NO314878B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasöytisk preparat for behandling av reumatoid artritt og multippel sklerose - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasöytisk preparat for behandling av reumatoid artritt og multippel sklerose Download PDFInfo
- Publication number
- NO314878B1 NO314878B1 NO19931372A NO931372A NO314878B1 NO 314878 B1 NO314878 B1 NO 314878B1 NO 19931372 A NO19931372 A NO 19931372A NO 931372 A NO931372 A NO 931372A NO 314878 B1 NO314878 B1 NO 314878B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- mbp
- rats
- collagen
- suppression
- animals
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 24
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 title claims description 14
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims description 13
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 title claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 52
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 claims description 31
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 claims description 31
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 claims description 29
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 claims description 29
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 claims description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 23
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 7
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 claims description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 83
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 abstract description 33
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 31
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 143
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 139
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 139
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 108
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 71
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 65
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 56
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 54
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 53
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 53
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 37
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 34
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 33
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 33
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 30
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 29
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 29
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 25
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 25
- 230000004044 response Effects 0.000 description 22
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 20
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 18
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 17
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 16
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 16
- 230000001712 encephalitogenic effect Effects 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 15
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 14
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 14
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 14
- 101001018322 Sus scrofa Myelin basic protein Proteins 0.000 description 13
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 13
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 12
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 12
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 12
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 7
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 5
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 3
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 3
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010023232 Joint swelling Diseases 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 101000650578 Salmonella phage P22 Regulatory protein C3 Proteins 0.000 description 3
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 3
- 101001040920 Triticum aestivum Alpha-amylase inhibitor 0.28 Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 206010052804 Drug tolerance Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 201000004982 autoimmune uveitis Diseases 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 2
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010071155 Autoimmune arthritis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101001018362 Bos taurus Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013142 Disinhibition Diseases 0.000 description 1
- 206010014025 Ear swelling Diseases 0.000 description 1
- 206010017577 Gait disturbance Diseases 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010021639 Incontinence Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000011644 Neurologic Gait disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010033885 Paraparesis Diseases 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 206010037714 Quadriplegia Diseases 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009171 T-cell vaccination Methods 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- LEBBDRXHHNYZIA-LDUWYPJVSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] n-[(z)-1,3-dihydroxyoctadec-4-en-2-yl]carbamate Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C/C(O)C(CO)NC(=O)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LEBBDRXHHNYZIA-LDUWYPJVSA-N 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000000599 auto-anti-genic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 238000011970 concomitant therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 230000002888 effect on disease Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 208000010726 hind limb paralysis Diseases 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000001175 peptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001005 suppressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000024664 tolerance induction Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
- A61K39/36—Allergens from pollen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører feltet behandling av autoimmunsykdommer og spesielt T-celle-medierte eller T-celle-avhengige autoimmunsykdommer. Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av reumatoid artritt og multippel sklerose.
I. Autoimmuns<y>kdommer generelt
Autoimmunsykdommer forårsakes av en anormal immunrespons som innbefatter enten celler eller antistoffer rettet mot normalt vev. Et antall strategier er utviklet for å undertrykke autoimmunsykdommer, hovedsakelig legemidler som uspesifikt undertrykker immunresponsen. En fremgangsmåte for å indusere immunologisk toleranse ved oral administrering av et antigen for å forhindre autoimmunresponser ble først demonstrert av Wells i 1911: Wells, H., J. Infect. Dis. 9: 147 (1911). Den orale induksjonen av uimottagelighet er også demonstrert for flere T-celle avhengige antigener. Antigen-drevet perifer immuntoleranse ved den orale fremgangsmåten har i den senere tid vist seg å være en effektiv immunregulatorisk, terapeutisk tilnærmelse i flere eksperimentelle autoimmunsykdommer (Higgins, P.J., et al., J. Immunol. 140:440 (1988); Lider, 0., et al., J. Immunol. 142:748-752 (1989); Bitar, D.M., et al., Cell. Immunol. 112:364 (1988); Nussenblatt, R.B., et al., J. Immunol. 144:1689
(1990); Nagler-Anderson, C, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:7443-7446 (1986); Thompson, H.S.G., et al., Clin. Exp. Immunol. 64:581-586 (1986).
II. Eksperimentell allergisk encefalomyelitt
Forskere har videre undersøkt fremgangsmåter for å undertrykke autoimmunsykdommer i forskjellige dyremodeller. Eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE) er en T-celle-mediert autoimmunsykdom rettet mot myelin basal protein (MBP) og er undersøkt som en modell for multippel sklerose i flere pattedyr spesies. Se Alvord, E., et al., Experimental Allergic Encephalomyelitis - A Useful Model For Multiple Sclerosis (Allan R. Liss, New York, 1984). Immunoregulering av EAE er kjent som i det minste delvis avhengig av suppressor T-celler (Ts). Det er vist at Ts er til stede i rotter som har kommet seg fra EAE. Swierkosz, J. et al., J. Immunol. 119:1501 (1977). Videre er det vist at suppressor T-celler er ansvarlige for uimottageligheten overfor EAE som vises av visse musestammer. Lando, Z. et al., Nature 287:551 (1980).
Forskjellige fremgangsmåter har vært anvendt for å indusere antigenspesifikk undertrykkelse av EAE. F.eks. har immunisering med MBP emulgert i ufullstendig
Freund's adjuvans, som vist av Lando, Z. et al., J. Immunol. 126:1526 (1981), og intravenøs injeksjon av MBP-konjugerte lymfoidceller som vist av Sriram, S. et al., Cell. Immunol. 75:378 (1983), vært anvendt.
Tre artikler av Alvord et al. er rapportert i Annals of Neurology i bind 6, på sidene hhv. 461-468, 468-473 og 474-482 (1979). Den første og andre av disse artiklene beskriver undertrykkelsen av EAE i aper ved parenteral administrering av MBP bare ved administrering sammen med en ikke-spesifikk adjunktiv faktor, f.eks. et antibiotikum eller et steroid. Den tredje rapporten beskriver nærværet i cerebrospinalvæsken av pasienter med multippel sklerose av flere proteaser som nedbryter MBP til antigenisk aktive peptidfragmenter.
Artikler av Traugott et al., J. Neurological Science 56:65-73 (1982), og Raine et al., Lab. Investigation 48:275-84 (1983) beskriver at behandling av en stamme av marsvin som lider av kronisk tilbakevendende EAE ved parenteral administrering av MBP alene eller i ufullstendig Freund's adjuvans (IFA) eller i kombinasjon med et flytende hapten av myelin, nemlig galaktocerebrosid, undertrykket de kliniske symptomene av EAE. Videre beskriver McKenna et al., Cell. Immun. 81:391-402 (1983), at preinjeksjon av rotter med marsvin MBP koblet til syngeniske miltleukocytter eller til syngeniske røde blodceller undertrykket den etterfølgende induksjonen av EAE ved anvendelse av marsvin MBP i Freund's komplette adjuvans. Graden av undertrykkelse korrelerte positivt med mengden MBP administrert.
En rapport av Strejan et al., Cell. Immun. 84:171-184 (1984), beskriver at preinjeksjon av rotter med marsvin MBP innkapslet i fosfatidylserinliposomer undertrykket de kliniske tegnene og symptomene på EAE som opptrer i rotter injisert med marsvin MBP i komplett Freund's adjuvans.
En artikkel av McKenna et al., Cell. Immun. 88:251-259 (1984), beskriver at de undertrykkende effektene av injiserte marsvin MBP leukocyttkomplekser beskrevet i deres rapport fra 1983 ble opphevet når dyrene ble forbehandlet med cyklofosfamid, et legemiddel som inhiberer produksjonen av suppressor T lymfocytter.
En rapport av Krasner et al., Neurology 36:92-94 (1986) beskriver at syntetisk C kopolymer I, som undersøkes som en behandling for multippel sklerose fordi den beskytter dyrene mot EAE, ikke viser immunologisk kryssreaktivitet med MBP.
I tillegg beskriver Belik et al., Vopr. Med. Khim. 24:372-377 (1978), parenteral administrering av "alkalisk myelin proteinfragment" og "syntetisk encefalitogenisk peptid" til marsvin med EAE. Dyrene kom seg etter administrering av "alkalisk myelin proteinfragment" til dyrene sensitisert med bovint "alkalisk myelin proteinfragment" eller ved "syntetisk encefalitogenisk peptid".
Tidligere undersøkelser i EAE og EAU demonstrerte at økende doser av MBP eller S-Ag var forbundet med bedre sykdomsbeskyttelse (Higgins, P.J., et al., J. Immunol. 140:440 (1988); Nussenblatt, R.B., et al., J. Immunol. 144:1689 (1990)) og generelt har forskere rapportert forbedring av oral toleranse ved tilførsel av større mengder antigen (Mowat, A.M., Immunol. Today 8:93 (1987)).
En rapport har antydet at EAE kan undertrykkes ved adoptiv overføring av CD8<+> T-celler fra dyr som oralt har utviklet toleranse (Lider, 0., et al., J. Immunol. 142:748-752(1989)).
Imidlertid er det ikke kjent innen teknikken med hell å behandle EAE etter at EAE har manifestert seg i det angrepne dyret. Videre er det ikke kjent innen teknikken på vellykket måte å behandle multippel sklerose etter at multippel sklerose har manifestert seg i pasienten. Det foreligger følgelig fremdeles behov for en fremgangsmåte for undertrykkelse og behandling av multippel sklerose.
III. Adjuvans artritt
Adjuvans artritt (AA) er en eksperimentell modell for inflammatorisk leddsykdom og spesielt en modell for reumatoid artritt. Adjuvans artritt induseres ved intradermal injeksjon av en suspensjon av Mycobacterium tuberculosis (MT) i olje (Pearson, C.M., J. Chronic Dis. 16:863-874 (1963)). Mellom 10 og 15 dager etter injeksjonen utvikler dyrene en alvorlig, progressiv artritt.
På grunn av dens likhet med human reumatoid artritt når det gjelder både kliniske og histopatologiske trekk (Jasin, H.E., Federation Proe. 32:147 (1972) ), har AA vært anvendt som en modell for å undersøke mekanismer for immunmediert leddsykdom og for å undersøke fremgangsmåter for behandling av en organspesifikk autoimmunsykdom.
Adjuvans artritt er en cellemediert autoimmunsykdom og kan overføres ved cellepopulasjoner eller ved T-celle kloner spesifikke for MT (Taurog, J.D., et al., Cell. Immunol. 75:271 (1983); Taurog, J.D., et al., Cell. Immunol. 80:198 (1983); Cohen, L.R., et al., Arthritis and Rh em. 28:841 (1985) ). Undersøkelser har antydet at det primære autoantigenet i adjuvans artritt er et 65-kd mycobakterielt varmesjokkprotein (HSP) (van Eden, W. et al., Nature 331:171 (1988)). Dette proteinet synes også å være viktig i streptokokkisk celleveggartritt (DeJoy, S.Q., et al., J. Exp. Med. 170:369
(1989); van den Broek, M. et al., J. Exp. Med. 170:449 (1989)). Immunitet overfor type II kollagen er vist å eksistere i adjuvans artritt (Trentham, D.E. et al., J. Clin. Invest. 66:1109 (1980)).
Utvikling av toleranse etter oral eller intravenøs administrering av kollagen er vist å undertrykke en annen type artritt betegnet kollagenindusert artritt (CIA). Undertrykkelse av CIA i DBA mus ved oralt administrerte type II kollagener (CII) er doseavhengig og undertrykkelse observeres når 0,5 mg, men ikke 3 mg, ble gitt 8 ganger i løpet av en to ukers periode (Nagler-Anderson, C, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:7443-7446
(1986)). Tilsvarende resultater ble rapportert for CIA i rotter med større beskyttelse når CII ble gitt ved 2,5 ug/g enn 25 ug/g (Thompson, H.S.G., et al., Clin. Exp. Immunol. 64:581-586 (1986) ). Når det gjelder i.v. toleranseutvikling ble 1 mg gitt for å undertrykke CIA i DBA mus (Myers, L.K., et al., J. Exp. Med. 170:1999 (1989)).
Adoptiv overføring av beskyttelse for CIA artritt er rapportert for dyr behandlet intravenøst med CII (Myers, L.K., et al., J. Immunol. 143:3976 (1989)), men ikke for oral toleranseutvikling (Nagler-Anderson, G, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:7443-7446 (1986); Thompson, H.S.G., et al., Clin. Exp. Immunol. 64:581-586
(1986)).
Imidlertid har det ikke tidligere vært kjent at oral administrering av CII undertrykker AA, dyremodellen for human reumatoid artritt, og at denne undertrykkelsen adoptivt kan overføres ved milt T-celler fra Cll-tilførte dyr.
Følgelig foreligger det et behov for behandling av autoimmunsykdommer, og spesielt for behandling av T-celle-formidlede eller T-celle-avhengige autoimmunsykdommer.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av reumatoid artritt, kjennetegnet ved at den innbefatter blanding av type II kollagen, et biologisk aktivt fragment av nevnte type II kollagen eller en analog strukturelt beslektet med nevnte type II kollagen, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient egnet for oral eller enteral administrasjon, hvori bæreren eller eksipienten innbefatter et tørt pulver, næringsbestanddeler, vandig eller ikke-vandig løsemiddel, suspenderingsmiddel eller emulgeringsmiddel, og hvori mengden av nevnte type II kollagen, nevnte fragment, eller nevnte analog er tilstrekkelig til å levere mellom 10 mikrogram og 100 milligram til en pasient per dag.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av multippel sklerose, kjennetegnet ved at den innbefatter blanding av bovint myelin, et biologisk aktivt fragment av nevnte bovine myelin eller en strukturelt beslektet analog av nevnte bovine myelin, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient egnet for oral eller enteral administrasjon, hvori bæreren eller eksipienten innbefatter et tørt pulver, næringsbestanddeler, vandig eller ikke-vandig løsemiddel, suspenderingsmiddel eller emulgeringsmiddel, og hvori mengden av nevnte bovine myelin, nevnte fragment eller nevnte analog er tilstrekkelig til å levere til en pasient mellom 1 og 1000 mg per dag.
