ES2386709T3 - Compuesto de fosforamidita y método para producir un oligo-ARN - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1), **Fórmula**en donde:Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector;R1 es un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),en donde:R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógenoadyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico aminoopcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo denitrógeno adyacente; yWG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno y WG2 representa un grupo de extracción deelectrones.
Description
Compuesto de fosforamidita y método para producir un oligo-ARN.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un novedoso compuesto de fosforamidita en el que se introduce un novedoso 5 grupo protector en el grupo 2'-hidroxilo y a un agente para introducir el grupo protector.
Los ácidos oligorribonucleicos (oligo-ARN) son útiles como sondas de ARN para el análisis génico, materiales farmacéuticos de ARN (ARN antisentido, ribozimas, ARN para el control de la expresión génica mediada por ARNi), enzimas artificiales y aptámeros. Un procedimiento de síntesis sólida para preparar oligo-ARN se estableció a fines
10 de la década de 1980. En el primer informe del procedimiento se usaron los compuestos de fosforamidita con tercbutildimetilsililo (TBDMS) o triisopropilsililo (TIPS) como un grupo protector 2'-hidroxilo (documento no patente 1).
La síntesis química de los oligo-ARN presenta muchos más problemas que la síntesis química de los ácidos oligodesoxirribonucleicos (oligo-ADN) constituidos solamente por desoxirribonucleótidos.
Por ejemplo, el uso del grupo TBDMS como un grupo protector de 2’-hidroxilo puede causar una reacción 15 secundaria en la cual el grupo TBDMS que protege al grupo 2’-hidroxilo migra al grupo 3’-hidroxilo durante la fosforamidación del grupo 3’-hidroxilo.
Además, el uso de un sustituyente voluminoso tal como el grupo TBDMS como grupo protector de 2’-hidroxilo puede reducir la tasa de la reacción de condensación para la formación de la unión de internucleótidos debido al impedimento estérico en la cercanía del átomo de fósforo en la posición 3’, resultando posiblemente en la escisión o
20 reorganización del enlace de los internucleótidos durante la eliminación del grupo protector 2'-hidroxilo luego de la oligomerización.
Con el objetivo de superar los problemas planteados anteriormente, actualmente se están investigando los procedimientos más eficientes para sintetizar oligo-ARN.
Como grupo protector de 2’-hidroxilo, se sabe que el grupo 1-(2-cianoetoxi)etilo (CEE) se elimina junto con el grupo 25 protector de bissililo 3' y 5' en condiciones neutras capaces de eliminar el grupo protector de bissililo (documento no patente 2).
En base a esta información, Wada desarrolló un compuesto de fosforamidita para producir oligo-ARN en los cuales el grupo CEE, que es capaz de eliminarse en condiciones neutras, se introduce en el grupo 2’-hidroxi (documento no patente 3 y documento no patente 4). Sin embargo, dado que la introducción del grupo CEE en la posición 2’30 hidroxilo conduce a la formación de un nuevo centro asimétrico, los oligo-ARN en los cuales los grupos 2’-hidroxilo son protegidos por el grupo CEE están en una mezcla diaestereoisomérica. Por lo tanto, la purificación y el aislamiento del oligo-ARN es complicado. Además, dado que los oligo-ARN en los cuales se introdujo el grupo CEE tienen un grupo metilo en el carbono unido al átomo 2’-oxígeno, se espera algún impedimento estérico alrededor del átomo de fósforo unido al grupo 3’-hidroxilo, lo que genera preocupaciones sobre una reducción en la eficiencia de
35 condensación y la tasa de reacción de condensación.
Documento no patente 1: N. A. Usman et al., Journal of the American Chemical Society, Vol. 109, 7845 (1987)
Documento no patente 2: Wolfgang Pfleiderer et al., Helvetica Chimica Acta, Vol. 81, 1545 (1998)
Documento no patente 3: Takeshi Wada, Bioindustry, Vol. 21, No. 1, 17 (2004)
Documento no patente 4: T. Umemoto et al., Tetrahedron Letters, Vol. 45, 9529 (2004)
40 La publicación ORGANIC LETTERS, ACS, COLUMBUS, OH; ESTADOS UNIDOS, vol. 7, No. 16, 1º de enero de 2005 (2005-01-01), páginas 3477-3480, se refiere a un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general útil para sintetizar oligómeros de ARN.
La publicación TET. LETTERS, vol. 45. No. 52, 20 de diciembre de 2004 (2004-12-20), páginas 9529-9531, se
refiere a un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general útil para sintetizar oligonucleótidos. El compuesto de fosforamidita se sustituye por metilo en el átomo de carbono que se une al 2’hidroxilo.
La publicación HELVETICA CHIMICA ACTA, CH, vol. 83, 1º de enero de 2000 (2000-01-01), páginas 1127-1144, se refiere a una preparación de bloques de construcción para la incorporación de ribonucleótidos sustituidos por 2’-O[(3-bromopropoxi)metilo] representados por la siguiente fórmula general en secuencias de oligonucleótidos. El compuesto es útil para introducir funcionalidades adicionales en la posición 2’-O de oligonucleótidos.
10 La BASE DE DATOS CAPLUS (en línea), CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE, No. de acceso a la base de datos STN 2001:675264, se refiere a un procedimiento para sintetizar una ribonucleasa artificial que tiene funcionalidades adicionales usando el compuesto intermediario representado por la siguiente fórmula general.
La publicación HELVETICA CHIMICA ACTA, 81 (8), 1545-1566, divulga compuestos de acetal representados por las 15 siguientes fórmulas generales.
Los compuestos se sustituyen por metilo en el átomo de carbono que se une al 2’-hidroxilo.
El documento JP-A-3 074 398 se refiere a un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general útil para sintetizar oligonucleótidos. El compuesto de fosforamidita se sustituye por metilo en el átomo de 20 carbono que se une al 2’-hidroxilo.
El documento JP-A-7 502 037 en la BASE DE DATOS DE CHEMICAL ABSTRACTS (en línea), No. de acceso de la base de datos (4063g-i), no divulga que los compuestos de JP-A-7 502 037 en la BASE DE DATOS DE CHEMICAL ABSTRACTS (en línea), No. de acceso de base de datos (4063g-i) son útiles como un reactivo para producir el compuesto de fosforamidita (1) de la presente invención.
5 El documento JP-A-7 502 037 (Estados Unidos 5.504.263) se refiere a un proceso para la producción de hidrofluorocarburos de a-fluoroéteres, tales como FCH2OCH2CH2F, y un proceso para la producción de
a fluoroéteres y novedosos a-fluoroéteres adecuados para el uso en la producción de hidrofluorocarburos.
El documento JP 62 116 533 A (Estados Unidos 4.629.814) se refiere a un proceso mejorado para la preparación de ciertos éteres de bis-bromoalquilo, tales como BrCH2OCH2CH2Br.
10 El documento JP 49 126 825 A (Estados Unidos 3.956.500) se refiere a una novedosa 1,3-oxatiolano y 1,4 oxatiano carbamoiloxima representada por la siguiente fórmula.
El documento US-A-4.925.856 se refiere a una sal de aldoxima útil en el tratamiento de envenenamiento por ciertos productos químicos que contienen fósforo.
La publicación J. ORG. CHEM., vol. 46, No. 3, 1981, páginas 571-577, se refiere a una preparación, un estudio estructural de resonancia magnética y una capacidad alquilante con respecto a iones de (haloalquil)oxonio y (haloalquil)carboxonio.
La publicación TET LETTERS vol. 26, 1973, páginas 2407-2408, se refiere a una reactividad con respecto a 20 vinilcuprato.
La BASE DE DATOS DE CHEMICAL ABSTRACTS (en línea), No. de acceso de la base de datos (4063g-i) se refiere a una preparación de derivados de fluoroetanol, tales como ClCH2OCH2CH2F.
Divulgación de la invención
Problema a solucionar mediante la invención
25 Un objetivo principal de la presente invención es proporcionar un compuesto de fosforamidita novedoso y útil para un procedimiento de síntesis de alto rendimiento para oligo-ARN.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un compuesto de éter novedoso que pueda usarse para acoplar un grupo protector al grupo 2’-hidroxilo de ribosa, en donde el grupo protector puede eliminarse en condiciones neutras.
Luego de estudios intensivos y diligentes, los inventores de la presente invención encontraron un compuesto que podría lograr los objetivos anteriores y, por lo tanto, se completó la presente invención.
I. Un compuesto de fosforamidita de la presente invención
La presente invención puede incluir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1) 35 (a la que se hace referencia de aquí en adelante como “compuesto de fosforamidita de la presente invención”).
[Quím. 1]
en donde:
Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector;
R1 es un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),
[Quím. 2]
R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi.
R2a
y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo, o R2a y R2b, junto con el átomo de nitrógeno
10 adyacente, pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente; y WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno y WG2 representa un grupo de extracción de electrones.
Los ejemplos de la “nucleobase” Bx no se limitan particularmente en la medida que es una nucleobase usada en la
15 síntesis de un ácido nucleico y puede incluir, por ejemplo, adenina, guanina, citosina, uracilo o una forma modificada de los mismos.
Una “forma modificada” de una nucleobase significa un compuesto en el cual una nucleobase tiene uno o más sustituyentes arbitrarios.
Los ejemplos del “sustituyente” para la “forma modificada” de Bx pueden incluir halógeno, acilo, alquilo, arilalquilo,
20 alcoxi, alcoxialquilo, hidroxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, carboxi, ciano y nitro. La forma modificada de Bx puede sustituirse por 1 a 3 de estos sustituyentes.
La nucleobase Bx puede estar protegida. Particularmente, es preferible que se proteja el grupo amino de una nucleobase que tiene un grupo amino, tal como adenina, guanina y citosina.
El grupo protector del grupo amino no se limita particularmente en la medida que es un grupo protector usado como
25 un grupo protector de un ácido nucleico y puede incluir, por ejemplo, benzoilo, 4-metoxibenzoilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, fenilacetilo, fenoxiacetilo, 4-terc-butilfenoxiacetilo, 4-isopropilfenoxiacetilo y (dimetilamino)metileno.
Los ejemplos del “grupo cíclico amino saturado” de R2 pueden incluir pirrolidina-1-ilo, piperidina-1-ilo, morfolina-1-ilo y tiomorfolina-1-ilo.
30 Los grupos de extracción de electrones WG1 y WG2 pueden incluir ciano, nitro, alquilsulfonilo y halógeno. Entre ellos, es preferible el ciano.
Los ejemplos del “halógeno” del compuesto de fosforamidita de la presente invención pueden incluir flúor, cloro, bromo y yodo.
Los ejemplos del “acilo” del compuesto de fosforamidita de la presente invención pueden incluir un alcanoilo recto o
35 ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y un aroilo que tiene de 7 a 13 átomos de carbono. Específicamente, el acilo puede incluir, por ejemplo, formilo, acetilo, n-propionilo, isopropionilo, n-butirilo, isobutirilo, terc-butirilo, valerilo, hexanoilo, benzoilo, naftoilo y levulinilo.
Los ejemplos del “alquilo” del compuesto de fosforamidita de la presente invención pueden incluir un alquilo recto o ramificado que tiene de 1 a 5 átomos de carbono. Específicamente, el alquilo puede incluir, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo y terc-pentilo. El alquilo puede sustituirse y ejemplos del “sustituyente” pueden incluir halógeno, alquilo, alcoxi, ciano y nitro. El alquilo puede sustituirse por 1 a 3 de estos sustituyentes.
Los ejemplos del resto “alquilo” del "arilalquilo", "alcoxialquilo", "monoalquilamino", "dialquilamino" y "alquilsulfonilo" del compuesto de fosforamidita de la presente invención puede incluir los mismos grupos alquilo mencionados anteriormente.
Los ejemplos del “alcoxi” del compuesto de fosforamidita de la presente invención pueden incluir un alcoxi recto o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Específicamente, el alcoxi puede incluir, por ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, sec-butoxi y terc-butoxi. Entre estos, son preferibles los grupos alcoxi que tienen de 1 a 3 átomos de carbono, y el metoxi es más preferible.
Los ejemplos del resto “alcoxi” del "alcoxialquilo" del compuesto de fosforamidita de la presente invención pueden incluir los mismos grupos de alcoxi mencionados anteriormente.
Los ejemplos del resto “arilo” del “arilalquilo” del compuesto de fosforamidita de la presente invención pueden incluir grupos arilo que tienen de 6 a 12 átomos de carbono.
Específicamente, el arilo puede incluir, por ejemplo, fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo y bifenilo. El arilo puede sustituirse y ejemplos del “sustituyente” pueden incluir halógeno, alquilo, alcoxi, ciano y nitro. El arilo puede sustituirse por 1 a 3 de estos sustituyentes.
Los ejemplos del “halógeno”, “alquilo” y “alcoxi”, que son sustituyentes del alquilo o arilo del compuesto de fosforamidita de la presente invención, pueden incluir, respectivamente, los mismos grupos mencionados anteriormente.
El compuesto de fosforamidita de la presente invención puede usarse como un reactivo para producir oligo-ARN.
El compuesto de fosforamidita de la presente invención es un compuesto de fosforamidita que tiene un grupo protector de tipo de éter en la posición 2’-hidroxilo, que puede eliminarse en condiciones neutras. Además, el compuesto de fosforamidita de la presente invención se caracteriza por el hecho de que la reacción de condensación se lleva a cabo en un tiempo menor y resulta en un rendimiento mejor durante la síntesis del oligo-ARN cuando se lo compara con un compuesto de fosforamidita convencional. Esto se debe a que el grupo protector de tipo de éter introducido en el grupo 2’-hidroxilo es un grupo protector lineal y, por lo tanto, no completa estéricamente el espacio alrededor del átomo de fósforo unido al grupo 3’-hidroxilo. El compuesto de fosforamidita de la presente invención hace posible producir oligo-ARN de alta pureza esencialmente mediante el mismo procedimiento usado en la producción de oligo-ADN.
En el presente documento, el término “oligo-ADN” significa un ácido oligonucleico que tiene sólo desoxirribonucleótidos. Además, en el presente documento, el término “oligo-ARN” significa un ácido oligonucleico que contiene al menos un ribonucleótido y que también puede tener uno o más desoxirribonucleótidos.
Los ejemplos específicos del compuesto de fosforamidita de la presente invención pueden incluir los siguientes compuestos 1 a 5:
- 1.
- N6-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina-3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita)
- 2.
- N2-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina-3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita)
- 3.
- N2-fenoxiacetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina-3'-O-(2-cianoetil-N,Ndiisopropilfosforamidita)
- 4.
- N4-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)citidina-3’-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita)
- 5.
- 5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)uridina-3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita)
Breve descripción de los dibujos
FIGURA 1
La FIGURA 1 muestra un cromatograma obtenido por análisis por HPLC de fase inversa.
En la figura, el eje vertical indica el tiempo (minutos) y el eje horizontal indica la absorbancia óptica.
Mejor forma de llevar a cabo la invención
II. Procedimiento para producir el compuesto de fosforamidita de la presente invención El compuesto de fosforamidita de la presente invención puede producirse como se describe a continuación.
