuppressziv hatása a kísérleti autoimmun betegségekre, azonos dózis-tartományú ClI-vel tápláltak állatokat, melyeket CFA-ban oldott mielin alapú fehérjével immunizáltunk, kísérleti autoimmun enkefalomielitisz (EAE) indukciója céljából (Higgins, P. J. és társai, J. Immunoi. 140:440 (1988)). Semmilyen hatást nem tapasztaltunk az EAE kifejlődésére ClI-vel való táplálást követően.

• 9 ··

XIV. táblázat

Kollagén II táplálásának hatása az adjuváns artritiszre

Előkezelés

Végtagízület

Betegség kezdete • · «·· ·· • · • · « ·

Maximum artrit pontszám

kontroll	40/40	13.1 +/- 0.3	9.1 +/- 1.2
(puffer magában)
CII 0.3 Mg	19/20	12.6 +/- 0.2	9.6 +/- 1.4
CII 3 μς	26/36 a	15.3 +/- 1.1 b	5.1 +/- 0.9 c
CII 30 M9	30/40 a	13.7 +/- 0.4	6.2 +/- 0.7 b
CII 300 Mg	39/40	13.1 +/- 0.3	7.7 +/- 0.9
CII 1 mg	19/20	12.4 +/- 0.2	9.0 +/- 1.6

Lewis patkányokat tápláltunk pufferrel (kontroll csoport), illetve változó adagú ClI-vel a -7, -5 és -2 napokon 3-szor naponta, és a 0. napon 1 mg MT-t tartalmazó CFA-val faroktőben intradermálisan beoltottuk azokat, az adjuváns artritisz indukciója céljából. Az artritisz kiértékelése a 12-31. napokon, 2-3 naponta történt. A p értékek a ClI-vel táplált csoportokat reprezentálják a kontroliokkal (PBS-sel táplált) szemben.

ns = nem szignifikáns a_p < 0.001 kontrollal szemben b_p < 0.05 kontrollal szemben

Cp < 0.01 kontrollal szemben

-68• · · «···«» « ··· ··· ·»*4» • 4 · 9 ·· »«····· ·· ««99

19. példa

II. típusú kollagén és MT orális adagolását kővető késleltetett típusú hiperszenzitivitás (DTH) válaszok

A korábbi beszámolókból kitűnik, hogy a ClI-vel és az MT-vel szembeni immunitás az AA-ban fejlődik ki (Trentham, D. E. és társai, J. Clin. Invest. 66:1109 (1980)). DTH válaszokat állítottunk elő, hogy meghatározzuk a CII táplálás hatását az MT-re és ClI-re adott in vivő T-sejt válaszra. A 8A ábrán látható, hogy CA-val immunizált állatok DTH-t mutattak CII ellen, bár ez nem kifejezetten olyan hatású, mint a DTH MT ellen (8B ábra). Továbbá, a CII orális adagolása csökkentette a DTH válaszokat CII ellen AA állatokban, míg az MT-re adott DTH válaszban nem volt hatása. A CII által kiváltott DTH szuppresszió dózis-válasz tartománya azonos volt a betegség ClI-vel való szuppressziójáéval, vagyis a legjelentősebb szuppresszió a 3 pg 30 Mg tartományban jelentkezett. Megjegyezzük, hogy azokban az állatokban, melyeket csak 3 Mg-mal tápláltak azt követő immunizálás nélkül, Cll-re való érzékenyítés nem jelentkezett. Az antigén orális adagolását követő, MT-re adott celluláris immunválasz szuppresszióját vizsgáltuk a következőkben. A 9. ábrán látható, hogy a 3 pg és a 30 pg MT-vel táplált állatokban az MT-re adott proliferativ válasz szuppressziója jelentkezett. Hasonló szuppresszió jelentkezett a DTH válaszokban.