FIGURBESKRIVELSE
Fig. 1: Antigen spesifisitet for oralt indusert undertrykkelse av den proliferative responsen i Lewis rotter. Dyrene ble tilført 500 ug av MBP eller BSA på dager -7, -5 og -2, deretter immunisert med 100 fig MBP i CF A på dag 0. Ni dager etter immunisering ble lymfeknuter fjernet og proliferativ respons overfor MBP, BSA og PPD (alle ved 50 Hg/ml) bestemt som beskrevet i Eksempel 3. Stimuleringsindeks = eksperimentell cpm/kontroll cpm. Fig. 2: Oralt indusert undertrykkelse av adjuvans artritt, målt ved leddsvelling.
Fig. 3: Protokoll for indusering av tilbakevendende EAE i mus.
Fig. 4: Oralt indusert undertrykkelse av lymfoid cetleproliferering i SJL mus. Dyrene ble tilført 400 ug MBP 7 ganger i løpet av en to ukers periode og immunisert med 400 ug MBP i CFA (0,6 mg/ml M. tuberculosis). Stimuleringsindeks er MBP-indusert proliferasjon dividert med bakgrunn. Fig. 5: Antigen spesifikk undertrykkelse av popliteal dreneringslymfeknutecelle (PLNC) responser ved milt og mesenteriske lymfeknuteceller (LNC) oppnådd fra myelin basal protein (MBP) tilført rotter. Resultatene er uttrykt som prosent undertrykkelse av PLNC til MBP (sirkler) som til Mycobacterium tuberculosis (firkanter). Lukkede sirkler eller lukkede firkanter representerer responsen av miltceller. Åpne sirkler eller åpne firkanter representerer responsen av mesenteriske lymfeknuteceller. Fig. 6: Spesifikk undertrykkelse av IgG responser til MBP etter oral MBP tilførsel. Blod ble tatt fra rotter med intervaller og sera ble undersøkt for anti-OVA (Fig. 6A, åpne sirkler) eller anti-MBP (Fig. 6B, åpne firkanter) antistoffer. Disse sera ble sammenlignet med sera oppnådd fra uforede og tilleggstilførte dyr (lukkede symboler). Resultater er uttrykt som ELISA O.D. 492 nivåer + S.D. Fig. 7: Lewis rotter ble foret med MT (A) eller CII (B) på dag -7, -5 og -2. Dyr ble deretter intradermalt injisert med CFA inneholdende 10 mg/ml av MT ved halebasen på dag 0 for induksjon av AA. Med begynnelse på dag 13 ble dyrene undersøkt vedrørende kliniske tegn på AA og ble tilskrevet individuell scoring, "arthritis scoring" reflekterer den gjennomsnittlige arthritis scoringen (sum for de fire potene) fra 5-10 individuelle rotter i hver gruppe for hvert tidspunkt. Fig. 8: Lewis rotter ble tilført enten buffer alene (kontroll), eller varierende doser CII som angitt, på dager -7, -5 og -2. Dyrene ble deretter immunisert intradermalt med CFA inneholdende 10 mg/ml MT ved basen av halen. En måned senere ble dyrene tilført enten 20 ug CII (A) eller 10 ug MT (B). Øretykkelse ble målt før og 48 timer etter injeksjon. P-verdier sammenligner tilførte dyr mot kontroll, ns = ikke signifikant. Fig. 9: Lewis rotter ble tilført varierende doser av MT på dag -7, -5 og -2 og ble immunisert på dag 0 med 0,1 ml CFA ved halebasen. Drenerende lymfeknuter ble samlet 9 dager senere og proliferative responser ble målt. Fig. 10: Lewis rotter ble indusert for arthritis ved intradermal injeksjon av CFA inneholdende 10 mg/ml MT. Innledende tegn på arthritis kom til syne 13-14 dager etter sykdomsinduksjon. På dag 17 ble dyrene separert i to grupper avhengig av sykdomsgraden. Kontrollgruppen forble ubehandlet, mens den behandlede gruppen fikk 3 ug CII oralt tre ganger pr. uke med intervaller på annenhver dag. Dyrene i begge grupper ble undersøkt vedrørende artritt inntil dag 34. Data er uttrykt som gjennomsnittlig arthritis scoring + standardavvik.
I. Definisjoner
I beskrivelsen som følger er et antall uttrykk anvendt innen immunologien benyttet omfattende. For å tilveiebringe en klar og konsis forståelse av beskrivelsen og kravene, innbefattende rammen som skal gis slike betegnelser, er følgende definisjoner tilveiebrakt.
Autoimmunsykdom. En autoimmunsykdom er en feilfunksjon av immunsystemet til et dyr, innbefattende mennesker, hvori immunsystemet ikke er i stand til å skille mellom fremmede stoffer i dyret og stoffer som er del av dyrets normale sammensetning.
Autoantigen. Et "autoantigen" er et hvilket som helst stoff som normalt finnes i et dyr som, i en anormal situasjon så som en autoimmunsykdom, ikke lenger erkjennes som del av dyret selv av lymfocyttene eller antistoffene til dyret, og derfor angripes av det immunregulatoriske systemet som om det var et fremmedstoff.
Biologisk aktive fragmenter. Betegnelsen "biologisk aktivt fragment(er)" av et autoantigen innbefatter enhver partiell aminosyresekvens av et autoantigen som er i stand til åindusere den samme biologiske responsen som hele autoantigenet, d.v.s. evnen til å undertrykke eller eliminere T-celle-mediert eller T-celle-avhengig autoimmunrespons, ved oral administrering.
Analog. Betegnelsen "analog(er)" av et autoantigen innbefatter forbindelser som er så strukturelt beslektet med autoantigenet at de har den samme biologiske aktiviteten som autoantigenet, d.v.s. evnen til å eliminere eller undertrykke den samme eller ekvivalent T-celle-mediert eller T-celle-avhengig autoimmunrespons, ved administrering av autoantigenet. Som sådan innbefatter betegnelsen aminosyresekvenser som skiller seg fra aminosyresekvensen av autoantigenet ved en eller flere aminosyrer (samtidig som det bevarer i det vesentlige ekvivalent biologisk aktivitet med autoantigenet) såvel som kjemiske forbindelser som etterligner den biologiske aktiviteten av autoantigenene i deres evne til å undertrykke eller lette symptomene på sykdommen. Slike forbindelser kan bestå av vev fra et målorgan som er setet for angrep i en autoimmunsykdom.
Dyr. Betegnelsen "dyr" innbefatter alle levende former som har et immunoregulatorisk system og som derfor er utsatt for autoimmunsykdommer, innbefattende mennesker.
Behandling. Betegnelsen "behandling" er ment å innbefatte både de profylaktiske forholdsreglene for å forhindre slike autoimmunsykdommer såvel som undertrykkelsen eller lettelsen av symptomer etter inntreden av slike autoimmunsykdommer.
Administrering. Med betegnelsen "innføring" eller "administrering" av et autoantigen til et subjekt som har behov for behandling med slikt autoantigen er ment tilveiebringelse av autoantigenet eller dets biologisk aktive fragmenter, eller biologisk aktive analoger, til slikt subjekt ved en fremgangsmåte som bevarer den terapeutiske effektiviteten av slikt autoantigen for tidsrommet som er tilstrekkelig til å tilveiebringe en ønsket fordelaktig effekt i et slikt subjekt. I en foretrukket utførelsesform innføres autoantigenet i magen av et slikt subjekt via munnen. Med "oral" skal administreringen ikke begrenses til den som tilveiebringes per os og er ment å innbefatte enhver administrering som tilveiebringer slike antigener til subjektets mage eller fordøyelseskanal.
Type II kollagen. Type II kollagen ("CII") er typen kollagen som bl.a. finnes i brusk, intervertebralskiven og glasslegemet. Type II kollagen inneholder tre al(II) kjeder ([ai(ii)]3).
Som kjent innen teknikken er kollagen en familie av fiberforrnige proteiner som er klassifisert i et antall strukturelt og genetisk distinkte typer (Stryer, L., Biochemistry, 2nd Edition, W.H. Freeman & Co., 1981, s. 184-199). Type I kollagen er den mest vanlige formen og finnes bl.a. i hud, sener, hornhinne og ben, og består av to underenheter av a 1(1) kollagen og en underenhet av en annen sekvens betegnet al. Andre typer kollagen, innbefattende type II kollagen, har tre identiske underenheter eller kjeder, hver bestående av ca. 1000 aminosyrer. Type III kollagen finnes bl.a. i blodkar, det kardiovaskulære systemet og føtal hud og inneholder tre al (III) kjeder
([al(III)]3). Type IV kollagen er bl.a. lokalisert i basalmembraner og inneholder al(IV) kjeder ([al(rV)]3).
Foreliggende oppfinnelse er videre basert på den erkjennelsen at den enterale administreringen av type II kollagen er en effektiv fremgangsmåte for å undertrykke adjuvans artritt. Undertrykkelsen av adjuvans artritt ved type II kollagen er spesielt overraskende fordi type II kollagen uventet er langt mer effektiv ved undertrykkelse av
adjuvans artritt enn MT. I en foretrukket utførelsesform skjer slik administrering per os.
Enteralt indusert toleranse i både EAE og adjuvans artritt er doseavhengig og både kliniske og histologiske symptomer av sykdommen svekkes i alvorsgrad. Fordi f.eks. oral administrering av et irrelevant antigen, så som bovint serum albumin (BSA) eller et annet autoantigen så som kollagen eller "S" antigen (autoantigenet innbefattet ved eksperimentell autoimmun uveititt) ikke har noen effekt på utsattheten overfor EAE, kan det fastslås at den oralt induserte toleransen overfor EAE er spesifikk for MBP, antigenet overfor hvilket T-cellene som medierer sykdommen er sensitisert.
Videre induserer den orale administreringen av MBP til rotter undertrykkelsen av immunresponser til MBP. F.eks. nedsettes både lymfoidcelleproliferasjon og produksjonen av anti-MBP antistoffer. Cellene som er ansvarlige for både undertrykkelsen av sykdommen og undertrykkelse av antigen-spesifikke cellularresponser in vitro er av T-celle opphav og er suppressor/cytotoksiske CD8+ T-lymfocytter.
Som demonstrert nedenfor ved anvendelse av EAE dyremodellen for multippel sklerose og ved å anvende dyremodellen for AA, er den enkle fremgangsmåten for administrering av autoantigener så som MBP eller CII en effektiv behandling for å undertrykke utviklingen av spesifikk autoimmunsykdom, visse immunresponser til autoantigenene, og utviklingen av sykdommen etter at sykdommen har manifistert seg i et subjekt.
Generelt innføres autoantigenet, fragmentet eller analogen oralt i en mengde på fra 1 til 1000 mg pr. dag, og kan administreres i en enkeltdoseform eller flerdoseform. Fortrinnsvis administreres autoantigenet, fragmentet eller analogen i en mengde på fra 25 til 850 mg pr. dag. Som det vil være åpenbart for fagmannen, er den nøyaktige dosen en funksjon av autoantigenet, alder, kjønn og fysisk tilstand for pasienten, såvel som annen samtidig behandling som administreres. Slike preparater kan administreres til et dyr med behov for behandling for slik autoimmunsykdom for å bedre, fjerne, mildne, reversere eller redusere alvoret av sykdommen. Slike preparater kan også administreres til et dyr som er disponert for å utvikle slik autoimmunsykdom for å forhindre inntreden av slik sykdom eller for å redusere graden av sykdom når den inntrer.
Når autoantigenet, fragmentet eller analogen innføres oralt kan den være blandet med andre næringsmiddelformer og konsumeres i fast, halvfast, suspensjonsform eller emulsjonsform. Slikt autoantigen kan være blandet med farmasøytisk akseptable salter, bærere, smaksforbedrende stoffer o.l.
Et autoantigen kan administreres i kombinasjon med et hvilket som helst annet egnet autoantigen for administrering til et subjekt i behov for slikt antigen. F.eks. kan type II kollagen(er) fra mer enn en vevskilde eller spesies anvendes. Autoantigenene kan også administreres i kombinasjon med en hvilken som helst egnet farmakologisk bærer for administrering til et subjekt i behov for slikt autoantigen. Slike autoantigener kan administreres i en hvilken som helst form som bevirker profylaktiske, palliative, preventive eller helbredende betingelser av autoimmunsykdom i mennesker og dyr.
Autoantigenene kan anvendes i doseringsformer så som tabletter, kapsler, pulverpakker eller flytende oppløsninger for oral administrering så lenge som den biologiske aktiviteten av autoantigenet ikke ødelegges ved slik doseringsform.
