CN101048423A - 亚磷酰胺化合物及低聚核糖核酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供低聚RNA的合成中有用的新的亚磷酰胺化合物。下述通式(1)表示的亚磷酰胺化合物,式中,Bx表示可具有保护基的核酸碱基,R1表示以下的通式(2)表示的取代基,R2a、R2b相同或不同,表示烷基或R2a、R2b与邻接的氮原子一起形成5~6元饱和氨基环基,该饱和氨基环基除氮原子以外还可具有1个氧原子或硫原子作为成环原子,WG1、WG2相同或不同,表示吸电性基团;式(2)中,R11、R12、R13相同或不同,表示氢或烷氧基。
Description
技术领域
本发明涉及在2’位羟基导入了新的保护基的新的亚磷酰胺(phosphora-midite)化合物及该保护基的导入试剂。
背景技术
低聚核糖核酸(低聚RNA)作为基因解析的RNA探针、RNA药物原材料(反义RNA、核酶、利用了RNAi的基因表达控制)、人工酶、适体有用。
低聚RNA的固相合成法的确立在1980年代的后半期。最初报道的是使用以叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、三异丙基硅烷基(TIPS)为2’位羟基的保护基的亚磷酰胺化合物的RNA固相合成法(非专利文献1)。
低聚RNA的化学合成与仅由脱氧核糖核酸(DNA)构成低聚脱氧核糖核酸(低聚DNA)的情况相比,存在较多需注意的问题。
首先,作为2’位羟基的保护基采用TBDMS基时,例如,将3’位羟基亚磷酰胺化时,会引发保护2’位羟基的TBDMS基转移至3’位的副反应。
另外,如果使用像TBDMS基那样的空间位阻大的取代基作为2’位羟基的保护基,则结合于3’位的磷原子的周围的空间拥塞,因此生成核苷酸间连键的缩合反应的速度下降,低聚物化后,在除去2’位羟基的保护基时,会引发核苷酸间连键的切断或重排反应。
为了解决上述问题,目前进行着以实施更有效的低聚RNA合成为目的的研究。
已知在脱去保护3’位和5’位的双硅保护基的条件(中性条件)下,作为2’位羟基的保护基的1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)与双硅保护基同时脱去(非专利文献2)。基于这一情况,和田等发现在2’位羟基导入了中性条件下可脱保护的CEE基的亚磷酰胺化合物可作为用于制备低聚RNA的化合物使用(非专利文献3、非专利文献4)。
但是,在2’位羟基导入CEE基会生成新的不对称中心,因此2’位羟基得到了保护的低聚RNA会转变为非对映异构体混合物。所以,低聚RNA的制备过程中的精制和分离操作会变得复杂。另外,由于与2’位氧原子结合的碳上取代有甲基,因此考虑到结合于3’位羟基的磷原子的周围的空间位阻,可能会出现缩合效率下降及缩合反应速度减慢的情况。
非专利文献1:N.A.Usman等,Journal American Chemical Society,Vol.109,7845(1987)
非专利文献2:Wolfgang Pfleiderer等,Helvetica Chimica Acta,Vol.81,1545(1998)
非专利文献3:和田猛,BIO INDUSTRY,Vol.21,No.1,17(2004)
非专利文献4:T.Umemoto等,Tetrahedron Letters,Vol.45,9529(2004)
发明的揭示
本发明的目的主要是实现简便且高收率的低聚RNA的合成法,提供有用的新的亚磷酰胺化合物。此外,还提供可在2’位羟基导入中性条件下易脱离的保护基的新的醚化合物。
本发明者进行认真研究的结果是,找到了可实现上述目的的化合物,从而完成了本发明。
I.本发明的亚磷酰胺化合物
本发明可例举以下的通式(1)表示的亚磷酰胺化合物(以下称为“本发明的亚磷酰胺化合物”),
式中,Bx表示可具有保护基的核酸碱基(nucleobase),R1表示以下的通式(2)表示的取代基,
式中,R11、R12、R13相同或不同,表示氢或烷氧基,
R2a、R2b相同或不同,表示烷基或R2a、R2b与邻接的氮原子一起形成5~6元饱和氨基环基,该饱和氨基环基除氮原子以外还可具有1个氧原子或硫原子作为成环原子,WG1、WG2相同或不同,表示吸电性基团。
Bx所表示的核酸碱基只要是被用于核酸的合成的碱基即可,无特别限定,例如可例举腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或它们的修饰体。
核酸碱基的修饰体是指核酸碱基被任意的取代基取代而得的化合物。
作为Bx的修饰体中的取代基,例如可例举卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基,修饰体可以被1~3个上述取代基取代。
Bx所表示的核酸碱基可被保护,其中,例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶等具有氨基的核酸碱基中的氨基最好被保护起来。所述氨基的保护基,只要是可作为核酸的保护基使用的基团即可,无特别限定,具体例如可例举苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。
R2所表示的饱和氨基环基例如可例举吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、吗啉-1-基或硫代吗啉-1-基。
WG1、WG2所表示的吸电性基团例如可例举氰基、硝基、烷基磺酰基、卤素,其中优选氰基。
本发明的亚磷酰胺化合物中的卤素例如可例举氟、氯、溴、碘。
本发明的亚磷酰胺化合物中的酰基例如可例举直链状或支链状的碳数1~6的烷酰基、碳数7~13的芳酰基。具体例如可例举甲酰基、乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基萘甲酰基、乙酰丙酰基。
本发明的亚磷酰胺化合物中的烷基例如可例举直链状或支链状的碳数1~5的烷基。具体例如可例举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基。该烷基可被取代,所述取代基例如可例举卤素、烷基、烷氧基、氰基、硝基,可以被1~3个上述取代基取代。
本发明的亚磷酰胺化合物中的芳烷基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二烷基氨基及烷基磺酰基中的烷基部分可例举与前述烷基同样的基团。
本发明的亚磷酰胺化合物中的烷氧基例如可例举直链状或支链状的碳数1~4的烷氧基。具体可例举甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。其中,优选碳数1~3的烷氧基,尤其好的是甲氧基。
本发明的亚磷酰胺化合物中的烷氧基烷基的烷氧基部分可例举与前述烷氧基同样的基团。
本发明的亚磷酰胺化合物中的芳烷基的芳基例如可例举碳数6~12的芳基。具体例如可例举苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基。该芳基可被取代,所述取代基例如可例举卤素、烷基、烷氧基、氰基、硝基,可被1~3个上述取代基取代。
作为本发明的亚磷酰胺化合物中的烷基、芳基的取代基的卤素、烷基及烷氧基,可分别例举与前述同样的基团。
本发明的亚磷酰胺化合物可作为制备低聚RNA的试剂使用。
本发明的亚磷酰胺化合物是2’位羟基具有中性条件下脱离的醚型保护基的亚磷酰胺化合物。此外,由于被导入2’位羟基的基团是直线状的取代基,结合于3’位羟基的磷原子的周围的空间不拥塞,所以与以往所用的亚磷酰胺化合物相比,具有合成低聚RNA时可在非常短的时间内实施缩合反应且缩合收率良好的特点。通过使用本发明的亚磷酰胺化合物,能够采用与低聚RNA的制备几乎同样的方法制备高纯度的低聚RNA。
本发明中的低聚DNA是指仅由脱氧核糖核酸(DNA)构成的低聚核酸。此外,本发明的低聚RNA是指由核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)构成的低聚核酸,其中至少含有1个核糖核酸(RNA)。
作为本发明的亚磷酰胺化合物的具体例,可例举以下的1.~5.的化合物。
1.N6-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)
2.N2-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)
3.N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)
4.N4-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)
5.5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)
附图的简单说明
图1表示通过反相HPLC分析获得的色谱图。图中,纵轴表示时间(分钟),横轴表示吸收强度。
实施发明的最佳方式
II.本发明的亚磷酰胺化合物的制法
本发明的亚磷酰胺化合物可按照以下步骤制得。
以下所示的制法中,原料具有影响反应的取代基(例如,羟基、氨基、羧基)时,一般预先按照公知的方法用适当的保护基对原料进行保护后再实施反应。保护基可在反应后采用催化还原、碱处理、酸处理等公知方法脱去。
本发明的亚磷酰胺化合物可由公知化合物或易制备的中间体,通过实施例如以下的步骤a~步骤h的操作制得。
以下进行详细说明。
(1)步骤a:
通过使烷基化试剂作用于以下的通式(14)表示的核苷衍生物,制备在2’位羟基导入中性条件下脱离的醚型保护基的下述通式(15)、(15’)表示的核苷衍生物的步骤。
式中,Bx、R1、WG1如前所述。
烷基化试剂例如可例举以下的通式(13)表示的醚化合物。
式中,L表示卤素、芳硫基、烷基亚砜基或烷硫基,WG1如前所述。
L所表示的卤素、芳硫基中的芳基、烷基亚砜基及烷硫基中的烷基可例举与本发明的亚磷酰胺化合物中的卤素、芳基、烷基相同的基团。
作为醚化合物(13)的具体例,可例举以下的1.~2.的化合物。
1.氯甲基2-氰基乙基醚
2.2-氰基乙基甲硫基甲基醚
醚化合物(13)是可在碱性条件下对2’位羟基导入中性条件下可脱离的醚型取代基的新的烷基化试剂,作为制备本发明的亚磷酰胺化合物的试剂有用。
醚化合物(13)可通过实施以下的步骤1~步骤4来制备。
步骤1:
将以下的通式(20)表示的醇化合物烷硫基甲基化,制备以下的通式(24)表示的化合物的步骤。
式中,WG1如前所述,R3表示烷基或芳基。
化合物(24)是L为烷硫基的醚化合物(13)。
R3所表示的烷基可例举与本发明的亚磷酰胺化合物中的烷基同样的基团。
R3为甲基时,作为烷硫基甲基化试剂,例如可例举二甲亚砜、乙酸酐及乙酸的混合溶液。二甲亚砜的用量相对于化合物(20)以10~200倍摩尔量为宜,优选20~100倍摩尔量。乙酸的用量相对于化合物(20)以10~150倍摩尔为宜,优选20~100倍摩尔量。乙酸酐的用量相对于化合物(20)以10~150倍摩尔量为宜,优选20~100倍摩尔量。反应温度优选0℃~100℃。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异,通常以1~48小时为宜。