• · · «£ «··· ♦ ··· ··· ·· ····*· * · ···· ··· ·· ·· ··

20. példa

Adjuváns artritisz szuppressziója orálisan tolerizált patkányokból nyert T sejtek adoptiv átvitelével

Korábban kimutatták, hogy a mielin alapú fehérje orális adagolását követő EAE szuppressziója adoptivan átvihető a táplált állatok lép T sejtjei segítségével (Lider, 0., és társai, J. Immunoi. 142:748-752 (1989)), és hasonló eredményeket kaptunk az autoimmun uveitis modelben is. A XV. táblázatban látható, hogy az AA elleni védelem adoptivan átvihető naiv patkányokba, ClI-vel tolerizált patkányokból származó lép T sejtekkel. A védelem még kifejezettebb, ha a splenocitákat a -2. napon visszük át, és ha a T sejteket B sejtekkel szemben visszük át.

-70• w * ···%·« ··· «··99 • · ·· w · ···· ··· V· 99♦ ·

XV. táblázat

Nem-porcos kollagén táplálásának hatása adjuváns artritiszre

Előkezelés	Végtagízület	Betegség kezdete	Maximum artrit pontszám
kontroll (puffer magában)	20/20	12.6 +/- 0.7	9.7 +/- 1.9
Cl 3 μσ	9/16 a	16.3 +/- 3.6	5.2 +/- 2.5 b
Cl 30 μg	18/20	14.0 +/- 1.5	4.2 +/- 0.6 c
Cili 3 μg	18/20	14.4 +/- 0.5 b	7.2 +/- 2.0
cm 30 μg	18/20	14.5 +/- 0.6 b	6.3 +/- 0.7

Lewis patkányokat tápláltunk változó fokozatú Cl-el és CHI-mal 3-szor naponta, a -7. , -5. és -2. napokon (a kontroll állatokat csak pufferrel tápláltuk). A p-értékek a táplálást reprezentálják a kontrollal szemben, ns = nem szignifikáns. a_p < 0.01 kontrollal szemben b_p < 0.04 kontrollal szemben c_p < 0.001 kontrollal szemben

-ΊΧ♦ · ···· ·· · · * » • · ♦ ·*···· • ··· ··· ·«· · · • · * · · ·

21. példa

Az AA szuppressziőja CII orális adagolásával a betegség kezdete után

Annak meghatározására, hogy CII táplálása javíthat-e a már létrejött AA-n, állatokat tápláltunk ClI-vel a betegség kezdete után. Az artritisz kezdeti jelei a 13-14. napon jelentkeztek, a betegség CFA-val való indukciója után. A 17. napon az állatokat a betegség súlyossága szerint két csoportra osztottuk. A kontroll csoport kezeletlen maradt, míg a kezelt csoport 3 pg ClI-t kapott orálisan, 3-szór egy héten, másnapos intervallumokban. Mindkét csoport állatait pontoztuk artritiszre a 34. napig. A 10. ábrán látható, hogy a ClI-vel kezelt állatok enyhébb artritiszt mutattak és hamarabb meggyógyultak, mint a kontroll csoport.

22. példa

Nem-porcos kollagén táplálásának hatása az AA-ra

Bár a CII molekuláris szerkezete nagyon közel áll a többi kollagénhez, mint például az I. típusú (Cl) és a III. típusú (Cili) kollagénhez, ezen kollagének megoszlása teljesen különböző (Seyer, J. M., és társai, In: Textbook of Rheumatology, 3rd ed. (Kelly és társai, eds.), p. 22, Saunders, Philadelphia (1989)). Míg a CII általában az ízületek porcaiban van jelen, az I. és III. típusú kollagén főleg a csontokban, bőrben és egyéb lágy • · ···· · * ·· ·· ··· ·»·«·· • ··· ··· ··· ·· « ······ ······· ·· ·· ··

-72szövetekben fordul elő. A XVI. táblázatban látható, hogy a Cl orális adagolása szuppresszálja az AA-t, ahogy az izületi artritisz és a betegség súlyossága mutatja, ugyanabban a dózis tartományban, mint CII esetében. Cili-mai táplált állatok esetében késleltetés mutatkozott a betegség kezdetében, de nem volt szignifikáns hatása a betegség súlyosságára. Mielin alapú fehérje, egy irreleváns fehérje antigén orális adagolása nem szuppresszálta az AA-t.

