CN1753902A - 寡核苷酸取代吡咯 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学式(I)所示新型吡咯衍生物，它可以通过电聚合反应固定和导向寡核苷酸。本发明还涉及这样产生的电活性聚合物和用它们检测、鉴定和定量测定样品中的分析物的方法。在化学式(I)中，R1是一类寡核苷酸，Y是S或O，X是间隔臂，其选自－(CH2) n－O－、－(CH2) p－O－[(CH2) 2－O] q－、－(CH2) r－CO－NR’－(CH2) r，－O－、－(CH2) r－NCH3－(CH2) r、－O－、－(CH2) r－CO－NR’－[(CH2) 2－O] s－、－(CH2) r－NCH3－[(CH2) 2－O] s－，R’是H或CH3，n是1－5的整数，p是1－2的整数，q是1－4的整数，r是1－3的整数，r’是1－3的整数，s是1－3的整数，n、p、q、r、r’和s可相同或不同，吡咯环在2－、3－、4－或5－位取代。
Description
技术领域
本发明涉及通过电聚合固定和导向寡核苷酸的新型吡咯衍生物。本发明还涉及这样得到的电活性聚合物，以及用它们检测、鉴定和化验样品中被分析物的方法。
背景技术
共轭聚合物，如聚吡咯和它们的衍生物因其导电性和电活性而著称。同样为人人们所知的是，当特定的吡咯环在3-和4-位取代有官能化时，聚吡咯能保持其导电性和电活性。此类含有官能化的聚合物见述于WO-A1-95/29199，Garnier等(Synthetic Metals，100：89-94，1999)，Ho-Hoang等(SyntheticMetals，62：277-280，1994)，Ho-Hoang等(J.Mater.，Chem.，6(7)，1107-1112，1996)，和Korri-Youssoufi等(Materials Science and Engeering，C15，265-268，2001)。然后可将不同的反配体(antiligand)接枝到聚吡咯所含的官能化上。
例如，WO-A1-95/29199介绍了前体聚吡咯的合成，它利用的是在吡咯环的3-位取代有官能化的吡咯的电化学聚合。此前体聚合物通过电化学聚合沉积到导电基底上或形成自支撑膜。第二步，将诸如多核苷酸或肽这样的反配体化学接枝到前体聚合物的官能化上。这样得到的聚合物能保持其导电性和电活性。因此，这些聚合物可通过测定电位差或电流变化用来检测与接枝到聚合物上的反配体发生专一相互作用的分析物。WO-A1-00/77523也介绍了诸如寡核苷酸这样的反配体化学接枝到含官能化的前体聚合物上。
这样得到的聚合物可用作生物传感器，用来捕捉和检测分析物。这些聚合物的一个主要优点是，通过简单的电测量就有可能检测样品中的分析物，如感兴趣的生物分子。但是，制备这些聚合物的方法所涉及的化学接枝不允许平行合成大量带有不同反配体的聚合物。目前，制备反配体矩阵(matrix)需要固定和导向大量不同的反配体。生产“生物芯片”或DNA芯片就涉及在固体载体上固定和导向寡核苷酸矩阵。将寡核苷酸化学接枝到前体聚合物上的方法不可能得到有序的寡核苷酸矩阵。
此外，已知的做法是通过直接使未取代吡咯和在氮原子上含取代有带寡核苷酸的基团的吡咯的混合物发生电化学共聚来同时导向和固定寡核苷酸。Livache等(Analytical Biochemistry，255：188-194，1998)介绍了取代吡咯的合成，其中含有寡核苷酸的基团取代在吡咯环的氮原子上。这些含有寡核苷酸的取代吡咯与吡咯发生电化学共聚。相继电化学共聚可以导向和固定在不同电极上的不同的寡核苷酸矩阵。通过电聚合，可以得到用寡核苷酸的共聚物，它们可用于杂化反应，检测特定的DNA或RNA。但是，这些共聚物的导电性和电活性都较弱。因此，这些聚合物的缺点是，检测杂化反应是用另外标记的方法，而不是直接进行电测量。
EP-B1-0 691978和EP-B1-0912593也介绍了取代吡咯，吡咯环的氮原子上接枝有各种配体，如寡核苷酸。作为单体，这些取代吡咯与未取代的吡咯发生电化学共聚。但是，所得共聚物也存在导电性和电活性弱的缺点。
为了弥补本领域当前存在的缺点，本发明提出了新型吡咯，含寡核苷酸的基团取代在氮原子以外的部位。这些新型取代吡咯单独作为单体使用，或以与其它单体的混合物使用时，可通过电化学聚合反应合成共聚物。所得聚合物或共聚物具有导电性和电活性。本发明用寡核苷酸取代的吡咯提供通过一步电化学聚合导向和固定寡核苷酸的可能性。因此，本发明用寡核苷酸取代的吡咯及共聚物有可能制备有序的寡核苷酸矩阵。这些矩阵是诊断和连续筛选分子的特别有利的工具。此外，本发明的共聚物具有电活性，可通过电测量检测能够与共聚物上所带的寡核苷酸发生专一作用的分析物。
发明内容
本发明涉及用带寡核苷酸的基团取代的吡咯。本发明的这些取代吡咯以下定义为“用寡核苷酸取代的吡咯”或“本发明的取代吡咯”。
本发明的第一个主题是用寡核苷酸取代的吡咯，其特征在于它具有以下通式(I)：
其中
R1代表寡核苷酸，
Y代表S或O，
X代表间隔臂。
术语“间隔臂”意指可将寡核苷酸与吡咯环隔开的化学基团。间隔臂是本领域的技术人员所熟知的。任何能保持聚合物的导电性和电活性的间隔臂都可用于本发明的取代吡咯。间隔臂宜具有较小的位阻作用，以免影响取代吡咯的聚合。
在本发明的一个优选实施方式中，X表示间隔臂，该单体选自-(CH2)n-O-、-(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-、-(CH2)r-CO-NR’-(CH2)r，-O-、-(CH2)r-NCH3-(CH2)r，-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-，
R’代表-H或-CH3，
n是1-5的整数，
p是1-2的整数，
q是1-4的整数，
r是1-3的整数，
r’是1-3的整数，
s是1-3的整数，
n、p、q、r、r’和s可相同或不同，
吡咯环在2-、3-、4-或5-位取代。
术语“寡核苷酸”表示至少2个天然或修饰核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或二者均有)的系列，它们在合适的杂化条件下可与至少部分互补的寡核苷酸杂化。术语“核苷”是指由嘌呤或嘧啶碱基组成的有机化合物，嘌呤或嘧啶与单糖(核糖或脱氧核糖)相连。术语“核苷酸”是指由嘌呤或嘧啶碱基组成的有机化合物，嘌呤或嘧啶与单糖(核糖或脱氧核糖)和磷酸酯基相连。术语“修饰核苷酸”是指，例如，包含修饰碱基和/或对核苷酸间的连接基团和/或主链进行了修饰的核苷酸。修饰碱基的例子有次黄苷、甲基-5-脱氧胞苷、二甲基氨基-5-脱氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤和溴-5-脱氧尿苷。修饰核苷酸间连接基团的例子有硫代磷酸酯、N-烷基磷酰胺、烷基磷酸酯和烷基磷酸三酯连接基。由核苷酸组成、主链受到修饰的寡核苷酸的例子有FR-A-2 607507所介绍的α-寡核苷酸和M.Egholm等的文章(J.Am.Chem.Soc.，114，1895-1897，1992)主题的PNA。
