KR20100022470A - 올리고뉴클레오타이드의 합성 - Google Patents

Abstract

a) 화학식(1)(식에서, B는 헤테로사이클릭 기재이고 라디칼 R₂, R₃ 및 R₅는 상세설명에 정의된 바와 같음)을 가지는 하이드록실-함유 화합물을 제공하는 단계; b) 화학식(I)(활성화제 I)(여기서 R = 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬, 헤테로아릴; R₁, R₂ = H 이거나, 또는 함께 5 내지 6-원 고리를 형성; X₁, X₂ = 독립적으로 N 또는 CH; Y = H 또는 Si(R₄)₃ 이고, 여기서 R₄ = 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬, 헤테로아릴; B = 탈양성자화 산)을 가지는 활성화제의 존재하에서 상기 화합물과 포스피틸화제를 반응시켜 포스피틸화 화합물을 제조하는 단계: 및 c) 이미다졸, 이미다졸리움 염류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 활성화제 II의 존재하에서, 단리가 안된 상기 포스피틸화 화합물과 하기 화학식 1(여기서 R₅, R₃, R₂ 및 B는 독립적으로 선택되되, 상기에 정의된 바와 같음)을 가지는 제 2 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는, 올리고뉴클레오타이드의 제조방법.

(1) (I)

Description

올리고뉴클레오타이드의 합성{SYNTHESIS OF OLIGONUCLEOTIDES}

본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법들에 관한 것이다.

올리고뉴클리오타이드는 생명 과학의 각종 분야에서 중요한 역할들을 하는 주요 화합물이다. 이들은 예를 들어 유전자 발현 분석 분야에서는 프로브로서, PCR에서 또는 DNA 시퀀싱을 위해서는 프라이머로서 사용된다.

또한, 잠재적인 치료학적 적용분야들이, 즉 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하여 다수 존재한다.

적용분야들의 수가 증가하면서 다량의 올리고뉴클레오타이드가 요구됨에 따라, 개선된 합성방법의 개발에 대한 지속적인 요구가 존재한다.

전반적 개요에 대해서는 예를 들어 "Antisense - From Technology to Therapy" Blackwell Science (옥스포드, 1997)를 참고한다.

올리고뉴클레오타이드의 합성에서 주목할만한 유형의 구성요소는 포스포아미다이트이다: 예를 들어, S.L. Beaucage, M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 1859(1981) 22를 참고한다. 뉴클레오사이드 포스포아미다이트, 디옥시리보뉴클레오사이드 포스포아미다이트 및 이들의 유도체 포스포아미다이트 모두가 시판되고 있다. 정상(normal) 고체상 합성에서는 3'-O-포스포아미다이트가 사용되지만, 기타 합성방법에서는 5'-O-포스포아미다이트 및 2'-O-포스포아미다이트도 사용된다. 이러한 뉴클레오사이드 포스포아미다이트 제조의 한 단계는 (보호된) 뉴클레오사이드를 포스피틸화하는 것이다. 포스피틸화 단계 이후, 통상 비용 집약적인 단리법들, 예컨대 크로마토그래피를 이용하여, 제조된 아미다이트를 단리한다. 단리 단계 이후의 민감성 아미다이트는 특별한 조건(예컨대, 저온, 무수조건) 하에 저장해야 한다. 저장되는 동안에 어느 정도의 분해와 가수분해로 인해 아미다이트의 특성이 저하될 수 있다. 양쪽 반응들이 다 나타날 수 있으며 그 결과들은 검출가능하다. 가장 일반적으로는, 잔류하는 3'-, 5'- 또는 2'-O 하이드록실기를 포스피틸화하기 이전에, 뉴클레오사이드에 존재하는 하이드록실기와 아마노기들과 기타 관능기들을 보호한다.

이들 포스포아미다이트는 이후 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 하이드록실기에 결합된다. 또한 단리된 아미다이트를 사용하게 되면 아미다이트 결합시 일부 가수분해를 일으킬 수도 있다.

포스포아미다이트는 고가의 화합물이다. 디옥시아미다이트의 통상 가격은 그램 당 40,000 유로 범위 내이다. 상응되는 RNA 구성요소들은 심지어 이보다 더 고가이다.

WO 2006/094963에는 활성화제 I의 존재하에 포스포아미다이트를 합성하는 단계 및 활성화제 II의 존재하에서의 결합단계를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 제조방법이 개시되어 있다. 활성화제 II로는 테트라졸 유도체들, 피리디니움 염류 및 4,5-디시아노이미다졸이 기재되어 있다.

