KR20220083704A - 포스포아미다이트 활성화제 - Google Patents

포스포아미다이트 활성화제 Download PDF

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KR20220083704A
KR20220083704A KR1020227012543A KR20227012543A KR20220083704A KR 20220083704 A KR20220083704 A KR 20220083704A KR 1020227012543 A KR1020227012543 A KR 1020227012543A KR 20227012543 A KR20227012543 A KR 20227012543A KR 20220083704 A KR20220083704 A KR 20220083704A
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phosphoramidite
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molar concentration
phosphoramidite activator
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KR1020227012543A
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Inventor
세이호 기쿠치
기미히코 사노
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후지필름 와코 준야쿠 가부시키가이샤
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    • C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12

Abstract

본 발명은, 5-벤질싸이오-1H-테트라졸의 아세토나이트릴에 대한 용해성을 향상시키고, 또한 목적물의 수율·순도를 저하시키지 않는 포스포아미다이트 활성화제의 제공을 과제로 한다. 본 발명은, (i) 피페리딘, 피롤리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물, (ii) 5-벤질싸이오-1H-테트라졸, 및 (iii) 아세토나이트릴을 포함하는 포스포아미다이트 활성화제; 그 활성화제를 이용한 포스포아미다이트의 활성화 방법 및 인산 에스터 또는 싸이오 인산 에스터의 합성 방법에 관한 것이다.

Description

포스포아미다이트 활성화제
본 발명은, 포스포아미다이트 활성화제, 및 그 활성화제를 이용한 포스포아미다이트의 활성화 방법 및 인산 에스터 또는 싸이오 인산 에스터의 합성 방법에 관한 것이다.
데옥시리보 핵산(DNA) 및 리보 핵산(RNA)의 총칭인 핵산은, 구성 단위인 뉴클레오타이드가 인산 에스터 결합(포스포다이에스터 결합)에 의하여 쇄상으로 연결된 구조를 갖는 생체 고분자의 1종이다. 핵산의 화학 합성(인공 합성)은 생화학에 있어서의 중요 기술이며, 고수율·고순도의 핵산 합성 방법의 개발이 요구되고 있다.
핵산 합성은, 통상 (A) 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 탈보호, (B) 커플링 반응, (C) 미반응물의 캡핑, (D) 커플링 생성물의 산화 또는 황화 반응과 같은 일련의 반응 사이클을 반복함으로써 핵산쇄를 신장시켜 행한다. 최근에는, 신속하고 간편하며 자동화도 가능한 "고상(固相) 합성법"이 채용되는 경우가 많다. 또 (B) 커플링 반응에 있어서 포스포아미다이트를 사용하는 "포스포아미다이트법"에서의 핵산 합성이 주류가 되고 있다. 포스포아미다이트법에 있어서의 반응 사이클의 구체예를 이하에 나타낸다.
Figure pct00001
(상기 반응 사이클 중, Ac는, 아세틸기를 나타내고, Base는, 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민 및 유라실로부터 선택되는 핵산 염기를 나타내며, DMTr은, 4,4'-다이메톡시트리틸기를 나타내고, iPr은, 아이소프로필기를 나타내며, A는, tert-뷰틸다이메틸실릴기, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 나타내고, M은, 산소 원자 또는 황 원자를 나타낸다.)
포스포아미다이트법에 있어서 (B) 커플링 반응을 행할 때에는 포스포아미다이트의 활성화제가 필요 불가결하다. 현재까지, 1H-테트라졸을 시작으로 하여, 5-메틸싸이오-1H-테트라졸(MTT), 5-에틸싸이오-1H-테트라졸(ETT), 5-나이트로페닐-1H-테트라졸(NPT), 4,5-다이사이아노이미다졸(DCI) 등, 다양한 포스포아미다이트 활성화제가 개발되고 있으며, 특히 최근에는, 다양한 포스포아미다이트 활성화제 중에서도 5-벤질싸이오-1H-테트라졸(BTT; 5-벤질머캅토-1H-테트라졸(BMT)이라고도 불린다)이 유용한 것으로서 주목받고 있다.
포스포아미다이트법에 의한 핵산 합성에서는, 일반적으로 아세토나이트릴이 용매로서 이용되고 있다. 한편, 상술한 BTT는 아세토나이트릴에 대한 용해성이 나쁘고, 고농도의 BTT-아세토나이트릴 용액에서는 저온하에서 BTT의 결정이 석출되어 버려, 핵산 합성기의 배관을 막히게 할 우려가 있다. 그러므로, 아세토나이트릴 중의 BTT가 비교적 고농도이면 포스포아미다이트를 보다 신속하고 또한 효율적으로 활성화 가능함에도 불구하고, BTT-아세토나이트릴 용액으로서 보존·사용 가능한 농도는 0.25mol/L로 제한되어 있다.
따라서, BTT의 아세토나이트릴에 대한 용해성을 향상시키기 위하여, 특허문헌 1에서는, 공용매(共溶媒)로서 N-알킬이미다졸을 첨가한 포스포아미다이트 활성화제를 개시하고 있다.
특허문헌 1: 일본 공표특허공보 2008-530092호
그러나, 상술한 특허문헌 1에 기재된 포스포아미다이트 활성화제는, N-알킬이미다졸을 첨가함으로써 BTT의 아세토나이트릴에 대한 용해성은 향상되지만, 무첨가의 BTT-아세토나이트릴 용액으로 이루어지는 포스포아미다이트 활성화제를 이용한 경우보다 목적물의 수율·순도가 저하된다는 문제가 있었다.
본 발명은, 이와 같은 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 상술한 바와 같은 문제를 해결하는 우수한 포스포아미다이트 활성화제, 및 그 활성화제를 이용한 포스포아미다이트의 활성화 방법 및 인산 에스터 또는 싸이오 인산 에스터의 합성 방법의 제공을 과제로 한다.
본 발명자들은, 예의 검토의 결과, 피페리딘, 피롤리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 BTT-아세토나이트릴 용액에 첨가함으로써, BTT의 아세토나이트릴에 대한 용해성을 향상시키고, 또한 목적물의 수율·순도를 저하시키지 않는 우수한 포스포아미다이트 활성화제가 얻어지는 것을 알아내, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하의 발명 [i]~[xi]을 내포한다.
[i] (i) 피페리딘, 피롤리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물, (ii) 5-벤질싸이오-1H-테트라졸, 및 (iii) 아세토나이트릴을 포함하는 포스포아미다이트 활성화제(이하, 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제라고 약기하는 경우가 있다.).
[ii] 상기 (i)이 N-알킬피페리딘 또는 N-알킬피롤리딘인, 상기 발명 [i]에 기재된 포스포아미다이트 활성화제.
[iii] 상기 (i)이 N-메틸피페리딘 또는 N-메틸피롤리딘인, 상기 발명 [i] 또는 [ii]에 기재된 포스포아미다이트 활성화제.
[iv] 상기 (ii)의 몰 농도가 0.25mol/L 이상인, 상기 발명 [i] 내지 [iii] 중 어느 하나에 기재된 포스포아미다이트 활성화제.
[v] 상기 (i)의 피페리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 17.0% 이상이고, 상기 (i)의 피롤리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 20.0% 이상이며, 상기 (i)의 N-알킬피페리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 13.7% 이상이고, 또한 상기 (i)의 N-알킬피롤리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 16.0% 이상인, 상기 발명 [i] 내지 [iv] 중 어느 하나에 기재된 포스포아미다이트 활성화제.
[vi] 상기 (i)의 피페리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 17.0% 이상이고, 상기 (i)의 피롤리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 24.0% 이상이며, 또한 상기 (i)의 N-알킬피페리딘 또는 N-알킬피롤리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 19.3% 이상인, 상기 발명 [i] 내지 [v] 중 어느 하나에 기재된 포스포아미다이트 활성화제.
[vii] 포스포아미다이트를, 상기 발명 [i] 내지 [vi] 중 어느 하나에 기재된 포스포아미다이트 활성화제와 반응시키는 공정을 포함하는, 포스포아미다이트의 활성화 방법(이하, 본 발명의 활성화 방법이라고 약기하는 경우가 있다.).
[viii] 상기 포스포아미다이트가 하기 일반식 (I)로 나타나는 화합물인, 상기 발명 [vii]에 기재된 활성화 방법:
Figure pct00002
[일반식 (I) 중, R1은, 하기 관능기군 (I-1)로부터 선택되는 기를 나타내고:
Figure pct00003
(관능기군 (I-1) 중, n1 및 n2는 각각 독립적으로, 1~6의 정수를 나타낸다.),
R2 및 R3은 각각 독립적으로, 탄소수 1~6의 알킬기를 나타내며, R2와 R3이 결합하여 5~7원환의 복소환 구조를 형성하고 있어도 되고, A1은, 뉴클레오사이드를 나타낸다.].
