CN1871233A - 新型螯合剂和螯合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一组新型螯合剂、新型螯合物、用所述螯合物或螯合剂标记的生物分子以及与所述螯合物、螯合剂或标记的生物分子缀合的固体载体。更具体地讲，本发明涉及用于固相合成低聚核苷酸或低聚肽的新型螯合剂以及这样得到的低聚核苷酸或低聚肽。

Description

新型螯合剂和螯合物及其应用
发明领域
本发明涉及一组新型螯合剂、新型螯合物、用所述螯合物或螯合剂标记的生物分子以及与所述螯合物、螯合剂或标记的生物分子缀合的固体载体。
发明背景
本文使用的用于说明发明背景的出版物和其他材料，特别是用于详细说明本发明的那些出版物和其他材料通过引用结合到本文中来。
由于镧系(III)螯合物独特的发光性能，通常作为非放射性标记物广泛用于各种日常和研究应用。由于镧系(III)螯合物发光强、发光衰变时间长，因此为需要高灵敏度试验的理想标记物。基于镧系螯合物的时间分辨荧光试验越来越多地用于诊断、研究和高通量筛选。多相DELFIA技术用于需要特殊的灵敏度、强度和多标记方法的试验[Hemmil等，Anal.Biochem.1984，137，335-343]。基于荧光共振能量转化(TR-FRET)、荧光猝灭(TR-FQA)或改变结合反应过程中的发光性能，开发了发光高度稳定的螯合物，将时间分辨的应用延伸至均相试验[Hemmil，I.；Mukkala，V.-M.Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.2001，38，441-519]。
在大多数情况下缀合反应在溶液中进行，生物活性分子(例如蛋白质、肽、核酸、低聚核苷酸或半抗原)的氨基或巯基与镧系(III)螯合物的异硫氰酸基、卤代乙酰基、3，5-二氯-2，4，6-三嗪基衍生物以及其他报道基团反应。
由于在所有的情况下均使用过量的活性标记物进行标记反应，因此繁复的纯化过程是不可避免的。更具体地讲，当存在几个相似反应活性的官能团需要连接几个标记分子或对特定部位标记时，所需的生物分子缀合物的分离和表征鉴定是非常困难的，通常在实际应用中不能实现。当然，不能避免大生物分子(例如蛋白质)的溶液相标记。在这些情况下，标记反应必须尽可能地有选择性和有效。
已努力开发适用于时间分辨荧光应用的新型高度发光螯合物标记物。这些标记物的实例有由作为能量传递(mediating)基团的以下物质的衍生物和作为螯合部分的多元羧酸组成的稳定的螯合物：各种吡啶[US 4,920,195、US 4,801,722、US 4,761,481、PCT/FI91/00373、US 4,459,186、EP A-0770610、Remuinan等，J.Chem.Soc.Perkin Trans2，1993，1099]、各种联吡啶[US 5,216,134]、各种三联吡啶[US4,859,777、US 5,202,423、US 5,324,825]或各种酚类化合物[US4,670,572、US 4,794,191、意大利专利42508 A789]。此外，还公开了各种二羧酸酯衍生物[US 5,032,677、US 5,055,578、US 4,772,563]、大环穴状化合物[US 4,927,923、WO 93/5049、EP-A-493745]和大环席夫碱类[EP-A-369-000]。还公开了使用固相合成法，用发光标记物标记生物特异性结合反应物(例如半抗原、肽、受体配体、药物或PNA低聚物)的方法[US 6,080,839]。还开发了在固相上多标记低聚核苷酸的类似方法[EP A 1152010、EP A 1308452]。
但是，以前未描述过在其发色部分具有呋喃基取代的吡啶基且具有能与生物分子或固相结合的活性基团的螯合物或螯合剂。
发明目标和概述
本发明的主要目标为提供螯合剂及其金属螯合物，所述螯合剂及其金属螯合物用于标记生物分子用作时间分辨荧光光谱、磁共振成象(MRI)或正子发射断层摄影(PET)的探头。
本发明的一个具体的目标为提供一种螯合剂，所述螯合剂与不同的螯合的镧系离子，特别是铕(III)、钐(III)、铽(III)和镝(III)一起有很强的荧光。这些镧系螯合物特别用于多参数生物亲和力试验和候选药物的高通量筛选。
本发明的另一个目标为提供使金属螯合物高度稳定的螯合剂。具体目标为要获得有足够的稳定性以用于体内应用的螯合物，例如用于MRI或PET应用。
本发明的另一个目标为提供适用于在溶液中标记生物分子的螯合物或螯合剂。
本发明的再一个目标为提供适用于在固相上合成并同时标记低聚肽或低聚核苷酸的螯合物或螯合剂。
本发明的再一个目标为提供与本发明的螯合物、螯合剂或生物分子缀合的固体载体。
因此，本发明的一方面涉及一种螯合剂，所述螯合剂包含：
-发色部分，所述发色部分包含一个或多个芳族单元，其中至少一个所述芳族单元为呋喃基取代的吡啶基，
-螯合部分，所述螯合部分包含至少两个羧酸或膦酸基团或所述酸的酯或盐，所述螯合部分与所述发色部分的芳族单元或者直接相连或者通过含氮的烃链相连，和
-活性基团A，所述活性基团通过连接基x连接于所述发色部分或所述螯合部分，所述活性基团A能与固相上的生物分子或官能团结合。
本发明的另一方面涉及一种螯合物，所述螯合物包含：
-金属离子，
-发色部分，所述发色部分包含一个或多个芳族单元，其中至少一个所述芳族单元为呋喃基取代的吡啶基，
-螯合部分，所述螯合部分包含至少两个羧酸或膦酸基团或所述酸的酯或盐，所述螯合部分与所述发色部分的芳族单元或者直接相连或者通过含氮的烃链相连，和
-活性基团A，所述活性基团通过连接基x连接于所述发色部分或所述螯合部分，所述活性基团A能与固相上的生物分子或官能团结合。
本发明的第三方面涉及一种与本发明的螯合物缀合的生物分子。
本发明的第四方面涉及一种与本发明的螯合剂缀合的生物分子。
本发明的第五方面涉及一种与本发明的螯合物或标记的生物分子缀合的固体载体。
本发明的第六方面涉及一种已标记的低聚肽，所述已标记的低聚肽通过在固相上合成的方法制得，所述方法为向低聚肽合成仪上的所述低聚肽结构中引入适当的本发明的螯合剂，随后脱保护并任选还引入金属离子。
本发明的第七方面涉及一种已标记的低聚核苷酸，所述已标记的低聚核苷酸通过在固相上合成的方法制得，所述方法为向低聚核苷酸合成仪上的所述低聚核苷酸结构中引入适当的本发明的螯合剂，随后脱保护并任选还引入金属离子。
本发明的第八方面涉及一种与权利要求1的螯合剂缀合的固体载体，所述固体载体适用于合成低聚核苷酸，其中所述活性基团A为：-Y-O-x′-
其中
x′为与所述固体载体相连的连接基，与所述连接基x相同或不同。
Y不存在或为嘌呤或嘧啶或任何其他适用于合成修饰的低聚核苷酸的修饰碱的基团，所述碱通过i)或ii)与氧原子相连，
i)被已保护的羟乙基取代的烃链，
ii)呋喃环或吡喃环或适用于合成修饰的低聚核苷酸的任何修饰的呋喃环或吡喃环。
本发明的第十方面涉及一种螯合剂，所述螯合剂包含：
-发色部分，所述发色部分包含至少两个芳族单元，其中至少一个所述芳族单元为呋喃基取代的吡啶基，和
-螯合部分，所述螯合部分包含至少两个羧酸或膦酸基团或所述酸的酯或盐，所述螯合部分与所述发色部分的芳族单元或者直接相连或者通过含氮的烃链相连，
其中所述芳族单元通过含氮的烃链互相连接。
最后，本发明还涉及包含上述螯合剂和金属离子的螯合物。
发明详述
螯合剂
基于其中的发色部分最常见为包含一个或多个呋喃基取代的吡啶基的二价芳族结构的螯合剂及金属螯合物为新型物质。所述呋喃基取代的吡啶基能吸收光或能量并将激发能转移至螯合的镧系离子，使得荧光性更强，而与使用的镧系离子无关。除了一个或多个所述呋喃基取代的吡啶基，所述发色部分还可包含未取代的吡啶基、带有其他取代基的吡啶基和/或其他芳基。
在合成策略中，使用3-(三丁基甲锡烷基)呋喃代替2-(三丁基甲锡烷基)呋喃作为试剂，可通过其C2原子或通过其C3原子使呋喃基与吡啶环相连。在本文具体实施例中说明的化合物中，吡啶基的4-位带有呋喃取代基。虽然该位置是最优选的取代基的位置，但吡啶环的其他位置也可被取代。