寡核苷酸通过磷酸二酯基团连接到间隔臂上。更具体地，寡核苷酸的3’-OH或5’-OH通过磷酸化基团连接到间隔臂的氧原子上。寡核苷酸宜包含2-70个核苷酸，较好包含20个核苷酸。
在本发明的优选实施方式中，寡核苷酸在连接到间隔臂的一端包含多核苷酸序列TTTTT，该序列包含5-10个T，较好包含10个T。此多T有可能将对要检测的分析物具有专一相互作用的寡核苷酸部分与吡咯环隔开。
本发明还涉及用寡核苷酸取代的吡咯，它具有化学式(II)：
其中，R1、Y和X的定义同上。
X宜为-(CH2)n-O-，n等于2。
本发明还涉及用寡核苷酸取代的吡咯，它具有化学式(III)：
其中，R1、Y和X的定义同上。
X宜为-(CH2)n-O-，n等于2。
本发明的另一个主题是用寡核苷酸官能化的导电活性共聚物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)提供至少一种单体，其选自本发明通式(II)所示用寡核苷酸取代的吡咯；
2)提供至少一种单体，其选自可与其它吡咯共聚的取代吡咯；
3)步骤1)中的单体与步骤2)中的单体发生电化学共聚。
通式(II)所示的用寡核苷酸取代的吡咯中，X宜为-(CH2)n-O-，n等于2。
在另一个优选实施方式中，本发明通式(II)所示用寡核苷酸取代的吡咯与步骤2)中的取代吡咯之摩尔比为1/1000-1/100,000。此摩尔比宜为1/5000-1/20000。此摩尔比更宜为1/20,000。
术语“单体”是指能与其它单体发生化学或电化学聚合反应形成聚合物的化学单元。
术语“聚合”是指具有相同化学性质的单元发生化学或电化学反应，使特定数量的单体组成大分子(n x M→(M)n)。它通常涉及吡咯单元的缩合，形成聚吡咯。术语“共聚”是指不同单元的同时聚合，例如取代基不含寡核苷酸的吡咯与本发明取代吡咯的混合物同时的聚合。
术语“电聚合”、“电共聚”和“电化学聚合”表示通过电化学过程的聚合。电聚合方法是本领域的技术人员所熟知的。例如，循环伏安法、计时位分析法(施加电流法)和计时按培法(施加电势法)。在本发明的特定实施方式中，沉积通过计时安培法或控制电位沉积法进行。此方法是将电位从平衡电位(电流为0)迅速提高到固定值，电极上的反应在此值下进行，并测定电流-时间函数关系。
吡咯按Diaz机理(Sadki等，Chem.Soc.Rev.，29：283-293，2000)进行的电聚合形成聚吡咯。此聚合在吡咯单体的2-和5-位上进行。
“能与其它吡咯聚合的取代吡咯”是指吡咯环的3-或4-位取代的吡咯能够在2-和5-位发生聚合或与其它吡咯共聚，更好是与本发明用寡核苷酸取代的吡咯共聚。这些能与其它吡咯发生聚合的取代吡咯所含基团是这样一种分子，其位阻足够小，不会影响聚合反应或共聚反应。一般，这些取代吡咯没有含寡核苷酸的取代基。此外，这些在吡咯环的3-或4-位取代有低位阻基团的吡咯在与其它吡咯聚合或共聚后，可得到具有导电性和电活性的聚合物。能与其它吡咯聚合形成导电聚合物的取代吡咯是本领域的技术人员所熟知的，且文献有广泛介绍，特别是WO-A1-95/29199，Garnier等(Synthetic Metals，100：89-94，1999)，Ho-Hoang等(Synthetic Metals，62：277-280，1994)，Ho-Hoang等(J.Mater.，Chem.，6(7)，1107-1112，1996)，和Korri-Youssoufi等(Materials Science and Engeering，C15，265-268，2001)。本发明用寡核苷酸取代的吡咯与用不含寡核苷酸的基团取代的吡咯共聚可能减小共聚反应过程中的位阻。
因此，当本发明用寡核苷酸取代的吡咯在吡咯环的3-和4-位取代时，本发明的这些吡咯与取代吡咯的混合物可直接共聚。
在本发明的优选实施方式中，本发明用寡核苷酸(ODN)取代的吡咯与3-(羟基乙基)吡咯共聚。因此，在此实施方式中，能与其它吡咯发生聚合的取代吡咯是3-(羟基乙基)吡咯。此共聚反应得到的用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物可用下式表示。
在本发明的特定实施方式中，用寡核苷酸官能化的共聚物在第一导电和电活性聚合物上沉积或形成。在这些方法中，第一取代吡咯聚合或共聚形成导电和电活性聚合物的预制膜(prefilm)或薄下层。接着，用用寡核苷酸官能化的共聚物形成第二层。
因此，本发明还涉及制备用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的方法，它包括如下步骤：
1)提供至少一种单体，该单体选自可与其它吡咯聚合的取代吡咯；
2)使步骤1)中的单体发生电化学聚合，形成第一导电电活性聚合物；
3)提供一种单体，该单体选自通式(II)所示用寡核苷酸取代的吡咯；
4)提供至少一种单体，该单体选自可与其它吡咯聚合的取代吡咯；
5)步骤3)中的单体与步骤4)中的单体在步骤2)中形成的所述第一导电电活性聚合物上发生电化学共聚，获得用寡核苷酸官能化的导电电话性共聚物。
步骤1)和步骤4)所用取代吡咯可相同或不同。
步骤3)中的取代吡咯与步骤4)中的取代吡咯之摩尔比宜为1/20000。
步骤1)和步骤4)中的取代吡咯宜为3-(羟基乙基)吡咯。
本发明还涉及制备用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的方法，它包括如下步骤：
1)提供至少一种单体，该单体选自可与其它吡咯聚合的取代吡咯；
2)使步骤1)中的单体发生电化学聚合，形成第一导电电活性聚合物；
3)提供一种单体，该单体选自通式(II)所示用寡核苷酸取代的吡咯；
4)步骤3)中的单体在步骤2)中形成的所述第一导电电活性聚合物上发生电化学聚合，得到用寡核苷酸官能化的导电电活性聚合物。
步骤1)中的取代吡咯宜为3-(羟基乙基)吡咯。
本发明还涉及制备用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的方法，它包括如下步骤：
1)提供至少一种单体，该单体选自可与其它吡咯聚合的取代吡咯；
2)使步骤1)中的单体发生电化学聚合，形成第一导电电活性聚合物；
3)提供通式(III)所示用寡核苷酸取代的吡咯；
4)步骤3)中的取代吡咯电化学偶合到步骤2)中形成的所述第一导电电活性聚合物上，得到用寡核苷酸官能化的导电电活性聚合物。
步骤1)中的取代吡咯宜为3-(羟基乙基)吡咯。