[ix] (1) 상기 발명 [i] 내지 [vi] 중 어느 하나에 기재된 포스포아미다이트 활성화제의 존재하에서, 포스포아미다이트와 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 반응시켜, 아인산 에스터를 생성하는 공정, 및 (2) 상기 아인산 에스터를 산화 또는 황화시켜, 인산 에스터 또는 싸이오 인산 에스터를 생성하는 공정을 포함하는, 인산 에스터 또는 싸이오 인산 에스터의 합성 방법(이하, 본 발명의 합성 방법이라고 약기하는 경우가 있다.).
[x] 상기 포스포아미다이트가 하기 일반식 (I)로 나타나는 화합물이고, 상기 인산 에스터가 하기 일반식 (II-1)로 나타나는 화합물이며, 또한 상기 싸이오 인산 에스터가 하기 일반식 (II-2)로 나타나는 화합물인, 상기 발명 [ix]에 기재된 합성 방법:
Figure pct00004
[일반식 (I), (II-1) 및 (II-2) 중, R1은, 하기 관능기군 (I-1)로부터 선택되는 기를 나타내고:
Figure pct00005
(관능기군 (I-1) 중, n1 및 n2는 각각 독립적으로, 1~6의 정수를 나타낸다.),
R2 및 R3은 각각 독립적으로, 탄소수 1~6의 알킬기를 나타내며, R2와 R3이 결합하여 5~7원환의 복소환 구조를 형성하고 있어도 되고, A1은, 뉴클레오사이드를 나타내며, A2는, 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.].
본 발명의 포스포아미다이트 활성화제를 이용함으로써, 효율적으로 포스포아미다이트를 활성화하여, 높은 수율·순도로 목적물을 얻는 것이 가능해진다.
[본 발명의 포스포아미다이트 활성화제]
본 발명의 포스포아미다이트 활성화제는, (i) 피페리딘, 피롤리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물, (ii) 5-벤질싸이오-1H-테트라졸, 및 (iii) 아세토나이트릴을 포함하는 것이다.
(i)의 N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘에 있어서의 알킬기로서는, 예를 들면 탄소수 1~6의 알킬기를 들 수 있으며, 그중에서도 탄소수 1~3의 것이 바람직하다. 또, 그 알킬기는, 직쇄상, 분기상 및 환상 중 어느 것이어도 되며, 직쇄상 또는 분기상이 바람직하다. 구체적으로는 예를 들면, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 아이소프로필기, n-뷰틸기, 아이소뷰틸기, n-펜틸기, 아이소펜틸기, n-헥실기, 아이소헥실기 등을 들 수 있으며, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 아이소프로필기가 바람직하고, 메틸기가 특히 바람직하다.
(i)의 N-알킬피페리딘으로서는, 구체적으로는 예를 들면, N-메틸피페리딘, N-에틸피페리딘, N-n-프로필피페리딘, N-아이소프로필피페리딘, N-n-뷰틸피페리딘, N-아이소뷰틸피페리딘, N-n-펜틸피페리딘, N-아이소펜틸피페리딘, N-n-헥실피페리딘, N-아이소헥실피페리딘 등을 들 수 있으며, N-메틸피페리딘, N-에틸피페리딘, N-n-프로필피페리딘, N-아이소프로필피페리딘이 바람직하고, N-메틸피페리딘이 특히 바람직하다.
(i)의 N-알킬피롤리딘으로서는, 구체적으로는 예를 들면, N-메틸피롤리딘, N-에틸피롤리딘, N-n-프로필피롤리딘, N-아이소프로필피롤리딘, N-n-뷰틸피롤리딘, N-아이소뷰틸피롤리딘, N-n-펜틸피롤리딘, N-아이소펜틸피롤리딘, N-n-헥실피롤리딘, N-아이소헥실피롤리딘 등을 들 수 있으며, N-메틸피롤리딘, N-에틸피롤리딘, N-n-프로필피롤리딘, N-아이소프로필피롤리딘이 바람직하고, N-메틸피롤리딘이 특히 바람직하다.
(i)은, 피페리딘, 피롤리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘 중, 어느 하나만을 단독으로 포함하고 있어도 되고 2개 이상을 조합하여 포함하고 있어도 된다.
(i)로서는, 피페리딘, 피롤리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물이 바람직하고; 피페리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물이 보다 바람직하며; N-알킬피페리딘 또는 N-알킬피롤리딘이 더 바람직하고; N-메틸피페리딘 또는 N-메틸피롤리딘이 더 바람직하다.
(ii)의 몰 농도의 하한값으로서는, 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제의 전체 용량에 대하여 통상 0.20mol/L 이상이며, 0.25mol/L 이상이 바람직하고, 0.30mol/L 이상이 보다 바람직하다. (ii)의 몰 농도의 상한값으로서는, 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제의 전체 용량에 대하여 통상 1.00mol/L 이하이며, 0.50mol/L 이하가 바람직하고, 0.40mol/L 이하가 보다 바람직하다.
(i)의 피페리딘의 몰 농도의 하한값으로서는, (ii)의 몰 농도에 대하여 17.0% 이상이 바람직하고; 상한값으로서는, (ii)의 몰 농도에 대하여 통상 150% 이하이며, 100% 이하가 바람직하고, 50.0% 이하가 보다 바람직하다.
(i)의 피롤리딘의 몰 농도의 하한값으로서는, (ii)의 몰 농도에 대하여 20.0% 이상이 바람직하고, 24.0% 이상이 보다 바람직하며; 상한값으로서는, (ii)의 몰 농도에 대하여 통상 150% 이하이고, 100% 이하가 바람직하며, 50.0% 이하가 보다 바람직하다.
(i)의 N-알킬피페리딘의 몰 농도의 하한값으로서는, (ii)의 몰 농도에 대하여 13.7% 이상이 바람직하고, 19.3% 이상이 보다 바람직하며; 상한값으로서는, (ii)의 몰 농도에 대하여 통상 150% 이하이고, 100% 이하가 바람직하며, 50.0% 이하가 보다 바람직하다.
(i)의 N-알킬피롤리딘의 몰 농도의 하한값으로서는, (ii)의 몰 농도에 대하여 16.0% 이상이 바람직하고, 19.3% 이상이 보다 바람직하며; 상한값으로서는, (ii)의 몰 농도에 대하여 통상 150% 이하이고, 100% 이하가 바람직하며, 50.0% 이하가 보다 바람직하다.
본 발명의 포스포아미다이트 활성화제로서는, (i) 피페리딘, 피롤리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물, (ii) 5-벤질싸이오-1H-테트라졸, 및 (iii) 아세토나이트릴 이외의 성분을 포함하고 있어도 되지만, 당해 (i), (ii) 및 (iii)만으로 이루어지는 것이 바람직하고; 그중에서도, (i) 피페리딘, 피롤리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, (ii) 0.25mol/L 이상의 5-벤질싸이오-1H-테트라졸, 및 (iii) 아세토나이트릴만으로 이루어지는 것이 보다 바람직하며; (i) 피페리딘, 피롤리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, (ii) 0.25mol/L 이상의 5-벤질싸이오-1H-테트라졸, 및 (iii) 아세토나이트릴만으로 이루어지고, (i)의 피페리딘의 몰 농도가 (ii)의 몰 농도에 대하여 17.0% 이상이며, (i)의 피롤리딘의 몰 농도가 (ii)의 몰 농도에 대하여 20.0% 이상이고, (i)의 N-알킬피페리딘의 몰 농도가 (ii)의 몰 농도에 대하여 13.7% 이상이며, 또한 (i)의 N-알킬피롤리딘의 몰 농도가 (ii)의 몰 농도에 대하여 16.0% 이상인 것이 더 바람직하다. 그중에서도, (i) 피페리딘, 피롤리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, (ii) 0.30mol/L 이상의 5-벤질싸이오-1H-테트라졸, 및 (iii) 아세토나이트릴만으로 이루어지고, (i)의 피페리딘의 몰 농도가 (ii)의 몰 농도에 대하여 17.0% 이상이며, (i)의 피롤리딘의 몰 농도가 (ii)의 몰 농도에 대하여 24.0% 이상이고, 또한 (i)의 N-알킬피페리딘 또는 N-알킬피롤리딘의 몰 농도가 (ii)의 몰 농도에 대하여 19.3% 이상인 것이 보다 더 바람직하며; (i) N-알킬피페리딘 또는 N-알킬피롤리딘, (ii) 0.30mol/L 이상의 5-벤질싸이오-1H-테트라졸, 및 (iii) 아세토나이트릴만으로 이루어지고, (i)의 N-알킬피페리딘 또는 N-알킬피롤리딘의 몰 농도가 (ii)의 몰 농도에 대하여 19.3% 이상인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 포스포아미다이트 활성화제에 있어서의 (i) 피페리딘, 피롤리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘, (ii) 5-벤질싸이오-1H-테트라졸, 및 (iii) 아세토나이트릴은 모두, 시판 중인 것 또는 자체 공지의 방법에 의하여 적절히 합성한 것을 이용하면 된다.