根据一个优选的实施方案，所述发色部分包含两个或三个吡啶基，其中至少一个吡啶基被呋喃基取代。这些吡啶基可直接互相连接，分别形成联吡啶或三联吡啶基。或者，更优选这些吡啶基通过含氮的烃链互相连接。在这种情况下，可得到稳定性非常好的螯合物。该结构的螯合剂使得金属螯合物足够稳定，可用于体内MRI和/或PET应用。
包含三个芳族单元(例如三个吡啶基，其中至少一个吡啶基被呋喃基取代)的化合物，例如基于氮杂冠醚(aza-crown)的化合物特别适用于基于能量转移或猝灭的试验，这是因为它们在约615nm处的发射光谱峰更占优势，这对分析用的波长扰动较小。
在螯合部分与发色部分的芳族单元相连的情况下，螯合部分可与吡啶环相连或与其上的取代基(例如呋喃基)相连。
为了使螯合剂或螯合物能与生物分子或固体载体共价结合，所述螯合剂或螯合物必须带有活性基团A。但是，也存在不需要这种共价结合的应用情况。本发明的螯合化合物还可用于螯合物中不需要活性基团的应用。这种技术的一个实例例如描述于Blomberg等，J.Immunological Methods，1996，193，199。另一个不需要活性基团A的实例为分离嗜曙红细胞和嗜碱细胞。在这种应用时，带正电荷的螯合物和带负电荷的螯合物分别与带负电荷的细胞表面和带正电荷的细胞表面结合。
虽然在许多应用中活性基团A原则上可与发色基团或螯合部分直接相连，但是特别考虑到位阻的原因，还是非常希望活性基团A与发色基团或螯合部分之间分别具有连接基x。在螯合物用于固相合成低聚肽和低聚核苷酸的情况下，所述连接基是非常重要的，但再溶液中标记生物分子也希望具有连接基。
根据一个优选的实施方案，所述活性基团A选自异硫氰酸酯、卤代乙酰氨基、顺丁烯二酰亚氨基、二氯三嗪基、二氯三嗪基氨基、吡啶基二硫基、硫代酯、氨基氧基、酰肼、氨基、聚合基团和羧酸或其酰氯或活性酯。特别是在螯合物或螯合剂与微米微粒(micropaticle)或纳米微粒相连的情况下，优选活性基团为聚合基团。在这种情况下，可在形成颗粒的过程中将标记引入颗粒中。
优选所述连接基x由1-10个部分形成，每一个部分选自亚苯基、包含1-12个碳原子的亚烷基、亚乙炔基(-C≡C-)、1，2-亚乙烯基(-C＝C-)、醚基(-O-)、硫醚基(-S-)、酰氨基(-CO-NH-、-CO-NR′-、-NH-CO-和-NR′-CO-)、羰基(-CO-)、酯基(-COO-和-OOC-)、二硫基(-SS-)、重氮基(-N＝N-)和叔胺基，其中R′表示包含少于5个碳原子的烷基。
基团A-x-可以不同的方式与分子相连。基团A-x-可与螯合部分相连，与将芳族单元结合在一起的含氮的链相连，或者与芳族单元相连。在最后一种情况下，优选所述基团A-x-与呋喃取代基相连。这种化合物易制备，并发现非常有效。
根据一个特别优选的实施方案，所述螯合剂为以下特定结构中的一种：
用于合成肽的螯合剂
根据一个优选的实施方案，本发明的螯合剂适用于合成低聚肽。在这种应用中，所述活性基团A通过连接基x与螯合剂相连，A为氨基酸残基-CH(NHR1)R5，其中R1为临时的保护基团，R5为羧酸或其盐、酰卤或酯。特别优选的螯合剂为以下结构：
Figure A20048003152500181
其中x如上定义，所述保护基团R1选自Fmoc(芴基甲氧基羰基)、Boc(叔丁氧基羰基)或Bsmoc(1，1-二氧代苯并[b]噻吩-2-基甲氧基羰基)，R″为烷基酯或烯丙基酯，R为烷基。
可使用肽合成仪将螯合剂引入生物分子中。可例如通过描述于Jones，J.，The Chemical Synthesis of Peptides，Oxford Univesity Press，Oxford，1994的碳二亚胺化学(即在活化剂存在下，标记试剂的羧酸官能团与固体载体或氨基酸的氨基反应)将螯合剂与和固体载体相连或固定的氨基酸的氨基偶联。当缩合步骤完成后，将标记试剂的临时的氨基保护基团选择性地除去，而材料仍与固体载体相连(例如在Fmoc-保护基团的情况下，与哌啶相连)。随后如上进行螯合剂或其他试剂(氨基酸、半抗原)的二次偶联。当所需分子的合成完成后，材料从固体载体上移除并脱保护。可采用HPLC技术进行纯化。最后，通过加入已知量的金属离子将已纯化的配体转化为相应的金属螯合物。
用于合成低聚核苷酸的螯合剂
根据另一个优选的实施方案，本发明的螯合剂适用于合成低聚核苷酸。在这种情况下，所述活性基团A通过连接基x与螯合剂相连，A为
-Y-O-PZ-O-R4
其中
一个氧原子任选被硫置换，Z为氯或NR2R3，R4为保护基团，R2和R3为烷基，Y不存在或为嘌呤碱或嘧啶碱或任何其他适用于合成修饰的低聚核苷酸的修饰碱的基团。所述碱通过i)或ii)与氧原子相连，其中i)为被已保护的羟乙基取代的烃链，ii)为适用于合成修饰的低聚核苷酸的呋喃环或吡喃环或任何修饰的呋喃环或吡喃环。
可使用低聚核苷酸合成仪将螯合剂引入低聚核苷酸中。一种基于Mitsonobu烷基化(J.Org.Chem.，1999，64，5083；Nucleosides，Nucleotides，1999，18，1339)的可用的方法公开于EP-A-1152010。所述专利公开的方法为在链装配的过程中将所需数量的缀合基团与低聚核苷酸结构直接相连。因此避免了溶液相标记和繁杂的纯化过程。在合成核苷低聚核苷酸结构单元的方法中，关键的反应为上述的Mitsonobu烷基化反应，该反应将各种螯合剂引入核苷中，最后引入低聚核苷酸结构中。在链装配的过程中引入螯合剂。合成完成后，在脱保护步骤中转化为镧系螯合物。
由于活性细胞中的酶降解低聚核苷酸，因此通常未修饰的低聚核苷酸在生理条件下稳定性差。因此，希望根据已知的方法制备修饰的低聚核苷酸，以增强其耐化学品和耐酶降解的稳定性。在现有技术中广泛公开了低聚核苷酸的修饰。参见US 5,612,215。已知从RNA链的核糖单元除去或置换2′-羟基可得到更好的稳定性。WO 92/07065和US 5,672,695公开了用卤素、氨基、叠氮基或巯基置换核糖的2′-羟基。US 5,334,711公开了用烷基或烯基，优选甲基或烯丙基置换2′-羟基的氢。此外，例如可将核苷酸间的磷酸二酯键修饰，使得一个或多个氧被硫、氨基、烷基或烷氧基置换。优选将核苷酸间的键修饰为硫代磷酸酯键。在核苷酸中的碱也可被修饰。
优选Y为胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺苷、鸟嘌呤或胞嘧啶中任一种碱的基团，所述碱通过i)或ii)与氧原子相连，其中i)为被已保护的羟乙基取代的烃链，ii)为在其4-位上具有已保护的羟乙基并任选在其2-位上具有羟基、已保护的羟基或修饰的羟基的呋喃环。
优选活性基团-Y-O-P(NR2R3)-O-R4具有下式的结构之一：
Figure A20048003152500201
其中-为连接基x的位置，DMTr为二甲氧基三苯甲基。
用于该用途的特别优选的螯合剂选自以下公开的特定结构中的一种：
Figure A20048003152500211
其中R″为烷基酯或烯丙基酯，R为烷基，其中x如上定义，A为如上定义的-Y-O-P(NR2R3)-O-R4。
螯合物
所述螯合物包含上述的螯合剂和螯合的金属离子。
在螯合物是用于生物亲和力试验的情况下，所述螯合的金属离子M优选为镧系元素，特别是铕(III)、钐(III)、铽(III)或镝(III)。所述螯合剂优选为上述优选的试剂之一。
特别优选的镧系螯合物为：
Figure A20048003152500231
其中M为金属，z为2或3。
本发明的螯合物可用于体内MRI或PET。用于MRI的优选的金属为钆。但是，用于MRI的还有镧系元素，特别是铕(III)，还有其他镧系元素例如钐(III)和镝(III)。在PET应用中，在恰好使用之前将放射性金属同位素引入螯合剂中。特别合适的放射性同位素有Ga-66、Ga-67、Ga-68、Cr-51、In-111、Y-90、Ho-166、Sm-153、Lu-177、Er-169、Tb-161、Dy-165、Ho-166、Ce-134、Nd-140、Eu-157、Er-165、Ho-161、Eu-147、Tm-167和Co-57。为了得到非常稳定的螯合物，优选所述螯合物含有通过含氮烃链将几个吡啶基相互连接在一起的发色部分。