본 발명의 목적은 종래 기술의 적어도 일부의 단점들을 극복한 올리고뉴클레이타이드의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 특허 출원은, 여기에 그 내용이 참고문헌으로 포함된 특허 출원 WO 2006/094963에 개시된 발명의 개선에 관한 것이다.

본 발명은 특히 개선된 활성제 II를 사용하는, WO 2006/094963의 청구항 1에 따른 올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명은

a) 하기 화학식

(식에서,

B는 헤테로사이클 기재이고

i) R₂는 H, 보호된 2'-하이드록실기, F, 보호된 아미노기, O-알킬기, O-치환된 알킬, 치환된 알킬아미노 또는 C4'-O2' 메틸렌 결합이고,

R₃는 OR'₃, NHR''₃, NR''₃R'''₃, 여기서 R'₃은 하이드록실 보호기, 보호된 뉴클레오타이드 또는 보호된 올리고뉴클레오타이드이고, R''₃ 및 R'''₃은 독립적으로 아민 보호기들이고,

R₅는 OH

또는

ii) R₂는 H, 보호된 2'-하이드록실기, F, 보호된 아미노기, O-알킬기, O-치환된 알킬, 치환된 알킬아미노 또는 C4'-O2' 메틸렌 결합(linkage)이고,

R₃는 OH 이고

R₅는 OR'₅, 여기서 R'₅은 하이드록실 보호기, 보호된 뉴클레오타이드 또는 보호된 올리고뉴클레오타이드

또는

iii) R₂는 OH 이고

R₃는 OR'₃, NHR''₃, NR''₃R'''₃, 여기서 R'₃은 하이드록실 보호기, 보호된 뉴클레오타이드 또는 보호된 올리고뉴클레오타이드이고, R''₃ 및 R'''₃은 독립적으로 아민 보호기들이고,

R₅는 OR'₅, 여기서 R'₅은 하이드록실 보호기, 보호된 뉴클레오타이드 또는 보호된 올리고뉴클레오타이드)

을 가지는 하이드록실기-함유 화합물을 제공하는 단계:

b) 하기 화학식 I(활성화제 I)

(식에서,

R = 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬, 헤테로아릴이고

R₁, R₂ = H 이거나, 또는 함께 5 내지 6-원 고리를 형성하고,

X₁, X₂ = 독립적으로 N 또는 CH 이고,

Y = H 또는 Si(R₄)₃ 이고, 여기서 R₄ = 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬, 헤테로아릴이고,

B = 탈양성자화 산)

을 가지는 활성화제의 존재하에서 a) 단계의 상기 화합물과 포스피틸화제를 반응시켜 포스피틸화 화합물을 제조하는 단계: 및

c) 이미다졸 및 이미다졸리움 염류로 이루어진 군으로부터 선택된 활성화제 II의 존재하에서 단리가 안된 상기 포스피틸화 화합물과 하기 화학식

(여기서 R₅, R₃, R₂ 및 B는 독립적으로 선택되되, 상기에 정의된 바와 같음)을 가지는 제 2 화합물을 반응시키는 단계

를 포함하는, 올리고뉴클레오타이드의 제조방법을 제공한다.

"이미다졸"은 비치환된 헤테로사이클릭 화합물이고; IUPAC 이름은 1,3-디아졸 또는 1,3-디아조사이클로펜타-2,4-디엔이다.

"이미다졸리움"은 위에 정의된 이미다졸의 양성자화된 형태이다. 언급된 활성화제들 II는 단계 (c)의 반응을 개시하는데 매우 효율적이며, 구체적으로는 WO 2006/094963에 개시된 활성화제들 II에 비하여, 특히 산업안전 및 환경보호에 관한 한 유리하다.

본 발명에 따르면, 포스피틸화 화합물은, 바람직하게는 이미다졸의 유도체로서 화학식 I을 가지는 활성화제를 사용하여 뉴클레오사이드의 하이드록실기, 뉴클레오타이드의 하이드록실기 또는 올리고뉴클레오타이드의 하이드록실기를 포스피틸화함으로써 제조된다.

정제 또는 단리과정을 거치지 않고, 이렇게 제조된 민감성 포스포아미다이트를, 활성제 I과는 상이한 활성제 II의 존재하에서, 뉴클레오사이드의 하이드록실기, 뉴클레오타이드의 하이드록실기 또는 올리고뉴클레오타이드의 하이드록실기에 결합시킨다. 제조된 포스포아미다이트의 단리 및 활성제 I로부터의 아미다이트 단리는 수행되지 않는다. 바람직하게, 동일한 반응용기 내에서 본 반응을 지속시킨다. 활성제 I의 존재하에서 활성제 II를 사용되어도 된다.