En el siguiente procedimiento de producción es común, cuando las materias primas tienen un sustituyente que afecta la reacción (por ejemplo hidroxilo, amino y carboxi), que las materias primas se usen para la reacción luego de protegerse con un grupo protector adecuado de acuerdo con un procedimiento conocido.
5 Luego de que la reacción se completa, el grupo protector puede eliminarse mediante un procedimiento conocido, tal como una reacción catalítica, tratamiento alcalino, tratamiento ácido o similares. El compuesto de fosforamidita de la presente invención puede producirse a partir de un compuesto conocido o un intermediario que puede producirse fácilmente, por ejemplo, a través de las siguientes etapas a a h.
El procedimiento para producir el compuesto de fosforamidita de la presente invención se describe en detalle a 10 continuación.
(1) Etapa a:
Proceso para producir un derivado de nucleósido representado por las siguientes fórmulas generales (15) y (15’), en donde un grupo protector de tipo de éter que puede eliminarse en condiciones neutras se introduce en el grupo 2’hidroxilo permitiendo que un reactivo de alquilación actúe en un derivado de nucleósido representado por la
15 siguiente fórmula general (14).
[Quím. 3]
en donde:
Bx, R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente.
20 Ejemplos del “reactivo alquilante” pueden incluir un compuesto de éter representado por la siguiente fórmula general (13). [Quím. 4]
en donde: 25 L representa halógeno y WG1 representa ciano o cuando L es un grupo aril C6-C12 tio, un grupo alquil C1-C5 sulfóxido
o un grupo alquil C1-C5 tio, WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno.
Ejemplos del “halógeno”, el resto “arilo” del “grupo ariltio” y los restos “alquilo” del “grupo alquilsulfóxido” y el “grupo alquiltio” de L pueden incluir los mismos halógeno, arilo y alquilo, respectivamente, que aquellos del compuesto de fosforamidita de la presente invención.
30 Ejemplos específicos del compuesto de éter (13) pueden incluir los siguientes compuestos 1 y 2:
- 1.
- Clorometil 2-cianoetiléter
- 2.
- 2-Cianoetilmetiltiometiléter El compuesto de éter (13) es un nuevo reactivo alquilante que puede introducir un sustituyente de tipo de éter, que puede eliminarse en condiciones neutras, en la posición 2’-hidroxilo en condiciones básicas, y que es útil como un
35 reactivo para producir el compuesto de fosforamidita de la presente invención. El compuesto de éter (13) puede producirse mediante las siguientes etapas 1 a 4. Etapa 1: Proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (24) alquiltiometilando un
compuesto de alcohol representado por la siguiente fórmula general (20).
[Quím. 5]
en donde:
WG1 es el mismo que se definió anteriormente; y
5 R3 representa alquilo o arilo.
El compuesto (24) es el compuesto de éter (13) en donde L es un grupo alquiltio.
Ejemplos del “alquilo” de R3 pueden incluir el mismo alquilo que el del compuesto de fosforamidita de la presente invención.
Cuando R3 es metilo, ejemplos del “reactivo alquiltiometilante” pueden incluir un disolvente mezclado que contiene
10 dimetilsulfóxido, anhídrido acético y ácido acético. La cantidad de dimetisulfóxido a usarse puede estar en el rango de 10 a 200 moles por mol de compuesto (20), y preferiblemente 20 a 100 moles por mol de compuesto. La cantidad de ácido acético a usarse puede estar en el rango de 10 a 150 moles por mol de compuesto (20), y preferiblemente 20 a 100 moles por mol de compuesto. La cantidad de anhídrido acético a usarse puede estar en el rango de 10 a 150 moles por mol de compuesto (20), y preferiblemente 20 a 100 moles por mol de compuesto. La temperatura de
15 reacción está preferiblemente en el rango de 0ºC a 100ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de materias primas y la temperatura de reacción y se ubica preferiblemente entre 1 y 48 horas.
Etapa 2:
Proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (25) halogenando el compuesto (24).
20 [Quím. 6]
en donde:
WG1 y R3 son los mismos que se definieron anteriormente; y
X2 representa el halógeno
25 El compuesto (25) es un compuesto en donde L del compuesto de éter (13) es un halógeno. Ejemplos del “halógeno” de X2 pueden incluir el mismo halógeno que el del compuesto de fosforamidita de la
presente invención. La etapa puede realizarse mediante un procedimiento conocido (T. Benneche et al., Synthesis
762 (1983)).
El disolvente a usarse no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo,
30 un hidrocarburo halogenado tal como diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono y 1,2-dicloroetano. Ejemplos del “agente de halogenación” pueden incluir cloruro de sulfurilo y oxicloruro de fósforo. La cantidad de agente de halogenación a usarse puede estar adecuadamente en el rango de 1 a 20 moles por mol
de compuesto (24), y preferiblemente 1 a 10 moles por mol de compuesto. La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de 0ºC a 100ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de materias primas y 35 la temperatura de reacción y se ubica preferiblemente entre 30 minutos y 24 horas.
Etapa 3:
Proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (25a) ariltiolando el compuesto
(25).[Quím. 7]
en donde:
WG1 y X2 son los mismos que se definieron anteriormente; y
R3a representa arilo.
5 El compuesto (25a) es un compuesto de la clase de compuestos de éter (13) en donde L es un grupo ariltio. Ejemplos del “arilo” R3a pueden incluir el mismo arilo que el del compuesto de fosforamidita de la presente invención. La etapa puede llevarse a cabo por un procedimiento conocido. El disolvente a usarse no se limita específicamente
salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, diclorometano y acetonitrilo. Ejemplos del “reactivo ariltiolante” pueden incluir tiofenol y 4-metil bencenotiol. La cantidad de reactivo de ariltiolación a usarse puede estar
10 adecuadamente en el rango de 1 a 20 moles por mol de compuesto (25), y preferiblemente 1 a 5 moles por mol de compuesto. La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de 0ºC a 100ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de materias primas y la temperatura de reacción y se ubica preferiblemente entre 1 y 48 horas.
Etapa 4:
15 Proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (24a) oxidando el compuesto (24). [Quím. 8]
En donde:
20 WG1 y R3 son los mismos que se definieron anteriormente.
El compuesto (24a) es un compuesto de la clase de compuestos de éter (13) en donde L es un grupo alquilsulfóxido.
Ejemplos del “alquilo” de R3 pueden incluir el mismo alquilo que el del compuesto de fosforamidita de la presente invención.
La etapa puede llevarse a cabo por un procedimiento conocido. El disolvente a usarse no se limita específicamente 25 salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, diclorometano, cloroformo y metanol.
Ejemplos del "agente oxidante" pueden incluir ácido metacloroperbenzoico, sal de metaperyodato y peróxido de hidrógeno. La cantidad de reactivo de oxidación a usarse puede estar adecuadamente en el rango de 1 a 10 moles por mol de compuesto (24), y preferiblemente 1 a 2 moles por mol de compuesto. La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de 0ºC a 100ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de materias primas y
30 la temperatura de reacción y se ubica preferiblemente entre 1 y 48 horas.
Cuando el compuesto (25) se usa como el reactivo alquilante, la etapa puede llevarse a cabo como se describe a continuación.
La etapa puede realizarse haciendo reaccionar el reactivo alquilante y una base con el compuesto (14), que está comercialmente disponible o se sintetiza de acuerdo con un procedimiento conocido.
35 El disolvente a usarse no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, un hidrocarburo halogenado tal como diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono y 1,2-dicloroetano. La cantidad de reactivo de alquilación a usarse puede estar adecuadamente en el rango de 1 a 20 moles por mol de compuesto (14), y preferiblemente 1 a 10 moles por mol de compuesto. En la etapa, por medio del intermediario producido haciendo reaccionar un reactivo de metal y una base con el compuesto (14), puede hacerse reaccionar el
40 reactivo de alquilación si es necesario. Ejemplos del “reactivo de metal” pueden incluir dicloruro de dibutilestanilo. La cantidad de reactivo de metal a usarse puede estar adecuadamente en el rango de 1 a 20 moles por mol de compuesto (14), y preferiblemente 1 a 10 moles por mol de compuesto. Ejemplos de la “base” pueden incluir una base orgánica tal como piridina, 2,6-dimetilpiridina, 2,4,6-trimetilpiridina, N-metilimidazol, trietilamina, tributilamina, N,N-diisopropiletilamina y 1,8-diazabiciclo[5.4.0]-7-undeceno. La cantidad de base a usarse puede estar adecuadamente en el rango de 1 a 20 moles por mol de compuesto (14), y preferiblemente 1 a 10 moles por mol de compuesto. La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de 0ºC a 120ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de materias primas y la temperatura de reacción y se ubica preferiblemente entre 30
5 minutos y 24 horas.
Cuando el compuesto (24) o (25a) se usa como el reactivo alquilante, la etapa puede llevarse a cabo como se describe a continuación.
La etapa puede realizarse haciendo reaccionar el reactivo alquilante, un ácido y un reactivo para halogenar el átomo de azufre en el compuesto (14) que está comercialmente disponible o se sintetiza de acuerdo con un procedimiento 10 conocido (por ejemplo, M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385 (1990)). La cantidad de reactivo de alquilación a usarse puede estar adecuadamente en el rango de 1 a 5 moles por mol de compuesto (14), y preferiblemente 1,05 a 3 moles por mol de compuesto. Ejemplos del “ácido” pueden incluir ácido trifluorometanosulfónico, trifluorometanosulfonato de plata y trimetilsilil trifluorometanosulfonato. La cantidad del ácido a usarse puede estar en el rango de 0,01 a 20 moles por mol de compuesto (14), y preferiblemente 0,02 a 10 15 moles por mol de compuesto. El disolvente a usarse no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono, 1,2-dicloroetano, benceno, tolueno, xileno, tetrahidrofurano, acetonitrilo y mezclas de los mismos. Ejemplos del “reactivo para halogenar un átomo de azufre” a usarse en la etapa pueden incluir N-bromosuccinimida (NBS) y N-yodosuccinimida (NIS). La cantidad de reactivo para halogenar un átomo de azufre a usarse puede estar en el rango de 1 a 10 moles por mol de compuesto
20 (14), y preferiblemente 1,05 a 5 moles por mol de compuesto. La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de -7,8ºC a 30ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de materias primas y la temperatura de reacción y se ubica preferiblemente entre 5 minutos y 5 horas.
Cuando el compuesto (24a) se usa como el reactivo alquilante, la etapa puede llevarse a cabo como se describe a continuación.
25 La etapa puede realizarse haciendo reaccionar el reactivo alquilante, un anhídrido ácido y una base con el compuesto (14), que está comercialmente disponible o se sintetiza de acuerdo con un procedimiento conocido. La cantidad de reactivo de alquilación a usarse puede estar adecuadamente en el rango de 1 a 5 moles por mol de compuesto (14), y preferiblemente 1,05 a 3 moles por mol de compuesto. Ejemplos del “anhídrido ácido” pueden incluir anhídrido trifluorometanosulfónico y anhídrido acético. La cantidad de anhídrido ácido a usarse puede estar en
30 el rango de 0,01 a 20 moles por mol de compuesto (14), y preferiblemente 0,02 a 10 moles por mol de compuesto. Ejemplos de la “base” pueden incluir tetrametilurea y colidina. La cantidad de la base a usarse puede estar en el rango de 0,01 a 20 moles por mol de compuesto (14), y preferiblemente 0,02 a 10 moles por mol de compuesto. El disolvente a usarse no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono, 1,2-dicloroetano y mezclas de los mismos. La temperatura de
35 reacción está preferiblemente en el rango de -78ºC a 30ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de los materiales y la temperatura de reacción, y preferiblemente está entre 5 minutos y 24 horas.
(2) Etapa b:
Proceso para aislar y purificar el derivado de nucleósido (15) producido mediante la etapa (a);
En la etapa, el derivado de nucleósido puede aislarse y purificarse de la mezcla producida mediante la etapa (a)
40 usando una técnica de separación y purificación estándar tal como cromatografía de capa fina, cromatografía en columna de gel de sílice o similares.
(3) Etapa c:
Proceso que se realiza separadamente de la etapa b, para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general (17), en donde un grupo protector de tipo de éter que puede eliminarse
45 en condiciones neutras se introduce en el grupo 2’-hidroxilo permitiendo que un reactivo de alquilación actúe en un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general (16).
[Quím. 9]
en donde: 50 Bx y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente; y A representa un sustituyente de silicio representado por las siguientes fórmulas generales (18a) o (18b).
[Quím. 10]
En donde:
R6 representa alquilo.
Ejemplos del “alquilo” de R6 pueden incluir el mismo alquilo que el del compuesto de fosforamidita de la presente invención.
Ejemplos del “reactivo alquilante” pueden incluir los mismos artículos que se mencionaron anteriormente.
Cuando el compuesto (25) se usa como el reactivo alquilante, la etapa puede llevarse a cabo como se describe a continuación.
La etapa puede realizarse haciendo reaccionar el reactivo alquilante y una base con el compuesto (16), que está comercialmente disponible o se sintetiza de acuerdo con un procedimiento conocido. El disolvente a usarse no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, un hidrocarburo halogenado tal como diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono y 1,2-dicloroetano. La cantidad del reactivo alquilante a usarse puede estar en el rango de 1 a 20 moles por mol de compuesto (14), y preferiblemente 1 a 10 moles por mol de compuesto. En la etapa, luego del intermediario producido haciendo reaccionar un reactivo de metal y una base con el compuesto (16), el reactivo alquilante puede hacerse reaccionar si es necesario. Ejemplos del “reactivo de metal” pueden incluir dicloruro de dibutilestanilo y cloruro de t-butil magnesio. La cantidad de reactivo de metal a usarse puede estar adecuadamente en el rango de 1 a 20 moles por mol de compuesto (16), y preferiblemente 1 a 10 moles por mol de compuesto. Ejemplos de la “base” pueden incluir una base orgánica tal como piridina, 2,6dimetilpiridina, 2,4,6-trimetilpiridina, N-metilimidazol, trietilamina, tributilamina, N,N-diisopropiletilamina y 1,8diazabiciclo[5.4.0]-7-undeceno. La cantidad de la base a usarse puede estar en el rango de 1 a 20 moles por mol de compuesto (16), y preferiblemente 1 a 10 moles por mol de compuesto. La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de 0ºC a 120ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de materias primas y la temperatura de reacción y se ubica preferiblemente entre 30 minutos y 24 horas.
Cuando el compuesto (24) o (25a) se usa como el reactivo alquilante, la etapa puede llevarse a cabo como se describe a continuación.
La etapa puede realizarse haciendo reaccionar el reactivo alquilante, un ácido y un reactivo para halogenar el átomo de azufre en el compuesto (16) que está comercialmente disponible o se sintetiza de acuerdo con un procedimiento conocido (por ejemplo M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385 (1990)).