生物分子
与本发明的螯合剂或螯合物缀合的生物分子优选为低聚肽、低聚核苷酸、DNA、RNA、修饰的低聚核苷酸或多核苷酸(例如单硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和/或糖修饰的或碱修饰的低聚核苷酸或多核苷酸)、蛋白质、寡糖、多糖、磷脂、PNA、LNA、抗体、半抗原、药物、受体结合配体和凝集素(lectine)。
固体载体缀合物
本发明的螯合物、螯合剂和生物分子可在固体载体上缀合。所述固体载体优选为颗粒(例如微米微粒或纳米微粒)、载玻片(slide)或平板。
在所述螯合物或螯合剂含有聚合基团作为活性基团的情况下，则可在制备颗粒的同时将螯合物或螯合剂引入固体载体(例如颗粒)中。
与固体载体共价缀合或非共价缀合的生物分子优选为已标记的低聚肽，所述已标记的低聚肽在固相上合成制得，在低聚肽合成仪上向所述低聚肽结构中引入螯合剂，随后脱保护并任选引入金属离子。或者，与固体载体共价缀合或非共价缀合的生物分子优选为已标记的低聚核苷酸，所述已标记的低聚核苷酸在固相上合成制得，在低聚核苷酸合成仪上向所述低聚核苷酸结构中引入螯合剂，随后脱保护并任选引入金属离子。
与含有活性基团A的螯合剂缀合的固体载体适用于合成低聚核苷酸，所述活性基团A通过连接基x与所述螯合剂相连，A为如上定义的-Y-O-x′-。
用以下非限制性的实施例来说明本发明。
实施例
用以下实施例进一步说明本发明。在实验部分使用的结构和合成路线描述于流程1-11。流程(scheme)1说明螯合物3的合成。实验细节见实施例1-3。流程2说明螯合物9的合成。实验细节见实施例4-9。流程3说明标记试剂13的合成。实验细节见实施例10-13。流程4说明用于将镧系螯合物引入固相上的低聚肽结构的结构单元18的合成。实验细节见实施例14-18。流程5说明标记试剂21-23的合成。实验细节见实施例19-23。流程6A和B说明标记试剂34的合成。实验细节见实施例24-34。流程7说明用于将镧系螯合物固相引入固相上的低聚核苷酸结构的低聚核苷酸标记试剂的制备。流程8说明呋喃部分通过C3与吡啶环相连的螯合物的合成。流程9说明用标记试剂23标记半抗原。实验细节见实施例37。流程10说明用结构单元18标记固相上的低聚肽。实验细节见实施例35。流程11说明用标记反应物34a标记溶液中的低聚肽。实验细节见实施例36。流程12A说明实施例38-45，流程12B说明实施例46-47，流程13说明实施例48-54。
实验方法
机器辅助低聚肽合成的试剂购自Applied Biosystems(FosterCity，CA)。在填充硅胶60(Merck)的柱上进行吸附柱层析。NMR光谱在Brucker 250或Jeol LA-400光谱仪上记录，对于1H的工作频率分别为250.13和399.8MHz。使用Me4Si作为内标。偶联常数的单位是Hz。IR光谱在Perkin Elmer 2000 FT-IR分光光度计上记录。快原子轰击质谱在VG ZabSpec-ao TOF仪器上记录，使用正检测模式。电喷雾质谱在Applied Biosystems Mariner ESI-TOF仪器上记录。按照介绍的方法，将低聚肽装配在Applied Biosystems 433A合成仪上。荧光光谱在PerkinElmer LS 55仪器上记录。
实施例1
合成2，2′，2″，2-{[4-(2-呋喃基)吡啶-2，6-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)1
将2，2′，2″，2-{[4-溴吡啶-2，6-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)(0.29g，0.43mmol)和2-(叔丁基甲锡烷基)呋喃(0.15g，0.43mmol)溶解于DMF(2.0ml)中，随后用氩气脱气。加入四(三苯基膦)合钯(0)(0.025g，0.020mmol)，随后于100℃下将该混合物搅拌5小时。将该混合物冷却至室温，随后真空浓缩。在硅胶柱上纯化(洗脱液：开始用石油醚，随后用石油醚/乙酸乙酯＝5∶2(v/v))。产量0.14g(50％)。
         1H NMR(400MHz，CDCl3)：1.46(36H，s)；3.51(8H，s)；4.06(4H，s)；6.48-6.53(1H，m)；6.92-6.97(1H，m)；7.50-7.52(1H，m)；7.74-7.78(2H，m)；MS：682(MH+)；.UVλmax/nm(H2O)290，227 IR(film)/cm-1 1782(C＝O)，1146(C-O).
实施例2
合成2，2′，2″，2-{[4-(2-呋喃基)吡啶-2，6-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)2
将化合物1(20mg，0.03mmol)溶解于三氟乙酸(0.5ml)中，随后于室温下搅拌3.5小时。真空除去所有的挥发性物质，随后用乙醚研磨残余物。过滤收集沉淀并干燥。产量9.3mg(46％)。
                                             1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：d3.60(8H，s)；4.19(4H，s)；6.79-6.82(1H，m)；7.42-7.48(1H，m)；7.95-7.99(1H，m)；8.03-8.06(1H，m)；).MS 436(M+).UVλmax/nm(H2O)301.IR(film)/cm-1 1735；1618(C＝O)，1195(C-O).
实施例3
合成2，2′，2″2-{[4-(2-呋喃基)吡啶-2，6-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)镧系元素(III)螯合物3
如Takalo等，Bioconjugate Chem.，1994，5，278中所述，将化合物2转化为相应的铕(III)螯合物3a和钐(III)螯合物(3b)。
实施例4
合成4′-(2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶4
将4′-(三氟甲磺酸基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶(2.0g，5.2mmol)溶解于干燥的DMF(10ml)中。加入干燥的TEA(2.3g，23mmol)和2-(叔丁基甲锡烷基)呋喃(2.6g，7.3mmol)，随后用氩气将该混合物脱气。加入二氯·双(三苯基膦)合钯(II)(0.10g，0.15mmol)，随后在氩气气氛下，于90℃下将该混合物加热1小时。加入水(200ml)，于室温下继续搅拌1小时。过滤形成的沉淀，并用冷水(3×20ml)洗涤。将该沉淀悬浮于乙醚(120ml)中，过滤，用乙醚(3×30ml)洗涤。用硅胶柱纯化(洗脱液：氯仿∶甲醇∶氢氧化铵＝12∶1∶0.25，v/v/v)。产量1.4g(88％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ6.57(1H，dd，J2 and 4)；7.12(1H，d，J4)；7.36(2H，ddd，J1，5 and 8)；7.59(1H，d，J2)；7.87(2H，dt，J2 and 8)；8.65(2H，brd，J8)；8.72(2H，s)；8.74(2H，br d，J5)；MS 300[M+].UVλmax/nm(EtOH)268，251.