• ···· *· ·· • ··· ··· ··· • · · «···· ·· ··

XV. táblázat

Adjuváns artritisz szuppressziója ClI-vel orálisan tolerizált patkányokból nyert splenociták adoptiv átvitelével

Donor Átvitt sejtek	Átvitel	Végtagízület Betegség	Art
	napj a	kezdete	pon
I. kísérlet

normál	splenociták	0	20/20	13.6+/-0.2	11.
ClI-vel	splenociták	0	17/20	14.0+/-0	6.
táplált
normál	splenociták	-2	20/20	13.8+/-0.2	9.
ClI-vel	splenociták	-2	8/20b	15.2+/-0.7c	2.
táplált

II. kísérlet

1	normál	splenociták	-2	20/20	13.8+/-0.2	9.
2	ClI-vel	lép B sejtek	-2	20/20	13.8+/-0.2	8.
	táplált
3	ClI-vel	Lép T sejtek	-2	16/20	14.0+/-0.5	4.

táplált

Donor Lewis patkányokat vagy nem tápláltunk (normál), vagy előtápláltunk 3 μg ClI-vel 3-szór, 2-3 naponként. A lépeket az • · · · · · · · ·· ·· «·· ··*··· • · · · · · · ··· ·· ······· · · ·· ··

-74utolsó táplálás után 7 nappal távolítottuk el és 1*10® splenocitát vagy nylon szűrőn szeparált B- (tapadó), illetve Tsejtet (nem tapadó) vittünk át i.p. injekcióval minden recipiensbe, melyeket az adoptiv átvitel után rögtön vagy 2 nappal később AA-ra indukáltunk.

ap	<	0.05,	2.	csoport 1.	csoporttal	szemben
bP	<	0.001,	4	. csoport 3	. csoporttal	szemben
CP	<	0.01,	4.	csoport 3.	csoporttal	szemben
dP	<	0.05,	3.	csoport 1.	csoporttal	szemben

A fenti limfocita proliferáció és DTH kísérletek jelzik, hogy az MT orális adagolása szuppresszálja a celluláris immunválaszt MT-vel szemben, anélkül, hogy a klinikai betegséget gátolná. Mindamellett, a celluláris immunitást MT-vel szemben az orális tolerancia nem alapvetően szuppresszálja és lehetséges, hogy az étrend, amely nagy hatással van az MT immunitás szuppressziójára, szuppresszálhatja a betegséget. Ebben a tekintetben, mások kimutatták az AA szuppresszióját, 65 kd HSP olajban adagolásával (Billingham, Μ. E. J., és társai, J. Exp. Med. 171:339 (1990), vagy MT intradermális vagy intravénás adagolásával (Larsson, P., és társai, J. Cell. Biochemistry 40:49 (1989); Gery, I., és társai, Int. Arch. Allergy 31:57 (1967)).

Az AA szuppressziója CII orális adagolásával azt sugallja, hogy egyrészt patogén immunitás fejlődik ki az AA-ban ClI-re, másrészt keresztreagáló epitópok vannak az MT és CII között. Megjegyezzük, hogy a CII T sejtvonalakról úgy számoltak be, hogy azoknak kis hatásuk van az AA javulására T sejt vakcinával (Holoshitz, J. és társai, Science 219:56 (1983), míg a CIA enyhe • ·· • · ·

-75szuppresszióját tapasztalták 65 kd HSP-vel (Billingham, Μ. E. J., és társai, J. Exp. Med. 171:339 (1990)). Néhány kutató beszámolt az AA szuppressziójáról intravénásán adagolt ClI-vel (Phadke, K., és társai, Arthritis Rheum. 27:797 (1984)), holott ebben a kérdésben nem volt általános egyetértés (Cremer, M. A., és társai, J. Immunoi. 131:2995 (1983)). Kísérleteink azt sugallják, hogy a kutatók eredménytelensége az AA ClI-nek intravénás adagolásával való szuppressziójának kimutatásában (Cremer, M. A., és társai, J. Immunoi. 131:2995 (1983)) túl nagy adagok, azaz 1 mg, alkalmazásához kapcsolódhat. Előzetes kísérletekben az MT és CII között némi kereszt-reaktivitást tapasztaltak proliferációs mérésekben, de meghatározatlan maradt, hogy vajon az AA szuppressziója orális CII adagolással kapcsolódik-e az MT és CII közötti kereszt-reaktivitáshoz. Nem találtak aminosav sorrend homológiát a csirke II típusú kollagén és az MT 65 kd hőkezelt fehérje 180-188 peptid között. Utóbbiról azt találták, hogy stimulálja az artritiszt közvetítő klónokat patkányokban (van Edén, W., és társai, Natúré 331:171 (1988)). Nemrég egy ClI-ből nyert 26 aminosav szekvenciáról számoltak be, amely szuppresszálja a kollagén indukált artritiszt (Myers, L. K., és társai, J. Exp. Med. 170:1999 (1989)), azonban semmi homológot nem találtak ezen peptid és a 65 kd peptid között. Világos, hogy megadva az MT és a CII méretét, keresztreagáló epitópok lehetnek jelen, melyek nem könnyen azonosíthatók. Alternatívan, az MT izületi károsodást indukálhat, mely patogén immunválaszhoz vezet ClI-re.