아미다이트 결합을 위한 종래 기술의 활성제는 아미다이트 기능의 활성화를 위한 높은 반응도를 보인다. 포스피틸화를 위해 이러한 활성제를 사용하게 되면 어느 정도의 "과도반응"(예컨대, 3'-3' 부산물)도 생긴다. 이와 기타 문제들을 극복하기 위해서 활성제의 반응도를 조절한다. 이 경우, 반응은 실질적으로 부산물(예컨대, 3'-3' 부산물)이 없는 아미다이트 레벨에서 선택적으로 중단될 것이다. 이러한 결과(아미다이트의 in-situ 생성)만이 아미다이트 결합으로 시작되는 전체적 접근이 계속되도록 허용한다.

활성화제 II는 결합단계를 유도할 수 있다. 활성화제 II를 첨가한 후, 아미다이트는 아미다이트 결합을 시작하게 된다. 활성화제 화합물로는 이미다졸류 및 이미다졸리움 염류, 즉, 산(바람직하게는 강산)을 포함하는 이미다졸의 염류가 적합하다. 바람직한 산류로는, 예를 들자면, 트리플루오로아세테이트, 트리플레이트, 디클로로아세테이트, 메실, 토실, o-클로로페놀레이트가 있다.

이미다졸과 염을 구성하기에는 pKa 4.5 미만의 산류가 바람직하다.

일 구현예에서, 상기 활성화제는 양성자화된 N-1-(H)이미다졸이다. 상대이온류는 일반적으로 WO 2006/094963에 기재된 바와 같다. 트리플루오로아세테이트가 상대이온으로 바람직하다. 이미다졸과의 특히 바람직한 반응 도식(reaction scheme)이 도 2에 도시되어 있으며, 여기서 R1(CH₂-OH) 및 R2(CH₂-OH)는 (올리고-)뉴클레오사이드 또는 - 뉴클레오타이드를 나타낸다.

이미다졸 또는 이미다졸리움은 예컨대 WO 2006/094963에 개시되어 있는 다른 활성화제 II와 조합되어 사용될 수 있다.

제 2 측면에서, 상기 활성화제는 테트라졸-부족 상태이다. "테트라졸"은 특히 WO 2006/094963에 기재되어 있는 테트라졸 화합물류를 가리키는 것으로 이해하면 된다. 테트라졸-부족 상태는, WO 2006/094963의 청구항 1에 기재된 바와 같이, 용액 내의 테트라졸 양이 하이드록실-함유 화합물 1 몰당 1 몰 미만인 것을 가리키는 것으로 이해하면 된다. 이 양은 바람직하게 하이드록실-함유 화합물 1 몰당 0.5 몰 미만이고, 더 바람직하게는 하이드록실-함유 화합물 1 몰당 0.1 몰 미만이다. 이러한 측면에서 상기 활성화제는, 바람직하게, 테트라졸이 대체로 또는 완전히 없는 상태에 놓인다. 제 2 측면에서 바람직한 활성화제는 제 1 측면에 따른 활성화제이다.

양쪽 측면에서 모두 바람직한 용매류로는 C-H 산성 용매류, 특히는 카보닐기를 함유하는 용매류가 있다. 예를 들어, 이러한 용매류는 에틸 아세테이트 또는 에틸 아세토아세테이트 같은 에스테르류 및 케톤류에서 선택될 수 있다. 아세톤이 바람직하다.

본 발명은, 특히, 활성화제 II가 N⁰-H 결합(bond)을 가지는 이미다졸인, WO 2006/094963의 청구항 1에 따른 방법을 포함한다.

바람직하게, 이미다졸은 양성자화된 N-1-(H)이미다졸이다.

본 발명은 활성화제 II가 테트라졸-부족 상태에 있는, WO 2006/094963의 청구항 1에 따른 방법을 더 포함한다.

바람직하게, 활성화제 II는 N⁰-H 결합을 가지는 이미다졸, 바람직하게는 양성자화된 N-1-(H)이미다졸이다.

결합단계에 이어, 산화(PO 형성) 또는 황화(PS 형성)반응이 통상 이용된다. PO 형성을 위해서는 퍼옥사이드 접근법이 바람직하다. 이 반응은 어떠한 추출 단계들(요오드 산화는 몇 번의 추출 단계들을 요구함)없이도 수행될 수 있다.

황화반응의 경우에는, 황화반응을 위해 공지된 모든 시약(즉, PADS, S-테트라, beaucage)이 사용가능하다. PS 형성을 위해 바람직한 시제는 황(sulphur)이다. 생산비의 차이면에서 보면 황을 사용하는 것이 이익이다.