实施例5
合成4′-(呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶-N，N″-二氧化物5
将化合物4(0.15g，0.50mmol)溶解于二氯甲烷(5.0ml)中。分批加入3-氯过苯甲酸(0.33g，1.9mmol)，随后于室温下将该混合物搅拌6小时。真空蒸除溶剂，随后用硅胶柱纯化粗产物(洗脱液：二氯甲烷∶甲醇＝95∶5(v/v))。产量83mg(50％)。
                                1H NMR(400MHz；CDCl3)：δ6.55(1H，m)；7.10(1H，m)；7.32(2H，m)；7.41(1H，m)；7.58(1H，m)；8.22(2H，br d，J8)；8.40；2H，d，J6)；9.19(2H，s)；MS 332[M+].UVλmax/nm(EtOH)288，249，234.IR(film)1269cm-1(N-O).
实施例6
合成4′-(2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶-6，6″-二甲腈6
将化合物5(0.070g，0.21mmol)溶解于二氯甲烷(5.0ml)中。加入三甲基甲硅烷基甲腈(0.21g，2.1mmol)，随后将该混合物搅拌5分钟，随后滴加苯甲酰氯(0.12g，0.84mmol)。于室温下将该反应进行1.5小时。加入碳酸钾(10％w/v的水溶液，5.0ml)，随后于室温下将该混合物搅拌1.5小时。过滤形成的沉淀并用水(2×10ml)和二氯甲烷(2×10ml)洗涤。产量0.024g(33％)。MS 530[M+]。IR(KBr)/cm-1：2286(C≡N)；1610(C-N)。
实施例7
合成2，2′，2″，2-{[4′-(2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶-6，6′-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)7
将化合物6(22mg，0.063mmol)悬浮于干燥的THF(1.5ml)中，随后用氩气脱气。在5分钟内滴加硼烷-THF络合物(1M，23mg，0.27mmol)，随后于室温下将该混合物搅拌16小时。加入干燥的甲醇(4.0ml)猝灭该反应。真空除去所有的挥发性物质，随后将残余物溶解于HCl的甲醇溶液(10ml)中，随后于室温下搅拌1小时，浓缩。将残余物悬浮于干燥的THF中，过滤，干燥。将残余物溶解于干燥的DMF(3.0ml)中，随后用氩气脱气。加入DIPEA(66mg，0.51mmol)、溴代乙酸叔丁酯(60mg，0.31mmol)和碘化钾(7.0mg，0.043mmol)，随后于室温下将该混合物搅拌16小时。真空除去所有的挥发性物质。在硅胶柱上纯化(洗脱液：石油醚∶乙酸乙酯∶TEA＝10∶1∶1，v/v/v)。产量15mg。
                                                 1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.49(36H，s)；4.19(4H，s)；6.57(1H，m)；7.12(1H，m)；7.57(1H，m)；7.70(2H，d，J7.59)；7.85(2H，t，J7.5)；8.51(2H，d，J7.5)；8.72(2H，s).MS 836[M+].UVγmax/nm(EtOH)289，253IR(膜)/cm-1：1733(C＝O)；1145(C-O-O).
实施例8
合成2，2′，2″，2-{[4′-(2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶-6，6′-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)8
将化合物7(4.1mg，0.0051mmol)溶解于TFA(1.0ml)中，随后于室温下将该混合物搅拌4小时，随后浓缩。用乙醚研磨残余物，过滤收集并干燥。产量3.6mg(86％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.59(8H，s)；4.14(4H，s)；6.76(1H，dd，J1.8 and 3.5)；7.42(1H，d，J3.5)；7.66(1H，d，J8.0)；7.98(1H，s)；8.02(2H，t，J8.0)；8.52(2H，d，J8.0)；8.67(2H，s).UVγmax/nm(EtOH)289，IR(膜)/cm-1：1685(C＝O)；1200(C-O-O).
实施例9
合成2，2′，2″，2-{[4′-(2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶-6，6′-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)镧系元素(III)螯合物9
如实施例3所述，将化合物8转化为相应的铕(III)螯合物9a和钐(III)螯合物9b。
实施例10
合成2，2′，2″，2-{[2-(4-氨基苯基)乙基亚氨基]双(亚甲基)双[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)10
如实施例1所述，将2，2′，2″，2-{[2-(4-氨基苯基)乙基亚氨基]双(亚甲基)双(4-溴吡啶-6，2-二基)双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)(0.30g、0.30mmol)与2-叔丁基甲锡烷基呋喃(0.22g，0.60mmol)反应。产量0.22g(75％)。
                                                               1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.45(36H，s)；3.50(8H，s)；3.88(4H，s)；4.04(4H，s)；6.50(1H，s)；6.87(1H，s)；8.02(4H，s).MS 965[M+].UVγmax/nm(EtOH)287，226.IR(膜)/cm-1：1735(C＝O)，1149(C-O).
实施例11
合成2，2′，2″，2-{[2-(4-氨基苯基)乙基亚氨基]双(亚甲基)双[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)11
如实施例2所述，用TFA将化合物10脱保护，得到目标化合物。收率70％。
                              1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.56(8H，s)；4.08(4H，s)；6.73(2H，m)；6.90(2H，m)；7.13(2H，m)；7.21(2H，m)；7.73(2H，s)；7.90(2H，s)；7.92(2H，s).MS 853[M+].UVγmax/nm(H2O)303.IP(膜)/cm-1：1674(C＝O)，1617(C＝O)，1200(C-O).
实施例12
合成2，2′，2″，2-{[2-(4-氨基苯基)乙基亚氨基]双(亚甲基)双[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)镧系元素(III)螯合物12
如实施例3所述，将化合物11转化为相应的铕(III)螯合物12a和钐(III)螯合物12b。
实施例13
合成2，2′，2″，2-{[2-(4-异硫氰酸基苯基)乙基亚氨基]双(亚甲基)双[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)镧系元素(III)螯合物13
如Takalo等，Bioconjugate Chem.，1994，5，278中所述，将化合物12转化为相应的异硫氰酸基衍生物。
实施例14
合成2，2′，2″，2-{[6-(4-甲氧基三苯甲基)己基亚氨基]双(亚甲基)双[(4-溴)吡啶-6，2-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)14
将[(4-溴-6-溴甲基-2-吡啶基)亚甲基次氨基]双(乙酸)二(叔丁酯)(2.06g，6.0mmol)和6-(4-甲氧基三苯甲基)己二胺(1.15g，3.2mmol)溶解于干燥的DMF(100ml)中。加入DIPEA(5.2ml，30mmol)，随后将于室温下该混合物搅拌2小时，随后浓缩。在硅胶柱上纯化，得到1.30g化合物14。
实施例15
合成2，2′，2″，2-{[6-(4-甲氧基)三苯甲基氨基己基]双(亚甲基)双[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)15
将化合物14(1.11g，0.91mmol)和2-(叔丁基甲锡烷基)呋喃(0.68g，1.9mmol)溶解于DMF(35ml)中，随后用氩气脱气。加入四(三苯基膦)合钯(0)(0.12g)，随后于90℃下将该混合物搅拌2.5小时。将该混合物冷却至室温，随后真空浓缩。在硅胶柱上纯化(洗脱液：石油醚/乙酸乙酯/TEA＝5∶1∶1(v/v/v)；随后5∶3∶1(v/v/v))。产量0.83g(75％)。
实施例16
合成2，2′，2″，2-{(6-氨基己基)双(亚甲基)双[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)16
将化合物15(0.95g，0.80mmol)溶解于TFA(0.25ml)和二氯甲烷(25ml)的混合物中，随后于室温下将该混合物搅拌2小时。用饱和NaHCO3洗涤该反应混合物。有机相经Na2CO3干燥，浓缩，随后在硅胶柱上纯化。产量0.61g(83％)。
实施例17
合成被保护的低聚肽标记反应物17
将化合物16(0.57g，0.62mmol)和Fmoc-Glu-Oall(0.3g，0.74mmol)溶解于二氯甲烷(25ml)中。加入DCC(0.15g，0.74mmol；预溶解于3mlDCM中)，随后于室温下将该反应进行6小时。滤除形成的沉淀，浓缩滤液，随后在硅胶柱上纯化。
实施例18
合成低聚肽标记反应物18
将化合物17(0.42g，0.32mmol)溶解于DCM(10ml)中，随后用氩气脱气。加入Pd(PPh3)4(8mg，0.007mmol)和PhSiH3(69mg，0.64mmol)，随后于室温下将该反应进行30分钟，用10％的柠檬酸洗涤。分离有机层，经4分子筛干燥，随后浓缩。
实施例19
合成2，2′，2″，2-{(6-氨基己基)双(亚甲基)双[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)19
如实施例2中合成化合物3所述进行合成。收率81％。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.25-1.32(4H，m)；1.47-1.55(2H，m)；1.72-1.81(2H，m)；2.70-2.78(2H，m)；3.18-3.23(2H，m)；3.55(8H，s)；4.06(4H，s)；4.53(4H，s)；6.73(2H，dd，J1.6 and 3.6)7.20(2H，d，J3.6)；7.72(2H，s)；7.93(2H，d，J 1.6).MS 746(M+).UVγmax/nm(H2O)302.IR(KBr)/cm-1 1676；1618(C＝O)，1199(C-O).