La cantidad del reactivo de alquilación a usarse puede estar adecuadamente en el rango de 1 a 5 moles por mol de compuesto (16), y preferiblemente 1,05 a 3 moles por mol de compuesto. Ejemplos del “ácido” pueden incluir ácido trifluorometanosulfónico, trifluorometanosulfonato de plata y trifluorometanosulfonato de trimetilsililo. La cantidad del ácido a usarse puede estar en el rango de 0,01 a 20 moles por mol de compuesto (16), y preferiblemente 0,02 a 10 moles por mol del compuesto. El disolvente a usarse no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono, 1,2-dicloroetano, benceno, tolueno, xileno, tetrahidrofurano, acetonitrilo y mezclas de los mismos. Ejemplos del “reactivo para halogenar un átomo de azufre” a usarse en la etapa pueden incluir N-bromosuccinimida (NBS) o N-yodosuccinimida (NIS). La cantidad del reactivo para halogenar un átomo de azufre a usarse puede estar en el rango de 1 a 10 moles por mol del compuesto (16) y preferiblemente 1,05 a 5 moles por mol del compuesto. La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de -78ºC a 30ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de materias primas y la temperatura de reacción y se ubica preferiblemente entre 5 minutos y 5 horas.
Cuando el compuesto (24a) se usa como el reactivo alquilante, la etapa puede llevarse a cabo como se describe a continuación.
La etapa puede realizarse haciendo reaccionar el reactivo alquilante, un anhídrido ácido y una base con el compuesto (16), que está comercialmente disponible o se sintetiza de acuerdo con un procedimiento conocido. La cantidad del reactivo alquilante a usarse puede estar adecuadamente en el rango de 1 a 5 moles por mol de compuesto (16), y preferiblemente 1,05 a 3 moles por mol del compuesto. Ejemplos del “anhídrido ácido” pueden incluir anhídrido trifluorometanosulfónico y anhídrido acético. La cantidad de anhídrido ácido a usarse puede estar en el rango de 0,01 a 20 moles por mol de compuesto (16), y preferiblemente 0,02 a 10 moles por mol de compuesto. Ejemplos de la “base” pueden incluir tetrametilurea y colidina. La cantidad de la base a usarse puede estar en el rango de 0,01 a 20 moles por mol de compuesto (16), y preferiblemente 0,02 a 10 moles por mol del compuesto. El disolvente a usarse no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono, 1,2-dicloroetano y mezclas de los mismos. La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de -78ºC a 30ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de los materiales y la temperatura de reacción, y preferiblemente está entre 5 minutos y 24 horas.
(4) Etapa d:
Proceso que se realiza separadamente de las etapas a a c para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general (19) permitiendo que dimetilsulfóxido, ácido acético y anhídrido acético actúen en el compuesto de ácido ribonucleico (16).
[Quím. 11]
10 En donde:
A y Bx son los mismos que se definieron anteriormente.
La etapa puede realizarse haciendo reaccionar el reactivo dimetilsulfóxido, ácido acético y anhídrido acético con compuesto (14), que está comercialmente disponible o se sintetiza de acuerdo con un procedimiento conocido.
La cantidad de dimetilsulfóxido a usarse puede estar en el rango de 10 a 200 moles por mol de compuesto (16), y 15 preferiblemente de 20 a 100 veces de moles por mol del compuesto.
La cantidad de ácido acético a usarse puede estar en el rango de 10 a 150 moles por mol de compuesto (16), y preferiblemente 20 a 100 moles por mol del compuesto. La cantidad de anhídrido acético a usarse puede estar en el rango de 10 a 150 moles por mol de compuesto (16), y preferiblemente 20 a 100 moles por mol del compuesto. Es preferible que la temperatura de reacción esté en el rango de 10ºC a 50ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo
20 del tipo de materias primas y la temperatura de reacción, y preferiblemente está entre 30 minutos y 24 horas.
(5) Etapa e:
Proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general (17), en donde un grupo protector de tipo de éter que puede eliminarse en condiciones neutras se introduce en el grupo 2’hidroxilo, permitiendo un compuesto de alcohol representado por la siguiente fórmula general (20), un ácido y un
25 reactivo para halogenar un átomo de azufre para actuar como un derivado de nucleósido (19) producido mediante la etapa d.
[Quím. 12]
En donde:
30 A, Bx, y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente.
La etapa puede realizarse haciendo reaccionar el compuesto de alcohol (20), un ácido y un reactivo para halogenar el átomo de azufre en el compuesto de ácido ribonucleico (19) de acuerdo con un procedimiento conocido. El disolvente a usarse no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono, 1,2-dicloroetano, benceno, tolueno, xileno, tetrahidrofurano, 35 acetonitrilo y mezclas de los mismos. La cantidad del compuesto de alcohol (20) a usarse puede estar en el rango de 1 a 20 moles por mol de compuesto (19), y preferiblemente 1 a 10 moles por mol de compuesto. Ejemplos del “ácido” pueden incluir ácido trifluorometanosulfónico, trifluorometanosulfonato de plata y trimetilsilil trifluorometanosulfonato. Ejemplos del “reactivo para halogenar un átomo de azufre” a usarse en la etapa pueden incluir N-bromosuccinimida (NBS) y N-yodosuccinimida (NIS). La cantidad de reactivo para halogenar un átomo de 40 azufre a usarse puede estar en el rango de 0,1 a 20 moles por mol de compuesto (19), y preferiblemente 0,2 a 10 moles por mol del compuesto. La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de -100ºC a 20ºC. El
tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de materias primas y la temperatura de reacción y se ubica preferiblemente entre 5 minutos y 12 horas.
(6) Etapa f:
Proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general (21) eliminando los grupos protectores de los grupos 3’-y 5’-hidroxilo del compuesto de ácido ribonucleico (17) producido mediante la etapa c o la etapa e.
[Quím. 13]
En donde:
10 A, Bx, y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente.
La etapa puede realizarse disolviendo el compuesto (17) en un disolvente orgánico y haciendo reaccionar un agente de fluoración y un ácido como una mezcla de una relación de mezcla arbitraria. Ejemplos del “agente de fluoración” a usarse en la etapa pueden incluir fluoruro de amonio, fluoruro de tetra n-butilamonio (TBAF), trihidrofluoruro de trietilamina, piridina de fluoruro de hidrógeno. La cantidad de reactivo de fluoración a usarse puede estar en el rango
15 de 0,1 a 20 moles por mol de compuesto (17), y preferiblemente 0,2 a 10 moles por mol del compuesto. La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de 0ºC a 120ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de materias primas y la temperatura de reacción y se ubica preferiblemente entre 30 minutos y 24 horas.
(7) Etapa g:
Proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico (15) introduciendo un grupo protector (R1), que puede
20 eliminarse en condiciones ácidas, en el grupo 5’-hidroxilo del compuesto de ácido ribonucleico (21) producido mediante la etapa f.
[Quím. 14]
En donde:
25 A, Bx, R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente; y
X3 representa halógeno.
Ejemplos del “halógeno” de X3 pueden incluir el mismo halógeno que los del compuesto de fosforamidita de la presente invención. La etapa puede realizarse haciendo reaccionar R1X3 con el compuesto (21) de acuerdo con un procedimiento conocido.
30 La cantidad de R1X3 a usarse puede estar adecuadamente en el rango de 1 a 20 moles por mol de compuesto (21), y preferiblemente 1 a 10 moles por mol del compuesto. El disolvente a usarse no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, acetonitrilo y tetrahidrofurano. Ejemplos de la “base” pueden incluir una base orgánica tal como piridina, 2,6-dimetilpiridina, 2,4,6-trimetilpiridina, N-metilimidazol, trietilamina, tributilamina, N,N-diisopropiletilamina y 1,8-diazabiciclo[5.4.0]-7-undeceno. La cantidad de base a usarse puede
35 estar adecuadamente en el rango de 1 a 20 moles por mol de compuesto (21), y preferiblemente 1 a 10 moles por mol del compuesto. La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de 0ºC a 120ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de los materiales y la temperatura de reacción, y preferiblemente está entre 30 minutos y 24 horas.
(8) Etapa h: Proceso para producir el compuesto de fosforamidita de la presente invención fosforamiditando el grupo 3’-hidroxilo permitiendo que un reactivo fosforamiditante y si es necesario un agente activador actúen en un derivado de nucleósido (15) producido mediante la etapa b o la etapa g.
[Quím. 15]
los mismos artículos que aquellos del compuesto de fosforamidita de la presente invención.
Un procedimiento para producir un oligo-ARN (3) con el compuesto de fosforamidita de la presente invención puede realizarse mediante un procedimiento conocido y, por ejemplo, puede realizarse condensando un compuesto de monómero de ácido nucleico en dirección 3’ a 5’ etapa por etapa de acuerdo con las siguientes etapas A a G.
10 Los compuestos y reactivos a usarse en la siguiente etapa excepto el compuesto de fosforamidita de la presente invención no se limitan particularmente en la medida que se usan generalmente en la síntesis de oligo-ARN o oligo-ADN. Además, todas las etapas pueden realizarse usando un sintetizador automático para ADN o en manual como en el caso del uso de agentes convencionales para sintetizar un ácido nucleico. El uso de un sintetizador automático es deseable desde el punto de vista de la simplicidad y facilidad del procedimiento y la precisión de la síntesis. Los
15 compuestos y reactivos descritos en las siguientes etapas A a G excepto un compuesto de monómero de ácido nucleico no se limitan particularmente en la medida que se usan generalmente en la síntesis de oligo-ARN o oligo-ARN.
(1) Etapa A:
Proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (5) eliminando el grupo protector
20 de 5’-hidroxilo de un compuesto representado por la siguiente fórmula general (4) haciéndolo reaccionar con un ácido.
[Quím. 18]
En donde: 25 n, R1 y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente; cada Bx representa independientemente adenina, guanina, citosina, uracilo, timina o una forma modificada de los
mismos; y cada R4 representa independientemente H, aciloxi o un sustituyente representado por la siguiente fórmula
general (6).
[Quím. 19]
En donde:
WG1 es el mismo que se definió anteriormente; y
E representa acilo o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (7). [Quím. 20]
En donde:
Q representa una unión simple o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (8).
[Quím. 21]
En donde:
WG2 es el mismo que se definió anteriormente; y
10 T representa H, aciloxi, un sustituyente representado por la fórmula general anterior (6) o (7), con la condición que E
o T sea un sustituyente (7).
La etapa se realiza haciendo reaccionar un ácido con un compuesto representado por la siguiente fórmula general (26a), (26b) [un compuesto (4) en donde n es 1] que se une al soporte sólido, o un oligo-ARN o un oligo-ADN producido realizando las operaciones de la etapa A a la etapa D [compuesto (4) en donde n es 2 a 100] que se une
15 al soporte sólido (de aquí en adelante denominado el “compuesto unido al soporte sólido”).
[Quím. 22]
En donde:
Bx y R1 son los mismos que se definieron anteriormente;
20 R2L y R4L representan un sustituyente (7);
R2 representa aciloxi; y
R4 representa H, aciloxi o un sustituyente (6).
Ejemplos del resto “acilo” del grupo “aciloxi” de R2 y R4 pueden incluir acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, benzoilo,
4-metoxibenzoilo, fenilacetilo, fenoxiacetilo, 4-terc-butilfenoxiacetilo y 4-isopropilfenoxiacetilo. Ejemplos del “soporte 25 sólido” pueden incluir un vidrio de poro controlado (CPG), un vidrio de poro controlado por oxalilo (ver, por ejemplo,
Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol.19, 1527 (1991)), soporte TentaGel – soporte de derivación de
aminopolietilenglicol (ver, por ejemplo, Wright et al., Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)) y un copolímero de
poliestireno y divinilbenceno Poros. Ejemplos del “ligante” pueden incluir 3-aminopropilo, succinilo, 2,2’-dietanol
sulfonilo y un alquilamino de cadena larga (LCAA). Los compuestos (26a) y (26b) que se unen al soporte sólido se 30 producen de acuerdo con un procedimiento conocido o están disponibles comercialmente, y ejemplos de una
realización preferida son compuestos representados por la siguiente fórmula general (27) o (28).
[Quím. 23] En donde:
Bx, R1, R4 y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente.
Los compuestos (27) y (28) en donde R4 es un sustituyente (6) pueden producirse a partir de un compuesto de 5 fosforamidita de la presente invención de acuerdo con un procedimiento conocido.
Ejemplos del “ácido” a usarse en la etapa pueden incluir ácido trifluoroacético, ácido dicloroacético, ácido tricloroacético. El ácido a usarse en la etapa puede diluirse en un disolvente adecuado para que sea de una concentración de 1 a 5%. El disolvente no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo, agua y mezclas de los mismos. La temperatura de reacción en la
10 reacción está preferiblemente en el rango de 20ºC a 50ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de ácido y la temperatura de reacción, y está preferiblemente entre 1 minuto y 1 hora.
La cantidad del reactivo a usarse está preferiblemente en el rango de 1 a 100 moles por mol de compuesto unido al soporte sólido, y más preferiblemente 1 a 10 moles por mol de compuesto unido al soporte sólido.
(2) Etapa B:
15 Proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (9) condensando un monómero de ácido nucleico con el compuesto producido mediante la etapa A usando un agente activador.
[Quím. 24]
En donde:
20 Bx, E, n, R1,R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente.
La etapa puede realizarse haciendo reaccionar un compuesto de monómero de ácido nucleico y un agente activador con un compuesto unido al soporte sólido. Ejemplos del “compuesto de monómero de ácido nucleico” pueden incluir el compuesto de fosforamidita de la presente invención y un compuesto representado por la siguiente fórmula general (29) que está comercialmente disponible.
25 [Quím. 25] En donde:
R1,R2a, R2b y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente; y
By representa una nucleobase que puede tener un grupo protector.
5 Ejemplos de la “nucleobase” By no se limitan particularmente en la medida que es una nucleobase usada para sintetizar un ácido nucleico y puede incluir, por ejemplo, adenina, guanina, citosina, timina y una forma modificada de los mismos. La forma modificada es la misma que la que se define anteriormente para Bx.
Ejemplos del “sustituyente” para la “forma modificada” de By pueden incluir halógeno, alquilo, arilaquilo, alcoxi, hidroxilo, amino, monoalquilamino, dialquilamino, carboxi, ciano y nitro; y la forma modificada de By puede
10 sustituirse con 1 a 3 de estos sustituyentes. Ejemplos del “halógeno”, “arilo”, “alquilo”, “arilalquilo”, “alcoxi”, “alcoxialquilo”, “amino”, “monoalquilamino” y “dialquilamino” para la “forma modificada” de By pueden incluir los mismos artículos que los del compuesto de fosforamidita de la presente invención.
La nucleobase de By puede protegerse, y especialmente la nucleobase que tiene un grupo amino (por ejemplo adenina, guanina, citosina) puede protegerse preferiblemente del grupo amino. El grupo protector del grupo amino
15 de By puede incluir los mismos artículos que los de Bx.
Ejemplos del “agente activador” pueden incluir los mismos artículos que se mencionaron anteriormente.
El disolvente de reacción no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, acetonitrilo y tetrahidrofurano. La temperatura de reacción en la reacción está preferiblemente en el rango de 20ºC a 50ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de agente activador y la temperatura de reacción, y está
20 preferiblemente entre 1 minuto y 1 hora. La cantidad del agente a usarse está preferiblemente en el rango de 1 a 100 moles por mol de compuesto unido al soporte sólido, y más preferiblemente 1 a 10 moles por mol de compuesto unido al soporte sólido.
(3) Etapa C:
Proceso para proteger el grupo 5’-hidroxilo del compuesto sin reaccionar (5) en la etapa B.[Quím. 26]
25 En donde: Bx, E, n, R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente; y R5 representa metilo o fenoximetilo.
