CN105713103B

CN105713103B - 一种北柴胡多糖片段的纯化工艺及其在制备抗炎药物中的应用

Info

Publication number: CN105713103B
Application number: CN201610151866.1A
Authority: CN
Inventors: 佟海滨; 孙新; 吴明江
Original assignee: Wenzhou University; Beihua University
Current assignee: Wenzhou University; Beihua University
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2016-03-17
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2036-03-17
Also published as: CN105713103A

Abstract

本发明属于天然药物化学领域，特别是涉及到一种天然多糖类抗炎药物分子的分离纯化及其应用。本发明利用水提醇沉、脱蛋白、酸水解、冷冻干燥、脱盐、亲和色谱等方法，从北柴胡中纯化具有拮抗P‑选择素功能的多糖片段。流式细胞术和蛋白互作分析实验结果表明北柴胡多糖片段可以有效阻断P‑选择素与HL‑60细胞的结合，并拮抗P‑选择素与PSGL‑1间的相互作用。平行板流动小室和急性腹腔炎小鼠模型实验结果表明，北柴胡多糖片段在剪切应力状态下对P‑选择素介导的HL‑60细胞黏附具有显著抑制作用，并能有效抑制小鼠腹腔液中白细胞的渗出。通过本方法制备的北柴胡多糖片段具有良好的抗炎活性，作为新型抗炎药物有着广阔的应用前景。

Description

一种北柴胡多糖片段的纯化工艺及其在制备抗炎药物中的应用

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，特别是涉及到一种具有特异靶向性的天然抗炎药物分子的分离纯化及其应用。

背景技术

炎症反应在人体防御病原体入侵以及修复自身损伤组织中扮演着相当重要的角色，它受到免疫系统高度精细的调控，适度的炎症反应可动员体内的防御力量克服对机体的损伤作用，一旦这种调节能力失常将会引起一系列非可控性炎症反应。近年来的研究发现，白细胞向组织中大量而持续的浸润是多种急慢性炎症疾病，如牛皮癣、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、支气管哮喘、慢性阻塞性肺炎及动脉粥样硬化等发病的中心环节，预防和治疗上述炎症相关疾病始终是医学领域的难题。大量的研究表明P-选择素（P-Selectin）是参与炎症反应的重要黏附分子之一，它可以作为抗炎药物研发的新靶点。

炎症反应是一个多步骤的过程，其中白细胞在血管内皮上的动态黏附和血管渗出是炎症反应的重要环节，其分子基础在于白细胞与内皮细胞表面黏附分子间的相互作用。P-选择素是炎症部位血管内皮早期表达的参与介导白细胞与血管内皮起始识别与滚动黏附的关键分子。P-选择素又称CD62P，储存于内皮细胞的Weibel-Palade小体中，当血管内皮受到炎症因子刺激后，P-选择素被迅速转运并整合到活化的内皮表面，通过与白细胞微绒毛上P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）的高度动态相互作用，从而捕获并介导白细胞在血管内皮上的起始识别和滚动黏附，并引发一系列白细胞活化的生理事件。因而，P-选择素是参与启动炎症反应并维持炎症状态的关键黏附分子，P-选择素过渡或持续表达已经成为某些组织炎症病变的标志，研究人员发现阻断P-选择素与其生理配体的结合，可明显减少白细胞在微静脉壁上的黏着数目，并有效抑制白细胞活化，缓解组织损伤，表现出良好的抗炎效果。筛选P-选择素的高效拮抗剂，阻断白细胞黏附，可以为炎症相关疾病的治疗提供新的策略和手段。

柴胡是我国的传统中药和常用中药，《中华人民共和国药典》（2005年版）收载伞形科多年生草本植物北柴胡（Bupleurum chinense DC.）和狭叶柴胡（南柴胡，Bupleurumscorzonerifolium Willd.）的干燥根为柴胡的药用部位，北柴胡是商品柴胡的主流品种，在我国已有两千多年的应用历史。柴胡味苦，性微寒，归肝、胆、肺经，具有和解表里、疏肝解郁、升阳举陷、退热截疟之功效，常用于治疗感冒发热、寒热往来、胸满胁痛、肝郁气滞、疟疾等。柴胡含有丰富的活性化学成分，主要包括柴胡皂苷，甾醇，挥发油（柴胡醇、丁香酚等）和多糖等。近些年来国内外的研究主要集中在柴胡皂苷的药效学功能，而对柴胡多糖的研究报道较少，尤其是有关北柴胡中具有拮抗P-选择素功能的多糖片段纯化及其药物用途未见报道。

发明内容

本项发明目的是提供一种从北柴胡中分离纯化具有拮抗P-选择素功能的多糖片段的方法，通过体内、体外炎症模型，确证北柴胡多糖片段针对P-选择素靶点的抗炎效果，将其应用于制备预防和治疗炎症相关疾病的药物之中。