当本发明用寡核苷酸取代的吡咯是在吡咯环的2-或5-位取代时，它就不能与其它吡咯聚合或共聚。因此，为由通式(III)所示用寡核苷酸取代的吡咯制备用寡核苷官能化酸的导电电活性共聚物，需要制备第一导电电活性聚合物，在该聚合物上本发明2-或5-位用寡核苷酸取代的吡咯发生电化学偶合。
因此，在本发明的优选实施方式中，通式(III)所示用寡核苷酸(ODN)取代的吡咯电化学偶合到第一导电电活性聚合物聚[3-(羟基乙基)吡咯]上。在此实施方式中，本发明用寡核苷酸取代的吡咯因而位于聚合物链的末端。由此共聚得到的用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物表示如下：
本发明的另一个主题是用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物，该共聚物可通过本发明方法得到。
本发明的共聚物用寡核苷酸官能化。这些寡核苷酸通过共价键接枝到形成聚合物的特定单体单元(吡咯环)上，从而使这些导电电活性聚合物具有另一个官能化。举例来说，用寡核苷酸官能化的共聚物适合捕捉和检测分析物。
术语“导电聚合物”是指电子高度离域的聚合物，最常见的情况是电子沿着单键和双键(共轭键)链分布，使其性质类似于微电子半导体。
术语“电活性聚合物”是指这样一种聚合物，当聚合物所带的寡核苷酸与分析物发生专一性相互作用时，其电化学响应发生改变。因此，按照与分析物专一性相互作用，观察电化学信号的变化。这样，导电电活性共聚物就将它与分析物的相互作用转变为电化学信号的变化。
本发明的共聚物可用于将寡核苷酸导向和固定在固体载体上的任何应用中。更具体地，本发明聚合物可以自支撑膜或电极上的膜的形式得到。实际上，有了该电极就可以借助测定反应期间通过的电流来控制聚合反应的进程，还有可以接着测定共聚物的电化学响应。因此，本发明还涉及一种电极，该电极包含表面涂有至少一种本发明用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的导电载体。
电极的导电载体是本领域已知的；可特别提及的例子有金属或碳衍生物制成的基底。生产本发明电极时，通常将共聚物沉积到导电载体上。电化学共聚反应宜在电极表面进行，从而得到包含该表面涂有本发明共聚物的导电载体的电极。在优选实施方式中，电极是通过将共聚物层沉积在金或铂制成的载体表面上得到的。
在能够限制并控制电极上的电化学聚合反应的条件下，本发明用寡核苷酸取代的吡咯就可以将寡核苷酸固定和导向在小表面上。此种定向电共聚可以产生微型有序点的矩阵，每个点都含有确定的寡核苷酸。在一种优选实施方式中，本发明还涉及电极矩阵。
因此，本发明还涉及含有本发明至少一个电极的电极矩阵。在优选实施方式中，该矩阵中的各种电极含有不同的寡核苷酸。根据特定的实施方式，本发明涉及连接到固体载体上的许多电极或微电极，这些电极涂有本发明的共聚物，且宜带有不同的寡核苷酸。这种电极矩阵宜通过本发明用寡核苷酸取代的吡咯的定向电聚合得到。
本发明的共聚物、电极和电极矩阵具体可用于检测存在于样品中且能够与共聚物所含寡核苷酸发生专一性反应的分析物。因此，本发明还涉及用于检测样品中的分析物的器件，它包含本发明的至少一种共聚物和/或本发明的至少一个电极。本发明还涉及检测样品中的分析物的器件，所示器件包含至少一个本发明的电极矩阵。
本发明的另一个主题是检测样品中的分析物的方法，它包括如下步骤：
1)提供本发明用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物或电极，而该电极包含涂有本发明用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的导电载体；
2)在适合分析物与所述寡核苷酸发生专一性相互作用的条件下，让步骤1)中的电活性共聚物或电极与样品接触；
3)用电测量方法检测连接到所述寡核苷酸上的分析物。
因此，本发明涉及本发明共聚物、电极或电极矩阵的应用，用来检测存在于样品中且能与本发明寡核苷酸发生专一性相互作用的分析物。
术语“分析物”是指任何能与寡核苷酸发生专一性相互作用，因而能用本发明共聚物检测的分子。例如，此分析物可以是生物分子，如蛋白质、肽、脂质、类固醇、糖或核酸。共聚物所含寡核苷酸对待检测分析物具有专一性。寡核苷酸和待检测分析物宜形成反配体/配体(例如，DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA或DNA/蛋白质)对。
本发明可以检测任何类型的样品中的分析物。在本发明的特定实施方式中，样品是生物样品。此样品宜取自患者，以便进行诊断。样品例如可以是尿、血、血清、血浆、细胞提取物或体液。
在本发明的一个优选实施方式中，可以检测的是专门与本发明导电电活性共聚物上的寡核苷酸杂化的DNA和/或RNA。
本发明的共聚物是电活性共聚物，当分析物与聚合物所含寡核苷酸发生专一性相互作用时，其电化学响应将发生变化。因此，本发明的导电电活性共聚物将它与分析物的相互作用转化成电化学信号。与参照共聚物相比，分析物与共聚物所含寡核苷酸的专一性相互作用使所研究的共聚物的电化学响应发生改变。因此，分析物的检测宜通过电学测量进行。
术语“电测量”是指电位变化的测量，如聚合物的氧化电势的变化，或者电流变化的测量，如在指定电位下观察到的氧化电流的变化。利用本领域的技术人员所熟知的方法，可以快速、灵敏和定量测定这些变化。
在本发明的优选实施方式中，电测量包括电位变化或电流变化的测量。在本发明的特定实施方式中，采用循环伏安法。这是一种电分析法，包括在恒定速率下沿一个方向扫描电位范围，然后沿另一个方向扫描。所得伏安曲线图以电流形式给出所研究的电化学体系的响应情况，并提供其表征。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，可以用聚合物的电聚合所用电极检测分析物与共聚物所含寡核苷酸之间的专一性相互作用。例如，通过对含有本发明共聚物的电极的电测量，可以检测与共聚物的寡核苷酸互补的核酸的杂化情况。
用本发明共聚物的检测宜采用电测量的方法。但是，本领域的技术人员已知的其它溶胀检测方法也可以采用。
本发明的另一个主题使是通式(IV)的取代吡咯：
其中，R2是胺保护基团。本发明的取代吡咯可采用各种胺保护基团。这些胺包含基团是本领域的技术人员所熟知的(Kocienski P.J.，Thieme PublishingGroup，1994；Hanson J.R.，Protecting Groups in Organic Synthesis，Continuum International Publishing Group)。胺保护基团宜选自单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、甲苯磺酰基、三异丙基甲硅烷基、叔丁氧基羰基、9-芴氧基羰基、苄氧基羰基和乙酰基。
R3是能与自由羟基反应的含磷基团。R3宜选自磷酸三酯、H-磷酸酯或亚磷酰胺基团，
