CN105924522A - 一种vi型胶原蛋白抗体、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种VI型胶原蛋白抗体、制备方法及其应用，属于生物技术领域。一种VI型胶原蛋白单克隆抗体，包括抗原结合位点，所述的抗原结合位点位于序列VI型胶原蛋白a1片段，核苷酸序列为SEQ ID No:1。本发明选择VI型胶原a1片段中的抗原作为免疫原，使用大肠杆菌表达系统，得到的单克隆抗体，能够与人体血清内中VI型胶原蛋白进行特异性结合，用于检测血清中VI型胶原的含量变化，可大大提高临床对不明原因性肝病的诊断水平。

Description

一种VI型胶原蛋白抗体、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种VI型胶原蛋白抗体、制备方法及其应用。

背景技术

VI型胶原蛋白(collagen VI)属于胶原类蛋白之一，普遍存在于胞外基质的功能蛋白，其显著特征是分子量大和半胱氨酸含量高，由a1，a2，a3三亚基组成。由于其良好的生物学特性，可以促进间质细胞和软骨细胞的生成与迁移而维持组织的完整性，并且机械性能良好。VI型胶原、IV型胶原和层粘连蛋白是肝细胞外基质的主要成份，VI型胶原蛋白在肝细胞成熟过程中起一定作用。当细胞发生炎症时,VI型胶原会被酶最先作用释放一些VI型胶原蛋白肽，血清中VI型胶原的含量会明显升高。

通过维持细胞外基质的结构和功能,Ⅵ型胶原能够维持血管、肺、软骨、肌肉及皮肤等组织的完整性,如果编码Ⅵ型胶原蛋白的基因发生突变,将会形成Bethle肌病和Ullrich综合征,导致肌肉无力和消瘦；Ⅵ型胶原蛋白的缺失还可以导致线粒体功能的丧失和细胞凋亡。另一方面,Ⅵ型胶原的增加或积累同样会导致疾病的发生,如浅表性纤维瘤、神经纤维瘤、瘢痕疙瘩、肺纤维化、肝纤维化、糖尿病肾损伤以及风湿性关节炎等。Ⅵ型胶原还影响了细胞的分化、粘附、迁移、增殖以及生存。将心肌纤维细胞置于含有Ⅵ型胶原的基质中培养，发现由于Ⅵ型胶原的诱导，成肌纤维细胞出现了分化，体内实验同样证实了这个结果。在Ⅵ型胶原功能研究中，Ⅵ型胶原对各种定向造血干细胞具有较强的粘附性，发挥这种粘附性的位置限定在3个肽链的螺旋区。Ⅵ胶原还能够促进各种细胞的增殖，这种促进增殖作用可以被Ⅵ型胶原的单独的肽链所阻断。而增强纤维细胞的扩散和移动是通过Ⅵ型胶原同细胞表面蛋白聚糖N G、核心蛋白聚糖、多配体聚糖、透明质酸以及其他类型胶原相结合而实现的。

胶原蛋白作为肝纤维化增生结缔组织的主要成份，其细胞来源一直是肝纤维化的研究重点。研究表明，胶原蛋白可由多种细胞产生，如贮脂细胞、肝细胞、内皮细胞等，而贮脂细胞是ECM，尤其是胶原蛋白的主要细胞来源。贮脂细胞在炎症刺激下，转化为能表达平滑肌肌动蛋白的肌纤维母细胞,合成许多ECM成份如胶原蛋白、蛋白多糖、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、内动蛋白、健蛋白和透明质酸。

临床诊断上，VI型胶原蛋白由于其结构的复杂性，使用基因工程的办法很难在体外再现出生物活性高的抗原，导致没有高准确度的体外诊断试剂原料，影响到临床案例被误诊和漏诊，影响到相关疾病的早发现、早治疗。

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明公开了VI型胶原蛋白抗原诊断试剂抗体产品,有效解决了临床诊断试剂原料质量低下的问题，大大提高了对临床不明原因性肝病的诊断水平，推动我国肝病诊断试剂的整体水平的提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种VI型胶原蛋白抗体、制备方法及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种VI型胶原蛋白单克隆抗体，包括抗原结合位点，所述的抗原结合位点位于序列VI型胶原蛋白a1片段，核苷酸序列为SEQ ID No:1。

进一步地，上述VI型胶原蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤为：选择VI型胶原蛋白a1片段作为抗原，转入大肠杆菌进行抗原蛋白表达，分4次将筛选的抗原免疫SPF级小鼠，将小鼠产生的效应B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到单克隆细胞株，由单克隆细胞株分泌获得。