본 발명의 포스포아미다이트 활성화제는, 자체 공지의 방법에 준하여 (i), (ii) 및 (iii)을 혼합하여 조제하면 된다. 구체적으로는 예를 들면, 원하는 몰 농도가 되도록 (i) 및 (ii)의 사용량을 적절히 설정하고, 먼저 (i)과 (iii)을 혼합하며, 이어서 (ii)를 혼합함으로써 조제할 수 있다.
본 발명의 포스포아미다이트 활성화제의 조제는, (i), (ii) 및 (iii)에 영향을 주지 않고 혼합 가능한 조제 조건(온도, 압력, 분위기 등)이면 특별히 제한은 없으며, 예를 들면 15~40℃, 상압(1기압), 불활성 가스(예를 들면, 질소, 아르곤 등) 분위기하에서 조제하면 된다.
[본 발명의 활성화 방법]
본 발명의 활성화 방법은, 포스포아미다이트를 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제와 반응시키는 공정을 포함한다.
본 발명의 활성화 방법에 있어서의 포스포아미다이트란, 아인산 다이에스터의 모노아마이드 유도체이며, 본 발명에서는 특히, 당해 아인산 다이에스터의 일방의 에스터 부분에 뉴클레오사이드가 결합하고 있는 뉴클레오사이드포스포아미다이트를 나타내는 것으로 한다. 본 발명의 활성화 방법에 있어서의 포스포아미다이트는, 통상 이 분야에서 이용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 시판 중인 것 또는 자체 공지의 방법에 의하여 적절히 합성한 것을 이용하면 된다.
본 발명의 활성화 방법에 있어서의 포스포아미다이트 중의 뉴클레오사이드는, 핵산 염기 및 당으로 이루어지는 화합물이며, 5'위의 하이드록시기(5'-OH기)가 보호기로 보호되어 있는 것이 바람직하다. 당해 핵산 염기로서는, 구체적으로는 예를 들면, 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민 및 유라실, 및 이들의 일부가 치환·수식된 유도체 등을 들 수 있다. 당해 당으로서는, 구체적으로는 예를 들면, 리보스 및 데옥시리보스, 및 이들의 일부가 수식된 유도체 등을 들 수 있다. 당해 보호기로서는, 아세틸기, tert-뷰틸다이페닐실릴기, tert-뷰틸다이메틸실릴기, 4,4'-다이메톡시트리틸기(4,4'-다이메톡시트라이페닐메틸기), 4-모노메톡시트리틸기(4-메톡시트라이페닐메틸기)를 들 수 있으며, 4,4'-다이메톡시트리틸기가 바람직하다.
또, 본 발명의 활성화 방법에 있어서의 포스포아미다이트 중의 뉴클레오사이드가, 2'위에 하이드록시기(2'-OH기)를 갖는 경우, 2'-OH기도 5'-OH기와 동일하게 보호기로 보호되어 있는 것이 바람직하다. 당해 보호기로서는, 아세틸기, tert-뷰틸다이페닐실릴기, tert-뷰틸다이메틸실릴기, 트라이아이소프로필실록시메틸기, 4,4'-다이메톡시트리틸기, 4-모노메톡시트리틸기를 들 수 있으며, tert-뷰틸다이메틸실릴기가 바람직하다.
또한, 본 발명의 활성화 방법에 있어서의 포스포아미다이트 중의 뉴클레오사이드는, 부반응을 발생시키지 않기 위하여, 5'-OH기 또는 2'-OH기 이외의 관능기도 필요에 따라 보호되어 있는 것이 바람직하다. 구체적으로는 예를 들면, 본 발명의 활성화 방법에 있어서의 포스포아미다이트 중의 뉴클레오사이드가 핵산 염기로서 아데닌, 구아닌 또는 사이토신을 갖는 경우, 당해 핵산 염기 중의 아미노기가 아세틸기, 아이소뷰티릴기, 벤조일기, 4-(tert-뷰틸)벤조일기, 페녹시아세틸기 등의 아실기로 보호되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 활성화 방법에 있어서의 포스포아미다이트는, 구체적으로는 예를 들면, 하기 일반식 (I)로 나타나는 화합물을 들 수 있다.
Figure pct00006
[일반식 (I) 중, R1은, 하기 관능기군 (I-1)로부터 선택되는 기를 나타내고:
Figure pct00007
(관능기군 (I-1) 중, n1 및 n2는 각각 독립적으로, 1~6의 정수를 나타낸다.),
R2 및 R3은 각각 독립적으로, 탄소수 1~6의 알킬기를 나타내며, R2와 R3이 결합하여 5~7원환의 복소환 구조를 형성하고 있어도 되고, A1은, 뉴클레오사이드를 나타낸다.]
일반식 (I)의 관능기군 (I-1)에 있어서의 n1 및 n2로서는, 각각 2~5의 정수가 바람직하고, 2가 보다 바람직하다.
일반식 (I)의 관능기군 (I-1)로서는, 사이아노에틸기가 특히 바람직하다.
일반식 (I)의 R2 및 R3에 있어서의 탄소수 1~6의 알킬기로서는, 탄소수 2~3의 것이 바람직하다. 또, 그 알킬기는, 직쇄상, 분기상 및 환상 중 어느 것이어도 되고, 분기상이 바람직하다. 구체적으로는 예를 들면, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 아이소프로필기, n-뷰틸기, 아이소뷰틸기, n-펜틸기, 아이소펜틸기, 사이클로펜틸기, n-헥실기, 아이소헥실기, 사이클로헥실기 등을 들 수 있으며, 에틸기, n-프로필기, 아이소프로필기가 바람직하고, 아이소프로필기가 특히 바람직하다.
일반식 (I)의 R2와 R3이 결합하여 5~7원환의 복소환 구조를 형성하고 있는 경우, 당해 5~7원환의 복소환 구조는, R2 및 R3과 결합하고 있는 일반식 (I) 중의 질소 원자 외에, 1개 이상의 헤테로 원자를 더 갖고 있어도 된다. 당해 5~7원환의 복소환 구조로서는, 구체적으로는 예를 들면, 피롤리딘, 피페리딘, 헥사메틸렌이민, 옥사졸리딘, 모폴린, 싸이아졸리딘, 싸이오모폴린 등을 들 수 있으며, 피페리딘, 모폴린, 싸이오모폴린이 바람직하다.
일반식 (I)의 R2 및 R3으로서는, 탄소수 2~3의 알킬기가 바람직하고, 아이소프로필기가 특히 바람직하다. 또, 일반식 (I)의 R2와 R3이 동일한 것이 바람직하다.
일반식 (I)의 A1에 있어서의 뉴클레오사이드는, 상술한 본 발명의 활성화 방법에 있어서의 포스포아미다이트 중의 뉴클레오사이드와 동일한 것을 나타낸다.
본 발명의 포스포아미다이트 활성화제의 사용량으로서는, 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제 중의 (ii) 5-벤질싸이오-1H-테트라졸의 함유량이 포스포아미다이트 1mol에 대하여 통상 1~20당량이 되는 양이다.
본 발명의 활성화 방법은, 포스포아미다이트와 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제가 순조롭게 반응 가능한 반응 조건(온도, 압력, 분위기 등)이면 특별히 제한은 없으며, 예를 들면 10~40℃, 상압, 불활성 가스 분위기하에서 행하면 된다. 본 발명의 활성화 방법에 있어서의 반응 시간은, 그 반응 조건에 따라 변화할 수 있기 때문에 일률적으로 말할 수 있는 것은 아니지만, 통상 1분~3시간이다.