일 구현예에서, 황화반응은 아세톤의 존재하에서 이루어진다.

포스피틸화제는 하이드록실-함유 화합물의 하이드록실기에 대해 대략 등몰비(equimolar ratio)의 양으로 사용될 수 있다.

다른 구현예에서, 포스피틸화제는 하이드록실-함유 화합물 내의 하이드록실기를 상회하는, 예컨대 3 내지 5 몰/몰의 양으로 사용될 수 있다.

또 다른 바람직한 일 구현예에서, 청구항 1의 단계 b)이후에 폴리머 알콜이 첨가된다. 적합한 폴리머 알콜로는 머크(Merck)사(Darmstadt)에서 PVA 145000으로 시판되고 있는 폴리비닐알콜(PVA)이 있다. 입자크기가 >120 μm(80%)인 매크로다공성 PVA가 바람직하다. 또한 하이드록실기, 또는 에놀(enol)을 형성할 수 있는 기타 화합물이 포함된 막(membrane)이 적합하다.

활성화제 I는 화학량론적, 촉매적 양으로(3 내지 50 몰%, 바람직하게는 10 내지 30 몰%) 또는 이를 초과하는 양으로 사용될 수 있다.

바람직한 일 구현예에서, 활성화제 I는

로 이루어지는 군에서 선택되는 화학식을 가지며,

식에서

Y = H 또는 Si(R₄)₃ 이고, 여기서 R₄ = 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬, 헤테로아릴이고,

B = 탈양성자화 산이며,

R은 메틸, 페닐 또는 벤질이다.

이들 활성화제의 제조는 예를 들어 Hayakawa 외, J. Am. Chem. Soc. 123(2001) 8165-8176에 기재되어 있다.

일 구현예에서, 활성화제는 첨가제와 조합하여 사용된다. 첨가제는 화학식 I을 가지는 화합물 및 기타 헤테로사이클릭 염기, 예를 들어 피리딘과 같은 비양성자화(unprotonated) 형태 중에서 선택될 수 있다. 활성화제 및 첨가제 사이의 적합한 비율은 1:1 내지 1:10 이다.

바람직한 일 구현예에서, 활성화제는 "in-situ" 공정에 따라 제조될 수 있다. 이 경우, 활성화제는 단리되지 않을 것이고, 이는 개선된 반응 결과를 가져온다. 표적 분자의 가수분해 또는 분해가 억제된다.

올리고뉴클레오타이드의 3'- 및/또는 5'- 위치에서의 고수율 포스피틸화(디, 트리, 테트라, 펜타, 헥사, 헵타 및 옥타머)를 위해서는, 활성화제를 in-situ 제조하고 첨가제와 조합시키는 것이 바람직하다.

전술된 바와 같이, 포스피틸화는 특히 올리고뉴클레오타이드 및 그의 구성요소인 포스포아미다이트의 합성에 유용하다. 따라서, 바람직한 일 구현예에서, 하이드록실-함유 화합물은 이로부터 유도된 당 잔기(moiety), 예를 들어 뉴클레오사이드 또는 올리고머를 포함한다. 이러한 뉴클레오사이드는, 예를 들어, 임으로 보호기를 함유하는- 아데노신, 시토신, 구아노신 및 우라실, 데스옥시아데노신, 데스옥시구아노신, 데스옥시티미딘, 데스옥시시토신 및 그 유도체이다.

보통, 포스피틸화되는 기를 제외하면, 이들의 헤테로사이클릭 관능기 및 하이드록실 함유기들은 적절하게 보호된다. 통상적으로, 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸 또는 t-부틸디메틸-실릴(TBDMS)이 5'-OH-기의 보호기로 사용되어, 3'-OH기가 포스피틸화되도록 한다. 포스페이트 에스테르 및 H-포스포네이트가 또한 가능한 기들이며, 예를 들어 하기를 참고한다.

포스페이트 에스테르 밍 포스포디에스테르에 대해, R은 알킬, 아릴, 알킬아릴 중에서 선택될 수 있다. 페닐이 바람직하다.

또한, 5', 3' 및 2'의 하이드록실 보호기들(예컨대 TBDMS)은 당해 기술에 잘 공지되어 있다.

일반적으로, 포스피틸화제는 1-H-테트라졸이 사용되는 포스피틸화 반응에서와 동일할 수 있다.