更进一步地，上述VI型胶原蛋白单克隆抗体可以用于制备VI型胶原蛋白检测试剂盒，检测血清中VI型胶原蛋白含量的试剂盒，用于临床上对肝病的辅助诊断。

本发明选择VI型胶原a1片段中的抗原作为免疫原，弥补以为抗原的缺陷，使用大肠杆菌表达系统，该系统采用植物细胞启动因子表达量高，成本低廉，得到的单克隆抗体，能够与人体血清内中VI型胶原蛋白进行特异性结合，用于检测血清中VI型胶原的含量变化，可大大提高临床对不明原因性肝病的诊断水平，推动我国肝病诊断试剂的整体水平的提高。

附图说明

图1为VI型胶原蛋白标记用抗体SDS-PAGE图

图中：1-10.0ug硫铵纯化标记用抗体、2-1.0ug硫铵纯化标记用抗体、3-10.0ugDEAE纯化标记用抗体、4-1.0ugDEAE纯化标记用抗体。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 VI型胶原蛋白单克隆抗体的制备

(1)小鼠免疫及脾细胞与杂交瘤的融合

取6～8周龄雌性Balb/c小鼠，初次免疫每只小鼠肌肉注射用福氏完全佐剂乳化的5μg重组抗原(总体积50μl)；15天后进行二次基础免疫，方法为取相同量的抗原用福氏不完全佐剂乳化，肌肉注射；30天后，尾静脉加强注射5μg不加佐剂的抗原，并于加强免疫后72小时，杀死小鼠，收集血液，取脾制备脾细胞悬液(悬于RPMI 1640培养基中)，细胞计数板细胞计数。

按1/6于脾细胞的数量取培养的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，混合后离心，利用聚乙二醇(PEG 1500)使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；将细胞悬液与等体积的饲养细胞混合后，分置于96孔细胞培养板中(200μl/孔)于5％二氧化碳培养箱(ESPEC BNA-311)37℃培养；3天后，用HT培养基(黄嘌呤1.361mg+胸腺嘧啶核苷0.388mg，加RPMI1640(GIBCO公司)培养基至100mL，45～50℃条件下溶解后，过滤除菌；半保留换液；7天后，用重组抗原包被板，利用如下述酶联免疫吸附法(ELISA)检测96孔细胞培养板中所得杂交瘤细胞上清培养液；对于ELISA检测为阳性的细胞克隆，利用有限稀释法进行克隆化。

(2)ELISA检测法

如上以VI型胶原蛋白作为抗原包被的ELISA板，检测时，于每孔中加入100μl细胞培养液上清；每块96孔微量滴定板设一阳性对照，加入100μl小鼠抗HEV-Ag多抗血清(1:100稀释使用)；另设一阴性对照，加入100μlHT细胞培养液。

37℃温浴30分钟，用PBST洗涤液洗5遍，拍干后加入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-GAM Ig，DAKO公司)，37℃温浴30分钟，取出后用PBST洗涤液洗5遍，拍干后先后加入底物液A、B各50μl(底物液A成分为：13.42g Na2HPO4·12H2O、4.2g柠檬酸·H2O和0.3g过氧化氢，用去离子水中调节体积为700ml；显色液B成分为：0.2g四甲基联苯胺、20ml二甲基甲酰胺用去离子水中调节体积为700ml)，37℃显色10分钟，加入50μl终止液(2M H2SO4)终止反应，并于酶标仪上检测各孔的OD450值，以OD450值高于阴性对照2倍以上者视为阳性。

(3)单克隆抗体腹水的获得及纯化

取10周龄的健康Balb/c小鼠，腹腔注射福氏不完全佐剂，每只0.5ml；7天后，收集克隆化的杂交瘤细胞，离心去上清，加入不含血清的培养基，调节细胞密度至2×105～2×106个/ml，每只小鼠注射0.5ml；7天后小鼠腹部增大，开始收集腹水；3000rpm离心30分钟，吸取上清部分的液体，0.45μm的微孔滤膜过滤除菌，分装后-70℃保存。

将腹水进行辛酸－饱和硫酸铵处理后，用PBS复溶；装入透析带中，放入2L 0.02M pH7.2磷酸盐缓冲液中，4℃搅拌下脱盐12小时左右，期间更换3次以上透析液；DEAE(Pharmacia公司)柱层析纯化，上样缓冲液为0.02MPB，洗脱缓冲液为0.2M PBS，并收集0.2M PBS洗脱组份；取出后分装-20℃保存。

(4)抗体纯化方法

将腹水或血清用0.02mol/L、pH7.4的PBS10倍稀释，搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵(浓度达到50％饱和度)，4℃过夜。4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于适量的PBS中，-20℃保存。