实施例20
合成2，2′，2″，2-{(6-氨基己基亚氨基)双(亚甲基)双[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)镧系元素(III)螯合物20
如实施例3所述，将化合物19(50mg，0.060mmol)转化为相应的铕(III)螯合物20a和钐(III)螯合物20b。
实施例21
合成2，2′，2″，2-{[6-碘代乙酰氨基己基亚氨基]双(亚甲基)双[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)镧系元素(III)螯合物21
如Takalo等，Bioconjugate Chem.，1994，5，278中所述，将化合物20转化为相应的碘代乙酰氨衍生物21。
实施例22
合成2，2′，2″，2-{[6-(异硫氰酸基己基硫脲基)己基亚氨基]双(亚甲基)双[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)镧系元素(III)螯合物22
将1，4-二异硫氰酸亚苯基酯(6.5mg，0.034mmol)溶解于吡啶∶水∶TEA(9∶1.5∶0.1，v/v/v，0.5ml)的混合物中。滴加化合物20(15mg，0.017mmol；预溶解于相同的溶液中；0.5ml)，随后于室温下将该反应进行1小时。加入丙酮(1.0ml)，随后将沉淀离心分离。
实施例23
合成2，2′，2″，2-{[6-异硫氰酸基己基亚氨基]双(亚甲基)双[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)镧系元素(III)螯合物23
如Takalo等，Bioconjugate Chem.，1994，5，278中所述，将化合物20(100mg)转化为相应的异硫氰酸基衍生物。
实施例24
合成4-(2-呋喃基)-吡啶-2，6-二乙酸二乙酯24
如实施例1所述，将4-溴吡啶-2，6-二羧酸二乙酯(3.70g，12.3mmol)与2-(叔丁基甲锡烷基)呋喃(12.3mmol)反应。产量3.49g(8.6％)。
               1H NMR 1H-NMR(CDCl3)：8.47(2H，s)，7.63(1H，d，J 1.6)，7.08(1H，d，J3.6Hz)，6.59(1H，dd，J1.9 and 3.5Hz)，4.51(4H，q，J7.1)，1.48(6H，t，J7.1).
对于C15H16NO5(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值290.10；实测值290.12。
实施例25
合成4-(呋喃-2-基)-6-(羟甲基)吡啶-2-羧酸乙酯25
将化合物24(3.30g，11.4mmol)悬浮于乙醇(150ml)中。加热至35℃，使该悬浮液溶解。随后加入NaBH4(0.43g，11.4mmol)，随后于室温下将该混合物搅拌40分钟。用6M的HCl水溶液将pH值调节至3，猝灭该反应。蒸发溶剂，随后将残余物悬浮于水(100ml)中，随后用NaHCO3将pH值调节至7。用CH2Cl2∶MeOH(1∶1，v/v)溶液将产物从水中萃取出来。CH2Cl2层用水洗涤两次，并经MgSO4干燥。在硅胶柱上纯化(洗脱液：石油醚(沸点40-60℃)∶乙酸乙酯∶三乙胺＝5∶2∶1，v/v/v)。产量1.76g(62.4％)。
                                                  1H NMR(CDCl3)：δ1.46(3H，t，J7)；4.49(2H，q，J7)；4.88(2H，s)；6.57(1H，dd)；7.00(1H，d)；7.58(1H，m)；7.73(1H，m)；8.23(1H，d).
对于C13H14NO4(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值248.09；实测值248.10。
实施例26
合成6-(溴甲基)-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸乙酯26
将PBr3(0.65ml，6.9mmol)加至DMF(50ml)中，随后冰浴冷却该混合物直至形成白色沉淀。加入化合物25(1.70g，6.9mmol；预溶解于50ml DMF中)，随后于室温下将该混合物搅拌40分钟。用饱和NaHCO3中和该混合物，随后加入水(100ml)。用CH2Cl2萃取产物。二氯甲烷层经MgSO4干燥，随后蒸发至干。在硅胶柱上纯化(洗脱液：5％的MeOH/CH2Cl2)。产量2.13g(87％)。对于C13H13BrNO3(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值310.01；实测值310.01。
实施例27
合成{2-{[4-(呋喃-2-基)-6-(羟甲基)吡啶-2-羰基]氨基}乙基}氨基甲酸4-硝基苄酯27
将化合物25(0.42g，1.7mmol)溶解于乙二胺(10ml)中。于室温下将该混合物搅拌3小时，随后蒸发至干。将残余物溶解于甲苯中，再度蒸发两次，随后溶解于THF(20ml)中。加入TEA(0.24ml，1.7mmol)，随后滴加氯甲酸4-硝基苄酯(0.76g，3.4mmol)的10ml THF的溶液。于室温下将该混合物搅拌2小时。滤除沉淀，随后将滤液蒸发至干。将残余物悬浮于CH2Cl2中，随后过滤产物。在硅胶柱上纯化(洗脱液：3％的MeOH/CH2Cl2)。产量0.46g(61.3％)。
                                              1H-NMR(CDCl3)：8.21(2H，d，J8.8H)，8.13(1H，s)，7.94(1H，s)，7.87(1H，s)，7.60(2H，d，J8.8)，7.42(1H，d，J3.4)，6.72(1H，dd，J 1.7 and 3.4)，5.18(2H，s)，4.66(2H，d，J5.6Hz)，3.42(2H，m)，3.23(2H，m).
对于C21H21N4O7(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值441.14；实测值441.14。
实施例28
合成{2-{[6-(溴甲基)-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-羰基]氨基}乙基}氨基甲酸4-硝基苄酯28
将PBr3(0.10ml，1.0mmol)加至DMF(10ml)中，随后冰浴冷却该混合物直至形成白色沉淀。加入化合物27(0.45g，1.0mmol)的DMF溶液(10ml)，随后于室温下将该混合物搅拌1小时。用饱和NaHCO3中和该混合物，随后加入20ml水。用CH2Cl2萃取产物。二氯甲烷层经Na2SO4干燥，随后蒸发至干。在硅胶柱上纯化(洗脱液：10％的MeOH/CH2Cl2)。产量0.39g(75.8％)
1H-NMR(CDCl3)：8.82(1H，t，J4.5)，8.20(2H，d，J 9.2)，8.03(1H，d，J 1.6)，7.90(1H，d，J 1.6)，7.59(2H，d，J 8.7)，7.46(1H，d，J3.2)，6.74(1H，dd，J 1.6 and 3.5)，5.18(2H，s)，4.76(2H，s)，3.43(2H，m)，3.25(2H，m).