Kimutatták, hogy aktív szuppresszió lép fel az antigén orális adagolását követően (Ngan, J., és társai, J. Immunoi.

• · ···· · · ·· ·· • · · ♦ · · · ··· ·· ······ ······· ·· ·· * ·

-76120:861 (1978); Mattingly, J. A., és társai, J. Immunoi. 125:1044 (1980); Mattingly, J. A., Cell. Immunoi. 86:46 (1984); Zhang, Z. , és társai, Cell. Immunoi. 104:426 (1987), és hogy az EAE szuppresszálható orálisan tolerizált állatokból nyert CD8⁺ T sejtek adoptiv átvitelével (Lider, 0., és társai, J. Immunoi. 142:748-752 (1989).

23. példa

Multiple szklerózisban szenvedő páciensek kezelése

A kezeléshez marha mielin extraktumot használtunk, melyet a

BioPure, Boston, Massachusetts állított elő. A marha mielin állatokban nem toxikus, és hatásos a krónikus visszaeső EAE gyógyításában. A BioPure marha mielin termékét szukróz gradienssel állítottuk elő sűrűség-centrifugálással egy Sharples centrifugában és SDS page elektroforézissel analizáltuk. A mielint marha agyból extraháltuk, melyet helyi vágóhidakról szereztünk be Massachusettsben, vizsgáltuk a tisztaságát és tételről tételre standardizáltuk agaróz gél elektroforézissel, fehérje meghatározással, lipid analízissel, aminosav meghatározással és immunreaktivitással. Szintén vizsgáltuk baktériumok és vírusok jelenlétére.

A mielint 100 mg-os kapszulákban adagoltuk multiple szklerózisos betegeknek, 3-szor naponta, 600 mg-os teljes napi adagban.

• · • · · · • ··· ··· ··· ·· • · · · · · ······· · · ·· ··

24. példa

Autoimmun artritiszes páciensek kezelése

A kezelésre használt II. típusú kollagén egy CII készítmény a Genzyme Corporationtól, Boston, Massachusetts (oldható csirke II típusú kollagén). Ez a készítmény hatásos az adjuváns artritisz gyógyításában.

A ClI-t orálisan adagoltuk autoimmun artritiszes betegeknek 10 Mg-ostól 100 mg-os napi adagokban. A ClI-t száraz vagy folyadékban oldott formában adagoltuk, a beteg által tolerálható adagokban. Előnyösen, 100 μg-ostól 30 mg-os teljes napi adagban adagoltuk. Ilyen adag többszörös dózisban adagolható, hogy biztosítsa a betegnek a teljes napi dózist. Előnyösen, naponta 3-szór adagolható.

A találmány ismertetése során a hivatkozásokat referenciaként említettük meg. A találmány teljes ismertetése során a megfelelő szakmai gyakorlattal rendelkezők számára világossá vált, hogy a találmány kivitelezése során a körülményeknek, paramétereknek, stb. azonosnak kell maradniuk, a találmány, vagy annak bármely kivitelezési módja korlátozása nélkül.

Claims (25)

1. Eljárás egy T-sejt által közvetített vagy T-sejttől függő autoimmun betegség kezelésére az ilyen kezelés igénye esetén, azzal jellemezve, hogy az eljárás az említett alanynak egy autoantigénnel, az említett autoantigén biológiailag aktív fragmentumával, vagy az említett autoantigénnel szerkezetileg rokon analóggal történő orális kezeléséből áll, a kezelés az említett autoimmun betegség során hatásos mennyiséget alkalmaz, és a kezelés az autoimmun betegségnek az említett alanyban való előfordulása után történik.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett autoimmun betegség EAE.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett autoimmun betegség multiple szklerózis.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett autoimmun betegség artritisz.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett autoimmun betegség reumatoid artritisz.