바람직한 일 구현예에서, 포스피틸화제는 하기 화학식

(식에서, Z는 이탈기, 예컨대 -CH₂CH₂CN, -CH₂CH=CHCH₂CN, 파라-CH₂C₆H₄CH₂CN, -(CH₂)_2-5N(H)COCF₃, -CH₂CH₂Si(C₆H₅)₂CH₃ 또는 -CH₂CH₂N(CH₃)COCF₃를 나타내고, R₁ 및 R₂는 독립적으로 2차 아미노기 N(R₃)₂이며, 여기서 R₃은 1 내지 약 6개의 탄소를 가지는 알킬이거나; 4 내지 7개의 원자를 포함하고, 질소, 황 및 산소 중에서 선택되는 3개 이하의 헤테로원자를 가지는 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알케닐 고리)을 지닌다.

통상적인 포스피탈화제로는 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트가 있다.

기타 바람직한 포스피틸화 시약으로는, 본원에 참고문헌으로 포함되어 있는 N. Ok 외, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307-8317에 기재된 바와 같은 옥사자포스폴리딘(oxazaphospholidine) 유도체가 있다. 이러한 포스피틸화제는, 뉴클레오타이드간 결합(internucleotide bond)이 입체 선택적 방식으로 포스포티오에이트로 전환될 수 있는, 올리고뉴클레오타이드의 합성을 허용한다. 이렇게 부분입체선택적으로 합성된 뉴클레오타이드간 포스포티오에이트 연결은 안티센스 약물 또는 면역자극 약물로서의 포스포티오에이트 사용에 대한 기대효과를 가진다.

탈양성자화된 산류 B^-의 적합한 예로는 트리플루오로아세테이트, 트리플레이트, 디클로로아세테이트, 메실, 토실, o-클로로페놀레이트가 있다. pKa 4.5 미만의 산류가 바람직하다. 바람직하게, 이들은 낮은 친핵성을 띤다.

일 구현예에서, 본 반응은 반응매질을 건조시키기 위해 분자체의 존재하에서 수행된다. 일반적으로, 물은 차단시키거나 건조 매체에 의해 반응 동안에는 고정시킨다.

본 발명의 활성화제 I을 포스피틸화제와 조합하고, 그 이후에 하이드록실 성분을 첨가하는 것이 가능하다. 활성화제 I와 하이드록실-함유 화합물을 조합하고, 그 이후에 포스피틸화제를 첨가하는 것 역시 가능하다.

첨가제를 사용하는 경우에, 활성화제는 포스피틸화제가 첨가되기 이전에 히드록시 성분과 혼합된다.

활성화제의 "in situ" 발생을 위해서는, 제어된 반응 온도하에서 첨가제를 첨가한 이후에, 선택된 산을 첨가하는 것이 바람직하다.

포스피틸화제는 선택된 산의 첨가 이전 또는 이후에 첨가할 수 있다.

산 및 포스피틸화제의 첨가와 관련하여, 뉴클레오사이드 성분은 마지막에 또는 초기에 첨가할 수 있다.

바람직한 일 구현예에서, 활성화제의 대응 염기, 하이드록실-함유 화합물 및 포스피틸화제를 조합하고, 산을 첨가하여 반응을 개시한다.

다음으로는 포스피틸화 화합물(포스포아미다이트)을 활성화제 II의 존재하에서 뉴클레오사이드의 하이드록실기, 뉴클레오타이드의 하이드록실기 또는 올리고뉴클레오타이드의 하이드록실기에 결합한다.

전술된 바와 같이 화합물이 반응된 이후에, 제조된 트리에스테르는 산화된다. 산화반응은, 예를 들어 안정적인 포스페이트 또는 티오포스페이트 결합을 형성하는데 사용될 수 있다.

본원에서 사용되었듯이, 올리고뉴클레오타이드는 또한 RNA 및 DNA 형태로, 올리고뉴클레오사이드, 올리고뉴클레오타이드 유사체, 개질된 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 모방체 및 이와 유사한 것을 포함한다. 일반적으로 이러한 화합물은 연결된 단량체성 하부단위의 골격을 포함하며, 여기서 각 연결된 단량체성 하부단위는 직접 또는 간접적으로 헤테로사이클릭 염기 잔기에 부착된다. 단량체성 하부단위를 잇는 연결, 단량체성 하부단위 및 헤테로사이클릭 염기 잔기는 구조상 다양하므로, 결과적으로 생성된 화합물에 대해 다수의 모티프들을 야기할 수 있다.

본 발명은 특히 화학식 X_n(여기서, 각 X는 A, dA, C, dC, G, dG, U, dT 중에서 선택되며 n = 2 내지 30, 바람직하게는 2 내지 12, 더 바람직하게는 2 내지 8 또는 2 내지 6)를 갖는 올리고뉴클레오타이드 및 보호기를 포함하는 이들 유도체의 합성에 유용하다. 당업계에 공지된 수정예는 헤테로사이클릭 염기, 당 또는 단량체성 하부단위를 잇는 연결에 있어서의 수정이다. 뉴클레오타이드간 연결의 변형예는 예를 들어 참고문헌으로 포함된 WO 2004/011474의 11쪽 하단부터 기재되어 있다.