Preparater av autoantigenene for oral administrering innbefatter autoantigener tilveiebrakt som tørre pulvere, næringsmidler, vandige eller ikke-vandige oppløsningsmidler, suspensjoner eller emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige oppløsningsmidler er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilsk olje, fiskeolje eller injiserbare organiske estere. Vandige bærere innbefatter vann, vann-alkoholoppløsninger, emulsjoner eller suspensjoner, innbefattende saltvannsoppløsning og bufrede medisinske parenterale bærere innbefattende natriumkloridoppløsning, Ringer's dekstroseoppløsning, dekstrose pluss natriumkloridoppløsning, Ringer's oppløsning inneholdende laktose, eller fikserte oljer.
Hvor antigenet, fragmentet eller analogen administreres enteralt kan den innføres i fast, halvfast, suspensjons eller emulsjons form og kan settes sammen med en hvilken som helst av en lang rekke farmasøytisk akseptable bærere, innbefattende vann, suspensjonmidler, emulgeringsmidler.
Autoantigenene kan også administreres ved hjelp av pumper, eller i former med vedvarende frigivelse, spesielt når det administreres som et forebyggende middel, for å forebygge utviklingen av autoimmunsykdom i et subjekt eller når det administreres for å lette eller forsinke en allerede etablert autoimmunsykdom.
Farmasøytiske preparater som inneholder autoantigener og som er nyttige i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen fremstilles ved en i og for seg kjent fremgangsmåte. F.eks. kan autoantigenene tilveiebringes som en farmasøytisk sammensetning ved hjelp av konvensjonell blanding, granulerings-, dragéfremstillings-, oppløsnings-, lyofiliserings- eller lignende prosesser. Slike sammensetninger, i og for seg selv, finner anvendelse ved kontroll av autoimmunsykdom enten den er kronisk eller akutt.
I tillegg er en lavpotens utgave av slike preparater nyttig ved behandlingen av milde, kroniske eller akutte autoimmunsykdomstilstander.
Autoantigener som er i det vesentlige frie for naturlige forurensninger kan isoleres og renses fra deres naturlige eller rekombinantkilder ifølge konvensjonelle betingelser og teknikker kjent innen teknikken, som tidligere har vært anvendt for å isolere slike proteiner, så som ekstraksjon, utfelling, kromatografi, affinitetskromatografi, elektroforese eller lignende.
En fagmann kan identifisere de antigeniske domenene av et antigen ved anvendelse av kjente teknikker, uten unødig eksperimentering, og slike domener er foretrukket i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. F.eks. kan derivater av de native autoantigenene eller derivater av rekombinant fremstilte autoantigener dannes ved proteolytisk spaltning av et protein av full lengde med vanlige proteaser, så som f.eks. trypsin, kymotrypsin og subtilisin. Affinitetskromatografi med actinderivatiserte harpikser kan benyttes for å analysere slike fragmenter for deres autoimmunsykdom-undertrykkende evne.
Når identifikasjon av forbindelser eller fragmenter derav som har autoimmunsykdoms-undertrykkende aktivitet er ønsket kan slike forbindelser eller fragmenter også identifiseres ved anvendelse av teknikker som er kjente innen fagfeltet.
Videre kan slike fragmenter identifiseres ved deres homologi til andre kjente autoantigeniske domener hvor det kan forutsis at funksjon vil følge homologi.
F.eks. kan autoantigener som er nyttige i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen identifiseres ved evnen av slike autoantigener til å undertrykke slik autoantigen indusert autoimmunsykdom ved administrering av slikt autoantigen til et subjekt som er angrepet av, eller disponert for, autoimmunsykdommen.
Etter den generelle beskrivelsen av oppfinnelsen vil de følgende eksemplene ytterligere beskrive materialene og fremgangsmåtene som anvendes ved utførelsen av oppfinnelsen. Eksemplene er ikke ment å begrense oppfinnelsen på noen måte.
Eksempler
A. Metodologi
Dyr: Lewis eller Wistar Furth hunrotter med vekt 150 til 220 g (6-8 uker gamle) ble oppnådd fra Charles River Laboratory, Wilmington, MA, eller fra Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, IN, og ble benyttet i alle forsøk.
Immunisering av dyr: Rotter ble immunisert i begge de bakre fotpotene med 50 ug marsvin MBP emulgert i komplett Freund's adjuvans (CFA). I noen forsøk ble 50 ug ovalbumin (OVA) (Sigma) tilsatt til de emulgerte antigenene og injisert på tilsvarende måte. EAE ble karakterisert ved lemparalyse og ble bedømt ved scoringer som følge: 0) ingen sykdom; 1) nedsatt aktivitet, slapp hale; 2) mild paralyse, ustø gange; 3) moderat paraparese, lemmer spriker fra hverandre; og 4) tetraplegia.
Induksjon av oral toleranse: Rotter ble tilført MBP eller bovint serum albumin (BSA) fem ganger ved tre dagers intervaller, 1 mg i 1 ml PBS (8 gm NaCl 0,2 gm KC1, 1,44 gm av NA2HPO4, 0,24 gm av KH2PO4 i 1000 ml av H2O) ved anvendelse av en 23-gauge nål dekket med plastrør.
Prolifereringsanalvse: 9 dager etter immunisering ble rottene avlivet og deres popliteale lymfeknuter ble fjernet. En enkelt cellesuspensjon ble fremstilt ved å presse lymfeknutene gjennom en sikt av rustfritt stål. Et totalt antall på 10^ lymfeknuteceller (LNC) ble dyrket med det angitte antallet av enten bestrålte (2000 rad) eller intakte LNC avledet fra forede rotter i kvadruplikat i rundbunnet 96-brønns plate (Costar). MBP og Mycobacterium tuberculosis (Mt), 50 ug/ml ble tilsatt til kulturen i et volum på 20 ul. Kulturene ble inkubert i 80 timer og ble pulset med 1 uCi [-<*>H] TdR/brønn i minst 16 timers kultur. Kulturene ble deretter høstet på en automatisk cellehøster og avlest på en standard væske scintillasjonsteller.
Prosent undertrykkelse av behandlet LNC (PLNC) proliferering ble beregnet ved følgende formel:
Prolifereirngsmedier: RPMI (Gibco) ble benyttet i alle forsøkene. Mediet ble filtrert sterilt etter tilsats av 2 x 10"^M 2-merkaptoetanol, 1% natriumpyruvat, 1% penicillin og streptomycin, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% autologt serum.
Rensing av forskjellige celleundersett: For deplesjon av CD3, CD4 og CD8 populasjoner fra miltceller ble negativ seleksjon anvendt. Petri-skåler ble dekket over natten ved 4°C med 10 ml av 1/1000 geit anti-mus IgG + IgM antistoffer (Tago) i PBS/BSA. Platene ble deretter vasket og belagt med 3% føtalt bovinserum i PBS i 30 minutter ved 20°C og vasket igjen. Lewis LNC ble farget med mus anti-rotte monoklonale antistoffer (Serotec/Bioproducts) for CD3 (MRC, OX/38), CD4 (W 3/25) eller CD8 (OX/8) fortynnet i 1/100 i PBS. Cellene ble flekket i 30 minutter på is, vasket og sådd på de forbelagte petriskålene, 15 million celler/5 ml PBS/plate ved 4°C. Supernatanten inneholdende ikke-vedhengende celler ble aspirert forsiktig 60 minutter senere og sentrifugert to ganger før celleundersøkelse og telling. Denne protokollen gir cellepopulasjoner på ca. 85-95% renhet bedømt ved hjelp av fluoressensaktivert cellesorterer ved å undersøke membran immunofluoressens.
Adoptive overføringsforsøk: Donorrotter ble tilført enten MBP eller BSA, 1 mg x 5 ganger, med 3-4 dagers intervaller og avledet 4 dager etter den siste tilførselen. Mesenteriske LNC og miltceller ble høstet og injisert intraperitonealt enten øyeblikkelig eller etter aktivering med concavalin-A (Con-A), 1,5 ug/ml, i prolifereringsmedium i 48 timer. Antallet celler injisert for adoptive overføringsforsøk var som følger: 120 x IO<6> for hele LNC populasjonen, enten aktivert eller ikke; 60 x IO<6> for CD3 depleterte LNC; 80 x IO<6> for CD4 depletert populasjon; og 95 x IO<6> for CD8 depletert LNC. Resipient Lewis rotter bile immunisert med BP/CFA 4 timer senere for induksjon av EAE.
Serumnivåer av antistoffer: En fastfase enzymforbundet immunoabsorbent analyse (ELISA) ble benyttet for bestemmelse av antistoff titere mot MBP og OVA. Mikrotiterplater ble inkubert med 0,1 ml pr. brønn av 10 ug antigen/ml i dobbeltdestillert vann. Plater ble inkubert i 18 timer ved 25°C. Etter tre vaskinger med PBS/tween-20 (Bio-Rad), pH 7,5, ble plater inkubert med 3% BSA/PBS i 2 timer ved 37°C, vasket to ganger, og 100 ul av fortynnet serum ble tilsatt i kvadruplikat. Platene ble inkubert i 2 timer ved 37°C. Etter tre rensinger med PBS/tween-20 ble platene inkubert med 100 ul/brønn av peroksydase-konjugert geit anti-rotte IgG antistoff (Tago, USA) fortynnet 1:1000 i 1% BSA/PBS i en time ved 25°C. Fargereaksjon ble oppnådd ved eksponering mot D-fenylendiamin (0,4 mg/ml fosfat) citrat buffer, pH 5,0, inneholdende 30% H202- Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 0,4N H2SO4 og OD 492 nm ble avlest på en ELISA avlesningsenhet.
In vi tro måling av anti stoffproduksjon: Popliteale og milt LNC ble oppnådd fra forede, native og tilleggstilførte rotter og sådd ved en konsentrasjon på 10<?> celler pr. ml petriskål enten alene eller bestrålt (2000 rad) sammen med andre PLNC som angitt. Kulturene ble holdt i prolifereringsmedier, med eller uten antigen (20 ug/ml) i 3 dager i en inkubator og deretter høstet. De fortynnede supematantene ble anvendt for å undersøke in vitro produksjonen og utskillelsen av IgG antistoff og ble målt for antistoffproduksjon ved anvendelse av en ELISA test som beskrevet tidligere.
Identifikasjon av forskjellige regioner av myelin basal protein molekylet som er ansvarlig for undertr<y>kkelse av EAE: Overlappende fragmenter av 1-37 regionen av marsvin myelin base protein ble syntetisert ved å anvende fastfase peptidteknikk. Houghten, R., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:5131-5135 (1985). Disse fragmentene ble deretter administrert oralt i ekvimolare konsentrasjoner til 15 mg av hele myelin basalproteinet. De ble administrert på dag -7, -5 og -2 før immunisering. Dyrene ble deretter tilført basalprotein i Freund's adjuvans ifølge etablerte fremgangsmåter og scoringen ble bedømt.
Demonstrasjon av at oral fremgangsmåte for administrering av et protein antigen bestemmer til hvilke fra<g>menter det forekommer en immunres<p>ons: Dyr ble gitt helt myelin basalprotein, enten immunisert i fotpoten med Freund's adjuvans eller administrert oralt. Syv til ti dager senere ble milt og lymfeknuteceller fjernet og restimulert in vitro med forskjellige fragmenter av myelin basalproteinmolekylet.
Kolla<g>ener oe adjuvans: Oppløselig forma av kylling type II kollagen ble oppnådd fra Genzyme Corporation, Boston, MA. Bovint type III kollagen ble innkjøpt fra Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, mens type I kollagen var en gave fra dr. D. Trentham, Beth Israel Hospital, Boston, MA. Mycobacterium tuberculosis og ufullstendig Freund's adjuvans (IFA) ble innkjøpt fra Difco Laboratories, Detroit, MI. Komplett Freund's adjuvans (CFA) ble fremstilt ved å blande IFA og MT malt til et fint pulver.
Oral administreringsprotokoU: Antigener ble oralt administrert i et 1 ml volum gjennom en sprøyte utstyrt med en 18G nål med kuletupp tre ganger (på dager -7, -5 og -2) før induksjon av sykdom. Kollagener ble oppløst i kaliumfosfat buffer (pH 7,6) mens MT ble suspendert i fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS) for tilførslene.
Induksjon av artritt: Adjuvans artritt ble indusert i dyr ved intradermal injeksjon ved haleroten med 0,1 ml CFA inneholdende 10 mg/ml M. tuberculosis.
Bedømmelse av artritt: Forekomsten av artritt ble definert som antallet rotter som hadde kliniske tegn på artritt i løpet av 35 dager etter induksjon av sykdom. Forekomsten av artritt ble bedømt i henhold til standard metodologi (Trentham, D.E. et al., J. Exp. Med. 146:857 (1977). Hver av de fire potene ble bedømt som følger: 0 = normal, 1 = bare rødhet, 2 = rødhet pluss mild opphovning, 3 = alvorlig opphovning, 4 = ledd-deformitet. Artrittscoringen for hvert dyr var summen av scoringen for hver av de fire potene. Den maksimale artrittscoringen var den høyeste scoringen for et individuelt dyr under hele sykdomsforløpet. Alle bedømmelser ble foretatt på en "blind" måte uten kjennskap til behandlingsgruppen.