6. A 4. vagy az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett autoantigén II. típusú kollagén.

• · · · · · • · t • ·*« • « • · · · · · · a · e

• · · « ·

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett artritisz kezelésére alkalmas mennyiség 10 μg - 100 mg per nap.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett artritisz kezelésére alkalmas mennyiség 100 μg - 30 mg per nap.

9. Eljárás egy T-sejt által közvetített vagy T-sejttől függő autoimmun betegség kezelésére az ilyen kezelés igénye esetén, azzal jellemezve, hogy az eljárás az említett alanynak egy autoantigénnel, az említett autoantigén biológiailag aktív fragmentumával, vagy az említett autoantigénnel szerkezetileg rokon analóggal történő orális kezeléséből áll, a kezelés az említett autoimmun betegség során hatásos mennyiséget alkalmaz, és a kezelés az autoimmun betegségnek az említett alanyban való előfordulása előtt történik.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett autoimmun artritisz reumatoid artritisz.

11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett autoimmun artritisz adjuváns artritisz.

12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett autoantigén II. típusú kollagén.

13 . Az 1. vagy a 9. igénypont szerinti élj árás, azzal j ellemezve, hogy az említett alany emlős. 14. Az 1. vagy a 9. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy az említett emlős humán.

15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett artritisz kezelésére alkalmas mennyiség 10 gg - 100 mg per nap.

16. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett artritisz kezelésére alkalmas mennyiség 100 gg - 30 mg per nap.

17. Az 1. vagy a 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett alanyt az említett autoantigénnel orálisan kezeljük.

18. Az 1. vagy a 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett alanyt az említett autoantigénnel enterálisan kezeljük.

19. Egy orálisan alkalmazandó gyógyszer, azzal jellemezve, hogy az egy autoantigént, az említett autoantigén biológiailag aktív fragmentumát, vagy az említett autoantigénnel szerkezetileg rokon analógot tartalmaz, ahol az említett autoantigén, az említett fragmentum, és az említett analóg orális dózisformában található.

9 · • 4 • · · a · · «·····« · · *c · ·

20. A 19. igénypont szerinti orálisan alkalmazandó gyógyszer, azzal jellemezve, hogy az említett autoantigén mielin alapú fehérje.

21. A 20. igénypont szerinti orálisan alkalmazandó gyógyszer, azzal jellemezve, hogy az említett mielin alapú fehérjét a szarvasmarha és a tengerimalac mielin alapú fehérjék csoportjából választjuk ki.

22. A 21. igénypont szerinti orálisan alkalmazandó gyógyszer, azzal jellemezve, hogy az említett mielin alapú fehérje tengerimalac mielin alapú fehérje.

23. A 22. igénypont szerinti orálisan alkalmazandó gyógyszer, azzal jellemezve, hogy az említett fragmentum a 7584., 1-37., 44-89., és 90-170. aminosavakat tartalmazza.

24. A 21. igénypont szerinti orálisan alkalmazandó gyógyszer, azzal jellemezve, hogy az említett mielin alapú fehérje szarvasmarha mielin alapú fehérje.

25. A 24. igénypont szerinti orálisan alkalmazandó gyógyszer, azzal jellemezve, hogy az említett mielin alapú fehérje az említett orális dózisforma esetén 100 mg egyéni dózis.

26. A 24. igénypont szerinti orálisan alkalmazandó gyógyszer, azzal jellemezve, hogy az említett mielin alapú ·»· · 4 · 9 4· « ··· ·4· ·4·4* • « 4 · ·4» ··>· ··· 4· *···

-82fehérje az említett orális dózisforma esetén 600 mg egyéni dózis.

27. A tengerimalac mielin alapú fehérjéből legalább egy fragmentumot tartalmazó készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett fragmentumot az 1-37., 44-89., 75-84., és 90-170. aminosavak csoportjából választjuk ki.