통상적 유도체로는 포스포티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸 및 알킬 포스포네이트 및 포스포노아세토 유도체가 있다.

추가적으로 통상적인 수정예는 당 잔기에 있어서의 수정이다. 리보스가 상이한 당으로 치환되거나, 하나 이상의 위치에서 다른 기(예컨대 F, O-알킬, S-알킬, N-알킬)로 치환된다. 2'-메틸 및 2'-메톡시에톡시가 바람직한 구현예들이다. 이러한 모든 수정예들은 당업계에 공지되어 있다.

헤테로사이틀릭 염기 잔기와 관련하여, 당업계에서 사용되는 다수의 기타 합성 염기류에는, 예를 들어 5-메틸-시토신, 5-히드록시-메틸-시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6- 또는 2-알킬 유도체, 2-티오우라실이 있다. 이러한 변형예들 또한 WO 2004/011474의 21쪽부터 기재되어 있다.

합성에 사용시, 이들 염기류는 보통 보호기, 예를 들어 N-6-벤질아데닌, N-4-벤질시토신 또는 N-2-이소부티릴 구아닌을 가진다. 일반적으로, 추가적인 반응에서 반응하지 말아야 하는 모든 반응기들, 특히 당의 하이드록실기는 보호되어야 한다.

올리고뉴클레오타이드의 합성과 관련된 구현예들에서, 반응매질 또는 기타 용매에 대한 공용매(co-solvent)로서 사용될 수 있는 알데하이드류 또는 케톤류의 존재하에서 반응을 수행하는 것이 유용하다.

에놀을 형성할 수 있는 화합물이 적합한 화합물이다. 통상적으로 이러한 화합물들은 화학식 R₁R₂C = O 을 가지며, 여기서 R₁ 및 R₂는 독립적으로 H 또는 단독으로 사이클릭 구조를 형성할 수 있는 1 내지 20 개의 탄소 원자들로 구성되어 있거나, R₁ 및 R₂는 함께 사이클릭 구조(system)를 형성하되 이 경우 R₁ 및 R₂ 모두가 H는 아니다. 매우 바람직한 케톤은 아세톤이다. 아세톤의 존재로 인해, 포스피틸화 공정 도중 분리되는, 디이소프로필아민(DIPA) 같은 임의량의 아민 활성이 중지된다. 이는 더 짧은 그리고 더 긴 올리고뉴클레오타이드의 포스피틸화에 사용되어 유사한 결과(분해가 안됨)를 가져올 수 있다. 예를 들어 아민의 존재하에서 에놀레이트를 형성할 수 있는 한, 화학식 R_x-C(=O)-R_y(식에서, R_x 및 R_y는 독립적으로 C₁-C₆ 알킬이거나, 함께 사이클로알킬을 형성)을 가지는 기타 케톤 화합물이 또한 사용될 수 있으며, 이는 α-위치에 CH₂-기를 가진다.

도 1은 본 발명에 따른 반응 도식을 보여주는 도면.

도 2는 본 발명에 따른 바람직한 반응 도식을 보여주는 도면.

하기의 비제한적 실시예들에 의해 본 발명을 더 상세히 설명하기로 한다.

실시예 1

5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-N-이소부티릴-2'-데스옥시구아노신(d-G-OH) 및 N-메틸이미다졸리움 트리플루오르아세테이트(MIT)를 아세톤 및 디클로로메탄(1:1)에 용해시키고 분자체를 첨가하였다. 이 현탁액을 디클로로메탄 중의 비스포스(BisPhos) 용액에 실온에서 첨가하고 빠르게 교반시켰다. 아세톤 및 디클로로메탄(1:1) 에 용해된 3'-O-레불리닐-N-이소부티릴-2'-데스옥시구아노신(HO-G-I), 에틸티오테트라졸(ETT) 또는 이미다졸리움 트리플루오르아세테이트(IT, CHK346/06) 및 NMI의 용액을 첨가하였다. 반응의 후속으로 RP-HPLC를 수행하고, 전환이 완료되면 Curox M400을 첨가하였다. 다음으로 RP-HPLC를 수행하고, 전환이 완료되면 정제단계를 수행함으로써 분자체를 제거한 후, 아세톤/디클로로메탄(1:1)으로 세정단계를 수행하였다. 이렇게 얻어진 용액을 MTBE 내로 전달하여 반응 생성물을 침전시켰다. 침전물을 정제하고, MTBE로 세정하고, 40 ^oC에서 감압하에 건조시켰다.