Lymfocytt <p>rolifererin<g>sanalvse: Rotter ble forbehandlet med 0,1 ml CFA inneholdende 1 mg/ml MT ved haleroten. Ni dager senere ble de drenerende lymfeknutene fjernet og enkle cellesuspensjoner ble preparert. Etter å være vasket to ganger ble cellene resuspendert i RPMI 1640 inneholdende 1% glutamin, 1% penicillin/streptomycin, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 5% føtalt kalveserum og 5 x 10~<5> M 2-merkaptoetanol. Cellene ble deretter sådd i en 96-brønns flatbunnet plate i kvadruplikat ved konsentrasjon på 2,5 x 10^ celler/brønn og dyrket med forskjellige konsentrasjoner av MT ved 37°C med 5 % CO2 i 72 timer. Tritiært thymidin ble deretter tilsatt til kulturen ved 1 uci/brønn. Cellene ble høstet 6 timer etter pulsingen og proliferering ble bestemt ved tritiært thymidin inkorporering målt ved væske scintilla-sjonstelling.
Hypersensitivitets ( DTH) responser av forsinket type: DTH responser ble målt 30 dager etter immuniseringen. Rotter ble injisert subkutant i begge ører med enten 10 ug av MT av 20 ug CII i 50 ul PBS. Øresvelling besto i forskjellen i øretykkelse målt før og 48 timer etter injeksjonen ved anvendelse av mikrometer skyvelær. DTH responser ble også utført i uimmuniserte dyr og dyr tilført bare CII.
Adontiv overføring av undertr<y>kkelse: Donorrotter ble tre ganger tilført 3 ug av CII ved 2-3 dagers intervaller. Deres milter ble fjernet 7 dager etter den siste tilførselen og en enkelt cellesuspensjon ble fremstilt. Etter lysering av de røde blodcellene med tris-NH4CI, pH 7,26, ble splenocyttene vasket to ganger i Hank's balanserte saltoppløsning (HBSS). I noen forsøk ble splenocyttene ytterligere separert i T- eller B-celle anrikede populasjoner ved å anvende nylon-ull kolonner. 1 x IO<8> celler ble injisert intraperitonealt til hver resipient, som deretter ble injisert med CFA for åindusere artritt enten på samme dag eller 2 dager senere. Splenocytter fra ubehandlede normalrotter tjente som en kontroll.
Eksempel 1:
Effekt av tilførsel av MBP og fra<g>menter derav:
Effektene av tilførsel av MBP og dets peptiske fragmenter på mottageligheten for, og graden av, akutt enfaset EAE ble undersøkt i Lewis rotten. Resultater viser at denne naturlige fremgangsmåten for toleranse induksjon undertrykker både utviklingen av sykdom og immunresponser på MBP.
For oralt å indusere undertrykkelse av EAE ble Lewis rotter tilført MBP renset fra marsvin hjerne (Diebler, G., et al., Prep. Biochem. 2:139 (1972)) ved anvendelse av en sprøyte utstyrt med en 20G nål med kulespiss. Kontrolldyr ble tilført samme mengder bovinserum albumin (BSA) eller saltvannsoppløsning alene. EAE ble indusert ved immunisering med 50 ug MBP emulgert i komplett Freund's adjuvans (CFA) inneholdende 200 ug Mycobacterium tuberculosis ved injeksjon i de bakre fotpotene. Sykdom ble karakterisert ved baklem paralyse og inkontinens vanligvis mellom dager 12 og 15 etter immunisering, og i alle tilfeller kom rottene seg i løpet av dag 16. Den første serien av forsøk undersøkte effekten av antallet tilførsler og dose av MBP på sykdomsuttrykk. Rotter ble tilført varierende mengder MBP enten en gang 7 dager før (dag -7), på dagen for immunisering (dag 0) eller tre ganger på dager -14, -7 og 0. Resultatene (tabell I) demonstrerer at tilførsel av MBP til rotter undertrykker EAE og at oralt-indusert undertrykkelse er doseavhengig. Flere tilførsler på 500 ug resulterte i fullstendig undertrykkelse av sykdom og var mer effektive enn en enkelt tilførsel ved denne dosen. I tillegg til klinisk manifestasjon av EAE ble histologiske tegn på sykdom i rotter undersøkt. 16 dager etter immunisering ble rottene avlivet og hjerner ble fjernet og fiksert i formalinoppløsning. Som fikseringsmiddel ble det anvendt en oppløsning av 100 ml 70% etanol, 10 ml 37% formalin og 5 ml iseddiksyre. Slides av parafin-innstøpte vev ble fremstilt fra hver rotte og farget med hematoxylin og eosin. Perivaskulære inflammatoriske fokuser ble kvantifisert på fargede slides ved etablerte fremgangsmåter (Sobel, R., et al., J. Immunol. 132:2393 (1984)). Som vist i tabell I forårsaket tilførsel til rotter av 500 ug MBP på dager -14, -7 og 0 en markert reduksjon i antallet inflammatoriske lesjoner i hjernen. En moderat reduksjon ble funnet i dyr tilført 100 ug, og ingen signifikant reduksjon av inflammasjon ble funnet i rotter tilført 25 ug
MBP.
Eksempel 2:
Virkning av tidligere eksponering mot antigen ved suppresion
En andre serie forsøk undersøkte virkningen av tilførsel av MBP før eller etter immunisering med MBP for å bestemme om effektiviteten av oralt indusert undertrykkelse påvirkes av tidligere eksponering mot antigen. For disse forsøkene ble dyr tilført 500 ug MBP tre ganger enten før eller etter aktiv induksjon av sykdom (immunisering med MBP). Resultatene (tabell II) demonstrerer at det kliniske uttrykket av sykdom undertrykkes uansett om dyrene tilføres MBP før eller etter sensitisering, effekten er mer fullstendig når antigen tilføres før immunisering. Imidlertid avslørte histologisk undersøkelse en dramatisk reduksjon av perivaskulære infiltrater i rotter tilført MBP enten før eller etter sensitisering overfor MBP. Mer enn 60% undertrykkelse av sykdom fant også sted når rotter ble foret tre ganger begynnende på dager +5 eller +7 etter immunisering (data ikke vist).
I tillegg ble det utført forsøk hvori rotter ble tilført 100 ug av MBP ved forskjellige tidspunkter, før og etter immunisering med MBP. Som vist i tabell III registreres sykdomsundertrykkelse med enkle tilførsler før eller etter immunisering.
Eksempel 3:
Effekt av oral administrering av MBP på cellulære og hormonelle immunresponser til
MBP
Effektene av oral administrering av MBP på cellulære og humorale immunresponser til MBP ble også undersøkt. Proliferative responser til MBP ble undersøkt etter foring av rotter med forskjellige doser av MBP og etter foring ved forskjellige tidspunkter med hensyn til immunisering. Ti dager etter immunisering ble rotter avlivet og enkle cellesuspensjoner av drenerende (popliteale) lymfeknuter ble fremstilt. Celler ble dyrket i mikrobrønner i fire dager, de siste 24 timene med ^H-thymidin tilsatt. Et volum på 0,2 ml inneholdende 4 x 10^ celler i RPMI 1640 inneholdende 2% glutamin, 1% penicillin/streptomycin, 5 x 10"<5> M 2-merkaptoetanol og 5% føtalt kalveserum ble tilsatt til hver mikrobrønn og MBP ble tilsatt ved 50 ug/ml. Brønner ble pulset med 1 uCi tritiert thymidin, høstet på fiberglassfiltere ved anvendelse av en multihøster og tellet ved
anvendelse av standard væske scintillasjonsteknikker.
Resultater (tabeller I og II) demonstrerer at foring med MBP forårsaker en uttalt (75-92%) reduksjon i proliferative responser til MBP. Undertrykkelse av proliferasjon, i motsetning til undertrykkelse av sykdom, fant sted ved alle doser og tilførselsmåter som ble undersøkt, innbefattende tilførsel etter immunisering. Oralt indusert undertrykkelse av den proliferative responsen til MBP er antigen-spesifikk, som vist i Fig. 1. Nærmere bestemt undertrykker foring med MBP ikke den proliferative responsen til renset proteinderivat (PPD), et antigen avledet fra M. tuberculosis som induserer en proliferativ respons som en følge av immunisering med CFA. Tilførsel av et irrelevant antigen, BSA, påvirker ikke den proliferative responsen på PPD og undertrykker bare svakt den proliferative responsen på MBP.
Eksempel 4:
Effekt av foring med MBP på produksjonen av antistoff til MBP
Effekten av foring med MBP på produksjonen av antistoff til MBP ble også undersøkt. Rotter tilført MBP ble immunisert og blod ble fjernet ved hjertepunktur 16 dager etter immunisering. Nivåer av anti-MBP antistoff i serumet ble målt ved ELISA. Et volum på 0,1 ml av MBP oppløsning (0,05 mg/ml i PBS) ble tilsatt pr. mikrobrønn og inkubert i 3 timer ved 37°C. Brønner ble vasket med PBS inneholdende 0,05 % Tween (PBST) og blokkert over natten ved 4°C med 5% BSA i PBS, pH 9,0. Etter vasking av brønner med PBST ble fortynnede rottesera tilsatt og inkubert i 3 timer ved romtemperatur, og etter vasking med PBST ble sekundært antistoff (peroksydasekonjugert geit anti-rotte) tilsatt i en time ved romtemperatur. Substrat ble tilsatt og reaksjonen ble stoppet med 0,1 M NaFl. Plater ble avlest ved 450 nm på en "Titertek multiscan". Abs45ø ble også bestemt for serum fra rotter immunisert bare med CFA, og ble subtrahert fra alle verdier som bakgrunn.
I motsetning til undertrykkelse av proliferative responser som fant sted ved i det vesentlige alle doser og tilførselsmåter som ble undersøkt, ble undertrykkelse av antistoffproduksjon bare observert når dyr ble tilført den høyeste undersøkte dosen (500 Hg) på dager -14, -7 og 0 (66% undertrykkelse, tabell I). Det bør legges merke til mangelen på undertrykkelse i rotter tilført 500 ug MBP på dager -7, -5 og -2 (tabell II) hvilket antyder at den tidsmessige sekvensen hvori en identisk dose av MBP tilføres er viktig ved undertrykkelse av antistoffersponser.
(a) Rotter ble tilført forskjellige doser av MBP på de angitte dagene og ble immunisert med 50 ug MBP i CFA (20 ug M. tuberculosis) på dag 0. Antallet syke rotter av det totale antallet immunisert er vist. Immuniserte kontrolldyr ble tilført BSA eller saltvannsoppløsning. (b) Rotter ble avlivet på dag 16 etter immunisering og hjerner ble fjernet og fiksert. Angitt er det gjennomsnittlige antallet perivaskulære inflammatoriske foki pr. dyr +/- standardavvik. ND = ikke bestemt. (c) Proliferativ respons til MBP ble målt for drenerende lymfeknuteceller 10 dager etter rottene ble immunisert. Et volum på 0,2 ml inneholdende 4 x IO<5> celler i RPMI 1640 inneholdende 2 % glutamin, 1 % penicillin/streptomycin, 5 x 10"<5>
M 2-merkaptoetanol og 5 % føtalt kalveserum ble tilsatt til hver mikrobrønn og MBP ble tilsatt ved 50 ug/ml. Brønner ble pulset med 1 uCi tritiert thymidin, høstet på fiberglassfiltere ved anvendelse av en multihøster og tellet ved anvendelse av standard væske scintillasjonsteknikker. Angitt er den prosentvise inhiberingen av proliferativ respons til MBP med hensyn på den immuniserte kontroll-gruppen. Gjennomsnittlig stimuleringsindeks for de immuniserte kontrollene (MBP-stimulert cpm/bakgrunns-cpm) var 6,0 (29.888 cpm/4960 cpm). (d) Rotter ble avlivet på dag 16 og blod ble tatt ved hjertepunktur. Sera ble fortynnet 1/15,625 i PBS og anti-MBP antistoffhivåer ble bestemt ved ELISA. Et volum på 0,1 ml MBP oppløsning (0,05 mg/ml i PBS) ble tilsatt pr. mikrobrønn og inkubert i 3 timer ved 37°C. Brønner ble vasket med PBS inneholdende 0,05 % Tween (PBST) og blokkert over natten ved 4°C med 5 % BSA i PBS, pH 9,0. Etter vasking av brønner med PBST ble fortynnede rottesera tilsatt og inkubert i 3 timer ved romtemperatur, og etter vasking med PBST ble sekundært antistoff (peroksydasekonjugert geit anti-rotte) tilsatt i en time ved romtemperatur. Substrat ble tilsatt, og reaksjonen ble stoppet med 0,1 M NaFl. Plater ble avlest ved 450 nm på en "Titertek multiscan". Abs45o ble også bestemt for serum fra rotter immunisert bare med CFA, og ble subtrahert fra alle verdier som bakgrunn. Angitt er den prosentvise reduksjonen i antistoffhivå, målt ved absorbans av peroksydasesubstrat ved 450 run, med hensyn til immuniserte kontroller (gjennomsnittlig absorbsjon ved A45Q for immuniserte kontroller med bakgrunn trukket fra var 0,148). (e) Grupper ble sammenlignet ved chi-kvadrat analyse med en frihetsgrad: *p<s05, **p<0,l,***p<,001.
(a) Rotter ble tilført 500 ug MBP på de angitte dagene og ble immunisert med 50
ug MBP i CFA på dag 0. Immuniserte kontroller ble tilført BSA eller saltvannsoppløsning.
(b) Se tabell I.
(c) Se tabell I. Gjennomsnittlig stimuleringsindeks for immuniserte kontroller var
9,4 (82.247 cpm/8.718 cpm).