X表示间隔臂，其选自-(CH2)n-O-、-(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-、-(CH2)r-CO-NR’-(CH2)r，-O-、-(CH2)r-NCH3-(CH2)r，-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-，
R’代表-H或-CH3，
n是1-5的整数，
p是1-2的整数，
q是1-4的整数，
r是1-3的整数，
r’是1-3的整数，
s是1-3的整数，
n、p、q、r、r’和s可相同或不同，
吡咯环在2-、3-、4-或5-位取代。
在一个优选实施方式中，本发明涉及通式(V)所示取代吡咯：
其中，R2是胺保护基团。R2宜选自单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、甲苯磺酰基、三异丙基甲硅烷基、叔丁氧基羰基、9-芴氧基羰基、苄氧基羰基和乙酰基。
R3是能与自由羟基反应的含磷基团。R3宜选自磷酸三酯、H-磷酸酯或亚磷酰胺基团，
X表示间隔臂，其选自-(CH2)n-O-、-(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-、-(CH2)r-CO-NR’-(CH2)r，-O-、-(CH2)r-NCH3-(CH2)r，-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-，
R’代表-H或-CH3，
n是1-5的整数，
p是1-2的整数，
q是1-4的整数，
r是1-3的整数，
r’是1-3的整数，
s是1-3的整数，
n、p、q、r、r’和s可相同或不同。
R2宜代表单甲氧基三苯甲基，R3宜代表亚磷酰胺基团。在本发明的优选实施方式中，X宜为-(CH2)n-O-，n等于2。
在另一个优选实施方式中，取代吡咯以如下通式(VI)表示：
其中，R2是胺保护基团。R2宜选自单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、甲苯磺酰基、三异丙基甲硅烷基、叔丁氧基羰基、9-芴氧基羰基、苄氧基羰基和乙酰基。
R3是能与自由羟基发生反应的含磷基团。R3宜选自磷酸三酯、H-磷酸酯或亚磷酰胺基团，
X表示间隔臂，该单体选自-(CH2)n-O-、-(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-、-(CH2)r-CO-NR’-(CH2)r，-O-、-(CH2)r-NCH3-(CH2)r，-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-，
R’代表-H或-CH3，
n是1-5的整数，
p是1-2的整数，
q是1-4的整数，
r是1-3的整数，
r’是1-3的整数，
s是1-3的整数，
n、p、q、r、r’和s可相同或不同。
R2宜代表单甲氧基三苯甲基，R3宜代表亚磷酰胺基团。在本发明的优选实施方式中，X宜为-(CH2)n-O-，n等于2。
本发明的另一个主题是制备化学式(I)所示用寡核苷酸取代的吡咯的方法，
其中R1、X和Y的定义同上。
该方法包含以下步骤：
1)进行合成寡核苷酸的循环，
2)在合成所述寡核苷酸的最后循环中，通式(IV)所示取代吡咯
在所述寡核苷酸的5’位或3’位的最后核苷酸上发生取代，
其中R2、R3和X定义同上；
3)去除所述保护基团R2。
在本发明的优选实施方式中，保护基团R2是单甲氧基三苯甲基，在步骤3)中，此保护基团通过在酸性介质中的处理去除。
在本发明的优选实施方式中，保护基团R2是单甲氧基三苯甲基，寡核苷酸通过反相色谱纯化，然后在步骤3)中去除保护基团。
通式(IV)所示取代吡咯的取代按照合成寡核苷酸的循环进行。在合成的最后循环中，核苷酸被通式(V)所示取代吡咯替换。
根据第一个实例，在下式所表示的“H-磷酸酯”序列循环中，此循环的最后核苷酸被本发明化学式(IV)所示取代吡咯所替换，其中含磷基团是H-磷酸酯。
“H-磷酸酯”序列循环
根据另一个实例，在下式所示亚磷酰胺缩合循环中，此链的最后核苷酸被本发明化学式(IV)所示取代吡咯所替换，其中含磷基团是亚磷酰胺。
类似地，根据另一个实例，在下式所示“磷酸三酯”缩合循环中，此循环最后的核苷酸被本发明化学式(IV)所示取代吡咯所替换，其中含磷基团是磷酸二酯。
磷酸三酯缩合循环
在寡核苷酸合成循环结束时、去保护之后，寡核苷酸5’位或3’位末端的自由羟基与通式(IV)所示取代吡咯中的活性磷(磷酸二酯、亚磷酰胺、H-磷酸酯)发生反应。
附图说明
图1：5’OH寡核苷酸在引入1-[N-甲苯磺酰基]-3-[7-O-(2-氰乙基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺基)羟乙基]前后的色谱图。
图1A寡核苷酸序列：
5’ttt ttt ttt ttg cct tga cga tac agc ta，保留时间(Rt)：14.87min
图1B寡核苷酸序列：
5’吡咯甲苯磺酰基-ttt ttt ttt ttg cct tga cga tac agc ta，Rt：16.35min
图1C同时注入2种寡核苷酸(Rt：15.07min和17.40min)
图2：用HPLC检测甲苯磺酰基的去除情况
图2A寡核苷酸序列：
5’吡咯甲苯磺酰基-ttt ttt ttt ttg cct tga cga tac agc ta，Rt：14.9min
图2B寡核苷酸序列：
在55℃下的0.5M NaOH溶液中处理24小时后，5’吡咯甲苯磺酰基-ttt tttttt tg cct tga cga tac agc ta(20％)，Rt：15.25min，5’-吡咯-ttt ttt tttttg cct tga cga tac agc ta(80％)，Rt：13.48min。
图3：含吡咯的纯化寡核苷酸的色谱图，吡咯在3位被取代且由含有MMT的吡咯单体合成。
寡核苷酸序列：5’吡咯-at ctc ggg aat cte aet gtt ag RT：17.6min
图4：3-(羟乙基)吡咯溶液在铂电极上进行的循环伏安法测定的第一个循环。
图5：为用3-(羟乙基)吡咯聚合膜修饰的电极的循环伏安曲线，所述3-(羟乙基)吡咯聚合物转移到不含单体的电解液中。
图6：在吡咯-ODN(3位)的5μM溶液中在铂电极上进行的循环伏安法测定的第一个循环。
图7：用在3-(羟乙基)吡咯预制膜上的吡咯-ODN膜(3位)修饰的铂电极的循环伏安曲线，所述两层膜转移到不含单体的电解液中。
图8：修饰电极在各种介质中的电化学信号的变化。
图9：经预制膜上的共聚物修饰的电极的循环伏安曲线，所述两层膜转移到不含单体的电解液中。
图10：修饰电极在各种介质中的电化学信号的变化。