Charge	수율(g)	(%)	d-G-OH (mmol)	비스포스 (mmol)	MIT (mmol)	HO-G-I (mmol)	ETT/IT (mmol)
1	17.94	125	15.63	18.73	19.88	12.06	32.78
2	15.46	108	15.63	17.19	1.68	12.06	28.89
3	n.b.	n.b.	1.56	1.72	1.84	1.21	2.23
4	n.b.	n.b.	1.56	1.72	1.84	1.21	2.57
5	n.b.	n.b.	1.56	1.72	1.68	1.21	2.89
6	n.b.	n.b.	1.56	1.72	1.68	1.21	2.89
7	n.b.	n.b.	1.56	1.72	1.68	1.21	2.89
8	n.b.	n.b.	1.56	1.56	1.68	1.41	3.21
9	n.b.	n.b.	1.56	1.40	45.89	1.57	3.21
10	n.b.	n.b.	1.56	1.48	45.89	1.49	3.21
11	n.b.	n.b.	1.56	1.56	40.79	1.57	3.21
12	57.79	124	39.08	42.98	19.88	39.16	80.28
13	45.65	98	39.08	42.98	19.88	39.16	80.28

실시예 2

5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-N-이소부티릴-2'-데스옥시구아노신(d-G-OH) 및 N-메틸이미다졸리움 트리플루오르아세테이트(MIT)를 아세톤 및 디클로로메탄(1:1)에 용해시키고 분자체를 첨가하였다. 빠른 교반조건 하, 실온에서 비스포스를 첨가하고, 아세톤 및 디클로로메탄(1:1)에 용해된 3'-O-레불리닐-N-이소부티릴-2'-데스옥시구아노신(HO-G-I), 이미다졸 및 NMI의 용액 및 디클로로메탄에 용해된 TFA를 적하하였다. 반응의 후속으로 RP-HPLC를 수행하였다. 전환이 완료되면 Curox M400을 첨가하였다. 반응의 후속으로 RP-HPLC를 다시 수행하였다. 전환이 완료되면, 용액을 정제하여 분자체를 제거하고, 아세톤/디클로로메탄(1:1)으로 세정하고, MTBE 내로 전달하여 생성물을 침전시켰다. 이렇게 얻은 생성물을 정제하고, MTBE로 세정하고, 40 ^oC에서 감압하에 건조시켰다.

Charge	수율(g)	(%)	d-G-OH (mmol)	비스포스 (mmol)	MIT (mmol)	HO-G-I (mmol)	이미다졸 (mmol)	TFA (mmol)
14	17.25	120	15.63	18.73	19.88	12.06	32.76	35.00
15	14.94	104	15.63	18.73	19.88	12.06	18.65	43.48
16	20.36	118	15.63	18.73	1.68	14.47	42.58	69.60
17	18.44	129	15.63	18.73	1.68	12.03	43.36	66.91

실시예 3

5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-N-이소부티릴-2'-데스옥시구아노신(d-G-OH) 및 NMI를 아세톤 및 디클로로메탄(1:1)에 용해시키고 분자체를 첨가하였다. 실온에서 비스포스를 적하하고, 디클로로메탄 중의 TFA 용액을 역시 적하하였다. 이 반응에 이어 RP-HPLC를 수행하고, 전환이 완료되면 아세톤 및 디클로로메탄(1:1)에 용해된 3'-O-레불리닐티미딘(HO-T-I) 및 이미다졸 용액을 첨가하였다. 또한, 디클로로메탄 중의 TFA 용액을 적하하였다. 반응의 후속으로 RP-HPLC를 수행하고, 전환이 완료되면 Curox M400을 첨가하였다. 반응의 후속으로 RP-HPLC를 다시 수행하였다. 전환이 완료되면, 용액을 정제하여 분자체를 제거하고, 아세톤/디클로로메탄(1:1)으로 세정하고, MTBE 내로 전달하여 생성물을 침전시켰다. 이렇게 얻은 생성물을 정제하고, MTBE로 세정하고, 40 ^oC에서 감압하에 건조시켰다.