步骤2:
将化合物(24)卤化,制备以下的通式(25)表示的化合物的步骤。
式中,WG1、R3如前所述,X2表示卤素。
化合物(25)是醚化合物(13)中的L为卤素的化合物。
X2所表示的卤素可例举与本发明的亚磷酰胺化合物中的卤素同样的卤素。
本步骤可按照公知的方法(例如,T.Benneche等,Synthesis 762(1983))实施。所用溶剂只要不会影响反应即可,无特别限定,例如可例举二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷等卤代烃类。作为卤化剂,例如可例举硫酰氯、磷酰氯。卤化剂的用量相对于化合物(24)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~10倍摩尔量。反应温度以0℃~100℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以30分钟~24小时为宜。
步骤3:
将化合物(25)芳硫基化,制备以下通式(25a)表示的化合物的步骤。
式中,WG1、X2如前所述,R3a表示芳基。
化合物(25)是醚化合物(13)中的L为芳硫基的化合物。
R3a所表示的芳基可例举与本发明的亚磷酰胺化合物中的芳基同样的基团。
本步骤可采用公知方法实施。所用溶剂只要不会影响反应即可,无特别限定,例如可例举二氯甲烷、乙腈。作为芳硫基化试剂,例如可例举苯硫酚、4-甲基苯硫醇。芳硫基化试剂的用量相对于化合物(25)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~5倍摩尔量。反应温度以0℃~100℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以1~48小时为宜。
步骤4:
将化合物(24)氧化,制备下述通式(24a)表示的化合物的步骤。
式中,WG1、R3如前所述。
化合物(24a)是醚化合物(13)中的L为烷基亚砜基的化合物。
R3所表示的烷基可例举与本发明的亚磷酰胺化合物中的烷基相同的基团。
本步骤可采用公知方法实施。所用溶剂只要不会影响反应即可,无特别限定,例如可例举二氯甲烷、氯仿、甲醇。作为氧化剂,例如可例举间氯过苯甲酸、偏高碘酸盐、过氧化氢。氧化剂的用量相对于化合物(24)以1~10倍摩尔量为宜,优选1~2倍摩尔量。反应温度以0℃~100℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以1~48小时为宜。
烷基化试剂采用化合物(25)时,可如下实施。
本步骤可按照公知方法,通过使烷基化试剂和碱作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的化合物(14)而实施。所用溶剂只要不会影响反应即可,无特别限定,例如可例举二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷等卤代烃类。烷基化试剂的用量相对于化合物(14)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~10倍摩尔量。本步骤中,也可根据需要使金属试剂和碱作用于化合物(14),制得中间体后再使烷基化试剂与之作用。所述金属试剂例如可例举二氯化二丁基锡。金属试剂的用量相对于化合物(14)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~10倍摩尔量。作为碱,可例举吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯等有机碱。碱的用量相对于化合物(14)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~10倍摩尔量。反应温度以0℃~120℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以30分钟~24小时为宜。
烷基化试剂采用化合物(24)或(25a)时,可如下实施。
本步骤可按照公知方法(例如,M.Matteucci,Tetrahedron Letters,Vol.31,2385(1990)),通过使烷基化试剂、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的化合物(14)而实施。烷基化试剂的用量相对于化合物(14)以1~5倍摩尔量为宜,优选1.05~3倍摩尔量。作为酸,例如可例举三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。酸的用量相对于化合物(14)以0.01~20倍摩尔量为宜,优选0.02~10倍摩尔量。所用溶剂只要不会影响反应即可,无特别限定,例如可例举二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、乙腈或它们的混合溶剂。作为本步骤中所用的针对于硫原子的卤化剂,例如可例举N-溴琥珀酰亚胺(NBS)、N-碘琥珀酰亚胺(NIS)。针对于硫原子的卤化剂的用量相对于化合物(14)以1~10倍摩尔量为宜,优选1.05~5倍摩尔量。反应温度以-78℃~30℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以5分钟~5小时为宜。
烷基化试剂采用化合物(24a)时,可如下实施。
本步骤可按照公知方法,通过使烷基化试剂、酸酐和碱作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的化合物(14)而实施。烷基化试剂的用量相对于化合物(14)以1~5倍摩尔量为宜,优选1.05~3倍摩尔量。作为酸酐,例如可例举三氟甲磺酸酐、乙酸酐。酸酐的用量相对于化合物(14)以0.01~20倍摩尔量为宜,优选0.02~10倍摩尔量。作为碱,例如可例举四甲基脲、三甲基吡啶。碱的用量相对于化合物(14)以0.01~20倍摩尔量为宜,优选0.02~10倍摩尔量。所用溶剂只要不会影响反应即可,无特别限定,例如可例举二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷或它们的混合溶剂。反应温度以-78℃~30℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以5分钟~24小时为宜。
(2)步骤b:
分离精制步骤a制得的核苷衍生物(15)的步骤。
本步骤可通过例如薄层色谱法、硅胶色谱法等常规的分离精制方法从步骤a制得的混合物进行分离精制。
(3)步骤c:
与步骤b分别进行,通过使烷基化试剂作用于以下的通式(16)表示的核糖核酸化合物,制得在2’位羟基导入了中性条件下脱离的醚型保护基的以下的通式(17)表示的核糖核酸化合物的步骤。
式中,Bx、WG1如前所述,A表示以下的通式(18a)或(18b)表示的硅取代基,
式中,R6表示烷基。
R6所表示的烷基可例举与本发明的亚磷酰胺化合物中的烷基相同的基团。
烷基化试剂可例举与前述相同的试剂。
烷基化试剂采用化合物(25)时,可如下实施。
本步骤可按照公知方法,通过使烷基化试剂和碱作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的化合物(16)而实施。所用溶剂只要不会影响反应即可,无特别限定,例如可例举二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷等卤代烃类。烷基化试剂的用量相对于化合物(14)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~10倍摩尔量。本步骤中,也可根据需要使金属试剂和碱作用于化合物(16),制得中间体后再使烷基化试剂作用。所述金属试剂例如可例举二氯化二丁基锡、氯化叔丁基镁。金属试剂的用量相对于化合物(16)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~10倍摩尔量。作为碱,可例举吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯等有机碱。碱的用量相对于化合物(16)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~10倍摩尔量。反应温度以0℃~120℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以30分钟~24小时为宜。
烷基化试剂采用化合物(24)或(25a)时,可如下实施。
本步骤可按照公知方法(例如,M.Matteucci,Tetrahedron Letters,Vol.31,2385(1990)),通过使烷基化试剂、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的化合物(16)而实施。烷基化试剂的用量相对于化合物(16)以1~5倍摩尔量为宜,优选1.05~3倍摩尔量。作为酸,例如可例举三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。酸的用量相对于化合物(16)以0.01~20倍摩尔量为宜,优选0.02~10倍摩尔量。所用溶剂只要不会影响反应即可,无特别限定,例如可例举二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、乙腈或它们的混合溶剂。作为本步骤中所用的针对于硫原子的卤化剂,例如可例举N-溴琥珀酰亚胺(NBS)、N-碘琥珀酰亚胺(NIS)。针对于硫原子的卤化剂的用量相对于化合物(16)以1~10倍摩尔量为宜,优选1.05~5倍摩尔量。反应温度以-78℃~30℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以5分钟~5小时为宜。
烷基化试剂采用化合物(24a)时,可如下实施。
本步骤可按照公知方法,通过使烷基化试剂、酸酐和碱作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的化合物(16)而实施。烷基化试剂的用量相对于化合物(16)以1~5倍摩尔量为宜,优选1.05~3倍摩尔量。作为酸酐,例如可例举三氟甲磺酸酐、乙酸酐。酸酐的用量相对于化合物(16)以0.01~20倍摩尔量为宜,优选0.02~10倍摩尔量。作为碱,例如可例举四甲基脲、三甲基吡啶。碱的用量相对于化合物(16)以0.01~20倍摩尔量为宜,优选0.02~10倍摩尔量。所用溶剂只要不会影响反应即可,无特别限定,例如可例举二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷或它们的混合溶剂。反应温度以-78℃~30℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以5分钟~24小时为宜。
(4)步骤d:
与步骤a~步骤c分别进行,通过使二甲亚砜、乙酸和乙酸酐作用于核糖核酸化合物(16)而制得下述通式(19)表示的核糖核酸化合物的步骤。
式中,A、Bx如前所述。
本步骤可按照公知方法,通过使二甲亚砜、乙酸和乙酸酐作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸化合物(16)而实施。
二甲亚砜的用量相对于化合物(16)以10~200倍摩尔量为宜,优选20~100倍摩尔量。酸酐的用量相对于化合物(16)以10~150倍摩尔量为宜,优选20~100倍摩尔量。乙酸酐的用量相对于化合物(16)以10~150倍摩尔量为宜,优选20~100倍摩尔量。反应温度以10℃~50℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以30分钟~24小时为宜。
(5)步骤e:
通过使下述通式(20)表示的醇化合物、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于步骤d制得的核苷衍生物(19),制备在2’位羟基导入了中性条件下脱离的醚型保护基的下述通式(17)表示的核糖核酸化合物的步骤。
式中,A、Bx、WG1如前所述。
本步骤可按照公知方法,通过使醇化合物(20)、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于核糖核酸化合物(19)而实施。
所用溶剂只要不会影响反应即可,无特别限定,例如可例举二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、乙腈或它们的混合溶剂。醇化合物(20)的用量相对于化合物(19)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~10倍摩尔量。作为酸,例如可例举三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。作为针对于硫原子的卤化剂,例如可例举N-溴琥珀酰亚胺(NBS)、N-碘琥珀酰亚胺(NIS)。针对于硫原子的卤化剂的用量相对于化合物(19)以0.1~20倍摩尔量为宜,优选0.2~10倍摩尔量。反应温度以-100℃~20℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以5分钟~12小时为宜。
(6)步骤f:
通过实施脱去步骤c或步骤e制得的核糖核酸化合物(17)的3’位和5’位羟基的保护基的反应,制得下述通式(21)表示的核糖核酸化合物的步骤。
式中,A、Bx、WG1如前所述。
本步骤可通过将化合物(17)溶于有机溶剂,使氟化剂和酸的任意混合比的混合试剂与之反应而实施。作为可用于本步骤的氟化剂,例如可例举氟化铵、氟化四正丁基铵(TBAF)、三乙胺三氢氟酸盐、氟化氢吡啶。氟化剂的用量相对于化合物(17)以0.1~20倍摩尔量为宜,优选0.2~10倍摩尔量。反应温度以0℃~120℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以30分钟~24小时为宜。
(7)步骤g:
制备在步骤f制得的核糖核酸化合物(21)的5’位羟基导入酸性条件下可脱离的保护基(R1)的核糖核酸化合物(15)的步骤。
式中,A、Bx、R1、WG1如前所述,X3表示卤素。
X3所表示的卤素可例举与本发明的亚磷酰胺化合物中的卤素相同的卤素。
本步骤可按照公知的方法,通过使R1X3作用于化合物(21)而实施。R1X3的用量相对于化合物(21)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~10倍摩尔量。所用溶剂只要对反应没有影响即可,无特别限定,例如可例举乙腈、四氢呋喃。作为碱,可例举吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯等有机碱。碱的用量相对于化合物(21)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~10倍摩尔量。反应温度以0℃~120℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以30分钟~24小时为宜。
(8)步骤h:
通过使亚磷酰胺化试剂和根据需要使用的活化剂作用于步骤b或步骤f制得的核苷衍生物(15),制备3’位羟基被亚磷酰胺化的本发明的亚磷酰胺化合物的步骤。
式中,Bx、R1、R2a、R2b、WG1、WG2如前所述。
作为亚磷酰胺化试剂,例如可例举下述通式(22)、(23)表示的化合物。
式中,R2a、R2b、WG2如前所述,X1表示卤素。
X1所表示的卤素可例举与本发明的亚磷酰胺化合物中的卤素相同的卤素。
本步骤是使亚磷酰胺化试剂作用于化合物(15)而将3’位羟基亚磷酰胺化的反应,可按照公知的方法实施。根据需要还可采用活化剂。所用溶剂只要对反应没有影响即可,无特别限定,例如可例举乙腈、四氢呋喃。
亚磷酰胺化试剂的用量相对于化合物(15)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~10倍摩尔量。作为活化剂,例如可例举1H-四唑、5-乙硫基四唑、4,5-二氯咪唑、4,5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑盐、三氟甲磺酸咪唑盐、三氟甲磺酸吡啶盐、N,N-二异丙基乙胺、2,4,6-三甲基吡啶/N-甲基咪唑。活化剂的用量相对于化合物(15)以1~20倍摩尔量为宜,优选1~10倍摩尔量。反应温度以0℃~120℃为宜。反应时间因所用原料的种类和反应温度等而异,通常以30分钟~24小时为宜。
以上所制备的本发明的亚磷酰胺化合物本身可通过例如浓缩、液相转换、转溶、溶剂萃取、结晶化、重结晶、分馏、层析等公知的方法进行分离精制。
III.低聚RNA的制法
作为本发明,可例举以采用本发明的亚磷酰胺化合物为特征的下述通式(3)表示的低聚RNA的制法。
以下进行详述。
式中,各B独立地表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或它们的修饰体,各R分别独立地表示H或羟基,且至少1个表示羟基,Z表示H或磷酸基,n表示1~100范围内的整数。
n优选10~50范围内的整数,更好为15~30范围内的整数。
作为B的修饰体中的取代基,例如可例举卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基,可以被1~3个上述取代基取代。
B的修饰体中的卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基可例举与本发明的亚磷酰胺化合物中所述的各基团相同的基团。
采用本发明的亚磷酰胺化合物的低聚RNA(3)的制法可按照公知方法实施,例如可通过实施以下所示的步骤A~步骤G的操作,分阶段地从3’至5’的方向缩合核酸单体化合物。
被用于下述步骤的化合物及试剂中,除了本发明的亚磷酰胺化合物以外,可使用任何通常用于低聚RNA或低聚DNA的合成的化合物及试剂,无特别限定。另外,与采用现有的核酸合成试剂的情况相同,所有的步骤可采用人工方法或市售的DNA自动合成机来实施。采用自动合成机实施时,操作方法简便,且合成的正确率高,所以优选使用自动合成机的方法。此外,下述步骤A~步骤G所记载的化合物及试剂中,除核酸单体化合物以外,可使用任何通常用于低聚DNA或低聚RNA的合成的化合物及试剂,无特别限定。
(1)步骤A:
通过使酸作用于下述通式(4)表示的化合物,将5’位羟基的保护基脱去,制备下述通式(5)表示的化合物的步骤。
式中,n、R1、WG2如前所述,各Bx分别独立地表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或它们的修饰体,各R4分别独立地表示H、酰氧基或下述通式(6)表示的取代基,
式中,WG1如前所述,
E表示酰基或下述通式(7)表示的取代基,
式中,Q表示单键或下述通式(8)表示的取代基,
式中,WG2如前所述,
T表示H、酰氧基、上述通式(6)或(7)表示的取代基,但E和T中的任一方表示取代基(7)。
本步骤通过使酸作用于被承载于固相载体的下述通式(26a)、(26b)表示的化合物(n=1的化合物(4))或通过实施步骤A~步骤D的操作而制备的被承载于固相载体的低聚RNA或低聚DNA(n=2~100的化合物(4))(以下称为被承载于固相载体的化合物)而实施。
式中,Bx、R1如前所述,R2L、R4L表示取代基(7),R2表示酰氧基,R4表示H、酰氧基或取代基(6)。
R2、R4所表示的酰氧基中的酰基例如可例举乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、苯乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基。
作为固相载体,可例举例如可控孔度玻璃(controlled pore glass;CPG)、草酰化-可控孔度玻璃(例如参照Alul等,Nucleic Acids Research,Vol.19,1527(1991))、TentaGel支承体-氨基聚乙二醇衍生物化支承体(例如参照Wright等,Tetrahedron Letters,Vol.34,3373(1993))、空孔-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。
作为连接基,例如可例举3-氨基丙基、琥珀酰基、2,2’-二乙醇磺酰基、长链烷基氨基(LCAA)。
化合物(26a)、(26b)是按照公知方法制得的或可作为市售品获得的被承载于固相载体的化合物,作为其优选例子,可例举以下的通式(27)、(28)表示的化合物。
式中,Bx、R1、R4、WG2如前所述。
R4为取代基(6)的化合物(27)、(28)可按照公知方法由本发明的亚磷酰胺化合物制得。
作为可用于本步骤的酸,例如可例举三氟乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。该可用于本步骤的酸也可用适当的溶剂将其浓度稀释至1~5%后再使用。作为溶剂,只要不会对反应有影响即可,无特别限定,可例举二氯甲烷、乙腈、水或它们的混合溶剂。上述反应的反应温度优选20℃~50℃。反应时间因所用酸的种类和反应温度而异,通常以1分钟~1小时为宜。所用试剂的量相对于被承载于固相载体的化合物以1~100倍摩尔量为宜,更好为1~10倍摩尔量。
(2)步骤B:
采用活化剂使核酸单体化合物与步骤A制得的化合物(5)缩合,制备下述通式(9)表示的化合物的步骤。
式中,Bx、E、n、R1、R4、T、WG2如前所述。
本步骤可通过使核酸单体化合物和活化剂作用于被承载于固相载体的化合物而实施。
作为核酸单体化合物,可例举本发明的亚磷酰胺化合物或可作为市售品获得的下述通式(29)表示的化合物。
式中,R1、R2a、R2b、WG2如前所述,BY表示可具有保护基的核酸碱基。
作为BY所表示的核酸碱基,只要是被用于核酸的合成的碱基即可,无特别限定,例如可例举腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或它们的修饰体。
该修饰体的定义与前述Bx相同。
作为BY的修饰体中的取代基,例如可例举卤素、烷基、芳烷基、烷氧基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基,可被1~3个上述取代基取代。
BY的修饰体中的卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基可例举与本发明的亚磷酰胺化合物中所述的各基团相同的基团。
BY所表示的核酸碱基可以被保护,其中例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶等具有氨基的核酸碱基的氨基最好被保护起来。该BY的氨基的保护基可例举与前述Bx所述同样的基团。
活化剂可例举与前述同样的试剂。
作为反应溶剂,只要不会对反应有影响即可,无特别限定,例如可例举乙腈、四氢呋喃。上述反应的反应温度以20℃~50℃为宜。反应时间因所用活化剂的种类和反应温度而异,通常以1分钟~1小时为宜。所用试剂的量相对于被承载于固相载体的化合物以1~100倍摩尔量为宜,更好为1~10倍摩尔量。
(3)步骤C:
将步骤B中未反应的化合物(5)的5’位羟基封端的步骤。
式中,Bx、E、n、R4、T、WG2如前所述,R5表示甲基、苯氧基甲基。
本步骤是对步骤B中未反应的5’位羟基进行保护的反应,通过将封端剂作用于被承载于固相载体的化合物而实施。
作为封端剂,例如可例举乙酸酐或苯氧基乙酸酐。该封端剂也可以用适当溶剂将其浓度稀释至0.05~1M后再使用。作为溶剂,只要不会对反应有影响即可,无特别限定,例如可例举吡啶、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃或它们的混合溶剂。此外,可根据需要在本步骤中使用例如4-二甲基氨基吡啶、N-甲基咪唑作为反应促进剂。上述反应的反应温度以20℃~50℃为宜。反应时间因所用封端剂的种类和反应温度而异,通常以1分钟~30分钟为宜。所用试剂的量相对于被承载于固相载体的化合物以1~100倍摩尔量为宜,更好为1~10倍摩尔量。
(4)步骤D:
通过使氧化剂作用于步骤B制得的化合物(9),将亚磷酸基转换为磷酸基的步骤。
式中,Bx、E、n、R1、R4、T、WG2如前所述。
本步骤是利用氧化剂将3价磷转换为5价磷的反应,通过使氧化剂作用于被承载于固相载体的化合物而实施。
作为氧化剂,例如可例举碘、过氧化氢叔丁基。该氧化剂也可用适当的溶剂将其浓度稀释至0.05~2M后再使用。作为溶剂,只要不会对反应有影响即可,可例举吡啶、四氢呋喃、水或它们的混合溶剂。例如可采用碘/水/吡啶-四氢呋喃、碘/吡啶-乙酸和过氧化剂(过氧化氢叔丁基/二氯甲烷等)。反应温度以20℃~50℃为宜。反应时间因所用氧化剂的种类和反应温度而异,通常为1分钟~30分钟。所用试剂的量相对于被承载于固相载体的化合物以1~100倍摩尔量为宜,更好为10~50倍摩尔量。
(5)步骤E:
将步骤D制备的化合物(11)从固相载体解离(cleave),除去各核酸碱基部及各2’位羟基的保护基的步骤。
式中,B、Bx、E、R、R1、R4、n、T、WG2、Z如前所述。
解离步骤是利用解离剂将所需链长的低聚RNA从固相载体及连接基解离的反应,可通过向承载有所需链长的低聚RNA的固相载体添加解离剂而实施。本步骤中可除去核酸碱基部的保护基。
作为解离剂,例如可例举浓氨水、甲胺。本步骤中可使用的解离剂例如可用水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃或它们的混合溶剂稀释后再使用。
其中,优选使用乙醇。
反应温度以15℃~75℃为宜,优选15℃~30℃,更好为18℃~25℃。脱保护反应时间以1~30小时为宜,优选1~24小时,更好为1~4小时。被用于脱保护的溶液中的氢氧化铵的浓度以20~30重量%为宜,优选25~30重量%,更好为28~30重量%。所用试剂的量相对于被承载于固相载体的化合物以1~100倍摩尔量为宜,更好为10~50倍摩尔量。
除去2’位羟基的保护基的步骤可通过使例如氟化四丁基铵、三氟化氢·三乙胺盐等除去2’位羟基的保护基的试剂与化合物作用而实施。作为所用溶剂,只要是不会影响反应的溶剂即可,无特别限定,例如可例举四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、吡啶、二甲亚砜或它们的混合溶剂。如果需要,还可添加清除本步骤中作为副产物生成的丙烯腈的化合物,该化合物例如有烷基胺、脒、硫醇、硫醇衍生物或它们的混合物。作为烷基胺,例如可例举直链状的碳数1~6的烷基胺。具体例如可例举甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺。作为脒,例如可例举苯甲脒、甲脒。作为硫醇,例如可例举直链状的碳数1~6的硫醇。具体例如可例举甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、1-丁硫醇、1-戊硫醇、1-己硫醇。作为硫醇衍生物,例如可例举具有相同或不同的直链状的碳数1~6的烷基硫醇基的醇或醚。具体例如可例举2-巯基乙醇、4-巯基-1-丁醇、6-巯基-1-己醇、巯基甲醚、2-巯基乙醚、3-巯基丙醚、4-巯基丁醚、5-巯基戊醚、6-巯基己醚。反应温度以20℃~80℃为宜。反应时间因所用脱保护剂的种类和反应温度而异,通常以1小时~100小时为宜。所用试剂的量相对于被除去的保护剂以50~500倍摩尔量为宜,更好为50~100倍摩尔量。
可利用例如萃取、浓缩、中和、过滤、离心分离、重结晶、硅胶柱色谱法、薄层色谱法、反相ODS柱色谱法、离子交换柱色谱法、凝胶过滤柱色谱法、透析、超滤等常规的分离精制方法,从上述反应混合物分离精制5’位得到保护的低聚RNA。
(6)步骤F:
将步骤E制备的化合物(12)的5’位羟基的保护基除去的步骤。
式中,B、n、R、R1、Z如前所述。
本步骤是最终除去低聚RNA的5’位羟基的保护基的步骤,可通过使酸作用于从固相载体解离得到的低聚RNA而实施。
作为可用于本步骤的酸,例如可例举三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸等。本步骤中可使用的酸也可用适当的溶剂稀释后再使用。作为溶剂,只要是不会对反应有影响的溶剂即可,无特别限定,例如可例举二氯甲烷、乙腈、水、pH为2~5的缓冲液或它们的混合溶剂。作为缓冲液,例如可例举乙酸缓冲液。上述反应的反应温度以20℃~50℃为宜。反应时间因所用酸的种类和反应温度而异,通常以1分钟~1小时为宜。所用试剂的量相对于被承载于固相载体的化合物以1~100倍摩尔量为宜,更好为1~10倍摩尔量。
(7)步骤G:
分离精制步骤F制备的化合物(3)的步骤。
分离精制步骤是指通过单独或组合使用例如萃取、浓缩、中和、过滤、离心分离、重结晶、C8-C18的反相柱色谱法、C8-C18的反相卡套柱(cartridge column)色谱法、阳离子交换柱色谱法、阴离子交换柱色谱法、凝胶过滤柱色谱法、高效液相色谱法、透析、超滤等通常的分离精制方法,从上述反应混合物分离精制所需低聚RNA的步骤。
作为洗脱溶剂,例如可例举乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、水的单溶剂或任意比例的混合溶剂。这种情况下,也可以1mM~2M的浓度作为添加剂添加例如磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、氯化钾、乙酸铵、乙酸三乙基铵、乙酸钠、乙酸钾、Tris-HCl、乙二胺四乙酸,将溶液的pH调整至1~9的范围。
通过重复实施步骤A~步骤D的操作,能够制得所需链长的低聚RNA(3)。本制法中作为制备低聚RNA(3)的起始原料,可使用R4为取代基(6)的化合物(26a)、R4为H或酰氧基的化合物(26a)或R2为烷氧基的化合物(26b)等。但是,作为起始原料使用了R4为H或酰氧基的化合物(26a)或R2为烷氧基的化合物(26b)的情况下,核酸单体化合物中的至少1种必须使用本发明的亚磷酰胺化合物。
此外,本制法中,也可通过在步骤E的操作之前实施步骤F的操作,然后再实施步骤E的操作,接着通过步骤G的操作分离精制低聚RNA。
实施例
以下,例举实施例,对本发明进行更详细的说明,但本发明并不仅限于此。
实施例1 氯甲基2-氰基乙基醚
步骤1 甲硫基甲基2-氰基乙基醚的制备
将32g(450mmol)3-羟基丙腈溶于450ml二甲亚砜,加入324mL乙酸酐和231mL乙酸,室温下搅拌24小时。将990g碳酸氢钠溶于4.5L水调制成溶液,用1小时的时间将反应液滴入该溶液中,紧接着搅拌1小时,用乙酸乙酯萃取反应液,用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂,用硅胶柱色谱法对所得油状物进行精制,获得41g呈无色油状物的甲硫基甲基2-氰基乙基醚(收率70%)。
1H-NMR(CDCl3):2.18(s,3H):2.66(t,2H,J=6.3Hz):3.77(t,2H,J=6.3Hz):4.69(s,2H)
步骤2 氯甲基2-氰基乙基醚的制备
使3.3g(25mmol)步骤1获得的甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于70mL二氯甲烷,冰冷下滴加2mL(25mmol)硫酰氯,再于室温反应1小时。反应后蒸除溶剂,在真空中进行蒸馏,获得2.5g呈无色油状物的目标化合物(收率85%)。沸点:84~85℃(0.3托)
1H-NMR(CDCl3):2.72(t,2H,J=6.3Hz):3.92(t,2H,J=6.3Hz):5.52(s,2H)
实施例2 5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)
步骤1 5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备
将546mg(1mmol)5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷溶于4mL的1,2-二氯乙烷后加入452mg(3.5mmol)二异丙基乙胺,再加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基锡,然后于室温反应1小时。升温至80℃后滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚,紧接着搅拌30分钟。反应结束后在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液,用二氯甲烷萃取,再用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂,利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制,获得5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(197mg,收率34%)。
1H-NMR(CDCl3):2.47(d,1H,J=7.8Hz);2.69(t,2H,J=6.3Hz);3.55(dd,1H,J=11.3,2.2Hz);3.62(dd,1H,J=11.3,2.2Hz);3.83(s,6H);3.87(t,2H,J=6.3Hz);4.07-4.08(m,1H);4.32(dd,1H,J=5.3,1.9Hz);4.54(q,1H,J=5.3Hz);4.94,5.11(2d,2H,J=6.9Hz);5.32(d,1H,J=8.2Hz);6.00(d,1H,J=1.9Hz);6.85-6.88(m,4H);7.29-7.41(m,9H);8.02(d,1H,J=8.2Hz);8.53(br.s,1H)
ESI-质谱:652[M+Na]+
步骤2 5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)的制备
将209mg(0.332mmol)步骤1获得的5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷和23mg(0.332mmol)四唑溶于2mL乙腈,再滴加150mg(0.498mmol)的2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺,于45℃反应1.5小时。反应后加入饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯萃取,再用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂,利用20g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制,获得目标化合物(200mg,收率73%)。
ESI-质谱:852[M+Na]+
实施例3 2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷
步骤1 3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备
氩气氛下,将150mg(0.3mmol)3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)尿苷溶于7mL四氢呋喃,加入54mg(0.4mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和100mg分子筛4A,搅拌10分钟。将温度调整为0℃,加入10mg(0.06mmol)三氟甲磺酸的四氢呋喃溶液2mL,搅拌后加入92mg(0.4mmol)N-碘琥珀酰亚胺,搅拌1小时。用硅藻土过滤反应液,用二氯甲烷洗涤后,有机相用1M硫代硫酸氢钠水溶液洗涤,再用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂。用薄层色谱法对所得残渣进行精制,获得3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(150mg,收率85%)。
1H-NMR(CDCl3):0.97-1.12(m,28H);2.68-2.73(m,2H);3.78-3.86(m,1H);3.96-4.05(m,2H);4.12-4.30(m,4H);5.0-5.04(m,2H);5.70(d,1H,J=8.2Hz);5.75(s,1H);7.90(d,1H,J=8.2Hz);9.62(br.s,1H)
ESI-质谱:570[M+H]+
步骤2 2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备
将200mg(0.35mmol)步骤1获得的3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷溶于2mL甲醇,再加入65mg(1.76mmol)氟化铵,于50℃加热搅拌5小时。放冷后加入乙腈搅拌,过滤浓缩。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制,获得目标化合物(108mg,收率94%)。
1H-NMR(CD3OD):2.72-2.76(t,2H,J=6.2Hz);3.68-3.92(m,4H);4.00-4.03(m,1H);4.26-4.32(m,2H);4.81-4.95(m,2H);5.71(d,1H,J=8.1Hz);6.00(d,1H,J=3.3Hz);8.10(d,1H,J=8.1Hz)
ESI-质谱:350[M+Na]+
实施例4 5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备
将14g(43mmol)2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷以吡啶共沸,用真空泵干燥30分钟。然后,溶于300mL四氢呋喃,在氩气氛下加入68g(856mmol)吡啶和20g分子筛4A,搅拌10分钟。将19.6g(57.8mmol)4,4’-二甲氧基三苯甲基氯以1小时的间隔分3次加入其中,再搅拌1小时。接着,加入10mL甲醇搅拌2分钟,再用硅藻土过滤,用乙酸乙酯洗涤。浓缩滤液后将残渣溶于乙酸乙酯,再与饱和碳酸氢钠水溶液分液。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤,用无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制,获得目标化合物(26.5g,收率98%)。
实施例5 N4-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)
步骤1 N4-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制备
将588mg(1mmol)N4-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胞苷溶于4mL的1,2-二氯乙烷,加入452mg(3.5mmol)二异丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基锡,室温下反应1小时。然后,将温度升至80℃,滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚,紧接着搅拌60分钟。反应结束后,在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液,用二氯甲烷萃取,再用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂,利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制,获得N4-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(219mg,收率35%)。1H-NMR(CDCl3):2.19(s,3H);2.56(d,1H,J=8.8Hz);2.65(t,2H,J=6.2Hz);3.55(dd,1H,J=10.5,2.5Hz);3.63(dd,1H,J=10.5,2.5Hz);3.82(s,6H);3.86(t,2H,J=6.2Hz);4.09-4.14(m,1H);4.28(d,1H,J=5.1Hz);4.44-4.49(m,1H);4.97,5.24(2d,2H,J=6.9Hz);5.96(s,1H);6.86-6.88(m,4H);7.09(d,1H,J=6.9Hz);7.26-7.42(m,9H);8.48(d,1H,J=6.9Hz);8.59(br.s,1H)
ESI-质谱:693[M+Na]+
步骤2 N4-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)的制备
将205mg(0.306mmol)步骤1获得的N4-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2mL二氯甲烷,加入105mg(0.812mmol)二异丙基乙胺,再滴加116mg(0.49mmol)2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺,室温下反应1小时。反应后蒸除溶剂,利用20g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制,获得目标化合物(242mg,收率91%)。
ESI-质谱:871[M+H]+
实施例6 N4-乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷
步骤1 N4-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制备
混合1.00g(1.89mmol)N4-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)胞苷和500mg(3.79mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚,将混合物溶于10mL甲苯和10mL四氢呋喃的混合溶剂。然后,加入975mg(3.79mmol)三氟甲磺酸银,再加入分子筛4A,干燥。冰冷下加入370mg(2.08mmol)N-溴琥珀酰亚胺,将反应容器遮光,搅拌10分钟。再追加70mg(0.39mmol)N-溴琥珀酰亚胺,搅拌25分钟。反应结束后加入二氯甲烷稀释,用饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤,用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂,用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制,获得N4-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(936mg,收率81%)。
1H-NMR(CDCl3):0.90-1.11(m,28H);2.28(s,3H);2.62-2.79(m,2H);3.78-3.89(m,1H);3.96-4.04(m,2H);4.19-4.23(m,3H);4.30(d,1H,J=13.6Hz);5.00(d,1H,J=6.8Hz);5.09(d,1H,J=6.8Hz);5.77(s,1H);7.44(d,1H,J=7.5Hz);8.30(d,1H,J=7.5Hz);10.13(s,1H)
ESI-质谱:611[M+H]+
步骤2 N4-乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制备
将500mg(0.819mmol)步骤1获得的N4-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2.5mL四氢呋喃和2.5mL甲醇的混合溶剂,加入150mg(4.10mmol)氟化铵,于50℃反应4小时。反应结束后,用乙腈稀释,过滤,蒸除溶剂,再用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制,获得目标化合物(210mg,收率70%)。
1H-NMR(D2O):2.13(s,3H);2.66-2.71(m,2H);3.72-3.78(m,3H);3.90(dd,1H,J=13.0,2.6Hz);4.06-4.11(m,1H);4.20(dd,1H,J=7.1,5.2Hz);4.29(dd,1H,J=5.1,2.9Hz);4.83(d,1H,J=7.2Hz);4.94(d,1H,J=7.2Hz);5.95(d,1H,J=2.9Hz);7.25(d,1H,J=7.6Hz);8.25(d,1H,J=7.6Hz)
ESI-质谱:391[M+Na]+
实施例7 N4-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制备
将9.9g(26.8mmol)2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷以吡啶共沸,用真空泵干燥30分钟。然后,溶于190mL四氢呋喃,在氩气氛下加入43g(538mmol)吡啶和20g分子筛4A,搅拌10分钟。将11.8g(34.9mmol)4,4’-二甲氧基三苯甲基氯以1小时的间隔分3次加入其中,再搅拌1小时。接着,加入2mL甲醇搅拌2分钟,再用硅藻土过滤,用乙酸乙酯洗涤。用蒸发器浓缩滤液后将残渣溶于乙酸乙酯,再与饱和碳酸氢钠水溶液分液。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤,用无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制,获得目标化合物(15g,收率83%)。
实施例8 N2-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)
步骤1 N2-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备
将627mg(1mmol)N2-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)鸟苷溶于4mL的1,2-二氯乙烷,加入452mg(3.5mmol)二异丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基锡,室温下反应1小时。然后,将温度升至80℃,滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚,紧接着搅拌60分钟。反应结束后,在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液,用二氯甲烷萃取,再用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂,利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制,获得N2-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷(450mg,收率63%)。1H-NMR(CDCl3):1.92(s,3H);2.47-2.51(m,2H);2.68(br.s,1H);3.30(dd,1H,J=10.7,3.8Hz);3.47(dd,1H,J=10.7,3.8Hz);3.55-3.60(m,1H);3.65-3.70(m,1H);3.74,3.75(2s,6H);4.22-4.23(m,1H);4.55-4.58(m,1H);4.78,4.83(2d,2H,J=7.0Hz);5.01(t,1H,J=5.1Hz);5.99(d,1H,J=5.1Hz);6.76-6.79(m,4H);7.17-7.44(m,9H);7.88(s,1H);8.36(br.s,1H);12.06(br.s,1H)
步骤2 N2-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)
将400mg(0.563mmol)步骤1获得的N2-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷溶于2mL二氯甲烷,加入181mg(1.4mmol)二异丙基乙胺,再滴加161mg(0.68mmol)2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺,室温下反应1小时。反应后蒸除溶剂,利用20g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制,获得目标化合物(471mg,收率92%)。
实施例9 N6-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)
步骤1 N6-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备
将22.0g(36.0mmol)N6-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)腺苷溶于170mL的1,2-二氯乙烷,加入16.3mg(126mmol)二异丙基乙胺后加入12.1g(39.7mmol)二氯化二丁基锡,室温下反应1小时。然后,将温度升至80℃搅拌15分钟,再滴加4.30g(36.0mmol)氯甲基2-氰基乙基醚,紧接着搅拌30分钟。反应结束后,在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液,用二氯甲烷萃取,再用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂,用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制,获得N6-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(7.47g,收率33%)。
1H-NMR(CDCl3);2.51(t,2H,J=6.2Hz);2.58(d,1H,J=5.5Hz);2.61(s,3H);3.45(dd,1H,J=10.7,4.0Hz);3.54(dd,1H,J=10.7,3.2Hz);3.62-3.79(m,2H);3.79(s,6H);4.25(br.q,1H,J=4.6Hz);4.59(q,1H,J=5.2Hz);4.87-4.94(m,3H);6.23(d,1H,J=4.4Hz);6.80-6.83(m,4H);7.22-7.32(m,7H);7.40-7.43(m,2H);8.20(s,1H);8.61(br.s,1H);8.62(s,1H)
ESI-质谱:695[M+H]+
步骤2 N6-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)的制备
将10.0g(14.4mmol)步骤1获得的N6-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于75mL二氯甲烷,加入4.7g(36mmol)二异丙基乙胺,再滴加4.82g(20.3mmol)2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺,室温下反应1小时。反应后剩余30mL左右的溶剂,进行蒸除,再用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制,获得目标化合物(12.0g,收率93%)。
ESI-质谱;895[M+H]+
实施例10 N6-乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷
步骤1 N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备
使245mg(1.09mmol)N-碘琥珀酰亚胺和280mg(1.09mmol)三氟甲磺酸银悬浮于8mL二氯甲烷,加入分子筛4A,干燥。冰冷下,在其中加入将400mg(0.73mmol)N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)腺苷和145mg(1.11mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于4mL二氯甲烷而形成的溶液,紧接着搅拌3小时。反应结束后加入二氯甲烷稀释,再用硫代硫酸钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤,用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂,所得混合物用硅胶柱色谱法精制,获得N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(201mg,收率45%)。
1H-NMR(CDCl3):0.98-1.11(m,28H);2.62(s,3H);2.69(td,2H,6.5,J=1.5Hz);3.81-3.89(m,1H):4.02-4.09(m,2H);4.17(d,1H,J=9.4Hz);4.28(d,1H,J=13.4Hz);4.50(d,1H,J=4.5Hz);4.67(dd,1H,J=8.8,4.5Hz);5.02(d,1H,J=7.0Hz);5.08(d,1H,J=7.0Hz);6.10(s,1H);8.34(s,1H);8.66(s,1H);8.67(s,1H)
ESI-质谱:636[M+H]+
步骤2 N6-乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备
将300mg(0.47mmol)步骤1获得的N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于0.1mL乙酸和2mL的0.5M氟化四丁基铵的四氢呋喃溶液的混合溶液,室温下搅拌2小时。反应结束后用硅胶柱色谱法对所得反应混合物进行精制,获得目标化合物(160mg,收率86%)。1H-NMR(DMSO-d6):2.25(s,3H);2.53-2.68(m,2H);3.41-3.46(m,1H);3.56-3.64(m,2H);3.69-3.73(m,1H);4.00-4.01(m,1H);4.36-4.37(m,1H);4.72-4.78(m,3H);5.20(bt,2H);5.41(d,1H,J=5.2Hz);6.17(d,1H,J=5.7Hz);8.66(s,1H);8.72(s,1H);10.72(s,1H)
ESI-质谱:415[M+Na]+
实施例11 N6-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备
将9.50g(24.2mmol)N6-乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于100mL脱水吡啶,浓缩干燥后,氩气氛下溶于100mL脱水吡啶。冰冷下,加入10.7g(31.2mmol)4,4’-二甲氧基三苯甲基氯,室温下反应1小时20分钟。反应结束后,用二氯甲烷稀释,再用水洗涤,用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂,用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制,获得目标化合物(13.8g,收率82%)。
实施例12 N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)
步骤1 N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备
将720mg(1mmol)N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)鸟苷溶于4mL的1,2-二氯乙烷,加入452mg(3.5mmol)二异丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基锡,室温下反应1小时。然后,将温度升至80℃,再滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚,紧接着搅拌60分钟。反应结束后,在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液,用二氯甲烷萃取,再用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂,利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制,获得N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷(384mg,收率48%)。
1H-NMR(CDCl3):2.47-2.51(m,2H);2.58(br.s,1H);3.42(dd,1H,J=10.1,3.8Hz);3.46(dd,1H,J=10.1,3.8Hz);3.53-3.57(m,1H);3.69-3.73(m,1H);3.77(s,6H);4.24-4.26(m,1H);4.48-4.50(m,1H);4.61-4.65(m,2H);4.83,4.87(2d,2H,J=7.0Hz);4.88(t,1H,J=5.7Hz);6.05(d,1H,J=5.7Hz);6.80-6.82(m,4H);6.92-6.96(m,3H);7.07-7.11(m,2H);7.20-7.42(m,9H);7.84(s,1H);8.99(s,1H);11.81(br.s,1H)
ESI-质谱:825[M+Na]+
步骤2 N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)的制备
将320mg(0.399mmol)步骤1获得的N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷溶于4mL二氯甲烷,加入128.8mg(0.996mmol)二异丙基乙胺,再滴加141.5mg(0.598mmol)2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺,室温下反应1小时。反应后蒸除溶剂,再利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制,获得目标化合物(316mg,收率79%)。
ESI-质谱:1003[M+H]+
实施例13 N2-苯氧基乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷
步骤1 N2-苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备
将2.0g(3.0mmol)N2-苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)鸟苷溶于16mL四氢呋喃,加入0.99g(7.6mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和1.0g分子筛4A,氩气氛下于-45℃搅拌10分钟。然后,加入0.68g(4.5mmol)三氟甲磺酸的5mL四氢呋喃溶液,搅拌后加入1.02g(4.5mmol)N-碘琥珀酰亚胺,搅拌15分钟。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液,过滤后用乙酸乙酯萃取,有机相用1M硫代硫酸氢钠水溶液洗涤,再依次用水和饱和氯化钠水溶液洗涤,接着用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂。所得残渣用硅胶柱色谱法精制,获得N2-苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷(2.0g,收率89%)。
1H-NMR(CDCl3):0.99-1.11(m,28H);2.59-2.77(m,2H);3.82-4.05(m,3H);4.15(d,1H,J=9.3Hz);4.25-4.35(m,2H);4.52-4.56(dd,1H,J=9.3,4.3Hz);5.00,5.07(2d,2H,J=7.2Hz);5.95(s,1H);6.99-7.12(m,3H);7.35-7.40(m,2H);8.09(s,1H);9.38(br.s,1H);11.85(br.s,1H)
ESI-质谱:766[M+Na]+
步骤2 N2-苯氧基乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备
在2.83mL(2.83mmol)的1M氟化四丁基铵/四氢呋喃溶液中加入0.14mL(0.14mmol)乙酸,调制出溶液。将1.0g(1.35mmol)步骤1获得的N2-苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷溶于2.83mL四氢呋喃,在其中加入先前调制的溶液,氩气氛下于室温搅拌1小时。减压下浓缩反应液后将其溶于二氯甲烷,用硅胶柱色谱法精制,获得目标化合物(0.67g,收率99%)。
1H-NMR(DMSO-d6):2.59-2.66(m,2H);3.41-3.63(m,4H);3.98(m,1H);4.32(m,1H);4.58-4.62(t,1H,J=5.3Hz);4.71-4.78(dd,2H,J=13.1,6.8Hz);4.87(s,2H);5.12(s,1H);5.37(s,1H);5.97(d,1H,J=6.1Hz);6.96-6.99(m,3H);7.28-7.34(m,2H);8.30(s,1H);11.78(br.s,2H)
ESI-质谱:500[M-H]-
实施例14 N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备
将660mg(1.32mmol)N2-苯氧基乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷以吡啶共沸,用真空泵干燥30分钟。然后,溶于9mL四氢呋喃,在氩气氛下加入2.1g(26.4mmol)吡啶和600mg分子筛4A,搅拌10分钟。将540mg(1.58mmol)4,4’-二甲氧基三苯甲基氯以1小时的间隔分3次加入其中,再搅拌1小时。接着,加入2mL甲醇搅拌2分钟,再用硅藻土过滤,用乙酸乙酯洗涤。用蒸发器浓缩滤液后将残渣溶于乙酸乙酯,再与饱和碳酸氢钠水溶液分液。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤,用无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制,获得目标化合物(800mg,收率75%)。
实施例15 N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷
步骤1 N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-甲硫基甲基腺苷的制备
将2.00g(3.62mmol)N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)腺苷溶于25mL二甲亚砜,加入17.5mL乙酸酐和12.5mL乙酸,室温下搅拌14小时。反应结束后在200mL水中加入反应液,用乙酸乙酯萃取,用饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤,再用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂,用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制,获得N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-甲硫基甲基腺苷(1.36g,收率61%)。
1H-NMR(CDCl3):0.96-1.11(m,28H);2.20(s,3H);2.61(s,3H);4.03(dd,1H,J=13.4,2.4Hz);4.18(d,1H,J=9.1Hz);4.27(d,1H,J=13.4Hz);4.63-4.71(m,2H);5.00(d,1H,J=11.5Hz);5.07(d,1H,J=11.5Hz);6.09(s,1H);8.31(s,1H);8.65(s,1H);8.69(s,1H)
ESI-质谱:635[M+Na]+
步骤2 N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备
将1.00g(1.63mmol)步骤1获得的N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-甲硫基甲基腺苷溶于25mL四氢呋喃。加入5.88g(82.7mmol)3-羟基丙腈,再加入分子筛4A,干燥,冷却至-45℃。接着,加入440mg(1.96mmol)N-碘琥珀酰亚胺,再加入490mg(3.26mmol)三氟甲磺酸,于-45℃搅拌15分钟。反应结束后,在冷却的状态下加入三乙胺进行中和,用二氯甲烷稀释,再用硫代硫酸钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤,用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂,所得混合物用硅胶柱色谱法精制,获得目标化合物(722mg,收率71%)。
实施例16 尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷
将承载有市售的2’/3’-O-苯甲酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷的CPG固相载体(37mg,1μmol)装入带玻璃滤器的柱子中,使用核酸自动合成机(ExpediteTM:Applied Biosystems公司)进行标题化合物的低聚RNA的合成。
作为核酸单体化合物使用5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺),作为缩合催化剂使用四唑,作为氧化剂使用碘溶液,作为封端剂溶液使用乙酸酐和N-甲基咪唑溶液。使核酸单体化合物缩合20次后,作为解离剂使用10M甲胺的乙醇水溶液,室温下用1~2小时实施从CPG固相载体的解离及各磷酸部位的保护基的脱离反应。减压下浓缩反应混合物后,用反相柱(ODS)除去不需要的峰,再用洗脱溶剂(乙腈-50mM三乙胺-乙酸缓冲液)精制。减压下浓缩残渣后,用1M氟化四丁基铵的THF溶液室温下反应1小时,脱离2’位羟基的保护基。对溶液进行脱盐处理后,用80%乙酸除去5’末端的保护基(室温下10分钟)。减压下浓缩后水层用乙醚洗涤,无需精制,获得高纯度的目标化合物。
MALDI-TOF-MS:计算值6367.52[M+H]+
实测值6366.50[M+H]+
由图1的反相HPLC分析的结果可明确化合物为高纯度的。测定条件如下所述。
测定条件:
HPLC装置
送液单元:LC-6A(株式会社岛津制作所制)
检测器:SPD-6A(株式会社岛津制作所制)
反相HPLC柱
Mightysil RP-18GP<4.6mmφ×15cm>(关东化学株式会社制)
柱温:35℃
流动相
梯度:线性梯度20分钟(B液:0%-70%)
A液:含5%乙腈的50mM三乙胺-乙酸缓冲液
B液:含90%乙腈的50mM三乙胺-乙酸缓冲液
流动相的流量:1ml/分钟
紫外可视分光光度计检测波长:260nm
实施例17 胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷
将承载有市售的2’/3’-O-苯甲酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷的CPG固相载体(37mg,1μmol)装入带玻璃滤器的柱子中,使用核酸自动合成机(ExpediteTM:Applied Biosystems公司)进行标题化合物的低聚RNA的合成。
作为核酸单体化合物使用5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)、3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)、N4-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)、N6-乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)、N2-苯氧基乙酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺),作为缩合催化剂使用5-乙硫基四唑,作为氧化剂使用碘溶液,作为封端剂溶液使用苯氧基乙酸酐和N-甲基咪唑溶液。使核酸单体化合物缩合19次后,在固相上进行5’末端的羟基的保护基的除去处理。然后,作为解离剂使用浓氨水-乙醇混合液(3∶1),于40℃用4小时实施从CPG固相载体的解离和各磷酸部位的保护基的脱离反应及碱基的保护基的除去处理。减压下浓缩反应混合物后,用含10%正丙胺和0.6%的2-巯基乙醚的1M氟化四丁基铵的THF溶液于室温反应1小时,除去2’位羟基的保护基。对溶液进行脱盐处理后,用DEAE-离子交换树脂(TOYOPEARL DEAE-650)进行精制,获得高纯度的目标化合物(112OD260,收率58%)。
将波长260nm的紫外吸光度(OD260)作为目标化合物的得量。以下,同样将吸光度(OD260)作为目标化合物的得量。
MALDI-TOF-MS:计算值6305.9[M+H]+
实测值6304.8[M+H]+
实施例18 腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-尿苷与实施例17同样,获得目标化合物(92OD260,收率31%)。
MALDI-TOF-MS:计算值9519.8[M+H]+
实测值9520.4[M+H]+
实施例19 尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷
与实施例17同样,获得目标化合物(254OD260,收率65%)。
MALDI-TOF-MS:计算值12185.8[M+H]+
实测值12183.3[M+H]+
实施例20 腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[-3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胸苷
与实施例17同样,获得目标化合物(75OD260,收率19%)。
MALDI-TOF-MS:计算值12731.8[M+H]+
实测值12731.7[M+H]+
实施例21 尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胸苷
与实施例17同样,获得目标化合物(83OD260,收率15%)。
MALDI-TOF-MS:计算值17476.6[M+H]+
实测值17474.6[M+H]+
产业上利用的可能性
本发明的亚磷酰胺化合物由于被导入2’位羟基的醚型保护基是直线状的取代基,结合于3’位的羟基的磷原子的周围的空间不拥塞,因此与以往使用的亚磷酰胺化合物相比,在合成低聚RNA时可在非常短的时间内进行缩合反应,缩合收率良好。
因此,通过采用本发明的亚磷酰胺化合物,能够使用与低聚DNA的制备几乎同样的方法来制得高纯度的低聚RNA。
Claims (13)
2.如权利要求1所述的亚磷酰胺化合物,其特征在于,WG1为氰基。
4.如权利要求3所述的低聚RNA(3)的制法,其特征在于,包括下述步骤A~G;
步骤A:
通过使酸作用于下述通式(4)表示的化合物,将5’位羟基的保护基脱去,制备下述通式(5)表示的化合物的步骤,
式中,n如前所述,各Bx分别独立地表示可具有保护基的核酸碱基,R1表示下述通式(2)表示的取代基,
式(2)中,R11、R12、R13相同或不同,表示氢或烷氧基,
各WG2表示吸电性基团,各R4分别独立地表示H、酰氧基或下述通式(6)表示的取代基,
式(6)中,WG1表示吸电性基团,
E表示酰基或下述通式(7)表示的取代基,
式(7)中,Q表示单键或下述通式(8)表示的取代基,
式(8)中,WG2如前所述,
T表示H、酰氧基、上述通式(6)或(7)表示的取代基,但E或T中的任一方为取代基(7);
步骤B:
采用活化剂使核酸单体化合物与步骤A制得的化合物(5)缩合,制备下述通式(9)表示的化合物的步骤,
式中,Bx、E、n、R1、R4、T、WG2如前所述;
步骤C:
将步骤B中未反应的化合物(5)的5’位羟基封端的步骤,
式中,Bx、E、n、R4、T、WG2如前所述,R5表示甲基、苯氧基甲基;
步骤D:
使氧化剂作用于步骤B制得的化合物(9),将亚磷酸基转换为磷酸基的步骤,
式中,Bx、E、n、R1、R4、T、WG2如前所述;
步骤E:
将步骤D制备的化合物(11)从固相载体解离,除去各核酸碱基部及各2’位羟基的保护基的步骤,
式中,B、Bx、E、n、R、R1、R4、T、WG2、Z如前所述;
步骤F:
将步骤E制备的化合物(12)的5’位羟基的保护基除去的步骤,
式中,B、n、R、R1、Z如前所述;
步骤G:
分离精制步骤F制备的低聚RNA(3)的步骤。
5.如权利要求4所述的低聚RNA的制法,其特征在于,通过重复实施步骤A~D制备所需链长的低聚RNA(3)。
6.如权利要求4或5所述的低聚RNA的制法,其特征在于,在步骤E中添加烷基胺、脒、硫醇、硫醇衍生物或它们的混合物。
8.如权利要求7所述的醚化合物,其特征在于,WG1为氰基。
9.下述通式(1):
表示的亚磷酰胺化合物的制法,式中,Bx表示可具有保护基的核酸碱基,R1表示以下的通式(2)表示的取代基,
R2a、R2b相同或不同,表示烷基或R2a、R2b与邻接的氮原子一起形成5~6元饱和氨基环基,该饱和氨基环基除氮原子以外还可具有1个氧原子或硫原子作为成环原子,WG1、WG2相同或不同,表示吸电性基团,式(2)中,R11、R12、R13相同或不同,表示氢或烷氧基,其特征在于,包括下述步骤a~h;
步骤a:
通过使烷基化试剂作用于以下的通式(14)表示的核苷衍生物,制备在2’位羟基导入中性条件下脱离的醚型保护基的下述通式(15)、(15’)表示的核苷衍生物的步骤,
式中,Bx表示可具有保护基的核酸碱基,R1、WG1如前所述;
步骤b:
分离精制步骤a制得的核苷衍生物(15)的步骤;
步骤c:
与步骤b分别进行,通过使烷基化试剂作用于以下的通式(16)表示的核糖核酸化合物,制得在2’位羟基导入了中性条件下脱离的醚型保护基的以下的通式(17)表示的核糖核酸化合物的步骤,
式中,Bx、WG1如前所述,A表示以下的通式(18a)或(18b)表示的硅取代基,
式中,R6表示烷基;
步骤d:
与步骤a~步骤c分别进行,通过使二甲亚砜、乙酸和乙酸酐作用于核糖核酸化合物(16)而制得下述通式(19)表示的核糖核酸化合物的步骤,
式中,A、Bx如前所述;
步骤e:
通过使下述通式(20)表示的醇化合物、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于步骤d制得的核苷衍生物(19),制备在2’位羟基导入了中性条件下脱离的醚型保护基的下述通式(17)表示的核糖核酸化合物的步骤,
式中,A、Bx、WG1如前所述;
步骤f:
通过实施脱去步骤c或e制得的核糖核酸化合物(17)的3’位和5’位羟基的保护基的反应,制得下述通式(21)表示的核糖核酸化合物的步骤,
式中,A、Bx、WG1如前所述;
步骤g:
制备在步骤f制得的核糖核酸化合物(21)的5’位羟基导入酸性条件下可脱离的保护基(R1)的核糖核酸化合物(15)的步骤,
式中,Bx、R1、WG1如前所述,X3表示卤素;
步骤h:
通过使亚磷酰胺化试剂和根据需要使用的活化剂作用于步骤b或g制得的核苷衍生物(15),制备3’位羟基被亚磷酰胺化的下述通式(1)表示的亚磷酰胺化合物的步骤,
式中,Bx、R1、WG1如前所述,R2a、R2b相同或不同,表示烷基或R2a、R2b与邻接的氮原子一起形成5~6元饱和氨基环基,该饱和氨基环基除氮原子以外还可具有1个氧原子或硫原子作为成环原子,WG2表示吸电性基团。
10.如权利要求9所述的亚磷酰胺化合物的制法,其特征在于,烷基化试剂是下述通式(13)表示的醚化合物,
式中,L表示卤素、芳硫基、烷基亚砜基或烷硫基,WG1表示吸电性基团。
11.如权利要求9或10所述的亚磷酰胺化合物的制法,其特征在于,WG1为氰基。
13.如权利要求9~12中任一项所述的亚磷酰胺化合物的制法,其特征在于,活化剂为1H-四唑、5-乙硫基四唑、5-苯甲基巯基-1H-四唑、4,5-二氯咪唑、4,5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑盐、三氟甲磺酸咪唑盐、三氟甲磺酸吡啶盐、N,N-二异丙基乙胺或2,4,6-三甲基吡啶/N-甲基咪唑。
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