图11：经共聚物修饰的电极在各种介质中的电化学信号的变化。
实施例
实施例1：1-(N-甲苯磺酰基)-3-羟乙基-吡咯的合成
1-(N-甲苯磺酰基)-3-羟乙基-吡咯通过以下合成方法获得：
1-(N-甲苯磺酰基)-3-羟乙基-吡咯的合成按照Korri-Youssoufi等，Materials Science and Engineering C15(2001)265-268所述方法进行。第一步，在强碱叔丁醇钾存在下，由吡咯和甲苯磺酰氯合成1-(N-甲苯磺酰基)吡咯。接着，用乙酐对1-(N-甲苯磺酰基)吡咯进行乙酰化，得到1-甲苯磺酰基-3-乙酰基吡咯，再在蒙脱石存在下用硝酸铊通过氧化转位转化为2-[3-(1-N-甲苯磺酰基吡咯)]乙酸甲酯。用硼烷二甲基硫醚在适当条件下还原，得到所需产物1-(N-甲苯磺酰基)-3-羟乙基-吡咯。反应的总体产率为21.8％。
实施例2：1-[N-(对-单甲氧基三苯甲基)]-3-羟乙基吡咯的合成
1-[N-(对-单甲氧基三苯甲基)]-3-羟乙基吡咯通过以下合成方法获得：
用氢氧化钠(2.5M NaOH/甲醇)溶液以常用方法回流2小时，对1-(N-甲苯磺酰基)-3-羟乙基-吡咯上的氮原子去保护。用乙醚萃取3-羟乙基吡咯后，浓缩产物至干，然后在无水二氯甲烷中，在1当量TEA存在下用单甲氧基三苯甲基氯(1.2当量)对胺官能化进行单甲氧基三苯甲基化。在二氧化硅柱上纯化后，得到预期产物，1-[N-(对-单甲氧基三苯甲基)]-3-羟乙基吡咯，产率25％。1-[N-(对-单甲氧基三苯甲基)]-3-羟乙基吡咯的1H NMR：δppm(CDCl3)＝7.28-6.75(m，16H，Ar MMtr，H-2，H-5)；5.88(t，1H，H-4)；3.79(s，3H，OCH3)；3.73(t，2H，2xH-7)；2.7(t，2H，2xH-6)。
实施例3：1-[N-甲苯磺酰基]-3-[7-O-(2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺基)羟乙基]-吡咯的合成
1-[N-甲苯磺酰基]-3-[7-O-(2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺基)羟乙基]-吡咯通过以下合成方法获得：
1-(N-甲苯磺酰基)-3-羟乙基-吡咯(50mg，187.5μmol，1当量)与无水乙腈一起蒸发3次，然后溶解在1ml乙腈中。将圆底烧瓶置于惰性气氛下，加入68μl(48mg，375μmol，2当量)DIPEA(二异丙基乙胺)。滴加氯代膦(thlorophosphine)(48μl，72mg，275μmol，1.1当量)，搅拌整个混合物5分钟。然后在旋转蒸发器中将反应混合物浓缩至一半体积，装入倒入环己烷/三乙胺(99∶1)混合物的硅胶柱，用环己烷洗涤。然后用环己烷/乙酸乙酯(80∶20)混合物洗提产物。合并所需部分并浓缩。用乙腈得到黄色油状物，通过Millex PVDF 0.22μm过滤器过滤，再浓缩得到67mg(144μmol，77％)产物。
TLC：Rf＝0.5环己烷/乙酸乙酯(50∶50)
31P NMR：148.32ppm
1H NMR：δppm(CD3CN)＝7.75(d，2H，J＝8Hz，H-o)；7.35(d，2H，J＝8Hz，H-m)；7.05(m，2H，H-2+H-5)；6.20(s，1H，H-4)；3.69(m，6H，O-CH2-CH2-CN+2x NCH(CH3)2+2xH-7)；2.60(m，4H，2xH-6+O-CH2-CH2-CN)；2.37(s，3H，CH3-Ph)；1.10(m，12H，2xNCH(CH3)2)。
实施例4：1-[N-(对-单甲`氧基三苯甲基)]-3-[7-O-(2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺基)羟乙基]-吡咯的合成
1-[N-(对-单甲氧基三苯甲基)]-3-[7-O-(2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺基)羟乙基]-吡咯通过以下反应式合成：
1-[N-(对-单甲氧基三苯甲基)]-3-羟乙基吡咯(120mg，300μmol，1当量)与无水乙腈一起蒸发3次，然后溶解在2ml乙腈中。将圆底烧瓶置于惰性气氛下，加入160μl(114mg，600μmol，2当量)DIPEA(二异丙基乙胺)。滴加氯代膦(82μl，87mg，330μmol，1.1当量)，搅拌整个混合物5分钟。然后在旋转蒸发器中将反应混合物浓缩至一半体积，装入倒入环己烷/三乙胺(99∶1)混合物的硅胶柱，用环己烷洗涤。然后用环己烷/乙酸乙酯(90∶10)混合物洗提产物。合并所需部分并浓缩。用乙腈得到黄色油状物，通过Millex PVDF 0.22μm过滤器过滤，再浓缩得到120mg(205μmol，68％)产物。
TLC：Rf＝0.3环己烷/乙酸乙酯(50∶50)
31P NMR：147.15ppm
1H NMR：δppm(CD3CN)＝7.09(m，15H，MMTr+H-5)；6.80(d，1H，J＝8.9Hz，H-2)；6.51(s，1H，H-4)；3.63(m，9H，OCH3+O-CH2-CH2-CN+2xNCH(CH3)2+2xH-7)；2.67(m，4H，2xH-6+O-CH2-CH2-CN)；1.10(m，12H，2xNCH(CH3)2)。
实施例5：1-[N-甲苯磺酰基]-3-[2-(三乙氧基)羟乙基]吡咯的合成
1-[N-甲苯磺酰基]-3-[2-(三乙氧基)羟乙基]吡咯通过以下反应过程合成：
1-(N-甲苯磺酰基)-3-羟乙基-吡咯的醇官能化在CBr4和三苯基膦存在下，于0℃下在无水乙腈中被溴所取代。然后在碱性介质中对三甘醇臂进行亲核取代偶合。反应总产率为24.6％。
1-[N-甲苯磺酰基]-3-[2-(三乙氧基)羟乙基]-吡咯的1H NMR：δppm(CDCl3)＝7.65(d，2H，2xH Ts)；7.20(d，2H，2xH Ts)；6.98(t，1H，H-5)；6.9(s，1H，H-2)；6.11(d，1H，H-4)；3.65-3.5(m，14H，7xCH2-O)；2.60(t，2H，2xH-6)；2.33(s，3H，CH3Ts)。
实施例6：1-(N-甲苯磺酰基)-2-(羟乙基)吡咯的合成
1-(N-甲苯磺酰基)-2-(羟乙基)吡咯通过以下反应过程合成：
在硫酸正丁铵和氢氧化钠存在下，在0℃二氯甲烷中通过与甲苯磺酰氯反应，在2-乙酰基吡咯的1位引入甲苯磺酰基。然后在蒙脱石存在下，用硝酸铊通过氧化转位得到2-[2-(1-N-甲苯磺酰基吡咯)]乙酸甲酯。接下来的一步是用LiBH4还原，得到所需产物1-(N-甲苯磺酰基)-2-(羟乙基)吡咯。合成的总产率为3％。