实施例2 VI型胶原蛋白单克隆抗体的检定

(1)单抗纯度：

用SDS-PAGE蛋白电泳法，泳道1、3加样量为10μg，泳道2、4加样量为1.0μg，同时用已知分子量的标准系列作为参照，经考马斯亮蓝染色，纯度大于90％，结果如图1所示。

(2)蛋白含量：

采用紫外吸收法对蛋白含量进行检测，蛋白含量不低于0.5mg/ml。

(3)免疫活性：

用双抗原夹心法检测抗体滴度，滴度≥1:100

实施例3VI型胶原蛋白单克隆抗体的初步鉴定

(1)单抗亲和力及表位分组抗原和抗体进行包被

使用96孔聚苯乙烯板进行包被，使用0.05M NaHCO3缓冲液(pH9.6)将抗体稀释至合适浓度，抗原稀释为2.5ug/ml，每孔加入100ul，37℃ 2小时，用pH7.4的含0.1％Tween PBS(PBST)洗涤3遍后，每孔加入含20％牛血清的包被缓冲液200ul，37℃封闭2小时，PBST洗涤3遍，保存于4℃备用。

(2)采用不同检测方法

a.间接ELISA

间接ELISA中，使用含5％牛血清的PBST将待检抗体稀释至合适浓度，加入包被有抗原的微孔板中，100ul/孔，37℃孵育1小时，PBST洗涤5遍；然后每孔加入100ul使用含5％牛血清PBST 1：5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育30分钟后，PBST洗涤五遍，加入TMB底物，37℃显色15分钟；在波长450nm处读取各孔A值。

b.竞争ELISA

根据标记抗体的滴定结果，将标记抗体浓度稀释至A值约为2.00左右，同时将竞争抗体浓度稀释为标记抗体现浓度的20倍；竞争抗体和标记抗体各50ul加入微孔板中，平行双孔测定。与竞争抗体浓度相同的无关单抗作为阴性对照，与竞争抗体浓度相同与标记抗体同株的未标记抗体作为阳性对照。37℃孵育1小时后，洗板，TMB显色，450nm处读取A值，计算竞争抗体对标记抗体的抑制率。

抑制率＝A竞争-A阳性/A阴性-A阳性

如抑制率≥75％为两株单抗所识别位点完全不相关；≥50％<75％为不完全相关；≥25％<50％为相关；<25％为完全相关。

c.双抗体夹心ELISA，间接双抗体夹心ELISA，LAB间接双抗体夹心ELISA

包被有捕获抗体的酶标板条中加入使用含5％牛血清PBST 10倍稀释的待测血清，37℃孵育2小时，PBST洗涤3遍。

(1)经典双抗体夹心法：加入HRP标记的一抗，37℃孵育1小时，PBST洗涤5遍后，加入底物显色；

(2)间接双抗体夹心：加入羊抗HEV多抗，37℃孵育1小时后，PBST洗涤5遍，然后加入HRP标记兔抗羊IgG抗体，37℃孵育30分钟后，PBST洗涤5遍，加入底物显色；

(3)LAB间接双抗体夹心：加入羊抗HEV多抗，37℃孵育1小时后，PBST洗涤5遍，然后加入生物素标记兔抗羊IgG抗体，37℃孵育30分钟后，PBST洗涤5遍，再加入HRP标记亲和素，37℃孵育30分钟后，PBST洗涤5遍，加入底物显色。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种VI型胶原蛋白单克隆抗体，其特征在于，包括抗原结合位点，所述的抗原结合位点位于序列VI型胶原蛋白a1片段。

2.根据权利要求1所述的VI型胶原蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述的抗原结合位点的核苷酸序列为SEQ ID No:1。

3.根据权利要求1所述的VI型胶原蛋白单克隆抗体，其特征在于，以VI型胶原蛋白a1片段作为抗原，转入大肠杆菌进行抗原蛋白表达，以SPF级小鼠作为免疫对象，将小鼠产生的效应B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，由获得单克隆细胞株分泌产生。

4.权利要求1所述的VI型胶原蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤为：选择VI型胶原蛋白a1片段作为抗原，转入大肠杆菌进行抗原蛋白表达，分4次将筛选的抗原免疫SPF级小鼠，将小鼠产生的效应B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到单克隆细胞株，由单克隆细胞株分泌获得。

5.权利要求1所述的VI型胶原蛋白单克隆抗体在制备VI型胶原蛋白检测试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒是检测血清中VI型胶原蛋白含量的试剂盒。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒用于临床上对肝病的辅助诊断。