La etapa es una reacción para proteger el grupo 5’-hidroxilo sin reaccionar en la etapa (B), y puede realizarse 30 haciendo reaccionar un agente protector con un compuesto unido al soporte sólido. Ejemplos del “agente protector”
pueden incluir anhídrido acético y anhídrido fenoxiacético.
El agente protector a usarse puede diluirse en un disolvente adecuado para que esté en una concentración de 0,05
a 1M.
El disolvente no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, piridina,
diclorometano, acetonitrilo, tetrahidrofurano y mezclas de los mismos. Además, por ejemplo, pueden usarse 4dimetilaminopiridina, N-metilimidazol como un acelerador de reacción en la etapa si es necesario. La temperatura de reacción en la reacción está preferiblemente en el rango de 20ºC a 50ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de agente protector y la temperatura de reacción, y está preferiblemente entre 1 y 30 minutos. La cantidad del agente a usarse está preferiblemente en el rango de 1 a 100 moles por mol de compuesto unido al soporte sólido, y más preferiblemente 1 a 10 moles por mol de compuesto unido al soporte sólido.
- (4)
- Etapa D:
Proceso para convertir un grupo fósforo en un grupo fosfato haciendo reaccionar un agente oxidante con compuesto
- (9)
- producido en la etapa B.[Quím. 27]
En donde:
Bx, E, n, R1, R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente.
La etapa es una reacción para convertir fósforo trivalente en fósforo pentavalente usando un agente oxidante, y puede realizarse haciendo reaccionar un agente oxidante con un compuesto unido al sólido.
15 Ejemplos del “agente oxidante” pueden incluir yodo y hidroperóxido de terc-butilo.
Además, el agente oxidante a usarse puede diluirse en un disolvente adecuado para que esté en una concentración de 0,05 a 1M. El disolvente no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, piridina, tetrahidrofurano, agua y mezclas de los mismos. Por ejemplo, se puede usar yodo/agua/piridinatetrahidrofurano, yodo/piridina-ácido acético y un agente de peroxidación (t-butilhidroperóxido/cloruro de metileno y
20 similares). La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de 20ºC a 50ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de agente oxidante y la temperatura de reacción, y está preferiblemente entre 1 y 30 minutos. La cantidad del agente a usarse está preferiblemente en el rango de 1 a 100 moles por mol de compuesto unido al soporte sólido, y más preferiblemente 1 a 50 moles por mol de compuesto.
(5) Etapa E:
25 Proceso para escindir el compuesto (11) producido mediante la etapa D a partir del soporte sólido, y luego eliminar los grupos protectores de cada nucleobase y cada grupo 2’-hidroxilo.
[Quím. 28]
30 En donde:
B, Bx, E, R, R1, R4, n, T, WG2 y Z son los mismos que se definieron anteriormente.
La etapa de escisión es una reacción para escindir un oligo-ARN que tiene una longitud de cadena deseada del soporte sólido y un ligante con un agente de escisión y se realiza agregando un agente de escisión al soporte sólido que contiene un oligo-ARN que tiene una longitud de cadena deseada.
En la etapa, puede eliminarse el grupo protector de una nucleobase. Ejemplos del “agente de escisión” pueden 5 incluir amoníaco acuoso concentrado y metilamina. El agente de escisión a usarse en la etapa puede diluirse por, por ejemplo, metanol, etanol, alcohol isopropilo, acetonitrilo, tetrahidrofurano y mezclas de los mismos.
Entre ellos, el etanol es preferible. La temperatura de reacción puede estar en el rango de 15ºC a 75ºC, preferiblemente 15ºC a 30ºC, y más preferiblemente 18ºC a 25ºC. El tiempo de reacción para la desprotección puede estar en el rango de 1 a 30 horas, preferiblemente 1 a 24 horas, y más preferiblemente 1 a 4 horas. La 10 concentración de amonio-hidróxido en la solución a usarse para la desprotección puede ser de 20 a 30% en peso, preferiblemente 25 a 30% en peso, más preferiblemente 28 a 30% en peso. La cantidad del agente a usarse está preferiblemente en el rango de 1 a 100 moles por mol de compuesto unido al soporte sólido, y preferiblemente de 10 a 50 veces de moles por mol de compuesto. La etapa para eliminar el grupo protector del grupo 2’-hidroxilo se realiza haciendo reaccionar el agente para eliminar el grupo protector del grupo 2’-hidroxilo tal como fluoruro de
15 tetrabutilamonio, sal de fluoruro de trihidrógeno/trietilamina. El disolvente a usarse no se limita específicamente salvo que participe en la reacción y puede incluir, por ejemplo, tetrahidrofurano, N-metilpirrolidona, piridina, dimetilsulfóxido y mezclas de los mismos. Si es necesario, alquilamina, amidina, tiol, derivados de tiol o mezclas de estos pueden agregarse como un compuesto que depura el acrilonitrilo que es un producto derivado en la etapa.
Ejemplos de la “alquilamina” pueden incluir una alquilamina recta que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
20 Específicamente, la alquilamina puede incluir, por ejemplo, metilamina, etilamina, n-propilamina, n-butilamina, npentilamina y n-hexilamina. Ejemplos de la “amidina” pueden incluir benzamidina y formamidina. Ejemplos del “tiol” pueden incluir un tiol recto que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
Específicamente, el “tiol” puede incluir, por ejemplo, metanotiol, etanotiol, 1-propanotiol, 1-butantiol, 1-pentanotiol y 1-hexanotiol.
25 Ejemplos del “derivado de tiol” pueden incluir el mismo u otro alcohol y éter y tienen un alquiltiol recto que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Específicamente, el derivado de tiol puede incluir, por ejemplo, 2-mercaptoetanol, 4mercapto-1-butanol, 6-mercapto-1-hexanol, mercaptometil éter, 2-mercaptoetil éter, 3-mercaptopropil éter, 4mercaptobutil éter, 5-mercaptopentilo éter y 6-mercaptohexil éter. La temperatura de reacción está preferiblemente en el rango de 20ºC a 80ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo del agente desprotector a usarse y la
30 temperatura de reacción, y está preferiblemente en el rango de 1 hora a 100 horas. La cantidad del agente a usarse está preferiblemente en el rango de 50 a 500 moles por mol de grupo protector eliminado, y más preferiblemente 50 a 100 moles por mol del grupo protector eliminado. El oligo-ARN protegido en el grupo 5’-hidroxilo puede aislarse y purificarse de la mezcla de reacción anteriormente mencionada usando una técnica de separación y purificación estándar tal como extracción, concentración, neutralización, filtración, centrifugación, recristalización, cromatografía
35 en columna de gel de sílice, cromatografía de capa fina, cromatografía en columna hidrófoba, cromatografía en columna de intercambio de iones, cromatografía en columna de filtración de gel, diálisis, ultrafiltración y similares.
(6) Etapa F:
Proceso para eliminar el grupo protector de 5’-hidroxilo del compuesto (12) producido mediante la etapa E.[Quím. 29]
En donde:
B, n, R, R1 y Z son los mismos que se definieron anteriormente.
La etapa es una reacción para eliminar finalmente el grupo protector del grupo 5’-hidroxilo del oligorribonucleótido y puede realizarse haciendo reaccionar un ácido en el oligo-ARN escindido del soporte sólido. Ejemplos del “ácido” a 45 usarse en la etapa pueden incluir ácido tricloroacético, ácido dicloroacético y ácido acético. El ácido diluido en un disolvente adecuado puede usarse en la etapa. El disolvente no se limita específicamente salvo que participe en la
reacción y puede incluir, por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo, agua, una solución amortiguadora en donde el pH está en el rango de 2 a 5 y mezclas de los mismos. Ejemplos de la “solución amortiguadora” pueden incluir una solución amortiguadora de acetato. La temperatura de reacción en la reacción está preferiblemente en el rango de 20ºC a 50ºC. El tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de ácido y la temperatura de reacción y está
5 preferiblemente entre 1 minuto y 1 hora.
La cantidad del agente a usarse está preferiblemente en el rango de 1 a 100 moles por mol de compuesto unido al soporte sólido, y más preferiblemente 1 a 10 moles por mol de compuesto.
(7) Etapa G:
Proceso para aislar y purificar el compuesto (3) producido mediante la etapa F.
10 La etapa de aislar y purificar es una etapa para aislar y purificar un oligo-ARN de la mezcla de reacción anterior con un procedimiento conocido para aislar y purificar que puede incluir, por ejemplo, extracción, concentración, neutralización, filtración, separación centrífuga, recristalización, cromatografía en columna de fase inversa (C8 a C18), cromatografía en columna (C18 a C18) de cartucho de fase inversa, cromatografía en columna de intercambio de iones, cromatografía en columna de intercambio de aniones, cromatografía en columna de filtración de gel,
15 cromatografía líquida de alto rendimiento, diálisis, ultrafiltración y combinaciones de los mismos. Ejemplos del “eluyente” pueden incluir acetonitrilo, metanol, etanol, alcohol isopropílico, agua y disolvente mezclados en una relación arbitraria. En este caso, por ejemplo, el pH de la solución puede controlarse para que esté en el rango de pH 1 a 9 agregando fosfato de sodio, fosfato de potasio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, acetato de amonio, acetato de trietilamonio, acetato de sodio, acetato de potasio, ácido tris-clorhídrico o ácido etilendiaminotetraacético
20 como un aditivo en una concentración de 1 mM a 2 M.
Un oligo-ARN que tiene una longitud de cadena deseada puede producirse repitiendo las etapas A a D. Además, en el procedimiento, se usa el compuesto (26a) en donde R4 es el sustituyente (6), el compuesto (26a) en donde R4 es H o aciloxi, o el compuesto (26b) en donde R2 es alquiloxi, etc.
Cuando se usa el compuesto (26a) en donde R4 es H o aciloxi o el compuesto (26b) en donde R2 es alquiloxi como
25 un material de partida, es necesario usar uno o más compuestos de fosforamidita de la presente invención como un compuesto de monómero de ácido nucleico.
Además, en el procedimiento, el aislamiento y purificación de un oligo-ARN también se realiza realizando las operaciones de la etapa F antes de realizar las operaciones de la etapa E, las operaciones de la etapa E, y luego las operaciones de la etapa G.
30 Específicamente, la presente invención proporciona lo siguiente:
1. Un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1),
en donde: Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; 35 R1 es un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),
en donde: R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;
R2a
y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo, o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente; y WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno y WG2 representa un grupo de extracción de electrones.
- 2.
- El compuesto de fosforamidita de acuerdo con 1, en donde WG1 es ciano.
- 3.
- Un procedimiento para producir un oligorribonucleótido representado por la siguiente fórmula general (3), caracterizado por usar el compuesto de fosforamidita de acuerdo con la reivindicación 1 o 2,
10 en donde: cada B representa independientemente adenina, guanina, citosina, uracilo, timina o una forma modificada de las mismas; cada R representa independientemente H o hidroxilo y al menos uno de R es hidroxilo; 15 Z representa H o un grupo fosfato; y n representa un número entero en el rango de 1 a 100.
4. El procedimiento para producir el oligorribonucleótido (3) de acuerdo con 3, que comprende las siguientes etapas A a G,
Etapa A: proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (5) eliminando el grupo 20 5’-hidroxilo haciendo reaccionar un ácido con un compuesto representado por la siguiente fórmula general (4),
en donde:
n es el mismo que se definió anteriormente;
cada Bx representa independientemente una nucleobase que puede tener un grupo protector; y 25 R1 es un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),
en donde:
R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;
cada WG2 representa un grupo de extracción de electrones; y
cada R4 representa independientemente H, aciloxi o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general
(6),
en donde: 10 WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno; y E representa acilo o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (7),
en donde
Q representa una unión simple o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (8),
en donde: WG2 es el mismo que se definió anteriormente; y T representa H, aciloxi o el sustituyente representado por la fórmula general anterior (6), con la condición de que
20 ninguno de E o T sea un sustituyente (7).
Etapa B: proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (9) condensando un
compuesto de monómero de ácido nucleico con el compuesto producido en la etapa A usando un agente activador,
en donde:
Bx, E, n, R1, R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente,
Etapa C: proceso para proteger el grupo 5’-hidroxilo del compuesto sin reaccionar (5) en la etapa B,
en donde:
Bx, E, n, R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente; y
R5 representa metilo o fenoximetilo,
10 Etapa D: proceso para convertir un grupo fosforoso en un grupo fosfato haciendo reaccionar un agente oxidante con el compuesto (9) que se produce en la etapa B,
en donde: 15 Bx, E, n, R1, R4,T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente, Etapa E: proceso para escindir el compuesto (11) producido mediante la etapa D a partir del soporte sólido y luego desproteger cada nucleobase y cada grupo 2’-hidroxilo,
en donde:
B, Bx, E, n, R, R1, R4, T, WG2 y Z son los mismos que se definieron anteriormente,
Etapa F: proceso para eliminar el grupo protector de 5’-hidroxilo del compuesto (12) producido mediante la etapa (E),
B, n, R, R1 y Z son como se definieron anteriormente,
Etapa G: proceso para aislar y purificar el oligorribonucleótido (3) producido en la etapa F.
5. Un procedimiento para producir un oligonucleótido representado por la siguiente fórmula general (3), que
10 comprende las siguientes etapas A a D, en donde el compuesto de monómero de ácido nucleico en la etapa B es el compuesto de fosforamidita de acuerdo con 1 o 2,
15 en donde:
cada B representa independientemente adenina, guanina, citosina, uracilo, timina o una forma modificada de los
mismos;
cada R representa independientemente H o hidroxilo y al menos uno de R es hidroxilo;
A representa H o un grupo fosfato; y
20 n representa un número entero en el rango de 1 a 100. Etapa A: proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (5) eliminando el grupo protector de 5’-hidroxilo haciendo reaccionar un ácido en un compuesto representado por la siguiente fórmula general (4),
en donde:
n es el mismo que se definió anteriormente;
cada Bx representa independientemente una nucleobase que puede tener un grupo protector; y R1 es un sustituyente
representado por la siguiente fórmula general (2),
10 en donde:
R11, R 12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;
cada WG2 representa un grupo de extracción de electrones; y
cada R4 representa independientemente H, aciloxi o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general
(6),
en donde:
WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno; y
E representa acilo o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (7),
en donde:
Q representa una unión simple o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (8),
en donde: WG2 es el mismo que se definió anteriormente; y T representa H, aciloxi o el sustituyente representado por la fórmula anterior general (6), con la condición de que E o
5 T sea un sustituyente (7),
Etapa B: proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (9) condensando un
10 en donde:
Bx, E, n, R1, R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente,
Etapa C: proceso para proteger el grupo 5’-hidroxilo del compuesto sin reaccionar (5) en la etapa B,
15 en donde:
Bx, E, n, R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente; y
R5 representa metilo o fenoximetilo,
Etapa D: proceso para convertir un grupo fosforoso en un grupo fosfato haciendo reaccionar un agente oxidante en
el compuesto (9) producido en la etapa B, 20
en donde:
Bx, E, n, R1,R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente.
- 6.
- El procedimiento para producir un oligorribonucleótido de acuerdo con 4 o 5, que se caracteriza por la adición de alquilamina, amidina, tiol, un derivado de tiol o mezclas de los mismos en la etapa E.
- 7.
- Un compuesto de éter representado por la siguiente fórmula general (13),
10 en donde:
cuando L es halógeno, WG1 representa ciano;
cuando L es un grupo aril C6-C12 tio, un grupo alquil sulfóxido C1-C5 o un grupo alquil C1-C5 tio, WG1 representa
ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno.
8. El compuesto de éter de acuerdo con 7, en donde WG1 es ciano.
15 9. Un procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1), comprendiendo el procedimiento las etapas a a c,
en donde: Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; y 20 R1 representa un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),
en donde:
R11, R12 yR13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;
R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno
5 adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente; y
WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno y WG2 representa un grupo de extracción de electrones,
10 Etapa a: proceso para producir un derivado de nucleósido representado por las siguientes fórmulas generales (15) y (15’), en donde un grupo protector de tipo de éter que puede eliminarse en condiciones neutras se introduce en el grupo 2’-hidroxilo, permitiendo que un reactivo alquilante actúe en un derivado de nucleósido representado por la
15 en donde: Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; y R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente, Etapa b: proceso para aislar y purificar el derivado de nucleósido (15) producido mediante la etapa a, 20 Etapa c: proceso para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1) fosforamiditando el grupo 3’-hidroxilo permitiendo que un reactivo fosforamiditante y si es necesario un agente
en donde:
25 Bx, R1 yWG1 son los mismos que se definieron anteriormente;
R2a yR2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo, o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente; y WG2 representa un grupo de extracción de electrones.
30 8. Un procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1), comprendiendo el procedimiento las etapas a2 a d2,
en donde:
Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; y
R1 representa un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),
en donde:
5 R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;
R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente; y WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno y WG2 representa un grupo de
10 extracción de electrones,
Etapa a2: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general (17), en donde un grupo protector de tipo de éter que puede eliminarse en condiciones neutras se introduce en el grupo 2’-hidroxilo, permitiendo que un reactivo alquilante actúe en un compuesto de ácido ribonucleico representado
Bx y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente; y
20 en donde:
R6 representa alquilo,
Etapa b2: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general
(21) eliminando los grupos protectores del grupo hidroxilo 3’ y 5’ del compuesto de ácido ribonucleico (17) producido
en donde:
A, Bx y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente,
Etapa c2: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico (15) introduciendo un grupo protector (R1), que
puede eliminarse en condiciones ácidas, en el grupo hidroxilo 5’ del compuesto de ácido ribonucleico (21) producido en donde:
Bx R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente; y
X3 representa halógeno,
Etapa d2: proceso para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1) fosforamiditando el grupo 3’ hidroxilo permitiendo que un reactivo fosforamiditante y si es necesario un agente activador actúe en un derivado de nucleósido (15) producido mediante la etapa v2,
en donde:
10 Bx R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente;
R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente; y WG2 representa un grupo de extracción de electrones.
10. Un procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1), comprendiendo el procedimiento las etapas a2 a d2,
en donde: Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; y 20 R1 representa un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),
en donde:
R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;
25 R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente; y
WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno y WG2 representa un grupo de extracción de 30 electrones,
Etapa a2: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general
(17) permitiendo que un grupo protector de tipo de éter que puede eliminarse en condiciones neutras se introduzca
en el grupo 2’-hidroxilo, permitiendo que un reactivo alquilante actúe en un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general (16),
en donde:
Bx y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente; y
A representa un sustituyente de silicio representado por la siguiente fórmula general (18a) o (18b),
en donde:
R6 representa alquilo,
15 Etapa b2: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general (21), eliminando los grupos protectores del grupo 3’ y 5’ hidroxilo del compuesto de ácido ribonucleico (17)
20 en donde:
A, Bx y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente,
Etapa c2: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico (15) introduciendo un grupo protector (R1) que puede eliminarse en condiciones ácidas, en el grupo 5’ hidroxilo del compuesto de ácido ribonucleico (21) producido mediante la etapa b2,
en donde: A, Bx y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente, 30 Etapa d3: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico (15) introduciendo un grupo protector (R1) que puede eliminarse en condiciones ácidas, en el grupo 5’ hidroxilo del compuesto de ácido ribonucleico (21) producido
en donde:
Bx, R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente; y
X3 representa halógeno,
Etapa d2: proceso para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1)
fosforamiditando el grupo 3’ hidroxilo permitiendo que un reactivo fosforamiditante y si es necesario un agente
activador actúe en un derivado de nucleósido (15) producido mediante la etapa v2,
10 en donde:
Bx, R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente;
R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de
15 nitrógeno adyacente; y
WG2 representa un grupo de extracción de electrones,
11. Un procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1),
20 en donde:
Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; y
R1 representa un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),
25 en donde:
R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;
R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente forman un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de
30 nitrógeno adyacente; y
WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno y WG2 representa un grupo de extracción de electrones,
Etapa a3: proceso que se realiza de forma separada de las etapas a a c, para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por las siguiente fórmula general (19) permitiendo que el dimetilsulfóxido, ácido acético y anhídrido acético actúen en el compuesto de ácido ribonucleico (16),
en donde:
A y Bx son los mismos que se definieron anteriormente,
Etapa b3: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general
10 (17), en donde un grupo protector de tipo de éter que puede eliminarse en condiciones neutras se introduce en el grupo 2’-hidroxilo, permitiendo que un compuesto de alcohol representado por la siguiente fórmula general (20), un ácido y un agente de halogenación para un átomo de azufre actúe en un derivado de nucleósido (19) producido en la
15 en donde: A, Bx y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente, Etapa c3: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general
(21) eliminando los grupos protectores del grupo 3’ y 5’ hidroxilo del compuesto de ácido ribonucleico (17) producido 20 mediante la etapa b3,
en donde:
25 A, Bx y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente,
Etapa d3: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico (15) introduciendo un grupo protector (R1), que puede eliminarse en condiciones ácidas, en el grupo 3’ y 5’ hidroxilo del compuesto de ácido ribonucleico (21) producido mediante la etapa c3,
en donde:
Bx, R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente; y 35 X3 representa halógeno,
Etapa e3: proceso para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1) fosforamiditando el grupo 3’ hidroxilo permitiendo que un reactivo fosforamiditante y si es necesario un agente activador actúen en un derivado de nucleósido (15) producido mediante la etapa d3,
en donde:
Bx, R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente;
R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno
10 adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros opcionalmente teniendo un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente; y WG2 representa un grupo de extracción de electrones.
12. El procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita de acuerdo con 9 a 11, en donde el reactivo
15 en donde: L representa halógeno, un grupo ariltio, un grupo alquilsulfóxido o un grupo alquiltio; y WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno. 20 13. El procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita de acuerdo con cualquiera de 9 a 12, en donde WG1 es ciano.
14. El procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita de acuerdo con cualquiera de 9 a 13, en donde el
25 en donde:
R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente;
30 WG2 representa un grupo de extracción de electrones; y
X1 representa halógeno.
15. El procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita de acuerdo con cualquiera de 9 a 14, en donde el agente activador es 1H-tetrazol, 5-etiltiotetrazol, 5-bencilmercapto-1H-tetrazol, 4,5-dicloroimidazol, 4-5dicianoimidazol, benzotriazol triflato, pridinio triflato, N-N-diisopropieletilamina o 2,4,6-colidina/N-metilimidazol.
35 16. Un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general (21), en donde:
Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; y WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno.
17. El compuesto de ácido ribonucleico de acuerdo con 16, en donde WG1 es ciano.
en donde:
Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector;
R1 es un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),
en donde:
R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;
y WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno.
19. El compuesto de ácido ribonucleico de acuerdo con 18, en donde WG1 es ciano.
en donde:
Bx representa un nucleobase que puede tener un grupo protector;
en donde:
R6 representa alquilo;
y
WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno.
21. El compuesto de ácido ribonucleico de acuerdo con 20, en donde WG1 es ciano.
EJEMPLOS
La presente invención se describirá ahora más detalladamente con referencia a los ejemplos, a los cuales, sin embargo, la presente invención no se limita. Ejemplo 1 Clorometil 2-cianoetiléter Etapa 1 Producción de metiltiometil 2-cianoetil éter Se disolvió 3-hidroxipropionitrilo (32 g, 450 mmol) en 450 mL de dimetilsulfóxido y se agregaron 324 mL de anhídrido
acético y 231 mL de ácido acético al mismo, y la solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24
horas. Se disolvió bicarbonato de sodio (990 g) en 4,5 L de agua, y la solución de reacción se agregó a la solución de bicarbonato de sodio acuoso por goteo durante 1 hora. La solución de reacción se agitó durante 1 hora y se sometió a la extracción con etil acetato, y el extracto se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, y el disolvente se destiló. El producto aceitoso obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener 41 g de metiltiometil 2-cianoetiléter como un producto aceitoso incoloro (rendimiento 70%).
1H-NMR (CDCl3) : 2,18 (s, 3H); 2,66 (t, 2H, J =6,3 Hz); 3,77 (t, 2H, J =6,3 Hz); 4,69 (s, 2H) Etapa 2 Producción de clorometil 2-cianoetil éter Se disolvió metiltiometil 2-cianoetil éter (3,3 g, 25 mmol) en 70 mL de cloruro de metileno y se agregaron 2 mL de
cloruro de sulfurilo (25 mmol) por goteo, y la reacción se llevó a cabo adicionalmente a temperatura ambiente
durante 1 hora.
Luego de que se completó la reacción, el disolvente se destiló bajo presión reducida para obtener 2,5 g del
compuesto objetivo como un producto aceitoso incoloro (rendimiento 85%).
Punto de ebullición: 84 -85ºC (0,3 Torr)
1H-NMR (CDCl3) 2,72 (t, 2H, J =6, 3 Hz); 3, 92 (t, 2H, J =6,3 Hz); 5,52 (s, 2H)
Ejemplo 2
5'-O-(4,4'-Dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)-uridina 3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita)
Etapa 1
Producción de 5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)-uridina
Se disolvió 5'-O-(4,4'-Dimetoxitritil)uridina (546 mg, 1 mmol) en 4 mL de 1,2 dicloroetano, y 452 mg de
diisopropiletilamina (3,5 mmol) se agregó al mismo, y 365 mg de dibutilestanil dicloruro (1,2 mmol) se agregaron
adicionalmente al mismo. La reacción se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente.
Posteriormente, la reacción se llevó a cabo a 80ºC y se agregaron 155,4 mg de cloromoetil 2-cianoetiléter (1,3 mmol)
por goteo, y la solución de reacción se agitó durante 30 minutos.
Luego de que la reacción se completó, la solución de reacción se agregó en una solución de bicarbonato de sodio
saturado acuoso y se sometió a extracción con cloruro de metileno, y el extracto se secó sobre sulfato de magnesio
anhidro y el disolvente se destiló. La mezcla obtenida se purificó mediante 30 g de cromatografía en columna de gel
de sílice para obtener 5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)-uridina (197 mg; rendimiento 34 %).
1H-NMR (CDCl3): 2, 47 (d, 1H, J =7,8 Hz); 2,69 (t, 2H, J =6,3 Hz); 3,55 (dd, 1H, J = 11, 3, 2, 2 Hz); 3,62 (dd, 1H, J
=11,3, 2,2 Hz); 3, 83 (s, 6H); 3,87 (t, 2H, J =6,3 Hz); 4,07 -4,08 (m, 1H); 4,32 (dd, 1H, J =5,3, 1,9 Hz); 4,54 (q, 1H, J
=5, 3 Hz); 4,94, 5,11 (2d, 2H, J =6,9 Hz); 5,32 (d, 1H, J =8,2 Hz); 6,00 (d, 1H, J =1,9 Hz); 6,85 -6,88 (m, 4H); 7,29 7,41 (m, 9H); 8,02 (d, 1H, J =8,2 Hz); 8,53 (br,s, 1H)
ESI-Masa: 652 [M+Na]+
Etapa 2
Producción de 5'-O-(4,4'-dimeto-xitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)-uridina 3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropil fosforamidita)
Se disolvió 5'-O-(4,4'-Dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)-uridina (209 g, 0,332 mmol) en 2 mL de acetonitrilo obtenido en la etapa 1 y 23 mg de tetrazol (0,332 mmol) y se agregaron 150 mg de 2-cianoetil N,N,N',N'tetraisopropil fosforodiamidita (0,498 mmol) por goteo y la reacción se llevó a cabo a 45ºC durante 1,5 horas.
Luego de que la reacción se completó, la solución de reacción se mezcló con una solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso y se sometió a extracción con etil acetato, y el extracto se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se destiló. La mezcla obtenida se purificó mediante 20 g de cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (200 mg; rendimiento 73 %).
ESI-Masa: 852 [M+Na]+
Ejemplo 3
2'-O-(2-Cianoetoximetil)uridina
Etapa 1
Producción de 3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil) -2'-O-(2-cianoetoximetil)uridina
Se disolvió 3',5'-O-(Tetraisopropildisiloxan-1,3-diil) uridina (150 mg, 0,3 mmol) en 7 mL de tetrahidrofurano bajo una atmósfera de argón, y 54 mg de metiltiometil 2-cianoetiléter (0,4 mmol) y se agregaron 100 mg de tamices moleculares de 4A, y la solución de reacción se agitó durante 10 minutos. La reacción se llevó a cabo a 0ºC y se agregaron 2 mL de una solución de ácido trifluorometanosulfónico (10 mg, 0,06 mmol) en tetrahidrofurano. Luego se agregaron 92 mg de N-yodosuccinimida (0,4 mmol), y la solución de reacción se agitó durante 1 hora. Luego de que se completó la reacción, la solución de reacción se filtró a través de celite y se lavó con cloruro de metilo, y la capa orgánica obtenida se lavó con solución 1 M de tiosulfato de hidrógeno de sodio acuoso. La capa orgánica se lavó con una solución de bicarbonato de sodio acuoso saturado y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, y el disolvente se extrajo por destilación.
El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía de capa fina para obtener 3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3diil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)uridina (150 mg; rendimiento 85 %).
1H-NMR (CDCl3) : 0,97 -1,12 (m, 28H); 2,68 -2, 73 (m, 2H); 3,78 -3,86 (m, 1H); 3,96 -4,05 (m, 2H); 4,12 -4,30 (m, 4H); 5,0 -5,04 (m, 2H); 5,70 (d, 1H, J =8,2 Hz); 5,75 (s, 1H); 7,90 (d, 1H, J =8,2 Hz); 9,62 (br,s, 1H)
ESI-Masa: 570 [M+H]+
Etapa 2
Producción de 2'-O-(2-cianoetoximetil)uridina
Se disolvió 3',5'-O-(Tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)uridina (200 mg, 0,35 mmol) obtenida en la etapa 1 en 2 mL de metanol y se agregaron en el mismo 65 mg de fluoruro de amonio (1,76 mmol) y la solución de reacción se agitó con calentamiento a 50ºC durante 5 horas.
Luego del enfriamiento de aire, se agregó acetonitrilo a la solución de reacción. La solución se agitó y se filtró y se concentró.
El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (108 mg; rendimiento 94 %).
1H-NMR (CD3OD): 2,72 -2,76 (t, 2H, J =6,2 Hz); 3,68 -3,92 (m, 4H); 4,00 -4,03 (m, 1H); 4,26 -4,32 (m, 2H); 4,81 4,95 (m, 2H); 5,71 (d, 1H, J =8,1 Hz); 6,00 (d, 1H, J =3,3 Hz); 8,10 (d, 1H, J =8,1 Hz)
ESI-Masa: 350 [M+Na]+
Ejemplo 4
Producción de 5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil) uridina
Se sometió 2'-O-(2-Cianoetoximetil)uridina (14 g, 43 mmol) a una destilación azeotrópica con piridina y luego se secó con una bomba de vacío durante 30 minutos.
El residuo se disolvió en 300 mL de tetrahidrofurano y 68 g de piridina (856 mmol) y se agregaron 20 g de tamices moleculares de 4A bajo una atmósfera de argón y la mezcla se agitó durante 10 minutos.
A la solución de reacción se agregaron 19,6 g de 4,4'-dimetoxitritilcloruro (57,8 mmol) en 3 porciones cada 1 hora y la mezcla se agitó adicionalmente durante 1 hora.
Luego de que se agregaron 10 mL de metanol y la solución de reacción se agitó durante 2 minutos, la solución de reacción se filtró con celite y se lavó con etil acetato.
Luego de concentrar el filtrado, el residuo se disolvió en etil acetato y se lavó con una solución de bicarbonato de
sodio saturado acuoso.
Luego de que la capa orgánica se lavó con salmuera saturada y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, el
disolvente se destiló.
El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto
objetivo (26,5 g; rendimiento 98 %).
Ejemplo 5
N4-Acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)citidina-3’-O-(2-cianoetil N,N-diisopropil fosforamidita)
Etapa 1
Producción de N4-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)citidina
Se disolvió N4-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-citidina (588 mg, 1 mmol) en 4 mL de 1,2-dicloroetano y se agregaron
452 mg de diisopropiletilamina (3,5 mmol) al mismo y luego se agregaron 365 mg de dibutilestanil dicloruro (1,2
mmol) adicionalmente al mismo. La reacción se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente.
Posteriormente, la reacción se llevó a cabo a 80ºC y se agregaron 155,4 mg de cloromoetil 2-cianoetiléter (1,3 mmol)
por goteo, y la solución de reacción se agitó durante 60 minutos.
Luego de que la reacción se completó, la solución de reacción se agregó en una solución de bicarbonato de sodio
saturado acuoso y se extrajo con cloruro de metileno.
El extracto se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se destiló.
La mezcla obtenida se purificó mediante 30 g de cromatografía en columna de gel de sílice para obtener N4-acetil5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)citidina (219 mg; rendimiento 35 %).
1H-NMR (CDCl3) : 2,19 (s, 3H); 2,56 (d, 1H, J =8,8 Hz); 2,65 (t, 2H, J =6,2 Hz); 3,55 (dd, 1H, J =10,5; 2,5 Hz); 3, 63
(dd, 1H, J =10,5, 2,5 Hz); 3,82 (s, 6H); 3,86 (t, 2H, J =6,2 Hz); 4,09 -4,14 (m, 1H); 4,28 (d, 1H, J =5,1 Hz); 4,44 4,49 (m, 1H); 4,97, 5,24 (2d, 2H, J =6,9 Hz); 5,96 (s, 1H); 6,86 -6,88 (m, 4H); 7,09 (d, 1H, J =6,9 Hz); 7,26 -7,42 (m, 9H); 8,48 (d, 1H, J =6,9 Hz); 8,59 (br,s, 1H)
ESI-Masa: 693 [M+Na]+ Etapa 2 Producción de N4-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)citidina-3'-O-(2-cianoetil-N,N
diisopropilfosforamidita) El N4-Acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil) citidina (205 mg, 0,306mmol) obtenido en la etapa 1 se disolvió en 2 mL de cloruro de metileno y se agregaron 105 mg de diisopropiletilamina (0,812 mmol) y se agregaron
por goteo 116 mg de 2-cianoetil N,N-diisopropil clorofosforamidita (0,49 mmol). La solución de reacción se hizo reaccionar durante 1 h a temperatura ambiente. Luego de que se completó la reacción, el disolvente se destiló y la mezcla obtenida se purificó con 20 g de
cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (242 mg; rendimiento 91 %). ESI-Masa: 871 [M+H]+ Ejemplo 6 N4-Acetil-2'-O-('2-cianoetoximetil)citidina Etapa 1 Producción de N4-acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan -1,3-diil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)citidina Se mezclaron N4-acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)citidina (1,00 g, 1,89 mmol) y metiltiometil 2
cianoetiléter (500 mg, 3,79 mmol) y la mezcla se disolvió en un disolvente mezclado de 10 mL de tolueno y 10 mL de
tetrahidrofurano. Posteriormente, se agregaron 975 mg de trifluorometanosulfonato de plata y se secó agregando tamices moleculares de 4A. Bajo enfriamiento con hielo, se agregaron 370 mg de N-bromosuccinimida (2,08 mmol) y la solución se agitó durante 10 minutos en el recipiente de reacción protegido de la luz.
Además se agregaron 70 mg de N-bromosuccinimida (0,39mmol) y se agitó durante 25 minutos.
Luego de que se completó la reacción, la solución de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se lavó con una solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso. El extracto se secó sobre sulfato de sodio anhidro y el disolvente se destiló. La mezcla obtenida se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener N4acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-2'-O-(2-cianoetoximetil) citidina (936 mg; rendimiento 81 %).
1H-NMR (CDCl3) : 0,90 -1,11 (m, 28H); 2,28 (s, 3H); 2,62 -2,79 (m, 2H); 3, 78 -3,89 (m, 1H); 3, 96 -4,04 (m, 2H); 4,19 -4,23 (m, 3H); 4,30 (d, 1H, J =13,6 Hz); 5,00 (d, 1H, J =6,8 Hz); 5,09 (d, 1H, J =6,8 Hz); 5,77 (s, 1H); 7,44 (d, 1H, J =7,5 Hz); 8,30 (d, 1H, J =7,5 Hz); 10,13 (s, 1H)
ESI-Masa: 611 [M+H]+
Etapa 2
Producción de N4-Acetil-2'-O-('2-cianoetoximetil)citidina
La N4-acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)citidina (500 mg, 0,819 mmol) obtenida en la etapa 1 se disolvió en un disolvente mezclado de 2,5 mL de tetrahidrofurano y 2,5 mL de metanol y se agregaron 150 mg de fluoruro de amonio (4,10 mmol) y luego la solución de reacción se hizo reaccionar a 50ºC durante 4 horas.
Luego de que se completó la reacción, la solución de reacción se diluyó con acetonitrilo y se filtró, y el disolvente se destiló. La mezcla obtenida se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (210 mg; rendimiento 70 %).
1H-NMR (D2O): 2, 13 (s, 3H); 2,66 -2,71 (m, 2H); 3, 72 -3,78 (m, 3H); 3,90 (dd, 1H, J =13,0, 2,6 Hz); 4, 06 -4, 11 (m, 1H); 4,20 (dd, 1H, J =7,1, 5,2 Hz); 4,29 (dd, 1H, J =5,1, 2,9 Hz); 4,83 (d, 1H, J =7,2 Hz); 4,94 (d, 1H, J =7,2 Hz); 5, 95 (d, 1H, J =2,9 Hz); 7,25 (d, 1H, J =7, 6 Hz); 8,25 (d, 1H, J =7,6 Hz)
ESI-Masa: 391 [M+Na]+
Ejemplo 7
Producción de N4-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)citidina
Se sometió 2'-O-(2-cianoetoximetil)citidina (9,9 g, 26,8 mmol) a destilación azeotrópica con piridina y luego se secó con una bomba de vacío durante 30 minutos. El residuo se disolvió en 190 mL de tetrahidrofurano y 43 g de piridina (538 mmol) y se agregaron 20 g de tamices moleculares de 4A bajo una atmósfera de argón y la mezcla se agitó durante 10 minutos.
A la solución de reacción se agregaron 11,8 g de 4,4'-dimetoxitritilcloruro (34,9 mmol) en 3 porciones cada 1 hora y la mezcla se agitó adicionalmente durante 1 hora.
Luego de que se agregaron 2 mL de metanol y la solución de reacción se agitó durante 2 minutos, la solución de reacción se filtró con celite y se lavó con etil acetato.
Luego de concentrar el filtrado con evaporación, el residuo se disolvió en etil acetato y se lavó con una solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso. Luego de que la capa orgánica se lavó con salmuera saturada y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, el disolvente se destiló.
El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (15 g; rendimiento 83 %).
Ejemplo 8
N2-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina-3’-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita)
Etapa 1
Producción de N2-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina
Se disolvió N2-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina (627 ml, 1 mmol) en 4 mL de 1,2 dicloroetano y se agregaron 452 mg de diisopropiletilamina (3,5 mmol) y luego se agregaron 365 mg de dibutilestanil dicloruro (1,2 mmol). Luego la solución de reacción se hizo reaccionar durante 1 h a temperatura ambiente.
Posteriormente, la solución de reacción se calentó hasta 80ºC y se agregaron 155,4 mg de cloromoetil 2cianoetiléter (1,3 mmol) por goteo, y la solución de reacción se agitó durante 60 minutos.
Luego de que la reacción se completó, la solución de reacción se mezcló con una solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso y se sometió a la extracción con cloruro de metileno. El extracto se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se destiló.
La mezcla obtenida se purificó mediante 30 g de cromatografía en columna de gel de sílice para obtener N2-acetil-5'O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina (450 mg; rendimiento 63 %).
1H-NMR (CDCl3) : 1,92 (s, 3H); 2,47 -2,51 (m, 2H); 2,68 (br,s, 1H); 3,30 (dd, 1H, J =10,7, 3,8 Hz); 3,47 (dd, 1H, J =10,7, 3,8 Hz); 3,55 -3,60 (m, 1H); 3,65 -3,70 (m, 1H); 3,74, 3,75 (2s, 6H); 4,22 -4,23 (m, 1H); 4,55 -4,58 (m, 1H); 4,78, 4,83 (2d, 2H, J =7,0 Hz); 5,01 (t, 1H, J =5,1 Hz); 5,99 (d, 1H, J=5,1 Hz); 6,76 -6,79 (m, 4H); 7, 17 -7,44 (m, 9H); 7,88 (s, 1H); 8,36 (br,s, 1H); 12,06 (br,s, 1H)
Etapa 2
Producción de N2-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina-3’-O-(2-cianoetil-N,Ndiisopropilfosforamidita)
La N2-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina (400 mg, 0,563 mmol) obtenido en la etapa 1 se disolvió en 2 mL de cloruro de metileno y se agregaron 181 mg de diisopropiletilamina (1,4 mmol) y se agregaron por goteo 161 mg de 2-cianoetil N,N-diisopropilclorofosforamidita (0,68 mmol). Luego la reacción se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente.
Luego de que se completó la reacción, el disolvente se destiló y la mezcla obtenida se purificó con 20 g de cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (471 mg; rendimiento 92 %).
Ejemplo 9
N6-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina-3’-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita)
Etapa 1
Producción de N6-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina
Se disolvió N6-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)adenosina (22,0 g, 36,0 mmol) en 170 mL de 1,2 dicloroetano y se agregaron 16,3 g de diisopropiletilamina (126 mmol) y luego se agregaron 12,1 g de dibutilestanil dicloruro (39,7 mmol). Luego la reacción se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, la solución de reacción se calentó hasta 80ºC y se agregaron 4,30 g de cloromoetil 2-cianoetiléter (36,0 mmol) por goteo y la solución de reacción se agitó durante 30 minutos.
Luego de que la reacción se completó, la solución de reacción se mezcló con una solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso y se sometió a la extracción con cloruro de metileno.
El extracto se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se destiló. La mezcla obtenida se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener N6-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2cianoetoximetil) adenosina (7,47 g; rendimiento 33 %).
1H-NMR (CDCl3): 2, 51 (t, 2H, J =6,2 Hz); 2, 58 (d, 1H, J =5,5 Hz); 2,61-(s, 3H); 3,45 (dd, 1H, J =10,7, 4,0 Hz); 3,54 (dd, 1H, J =10,7, 3,2 Hz); 3, 62 -3,79 (m, 2H); 3, 79 (s, 6H); 4,25 (br,q, 1H, J =4, 6 Hz); 4, 59 (q, 1H, J =5,2 Hz); 4,87 -4,94 (m, 3H); 6,23 (d, 1H, J =4,4 Hz); 6,80 -6, 83 (m, 4H); 7,22 -7,32 (m, 7H); 7,40 -7,43 (m, 2H); 8,20 (s, 1H); 8,61 (br,s, 1H); 8, 62 (s, 1H)
ESI-Masa: 695 [M+H]+
Etapa 2
Producción de N6-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina-3’-O-(2-cianoetil-N,Ndiisopropilfosforamidita)
El N6-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina (10,0 g, 14,4 mmol) obtenido en la etapa 1 se disolvió en 75 mL de cloruro de metileno y se agregaron 4,7 g de diisopropiletilamina (36 mmol) y se agregaron por goteo 4,82 g de 2-cianoetil N,N-diisopropil clorofosforamidita (20,3 mmol). Luego la reacción se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente.
Luego de que se completó la reacción, el disolvente se destiló y la mezcla obtenida, en la cual permanecieron aproximadamente 30 mL del disolvente, se purificó con cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (12,0 g; rendimiento 93 %). ESI-Masa: 895 [M+H]+
Ejemplo 10
N6-Acetil-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina
Etapa 1 Producción de N6-acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina
En 8 mL de cloruro de metileno se suspendieron 245 mg de N-yodosuccinimida (1,09 mmol) y 280 mg de trifluorometanosulfonato de plata (1,09 mmol), y la solución se secó agregando tamices moleculares de 4A.
A la solución de reacción se le agregó una solución de N6-acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-adenosina (400 mg, 0,73 mmol) y 145 mg de metiltiometil 2-cianoetiléter (1,11 mmol) en 4 mL de cloruro de metileno bajo enfriamiento por hielo, y la mezcla de reacción se agitó durante 3 horas.
Luego de que se completó la reacción, la solución de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se lavó con una solución de tiosulfato de sodio saturado acuoso y solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso. El extracto se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se destiló. La mezcla obtenida se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener N6-acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-2'-O-(2cianoetoximetil)adenosina (201 mg; rendimiento 45 %).
1H-NMR (CDCl3) : 0,98 -1,11 (m, 28H); 2,62 (s, 3H); 2,69 (td, 2H, 6,5, J =1,5 Hz); 3,81 -3,89 (m, 1H); 4,02 -4,09 (m, 2H); 4,17 (d, 1H, J =9,4 Hz); 4,28 (d, 1H, J =13,4 Hz); 4,50 (d, 1H, J =4,5 Hz); 4,67 (dd, 1H, J =8, 8, 4,5 Hz); 5,02 (d, 1H, J =7,0 Hz); 5,08 (d, 1H, J =7,0 Hz); 6,10 (s, 1H); 8,34 (s, 1H); 8,66 (s, 1H); 8,67 (s, 1H)
ESI-Masa: 636 [M+H]+
Etapa 2
Producción de N6-Acetil-2'-O-('2-cianoetoximetil)adenosina
El N6-Acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina (300 mg, 0,47 mmol) obtenido en la etapa 1 se disolvió en un disolvente mezclado de 0,1 mL de ácido acético y 2 mL de 0,5 M de una solución de fluoruro de tetrabutilamonio, y la solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego de que se completó la reacción, la mezcla de reacción obtenida se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (160 mg; rendimiento 86 %).
1H-NMR (DMSO-d6) : 2,25 (s, 3H); 2,53 -2,68 (m, 2H); 3,41 -3,46 (m, 1H); 3, 56 -3,64 (m, 2H); 3,69 -3,73 (m, 1H); 4,00 -4,01 (m, 1H); 4,36 -4,37 (m, 1H); 4,72 -4,78 (m, 3H); 5,20 (bt, 2H); 5,41 (d, 1H, J =5,2 Hz); 6,17 (d, 1H, J =5,7 Hz); 8,66 (s, 1H); 8,72 (s, 1H); 10,72 (s, 1H)
ESI-Masa: 415 [M+Na]+
Ejemplo 11
Producción de N6-acetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina
Se disolvió N6-acetil-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina (9,50 g, 24,2 mmol) en 100 mL de piridina deshidratada y luego se secó por concentración. Luego, el residuo se disolvió en 100 mL de piridina deshidratada bajo una atmósfera de argón.
Bajo enfriamiento con hielo, se agregaron 10,7 g de 4,4'-dimetoxitritil-cloruro (31,2 mmol), y la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora y 20 minutos. Luego de que se completó la reacción, la solución de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se lavó con agua. El extracto se secó sobre sulfato de sodio anhidro y el disolvente se destiló. La mezcla obtenida se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (13,8 g; rendimiento 82 %).
Ejemplo 12
N2-fenoxiacetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina-3’-O-(2-cianoetil-N,Ndiisopropilfosforamidita)
Etapa 1
Producción de N2-fenoxiacetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina
Se disolvió N2-fenoxiacetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina (720 mg, 1 mmol) en 4 mL de 1,2-dicloroetano y se agregaron 452 mg de diisopropiletilamina (3,5 mmol) y luego se agregaron 365 mg de dibutilestanil dicloruro (1,2 mmol). Luego la reacción se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, la reacción se llevó a cabo a 80ºC y se agregaron 155,4 mg de cloromoetil 2-cianoetiléter (1,3 mmol) por goteo y la solución se agitó durante 60 minutos.
Luego de que la reacción se completó, la solución de reacción se mezcló con una solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso y se sometió a la extracción con cloruro de metileno. El extracto se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se destiló. La mezcla obtenida se purificó mediante 30 g de cromatografía en columna de gel de sílice para obtener N2-fenoxiacetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina (384 mg; rendimiento 48 %).
1H-NMR (CDCl3): 2,47 -2,51 (m, 2H); 2,58 (br,s, 1H); 3,42 (dd, 1H, J =10,1, 3,8 Hz); 3,46 (dd, 1H, J =10,1, 3,8 Hz); 3,53 -3,57 (m, 1H); 3,69 -3,73 (m, 1H); 3,77 (s, 6H); 4,24 -4,26 (m, 1H); 4,48 -4,50 (m, 1H); 4,61 -4,65 (m, 2H); 4,83, 4,87 (2d, 2H, J =7,0 Hz); 4,88 (t, 1H, J =5,7 Hz); 6, 0 5 (d, 1H, J =5, 7 Hz); 6,80 -6,82 (m, 4H); 6,92 -6,96 (m, 3H); 7,07 -7,11 (m, 2H); 7,20 -7,42 (m, 9H); 7,84 (s, 1H); 8,99 (s, 1H); 11,81 (br,s, 1H)
ESI-Masa: 825 [M+Na]+,
Etapa 2
Producción de N2-fenoxiacetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina-3’-O-(2-cianoetil-N,Ndiisopropilfosforamidita)
El N2-fenoxiacetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina (320 mg, 0,399 mmol) obtenido en la etapa 1 se disolvió en 4 mL de cloruro de metileno y se agregaron 128,8 mg de diisopropiletilamina (0,996 mmol) y por goteo y se agregaron 141,5 mg de 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamidita (0,598 mmol) por goteo. Luego la reacción se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente.
Luego de que se completó la reacción, el disolvente se destiló y la mezcla obtenida se purificó con 30 g de cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (316 mg; rendimiento 79 %).
ESI-Masa: 1003 [M+H]+
Ejemplo 13
N2-fenoxiacetil-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina
Etapa 1
Producción de N2-fenoxiacetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina
Se disolvió N2-fenoxiacetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)guanosina (2,0 g, 3,0 mmol) en 16 mL de tetrahidrofurano, y 0,99 g de metiltiometil 2-cianoetiléter (7,6 mmol) y se agregó 1,0 g de tamices moleculares de 4A, y la solución de reacción se agitó a -45ºC durante 10 minutos bajo una atmósfera de argón.
Luego se agregó una solución de 0,68 g de ácido trifluorometanosulfónico (4,5 mmol) en 5 mL de tetrahidrofurano y la solución de reacción se agitó, se agregaron 1,02 g de N-yodosuccinimida (4,5 mmol) y la solución de reacción se agitó durante 15 minutos.
Luego se agregó una solución de bicarbonato de sodio acuoso saturado a la solución de reacción y luego la solución de reacción se filtró, la capa orgánica se lavó con solución 1M de tiosulfato de hidrógeno de sodio acuoso.
Adicionalmente, la solución de reacción se lavó con agua y salmuera saturada secuencialmente, y el extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el disolvente de destiló.
El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener N2-fenoxiacetil3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3 -diil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina (2,0 g; rendimiento 89 %).
1H-NMR (CDCl3) : 0,99 -1,11 (m, 28H) : 2, 59 -2,77 (m, 2H); 3,82 -4,05 (m, 3H); 4,15 (d, 1H, J =9,3 Hz); 4,25 -4,35 (m, 2H); 4,52 -4,56 (dd, 1H, J =9,3, 4,3 Hz); 5,00 -5, 07 (2d, 2H, J =7, 2 Hz); 5,95 (s, 1H), 6, 99 -7,12 (m, 3H); 7,35 -7,40 (m, 2H); 8,09 (s, 1H); 9,38 (br, s, 1H); 11, 85 (br,s, 1H)
ESI-Masa: 766 [M+Na]+
Etapa 2
Producción de N2-fenoxiacetil-2'-O-(2-cianoetoximetil)-guanosina
Se preparó una solución que consiste en 0,14 mL de ácido acético (0,14 mmol) y 2,83 mL de fluoruro de tetrabutilamonio 1 M en tetrahidrofurano (2,83 mmol). El N2-fenoxiacetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3 -diil)-2'-O(2-cianoetoximetil)guanosina (1,0 g, 1,35 mmol) obtenido en la etapa 1 se disolvió en 2,83 mL de tetrahidrofurano y se agregó la solución preparada anteriormente, y la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora bajo una atmósfera de argón.
La solución de reacción se concentró bajo presión reducida, y el residuo se disolvió en cloruro de metileno y se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (0,67 g; rendimiento 99%).
1H-NMR (DMSO-d6): 2,59 -2,66 (m, 2H); 3,41 -3,63 (m, 4H); 3,98 (m, 1H); 4,32 (m, 1H); 4,58 -4,62 (t, 1H, J =5,3 Hz); 4,71 -4,78 (dd, 2H, J =13,1, 6,8 Hz); 4,87 (s, 2H); 5,12 (s, 1H) 5,37 (s, 1H); 5,97 (d, 1H, J =6,1 Hz) 6,96 -6,99 (m, 3H); 7,28 -7,34 (m, 2H); 8,30 (s, 1H); 11,78 (br,s, 2H)
ESI-Masa: 500 [M-H]Ejemplo 14
N2-fenoxiacetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina
Se sometió N2-fenoxiacetil-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina (660 mg, 1,32 mmol) a una destilación azeotrópica con piridina y luego se secó con una bomba de vacío durante 30 minutos.
El residuo se disolvió en 9 mL de tetrahidrofurano, y 2,1 g de piridina (26,4 mmol) y se agregaron 600 mg de tamices moleculares de 4A bajo una atmósfera de argón, y la solución de reacción se agitó durante 10 minutos.
A la solución de reacción se agregaron 540 mg de 4,4'-dimetoxitritilcloruro (1,58 mmol) en 3 porciones cada 1 hora, y la solución de reacción se agitó adicionalmente durante 1 hora.
Luego de que se agregaron 2 mL de metanol y la solución de reacción se agitó durante 2 minutos, la solución de reacción se filtró a través de una celite y se lavó con etil acetato.
Luego de concentrar el filtrado con evaporación, el residuo se disolvió en etil acetato y se separó con una solución de bicarbonato de sodio saturado acuoso. Luego de que la capa orgánica se lavó con salmuera saturada y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, el disolvente se destiló.
El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (800 mg; rendimiento 75 %).
Ejemplo 15
N6-acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina
Etapa 1
Producción de N6-acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-2'-O-metiltiometiladenosina
Se disolvió N6-acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-adenosina (2,00 g, 3,62 mmol) en 25 mL de dimetilsulfóxido y se agregaron 17,5 mL de anhídrido acético y 12,5 mL de ácido acético y la solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 14 horas.
Luego de que se completó la reacción, la solución de reacción se agregó a 200 mL de agua, se extrajo con etil acetato y se lavó con solución de bicarbonato de sodio acuoso saturado. El extracto se secó sobre sulfato de sodio anhidro y el disolvente se destiló. La mezcla obtenida se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener N6-acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-2'-O-metiltiometil adenosina (1,36 g; rendimiento 61 %).
1H-NMR (CDCl3) : 0, 96 -1,11 (m, 28H); 2,20 (s, 3H); 2,61 (s, 3H); 4,03 (dd, 1H, J =13,4, 2, 4 Hz); 4, 18 (d, 1H, J =9,1 Hz); 4,27 (d, 1H, J =13,4 Hz); 4,63-4,71 (m, 2H); 5,00 (d, 1H, J =11,5 Hz); 5, 07 (d, 1H, J =11,5 Hz); 6,09 (s, 1H); 8,31 (s, 1H); 8,65 (s, 1H); 8,69 (s, 1H),
ESI-Masa: 635 [M+Na]+
Etapa 2
Producción de N6-acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina
Se disolvió N6-Acetil-3',5'-O-(tetraisopropildisiloxan-1,3-diil)-2'-O-metiltiometil adenosina (1,00 g, 1,63 mmol) obtenida
en la etapa 1 en 25 mL de tetrahidrofurano.
A la solución de reacción se le agregaron 5,88 g de 3-hidroxipropionitrilo (82,7 mmol), y la solución se secó
agregando tamices moleculares de 4A y se enfrió a -45ºC.
A la solución de reacción se le agregaron 440 mg de N-yodosuccinimida (1,96 mmol) y luego 490 mg de ácido trifluorometanosulfónico (3,26 mmol) y la solución de reacción se agitó a -45ºC durante 15 minutos. Luego de que se completó la reacción, la solución de reacción se neutralizó agregando trietilamina mientras se enfriaba y se diluyó con cloruro de metileno. La solución de reacción se lavó con solución de tiosulfato de sodio acuoso y solución de bicarbonato de sodio acuoso saturado, el extracto se secó sobre sulfato de sodio anhidro y el disolvente se destiló.
La mezcla obtenida se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto objetivo (722 mg; rendimiento 71 %)
Ejemplo 16
Uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3-5']-uridililo[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'- 5']-uridililo-[3'-5']-uridililo-[3'-5']-uridina
El oligo-ARN del compuesto del título se sintetizó ingresando un soporte sólido CPG disponible comercialmente (37 mg, 1 µmol) que contiene 2'/3'-O-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil) uridina a una columna con un filtro de vidrio y usando un sintetizador automático para ácido nucleico (Expedite™: Applied Biosystems). Se usó 5'-O-(4,4'Dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)uridina 3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita) como un compuesto de monómero de ácido nucleico, tetrazol como un catalizador de condensación, solución de yodo como un agente oxidante, anhídrido acético y solución de N-metilimidazol como una solución protectora.
Luego de condensar los compuestos de monómero de ácido nucleico 20 veces, el oligo-ARN se escindió haciéndolo reaccionar con 10 M de solución de etanol acuosa de metilamina como un agente de escisión a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas, y los grupos protectores de cada parte de fosfato se eliminaron.
Luego de concentrar la mezcla de reacción bajo presión reducida y eliminar picos indeseables con una columna de fase inversa (ODS), la solución de reacción se purificó con un eluyente (acetonitrilo – 50 mM solución amortiguadora de trietilamina -acetato).
Luego de concentrar el residuo bajo presión reducida, el residuo se hizo reaccionar con una solución 1 M THF de fluoruro de tetrabutilamonio a temperatura ambiente durante 1 hora para eliminar el grupo protector de 2’-hidroxilo.
Luego de desalinizar la solución de reacción, el grupo protector del extremo 5’ se eliminó con 80% de ácido acético (tratamiento a temperatura ambiente durante 10 minutos). Luego de concentrar bajo presión reducida, la capa acuosa se lavó con éter y el compuesto objetivo de alta pureza se obtuvo sin purificar.
MALDI-TOF-MS:
Calculado 6367,52 [M+H]+
Encontrado 6366,50 [M+H]+
Queda claro, a partir del resultado analítico de la HPLC de fase inversa de la Figura 1, que el compuesto obtenido es de alta pureza.
La condición de medición es la siguiente:
Condición de medición:
Dispositivo HPLC
Unidad para aspirar: LC -6A (SHIMADZU CORPORATION)
Detector: SPD-6A (SHIMADZU CORPORATION)
Columna HPLC de fase inversa: Mightysil RP-18GP <4,6 mm <x15 cm> (KANTO KAGAKU)
Temperatura de columna 35ºC
Gradiente de fase móvil: Gradiente lineal, 20 min. (Solución B: 0 % -70 %)
Solución A: 50mM trietilamina – solución amortiguadora de acetato incluyendo 5 % de acetonitrilo
Solución B: 50mM trietilamina – solución amortiguadora de acetato incluyendo 90 % de acetonitrilo
Una tasa de flujo de una fase móvil: 1 ml/min.
Longitud de onda para detección con espectrofotómetro visible ultravioleta: 260 nm
Ejemplo 17
Citidilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']guanilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil[3'-5']-citidilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-uridina
El oligo-ARN del compuesto del título se sintetizó ingresando un soporte sólido CPG disponible comercialmente (37 mg, 1 µmol) que contiene 2'/3'-O-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)uridina a una columna con un filtro de vidrio y usando un sintetizador automático de ácido nucleico (Expedite™: Applied Biosystems). Se usó 5'-O-(4,4'dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)uridina-3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita), N4-acetil-5'-O-(4,4'dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)citidina-3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita), N6-acetil-5'-O-(4,4'dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)adenosina-3’-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita) y N2-fenoxiacetil-5'-O(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-(2-cianoetoximetil)guanosina-3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita) como un compuesto de monómero de ácido nucleico; 5-etiltiotetrazol como un catalizador de condensación; solución de yodo como un agente oxidante; anhídrido fenoxiacético y solución de N-metilimidazol como una solución protectora.
Luego de condensar los compuestos de monómero de ácido nucleico 19 veces, el grupo protector de extremo 5’ se eliminó en fase sólida. Luego, el oligo-ARN se escindió haciendo reaccionar con una mezcla de amoníaco acuosoetanol (3:1) como un agente de escisión a 40ºC durante 4 horas, y los grupos protectores de cada parte de fosfato y base se eliminaron.
Luego de concentrar la mezcla de reacción bajo presión reducida, el residuo se hizo reaccionar con una solución 1 M THF de fluoruro de tetrabutilamonio que contiene 10% de n-propilamina y 0,6% de 2-mercaptoetil éter a temperatura ambiente durante 1 hora para eliminar el grupo protector de 2’-hidroxilo.
Luego de desalinizar la solución de reacción, la solución de reacción se purificó con resina de intercambio de iones
DEAE (TOYOPEARLDEAE-650) para obtener el compuesto objetivo de alta pureza (112 OD260; rendimiento 58 %).
Aquí, la absorbancia de luz ultravioleta en la longitud de onda (OD260) muestra un rendimiento de un compuesto
objetivo.
En adelante, la absorbancia (OD260) significa un rendimiento de un compuesto objetivo.
MALDI-TOF-MS:
Calculado 6305,9 [M+H]+
Encontrado 6304,8 [M+H]+
Ejemplo 18
Adenilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-uridilil[3'-5']-uridilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']adenilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil[3'-5']-guanilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-uridina
El compuesto objetivo se sintetizó de la misma manera que el Ejemplo 17 (92 OD260; rendimiento 31 %).
MALDI-TOF-MS:
Calculado 9519,8 [M+H]+
Encontrado 9520,4 [M+H]+
Ejemplo 19
Uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5'-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']
uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5'-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']uridilil-[3'- 5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3' -5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'- 5']-uridilil-[3'-5']-uridina
El compuesto objetivo se sintetizó de la misma manera que el Ejemplo 17 (254 OD260; rendimiento 65%).
MALDI-TOF-MS:
Calculado 12185,8 [M+H]+
Encontrado 12183,3 [M+H]+
Ejemplo 20
Adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5'-citidilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-guanilil
[3'-5']-adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']guanilil-[3'-5']-uridyly-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-guanilil[3'-5']-uridilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']uridilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']adenilil-[3'-5']-timidina
El compuesto objetivo se sintetizó de la misma manera que el Ejemplo 17 (75 OD260; rendimiento 19 %).
MALDI-TOF-MS:
Calculado 12731,8 [M+H]+
Encontrado 12731,7 [M+H]+
Ejemplo 21
Uridilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-adenilil[3'-5']-adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']guanilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil[3'-5'-guanilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']
5 guanilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-guanilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-adenilil-[3'-5']-citidilil[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-adenilil[3'-5']-adenilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-citidilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-uridilil-[3'-5']-adenilil[3'-5']-timidina
El compuesto objetivo se sintetizó de la misma manera que el Ejemplo 17 (83 OD260; rendimiento 15 %).
Calculado 17476,6 [M+H]+
Encontrado 17474,6 [M+H]+
Aplicabilidad industrial
El compuesto de fosforamidita de la presente invención tiene un grupo protector de tipo de éter que se introduce en
15 el grupo 2’-hidroxilo. El grupo protector de tipo de éter es un grupo protector lineal y la estructura estérica alrededor de un átomo de fósforo unido al grupo 3’-hidroxilo no está llena y, por lo tanto, el compuesto de fosforamidita de la presente invención hace posible realizar una reacción de condensación en un tiempo mucho más corto y obtener un mejor rendimiento de condensación en el proceso de sintetizar un oligo-ARN en comparación con un compuesto de fosforamidita convencional.
20 El uso del compuesto de fosforamidita de la presente invención hace posible producir un oligo-ARN de alta pureza usando esencialmente el mismo procedimiento que en la producción de oligo-ADN.
Claims (14)
- REIVINDICACIONES1. Un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1),en donde: Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; R1 es un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),10 en donde:R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de15 nitrógeno adyacente; yWG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno y WG2 representa un grupo de extracción de electrones.
- 2. El compuesto de fosforamidita de acuerdo con la reivindicación 1, en donde WG1 es ciano.
- 3. Un procedimiento para producir un oligorribonucleótido representado por la siguiente fórmula general (3), 20 caracterizado por usar el compuesto de fosforamidita de acuerdo con la reivindicación 1 o 2,en donde: cada B representa independientemente adenina, guanina, citosina, uracilo, timina o una forma modificada de los25 mismos; cada R representa independientemente H o hidroxilo, y al menos uno de Rs es hidroxilo; Z representa H o un grupo fosfato; y n representa un número entero en el rango de 1 a 100.
- 4. El procedimiento para producir el oligorribonucleótido (3) de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende las siguientes etapas A a G,Etapa A: proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (5) eliminando el grupo 5’-hidroxilo haciendo reaccionar un ácido con un compuesto representado por la siguiente fórmula general (4),en donde:n es el mismo que se definió anteriormente;cada Bx representa independientemente una nucleobase que puede tener un grupo protector; y 10 R1 es un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),en donde: R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi; 15 cada WG2 representa un grupo de extracción de electrones; y cada R4 representa independientemente H, aciloxi o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (6),20 en donde:WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno; yE representa acilo o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (7),25 en donde: Q representa una unión simple o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (8),en donde:WG2 es el mismo que se definió anteriormente; y5 T representa H, aciloxi o el sustituyente representado por la fórmula general anterior (6), con la condición de que ninguno de E o T sea un sustituyente (7). Etapa B: proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (9) condensando uncompuesto de monómero de ácido nucleico con el compuesto producido en la etapa A usando un agente activador,Bx, E, n, R1, R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente,en donde:Bx, E, n, R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente; yR5 representa metilo o fenoximetilo,Etapa D: proceso para convertir un grupo fosforoso en un grupo fosfato haciendo reaccionar un agente oxidante con 20 el compuesto (9) que se produce en la etapa B,en donde: Bx, E, n, R1, R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente, Etapa E: proceso para escindir el compuesto (11) producido mediante la etapa D a partir del soporte sólido y luegodesproteger cada nucleobase y cada grupo 2’-hidroxilo,en donde: B, Bx, E, n, R, R1, R4, T, WG2 y Z son los mismos que se definieron anteriormente, Etapa F: proceso para eliminar el grupo protector de 5’-hidroxilo del compuesto (12) producido mediante la etapa (E),en donde: B, n, R, R1 y Z son como se definieron anteriormente, Etapa G: proceso para aislar y purificar el oligorribonucleótido (3) producido en la etapa F.
- 5. Un procedimiento para producir un oligonucleótido representado por la siguiente fórmula general (3) que15 comprende las siguientes etapas A a D, en donde el compuesto de monómero de ácido nucleico en la etapa B es el compuesto de fosforamidita de acuerdo con la reivindicación 1 o 2,en donde: cada B representa independientemente adenina, guanina, citosina, uracilo, timina o una forma modificada de los5 mismos; cada R representa independientemente H o hidroxilo y al menos uno de R es hidroxilo; Z representa H o un grupo fosfato; y n representa un número entero en el rango de 1 a 100.10 Etapa A: proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (5) eliminando el grupo protector de 5’-hidroxilo haciendo reaccionar un ácido en un compuesto representado por la siguiente fórmula general (4),15 en donde: n es el mismo que se definió anteriormente; cada Bx representa independientemente una nucleobase que puede tener un grupo protector; y R1 es un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),en donde: R11, R 12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi; cada WG2 representa un grupo de extracción de electrones; y25 cada R4 representa independientemente H, aciloxi o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (6),en donde: WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno; y E representa acilo o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (7),en donde: 10 Q representa una unión simple o un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (8),en donde: WG2 es el mismo que se definió anteriormente; y T representa H, aciloxi o el sustituyente representado por la fórmula anterior general (6), con la condición de que E o15 T sea un sustituyente (7), Etapa B: proceso para producir un compuesto representado por la siguiente fórmula general (9) condensando un20 en donde: Bx, E, n, R1, R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente, Etapa C: proceso para proteger el grupo 5’-hidroxilo del compuesto sin reaccionar (5) en la etapa B,en donde: Bx, E, n, R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente; y R5 representa metilo o fenoximetilo, Etapa D: proceso para convertir un grupo fosforoso en un grupo fosfato haciendo reaccionar un agente oxidante enel compuesto (9) producido en la etapa B,10 en donde:Bx, E, n, R1,R4, T y WG2 son los mismos que se definieron anteriormente.
- 6. El procedimiento para producir un oligorribonucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 que se caracteriza por la adición de alquilamina, amidina, tiol, un derivado de tiol o mezclas de los mismos en la etapa E.15 7. Un procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1),en donde: Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; y 20 R1 representa un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),en donde:R11,R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;5 R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente; yWG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno y WG2 representa un grupo de extracción de 10 electrones,Etapa a: proceso para producir un derivado de nucleósido representado por las siguientes fórmulas generales (15) y (15’), en donde un grupo protector de tipo de éter que puede eliminarse en condiciones neutras se introduce en el grupo 2’-hidroxilo, permitiendo que un reactivo alquilante actúe en un derivado de nucleósido representado por laBx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; y R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente, 20 Etapa b: proceso para aislar y purificar el derivado de nucleósido (15) producido mediante la etapa a, Etapa c: proceso para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1) fosforamiditando el grupo 3’-hidroxilo permitiendo que un reactivo fosforamiditante y si es necesario un agente25 en donde:Bx, R1 yWG1 son los mismos que se definieron anteriormente;R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo, o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de30 nitrógeno adyacente; yWG2 representa un grupo de extracción de electrones.
- 8. Un procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1), comprendiendo el procedimiento las etapas a2 a d2,en donde: Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; y R1 representa un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),5 en donde:R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino 10 opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente; yWG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno y WG2 representa un grupo de extracción de electrones,Etapa a2: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general 15 (17), en donde un grupo protector de tipo de éter que puede eliminarse en condiciones neutras se introduce en el grupo 2’-hidroxilo, permitiendo que un reactivo alquilante actúe en un compuesto de ácido ribonucleico representado20 en donde: Bx y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente; yen donde: 25 R6 representa alquilo, Etapa b2: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general(21) eliminando los grupos protectores del grupo hidroxilo 3’ y 5’ del compuesto de ácido ribonucleico (17) producido mediante la etapa a2,en donde:A, Bx y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente,Etapa c2: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico (15) introduciendo un grupo protector (R1), que puede eliminarse en condiciones ácidas, en el grupo hidroxilo 5’ del compuesto de ácido ribonucleico (21) producido mediante la etapa b2,en donde:10 Bx R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente; yX3 representa halógeno,Etapa d2: proceso para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1) fosforamiditando el grupo 3’ hidroxilo permitiendo que un reactivo fosforamiditante y si es necesario un agente activador actúe en un derivado de nucleósido (15) producido mediante la etapa v2,en donde:Bx R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente;R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno20 adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente; yWG2 representa un grupo de extracción de electrones.
- 9. Un procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1), 25en donde:Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; y R1 representa un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),5 en donde:R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi;R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de10 nitrógeno adyacente; yWG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno y WG2 representa un grupo de extracción de electrones,Etapa a3: proceso que se realiza de forma separada de las etapas a a c para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general (19) permitiendo que dimetilsulfóxido, ácido acético yA y Bx son los mismos que se definieron anteriormente,Etapa b3: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general20 (17), en donde un grupo protector de tipo de éter que puede eliminarse en condiciones neutras se introduce en el grupo 2’-hidroxilo, permitiendo que un compuesto de alcohol representado por la siguiente fórmula general (20), un ácido y un agente de halogenación para un átomo de azufre actúen en un derivado de nucleósido (19) producido en25 en donde:A, Bx y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente,Etapa c3: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general(21) eliminando los grupos protectores del grupo 3’ y 5’ hidroxilo del compuesto de ácido ribonucleico (17) producido en la etapa b3,en donde: A, Bx y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente,Etapa d3: proceso para producir un compuesto de ácido ribonucleico (15) introduciendo un grupo protector (R1) que puede eliminarse en condiciones ácidas, en el grupo 5’ hidroxilo del compuesto de ácido ribonucleico (21) producidoBx, R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente; yX3 representa halógeno,Etapa e3: proceso para producir un compuesto de fosforamidita representado por la siguiente fórmula general (1) 10 fosforamiditando el grupo 3’ hidroxilo permitiendo que un reactivo fosforamiditante y si es necesario un agente activador actúe en un derivado de nucleósido (15) producido mediante la etapa d3,15 en donde:Bx, R1 y WG1 son los mismos que se definieron anteriormente;R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de20 nitrógeno adyacente; yWG2 representa un grupo de extracción de electrones.
- 10. El procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 9, en donde el reactivo alquilante es un compuesto de éter representado por la siguiente fórmula general (13),en donde: L representa halógeno, un grupo ariltio, un grupo alquil sulfóxido o un grupo alquiltio; y WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno.30 11. El procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde WG1 es ciano.
- 12. El procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde el reactivo de fosforamidita es un compuesto representado por la siguiente fórmula general (22) o (23),en donde:R2a y R2b son iguales o diferentes y cada uno representa alquilo o R2a y R2b tomados junto con el átomo de nitrógeno adyacente pueden formar un grupo cíclico amino saturado de 5 a 6 miembros, teniendo el grupo cíclico amino 5 opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre como un miembro que compone el anillo además del átomo de nitrógeno adyacente;WG2 representa un grupo de extracción de electrones; yX1 representa halógeno.
- 13. El procedimiento para producir un compuesto de fosforamidita de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones10 7 a 12, en donde el agente activador es 1H-tetrazol, 5-etiltiotetrazol, 5-bencilmercapto-1H-tetrazol, 4,5dicloroimidazol, 4-5-dicianoimidazol, benzotriazol triflato, imidazol triflato, pridinio triflato, N-N-diisopropieletilamina o 2,4,6-colidina/N-metilimidazol.15 en donde:Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; y WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno.
- 15. El compuesto de ácido ribonucleico de acuerdo con la reivindicación 14, en donde WG1 es ciano.Bx representa una nucleobase que puede tener un grupo protector; R1 es un sustituyente representado por la siguiente fórmula general (2),25 en donde: R11, R12 y R13 son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o alcoxi; y WG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno.
-
- 17.
- El compuesto de ácido ribonucleico de acuerdo con la reivindicación 16, en donde WG1 es ciano.
-
- 18.
- Un compuesto de ácido ribonucleico representado por la siguiente fórmula general (17),
en donde: Bx representa un nucleobase que puede tener un grupo protector; A representa un sustituyente de silicio representado por la siguiente fórmula general (18a) o (18b),en donde:R6 representa alquilo;yWG1 representa ciano, nitro, alquil C1-C5 sulfonilo o halógeno. 10 19. El compuesto de ácido ribonucleico de acuerdo con la reivindicación 18, en donde WG1 es ciano.
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