对于C21H20BrN4O6(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值503.06；实测值503.06。
实施例29
合成7-{4-(呋喃-2-基)-6-[2-(4-硝基苄基氧基羰基氨基)乙基氨基甲酰基]吡啶-2-基甲基}-[1，4，7]三氮杂环壬烷-1，4-二羧酸二叔丁酯29
将[1，4，7]三氮杂环壬烷-1，4-二羧酸二叔丁酯(0.75g，2.3mmol)和化合物28(1.15g，2.3mmol)溶解于干燥的DMF(60ml)中，加入2.0mlDIPEA(11.4mmol)，随后于室温下将该混合物搅拌过夜。将溶剂蒸发至干，随后产物在硅胶柱上纯化(洗脱液：乙醚)。产量1.20g(80.5％)。对于C37H50N7O10(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值752.36；实测值752.40。
实施例30
合成{2-{[4-(呋喃-2-基)-6-([1，4，7]三氮杂环壬基-1-甲基)吡啶-2-羰基]氨基}乙基}氨基甲酸4-硝基苄酯30
将化合物29(1.0g，1.3mmol)溶解于25ml TFA中，随后于室温下将该混合物搅拌30分钟。将溶剂蒸发至干。对于C27H34N7O6(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值552.26；实测值552.26。
实施例31
合成{2-{{4-(呋喃-2-基)-6-{4，7-双[2-乙氧基羰基-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-基甲基]-[1，4，7]三氮杂环壬基-1-甲基吡啶-2-羰基}氨基}乙基}氨基甲酸4-硝基苄酯31
将化合物30(0.39g，0.7mmol)和化合物26(0.43g，1.4mmol)溶解于20ml干燥的乙腈中。加入K2CO3(0.48g，3.5mmol)，随后将该混合物回流3小时。滤除沉淀，随后蒸发溶剂。在硅胶柱上纯化产物(洗脱液：石油醚(沸点40-60℃)∶乙酸乙酯∶三乙胺＝5∶1∶1，v/v/v；乙醚；10％的EtOH/CH2Cl2；20％的EtOH/10％的TEA/CH2Cl2)。对于C53H56N9O12(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值1010.40；实测值1010.46。
实施例32
合成2-{4-[6-(2-氨基乙基氨基羰基)-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-甲基]-7-[2-羧基-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-基甲基]-[1，4，7]三氮杂环壬基-1-甲基}-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸32
将化合物31(0.80g，8.0mmol)溶解于乙醇(30ml)中。加入10％的Pd/C(0.49g)，随后在氢气气氛下，于室温下将该混合物搅拌2小时。将该混合物过滤，蒸发溶剂。将残余物溶解于0.5M的KOH/MeOH溶液中，于室温下将该混合物搅拌3小时。蒸发溶剂。该化合物无需纯化便可用于下一步骤。对于C41H42KN8O8(M+K)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值813.28；实测值813.31。
实施例33
合成2-{4-[6-(2-氨基乙基氨基甲酰基)-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-甲基]-7-[2-羧基-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-基甲基]-[1，4，7]三氮杂环壬基-1-甲基}-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸镧系元素(III)螯合物33
如实施例所述3，将化合物32转化为相应的铕(III)螯合物(33a)和钐(III)螯合物(33b)。
实施例34
合成2-{4-[4-(呋喃-2-基)-6-(2-碘代乙酰氨基乙基甲酰基)吡啶-2-甲基]-7-[2-羧基-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-基甲基]-[1，4，7]三氮杂环壬基-1-甲基}-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸镧系元素(III)螯合物34
如Takalo等，Bioconjugate Chem.，1994，5，278中所述，将化合物33转化为相应的碘代乙酰氨基衍生物。
实施例35
使用标记反应物18标记固相上的低聚肽
如Peuralahti等，Bioconjugate Chem.，13，2002，870中所述的方法进行链装配、脱保护、引入镧系(III)离子和纯化。
实施例36
使用螯合物34a标记溶液中的低聚肽
使用Takalo等，Bioconjugate Chem.，1994，5，278中所述的方法进行标记反应。
实施例37
使用螯合物23标记8-ABA-cAMP
将8-ABA-cAMP(2.5μmol)溶解于500μl包含吡啶、水和三乙胺(9.0∶1.5∶0.1，v/v/v)的缓冲液中。加入化合物23(3.0μmol，Ln＝Eu)，于室温下将该混合物搅拌3小时。蒸发溶剂，随后使用HPLC纯化产物。ESI-TOF-MS：1326.26。
实施例38
合成1-(2-吡啶基)-3-(5-溴2-呋喃基)-E-丙烯酮35
于0℃下，将5-溴呋喃-2-甲醛(5.0g)溶解KOH(1.5g)的水(10ml)和甲醇(50ml)的混合溶液中。在10分钟内加入2-乙酰基吡啶(3.2g)，随后于室温下将该反应进行3小时。过滤分离形成的产物。产量7.3g。
实施例39
合成4′-(5-溴-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶36
将化合物35(3.12g，11.3mmol)、N-[2-(吡啶-2′-基)-2-氧代乙基]吡啶盐碘化物(3.69g，11.3mmol)和乙酸铵(21.8g，283mmol)溶解于干燥的甲醇(110ml)中，随后将该混合物加热回流过夜。冷却至-18℃后，过滤分离形成的产物。产量2.5g。
实施例40
合成4′-(5-溴-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶N，N″二氧化物37
如实施例所述5进行合成。收率78％。
                                                                   1H NMR(CDCl3)：δ8.38(2H，dd，J 1.5 and 6.3)；822(2H，dd，J2.2 and 6.3)；7.41(2H，dt，J1.5and 7.8)；7.33(2H，dt，J2.2 and 6.3)；7.03(1H，d，J3.7)；6.49(1H，d，J3.7).
对于C19H12BrN3O3(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值410.01；实测值410.05。
实施例41
合成4′-(5-溴-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶-6，6′-二甲腈38
如实施例6所述进行合成。化合物38：
                                                                     1H NMR(CDCl3)：δ8.83(2H，d，J7.9)；8.72(2H，s)；8.03(2H，t，J7.9)；7.80(2H，d；J7.9)；7.17(1H，d，J3.6)；6.57(1H，d，J3.6).
实施例42
合成2，2′，2″，2-{[4′-(5-溴-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶-6，6′-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)39
如实施例7所述进行合成。化合物39的收率为54％。
1H NMR(CDCl3)：δ8.66(2H，s)；8.51(2H，d，J 6.6)；7.86(2H，t，J 7.7)；7.73(2H，d，J 6.6)；7.09(1H，d，J 3.6)；6.51(1H，d，J 3.6)；4.20(4H，s)；3.56(8H，s)；1.49(36H，s).
实施例43
合成2，2′，2″，2-{[4′-(5-(4-氨基苯基亚乙炔基)-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶-6，6′-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)40
将化合物39(70mg，78μmol)溶解于干燥的THF(2ml)和TEA(3ml)的混合物中。加入Pd(Ph3P)2Cl2(1.1mg)和CuI(0.6mg)，随后用氩气将该混合物脱气10分钟。加入氨基苯基乙炔(11mg，94μmol)，随后在氩气气氛下，于65℃下将该混合物加热过夜。真空除去所有的挥发物。将残余物溶解于二氯甲烷(3ml)中，用水(3×2ml)洗涤，经Na2SO4干燥。在硅胶柱上纯化(洗脱液：PE∶EA∶TEA＝5∶3∶1，v/v/v)，得到39mg(53％)的化合物40。
                                                                  1H NMR(CDCl3)：δ8.73(2H，s)；8.52(2H，d，J7.5)；7.86(2H，t，J7.5)；7.73(2H，d，J7.5)；7.41(2H，d，J8.4)；7.14(1H，d，J3.6)；6.75(1H，d，J3.6)；6.68(2H，d，J 8.4)；4.19(4H，s)；3.56(8H，s)；1.49(36H，s).IR：2270cm-1(-C≡C-).