1-(N-甲苯磺酰基)-2-(羟乙基)吡咯的1H NMR：δppm(CDCl3)＝7.64(d，2H，2xH Ts)；7.31(d，2H，2xH Ts)；7.27(d，1H，H-5)；6.22(t，1H，H-4)；6.10(s，1H，H-3)；3.80(t，2H，2xH-6)；2.95(t，2H，2xH-7)；2.40(s，3H，CH3Ts)。
实施例7：在固体载体上合成寡核苷酸
用Beaucage和Lyer所述亚磷酰胺法(Tetrahedron，48，223-2311，1992)在固体载体(受控孔玻璃，CPG)上合成寡核苷酸。
将待合成序列上的第一个核苷通过3’位连接到固体载体(CPG)上，核苷的5’OH端基用酸不稳定的二甲氧基三苯甲基(DMT)基团保护。
-在脱三苯甲基的第一步中，通过酸处理(三或二氯乙酸)除去DMT基团，以产生活性5’OH端基。
-在第二步“偶合”中，待加基的亚磷酰胺与第一个核苷缩合，以产生亚磷酸三酯键。所述缩合反应在催化剂(四唑或S-硫代乙基四唑或DCI等)存在下进行。
-在第三步“封端”中，在前面的缩合步骤中未反应的5’OH端基用乙酰化试剂(乙酐)封闭，以防序列缺失。
-在第四步氧化中，通过氧化处理(水溶碘)将亚磷酸三酯键氧化成磷酸三酯键。亚磷酸三酯键也可用Beaucage试剂在乙腈溶液中氧化，得到硫代磷酸三酯键。
需要时，步骤1-4根据待合成序列的长度重复进行。这四步构成一个合成循环。
当所需序列完成后，连接寡核苷酸的固体载体在浓氨水溶液中培养，以便从载体上断开寡核苷酸，并让碱基和磷酸酯基团脱去保护。
实施例8：在寡核苷酸的5’端基引入3位被取代并在氮原子上用甲苯磺酰基保护的吡咯
合成的最后循环用吡咯单体1-[N-甲苯磺酰基]-3-[7-O-(2-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺基)羟乙基]-吡咯进行，其合成过程如上面实施例3所述。此单体在与常用核苷酸合成子完全相同的条件下使用，唯一的区别是偶合时间不同，此单体偶合的时间是15分钟而不是1.3分钟，其目的是将引入中所有可能出现的问题都考虑进去。该反应过程表示如下。在30％氨水中去保护后(55℃下进行16小时)，通过离子交换HPLC分析粗寡核苷酸(图1)。图1所示为寡核苷酸单独注射和与吡咯一起注射的情况，用以显示吡咯的引入情况。(20分钟内NaCl的梯度为400-640mM，Gen Pack FaxTM柱(Waters)TM，0.75ml/min)。
实施例9：甲苯磺酰基的去除和寡核苷酸的纯化
75℃下，甲苯磺酰基在2.5M氢氧化钠溶液中于4小时内消除，但在这些条件下，寡核苷酸完全降解。因此，我们用更加温和的水解条件(0.5M NaOH溶液，55℃，24小时)，以防止寡核苷酸的降解，同时使吡咯所含甲苯磺酰基去除80％。然后就可以用HPLC分离两种寡核苷酸，从而完全分开去保护的寡核苷酸(图2)。图2表示在55℃下，在0.5M NaOH介质中去除甲苯磺酰基(20分钟内NaCl的梯度为440-680mM，Gen Pack FaxTM柱(Waters)TM，0.75ml/min)。
如果不用HPLC纯化寡核苷酸，氢氧化钠可通过用丙酮进行简单沉淀的方法来消除，所述寡核苷酸实际上就可用于共聚反应实验。
实施例10：在寡核苷酸的5’端基引入3号位被取代并在氮原子上用单甲氧基三苯甲基保护的吡咯
合成的最后一个循环用吡咯单体进行，其合成过程如上面实施例4所述。此单体在与常用碱基完全相同的条件下使用，唯一的区别是偶合时间不同，此单体反应的时间是15分钟而不是1.3分钟，其目的是将引入中所有可能出现的问题都考虑进去。
此外，MMT基团保留在寡核苷酸上，以利于下一步的纯化。最后在浓氨水中对寡核苷酸去保护(55℃下进行16小时)。该反应过程表示如下。
实施例11：单甲氧基三苯甲基的去除和寡核苷酸的纯化
使用单甲氧基三苯甲基化单体的一大优点是，它可用来纯化寡核苷酸，在酸性介质中很容易消除。因此，它优于甲苯磺酰基。
寡核苷酸用手工纯化系统纯化，利用的是MMT基团的疏水性。(CTGenMDP-WS 1000TM柱)。此系统类似于OPCTM柱体(Applied BiosystemTM)，含有MMT基团的寡核苷酸在柱子中专一地保留在反相中，而不含MMT基团的杂质则洗到液相中。
洗去不需要的物质后，含有MMT的寡核苷酸用乙腈溶液洗提。蒸发后，寡核苷酸用80％乙酸溶液处理1小时。在低温条件下蒸发酸，用乙醇沉淀寡核苷酸。此化合物的纯度用离子交换色谱法控制，色谱柱为Gen Pack Fax柱(Waters)，柱中存在NaCl梯度(图3)。图3所示为含吡咯的纯化寡核苷酸，吡咯在3位被取代，并由含有MMT基团的单体合成(20分钟内NaCl的梯度为340-580mM，Gen Pack FaxTM柱(Waters)TM，0.75ml/min)。
其纯度明显高于用甲苯磺酰基化单体得到的产物。
实施例12：电化学装置
所有的操作均在水介质中进行，采用连接到Autolab PGSTAT 100TM稳压器上的三电极电化学装置。稳压器在参考电极与工作电极之间施加固定电住差，反电极用于调制电流，在工作电极与参考电极之间得到所需的稳定电住差，而不管电化学池的电学性质如何。由于操作在水介质中进行，所用电极如下：参考电极＝饱和甘汞电极(SCE)，反电极＝铂丝，工作电极＝直径1mm的铂片。
实施例13：所用溶液
(1)LiClO4的水电解液
高氯酸锂是所研究的溶液中使用的电解质。产物呈粉末形式(摩尔质量106.39g·mol-1)，易溶解于蒸馏水。
LiClO4电解液＝0.5M水溶液
(2)3-羟乙基吡咯在3-羟乙基吡咯电解液中聚合的溶液＝0.1M
LiClO4电解液＝0.5M水溶液
(3)3-羟乙基吡咯与吡咯-ODN(寡核苷酸)(3位)共聚的溶液
ODN(寡核苷酸)具有如下序列：
5’GCCTTGACGATACAGCTA3’
本发明用寡核苷酸取代的吡咯(或吡咯-ODN)表示如下：
此溶液用1∶20000的吡咯-ODN单元和吡咯单元制备。
3-羟乙基吡咯＝0.1M
[吡咯-ODN]＝5μM
LiClO4电解液＝0.5M水溶液
(4)吡咯-ODN(3位取代)聚合的溶液
[吡咯-ODN]＝5μM
LiClO4电解液＝0.5M水溶液
(5)1X杂化缓冲液HB
1X HB是用作杂化溶液的电解液介质。它具有如下组成：
-9.5mM磷酸盐缓冲液，
-0.515M NaCl，
-2.6mM KCl，
-0.048％Tween，
-1X Denhardt试剂
-10μg/ml鲑鱼DNA。
(6)非互补靶杂化溶液
所用的序列如：
5’CGCCAGCAGCTCCAA3’的非互补寡核苷酸在1X HB中的浓度为0.1μM。
(7)互补靶(CP)杂化溶液
与固定在聚吡咯膜上的ODN互补的寡核苷酸在1X HB中的浓度为0.1μM。
5’TAGCTGTATCGTCAAGGC3’
实施例14：检测原理