(d) Se tabell I. Midlere absorbsjon ved A45Q for immuniserte kontroller med
bakgrunn trukket fra var 0,403.
(e) Se tabell I.
Rotter ble tilført 100 ug MBP på de angitte dagene (med hensyn til dagen for immunisering = 0), og ble immunisert med 50 ug MBP med CFA (0,5 mg/ml M. tuberculosis).
Eksempel 5:
Vari<g>het av oralt indusert beskyttelse mot EAE
Ytterligere forsøk ble utført for å bestemme varigheten av oralt indusert beskyttelse mot EAE. Etter tilførsel på dager -7, -5 og -2 med 500 ug MBP ble rotter immunisert ved forskjellige tider etter den siste tilførselen. EAE ble fullstendig undertrykket i rotter for opptil 4 uker etter tilførsel, og etter 8 uker var 50 % av rottene tilført MBP igjen mottagelige for sykdom. Resultatene er angitt i tabell IV, som indikerer at toleranse overfor sykdommen opprettholdes i minst 4 uker etter den siste tilførselen, med mot-tagelighet for sykdomsinduksjon som igjen opptrer ved 8 uker etter tilførselen.
Rotter ble tilført 500 ug MBP på dager -7, -5 og -2 og ble immunisert på de angitte dagene med 50 ug MBP i CFA. Kontrollrotter (tilført BSA) ble likeledes immunisert.
Eksempel 6:
Effekt av fragmenter av MBP på utviklingen av EAE
Det er kjent at det encefalitogeniske området av marsvin MBP i rotter er en spesifikk dekapeptidsekvens lokalisert ved rester 75-84, som i seg selv kan indusere EAE, mens andre regioner av molekylet er ikke-encefalitogeniske (Hashim, G., Myelin: Chemistry and Biology, Alan R. Liss, N.Y. (1980)). Videre er det for andre antigener rapportert at det eksisterer distinkte suppressor determinanter ved seter som er forskjellige fra immunogeniske determinanter (Yowell, R., et al., Nature 279:70 (1979) ). Det ble derfor undersøkt om både encefalitogeniske og ikke-encefalitogeniske fragmenter av MBP kunne forebygge EAE ved oral administrering. Fragmenter av marsvin MBP ble generert ved begrenset pepsinnedbrytning og separert ved kolonnekromatografi (Whitaker, J., et al., J. Biol. Chem. 250:9106 (1975)). De tre forskjellige fragmentene ble tilført rotter, deretter ble dyrene immunisert med helt MBP. Det ble funnet at både de sykdomsinduserende (fragment 44-89) og ikke-encefalitogeniske (fragmenter 1-37 og 90-170) peptidene undertrykket EAE når de ble tilført til rotter, de ikke-encefalitogeniske fragmentene var mer effektive ved undertrykkelse av sykdommen enn det encefalitogeniske fragmentet (tabell V). Et dekapeptid (S79) ble syntetisert som adskiller seg fra den encefalitogeniske sekvensen (rester 75-84) ved en enkel aminosyresubstitusjon og er angitt å indusere undertrykkelse når den injiseres i rotter med CFA (Kardys, E., et al., J. Immunol. 127:862 (1981) ). Når S79 (Ala-Gln-Gly-His-Arg-Pro-Gln-Asp-Glu-Gly) ble tilført til dyr ble den også funnet å undertrykke EAE (tabell V). Bovint MBP, som skiller seg fra marsvin MBP ved flere seter innbefattende den encefalitogeniske sekvensen og som ikke er encefalitogenisk i rotter ved doser som er encefalitogeniske for marsvin MBP (Holoshitz, J., et al., J. Immunol. 131:2810 (1983) ), undertrykket også sykdom når den ble tilført til dyr før immunisering.
Lewis rotter ble tilført de angitte mengdene av MBP fragmenter eller peptider (ekvimolart med 500 ug helt marsvin MBP) på dager -7, -5 og -2 og ble immunisert på dag 0 med 50 ug marsvin MBP med CFA. Angitt er antallet syke rotter av det samlede immuniserte antallet, (a) Grupper ble sammenlignet med immuniserte kontroller ved chi-kvadrat analyse: p<, 01, p<. 001.
Eksempel 7:
Undertrykkelse av adjuvans indusert artritt ved tilførsel av Mvcobacteria
Adjuvans artritt ble indusert i Lewis hunrotter ved immunisering med 0,1 ml av 10 mg/ml komplett Freund's adjuvans i haleroten. Dyr ble tilført 2,0 mg av Mycobacteria tuberculosis i fosfatbufret saltvannsoppløsning på dager -7, -5 og -2 før immunisering på dag 0 og etter immunisering på dager +7 og +14. Artritt ble kvantifisert ved å måle leddoppsvelling i tre uker etter immunisering (tabell VI og Fig. 2). Senere undersøkelser har indikert at selv om resultatene vist i Fig. 2 oppnås i noen tilfeller ble i de fleste tilfeller adjuvans artritt ikke undertrykket ved å tilføre dyrene Mycobacteria tuberculosis. Derfor er evnen til å undertrykke adjuvans artritt med Mycobacteria tuberculosis administrering meget variabel. Årsaken til denne variabiliteten er ukjent.
Leddoppsvelling = tykkelse av ledd på måledagen.
p < 0,01 sammenlignet med kontroll (representativt forsøk på 4 dyr/gruppe).
Eksempel 8:
En adoptiv overføringsmodell for EAE i SJL mus
En fungerende, reproduserbar modell for adoptiv tilbakevendende EAE ble etablert i SJL mus. Protokollen for denne modellen ble tilpasset fra Mokhtarian, et al., Nature 309:356 (1984). Protokollen er angitt grafisk i Fig. 3. Kort uttrykt immuniseres donordyr med en emulsjon inneholdende 400 ug MBP og 30 ug M. tuberculosis i CFA. Ti dager deretter fjernes drenerende lymfeknuter og dyrkes med 50 ug/ml MBP i fire dager, vaskes omfattende, og 4-6 x 10<?> levedyktige celler injiseres intravenøst i resipient hundyr. Dyrene bedømmes for klinisk EAE ved anvendelse av standard skalaer, og scorings-bedømmes patologisk ved anvendelse av standard H & E histologisk analyse (Brown, A., et al., Lab Invest. 45:278 (1981), Lublin, F., et al., J. Immunol. 126:819 (1981) og Bernard, C, et al., Eur. J. Immunol. 16:655 (1976) ). Dyrene overvåkes minst 100 dager etter overføring slik at antallet tilbakefall kan bestemmes.
Eksempel 9:
Oralt indusert undertrykkelse av proliferative responser i SLJ mus
Tilførselen av 400 ug MBP hver annen dag i to uker (totalt av syv separate tilførsler) før immunisering med 400 ug MBP i CFA (0,6 mg/ml M. tuberculosis) undertrykker proliferasjonen av lymfeknuteceller i respons på MBP immunisering. Resultatene er vist i Fig. 4. Denne figuren angir kontrollresultatene mot tilførselsresulatene som en funksjon av den MBP-induserte proliferasjonen dividert med bakgrunnen (stimuleringsindeks).
Oppfinnelsen er ikke begrenset til disse utgavene og utførelsesformene av foreliggende søknad og utførelsesformene som er beskrevet ovenfor. Den omfatter enhver modifikasjon som resulterer i undertrykkelse av immunsykdommer som angitt i foreliggende oppfinnelse. Disse ekvivalentene er innbefattet innen beskyttelsen som er definert i kravene.
Eksempel 10:
Adoptiv overføring av beskyttende resistens til EAE utvikling fra MBP- tilførte donorrotter til native syngeniske resipientrotter
Donorrotter ble tilført enten MBP eller BSA, 1 mg x 5 ganger, ved 3-4 dagers intervaller og ble avlivet 4 dager etter den siste tilførselen. Mesenteriske lymfeknuteceller (LNC) og miltceller ble høstet og injisert intraperitonealt enten øyeblikkelig eller etter aktivering med concanavalin-A (Con-A), 1,5 ug/ml, i prolifereringsmedium i 48 timer. Antallet celler injisert for adoptive overføringsforsøk var som følger: 120 x 10^ for hele LNC populasjon, enten aktivert eller ikke; 60 x 10<*> >for CD3 depletert LNC; 80 x IO<6> for CD4 depletert populasjon; og 95 x IO<6> for CD8 depletert LNC. Resipient Lewis rotter ble immunisert med MBP/CFA 4 timer senere for induksjon av EAE. Evnen til å overføre resistens til utvikling av EAE fra forede donorrotter til native syngeniske resipientrotter er vist i tabell VII. LNC oppnådd fra uforede rotter eller fra bovint serum albumin (BSA) forede donorrotter overførte ikke beskyttelse mot EAE. Imidlertid var både miltceller eller mesenteriske (MES) lymfeknuteceller oppnådd fra MBP tilførte donorer i stand til å overføre relativ beskyttelse mot EAE indusert i resipientene, idet de demonstrerer hhv. 50% og 57% undertrykkelse av sykdom. Den midlere maksimale sykdomsgraden ble også redusert markert i resipienter av enten miltceller eller mesenteriske lymfeknuteceller oppnådd fra MBP tilførte donorrotter. Disse resultatene demonstrerer at den orale toleransen overfor EAE induksjon er av cellulært opphav, og at cellene som er ansvarlige for beskyttelsen finnes å være konsentrert i både de mesenteriske lymfeknutene og milten.
Lewis rotter ble tilført enten MBP eller BSA fem ganger, 1 mg pr. tilførsel ved 3 dagers intervaller, eller forble ubehandlet. Rottene ble deretter avlivet og deres milter og mesenteriske lymfeknuter ble fjernet. LNC ble høstet og aktivert i 48 timer i nærvær av Con-A. Lymfoblastene ble samlet, vasket tre ganger, og injisert intraperitonealt i native syngeniske rotter. Resipientrottene ble fire timer senere tilført MBP/CFA for induksjonen av EAE. Sykdommen ble scoringsvurdert daglig fra dag 10 ( resultater er statistisk signifikante, p < 0,05).
Eksempel 11:
Identifikasjon av lvmfeknutecelle underpopulasjon som medierer resistens mot EAE
Con-A aktiverte miltceller (SPC) oppnådd fra MBP tilførte donorrotter ble overført til native syngeniske rotter enten før eller etter depletering av enten T-celler, hjelper T-lymfocytter (CD4) eller suppressor/cytotoksiske T-lymfocytter (CD8). For deplesjon av CD3, CD4 og CD8 populasjoner fra miltceller ble negative seleksjon anvendt. Petriskåler ble belagt over natten ved 4°C med 10 ml av 1/1000 geit anti-mus IgG + IgM antistoffer (Tago) i PBS/BSA. Platene ble deretter vasket og belagt med 3 % føtalt bovinserum i PBS i 30 minutter ved 20°C og vasket igjen. Lewis LNC ble farget med muse anti-rotte monoklonale antistoffer (Serotec/Bioproducts) for CD3 (MRC, OX/38), CD4 (W3/25) eller CD8 (OX/8) fortynnet 1/100 i PBS. Cellene ble farget i 30 minutter på is, vasket og sådd på forbelagte petriskåler, 15 millioner celler/5 ml PBS/plate, ved 4°C. Supernatanten inneholdende ikke-vedhengende celler ble aspirert forsiktig 60 minutter senere og sentrifugert to ganger før celleundersøkelse og telling. Denne protokollen gir cellepopulasjoner på ca. 85-95 % renhet bedømt i fluoressens aktivert cellesorterer ved undersøkelse av membran immunofluoressens. Resultatene er demonstrert i tabell VIII. Resultatene demonstrerer at SPC er i stand til åoverføre beskyttelse mot EAE (50% forekomst), mens T-celle depletert SPC mistet sin evne til å beskytte resipientrotter (gruppe 2). Følgelig synes det som om miltcellene som er i stand til å overføre beskyttelse er T-lymfocytter. Imidlertid resulterer depletering av CD8 celler (gruppe 4) i manglende evne til å overføre beskyttelse, mens CD4+ depletert SPC viste en signifikant evne til å beskytte rotter mot EAE. Det er følgelig bevist at de antigen spesifikke T lymfocyttene som genereres etter oral administrering av MBP og som medierer resistens mot sykdomsinduksjon er av suppressor/cytotoksisk undersett. Donorrotter ble foret med MBP og behandlet som angitt i forklaringen til tabell I. Den Con-A aktiverte SPC ble injisert i native resipientrotter enten før (gruppe 1) eller etter depletering av visse subpopulasjoner (grupper 2-4). Depletering av CD3, CD4 eller CD8 lymfocytter ble utført ved å koble monoklonale IgG antistoffer til SPC og utvasking. Resipientrotter ble immunisert med MBP/CFA og EAE ble registrert fra dag 10 (""resultater er statistisk signifikante, p < 0,05).
Eksempel 12:
In vitro undertrykkelse av anti- MBP T- celle responser ved tilsats av lymfeknuteceller fra MBP forede rotter
Rotter ble immunisert med MBP/CFA og deres behandlede popliteale drenerende lymfeknuter (PLNC) høstet ni dager senere. En enkelt cellesuspensjon ble fremstilt ved å presse lymfeknutene gjennom en sikt av rustfritt stål. En total mengde på IO<5> LNC ble dyrket med det angitte antallet av enten bestrålt (2000 rad) eller intakt LNC avledet fra forede rotter i kvadruplikat i rundbunnede 96-brønns plater (Costar). MBP og Mycobacterium tuberculosis, 50 ug/ml ble tilsatt til kulturen i et volum på 20 ul. Kulturene ble inkubert i 80 timer og ble pulset med 1 uCi [^H] Tdr/brønn i de siste 16 timene av dyrkningen. Kulturene ble høstet på en automatisk cellehøster og avlest på en standard væske scintillasjonsteller.