[본 발명의 합성 방법]
본 발명의 합성 방법은, (1) 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제의 존재하에서, 포스포아미다이트와 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 반응시켜, 아인산 에스터를 생성하는 공정, 및 (2) 상기 아인산 에스터를 산화 또는 황화시켜, 인산 에스터 또는 싸이오 인산 에스터를 생성하는 공정을 포함하는 것이다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 포스포아미다이트는, 본 발명의 활성화 방법에 있어서의 포스포아미다이트와 동일한 것을 들 수 있으며, 바람직한 것도 동일하다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 뉴클레오사이드는, 통상 이 분야에서 이용되는 천연 또는 인공의 뉴클레오사이드이면 특별히 한정되지 않으며, 시판 중인 것 또는 자체 공지의 방법에 의하여 적절히 합성한 것을 이용하면 된다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 뉴클레오사이드는, 핵산 염기 및 당으로 이루어지는 화합물이며, 3'위의 하이드록시기(3'-OH기)가 보호기로 보호되어 있는 것이 바람직하다. 당해 핵산 염기로서는, 구체적으로는 예를 들면, 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민 및 유라실, 및 이들의 일부가 치환·수식된 유도체 등을 들 수 있다. 당해 당으로서는, 구체적으로는 예를 들면, 리보스 및 데옥시리보스, 및 이들의 일부가 수식된 유도체 등을 들 수 있다. 당해 보호기로서는, 아세틸기, tert-뷰틸다이페닐실릴기, tert-뷰틸다이메틸실릴기, 4,4'-다이메톡시트리틸기, 4-모노메톡시트리틸기를 들 수 있으며, tert-뷰틸다이메틸실릴기가 바람직하다.
또, 본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 뉴클레오사이드가 2'-OH기를 갖는 경우, 2'-OH기도 3'-OH기와 동일하게 보호기로 보호되어 있는 것이 바람직하다. 당해 보호기로서는, 아세틸기, tert-뷰틸다이페닐실릴기, tert-뷰틸다이메틸실릴기, 트라이아이소프로필실록시메틸기, 4,4'-다이메톡시트리틸기, 4-모노메톡시트리틸기를 들 수 있으며, tert-뷰틸다이메틸실릴기가 바람직하다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 뉴클레오사이드는, 부반응을 발생시키지 않기 위하여, 3'-OH기 또는 2'-OH기 이외의 관능기도 필요에 따라 보호되어 있는 것이 바람직하다. 구체적으로는 예를 들면, 본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 뉴클레오사이드가 핵산 염기로서 아데닌, 구아닌 또는 사이토신을 갖는 경우, 당해 핵산 염기 중의 아미노기가 아세틸기, 아이소뷰티릴기, 벤조일기, 4-(tert-뷰틸)벤조일기, 페녹시아세틸기 등의 아실기로 보호되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 올리고뉴클레오타이드는, 통상 이 분야에서 이용되는 올리고뉴클레오타이드이면 특별히 한정되지 않으며, 시판 중인 것 또는 자체 공지의 방법에 의하여 적절히 합성한 것을 이용하면 된다. 또한, 당해 올리고뉴클레오타이드에는, 포스포싸이오에이트형 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 한다. 또, 본 발명의 합성 방법에 의하여 얻어지는 "인산 에스터 또는 싸이오 인산 에스터"의 5'말단을 탈보호한 것을, 당해 올리고뉴클레오타이드로서 이용해도 된다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 올리고뉴클레오타이드는, 뉴클레오사이드가 3'위 및 5'위에 있어서 포스포다이에스터 결합 또는 포스포싸이오에이트 결합을 통하여 1~50개 정도 결합한 것이며, 3'말단의 하이드록시기가 보호기로 보호되어 있는 것이 바람직하다. 당해 뉴클레오사이드로서는, 3'-OH기가 보호되어 있지 않은 것 이외에는, 상술한 본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 뉴클레오사이드와 동일한 것을 들 수 있으며, 바람직한 것도 동일하다. 당해 올리고뉴클레오타이드 중의 복수 개의 뉴클레오사이드는 각각 동일해도 되고 상이해도 된다. 당해 올리고뉴클레오타이드의 3'말단의 보호기로서는, 상술한 본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 뉴클레오사이드의 3'-OH기의 보호기와 동일한 것을 들 수 있으며, 바람직한 것도 동일하다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 뉴클레오사이드 및 올리고뉴클레오타이드는, 고상 합성용 담체 상에 결합한 것이어도 된다. 당해 고상 합성용 담체로서는, 통상 이 분야에서 이용되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는 예를 들면, 다공질 유리, 다공질 합성 폴리머(예를 들면, 폴리스타이렌, 폴리아크릴아마이드 등), 실리카 입자의 표면을 당해 수지로 코팅한 것 등을 들 수 있다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 포스포아미다이트의 사용량으로서는, 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드 1mol에 대하여 통상 1~5당량이다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제의 사용량으로서는, (ii) 5-벤질싸이오-1H-테트라졸의 함유량이 포스포아미다이트 1mol에 대하여 통상 1~20당량이 되는 양이다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1)은, 아인산 에스터의 생성 반응이 순조롭게 진행 가능한 반응 조건(온도, 압력, 분위기 등)이면 특별히 제한은 없으며, 예를 들면 10~40℃, 상압, 불활성 가스 분위기하에서 실시하면 된다. 본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1)의 반응 시간은, 그 반응 조건에 따라 변화할 수 있기 때문에 일률적으로 말할 수 있는 것은 아니지만, 통상 1분~3시간이다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (2)는, 공정 (1)의 생성물인 아인산 에스터를 산화제에 의하여 산화시켜 인산 에스터를 생성하거나, 혹은 황화제에 의하여 황화시켜 싸이오 인산 에스터를 생성하는 공정이다.
당해 산화제로서는, 통상 이 분야에서 이용되는 것이면 특별히 제한은 없으며, 함수 아이오딘이 바람직하다. 구체적인 형태로서는 물을 용매의 하나로서 포함하는 아이오딘 용액의 형태를 들 수 있으며, 당해 용매로서는, 구체적으로는 예를 들면, 피리딘-테트라하이드로퓨란-물의 혼합 용매, 피리딘-물의 혼합 용매 등을 들 수 있다. 당해 아이오딘 용액 중에 포함되는 아이오딘의 농도는, 당해 용액의 전체 용량에 대하여 통상 0.02~0.10mol/L이다.
당해 황화제로서는, 통상 이 분야에서 이용되는 것이면 특별히 제한은 없으며, 구체적으로는 예를 들면, 페닐아세틸다이설파이드(PADS), 3H-1,2-벤조다이싸이올-3-온-1,1-다이옥사이드(Beaucage 시약), 5-페닐-3H-1,2,4-다이싸이아졸-3-온(POS), [(N,N-다이메틸아미노메틸리덴)아미노]-3H-1,2,4-다이싸이아졸린-3-싸이온(DDTT) 등을 들 수 있다. 또, 이들은 용액의 형태로 이용해도 되고, 구체적으로는 예를 들면, 농도 0.02~0.10mol/L의 POS 함유 아세토나이트릴 용액 등을 들 수 있다.
당해 산화제 또는 황화제의 사용량으로서는, 아인산 에스터 1mol에 대하여 통상 1~5당량이다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 포스포아미다이트가 상술한 일반식 (I)로 나타나는 화합물인 경우, 공정 (1)의 생성물인 아인산 에스터로서는, 구체적으로는 예를 들면, 일반식 (II-0)으로 나타나는 화합물을 들 수 있다. 또, 공정 (2)의 생성물인 인산 에스터로서는, 구체적으로는 예를 들면, 하기 일반식 (II-1)로 나타나는 화합물을 들 수 있으며, 공정 (2)의 생성물인 싸이오 인산 에스터로서는, 구체적으로는 예를 들면, 하기 일반식 (II-2)로 나타나는 화합물을 들 수 있다.
Figure pct00008
[일반식 (II-0)~(II-2) 중, R1은, 하기 관능기군 (I-1)로부터 선택되는 기를 나타내고:
Figure pct00009
(관능기군 (I-1) 중, n1 및 n2는 각각 독립적으로, 1~6의 정수를 나타낸다.),
A1은, 뉴클레오사이드를 나타내며, A2는, 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.].
일반식 (II-0)~(II-2)의 관능기군 (I-1)로서는, 일반식 (I)의 관능기군 (I-1)과 동일한 것을 들 수 있으며, 바람직한 것도 동일하다.
일반식 (II-0)~(II-2)의 A1에 있어서의 뉴클레오사이드는, 본 발명의 활성화 방법에 있어서의 포스포아미다이트 중의 뉴클레오사이드와 동일한 것을 들 수 있으며, 바람직한 것도 동일하다.