本发明的聚合物具体可用于检测可能存在于样品中并能与存在于聚合链上的ODN反应的生物活性物质。具体来说，如后面将要看到的，可以观察到在杂环的3位上官能化的共轭聚合物与一种或多种配体反应后，与未和生物介质中的配体反应的胡照聚合物相比，其电化学响应出现变化，这可通过氧化电势的变化看出来。聚合物电化学信号的变化给出了一种传感器功能，因而可用来定量测定生物活性物质，要么在固定电流下通过电位的变化测定，要么在固定电住下通过电流的变化测定。
在操作的第一个部分，证实单体可聚合，并建立了最佳聚合反应参数，确定了所用溶液中沉积物具有稳定性和电活性的条件。
最重要的一点涉及要在“ODN/NA”(寡核苷酸/核酸)识别期间进行修饰的聚合物的物理化学性质。实际上，为了研制快速、灵敏、定量测定NA存在的方法，本发明的目标是研制一种在单步操作中具有电活性的材料，及其在“ODN/NA”杂化后将发生变化的电化学响应。所述变化是电位型变化，它利用的是因聚合物的氧化电住而发生的电流变化；或者电流型变化，它利用的是在指定电住下观察到的氧化(或还原)电流的变化。这些电化学响应的变化可定量测定，官能化聚合物膜用作电流型或电位型电化学传感器。
实施例15：杂化之后电化学响应的变化
A.3-羟乙基吡咯聚合物预制膜上吡咯-ODN(3位)的聚合反应
1.3-羟乙基吡咯聚合物预制膜的制备
使用溶液(2)施加0.75V的电压2.4秒(电荷密度51mC·cm-2)。
图4：用循环伏安法对0.1M 3-羟乙基吡咯单体溶液在铂电极上(直径1mm)进行测定的第一个循环(0.5M LiClO4电解质水溶液，v＝50mV·s-1)。
图5：用3-(羟乙基)吡咯聚合膜修饰的电极的循环伏安曲线，所述3-(羟乙基)吡咯聚合物膜转移到不含单体的电解液中。
(0.5M LiClO4电解质水溶液，v＝50mV·s-1)。
据认为，此聚合物使表面均匀，可用作锚固点，以引发在3位被ODN所取代的吡咯发生第二层聚合反应。目前还不可能直接在电极上使3位被ODN取代的吡咯发生均聚反应。因此，吡咯-ODN单独在此聚合物预制膜上发生聚合反应可增加固定在载体上的ODN探子的数量，从而可观察到聚合物的电化学响应发生更加明显的变化。
2.用溶液(4)使吡咯-ODN(3位)在预制膜上于0.6V下发生聚合反应，时间为115秒(电荷密度19mC·cm-2)。
图6：吡咯-ODN(3位)的5μM溶液在铂电极(直径1mm)上进行的循环伏安法测定的第一个循环。
(0.5M LiClO4电解质水溶液，v＝50mV·s-1)。
将双层聚合物转移到LiClO4电解液中示于图7所示循环伏安法。
在0.5M LiClO4
水溶液中，(a)3-羟乙基吡咯的聚合物下层(Q＝57mC·cm-2)循环，(b)该下层和聚吡咯-ODN(3位)(Q＝15mC·cm-2)，v＝50mV·s-1循环。
将沉积物转移到杂化缓冲液(溶液(5))中，然后加入非互补靶(溶液(6))，洗涤，再加入互补靶(溶液(7))。
在这些不同溶液中，用循环伏安法(循环)分析沉积物。
所得结果示于图8，它显示氧化峰电活性的下降，同时显示氧化峰电势偏移。
图8：修饰电极在各种溶液中的电化学信号的变化。在1X HB中循环，v＝50mV·s-1，a：在1X HB中3天，b：在M5中1小时；c：在CP中2小时。
因此，吡咯-ODN(3位)能够将这些探子杂化时的现象转换为电化学信号。
B.3-羟乙基吡咯/吡咯-ODN(3位)在3-羟乙基吡咯聚合物预制膜上的共聚反应。
1.3-羟乙基吡咯聚合物预制膜的制备
使用溶液(2)施加0.75V的电压0.5秒(电荷密度9mC·cm-2)。
用溶液(3)使3-羟乙基吡咯/吡咯-ODN(3位)在预制膜上于0.75V下共聚，时间为1.3秒(电荷密度30mC·cm-2)。
图9：含有两层聚合物的膜在0.5M LiClO4水溶液中的循环伏安曲线；(a)3-羟乙基吡咯聚合物下层(Q＝37mC·cm-2)，(b)该下层和3位取代的共聚物(Q＝60mC·cm-2)，v＝50mV·s-1。
将沉积物转移到杂化缓冲液(溶液(5))中，然后加入非互补靶(溶液(6))，洗涤，再加入互补靶(溶液(7))。
在这些不同溶液中，用循环伏安法(循环)分析沉积物。
所得结果示于图10，它显示氧化峰电活性下降，同时显示氧化峰电势稍有偏移。
图10：修饰电极在以下几种情况下的电化学信号变化：
a：在杂化缓冲液中
b：在非互补靶存在下的杂化溶液中
c：在互补靶存在下的杂化溶液中。
因此，3-羟乙基吡咯/吡咯-ODN(3位)共聚物能够将这些探子杂化的现象转换为电化学信号。
C.3-羟乙基吡咯与吡咯-ODN(3位)直接在铂电极上共聚
3-羟乙基吡咯与吡咯-ODN(3位)共聚的溶液
此溶液用1∶20000的吡咯-ODN单元和吡咯单元制备。
3-羟乙基吡咯＝0.1M，
[吡咯-ODN]＝5μM，
LiClO4电解液＝0.5M水溶液。
在0.75V下在直径为3mm的铂电极、铂反电极、SCE参考电极上共聚，沉积前在氩气气氛下搅拌和脱气15分钟，沉积时间20秒，所得电荷＝7.39mC。
然后将所得沉积物转移到电解液和杂化缓冲液中。循环伏安曲线(图11)的形状证实了稳定、可逆电活性膜的存在。
修饰电极在以下几种情况下的电化学信号变化：
a：在杂化缓冲液中的循环伏安法，v＝20mV/s
b：20分钟后，在非互补探子存在下的杂化缓冲液中的循环伏安法，v＝20mV/s
c：在互补探子存在下的杂化缓冲液中的循环伏安法，v＝20mV/s，t＝5分钟
d：20分钟后，在互补探子存在下的杂化缓冲液中的循环伏安法，v＝20mV/s加入非互补靶后，电势有10mV的轻度偏移。
互补靶的存在导致20分钟后发生约60mV的位移。
Claims (30)
1.一种用寡核苷酸取代的吡咯，其特征在于它具有以下通式(I)：
其中
R1代表寡核苷酸，
Y代表S或O，
X代表间隔臂，其选自-(CH2)n-O-、-(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-、-(CH2)r-CO-NR’-(CH2)r，-O-、-(CH2)r-NCH3-(CH2)r，-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-，
R’代表-H或-CH3，
n是1-5的整数，
p是1-2的整数，
q是1-4的整数，
r是1-3的整数，
r’是1-3的整数，
s是1-3的整数，
n、p、q、r、r’和s可相同或不同，
吡咯环在2-、3-、4-或5-位取代。
2.权利要求1所述的用寡核苷酸取代的吡咯，其特征在于它对应于通式(II)：
其中R1、Y和X如上所述。
3.权利要求2所述的用寡核苷酸取代的吡咯，其特征在于X为-(CH2)n-O-，n等于2。
4.权利要求1所述的用寡核苷酸取代的吡咯，其特征在于它对应于通式(III)：
其中R1、Y和X如上所述。
5.权利要求4所述的用寡核苷酸取代的吡咯，其特征在于X为-(CH2)n-O-，n等于2。