Prosent undertrykkelse av forbehandlet LNC (PLNC) proliferering ble beregnet ved følgende formel:
PLNC ble dyrket sammen med bestrålt SPC eller mesenterisk LNC oppnådd fra enten native eller MBP forede rotter i nærvær av enten MBP eller Mycobacterium tuberculosis. LNC oppnådd fra MBP forede donorrotter ble undersøkt på andre dager etter den siste tilførselen. Resultatene er vist i Fig. S. Det er vist at innenfor tidsrammen for forsøket påvirket LNC oppnådd fra forede rotter ikke PLNC responsene mot Mycobacterium tuberculosis. Imidlertid var både SPC og mesenterisk LNC oppnådd fra forede rotter i stand til å undertrykke PLNC proliferering mot MBP. Antigen spesifikk undertrykkelse av PLNC responser var større ved anvendelse av SPC enn mesenterisk LNC. Undertrykkelsen er åpenbar fra dag 5 til dag 36 etter den siste tilførselen med MBP, hvilket indikerer at induksjonen av undertrykkelse oppnås kort tid etter tilførselen og den opprettholdes i et relativt langt tidsrom.
Følgelig synes det som om LNC oppnådd fra rotter som er gjort tolerante overfor EAE induksjon er antigen-spesifikke lymfocytter som er i stand til å undertrykke cellulære immunresponser bare overfor antigenet benyttet for tilførselen.
Eksempel 13:
Undertrykkelse av anti- MBP responser av PLNC i nærvær av bestrålt SPC og dens under<p>opulasjoner. oppnådd fra en MBP foret rotte
For å undersøke subpopulasjonen av SPC som er ansvarlig for undertrykkelse ble SPC oppnådd fra MBP foret rotte 20 dager etter den siste tilførselen depletert for visse lymfocyttpopulasjoner, bestrålt og blandet med PLNC oppnådd fra MBP/CFA immunisert rotte sammen med MBP. Popliteale og milt LNC ble sådd ved en konsentrasjon på 10<?> celler pr. ml petriskål enten alene eller bestrålt (2000 rad) sammen med annet PLNC som angitt. Kulturene ble holdt i prolifereirngsmedium, med eller uten antigen (20 ug/ml), i 3 dager i en inkubator og deretter høstet. De fortynnede supematantene ble benyttet for å undersøke in vitro produksjonen og utskillelsen av IgG antistoff og ble målt for antistoff fremstilling ved anvendelse av en ELISA test. Mikrotiter plater ble inkubert med 0,1 ml pr. brønn av 10 ug antigen/ml i dobbeltdestillert vann. Plater ble inkubert i 18 timer ved 25°C. Etter tre vaskinger med PBS/tween-20 (Bio-Rad), pH 7,5, ble plater inkubert med 3 % BSA/PBS i 2 timer ved 37°C, vasket to ganger, og en 100 ul av fortynnet serum ble tilsatt i kvadruplikat. Platene ble inkubert i 2 timer ved 37°C. Etter tre rensinger med PBS/tween-20 ble plater inkubert med 100 ul/brønn av peroksydase-konjugert geit anti-rotte IgG antistoff (Tago, USA) fortynnet 1:1000 i 1 % BSA/PBS i en time ved 25°C. Fargereaksjon ble oppnådd ved eksponering mot D-fenylendiamin (0,4 mg/ml fosfatcitrat buffer, pH 5,0) inneholdende 30 % H2O2. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 0,4N H2SO4 og OD 492 nm ble avlest på en ELISA avlesningsenhet. Resultatene vist i tabell DC viser den prosentvise undertrykkelsen av antigen prolifereringen av PLNC i nærvær av SPC oppnådd fra MBP forede rotter sammenlignet med deres responser på MBP i nærvær av SPC oppnådd fra intakte rotter. Det er demonstrert at SPC oppnådd fra MBP forede rotter (gruppe 1) undertrykker responsene av PLNC på MBP (70%). Depletering av T-celler (gruppe 2) eller suppressor/cytotoksiske T lymfocytter (gruppe 3) opphever undertrykkelse. Imidlertid øker depletering av hjelper T lymfocytter (CD4, gruppe 4) inhiberingen av anti-MBP prolifereringsrespons på PLNC. Fortynning av CD4 depletert SPC resulterer i reduksjon av undertrykkelsen fra 96% (i forholdet 1:1) til 18 % (i forholdet 1:100 av SPC:PLNC).
Disse resultatene antyder at cellene som er ansvarlige for både sykdomsinhibering og antigen-spesifikke cellularresponser in vitro er av T-celle opphav og at de er suppressor/cytotoksiske T lymfocytter.
Milter ble fjernet fra MBP forede Lewis rotter, deretter ble cellene høstet, bestrålt og sådd sammen med responder PLNC fjernet fra MBP/CFA immuniserte syngeniske rotter. SPC ble anvendt som ubehandlede celler eller depletert på CD3, CD4 eller CD8 T lymfocytter ved anvendelse av egnede monoklonale antistoffer for kobling og deretter utvasking. Resultatene er uttrykt som prosent undertrykkelse av PLNC responser på MBP og er angitt relativt til PLNC responsene i nærvær av bestrålt SPC fjernet fra uforede rotter.
Eksempel 14:
Humoral undertrykkelse av anti- MBP IgG produksjon indusert ved oral toleranse mot
MBP
Lewis rotter ble enten foret med MBP eller forble ubehandlet og ble deretter tilført MBP blandet med ovalbumin (OVA) emulgert i CFA. Blod ble deretter tatt fra rottene ved forskjellige intervaller og sera ble undersøkt med henblikk på anti-OVA eller anti-MBP antistoffer. Som vist i Fig. 6a ble IgG serumnivåene til OVA ikke påvirket i MBP forede rotter, mens IgG serumnivåer til MBP ble redusert i MBP forede rotter (6b).
Eksempel 15:
Bestemmelse av celletypen som er ansvarlig for undertr<y>kkelsen av IgG produksjon in vitro
Lewis rotter ble foret med MBP eller forble uforet og ble deretter immunisert med MBP + OVA/CFA. PLN ble fjernet 12 dager senere, og PLNC ble dyrket i 3 dager i nærvær av enten MBP eller OVA, supernatantene ble samlet, fortynnet 1:20 og undersøkt med henblikk på deres IgG innhold. Som vist i tabell X viste PLNC, som ble oppnådd fra forede rotter (gruppe 2) og dyrket in vitro med MBP, mindre respons med hensyn på IgG produksjon til MBP sammenlignet med til PLNC oppnådd fra uforede rotter (gruppe 1,45% undertrykkelse). Produksjonen av anti-OVA IgG produksjon i PLNC fra de samme rottene ble ikke påvirket (gruppe 4 vs. gruppe 5). Videre reduserte blanding av bestrålt PLNC oppnådd fra MBP forede og immuniserte rotter med PLNC fra immuniserte rotter dyrket sammen med MBP, antistoffproduksjonen av sistnevnte (gruppe 3,35% undertrykkelse), mens antistoff titerne mot OVA ikke ble påvirket (gruppe 6). I tillegg opphevet fjernelse av CD8+ celler undertrykkelsen av anti-MBP antistoffer, hvilket demonstrerer at, som ved adoptiv overføring og proliferative responser, var CD8+ celler ansvarlige for undertrykkelsen.
Rotter ble immunisert med MBP+OVA og CFA (ca. 3 dager etter den femte tilførselen av MBP). Tolv dager senere ble deres PLNC fjernet og dyrket sammen med MBP (grupper 1-4) eller med OVA (grupper 5-7) i tre dager. I noen grupper ble bestrålt PLNC oppnådd fra MBP forede og immuniserte rotter bestrålt og dyrket sammen med immunisert PLNC i nærvær av MBP (gruppe 3) eller i nærvær av OVA (gruppe 7). Supernatantene fra disse stimuleringene ble samlet, fortynnet og IgG nivåer ble bestemt ved ELISA.
Eksempel 15:
Identifikasjon av MBP området som aktivt undertrykker EAE ved anvendelse av overlappende syntetiske polypeptider av MBP
Overlappende fragmenter av aminosyre 1-37 fragmentet av marsvin myelin basal protein ble syntetisert ved anvendelse av fastfase peptidteknikk. Houghten, R., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:5131-5135 (1985). Disse fragmentene ble deretter administrert oralt i ekvimolare konsentrasjoner til 15 mg helt myelin basal protein. De ble administrert på dag -7, -5 og -2 før immunisering. Dyr ble deretter tilført basal protein i Freund's adjuvans i henhold til etablerte fremgangsmåter og scoringen ble bedømt.
Dyrene ble scoringsbedømt vedrørende mortalitet, nærvær av sykdom og sykdomsgrad. Som vist i tabell XI, ble 6/6 kontrolldyr syke med en mortalitet på 3/6.1 dyrene som fikk overlappende peptidfragmenter var det nedsatt mortalitet ved anvendelse av alle fragmenter, bortsett fra fragment 1-10. Når det betraktes på bakgrunn av sykdomsgrad viser området av molekylet mellom aminosyre 5 og 20 den mest uttalte reduksjonen av sykdom. Disse resultatene demonstrerer at i aminosyreområdet 1-37, som i seg selv er et supressogenisk fragment, kan spesifikke områder av molekylet være mer eller mindre undertrykkende når de administreres oralt.
Overlappende fragmenter av 1-37 området av marsvin myelin basal protein ble syntetisert ved å anvende fastfase peptid teknikk. Disse fragmentene ble deretter administrert oralt i ekvimolare konsentrasjoner til 15 mg av helt myelin basal protein. De ble administrert på dag -7, -5 og -2 før immunisering. Dyr ble tilført basal protein i Freund's adjuvans i henhold til etablerte fremgangsmåter og scoringsbedømt.
Eksempel 16:
Demonstrasjon av at oral fremgangsmåte for administrering av et protein antigen bestemmer til hvilket fragment det forekommer en immunrespons
Dyr ble gitt helt myelin basal protein, enten immunisert i fotputen med Freund's adjuvans eller administrert oralt. Syv til ti dager deretter ble milt og lymfeknuteceller fjernet og restimulert in vitro med forskjellige fragmenter av det basiske proteinmolekylet.
Som vist i tabell XII er den primære responsen, når myelin basal proteinet administreres perifert i Freund's adjuvans, til det 44-89 encefalitogeniske området som målt ved proliferering. Som imidlertid vist i tabell XIII er den primære responsen, når det administreres oralt, til fragment 1-37, den ikke-encefalitogeniske suppressor determinanten.
Dyr ble injisert i bakpoten med 50 ug MBP i CFA. Ti dager senere ble lymfeknuter fjernet og stimulert in vitro med 10 ug MBP eller ekvimolare mengder av MBP fragmenter.
Dyrene ble tilført 1 mg helt MBP x 3, deretter ble cellene fjernet fra forskjellige organer 15 dager etter tilførsel og proliferering ble målt. Resultatene er angitt som endring i cpm x 10"<3> sammenlignet med celler dyrket alene.
Eksempel 17:
Effekten av tilførsel av Mycobacterium tuberculosis eller type II kollagen på adjuvans artritt
Siden AA induseres ved CFA inneholdende M(. tuberculosis var en innledende tilnærmelse ved undersøkelsen av problemet å tilføre dyrene forskjellige doser av MT. Uventet ble det ikke observert noen undertrykkelse av sykdom målt ved forekomsten av artrittiske lemmer, begynnelsesdag eller maksimal artrittisk scoring over et vidt doseområde, hvori 3 ug, 30 ug, 300 ug eller 3 mg MT ble administrert på dager -7, -5 og -2 før immunisering. Representative data hvori dyrene ble forbehandlet med 3 ug er vist i Fig. 7A.
Basert på undersøkelser som rapporterte utviklingen av autoimmunitet til kollagen i rotter med AA (Trentharn, D.E., et al., J. Clin. Invest. 66:1109 (1980)), ble effekten av oral administrering av type II kollagen på AA undersøkt. Som vist i Fig. 7B og tabell XIV, undertrykket forforing av rotte med CII signifikant AA på en doseavhengig måte, de mest uttalte effektene ble observert i grupper tilført 3 ug eller 30 ug av CII. Tilfeldig undertrykkelse ble observert ved 300 ug. I dyr tilført 3 ug eller 30 ug var forekomsten av artrittiske lemmer mindre og sykdommen var mildere målt ved den maksimale artrittiske scoringen. Inntreden av sykdommen var også forsinket i dyr tilført 3 ug av CII. For å bestemme om oral administrering av CII hadde ikke-spesifikke undertrykkende effekter på eksperimentelle autoimmunsykdommer ble et identisk doseringsområde av CII tilført til dyr immunisert med myelin basal protein i CFA for induksjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) (Higgins, P.J., et al., J. Immunol. 140:440 (1988) ). Ingen effekt på utviklingen av EAE ble observert etter tilførsel av CII.