Charge	수율(g)	(%)	d-G-OH (mmol)	비스포스 (mmol)	NMI/TFA (mmol)	HO-G-I (mmol)	이미다졸/TFA (mmol)
18	18.30	116	15.63	17.13	31.23/ 20.19	14.39	39.22/ 46.45
19	19.46	124	15.63	17.13	31.23/ 20.19	14.37	39.22/ 46.45

Claims (15)

1. a) 하기 화학식

   

   (식에서,

   B는 헤테로사이클 기재이고

   i) R₂는 H, 보호된 2'-하이드록실기, F, 보호된 아미노기, O-알킬기, O-치환된 알킬, 치환된 알킬아미노 또는 C4'-O2' 메틸렌 결합이고,

   R₃는 OR'₃, NHR''₃, NR''₃R'''₃, 여기서 R'₃은 하이드록실 보호기, 보호된 뉴클레오타이드 또는 보호된 올리고뉴클레오타이드이고, R''₃ 및 R'''₃은 독립적으로 아민 보호기들이고,

   R₅는 OH

   또는

   ii) R₂는 H, 보호된 2'-하이드록실기, F, 보호된 아미노기, O-알킬기, O-치환된 알킬, 치환된 알킬아미노 또는 C4'-O2' 메틸렌 결합이고,

   R₃는 OH 이고

   R₅는 OR'₅, 여기서 R'₅은 하이드록실 보호기, 보호된 뉴클레오타이드 또는 보호된 올리고뉴클레오타이드

   또는

   iii) R₂는 OH 이고

   R₃는 OR'₃, NHR''₃, NR''₃R'''₃, 여기서 R'₃은 하이드록실 보호기, 보호된 뉴클레오타이드 또는 보호된 올리고뉴클레오타이드이고, R''₃ 및 R'''₃은 독립적으로 아민 보호기들이고,

   R₅는 OR'₅, 여기서 R'₅은 하이드록실 보호기, 보호된 뉴클레오타이드 또는 보호된 올리고뉴클레오타이드)

   을 가지는 하이드록실-함유 화합물을 제공하는 단계:

   b) 하기 화학식 I(활성화제 I)

   

   (식에서,

   R = 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬, 헤테로아릴이고

   R₁, R₂ = H 이거나, 또는 함께 5 내지 6-원 고리를 형성하고,

   X₁, X₂ = 독립적으로 N 또는 CH 이고,

   Y = H 또는 Si(R₄)₃ 이고, 여기서 R₄ = 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬, 헤테로아릴이고,

   B^- = 탈양성자화 산)

   을 가지는 활성화제의 존재하에서 a) 단계에서의 상기 화합물과 포스피틸화제를 반응시켜 포스피틸화 화합물을 제조하는 단계: 및

   c) 이미다졸, 이미다졸리움 염류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 활성화제 II의 존재하에서, 단리가 안된 상기 포스피틸화 화합물과 하기 화학식

   

   (여기서 R₅, R₃, R₂ 및 B는 독립적으로 선택되되, 상기에 정의된 바와 같음)을 가지는 제 2 화합물을 반응시키는 단계

   를 포함하는, 올리고뉴클레오타이드의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 화학식 I의 상기 활성화제는

   

   (식에서, Y는 제 1 항에서와 같이 정의되고, R은 메틸, 페닐 또는 벤질)

   으로 이루어진 군에서 선택되는 화학식을 가지는, 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 포스피틸화제는 하기의 화학식 II

   

   (식에서, Z는 이탈기를 나타내고, R₁ 및 R₂는 독립적으로 2차 아미노기임)

   을 가지는, 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스피틸화제는 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트인, 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈양성자화 산은 트리플루오로아세트산, 디클로로아세트산, 메탄 설폰산, 트리플루오르메탄 설폰산, o-클로로페놀레이트로 이루어진 군에서 유도되는, 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 아세톤의 존재하에서 이루어지는, 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스피틸화제는 상기 하이드록실-함유 화합물 내 하이드록실기의 1.0 내지 1.2 몰/몰의 양으로 사용되는, 방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스피틸화제는 상기 하이드록실-함유 화합물 내 하이드록실기의 3 내지 5 몰/몰의 양으로 사용되는, 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항의 단계 b) 이후에 폴리머 알콜을 첨가하는, 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머 알콜은 폴리비 닐 알콜인, 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈양성자화 산은 트리플루오로아세트산, 디클로로아세트산, 메탄 설폰산, 트리플루오르메탄 설폰산(트리플레이트), o-클로로페놀레이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 유도되는, 방법.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 아세톤의 존재하에서 이루어지는, 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 반응매질의 적어도 95% (w/w)이 아세톤인, 방법.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 단계 c)의 상기 제 2 화합물의 1 몰당 0.5 몰 미만의 테트라졸 또는 테트라졸 유도체를 포함하는, 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 단계 c)의 상기 제 2 화합물의 1 몰당 0.1 몰 미만의 테트라졸 또는 테트라졸 유도체를 포함하거나, 테트라졸 또는 테트라졸 유도체를 전혀 포함하지 않는, 방법.

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