6.一种用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)提供至少一种单体，该单体选自权利要求2或3所述用寡核苷酸取代的吡咯；
2)提供至少一种单体，该单体选自可与其它吡咯聚合的取代吡咯；
3)步骤1)中的单体与步骤2)中的单体发生电化学共聚。
7.权利要求6所述的制备用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的方法，其特征在于步骤1)中的取代吡咯与步骤2)中的取代吡咯的摩尔比在1/1000-1/100,000之间。
8.一种制备用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的方法，它包括如下步骤：
1)提供至少一种单体，该单体选自可与其它吡咯聚合的取代吡咯；
2)使步骤1)中的单体发生电化学聚合，形成第一导电电活性聚合物；
3)提供一种单体，该单体选自权利要求2或3所述的用寡核苷酸取代的吡咯；
4)提供至少一种单体，该单体选自可与其它吡咯聚合的取代吡咯；
5)步骤3)中的单体与步骤4)中的单体在步骤2)中形成的所述第一导电电活性聚合物上发生电化学共聚，获得用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物。
9.权利要求8所述的制备用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的方法，其特征在于步骤3)中的取代吡咯与步骤4)中的取代吡咯的摩尔比在1/1000-1/100,000之间。
10.一种制备用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的方法，它包括如下步骤：
1)提供至少一种单体，该单体选自可与其它吡咯聚合的取代吡咯；
2)使步骤1)中的单体发生电化学聚合，形成第一导电电活性聚合物；
3)提供一种单体，该单体选自权利要求2或3所述的用寡核苷酸取代的吡咯；
4)步骤3)中的单体在步骤2)中形成的所述第一导电电活性聚合物上发生电化学聚合，得到用寡核苷酸官能化的导电电活性聚合物。
11.一种制备用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的方法，它包括如下步骤：
1)提供至少一种单体，该单体选自可与其它吡咯聚合的取代吡咯；
2)使步骤1)中的单体发生电化学聚合，形成第一导电电活性聚合物；
3)提供含有权利要求4或5所述的用寡核苷酸取代的吡咯；
4)步骤3)中的取代吡咯电化学偶合到步骤2)中形成的所述第一导电电活性聚合物上，得到用寡核苷酸官能化的导电电活性聚合物。
12.一种用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物，其特征在于它可通过权利要求6-11中任一项所述的方法获得。
13.一种电极，其特征在于它包含表面涂有至少一种权利要求12所述的用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的导电载体。
14.一种电极矩阵，其特征在于它包含权利要求13所述的至少一个电极。
15.一种检测样品中的分析物的器件，其特征在于它包含至少一种权利要求12所述的共聚物和/或至少一个权利要求13所述的电极。
16.一种检测样品中的分析物的器件，其特征在于它包含至少一个权利要求14所述的电极矩阵。
17.一种检测样品中的分析物的方法，它包括如下步骤：
1)提供权利要求12所述的用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物或权利要求13所述的的电极，其中该电极包含涂有用寡核苷酸官能化的导电电活性共聚物的导电载体；
2)在适合分析物与所述寡核苷酸发生专一性相互作用的条件下，让步骤1)中的所述电活性共聚物或所述电极与样品接触；
3)用电测量方法检测连接到所述寡核苷酸上的分析物。
18.权利要求17所述的方法，其特征在于在步骤3)中，检测的是专门与所述导电电活性共聚物上的寡核苷酸杂化的DNA和/或RNA。
19.权利要求17或18所述的方法，其特征在于在步骤3)中，测定的是电位变化或电流变化。
20.一种取代吡咯，其特征在于它对应于通式(IV)：
其中，R2是胺保护基团，其选自单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、甲苯磺酰基、三异丙基甲硅烷基、叔丁氧基羰基、9-芴氧基羰基、苄氧基羰基和乙酰基。
R3是能与自由羟基反应的含磷基团其选自磷酸三酯、H-磷酸酯或亚磷酰胺基团，
X表示间隔臂，其选自-(CH2)n-O-、-(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-、-(CH2)r-CO-NR’-(CH2)r，-O-、-(CH2)r-NCH3-(CH2)r，-O-、-(CH2)r-CO-NR’-[(CH2)2-O]s-、-(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-，
R’代表-H或-CH3，
n是1-5的整数，
p是1-2的整数，
q是1-4的整数，
r是1-3的整数，
r’是1-3的整数，
s是1-3的整数，
n、p、q、r、r’和s可相同或不同，
吡咯环在2-、3-、4-或5-位取代。
21.权利要求20所述的取代吡咯，其特征在于它对应于通式(V)：
其中R2、R3和X定义同上。
22.权利要求21所述的取代吡咯，其特征在于R2是单甲氧基三苯甲基。
23.权利要求21和22中任一项所述的取代吡咯，其特征在于R3是亚磷酰胺基。
24.权利要求21-23中任一项所述的取代吡咯，其特征在于X为-(CH2)n-O-，n等于2。
25.权利要求20所述的取代吡咯，其特征在于它对应于通式(VI)：
其中R2、R3和X定义同上。
26.权利要求25所述的取代吡咯，其特征在于R2是单甲氧基三苯甲基。
27.权利要求25和26中任一项所述的取代吡咯，其特征在于R3是亚磷酰胺基。
28.权利要求25-27任一项所述的取代吡咯，其特征在于X为-(CH2)n-O-，n等于2。
29.一种制备通式(I)所示用寡核苷酸取代的吡咯的方法，
其中R1、X和Y的定义同上。
其特征在于，该方法包含以下步骤：
1)进行合成寡核苷酸的循环，
2)在合成所述寡核苷酸的最后循环中，通式(IV)所示取代吡咯在所述寡核苷酸的5’位或3’位的最后核苷酸上发生取代，
其中R2、R3和X定义同上；
3)去除所述保护基团R2。
30.权利要求29所述的方法，其特征在于在步骤2)中，保护基团R2是单甲氧基三苯甲基，在步骤3)中，此保护基团通过在酸性介质中处理去除。
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