Lewis rotter ble foret med enten buffer (kontrollgruppe) eller forskjellige doser av CII tre ganger på dager -7, -5 og - 2, og intradermalt injisert på dag 0 ved haleroten med CFA inneholdende 1 mg MT for induksjon av adjuvans artritt. Artritten ble vurdert hver 2-3 dager fra dag 12 til dag 31. p-verdier representerer CII forede grupper vs. kontroll (PBS foret).
ns = ikke signifikant. ap < 0,001 vs. kontroll
<D>p < 0,05 vs. kontroll
<c>p<0,01 vs. kontroll
Eksempel 18;
Forsinket type hypersensitivitetsresponser etter oral administrering av type II kollagen og MT
Det er rapportert at immunitet overfor både CII og MT utvikles i AA (Trentham, D.E., et al., J. Clin. Invest. 66:1109 (1980) ). DTH responser ble utført for å bestemme virkningen av tilførsel av CII på in vivo T-celle responser på både MT og CII. Som vist i Fig. 8A, utviklet dyrene immunisert med CA DTH til CII, selv om den ikke er så uttalt som DTH til MT (Fig. 8B). Videre reduserte oral administrering av CII DTH responsen til CII i dyr med AA, mens det var ikke noen effekt på DTH responsen til MT. Doseresponsområdet for undertrykkelse av DTH ved CII var identisk med det for undertrykkelse av sykdom med CII, d.v.s. den mest dominerende undertrykkelsen ses ved 3 ug og 30 ug. Det skal bemerkes at det ikke var noen sensitisering til CII i dyr som bare ble tilført 3 ug uten etterfølgende immunisering. Undertrykkelsen av cellulære immunresponser til MT etter oral administrering av antigenet ble så undersøkt. Som vist i Fig. 9 ble de proliferative responsene på MT undertrykket i dyr tilført 3 ug og 30 ug MT. Tilsvarende undertrykkelse ble observert målt ved DTH responser.
Eksempel 18:
Adjuvans artritt undertr<y>kkes ved adoptiv overføring av T- celler fra rotter som er gjort CII oralt tolerante
Det ble tidligere vist at undertrykkelse av EAE etter oral administrering av myelin basal protein kan overføres adoptivt ved milt T-celler fra forede dyr (Lider, O., et al., J. Immunol. 142:748-752 (1989) ), og tilsvarende resultater er oppnådd i autoimmun uveititt modellen. Som vist i tabell XV ble beskyttelse mot AA adoptivt overført til native rotter ved milt T-celler fra rotter som oralt var gjort tolerante overfor CII. Beskyttelse var mer uttalt når splenocytter ble overført på dag -2 og når milt T-celler vs. B-celler ble overført.
Lewis rotter ble tilført varierende grader av CI eller CIII tre ganger på dager -7, -5 og -2 (kontrolldyr ble tilført buffer alene), p-verdier representerer tilført vs. kontroll.
ns = ikke signifikant.
<a>p<0,01 vs. kontroll
°p < 0,04 vs. kontroll
cp < 0,001 vs. kontroll
Eksempel 19:
Undertrykkelse av AA ved oral administrering av CII etter sykdomsutbrudd
For å bestemme om tilførsel av CII kan lette allerede etablert AA ble dyr tilført CII etter sykdomsutbrudd. Innledende tegn på artritt kom til syne 13-14 dager etter sykdomsinduksjon med CFA. På dag 17 ble dyrene separert i to grupper avhengig av sykdomsgraden. Kontrollgruppen forble ubehandlet, mens behandlingsgruppen fikk 3 ug CII oralt tre ganger pr. uke med intervaller hver annen dag. Dyrene i begge grupper ble scoringsbedømt for artritt inntil dag 34. Som vist i Fig. 10 utviklet dyrene behandlet
med CII mildere artritt og tilfrisknet raskere enn kontrolldyrene.
Eksempel 20:
Virkningen av tilførsel av ikke- brusk kollagener på AA
Selv om molekylstrukturen av CII er meget nært beslektet med andre kollagener, så som type I (CI) og type III kollagen (CIII), er fordelingen av disse kollagenene helt forskjellig (Seyer, J.M., et al., i: Textbook of Rheumatology, 3. utgave (Kelly et al., red.), s. 22, Saunders, Philadelphia (1989)). Mens CII vanligvis er til stede i brusken i leddene finnes type I og type III kollagener hovedsakelig i ben, hud og annet mykvev. Som vist i tabell XVI ble det funnet at oral administrering av CI undertrykket AA, bestemt ved forekomsten av artrittiske lemmer og sykdomsgrad, i det samme doseområdet som CII. Det forekom en forsinkelse i sykdomsutbrudd i dyr tilført CIII, men det ble ikke observert noen signifikant effekt på sykdomsgrad. Oral administrering av et irrelevant protein antigen, myelin basal protein, undertrykket ikke AA.
Donor Lewis rotter ble enten uforet (normalt) eller forforet tre ganger ved 2-3 dagers intervaller med 3 ug av CII. Milter ble tatt 7 dager etter den siste tilførselen og 1 x IO<8 >splenocytter eller nylonullseparert B (vedhengende) eller T (ikke-vedhengende) celler ble overført ved i.p. injeksjon til hver resipient som ble indusert for AA øyeblikkelig eller 2 dager etter adoptiv overføring.
ap < 0,05, gruppe 2 vs. gruppe 1
<D>p < 0,001, gruppe 4 vs. gruppe 3
cp < 0,01, gruppe 4 vs. gruppe 3
°p < 0,05, gruppe 3 vs. gruppe 1
Lymfocyttprolifereringen og DTH forsøkene ovenfor indikerte at oral administrering av MT undertrykket cellulære immunresponser mot MT uten inhibering av klinisk sykdom. Ikke desto mindre ble cellulær immunitet overfor MT ikke alvorlig undertrykket ved oral toleranse, og det er mulig at fremgangsmåter som hadde en større effekt på undertrykkelse av MT immunitet ville undertrykke sykdom. I dette henseende har andre vist undertrykkelse av AA ved administrering av 65 kd HSP i olje (Billingham, M.E.J., et al., J. Exp. Med. 171:339 (1990)) eller ved administrering av MT intradermalt eller intravenøst (Larsson, P., et al., J. Cell. Biochemistry 40:49 (1989); Gery, I., et al., Int Arch. Allergy 31:57 (1967)).
Undertrykkelse av AA ved oral administrering av CII antyder enten at patogenisk
immunitet til CII utvikles i AA eller at det er kryssreaktive epitoper mellom MT og CII. Det bør legges merke til at CII T-celle linjer ble angitt å ha en mindre effekt ved bedring av AA ved T-celle vaksinering (Holoshitz, J., et al., Science 219:56 (1983)) og det var svak undertrykkelse av CIA ved 65 kd HSP (Billingham, M.E.J., et al., J. Exp. Med. 171:339 (1990)). Noen forskere har rapportert undertrykkelse av AA ved intravenøs administrering av CII (Phadke, K., et al., Arthritis Rheum. 27:797 (1984)) selv om dette ikke finnes uniformt (Cremer, M.A., et al., J. Immunol. 131:2995 (1983)). Foreliggende studier antyder at den manglende evnen av forskerne til å demonstrere undertrykkelse av AA ved i.v. administrering av CII (Cremer, M.A., et al., J. Immunol. 131:2995 (1983)) kan være forbundet med anvendelsen av en for stor dose, f.eks. 1 mg. I innledende forsøk ble det funnet en viss kryssreaktivitet mellom MT og CII i
prolifereringsanalyser, selv om det forblir ubestemt om undertrykkelsen av AA ved oral administrering av CII er forbundet med kryssreaktivitet mellom MT og CII. Aminosyre-sekvenshomologi mellom kylling type II kollagen og peptid 180-188 av 65 kd varmesjokkproteinet av MT, som er rapportert å stimulere kloner som medierer artritt i rotter (van Eden, W., et al., Nature 331:171 (1988)) er ikke funnet. I den senere tid er en 26-aminosyresekvens fra CII rapportert åundertrykke kollagenindusert artritt (Myers, L.K., et al., J. Exp. Med. 170:1999 (1989)), imidlertid ka det ikke lokaliseres noen homologier mellom dette peptidet og 65 kd peptidet. På bakgrunn av størrelsen av både MT og CII er det klart at kryssreaktive epitoper kan eksistere som ikke lett kan identifiseres. Alternativt kan MT indusere leddskade som fører til en patogen immunrespons på CII.
Det er demonstrert at aktiv undertrykkelse genereres etter oral administrering av antigen (Ngan, J., et al., J. Immunol. 120:861 (1978); Mattingly, J. A., et al., J. Immunol. 125:1044 (1980); Mattingly, J.A., Cell. Immunol. 86:46 (1984); Zhang, Z., et al., Cell. Immunol. 104:426 (1987)), og at EAE kan undertrykkes ved adoptiv overføring av CD8<+> T-celler fra dyr som har utviklet oral toleranse (Lider, O., et al., J. Immunol. 142:748-752 (1989)).
Eksempel 21:
Behandling av multi<pp>el sklerose pasienter
Medisineringen anvendt for behandling er et bovint myelinekstrakt fremstilt av BioPure, Boston, Massachusetts. Bovint myelin er ikke-toksisk når det administreres til dyr og er effektivt ved bedring av kronisk tilbakevendende EAE. BioPure's bovint myelin fremstilles på en sucrosegradient via densitetsentrifugering ved anvendelse av en "Sharples" sentrifuge og analysert ved hjelp av SDS page elektroforese. Myelinet ekstraheres fra bovine hjerner oppnådd fra lokale slakterhus i Massachusetts og undersøkes vedrørende renhet og porsjon til porsjon standardisering ved hjelp av agarose gel elektroforese, proteinbestemmelse, lipidanalyse, aminosyrebestemmelse og immunologisk aktivitet. Det undersøkes også vedrørende tilstedeværelsen av bakterier og viruser.
Myelinet administreres til pasienter med multippel sklerose i 100 mg kapsler som gis tre ganger pr. dag i en samlet dose på 600 mg/dag.
Eksempel 22:
Behandling av autoimmun artrittiske pasienter
Typen II kollagen som anvendes for behandling er et CII preparat oppnådd fra Genzyme Corporation, Boston, Massachusetts (oppløselig kyllingtype II kollagen). Dette preparatet er effektivt ved forbedring av adjuvans artritt.
CII administreres oralt til pasienter med autoimmun artritt i en dose på 10 ug til 100 mg pr. dag. CII administreres i en tørr form eller oppløses i en væske (og volum) som
pasienten er i stand til å tolerere. I en foretrukket utførelsesform administreres en samlet dose på 100 ug opptil 30 mg pr. dag. En slik dosering kan administreres i flere doser for åtilveiebringe den samlede daglige dosen til pasienten. I en foretrukket utførelsesform er slik multippel dosering tre ganger pr. dag.
Alle referanser som her er sitert er innbefattet i sin helhet som henvisninger. Idet oppfinnelsen nå er fullstendig beskrevet, skal det understrekes at omfanget kan utføres innen et vidt og ekvivalent område for betingelser, parametere o.l. uten å påvirke omfanget av oppfinnelsen eller en hvilken som helst utførelsesform av denne.
Claims (13)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av reumatoid artritt, karakterisert ved at den innbefatter blanding av type II kollagen, et biologisk aktivt fragment av nevnte type II kollagen eller en analog strukturelt beslektet med nevnte type II kollagen, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient egnet for oral eller enteral administrasjon, hvori bæreren eller eksipienten innbefatter et tørt pulver, næringsbestanddeler, vandig eller ikke-vandig løsemiddel, suspenderingsmiddel eller emulgeringsmiddel, og hvori mengden av nevnte type II kollagen, nevnte fragment, eller nevnte analog er tilstrekkelig til å levere mellom 10 mikrogram og 100 milligram til en pasient per dag.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat, karakteri sert ved at type II kollagen, fragment eller analog er i tørr form.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat, karakteri sert ved at type II kollagen, fragment eller analog er løst i en væske.
4.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at type II kollagen er kylling type II kollagen.
5.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav for fremstilling av et farmasøytisk preparat, karakterisert ved at mengden av nevnte type II kollagen, nevnte fragment eller nevnte analog er tilstrekkelig til å levere mellom 100 mikrogram og 30 milligram til en pasient per dag.
6.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at den er for fremstilling av et farmasøytisk preparat for oral administrering.
7.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at den er for fremstilling av et farmasøytisk preparat for enteral administrering.
8.
Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av multippel sklerose, karakterisert ved at den innbefatter blanding av bovint myelin, et biologisk aktivt fragment av nevnte bovine myelin eller en strukturelt beslektet analog av nevnte bovine myelin, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient egnet for oral eller enteral administrasjon, hvori bæreren eller eksipienten innbefatter et tørt pulver, næringsbestanddeler, vandig eller ikke-vandig løsemiddel, suspenderingsmiddel eller emulgeringsmiddel, og hvori mengden av nevnte bovine myelin, nevnte fragment eller nevnte analog er tilstrekkelig til å levere til en pasient mellom 1 og 1000 mg per dag.
9.
Fremgangsmåte ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at den er for fremstilling av et preparat for oral administrering.
10.
Fremgangsmåte ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at den er for fremstilling av et preparat for enteral administrering.
11.
Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at bovint myelin fremstilles ved densitetssentrifugering.
12.
Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at bovint myelin fremstilles fra bovin hjerne.
13.