本发明涉及到北柴胡多糖的分离提取方法、多糖水解方法、亲和色谱法、流式细胞术术、蛋白互作分析、平行板流动小室实验、急性腹腔炎小鼠模型等相关内容。

本发明分离纯化拮抗P-选择素功能的北柴胡多糖片段的方法是：

先将北柴胡粉碎后，利用乙醇回流提取脱脂，残渣利用水提醇沉法得到北柴胡粗多糖，经反复冻融、蛋白酶和sevag法联合脱蛋白，三氟乙酸水解后得到多糖水解产物，加样到P-选择素亲和层析柱，梯度洗脱，收集高盐洗脱部分，经脱盐、冷冻干燥后，得到与P-选择素具有高亲和力的北柴胡多糖功能性片段。

流式细胞术实验结果表明该多糖片段可以有效阻断重组人P-选择素与HL-60细胞的结合，在剂量为10、50、200μg/ml时，抑制率分别达到了23.4%、50.9%、85.2%，高剂量组拮抗效果接近P-选择素阻断型抗体9E1。利用体外蛋白互作实验结果表明北柴胡多糖片段的干预处理可以有效阻断P-选择素与PSGL-1间的相互作用，在剂量为50和200μg/ml时，抑制率分别达到了66%和94%。利用体外模拟毛细血管的平行板流动小室实验发现，10、50、200μg/ml剂量的北柴胡多糖片段在层流条件下抑制HL-60细胞在CHO-P单层细胞上的滚动黏附抑制率分别达到47.9%、73.9%、86.7%。利用急性腹腔炎小鼠模型检测北柴胡多糖片段的抗炎活性，结果表明尾静脉注射北柴胡多糖片段后能够有效抑制小鼠腹腔液中性粒细胞渗出，在剂量为10、50、200mg/kg时，抑制率分别达到了39.1%、61.2%、83.8%。

本发明纯化得到拮抗P-选择素功能的北柴胡多糖片段，并在分子水平、细胞水平和整体水平上确证了其抗炎活性，北柴胡多糖片段作为新型糖类抗炎药物有着良好的应用前景。

附图说明

附图1为流式细胞术检测北柴胡多糖片段拮抗P-选择素与HL-60细胞黏附作用示意图；

附图2为北柴胡多糖片段抑制P-选择素与PSGL-1相互作用示意图；

附图3 为北柴胡多糖片段对HL-60细胞与CHO-P在层流状态下的黏附抑制作用示意图；

附图4 为北柴胡多糖片段对小鼠急性腹腔炎的抑制作用示意图。

具体实施方式

实施例1：

拮抗P-选择素功能的北柴胡多糖片段制备：

（1）北柴胡总多糖的分离提取。将烘干的北柴胡粉碎过筛，经乙醇回流脱脂后，残渣于60～90℃热水浸提3～5次，每次提取2～4小时，抽滤，合并滤液，将滤液在30～70℃、真空度-0.03～-0.09MPa下减压浓缩，加入2～5倍体积的无水乙醇沉淀，低温静置过夜，离心，沉淀加蒸馏水溶解，再次重复乙醇沉淀的步骤2～5次，最后一次得到的沉淀经乙醇、丙酮、乙醚漂洗并减压干燥后，用蒸馏水溶解，经反复冻融后，上清液加入链霉菌蛋白酶消化4～24小时，之后按一定的体积比加入Sevag试剂脱蛋白3～15次，浓缩，冷冻干燥，得到深灰色的北柴胡总多糖样品。

（2）北柴胡总多糖的酸水解。将北柴胡总多糖置于具塞瓶中，加入0.1～1M三氟乙酸溶液，40～100℃条件下水解10～240分钟，无水甲醇旋蒸，加超纯水复溶，冷冻干燥, 得到北柴胡总多糖酸水解产物。

（3）rhP-Fc/Sepharose Protein A亲和层析制备。以重组人P-选择素/Fc嵌合体蛋白（rhP-Fc, Recombinant Human PSelectin/CD62P Fc Chimera）作为诱饵蛋白，利用Protein A特异性结合抗体Fc区段这一特性，在特定缓冲液条件下将rhP-Fc结合到Sepharose Protein A层析介质上，制备得到P-选择素免疫亲和层析柱。亲和层析柱经缓冲液平衡处理后，将北柴胡总多糖酸水解样品上样到层析柱，在温度为0～50℃、流速为0.5～3BV/h条件下，分别利用1～20倍柱体积的低盐洗脱液和高盐洗脱液洗脱样品，收集高盐洗脱部分，冷冻干燥后，加少量蒸馏水复溶，利用凝胶过滤法脱盐，样品经冷冻干燥后得到与P-选择素具有高亲和力的北柴胡多糖功能性片段。

实施例2：

北柴胡多糖片段拮抗P-选择素与HL-60细胞的黏附作用：利用流式细胞术评价北柴胡多糖片段阻断P-选择素与其生理配体PSGL-1（P-selectin glycoprotein ligand-1）的结合能力。HL-60细胞膜表面高表达PSGL-1，因而该实验选用HL-60细胞作为P-选择素生理配体的供体。首先将rhP-Fc与10、50、200μg/ml的北柴胡多糖片段共同孵育，再向反应体系中加入HL-60细胞悬液继续孵育，然后利用FITC偶联的抗人IgG荧光抗体标记rhP-Fc，采用流式细胞术检测各实验组的平均荧光强度和阳性细胞百分数。结果表明北柴胡多糖片段可以有效阻断rhP-Fc与HL-60细胞的结合，低、中、高剂量组的抑制效果分别达到23.4%、50.9%、85.2%，其中高剂量组的拮抗效果接近9E1组（P-选择素阻断型单抗），见附图1。

实施例3：

北柴胡多糖片段抑制P-选择素与PSGL-1相互作用：利用体外蛋白互作分析实验评价北柴胡多糖片段拮抗P-选择素与PSGL-1相互作用的能力。将rhP-Fc结合到SepharoseProtein A 固相基质后，与北柴胡多糖片段进行充分孵育，将上述固相基质与HL-60细胞膜裂解液共同孵育，经PBS反复清洗后，利用免疫印迹法对P-选择素共沉淀下来的PSGL-1进行分析，评价北柴胡多糖片段阻断P-选择素与PSGL-1结合的能力。实验结果表明，P-选择素能够牢牢结合HL-60细胞表达的PSGL-1，而北柴胡多糖片段的干预处理可以有效阻断P-选择素与PSGL-1间的相互作用，当剂量为50和200μg/ml时，阻断率为66%和94%，见附图2。

实施例4：

北柴胡多糖片段抑制HL-60细胞与P-选择素在生理状态下的结合：

采用Glycotech公司的平行板流动小室（Parallel-plate flow chamber），配合显微成像设备、注射泵以及真空泵，建立体外模拟毛细血管血流的实验装置，测定北柴胡多糖片段阻断HL-60细胞与P-选择素在血流剪切应力条件下相互作用的能力。利用慢病毒载体构建稳定转染P-选择素的CHO细胞系（CHO-P），将CHO-P细胞均匀铺于35mm培养板中，过夜培养成95%融合度以上的细胞单层后，置于平行板流动小室装置中，然后放置在倒置显微镜的载物台上（系统中注入HL-60细胞前，CHO-P细胞分别与10、50、200μg/ml的北柴胡多糖片段孵育10～120分钟）。倒置显微镜连接有CCD，将视频图像传送到电脑显示器同步观察。首先用注射泵注入PBS冲洗平行板流动小室1～5min，注入HL-60细胞单细胞悬液（5×10⁶cells/mL），以适合的流速维持层壁剪切压0.1～2dyn/cm²，模拟体外微循环的流体机械环境。当HL-60细胞进入视野后，随机选定10～20个区域（0.1266 mm²），记录黏附于CHO-P表面的HL-60细胞，最后通过软件NIH ImageJ计数。结果显示，北柴胡多糖片段可以明显地阻断HL-60细胞与CHO-P在层流状态下的结合。与阳性对照相比，低、中、高剂量组的抑制效果分别达到47.9%、73.9%、86.7%，见附图3。

实施例5：

北柴胡多糖片段对小鼠急性腹腔炎的抑制作用：向雄性小鼠腹膜内注射2mL的3%巯基乙醇酸钠培养基或者无菌生理盐水。10 min后，于小鼠尾静脉分别注射无菌生理盐水、剂量为10、50、200 mg/kg的北柴胡多糖片段的生理盐水溶液。1～5h后处死小鼠，用生理盐水灌洗，收集腹腔液。离心后，固定细胞，涂片和染色，记数每毫升灌洗液白细胞的数目。上述实验重复三次，取平均值。结果显示，与对照组相比，北柴胡多糖片段能够显著的抑制模型小鼠腹腔中白细胞的渗出，其低、中、高剂量北柴胡多糖片段的抑制率分别达到了39.1%、61.2%、83.8%，见附图4。

Claims

1.拮抗P-选择素功能的北柴胡多糖片段的制备方法，其特征在于具体步骤是：

将烘干的北柴胡粉碎过筛，经乙醇脱脂后，残渣利用水提醇沉法提取粗多糖，经反复冻融、酶法及Sevag法联合脱蛋白，冷冻干燥，将多糖样品置于具塞瓶中并加入0.1～1M三氟乙酸溶液，40～100℃条件下水解10～240分钟，无水甲醇旋蒸，冷冻干燥, 得到的酸水解产物上样到经缓冲液平衡处理的重组人P-选择素/Fc嵌合体蛋白（rhP-Fc）偶联的SepharoseProtein A 层析介质上，分别利用低盐洗脱液和高盐洗脱液洗脱样品，收集高盐洗脱部分，样品经脱盐、冷冻干燥后得到拮抗P-选择素功能的北柴胡多糖片段。

2.按权利要求1的方法提取的拮抗P-选择素功能的北柴胡多糖片段。

3.按权利要求1的方法提取的拮抗P-选择素功能的北柴胡多糖片段在制备针对P-选择素靶点的抗炎药物中的应用。