일반식 (II-0)~(II-2)의 A2에 있어서의 뉴클레오사이드는, 상술한 본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 뉴클레오사이드와 동일한 것을 들 수 있으며, 바람직한 것도 동일하다.
일반식 (II-0)~(II-2)의 A2에 있어서의 올리고뉴클레오타이드는, 상술한 본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1) 중의 올리고뉴클레오타이드와 동일한 것을 들 수 있으며, 바람직한 것도 동일하다.
본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (2)는, 아인산 에스터의 산화 반응 또는 황화 반응이 순조롭게 진행 가능한 반응 조건(온도, 압력, 분위기 등)이면 특별히 제한은 없으며, 예를 들면 10~40℃, 상압, 불활성 가스 분위기하에서 행하면 된다. 본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (2)의 반응 시간은, 그 반응 조건에 따라 변화할 수 있기 때문에 일률적으로 말할 수 있는 것은 아니지만, 통상 1분~3시간이다.
상술한 바와 같이, 핵산 합성에서는 통상, (A) 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 탈보호, (B) 커플링 반응, (C) 미반응물의 캡핑, (D) 커플링 생성물의 산화 또는 황화 반응이라는 4개의 공정(반응 사이클)을 반복하여 행함으로써 핵산쇄를 신장시킨다. 본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (1)은 상기 핵산 합성에 있어서의 공정 (B)에 해당하고, 본 발명의 합성 방법에 있어서의 공정 (2)는 상기 핵산 합성에 있어서의 공정 (D)에 해당한다. 따라서, 본 발명의 합성 방법을 포함하는 반응 사이클을 반복하여 행함으로써, 핵산쇄를 신장시켜, 원하는 핵산을 얻는 것이 가능하다.
상기 핵산 합성에 있어서의 공정 (A)는, 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 5'위에 있어서의 보호기를, 디블로킹제를 이용하여 탈보호하는 공정이다. 당해 디블로킹제로서는, 통상 이 분야에서 이용되는 것이면 특별히 제한은 없으며, 시판 중인 것 또는 자체 공지의 방법에 의하여 적절히 합성한 것을 이용하면 된다. 구체적으로는 예를 들면, 다이클로로아세트산-톨루엔 용액, 트라이클로로아세트산-다이클로로메테인 용액 등을 들 수 있다.
상기 핵산 합성에 있어서의 공정 (C)는, 상기 핵산 합성에 있어서의 공정 (B)에 있어서의 미반응물을, 캡핑제를 이용하여 캡핑하는 공정이다. 당해 캡핑제로서는, 통상 이 분야에서 이용되는 것이면 특별히 제한은 없으며, 시판 중인 것 또는 자체 공지의 방법에 의하여 적절히 합성한 것을 이용하면 된다. 구체적으로는 예를 들면, 무수 아세트산과 N-메틸이미다졸의 조합을 들 수 있다. 이들은 통상, 용액의 형태로 이용되며, 구체적으로는 예를 들면, 아세토나이트릴 용액, 피리딘-아세토나이트릴 용액, 2,6-루티딘-아세토나이트릴 용액, 테트라하이드로퓨란 용액, 피리딘-테트라하이드로퓨란 용액, 2,6-루티딘-테트라하이드로퓨란 용액 등의 형태를 들 수 있다.
또, 고상 합성법의 경우, 상기 핵산 합성에 있어서의 공정 (A)~(D)를 반복하여 핵산쇄를 신장시킨 후, 고상 합성용 담체로부터의 목적 핵산의 추출 및 탈보호를 행한다. 이 공정에서는 통상, 암모니아수나 메틸아민 용액이 이용된다. 당해 암모니아수로서는, 통상 이 분야에서 이용되는 것이면 특별히 제한은 없으며, 시판 중인 것 또는 자체 공지의 방법에 의하여 적절히 합성한 것을 이용하면 된다. 구체적으로는 예를 들면, 농도 25~28질량%의 암모니아 수용액을 들 수 있으며, 메틸아민 수용액-에탄올 수용액과의 혼합 용액의 형태로 이용해도 된다.
이하에 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 예에 의하여 결코 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 포스포아미다이트 활성화제 1의 조제 방법
아세토나이트릴 29.85mL에 피페리딘 0.15mL(1.52mmol)를 더하여 용해시키고, 0.5vol%(체적 퍼센트 농도: volume/volume%) 피페리딘 첨가 아세토나이트릴 용액을 조제했다. 이어서, 5-벤질싸이오-1H-테트라졸(BTT)(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 1.73g(9.00mmol)을 0.5vol% 피페리딘 첨가 아세토나이트릴 용액으로 30mL에 메스업하여, 0.5vol%의 피페리딘을 포함하는 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제 1을 조제했다.
실시예 2-4 포스포아미다이트 활성화제 2-4의 조제 방법
0.5vol% 피페리딘 첨가 아세토나이트릴 용액 대신에 표 1에 기재된 각종 첨가제를 0.5vol% 첨가한 아세토나이트릴 용액을 이용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여, 포스포아미다이트 활성화제 2-4를 조제했다.
비교예 1 포스포아미다이트 활성화제 101의 조제 방법
0.5vol% 피페리딘 첨가 아세토나이트릴 용액 대신에 첨가제를 더하지 않은 아세토나이트릴 용액을 이용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여, 포스포아미다이트 활성화제 101을 조제했다.
비교예 2-12 포스포아미다이트 활성화제 102-112의 조제 방법
0.5vol% 피페리딘 첨가 아세토나이트릴 용액 대신에 표 1에 기재된 각종 첨가제를 0.5vol% 첨가한 아세토나이트릴 용액을 이용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여, 포스포아미다이트 활성화제 102-112를 조제했다.
실험예 1 포스포아미다이트 활성화제의 보존 안정성 평가 1
실시예 1-4에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 1-4, 및 비교예 1-12에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 101-112를, 각각 0~2℃에서 1주일 및 2주일 정치한 후의 침전의 유무(BTT의 결정의 석출의 유무)를 확인했다.
평가 결과를 표 1에 나타낸다. 또, BTT의 몰 농도(mol/L)에 대한 첨가제의 몰 농도(mol/L)의 비율을 "BTT에 대한 비율(%)"로 하여, 평가 결과와 함께 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00010
또한, 각 포스포아미다이트 활성화제에 사용한 첨가제의 구조는 이하와 같다.
Figure pct00011
실시예 5 포스포아미다이트 활성화제 5의 조제 방법
아세토나이트릴 29.70mL에 피페리딘 0.30mL(3.04mmol)를 더하여 용해시키고, 1.0vol% 피페리딘 첨가 아세토나이트릴 용액을 조제했다. 이어서, BTT 1.73g(9.00mmol)을 1.0vol% 피페리딘 첨가 아세토나이트릴 용액으로 30mL에 메스업하여, 1.0vol%의 피페리딘을 포함하는 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제 5를 조제했다.
실시예 6-7 포스포아미다이트 활성화제 6-7의 조제 방법
1.0vol% 피페리딘 첨가 아세토나이트릴 용액 대신에 표 2에 기재된 각종 첨가제를 1.0vol% 첨가한 아세토나이트릴 용액을 이용한 것 이외에는 실시예 5와 동일하게 하여, 포스포아미다이트 활성화제 6-7을 조제했다.
비교예 13-15 포스포아미다이트 활성화제 113-115의 조제 방법
1.0vol% 피페리딘 첨가 아세토나이트릴 용액 대신에 표 2에 기재된 각종 첨가제를 1.0vol% 첨가한 아세토나이트릴 용액을 이용한 것 이외에는 실시예 5와 동일하게 하여, 포스포아미다이트 활성화제 113-115를 조제했다.
실험예 2 포스포아미다이트 활성화제의 보존 안정성 평가 2
실시예 5-7에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 5-7, 및 비교예 13-15에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 113-115를, 각각 0~2℃에서 1주일 및 2주일 정치한 후의 침전의 유무(BTT의 결정의 석출의 유무)를 확인했다.
평가 결과를 표 2에 나타낸다. 또, BTT의 몰 농도에 대한 첨가제의 몰 농도의 비율을 "BTT에 대한 비율(%)"로 하여, 평가 결과와 함께 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00012
표 1의 결과로부터, 다양한 첨가제 중에서도 피페리딘, 피롤리딘, N-메틸피페리딘 및 N-메틸피롤리딘만이, 침전을 발생시키지 않고 1주일 보존 가능한 것을 알 수 있었다. 즉, 피페리딘, 피롤리딘, N-메틸피페리딘 및 N-메틸피롤리딘이, 아세토나이트릴에 대한 BTT의 용해성을 향상시켜, BTT의 결정을 석출시키지 않고 포스포아미다이트 활성화제를 보존하기 위하여 유효한 것이 판명되었다.