实施例44
合成2，2′，2″，2-{[4′-(5-(4-氨基苯基乙基)-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶-6，6′-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)41
将化合物40(0.11g，0.12mmol)溶解于干燥的甲醇(50ml)中。加入10％的Pd/C(20mg)，随后在氢气气氛下将该混合物搅拌过夜，通过Celite过滤。在制备TLC层析板上纯化(洗脱液：石油醚∶乙酸乙酯∶三乙胺＝5∶3∶1，v/v/v)。对于C53H69N6O9(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值933.6；实测值933.6。
实施例45
合成2，2′，2″，2-{[4′-(5-(4-氨基苯基乙基)-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶-6，6′-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)42
将化合物41(14mg，15μmol)溶解于TFA(1ml)中，随后于室温下搅拌1.5小时，随后浓缩，用乙醚研磨，过滤。产量11mg。对于C37H36N6O9(M-H)-的ESI-TOF-MS质谱：计算值707.3；实测值707.3。
实施例46
合成2，2′，2″，2-{[4′-(5-(4-氨基苯基乙基)-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶-6，6′-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)铕(III)43
将化合物42(8.5mg，9μmol)溶解于水(400μL)中，随后用固体NaHCO3将pH值调节至6。分批加入氯化铕(III)(3.7mg，10μmol；预溶解于80μL水中)(用NaHCO3将pH值调节至5-7)，随后于室温下将该混合物搅拌1.5小时。用1M的NaOH将pH值调节至8.5，随后离心分离除去形成的氢氧化铕(III)。用丙酮沉淀，得到目标化合物。对于C37H32EuN6O9(M-H)-的ESI-TOF-MS质谱：计算值857.14；实测值857.20。
实施例47
合成2，2′，2″，2-{[4′-(5-(4-异硫氰酸基苯基乙基)-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三联吡啶-6，6′-二基]双(亚甲基次氨基)}四(乙酸)铕(III)44
将化合物43(5.7mg，6.5μmol；预溶解170μL于170水中)分批加至硫光气(2μL)、饱和NaHCO3(170μL)和氯仿(170μL)的混合物中。于室温下将该混合物剧烈搅拌1.5小时，随后各相分离。水相用氯仿(2×170μL)洗涤，用丙酮沉淀，得到化合物44.。对于C38H30EuN6O9S(M-H)-的ESI-TOF-MS质谱：计算值899.1；实测值899.2。
实施例48
合成6-(溴甲基)-4-(5-溴呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸乙酯45
将化合物26(0.8g，2.58mmol)溶解于干燥的二烷(20ml)中。加入溴(0.62g，3.87mmol)，随后于室温下将该混合物搅拌过夜。真空除去所有的挥发物。使用二氯甲烷作为洗脱液在硅胶柱上纯化，得到目标化合物。
实施例49
合成7-{4-(5-溴呋喃-2-基)-6-(乙基羰基)吡啶-2-基甲基}-[1，4，7]三氮杂环壬烷-1，4-二羧酸二(叔丁酯)46
使用实施例29所述的方法合成化合物46。对于C29H42BrN4O7(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值637.2；实测值637.2。
实施例50
合成7-{4-(5-溴呋喃-2-基)-6-(乙氧基羰基)吡啶-2-基甲基}-[1，4，7]三氮杂环壬烷47
使用实施例30所述的方法进行合成。对于C19H26BrN4O3(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值439.1；实测值439.1。
实施例51
合成4，7-双{6-[2-乙氧基羰基-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-基]甲基}-1-{6-[2-乙氧基羰基]-4-(5-溴呋喃-2-基)吡啶-2-基)甲基}-[1，4，7]三氮杂环壬烷48
使用实施例31所述的方法，将化合物46和化合物26进行反应，随后用碱性氧化铝纯化，得到目标化合物。对于C45H48BrN6O9(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值895.3；实测值895.4。
实施例52
合成4，7-双{6-[2-乙氧基羰基-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-基]甲基}-1-{6-(2-乙氧基羰基)-4-[5-(6-(羟基己炔-1-基-)-呋喃-2-基)吡啶-2-基]甲基}-[1，4，7]三氮杂环壬烷49
使用实施例43所述的方法，将化合物47和己炔醇进行反应，得到目标化合物。在中性氧化铝柱上纯化。对于C51H57N6O10(M+H)+的ESI-TOF-MS质谱：计算值913.4；实测值913.5。
实施例53
合成低聚核苷酸标记反应物50
将预干燥的化合物48(0.114g，0.125mmol)1和N，N，N′，N′-四异丙基二氨基次亚膦酸2-氰基乙酯(1.5当量)溶解于干燥的乙腈中。加入1H-四唑(1当量；0.45M的乙腈溶液)，随后于室温下将该混合物搅拌30分钟，随后倒入5％的NaHCO3中，随后用二氯甲烷萃取，经Na2SO4干燥。在碱性氧化铝柱上纯化，得到目标化合物。31PNMR(CDCl3)：δ151.2。
实施例54
使用Hovinen和Hakala，Org.Lett.3，2001，2473所述的方法，使用化合物50向低聚核苷酸结构中引入镧系(III)螯合物。
用常规方法合成低聚核苷酸d(AAT CAG ACT GTT CAAGAC)，反应物50与其5′-端位偶联。如Org.Lett.3，2001，2473所述，脱保护，转化为相应的镧系(III)螯合物并纯化。
                    流程1
Figure A20048003152500432
                            流程2
                            流程3
                            流程4
Figure A20048003152500451
                            流程5
Figure A20048003152500452
                            流程6A
Figure A20048003152500461
                            流程6B
Figure A20048003152500462
                            流程7
Figure A20048003152500463
                            流程8
Figure A20048003152500471
                            流程9
                            流程10
                            流程11
                            流程12A
Figure A20048003152500501
                            流程12B
                        流程13
本发明的某些螯合物的光化学性能示于表1。
使用LS-55发光光谱仪(PerkinElmer Instuments，Connecticut，USA)，在TS缓冲液(50mM tris，150mM NaCl，pH7.75)中，测定激发光谱和发射光谱以及荧光寿命，确定各螯合物和肽-偶联螯合物的光化学性能。根据预期的荧光强度，使用适当的浓度进行测定。
表1.合成的螯合物的光化学性能
  化合物   激发波长(excitaionwavelenght)/nm   激发波长(excitaionwavelenght)/nm   寿命/ms   发光产量(εΦ)
  3a   316   615   0.41   523
  3b   326   598   0.008   2
  9a   340   615   1.08   2100
  9b   348   605   0.014   12
  12a   318   616   0.96   470
  13a   314   615   1.07   1100
  20a   313   615   1.11   2700
  20b   321   598   0.019   13
  21b   306   644   0.0193   114
  与肽偶联的21b   313   645   0.0918   167
  22a   316   615   0.98   610
  33a   328   618   0.80   t.d.