Fremgangsmåte ifølge krav 8 for fremstilling av et farmasøytisk preparat, karakteri sert ved at mengden daglig dose av nevnte bovine myelin, nevnte fragment eller nevnte analog er tilstrekkelig til å levere 600 mg til en pasient per dag.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US59693690A | 1990-10-15 | 1990-10-15 | |
| PCT/US1991/007542 WO1992006708A1 (en) | 1990-10-15 | 1991-10-15 | Treatment of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO931372D0 NO931372D0 (no) | 1993-04-14 |
| NO931372L NO931372L (no) | 1993-05-18 |
| NO314878B1 true NO314878B1 (no) | 2003-06-10 |
Family
ID=24389347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19931372A NO314878B1 (no) | 1990-10-15 | 1993-04-14 | Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasöytisk preparat for behandling av reumatoid artritt og multippel sklerose |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6019971A (no) |
| EP (1) | EP0553291B1 (no) |
| JP (1) | JP2635444B2 (no) |
| KR (1) | KR0140841B1 (no) |
| AT (1) | ATE319474T1 (no) |
| AU (2) | AU9023791A (no) |
| CA (1) | CA2092905C (no) |
| DE (1) | DE69133516T2 (no) |
| ES (1) | ES2258261T3 (no) |
| HU (1) | HUT69942A (no) |
| IL (1) | IL99754A (no) |
| NO (1) | NO314878B1 (no) |
| WO (1) | WO1992006708A1 (no) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6645504B1 (en) | 1987-06-24 | 2003-11-11 | Autoimmune Inc. | Bystander suppression of type I diabetes by oral administration of glucagon |
| US5849298A (en) * | 1987-06-24 | 1998-12-15 | Autoimmune Inc. | Treatment of multiple sclerosis by oral administration of bovine myelin |
| US5869054A (en) * | 1987-06-24 | 1999-02-09 | Autoimmune Inc. | Treatment of multiple sclerosis by oral administration of autoantigens |
| US5843445A (en) * | 1987-06-24 | 1998-12-01 | Autoimmune, Inc. | Method of treating rheumatoid arthritis with type II collagen |
| IL99754A (en) * | 1990-10-15 | 1996-08-04 | Autoimmune Inc | Pharmaceutical preparation containing autoantib or particle or analogue for the treatment of autoimmune arthritis and multiple sclerosis |
| US6613332B1 (en) | 1991-06-21 | 2003-09-02 | The University Of Cincinnati | Oral administration of therapeutic proteins |
| ES2109362T3 (es) * | 1991-06-21 | 1998-01-16 | Univ Cincinnati | Unas proteinas administrables oralmente y metodo para hacerlas. |
| DE4125400C2 (de) * | 1991-07-31 | 2000-08-17 | Edwin Klaus | Verwendung von unlöslichem Kollagen zur Behandlung von degenerativen, nicht entzündlichen Gelenkprozessen |
| JP3712260B2 (ja) * | 1992-02-28 | 2005-11-02 | オートイミューン インク | 自己免疫疾患のバイスタンダー抑制 |
| JP3845447B2 (ja) * | 1992-09-25 | 2006-11-15 | オートイミューン インク | タイプ▲ｉｉ▼コラーゲンによるリウマチ性関節炎治療方法 |
| DK0603992T4 (da) * | 1992-12-22 | 2001-03-05 | Univ Cincinnati | Oral indgivelse af immunologisk aktive biomolekyler og andre terapeutiske proteiner |
| ES2141732T3 (es) * | 1993-02-02 | 2000-04-01 | Edwin Dr Klaus | Uso de colagenos para el tratamiento de procesos articulares patologicos. |
| AU674584B2 (en) * | 1993-06-02 | 1997-01-02 | Tvw Telethon Institute For Child Health Research | Cryptic peptides for use in inducing immunologic tolerance |
| GB9319429D0 (en) | 1993-09-21 | 1993-11-03 | London Health Ass | Methods and products for controlling immune responses in mammals |
| US6379670B1 (en) | 1994-11-18 | 2002-04-30 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Methods for treatment of multiple sclerosis using peptide analogs of human myelin basic protein |
| US6251396B1 (en) | 1994-11-18 | 2001-06-26 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Methods for treatment of multiple sclerosis using peptide analogs of human myelin basic protein |
| US5856446A (en) * | 1995-07-07 | 1999-01-05 | Autoimmune Inc. | Method of treating rheumatoid arthritis with low dose type II collagen |
| BR9706922A (pt) * | 1996-01-05 | 1999-07-20 | Autoimmune Inc | Método para facilitar a remoção de membrana pericondrial de tecido de cartilagem vertebral não processado para remover proteoglicanos de tecido contendo colágeno tipo ii e para obter um produto contendo colágeno tipo ii |
| AU3225097A (en) * | 1996-06-03 | 1998-01-05 | Auragen, Inc. | Immunotherapy for autoimmune disease |
| WO1998006861A2 (en) * | 1996-08-15 | 1998-02-19 | Agrivax Incorporated | Delivery of tolerogenic antigens via edible plants or plant-derived products |
| US20080050367A1 (en) | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US7790856B2 (en) | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US6743427B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-06-01 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
| US6913745B1 (en) | 1997-12-02 | 2005-07-05 | Neuralab Limited | Passive immunization of Alzheimer's disease |
| US6923964B1 (en) | 1997-12-02 | 2005-08-02 | Neuralab Limited | Active immunization of AScr for prion disorders |
| US6787523B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
| US6750324B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-06-15 | Neuralab Limited | Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies |
| TWI239847B (en) | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
| US6710226B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-03-23 | Neuralab Limited | Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics |
| US20050208114A1 (en) * | 1998-03-24 | 2005-09-22 | Petito George D | Composition and method for healing tissues |
| US7691829B2 (en) * | 1998-03-24 | 2010-04-06 | Petito George D | Composition and method for healing tissues |
| US20030147882A1 (en) | 1998-05-21 | 2003-08-07 | Alan Solomon | Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies |
| US6787637B1 (en) | 1999-05-28 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | N-Terminal amyloid-β antibodies |
| UA81216C2 (en) | 1999-06-01 | 2007-12-25 | Prevention and treatment of amyloid disease | |
| EP1286664B1 (en) * | 2000-05-12 | 2007-07-25 | Oregon Health and Science University | Combination of low dose estrogen and immunotherapeutic agent for treating immune diseases |
| US7462486B2 (en) * | 2000-05-12 | 2008-12-09 | Oregon Health & Science University | Methods of selecting T cell receptor V peptides for therapeutic use |
| ES2292594T3 (es) | 2000-05-24 | 2008-03-16 | The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of Department Of Health And Human Services | E-selectina para tratar o prevenir accidentes cerebrovasculares. |
| US7700751B2 (en) | 2000-12-06 | 2010-04-20 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide |
| MY139983A (en) | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| PE20050627A1 (es) | 2003-05-30 | 2005-08-10 | Wyeth Corp | Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo |
| EP1786465A4 (en) * | 2004-07-30 | 2009-01-21 | Univ Oregon Health & Science | METHODS FOR DETECTION AND TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISORDERS |
| PE20061329A1 (es) | 2004-12-15 | 2006-12-08 | Neuralab Ltd | Anticuerpos ab humanizados para mejorar la cognicion |
| US8784810B2 (en) | 2006-04-18 | 2014-07-22 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases |
| US8003097B2 (en) | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
| PL2182983T3 (pl) | 2007-07-27 | 2014-10-31 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Leczenie chorób amyloidowych z wykorzystaniem humanizowanych przeciwciał specyficznych względem Abeta |
| JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
| US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
| CN104922199A (zh) * | 2015-07-14 | 2015-09-23 | 无限极（中国）有限公司 | 一种保护骨关节组合物及其应用 |
| CA3099905A1 (en) | 2017-05-11 | 2018-11-15 | Avicenna Nutracetical, Llc | Methods for producing collagen |
| JP2022547619A (ja) * | 2019-09-16 | 2022-11-14 | フィジーン、エルエルシー | 椎間板変性疾患の治療、及び繊維芽細胞ならし培地によるタンパク質グリカン合成の刺激、並びにその製剤 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4350682A (en) * | 1979-05-11 | 1982-09-21 | Lescarden Ltd. | Cartilage extraction processes and products |
| WO1988000057A1 (en) * | 1986-06-30 | 1988-01-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Immunomodulating compositions and their use |
| CA1302880C (en) * | 1986-07-25 | 1992-06-09 | Peter Koepff | Agents for the treatment of arthroses |
| ATE258065T1 (de) * | 1987-06-24 | 2004-02-15 | Brigham & Womens Hospital | Behandlung von autoimmun-erkrankungen durch orale verabreichung von autoantigenen |
| US5849298A (en) * | 1987-06-24 | 1998-12-15 | Autoimmune Inc. | Treatment of multiple sclerosis by oral administration of bovine myelin |
| US5399347A (en) * | 1987-06-24 | 1995-03-21 | Autoimmune, Inc. | Method of treating rheumatoid arthritis with type II collagen |
| US5843445A (en) * | 1987-06-24 | 1998-12-01 | Autoimmune, Inc. | Method of treating rheumatoid arthritis with type II collagen |
| CA1340012C (en) * | 1987-08-17 | 1998-08-25 | Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Peptide determinant associated with immunity |
| AU642693B2 (en) * | 1989-12-20 | 1993-10-28 | Autoimmune, Inc. | Improved treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of auto antigens |
| US5075112A (en) * | 1990-02-12 | 1991-12-24 | Cartilage Technologies Inc. | Method of and dosage unit for inhibiting angiogenesis or vascularization in an animal using shark cartilage |
| BR9106114A (pt) * | 1990-03-02 | 1993-03-09 | Autoimmune Inc | Metodo para tratar ou prevenir uma doenca auto-imune (ad) e formulacao farmaceutica |
| IL99754A (en) * | 1990-10-15 | 1996-08-04 | Autoimmune Inc | Pharmaceutical preparation containing autoantib or particle or analogue for the treatment of autoimmune arthritis and multiple sclerosis |
| DE4125400C2 (de) * | 1991-07-31 | 2000-08-17 | Edwin Klaus | Verwendung von unlöslichem Kollagen zur Behandlung von degenerativen, nicht entzündlichen Gelenkprozessen |
-
1991
- 1991-10-15 IL IL9975491A patent/IL99754A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-10-15 ES ES92900084T patent/ES2258261T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-15 WO PCT/US1991/007542 patent/WO1992006708A1/en active IP Right Grant
- 1991-10-15 AT AT92900084T patent/ATE319474T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-15 DE DE69133516T patent/DE69133516T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-15 HU HU9301089A patent/HUT69942A/hu unknown
- 1991-10-15 CA CA002092905A patent/CA2092905C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-15 EP EP92900084A patent/EP0553291B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-15 AU AU90237/91A patent/AU9023791A/en not_active Abandoned
- 1991-10-15 JP JP4500704A patent/JP2635444B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-15 KR KR1019930701083A patent/KR0140841B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-04-14 NO NO19931372A patent/NO314878B1/no not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-05 US US08/463,946 patent/US6019971A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-01 AU AU30409/95A patent/AU693232B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2258261T3 (es) | 2006-08-16 |
| WO1992006708A1 (en) | 1992-04-30 |
| EP0553291A1 (en) | 1993-08-04 |
| ATE319474T1 (de) | 2006-03-15 |
| NO931372L (no) | 1993-05-18 |
| IL99754A (en) | 1996-08-04 |
| EP0553291B1 (en) | 2006-03-08 |
| DE69133516T2 (de) | 2006-08-10 |
| AU3040995A (en) | 1995-11-30 |
| US6019971A (en) | 2000-02-01 |
| AU693232B2 (en) | 1998-06-25 |
| CA2092905A1 (en) | 1992-04-16 |
| JP2635444B2 (ja) | 1997-07-30 |
| DE69133516D1 (de) | 2006-05-04 |
| CA2092905C (en) | 2002-01-08 |
| KR930702026A (ko) | 1993-09-08 |
| KR0140841B1 (ko) | 1998-06-01 |
| NO931372D0 (no) | 1993-04-14 |
| HU9301089D0 (en) | 1993-07-28 |
| HUT69942A (en) | 1995-09-28 |
| IL99754A0 (en) | 1992-08-18 |
| JPH05508662A (ja) | 1993-12-02 |
| EP0553291A4 (en) | 1994-11-30 |
| AU9023791A (en) | 1992-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO314878B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasöytisk preparat for behandling av reumatoid artritt og multippel sklerose | |
| US5869093A (en) | Treatment of immune diseases by oral administration of autoantigens | |
| EP0359783B2 (en) | Treatment of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens | |
| US5869054A (en) | Treatment of multiple sclerosis by oral administration of autoantigens | |
| US20050208061A1 (en) | Treatment of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens | |
| US6077509A (en) | Peptide fragments of myelin basic protein | |
| Miller et al. | Epitopes of myelin basic protein that trigger TGF-beta release after oral tolerization are distinct from encephalitogenic epitopes and mediate epitope-driven bystander suppression. | |
| AU651097B2 (en) | Enhancement of the down-regulation of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens | |
| JP3434510B2 (ja) | ミエリン塩基性タンパク質のペプチドフラグメントを用いたｔ‐細胞増殖の抑制 | |
| JP2004026797A (ja) | ペプチドｐ２７７類似体及びこれを含む糖尿病の治療又は診断のための薬剤組成物 | |
| EP0482089B1 (en) | Method of treating autoimmune uveoretinitis in human | |
| EP0977586B1 (en) | Combinations of antigen and mucosal binding component for inducing specific immunological tolerance |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |