AT397512B - Biosensor sowie verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

AT 397 512 B

Die Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor zur selektiven Bestimmung von enzymatisch umsetzbaren Substanzen, wie z. B. Glucose, mit auf einem inerten Träger angeordneten Elektroden undan einer Polypyrrolschicht immobilisierter Oxidase, wie z. B. Glucoseoxidase (GOD), sowie auf ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Biosensors. Für die Herstellung von Biosensoren ist es bekannt, auf einen mit Elektroden ausgestatteten Träger Enzyme, Coenzyme od. dgl. zu immobilisieren, welche in der Folge die gewünschte Umsetzung derjenigen Substanz bewirken, deren Konzentration gemessen werden soll. Prinzipiell können Biosensoren beispielsweise als resisüve, kapazitive oder eine von der Konzentration abhängige Spannung bzw. einen von der Konzentration abhängigen Strom liefernde Sensoren eingesetzt werden. Zur Immobilisierung von Enzymen bzw, Coenzymen sind eine Reihe von Verfahren bekanntgeworden, bei welchen in der Regel eine Derivatisierung des Trägers zur Herstellung kovalenter Bindungen mit dem Enzym bzw. Coenzym erforderlich ist. Im speziellen Fall der Glucoseoxidase ist es bereits bekannt, die mit Elektroden ausgestatteten Träger mit einer Polypyrrolschicht zu überziehen, welche elektrisch leitfähig ist und bei welcher in der Regel zur Erhöhung der Redoxaktivität, Redoxmediatoren, wie Ferrocen, verwendet wurden. Das auf derartig beschichteten Trägem immobilisierte Enzym bildete im Fall der Glucoseoxidase entweder mit Glucose Wasserstoffperoxid als Metaboliten, welches auf Grund der Redoxaktivität rasch in Sauerstoff und Wasser zersetzt wurde oder durch Elektronentransfer von FADH2 über Ferrocen auf der Elektrodenoberfläche freie Elektronen, wobei die Elektronen über das elektrisch leitfähige Beschichtungsmaterial zu den Elektroden abgeleitet wurden und entsprechend einer Messung zugeführt werden konnten. Derartige Biosensoren zur Messung von Glucosekonzentrationen sind allerdings auf Grund der hohen Redoxaktivitäten in hohem Maße störangsanfällig, und auch andere Substanzen, welche in derartigen Redoxvorgängen Elektronen liefern können, wie beispielsweise Ascorbinsäure und Glutathion aber auch Luftsauerstoff, können zu einer mehr oder minder starken Verzerrung des Meßwertes und im besonderen des gemessenen Stromes fuhren.

Eine wesentliche Voraussetzung für die Langzeitstabilität derartiger Biosensoren besteht u. a. darin, daß die immobilisierten Enzyme und Coenzyme ohne Aktivitätsverlust getrocknet werden können. Für die Ausbildung der erforderlichen Leitfähigkeit zum Abtransport der bei der Redoxreaktion gebildeten Elektronen sind in der Regel Substituenten mit konjugierten Doppelbindungen erforderlich, welche gleichzeitig die Redoxaktivität und damit die Störungsanfälligkeit für Fremdsubstanzen erhöhen.

Die Erfindung zielt nun darauf ab, einen Biosensor der eingangs genannten Art zu schaffen, welcher sich durch eine verringerte Störungsanfälligkeit gegenüber redoxsensiblen Substanzen, wie Ascorbinsäure und Glutathion, auszeichnen und gleichzeitig eine über weite Konzentrationsbereiche lineare und reproduzierbare Ansprechcharakteristik aufweisen. Im besonderen zielt die Erfindung darauf ab, einen Biosensor zur selektiven Bestimmung bestimmter, von einem bestimmten Enzym umsetzbarer Substanzen zu ermöglichen, ohne daß andere denkbare Redoxvorgänge das Ergebnis nennenswert beeinflussen. Zur Lösung dieser Aufgabe besteht die Erfindung im wesentlichen darin, daß die Polymerschicht wenigstens eine permselektive, poröse Schicht aus N- oder 3-substituiertem Polypyrrol enthält, deren Substitution so gewählt ist, daß die Redoxaktivität und gegebenenfalls die Leitfähigkeit gegenüber Polypyrrolschichten wesentlich verringert ist. Dadurch, daß eine permselektive, poröse Schicht aus N- oder 3-substituiertem Polypyrrol verwendet wird, kann auf Grund der Substitution sowohl die Redoxaktivität als auch die Leitfähigkeit wesentlich herabgesetzt werden. Die Herabsetzung der Leitfähigkeit führt hiebei dazu, daß der bisher in Biosensoren zur Bestimmung der eingangs genannten Substanzen verwendete Mechanismus der Elektronenleitung im Anschluß aneineRedoxzersetzung von ^C^bzw.der direkte Elektronentransfer mitHilfe von Mediatoren nicht verwendet wird. Für die gemessenen Werte ist somit im vorliegenden Fall nicht unmittelbar das Redoxpotential des Metaboliten am Polypyrrol, sondern die Diffusion von H2O2 durch die permselektive, poröse Schicht von Bedeutung, wobei die Zersetzung in der Folge unmittelbar an den Elektroden stattfindet, wodurch die Störeinflüsse durch andere denkbare Redoxvorgänge wesentlich herabgesetzt werden. Es wird somit insgesamt tatsächlich ausschließlich die von der jeweiligen Oxidase erzeugte H202-Konzentration für den Meßvorgang bestimmend, und die H202-Konzentration ist bei gegebener Oxidase ein repräsentativer und selektiv der zu bestimmenden Substanz zuordenbarer Konzentrationswert, welcher zur Erzielung eines entsprechenden Meßwertes herangezogen werden kann. Die in der genannten Weise substituierte permselektive, poröse Polypyrrolschicht weist hiebei nicht nur eine konventionell, nicht mehr ohne weiteres meßbare Redoxaktivität und daher ein sehr rasches Einschwingverhalten der Elektrode auf, sondern hat auf Grund ihrer deutlichen Verringerung der Leitfähigkeit bereits dann Vorteile, wenn in weiter außen liegenden Schichten dennoch Redoxvorgänge beliebiger Art stattfinden, solange derartige Redoxvorgänge nicht zur Freisetzung von H2O2 fuhren, wie dies durch Oxidasen bewirkt wird. Erfindungsgemäß ist es somit ausreichend, wie es einer bevorzugten Ausführungsform entspricht, daß die Ausbildung so getroffen ist, daß eine poröse, elektrisch isolierende Zwischenschicht aus N- und/oder 3-substituiertem Polypyrrol angeordnet ist, wobei naturgemäß Redoxvorgänge störender Art, wie beispielsweise Redoxvorgänge mit Ascorbaten oder Glutathion, bereits dadurch nachhaltig verhindert werden können, daß diejenige Schicht, an welcher die Oxidase immobilisiert ist, unter Einsatz- bzw. Meßbedingungen keine nennenswerten Redoxaktivitäten mehr aufweist. Insgesamt ist mit Rücksicht auf die gewünschte Diffusion von H2O2 zu den Elektroden für die Erzielung -2-

10 AT 397 512 B 15 20 25 30 35 40 45 50 hoher Empfindlichkeiten eine möglichst dünne Trägeizwischenschicht für die Immobilisierung der Oxidasen erstrebenswert, wobei dadurch, daß diese Zwischenschicht als poröse, permselektive Membran ausgebildet ist, mit geringen Schichtstärken das Auslangen gefunden werden kann. Die Polymerisation von Polypyrrolen, welche in der erfindungsgemäßen Weise substituiert wurden, gestaltet sich naturgemäß mitRücksicht auf die deutlich verringerte Leitfähigkeit auf elektrochemischem Wege relativ schwierig, und es können Homopolymere aus derartigen substituierten Polypyrrolen in der Regel nur in extrem dünner Schichtstärke aufgetragen werden. Wenn im Hinblick auf die gewünschte Immobilisierung der relativ großen Enzyme sowie deren Coenzyme eine bestimmte Schichtstärke angestrebt wird, wird es in der Regel erforderlich sein, diese Schichtstärke durch Abscheidung eines Copolymers aus unsubstituiertem Pyrrol und substituierten Pynolen aufzubauen. Eine derartige Copolymerschicht hat in der Folge Vorteile in bezug auf die Immobilisierung der Enzyme. Bedingt durch die Gefahr, daß eine derartige Copolymerschicht jedoch eine höhere Leitfähigkeit und gegebenenfalls auch noch eine meßbare Redoxaktivität aufweisen kann, empfiehlt es sich in solchen Fällen, zumindest eine, wenn auch relativ dünne Schicht aus Homopolymeren mit den für die Herabsetzung derRedoxaktivität bzw. Leitfähigkeit erforderlichen Substituenten abzuscheiden. Mit Vorteil wird daher der erfindungsgemäße Biosensor so ausgebildet, daß auf der Elektrode Homopolymere und Copolymere aus substituiertem Polypyrrol in wenigstens zwei Schichten aufgebracht sind. Für die Immobilisierung von Oxidasen an Polypyrrolen und insbesondere für die Ausbildung kovalenter BindungenzwischendenEnzymenundCoenzymensowiederTrägerschichtsindSubstituenten,wieCarboxylgruppen undNOj-Gruppen, prinzipiellbekannt. MitRücksichtaufdiebisherige Aufgabenstellung, dieelektrischeLeitfähigkeit hoch zu halten und die Redoxaktivität zu begünstigen, wurde das Ausmaß einer derartigen Substitution in der Regel auf dasjenige Ausmaß beschränkt, welches für die sichere Immobilisierung erforderlich war. Prinzipiell sind auch Carboxylgruppen und hTC^-Gruppen geeignet, die Leitfähigkeit und die Redoxaktivität des Polypyrrols herabzusetzen, wobei eine signifikante Erhöhung der Selektivität der Bestimmung von durch Oxidasen äbbaubaren Substanzen allerdings erst dann eintritt, wenn das Ausmaß einer derartigen Carboxylierung bzw. Nitrierung weit über das Ausmaß hinausgeht, welches für die Immobilisierung des Enzymes erforderlich wäre. Erfindungsgemäß werden zum Zwecke der Herabsetzung der Redoxaktivität und der Leitfähigkeit sowie zum Zwecke der Erleichterung der Immobilisierung von Enzymen am Träger bevorzugt Carboxy-substituierte Polypyrrole aufgebracht. Da insgesamt ein linearer Zusammenhang der Glucosekonzentration mit dem gemessenen Strom bei den erfindungsgemäß erzielbaren geringen Schichtstärken mit einem modifizierten N-Alkylpolypyrrol üblicherweise im Bereich von 0 Ws 9 mM als linear anzusehen ist, kann es wünchenswert werden, zur Bestimmung größerer Konzentrationen die Empfindlichkeitskurve insgesamt zu verschieben, was dadurch gelingt, daß die Ausgestaltung so getroffen ist, daß das Enzymimmobilisat mit einer peimselektiven Membrane abgedeckt ist. Die zusätzliche permselektive Membran geht zu Lasten der Empfindlichkeit, wodurch insgesamt der lineare Bereich in Richtung höherer Konzentrationen verschoben wird. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines derartigen Biosensors ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß das N- und/oder 3-substituierte Monomer elektrochemisch auf den die Elektroden aufweisenden Träger abgeschieden wird. Die elektrochemische Abscheidung führt zum Aufbau definierter und kontrollierbarer Schichtstärken, wobei allerdings, wie bereits erwähnt, die schlechte Leitfähigkeit der Monomere hier Grenzen in der auftragbaren Schichtstärke mit sich bringt. Neben einer elektrochemischen Abscheidung sind die Biosensoren in vorteilhafter Weise auch durch Abscheidungaus derGasphase herstellbar, wobei wenigstensein zu polymerisierendes Pyrrol mit Hilfe eines Oxidationsmittels, insbesondere Brom bei Drücken zwischen 1.10*^ und 0,1 mbar und Temperaturen zwischen -40 und +20 °C auf dem die Elektroden aufweisenden Träger abgeschieden wird. Im Falle von extrem schlechter Leitfähigkeit, wie sie erfindungsgemäß angestrebt wird, können durch Abscheidung aus der Gasphase größere, jedoch nicht so gut kontrollierbare Schichtstärken hergestellt werden. Der Aufwand für eine derartige, aus der Gasphase vorgenommene Abscheidung ist allerdings relativ groß, da der Dampfdruck des abzuscheidenden Pyrrols mit jenem des Oxidationsmittels bei dem Abscheidevorgang übereinstimmen muß. Jedoch bietet das Verfahren die Möglichkeit, auch auf nicht leitenden Unterlagen gut haftende Polymerschichten abzuscheiden. Derartige, durch Abscheidung aus der Gasphase beschichtete Elektroden können in der Folge in der Gasphase mit Hilfe eines Sauerstoffplasmas strukturiert bzw. geätzt werden. Um auch auf elektrochemischem Wege eine entsprechende Mindestschichtstärke bzw. eine entsprechende mikroporöse Struktur sicher zu erreichen, kann die Abscheidung in mehreren Schichten erfolg«), wobei abwechselnd Mono- und Copolymere abgeschieden werden können, insbesondere im Falle der Copolymere kann eines der Monomere unsubstituiertes Pyrrol oder Methylpyrrol sein, wodurch die Abscheidung größerer Schichtstärken auf elektrochemischem Wege erleichtert wird. 4-(3-Pyrrolo)-4-ketobuttersäure 3-((Hydroxy 4-Nitrophenyl) methyl) pyrrol 3-((Keto 4-Nitrophenyl) methyl) pyrrol -3- 55 5

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Zur Erzielung der gewünschten mikroporösen, permselektiven Struktur mit einer für eine Membran hinreichenden Schichtstärke und sterisch besonders günstigen Voraussetzungen für die Immobilisierung der gewünschten Mindestmenge an Enzym kann mit Vorteil so vorgegangen werden, daß die elektrochemische Abscheidung in wenigstens zwei aufeinanderfolgenden Schritten erfolgt, wobei in wenigstens einem Schritt die Abscheidung eines Homopolymers mit substituierten Pyrrolen vorgenommen wird. Eine besonders gute Reproduzierbarkeit der aufzutragenden Schichtstärke läßt sich hiebei dadurch erzielen, daß die elektrochemische Abscheidung unter Anwendung eines Cyclovoltametrischen Verfahrens vorgenommen wird, wobei insbesondere unter Anwendung einer Spannungsänderung von 50 - 200 mVs'\ vorzugsweise etwa 100 mVs'K gearbeitet werden kann. Das Cyclovoltametrische Verfahren kann bevorzugt im Spannungsbereich von -500 mV bis +1800 mV durchgeführt werden, wodurch auch im Falle leicht leitender Monomere eine relativ rasche und den Erfordernissen entsprechend homogene Abscheidung größerer Schichtstärken gelingt

Insgesamt wird auf diese Weise ein Biosensor mit hoher Selektivität und geringer Störungsanfälligkeit geschaffen, welcher abweichend von den bekannten Biosensoren auf Polypyrrolbasis ein anderes Meßprinzip anwendet und insbesondere die Messung störende Zusätze, wie Redoxmediatoren, keinesfalls enthält.

Besonders vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen und den Zeichnungsfiguren näher erläutert.

Beispiel 1

Herstellung eines Polvnvrrol-Biosensors 20 Al Herstellung der Elektroden

Glasblättchen einer Dicke von 100 bis 300pm wurden gereinigt und dienten alsTrägermaterial für dieElektroden. Im Hochvakuum wurde eine 50 bis 100 nm dicke Metallschicht (Ti, Pt, Pd, Au oder Rh) auf den Glaskörper aufgedampft Die Metallschichten wurden anschließend strukturiert mit 3 pm dicken Siliziumnitridschichten isoliert und geätzt 25

Bl Reinigung der Elektrode

Eine nach dem beschriebenen Verfahren hergestellte Pt-Elektrode mit einer Oberfläche von 0,64 mm2 wurde in destilliertem Wasser mit Ultraschall gereinigt mit Aceton abgespült und unter staubfreien Bedingungen getrocknet Die Elektrode wurde anschließend in eine Lösung von 2,5 % L1CIO4 in Acetonitril getaucht und unter Verwendung 30 einer Elektrodenkonfiguration mit 3 Elektroden gegen Ag/AgCl einer cyclischen Spannungsänderung zwischen -500 und +1800 mV unterworfen. Die Spannung wurde hiebei jeweils um 100 mV pro Sekunde geändert Die Pt-Elektrode wird 5 derartigen voltametrischen Zyklen unterworfen. CI Beschichten mit substituierten Polvpvrrolen 35 Eine 0,5%-ige Lösung der folgenden Verbindung:

N-CH2-C-NH-CH2-COOH 40 45 50 in einer Mischung aus Acetonitril und Dimethylsulfoxid, welches zusätzlich 2,5 % L1CIO4 enthielt wurde mehrere Stunden über Na2SC>4 oderCaC^ getrocknet Die klare Lösung wurde in eine Glaszelle gefüllt und 10min mit Argon gespülL Die wie unter B) gereinigte Pt-Elektrode wurde in die Lösung eingebracht und das System wurde 30 Spannungszyklen zwischen -300 und +1600 mV mit einer Spannungsänderung von 100 mV pro Sekunde unterworfen. Nach Beendigung des Abscheidungsverfahrens konnte eine dünne, braune Polymerschicht auf der Elektrode beobachtet werden.

Auf analoge Weise konnten auch Polymerbeschichtungen der folgenden Verbindungen auf der Pt-Oberfläche erfüllten werden: l-(Q-Carboxymethyl) - pyrrol 1 -(Ω-Carboxyethyl) - pyrrol, 55 1 -(Ω-Carboxypropy 1) - pyrrol l-(ß-Carboxypentyl) - pyrrol 1 -(Ω-Carboxydecy 1) - pyrrole l-(l,3-Dicarboxypropyl) - pyrrol -4-

AT397512B 1- ((1-Carboxy 3-methyl)butyl) - pyrrol 2- (l-Pyirolo) - acetylglycin 1-Dodecylpyrrol l-(4-Carboxybenzyl) - pyirol 5 l-(4-Nitrophenyl) pyrrol l-(4-Caiboxyyphenyl) pyrrol 3- Carboxymethyl-4-methyl-pyirol 4- (3-Pyrrolo)-4-hydroxybuttersäure 4-(3-PjTrolo)-4-ketobuttersäure 10 3-((Hydroxy 4-Nitrophenyl) methyl) pyrrol 3-((Keto 4-Nitrophenyl) methyl) pyrrol wobei als Leitsalz auch NR4BF4 oder NR4PFg, worin R H, Methyl, Ethyl oder Butyl bedeutet, eingesetzt werden konnte. Die Anzahl der Spannungszyklen konnte zwischen 10 und 30 variiert werden. 15 D) Beschichten mitcoDolvmerisierten. substituierten Pvrrolen Über dieunterC) beschriebene Schichtaus polymerisierten, substituiertenPyrrolen wird eine weiterecopolymere Schicht aus Pyrrol und dem unter C) angeführten substituierten Pyrrol aufgebracht. Zu einer der unter Q beschriebenen Lösung entsprechenden Lösung des substituierten Pyrrols werden 0,05 % Pyrrol zugesetzt und diese 20 Lösung wurde 10 Spannungszyklen zwischen -300 und +1200 mV mit einer Spannungsänderung von 100 mV pro Sekunde unterworfen. Nach Beendigung des Verfahrens konnte eine dunkel gefärbte Polymerschicht mit variabler Dicke auf der Elektrode beobachtet werden. Die beobachtete Polymerschicht bestand hiebei aus einem Copolymer aus substituiertem Pyrrol und aus unsubstituiertem Pyrrol, wobei das Verhältnis Pyrrol zu substituiertem Pyrrol in dem Copolymer etwa 10:1 betrug. 25 Auf analoge Weise konnten auch Copolymere aus Methylpyrrol und den unter C) angeführten substituierten

Polypyrrolen erhalten werden.

El Kopplung der Enzyme

Die Polypyrrol-beschichteten Elektroden wurden 60 min bei 25 °C ohne Rühren oder Schütteln in eine gesättigte 30 Lösung von N-CycIohexyl-N'-[2-(N-methylmoipholino)-ethyl]-carbodiimid-4-toluolsulfonat eingebracht. Danach wurden die Elektroden mehrmals mit Wasser gespült und sofort anschließend mit ein«1 Lösung, welche 5 mg/iml Glucoseoxidase, in einem Phosphatpuffer (pH=7,0; 0,1 M) enthielt, 2 h umgesetzt. Die so erhaltenen Biosensoren wurden mit Pufferlösung und Wasser gespült und bei 4 °C gelagert.

Auf analoge Weise konnten folgende Enzyme an die mit Polypyrrol beschichtete Elektrode gekoppelt warten: 35 Galactoseoxidase, Aminosäureoxidase, Xanthinoxidase, Cholesterinoxidase und Ascorbatoxidase und gekoppelte Enzymsysteme.

EmeschematischeZeichnungeineserhaltenenPynol-N-Buttersäurepyrrol-CopolymersmitanderCarboxylgruppe der Buttersäure gekoppeltem Enzym ist in Fig. 1 dargestellt. 40 Ft Aufbringen einer Deckschicht auf die Biosensoren

Um die Empfindlichkeit des Biosensors herabzusetzen und gleichzeitig den Meßbereich des Biosensors zu eihöhen, kann eine Deckschicht auf den Biosensor aufgebracht werden. 1 ml einer Lösung eines perfluorierten und sulfonierten Polymers wurde durch Zusatz von 20 μΐ Triethylamin und 25 pl Essigsäure gepuffert. Die Biosensoren wurden entweder durch Eintauchen in die Lösung oder durch 45 Aufsprühen der Lösung auf die Oberfläche der Biosensoren beschichtet Anschließend wurden die Biosensoren 30 min bei Raumtemperatur getrocknet und dann wieder bei 4 °C gelagert.

Beispiel 2

Polymerisation von Pvrrol durch Gasphasenabscheidung 50 Entsprechend dem Verfahren der Schritte A) und B) von Beispiel 1 vorbereitete, mit Gold beschichtete

Elektroden wurden in eine Glas-Vakuumkammer eingebracht, Brom und das Gemisch aus substituiertem Pynol und Pyrrol wurden jeweils in getrennten Kammern 10 min auf -180 °C gekühlt und die gesamte Apparatur wurde evakuiert (1,3.10"^ mbar). Alle Ventile des Systems wurden geschlossen und die Pyrrolkammer kontrolliert auf 0 °C aufgewärmt. Gleichzeitig wurde die Brom enthaltende Kammer auf -30 °C gebracht. Indem abwechselnd ein 55 Brom- und Pyrroldruck in der V akuumkammer aufgebaut wurde und zwischen jedem Druckaufbau evakuiert wurde, konnten qualitativ hochwertige Schichten von Pyrrol-Copolymeren auf der Elektrode erhalten werden.

Auf analoge Weise können sowohl Homopolymere als auch verschiedene Copolymere Schichten abgeschieden werden. -5-

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Beispiel 3

Herstellung der substituierten Pvrrole durch Phasentransferkatalvse 0,05 M Pyrrol in 20 ml Dichlormethan und 8 g KOH werden mit 10 ml einer 10 % wäßrig«! Lösung von Tetramethylammoniumhydroxid versetzL Zu dieser Mischungwird unter heftigemRühien langsam eineO,05 molare Lösung von Br-OE^-CHlXK^H^ (1-Bromacetacetal) in 40 ml Dichlormethan hei Raumtemperatur zugetropft. Während dem Reaktionsäblauf tritt eine leichte Gelbfärbung auf. Nach Beendigung der Reaktion wird die wäßrige Phase abgetrennt, das Lösungsmittel der organischen Phase sowie nicht umgesetzte Ausgangsmaterialien unter vermindertem Druck abgezogen.

Beispiel 4 0,05 M Dimethoxytetrahydrofuran und 0,05 M 4-Methylaminobenzoesäure werden gemeinsam mit 30 ml Essigsäure 30 min bei 70 °C auf dem Wasserbad gerührt Während der Reaktion tritt hiebei eine leichte Braunfärbung auf. Nach Ablauf der Reaktionszeit wird die Reaktionsmischung äbkühlen gelassen und zum Auskristallisieren des Produktes über Nacht auf einer Temperatur von etwa 5 °C gehalten. Anschließend werden die abgeschiedenen Kristalle abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Das Produkt konnte in nahezu quantitativer Ausbeute erhalten werden.

In der beiliegend«! Zeichnung sind in Hg. 2 Meßwerte, welche mit einem Monolayer-Biosensor nach dem Stand der Technik und welche mit einem erfindungsgemäßen Biosensor erhalten werden, verglichen. Auf der Ordinate ist jeweils der gemessene Strom in nA angegeben. Das an den beiden Elektroden immobilisierte Enzym war jeweils Glucoseoxidase und es sollte daher in einer 0,1M Phosphatpufferlösung bei 25 °C und einem Potential von 500 mV der Glucosegehalt der Lösung gemessen werden. Beide Lösungen enthielten jeweils 4 mM/1 Glucose, 1 mM/1 Glutathion, 10 mg/1 Ascorbat und 1 % eines Hefemediums. Mit dem Monolayer-Biosensor (1) wurde eine Antwort von 10 nA für Glucose, von 50 nA für Ascorbat, von 7,3 nA für Glutathion und von 2,3 nA für das Hefemedium gemessen. Daraus folgt, daß das Störsignal, welches auf den Ascorbatgehaltin der Lösung zurückzuführen ist, etwa 5-mal so stark wie das Glucosesignal ist Mit dem erfindungsgemäßen, mit substituiertem Polypyrrol beschichteten Biosensor (2) wurde eine Glucoseantwort von 210 nA, eine Ascorbatantwort von 14 nA, eine Antwort für das Hedemedium von 23 nA und für das Glutathion von 1,7 nA gemessen. Es wird somit mit dem erfindungsgemäßen Biosensor (2) nicht nur ein etwa 10-mal so hohe Antwort für Glucose erhalten, sondern es sind mit Ausnahme des Signals für Glucose auch alle anderen Signale, welche von die Messung störenden Verbindungen stammen, deutlich verringert, womit eine bedeutend genauere Messung des Glucosegehaltes einer Lösung mit dem mit einem substituierten Polypyrrol beschichteten Biosensor (2) ermöglicht wird.

Die im Zuge des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzten substituierten Pyrrole können durch Umsetzung von Pyrrol mit einer Verbindung der Formel RX, worin r -ch2cooh, -(ch2)2cooh, -{CR2)3com, -<ch2)4cooh, -(ch2)5cooh, -(CH2)10COOHf -(C6H4)COOH, -CH(CH)3CH2COOH, “(CH2)2C(CH3)2COOH, -CH2CH(CH3)CH2COOH, -ch(ch3)cooh, -ch/ch(Ch3)2/cooh, -ch/ch2ch(ch3)2/cooh, -CH/CH(CH3)C2H5/COOH, -CH(CH2C6H5)COOH, -{CH2)4CH(NH2)COOH, -CH(CHjOH)COOH, -CH(CH2SH)COOH, -CH(CH3)CONHCH(CH3)COOH, -CH2CONHCH2COOH, -CH2CONHCH(CH3)COOH, -CH2CH(oc2h5)2, -CH2CH(oc2h4)2 ^ -CH2CH(OCH3)2, -CH2CH(oc3h7)2, -CH2CH(oc4h9)2, -CH2CH(OC3H6)2, -CH2CH(OC4Hg)2 oder -CH2CH(OCH2)2 bedeutet und X eine Abgangsgruppe, gewählt aus der Gruppe F, CI, Br, I oder Tosyl bedeutet, mit einem Phasentransferkatalysator und/oder einem Kronenether in Anwesenheit einer starken Base, insbesondere NaOH oder KOH, hergestelltwerden, wobei alsPhasentransferkatalysatoren Tetraalkylammonium salze derFormel[N(R)4]nX, worin η 1 oder 2 bedeutet, die Substituenten R gleich oder voneinander verschieden sein können und geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 20 C-Atomen bedeuten und X F, CI, Br, I, C104, BF4, PFg, S04 oder SO3 bedeutet, eingesetzt werden können. Durch Einsatz derartigerTetraalkylammoniumsalze als Phasentransferkatalysatoren können die gewünschten substituierten Pyrrole in hohen Ausbeuten und ohne die weitere Umsetzung störende Nebenprodukte erhalten werden. Weiters ist es durch Umsetzung der Ausgangsmaterialien miteinem Phasentransferkatalysator oder einem Kronenether möglich, auch säurelabile Substituenten an das Pyrrolmolekül zu binden. -6-

Claims (12)

1. AT 397 512 B Analoge Ergebnisse können bei Einsatz eines Kronenethers zur Herstellung der substituierten Pyrrole erzielt werden, wobei jedoch für diese Umsetzung nur jene Kronenether geeignet sind, in welchen das Kation dar verwendeten starken Base, d. h. insbesondere Na+ oder K+, aufgenommen werden kann. Bei einem anderen Verfahren zur Herstellung der substituierten Pyrrole kann so vorgegangen werden, daß substituierte oder unsubstituierte γ-Aminocarbonsäuren, Aminosäuren oder Peptide mit bis zu 5 Monomereinheiten mit Dimethoxytetrahydrofuran in saurer Lösung umgesetzt werden, wobei als substituierte oder unsubstituierte Aminocarbonsäuren, ß-Aminopropionsäure, γ-Aminobuttersäure, γ-Aminovaleriansäure, ε-Aminocapronsäure, ω-Aminoundecansäure, Aminobenzoesäure, mit F, CI, Br und/oder Methyl substituierte Aminocarbonsäuren, insbesondere 3-Amino-3-methylpropansäure, 2-Fluoraminoessigsäure, 2-Bromaminoessigsäure, y-Amino-2-chlorbutter-säure, Y-Amino-2-fluorbuttersäure, Y-Amino-2-brombuttersäure, ’yLAmino-2,2-dimethylbuttersäure, γ-Amino-2-chlor-2-methylbuttersäure, l-Amino-l,3-propyldicarbonsäure, y-Amino-3-methyIbuttersäure, als die Redoxaktivität vermindernde Substituenten eingesetzt werden können bzw. als Aminosäuren Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Prolin, Lysin, Serin, Cystein und Arginin sowie Derivate dieser Aminosäuren als dieRedoxaktivitätvermindemdeSubstituenten eingesetzt werdenkönnen. Als die Redoxaktivität und die Leitfähigkeit vermindernde Substituenten können, wie oben erwähnt, auch Peptide mit zu 5 Monomereinheiten verwendet werden, welche durch Kondensation von gleichen oder verschiedenen Aminosäuren gewonnen werden können. Als Peptide dieser Art können insbesondere Alanylalanin, Glycylglycin, Alanylglycin, Ala-Ala-Ala, Gly-Ala-Gly und Gly-Gly-Ala, sowie Derivate dieser Peptide eingesetzt werden. Um die Redoxaktivität weiter herabzusetzen, können die Pyrrole auch 2-Buten-substituiert eingesetzt werden, wobei derartige 2-Butene wiederum weitere Substituenten, wie beispielsweise SO3H*, Br“, Pynol, Pyridin, 3-Methylpyridin oder Nicotinamid tragen können. Auch mit 3-Methylpyridin oder Nicotinamid substituiertePyrrole haben eine deutliche Verringerung da* Redoxaktivität gezeigt und sich als brauchbar erwiesen. In besonders vorteilhafter Weise können folgende substituierten Pyrrole als homopolymere Schicht auf den Träger abgeschieden werden: 2- (l-Pyrrolo) - acetylglycin 1-Dodecylpyrrol l-(4-Carboxybenzyl) - pynol l-(4-Nitrophenyl) pyrrol l-(4-Carboxyphenyl) pyrrol
2. 2. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine poröse, elektrisch weitgehend isolierende Zwischenschicht aus N- und/oder 3-substituiertem Polypyrrol angeordnet ist.
3. 3. Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Elektrode Homopolymere und Copolymere aus substituiertem Polypyrrol in wenigstens zwei Schichten aufgebracht sind.

   3- Carboxymethyl-4-methyl-pyrrol 1-o-Toxylpyrrol 1-p-Tosylpyrrol 1-Benzolsulfonylpyrrol 4- (3-Pyrrolo)-4-hydroxybuttersäure PATENTANSPRÜCHE 1. Biosensor zur selektiven Bestimmung von enzymatisch umsetzbaren Substanzen, wiez. B. Glucose, mit auf einem inerten Träger angeordneten Elektroden und an einer Polypyrrolschicht immobilisierter Oxidase, wie z. B. Glucoseoxidase (GOD), dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerschicht wenigstens eine permselektive, poröse Schicht aus N- oder 3-substituiertem Polypyrrol enthält, deren S ubstitution so gewählt ist, daß die Redoxaktivität und gegebenenfalls die Leitfähigkeit gegenüber Polypyrrolschichten wesentlich verringert ist
4. 4. Biosensor nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß Carboxy-substitnierte Polypyrrde aufgebracht sind. -7- AT397 512B
5. 5. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzymimmobilisat mit einer permselektiven Membrane abgedeckt ist.
6. 6. Verfahren zur Herstellung eines Biosensors nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein zu polymerisierendes Pyrrol mit Hilfe eines Oxidationsmittels, insbesondere Brom, bei Drücken zwischen 1.10'^ und 0,1 mbar und Temperaturen zwischen -40 und +20 °C auf dem die Elektroden aufweisenden Träger abgeschieden wird.
7. 7. Verfahren zur Herstellung eines Biosensors nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das N- und/oder 3-substituierte Monomer elektrochemisch auf dem die Elektroden aufweisenden Träger abgeschieden wird.
8. 8. Verfahren nach Anspruch6oder7,dadurch gekennzeichnet,daßfolgendesubstituiertenPyiroleals homopolymere Schicht auf den Träger abgeschieden werden: 2- (l-Pyrrolo) - acetylglycin 1-Dodecylpyirol l-(4-Carboxybenzyl) - pyrrol l-(4-Nitrophenyl) pyrrol l-(4-Carboxyphenyl) pyrrol 3- Carboxymethyl-4-methyl-pyrrol 1-o-Tosylpyrrol 1-p-Tosylpyrrol 1-Benzolsulfonylpyrrol 4- (3-Pyrrolo)-4-hydroxybuttersäure 4-(3-Pyrrolo)-4-ketobuttersäure 3-((Hydroxy 4-Nitrophenyl) methyl) pyrrol 3-((Keto 4-Nitrophenyl) methyl) pyrrol
9. 9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrochemische Abscheidung in wenigstens zwei aufeinanderfolgenden Schritten erfolgt, wobei in wenigstens einem Schritt die Abscheidung eines Homopolymers mit substituierten Pyrrolen vorgenommen wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 7,8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrochemische Abscheidung unter Anwendung eines cyclovoltametrischen Verfahrens vorgenommen wird.
11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daßdascyclovoltametrische Verfahren unter Anwendung einer Spannungsänderung von 50 bis 200 mVs‘\ vorzugsweise etwa 100 mVs'1, vorgenommen wird.
12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daßdas cyclovoltametrische Verfahren im Spannungsbereich von -500 mV bis +1800 mV durchgeführt wird. Hiezu 2 Blatt Zeichnungen -8-