또한, 표 2의 결과로부터, N-메틸피페리딘 및 N-메틸피롤리딘의 첨가량을 0.5vol%에서 1.0vol%로 증가시킨 결과, 2주일 후에도 침전을 발생시키지 않고 보존 가능한 것을 알 수 있었다. 따라서, N-메틸피페리딘 및 N-메틸피롤리딘의 첨가량에 대하여 상세하게 검토했다.
실시예 8-13 포스포아미다이트 활성화제 8-13의 조제
N-메틸피페리딘의 첨가량을 각각 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0vol%가 되도록 이용한 것 이외에는, 실시예 3과 동일하게 하여 포스포아미다이트 활성화제 8-13을 조제했다.
실시예 14-19 포스포아미다이트 활성화제 14-19의 조제 방법
N-메틸피롤리딘의 첨가량을 각각 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0vol%가 되도록 이용한 것 이외에는, 실시예 4와 동일하게 하여 포스포아미다이트 활성화제 14-19를 조제했다.
비교예 16-18 포스포아미다이트 활성화제 116-118의 조제 방법
첨가제로서 피페리딘 대신에 N-메틸이미다졸을 이용하여, 그 첨가량을 각각 0.4, 0.45, 0.5vol%가 되도록 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 포스포아미다이트 활성화제 116-118을 조제했다.
실험예 3 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제에 있어서의 첨가제의 첨가량 검토
실시예 8-19에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 8-19, 및 비교예 16-18에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 116-118을, 각각 0~2℃에서 2주일 정치한 후의 침전의 유무(BTT의 결정의 석출의 유무)를 확인했다.
평가 결과를 표 3에 나타낸다. 또, BTT의 몰 농도에 대한 첨가제의 몰 농도의 비율을 "BTT에 대한 비율(%)"로 하여, 평가 결과와 함께 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00013
실시예 20 포스포아미다이트 활성화제 20의 조제 방법
BTT 2.02g(10.5mmol)을 0.5vol% N-메틸피페리딘 첨가 아세토나이트릴 용액으로 30mL에 메스업하여, 0.5vol%의 N-메틸피페리딘을 포함하는 0.35mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제 20을 조제했다.
실시예 21-25 포스포아미다이트 활성화제 21-25의 조제 방법
N-메틸피페리딘의 첨가량을 각각 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0vol%가 되도록 이용한 것 이외에는, 실시예 20과 동일하게 하여 포스포아미다이트 활성화제 21-25를 조제했다.
실시예 26-31 포스포아미다이트 활성화제 26-31의 조제 방법
첨가제로서 N-메틸피페리딘 대신에 N-메틸피롤리딘을 이용하여, 그 첨가량을 각각 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0vol%가 되도록 이용한 것 이외에는, 실시예 20과 동일하게 하여 포스포아미다이트 활성화제 26-31을 조제했다.
비교예 19-24 포스포아미다이트 활성화제 119-124의 조제 방법
첨가제로서 N-메틸피페리딘 대신에 N-메틸이미다졸을 이용하여, 그 첨가량을 각각 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0vol%가 되도록 이용한 것 이외에는, 실시예 20과 동일하게 하여 포스포아미다이트 활성화제 119-124를 조제했다.
실험예 4 0.35mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제에 있어서의 첨가제의 첨가량 검토
실시예 20-31에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 20-31, 및 비교예 19-24에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 119-124를, 각각 0~2℃에서 2주일 정치한 후의 침전의 유무(BTT의 결정의 석출의 유무)를 확인했다.
평가 결과를 표 4에 나타낸다. 또, BTT의 몰 농도에 대한 첨가제의 몰 농도의 비율을 "BTT에 대한 비율(%)"로 하여, 평가 결과와 함께 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00014
표 3 및 표 4의 결과로부터, 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제의 경우, N-메틸피페리딘은 0.7vol% 이상, N-메틸피롤리딘은 0.6vol% 이상 첨가함으로써, 아세토나이트릴에 대한 BTT의 용해성이 향상되어, BTT의 결정이 석출되지 않는 것이 판명되었다. 또, 0.35mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제의 경우, N-메틸피페리딘은 0.9vol% 이상, N-메틸피롤리딘은 0.8vol% 이상 첨가함으로써, 아세토나이트릴에 대한 BTT의 용해성이 향상되어, BTT의 결정이 석출되지 않는 것이 판명되었다. 침전의 유무를 BTT에 대한 첨가제의 몰 농도의 비율로 비교하면, 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제의 경우에서는, N-메틸피페리딘 및 N-메틸피롤리딘은, 특허문헌 1(일본 공표특허공보 2008-530092호)에 개시되어 있는 첨가제인 N-메틸이미다졸과 동등량(19.3%) 첨가함으로써 BTT의 결정이 석출되지 않는 것이 판명되었다. 또, 0.35mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제의 경우에서는, N-메틸이미다졸보다 소량의 첨가이더라도 BTT의 결정이 석출되지 않는 것이 판명되었다.
다음으로, 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제의 액상계 합성에 있어서의 성능을 평가하기 위하여, 0~2℃의 저온하에서 2주일 보존 가능한 포스포아미다이트 활성화제(0.6vol%의 피페리딘, 0.6vol%의 피롤리딘, 0.8vol%의 N-메틸피페리딘, 또는 0.7vol%의 N-메틸피롤리딘을 포함하는 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제)를 이용하여, 액상계로 핵산 다이머 합성을 실시했다. 동시에, 0.5vol%의 N-메틸이미다졸을 포함하는 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제, 및 첨가제가 없는 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제를 이용한 핵산 다이머 합성도 행하여, 그 합성 결과를 비교했다.
합성예 1 3',5'-O-비스(tert-뷰틸다이메틸실릴)티미딘의 합성 방법
질소 분위기하에서 티미딘(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 25.0g(103mmol)을 N,N-다이메틸폼아마이드(DMF)(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 75mL 및 테트라하이드로퓨란(THF)(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 75mL에 용해시키고, 5℃로 냉각했다. 그 후, 얻어진 용액에 이미다졸(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 21.1g(310mmol)과 트라이플루오로메테인설폰산 tert-뷰틸다이메틸실릴(TBSOTf)(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 68.2g(258mmol)을 더하여, 실온에서 3시간 교반했다. 반응 후에 THF를 감압하 제거한 후, 다이아이소프로필에터(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 100mL와 아세트산 에틸(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 50mL, 이온 교환수 100mL와 포화 식염수 100mL를 더하여 분액하고, 수층을 다이아이소프로필에터 100mL와 아세트산 에틸 50mL의 혼합 용매로 추출했다. 유기층을 포화 식염수 200mL로 세정한 후, 황산 나트륨을 더하여 건조했다. 황산 나트륨을 여과 후, 유기층을 감압하 제거하여, 담황색 결정상의 3',5'-O-비스(tert-뷰틸다이메틸실릴)티미딘을 정량적으로 얻었다.
합성예 2 3'-O-(tert-뷰틸다이메틸실릴)티미딘의 합성 방법
합성예 1에서 얻어진 3',5'-O-비스(tert-뷰틸다이메틸실릴)티미딘 전량을 THF 194mL와 이온 교환수 32mL에 용해시키고, 5℃로 냉각했다. 그 후, 얻어진 용액에 트라이플루오로아세트산(TFA)(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 32mL를 20분 동안 적하하여, 3~5℃에서 4시간 교반했다. 1.0mol/L 수산화 나트륨 수용액 450mL로 pH를 조정하여, 아세트산 에틸 300mL로 2회 추출했다. 유기층을 포화 식염수 300mL로 세정한 후, 황산 나트륨을 더하여 건조했다. 황산 나트륨을 여과 후, 유기층을 감압하 제거했다. 얻어진 조(粗)생성물을 실리카젤 칼럼 크로마토그래피(다이클로로메테인:메탄올=100:0~97:3)로 정제하고, 얻어진 조체(粗體)를 아세트산 에틸 35mL와 헥세인 105mL로 재결정함으로써, 백색 분말상의 3'-O-(tert-뷰틸다이메틸실릴)티미딘을 13.0g(수율 35%) 얻었다.
합성예 1-2의 반응 스킴을 이하에 나타낸다.
Figure pct00015
(상기 반응 스킴 중, TBS는, tert-뷰틸다이메틸실릴기를 나타낸다.)
또한, 얻어진 3',5'-O-비스(tert-뷰틸다이메틸실릴)티미딘의 물성 데이터는 J. Org. Chem. 2016, 81, 3848에 기재된 데이터와 일치하고 있으며, 3'-O-(tert-뷰틸다이메틸실릴)티미딘의 물성 데이터는 Synlett 2018, 29, 2437에 기재된 데이터와 일치하고 있는 것을 확인했다.
실시예 32 포스포아미다이트 활성화제 32를 이용한 핵산 다이머의 합성
피페리딘의 첨가량을 0.5vol% 대신에 0.6vol%가 되도록 이용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여, 0.6vol%의 피페리딘을 포함하는 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제 32를 조제했다. 이어서, 질소 분위기하에서 5'-O-(4,4'-다이메톡시트리틸)티미딘-3'-[(2-사이아노에틸)-N,N-다이아이소프로필]포스포아미다이트(CARBOSYNTH사제) 752mg(1.01mmol)과 합성예 2에서 얻어진 3'-O-(tert-뷰틸다이메틸실릴)티미딘 300mg(0.84mmol)을 투입하고, 포스포아미다이트 활성화제 32를 6.73mL 더하여 실온에서 15분간 교반했다. 그 후, 1.0mol/L 아이오딘 함유 피리딘-수용액(9:1) 8.42mL(8.42mmol)를 더하여 실온에서 15분간 교반했다. 아세트산 에틸 84mL와 5질량% 싸이오 황산 나트륨 수용액 84mL를 더하여 분액하고, 수층을 아세트산 에틸 42mL로 추출했다. 유기층을 5질량% 싸이오 황산 나트륨 수용액 84mL로 세정한 후, 황산 나트륨을 더하여 건조했다. 황산 나트륨을 여과 후, 유기층을 감압하 제거했다. 얻어진 조생성물의 1H NMR을 측정 후, 실리카젤 칼럼 크로마토그래피(헥세인:아세트산 에틸=4:6, 아세트산 에틸:메탄올=98:2)로 정제하고, 담황색 결정상의 목적의 핵산 다이머를 506mg 얻었다. 조생성물의 NMR 수율은 64%, 단리 수율은 59%였다. 또한, NMR 수율은 내부 표준 물질로서 다이메틸설폰(후지필름 와코 준야쿠(주)제)을 사용하고, 화학 시프트 3.322ppm의 적분값을 기준으로 하여 목적의 핵산 다이머의 5.093ppm의 적분값으로부터 산출했다.
실시예 32의 반응 스킴을 이하에 나타낸다.
Figure pct00016
(상기 반응 스킴 중, DMTr은, 4,4'-다이메톡시트리틸기를 나타내고, TBS는, tert-뷰틸다이메틸실릴기를 나타낸다.)
또한, 얻어진 핵산 다이머의 물성 데이터는 J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 15930에 기재된 데이터와 일치하고 있는 것을 확인했다.
실시예 33 포스포아미다이트 활성화제 33을 이용한 핵산 다이머의 합성
첨가제로서 피페리딘 대신에 피롤리딘을 이용한 것 이외에는, 실시예 32와 동일하게 하여, 0.6vol%의 피롤리딘을 포함하는 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제 33을 조제하고, 그것을 이용하여 핵산 다이머를 합성했다.
실시예 34 포스포아미다이트 활성화제 11을 이용한 핵산 다이머의 합성
포스포아미다이트 활성화제 32 대신에, 실시예 11에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 11을 이용한 것 이외에는, 실시예 32와 동일하게 하여 핵산 다이머를 합성했다.
실시예 35 포스포아미다이트 활성화제 16을 이용한 핵산 다이머의 합성
포스포아미다이트 활성화제 32 대신에, 실시예 16에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 16을 이용한 것 이외에는, 실시예 32와 동일하게 하여 핵산 다이머를 합성했다.
비교예 24 포스포아미다이트 활성화제 101을 이용한 핵산 다이머의 합성
포스포아미다이트 활성화제 32 대신에, 비교예 1에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 101을 이용한 것 이외에는, 실시예 32와 동일하게 하여 핵산 다이머를 합성했다.
비교예 25 포스포아미다이트 활성화제 118을 이용한 핵산 다이머의 합성
포스포아미다이트 활성화제 32 대신에, 비교예 18에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 118을 이용한 것 이외에는, 실시예 32와 동일하게 하여 핵산 다이머를 합성했다.
실시예 32-35 및 비교예 24-25에 있어서의, NMR로부터 산출한 수율, 및 실리카젤 칼럼 크로마토그래피 정제 후의 단리 수율에 대하여, 표 3에 나타낸다. 또한, 실시예 33-35 및 비교예 24-25에 있어서 얻어진 생성물의 물성 데이터는 실시예 32와 동일했다.
[표 5]
Figure pct00017
표 5의 결과로부터, 특허문헌 1에 개시되어 있는 N-메틸이미다졸 함유 포스포아미다이트 활성화제를 이용한 경우에는, 첨가제를 포함하지 않는 포스포아미다이트 활성화제를 이용한 경우와 비교하여 얻어지는 핵산 다이머의 수율이 낮았다. 한편, 피페리딘, 피롤리딘, N-메틸피페리딘 또는 N-메틸피롤리딘 함유의 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제를 이용한 경우에는, 첨가제를 포함하지 않는 포스포아미다이트 활성화제를 이용한 경우와 동등 혹은 그 이상의 수율로 반응이 진행되어, 수율을 저하시키지 않는 것이 판명되었다. 그중에서도, 특히 N-메틸피페리딘 또는 N-메틸피롤리딘 함유의 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제를 이용한 경우에는, 첨가제를 포함하지 않는 포스포아미다이트 활성화제를 이용한 경우보다 고수율로 반응이 진행되는 것이 판명되었다.
따라서, 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제는, 액상계 합성에 있어서, 특허문헌 1에 개시되어 있는 첨가제(N-메틸이미다졸) 함유 포스포아미다이트 활성화제와 동등 혹은 그 이상의 높은 보존 안정성을 갖고, 또한 첨가제를 포함하지 않는 포스포아미다이트 활성화제와 동등 혹은 그 이상의 높은 반응 수율을 갖는다는 우수한 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
다음으로, 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제의 고상계 합성에 있어서의 성능을 평가하기 위하여, 액상계 합성으로 성능이 양호했던 포스포아미다이트 활성화제(0.8vol%의 N-메틸피페리딘 또는 0.7vol%의 N-메틸피롤리딘을 포함하는 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제)를 이용하여, 고상계로 DNA 올리고머 합성을 실시했다. 동시에, 0.5vol%의 N-메틸이미다졸을 포함하는 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제를 이용한 DNA 올리고머 합성도 행하여, 그 합성 결과를 비교했다.
실시예 36 포스포아미다이트 활성화제 11을 이용한 DNA 올리고머의 합성
유니버설 서포트(고상 합성용 담체, 상품명: Glen Unysupport CPG 1000, Glen Research사제)를 1.0μmol에 상당하는 양을 반응 칼럼에 충전하여, 5'-O-(4,4'-다이메톡시트리틸)티미딘-3'-[(2-사이아노에틸)-N,N-다이아이소프로필]포스포아미다이트(CARBOSYNTH사제)의 0.07M 아세토나이트릴 용액, 및 실시예 11에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 11을 조제하고, NTS M-2-MX DNA/RNA 합성기(니혼 테크노 서비스사제)를 이용하여 dT 20mer(5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')를 합성했다. 또한, 반응제에는, 디블로킹제로서 3질량% 다이클로로아세트산-톨루엔 용액(Sigma-Aldrich사제)을, 캡핑제로서 캡 A 시약(N-메틸이미다졸-아세토나이트릴 용액(2:8))(후지필름 와코 준야쿠(주)제) 및 캡 B 시약(무수 아세트산-2,6-루티딘-아세토나이트릴 용액(2:3:5))(후지필름 와코 준야쿠(주)제)을, 산화제로서 0.05M 아이오딘 용액(피리딘-물(9:1))(후지필름 와코 준야쿠(주)제)을 사용했다. 합성 후, 얻어진 DNA 올리고뉴클레오타이드를 28질량% 암모니아수에 55℃에서 15시간 침지하고, 고상 합성용 담체로부터의 dT 20mer의 추출과 탈보호를 실시했다. 얻어진 dT 20mer의 시료 용액에 대하여, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 순도를 측정했다(측정 조건: 칼럼; Wakopak(등록 상표) Ultra C18-5 4.6mm×150mm, 유속; 1.0mL/min, 칼럼 온도; 40℃, UV 검출 파장; 260nm, 용리액 A; 0.1M 아세트산 트라이에틸아민(TEAA) 수용액(pH7.0), 용리액 B; 50% 아세토나이트릴 0.1M TEAA 수용액(pH7.0)).
실시예 37 포스포아미다이트 활성화제 16을 이용한 DNA 올리고머의 합성
포스포아미다이트 활성화제 11 대신에, 실시예 16에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 16을 이용한 것 이외에는, 실시예 36과 동일하게, dT 20mer를 합성하여 그 순도를 HPLC로 측정했다.
비교예 26 포스포아미다이트 활성화제 118을 이용한 DNA 올리고머의 합성
포스포아미다이트 활성화제 11 대신에, 비교예 18에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 118을 이용한 것 이외에는, 실시예 36과 동일하게, dT 20mer를 합성하여 그 순도를 HPLC로 측정했다.
실시예 36 및 37 및 비교예 26에 있어서의, HPLC로 측정한 dT 20mer의 순도에 대하여, 표 6에 나타낸다.
[표 6]
Figure pct00018
다음으로, 포스포아미다이트 활성화제(0.8vol%의 N-메틸피페리딘, 또는 0.7vol%의 N-메틸피롤리딘을 포함하는 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제)를 이용하여, 고상계로 RNA 올리고머 합성을 실시했다. 동시에, 0.5vol%의 N-메틸이미다졸을 포함하는 0.30mol/L BTT의 포스포아미다이트 활성화제를 이용한 RNA 올리고머 합성도 행하여, 그 합성 결과를 비교했다.
실시예 38 포스포아미다이트 활성화제 11을 이용한 RNA 올리고머의 합성
유니버설 서포트(고상 합성용 담체, 상품명: Glen Unysupport CPG 1000, Glen Research사제)를 0.2μmol에 상당하는 양을 반응 칼럼에 충전하여, 5'-O-(4,4'-다이메톡시트리틸)-2'-O-(tert-뷰틸다이메틸실릴))유리딘-3'-[(2-사이아노에틸)-N,N-다이아이소프로필]포스포아미다이트(Sigma-Aldrich사제)의 0.07M 아세토나이트릴 용액, 및 실시예 11에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 11을 조제하고, NTS M-2-MX DNA/RNA 합성기(니혼 테크노 서비스사제)를 이용하여 rU 20mer(5'-UUUUUUUUUUUUUUUUUUUU-3')를 합성했다. 또한, 반응제는 실시예 36에 기재된 반응제와 동일한 것을 이용했다. 합성 후, 얻어진 RNA 올리고뉴클레오타이드를 28질량% 암모니아수-40질량% 메틸아민 수용액-70질량% 에탄올 수용액(1:1:1)의 혼합 용매에 60℃에서 3시간 침지하고, 고상 합성용 담체로부터의 rU 20mer의 추출과 탈보호를 실시했다. 또한, 얻어진 용액을 농축하여, 거기에 다이메틸설폭사이드 50μL 및 트라이에틸아민 삼불화 수소산염(TREAT-3HF) 200μL를 더하여 60℃에서 3시간 침지하고, tert-뷰틸다이메틸실릴기의 탈보호를 실시했다. 얻어진 rU 20mer의 순도를, 실시예 36과 동일한 측정 조건으로 HPLC로 측정했다.
실시예 39 포스포아미다이트 활성화제 16을 이용한 RNA 올리고머의 합성
포스포아미다이트 활성화제 11 대신에, 실시예 16에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 16을 이용한 것 이외에는, 실시예 38과 동일하게, rU 20mer를 합성하여 그 순도를 HPLC로 측정했다.
비교예 27 포스포아미다이트 활성화제 118을 이용한 RNA 올리고머의 합성
포스포아미다이트 활성화제 11 대신에, 비교예 18에서 얻어진 포스포아미다이트 활성화제 118을 이용한 것 이외에는, 실시예 38과 동일하게, rU 20mer를 합성하여 그 순도를 HPLC로 측정했다.
실시예 38 및 39 및 비교예 27에 있어서의, HPLC로 측정한 rU 20mer의 순도에 대하여, 표 7에 나타낸다.
[표 7]
Figure pct00019
표 6 및 표 7의 결과로부터, N-메틸피페리딘 또는 N-메틸피롤리딘 함유의 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제를 고상계 합성에 이용한 경우에도, 특허문헌 1에 개시되어 있는 N-메틸이미다졸 함유 포스포아미다이트 활성화제를 이용한 경우와 동등 혹은 그 이상의 순도로 DNA·RNA 올리고머가 얻어지는 것이 판명되었다.
따라서, 본 발명의 포스포아미다이트 활성화제는, 고상계 합성에 있어서, 특허문헌 1에 개시되어 있는 첨가제(N-메틸이미다졸) 함유 포스포아미다이트 활성화제와 동등 혹은 그 이상의 높은 보존 안정성을 갖고, 또한 동등 혹은 그 이상의 높은 순도로 목적물이 얻어진다는 우수한 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

Claims (10)

  1. (i) 피페리딘, 피롤리딘, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물,
    (ii) 5-벤질싸이오-1H-테트라졸, 및
    (iii) 아세토나이트릴
    을 포함하는 포스포아미다이트 활성화제.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 (i)이 N-알킬피페리딘 또는 N-알킬피롤리딘인, 포스포아미다이트 활성화제.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 (i)이 N-메틸피페리딘 또는 N-메틸피롤리딘인, 포스포아미다이트 활성화제.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 (ii)의 몰 농도가 0.25mol/L 이상인, 포스포아미다이트 활성화제.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 (i)의 피페리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 17.0% 이상이고, 상기 (i)의 피롤리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 20.0% 이상이며, 상기 (i)의 N-알킬피페리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 13.7% 이상이고, 또한 상기 (i)의 N-알킬피롤리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 16.0% 이상인, 포스포아미다이트 활성화제.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 (i)의 피페리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 17.0% 이상이고, 상기 (i)의 피롤리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 24.0% 이상이며, 또한 상기 (i)의 N-알킬피페리딘 또는 N-알킬피롤리딘의 몰 농도가 상기 (ii)의 몰 농도에 대하여 19.3% 이상인, 포스포아미다이트 활성화제.
  7. 포스포아미다이트를, 청구항 1에 기재된 포스포아미다이트 활성화제와 반응시키는 공정을 포함하는, 포스포아미다이트의 활성화 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 포스포아미다이트가 하기 일반식 (I)로 나타나는 화합물인, 활성화 방법:
    Figure pct00020

    [일반식 (I) 중, R1은, 하기 관능기군 (I-1)로부터 선택되는 기를 나타내고:
    Figure pct00021

    (관능기군 (I-1) 중, n1 및 n2는 각각 독립적으로, 1~6의 정수를 나타낸다.),
    R2 및 R3은 각각 독립적으로, 탄소수 1~6의 알킬기를 나타내며, R2와 R3이 결합하여 5~7원환의 복소환 구조를 형성하고 있어도 되고, A1은, 뉴클레오사이드를 나타낸다.].
  9. (1) 청구항 1에 기재된 포스포아미다이트 활성화제의 존재하에서, 포스포아미다이트와 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 반응시켜, 아인산 에스터를 생성하는 공정, 및
    (2) 상기 아인산 에스터를 산화 또는 황화시켜, 인산 에스터 또는 싸이오 인산 에스터를 생성하는 공정
    을 포함하는, 인산 에스터 또는 싸이오 인산 에스터의 합성 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 포스포아미다이트가 하기 일반식 (I)로 나타나는 화합물이고, 상기 인산 에스터가 하기 일반식 (II-1)로 나타나는 화합물이며, 또한 상기 싸이오 인산 에스터가 하기 일반식 (II-2)로 나타나는 화합물인, 합성 방법:
    Figure pct00022

    [일반식 (I), (II-1) 및 (II-2) 중, R1은, 하기 관능기군 (I-1)로부터 선택되는 기를 나타내고:
    Figure pct00023

    (관능기군 (I-1) 중, n1 및 n2는 각각 독립적으로, 1~6의 정수를 나타낸다.),
    R2 및 R3은 각각 독립적으로, 탄소수 1~6의 알킬기를 나타내며, R2와 R3이 결합하여 5~7원환의 복소환 구조를 형성하고 있어도 되고, A1은, 뉴클레오사이드를 나타내며, A2는, 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.].
KR1020227012543A 2019-10-18 2020-10-13 포스포아미다이트 활성화제 KR20220083704A (ko)

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