  33b   333   645   0.0161   t.d.
t.d.＝待测定(to be determined)
应理解的是，本发明的方法可以多种实施方案的形式使用，本文仅公开了一小部分。对于本领域的资深技术人员来说，在不脱离本发明的精神的前提下，还存在其他实施方案。因此，所述的实施方案仅用于说明，而不是要限制本发明。

Claims (30)

1.一种螯合剂，所述螯合剂包含：
-发色部分，所述发色部分包含一个或多个芳族单元，其中至少一个所述芳族单元为呋喃基取代的吡啶基，
-螯合部分，所述螯合部分包含至少两个羧酸或膦酸基团或所述酸的酯或盐，所述螯合部分与所述发色部分的芳族单元或者直接相连或者通过含氮的烃链相连，和
-活性基团A，所述活性基团通过连接基x连接于所述发色部分或所述螯合部分，所述活性基团A能与固相上的生物分子或官能团结合。
2.权利要求1的螯合剂，其中所述发色部分为单呋喃基取代的吡啶基或其中所述发色部分包含两个或三个吡啶基，其中至少一个所述吡啶基被呋喃基取代，所述吡啶基按照方式i)或方式ii)连接，
i)直接互相连接，分别形成联吡啶或三联吡啶基，
ii)通过含氮的烃链互相连接。
3.权利要求1的螯合剂，其中所述基团A-x-与呋喃基相连。
4.权利要求1的螯合剂，其中所述连接基x由1-10个部分形成，每一个部分选自亚苯基、包含1-12个碳原子的亚烷基、亚乙炔基(-C≡C-)、1，2-亚乙烯基(-C＝C-)、醚基(-O-)、硫醚基(-S-)、酰氨基(-CO-NH-、-CO-NR′-、-NH-CO-和-NR′-CO-)、羰基(-CO-)、酯基(-COO-和-OOC-)、二硫基(-SS-)、重氮基(-N＝N-)和叔胺基，其中R′表示包含少于5个碳原子的烷基。
5.权利要求1的螯合剂，其中所述活性基团A选自以下基团：异硫氰酸酯、卤代乙酰氨基、顺丁烯二酰亚氨基、二氯三嗪基、二氯三嗪基氨基、吡啶基二硫基、硫代酯、氨基氧基、酰肼、氨基、聚合基团和羧酸或其酰氯或活性酯。
6.权利要求1的螯合剂，所述螯合剂选自：
Figure A2004800315250003C1
7.权利要求1的螯合剂，所述螯合剂适用于合成低聚肽，其中所述活性基团A通过连接基x与所述螯合剂相连，A为氨基酸残基-CH(NHR1)R5，其中R1为临时的保护基团，R5为羧酸或其盐、酰卤或酯。
8.权利要求7的螯合剂，所述螯合剂选自：
Figure A2004800315250004C1
其中x如权利要求4所定义，所述保护基团R1选自Fmoc、Boc或Bsmoc，R″为烷基酯或烯丙基酯，R为烷基。
9.权利要求1的螯合剂，所述螯合剂适用于合成低聚核苷酸，其中所述活性基团A为
-Y-O-PZ-O-R4
其中
一个氧原子任选被硫置换，
Z为氯或NR2R3，
R4为保护基团，
R2和R3为烷基，
Y不存在或为嘌呤碱或嘧啶碱或任何其他适用于合成修饰的低聚核苷酸的修饰碱的基团，所述碱通过i)或ii)与氧原子相连，
i)被已保护的羟乙基取代的烃链，
ii)适用于合成修饰的低聚核苷酸的呋喃环或吡喃环或任何修饰的呋喃环或吡喃环。
10.权利要求9的螯合剂，其中Y为胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺苷、鸟嘌呤或胞嘧啶中任一种碱的基团，所述碱通过i)或ii)与氧原子相连，
i)被已保护的羟乙基取代的烃链，
ii)在其4-位上具有已保护的羟乙基并任选在其2-位上具有羟基、已保护的羟基或修饰的羟基的呋喃环。
11.权利要求9的螯合剂，其中-Y-O-P(NR2R3)-O-R4选自：
其中-为连接基x的位置，DMTr为二甲氧基三苯甲基。
12.权利要求11的螯合剂，所述螯合剂选自：
其中R″为烷基酯或烯丙基酯，R为烷基，x如权利要求4所定义，A为权利要求11所定义的-Y-O-P(NR2R3)-O-R4。
13.一种螯合物，所述螯合物包含：
-金属离子，
-发色部分，所述发色部分包含一个或多个芳族单元，其中至少一个所述芳族单元为呋喃基取代的吡啶基，
-螯合部分，所述螯合部分包含至少两个羧酸或膦酸基团或所述酸的酯或盐，所述螯合部分与所述发色部分的芳族单元或者直接相连或者通过含氮的烃链相连，和
-活性基团A，所述活性基团通过连接基x连接于所述发色部分或所述螯合部分，所述活性基团A能与固相上的生物分子或官能团结合。
14.权利要求13的螯合物，其中所述发色部分为单呋喃基取代的吡啶基或其中所述发色部分包含两个或三个吡啶基，其中至少一个所述吡啶基被呋喃基取代，所述吡啶基按照方式i)或方式ii)连接，
i)直接互相连接，分别形成联吡啶或三联吡啶基，
ii)通过含氮的烃链互相连接。
15.权利要求13的螯合物，其中所述基团A-x-与呋喃基相连。
16.权利要求13的螯合物，其中A选自以下基团：异硫氰酸酯、卤代乙酰氨基、顺丁烯二酰亚氨基、二氯三嗪基、吡啶基二硫基、硫代酯、氨基氧基、酰肼、氨基、聚合基团和羧酸或其酰氯或活性酯。
17.权利要求13的螯合物，其中所述连接基x由1-10个部分形成，每一个部分选自亚苯基、包含1-12个碳原子的亚烷基、亚乙炔基(-C≡C-)、1，2-亚乙烯基(-C＝C-)、醚基(-O-)、硫醚基(-S-)、酰氨基(-CO-NH-、-CO-NR′、-NH-CO-和-NR′-CO-)、羰基(-CO-)、酯基(-COO-和-OOC-)、二硫基(-SS-)、重氮基(-N＝N-)和叔胺基，其中R′表示包含少于5个碳原子的烷基。
18.权利要求13的螯合物，所述螯合物选自：
Figure A2004800315250008C1
其中M为金属，z为2或3，x和A如上定义。
19.权利要求18的螯合物，其中所述金属M为镧系元素或适用于正子发射断层摄影或磁共振成象的金属。
20.一种与上述权利要求13-19中任一项的螯合物缀合的生物分子。
21.一种与上述权利要求13-19中任一项的螯合物缀合的生物分子，其中所述生物分子选自低聚肽、低聚核苷酸、DNA、RNA、修饰的低聚核苷酸或多核苷酸、蛋白质、寡糖、多糖、磷脂、PNA、LNA、抗体、半抗原、药物、受体结合配体和凝集素。
22.权利要求21的生物分子，其中所述修饰的低聚核苷酸或多核苷酸为单硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和/或糖修饰的或碱修饰的低聚核苷酸或多核苷酸。
23.一种与上述权利要求1-12中任一项的螯合剂缀合的生物分子。
24.一种与上述权利要求13-19中任一项的螯合物缀合的固体载体。
25.一种与上述权利要求13-19中任一项的螯合物缀合的固体载体，其中所述固体载体选自纳米微粒、微米微粒、载玻片或平板。
26.一种已标记的低聚肽，所述已标记的低聚肽通过在固相上合成的方法制得，所述方法为向低聚肽合成仪上的所述低聚肽结构中引入权利要求7或8的螯合剂，随后脱保护并任选还引入金属离子。
27.一种已标记的低聚核苷酸，所述已标记的低聚核苷酸通过在固相上合成的方法制得，所述方法为向低聚核苷酸合成仪上的所述低聚核苷酸结构中引入上述权利要求9-12中任一项的螯合剂，随后脱保护并任选还引入金属离子。
28.一种与权利要求26的已标记的低聚肽或权利要求27的已标记的低聚核苷酸缀合的固体载体，其中所述低聚肽或低聚核苷酸共价或非共价固定于所述固体载体上。
29.一种与权利要求26的已标记的低聚肽或权利要求27的已标记的低聚核苷酸缀合的固体载体，其中所述低聚肽或低聚核苷酸共价或非共价固定于所述固体载体上，所述固体载体选自纳米微粒、微米微粒、载玻片或平板。
30.一种与权利要求1的螯合剂缀合的固体载体，所述固体载体适用于合成低聚核苷酸，其中所述活性基团A为
-Y-O-x′-
其中
x′为与所述固体载体相连的连接基，与所述连接基x可相同或不同，
Y不存在或为嘌呤或嘧啶或任何其他适用于合成修饰的低聚核苷酸的修饰碱的基团，所述碱通过i)或ii)与氧原子相连，
i)被已保护的羟乙基取代的烃链，
ii)呋喃环或吡喃环或任何适用于合成修饰的低聚核苷酸的修饰的呋喃环或吡喃环。
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