JPH02128152A - 酵素固定化方法及びバイオセンサ - Google Patents
酵素固定化方法及びバイオセンサInfo
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- JPH02128152A JPH02128152A JP63282721A JP28272188A JPH02128152A JP H02128152 A JPH02128152 A JP H02128152A JP 63282721 A JP63282721 A JP 63282721A JP 28272188 A JP28272188 A JP 28272188A JP H02128152 A JPH02128152 A JP H02128152A
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-
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/002—Electrode membranes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
この発明はバイオセンサに関スる。
（従来の技術）
酵素及び電子移動媒体を電極表面上に固定化したバイオ
センサは、１９８４年「アナリティカルケミストリー（
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） Ｊ ５
６巻、４号、６６７ページ記載のものがある。このバイ
オセンサは、グラファイト電極（直径４ｍｍ）を空気中
、ｉｏｏ’ｃ、４０時間加熱後、冷却し、０．１Ｍ １
．１’−ジメルフェロセン（電子移動媒体）トルエン溶
液１５μｍを滴下乾燥する。
センサは、１９８４年「アナリティカルケミストリー（
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） Ｊ ５
６巻、４号、６６７ページ記載のものがある。このバイ
オセンサは、グラファイト電極（直径４ｍｍ）を空気中
、ｉｏｏ’ｃ、４０時間加熱後、冷却し、０．１Ｍ １
．１’−ジメルフェロセン（電子移動媒体）トルエン溶
液１５μｍを滴下乾燥する。
１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチル）カ
ルボジイミドｐ−メチルトルエンスルホネート水溶液中
に２０°Ｃ１８０分間浸漬した後、１２．５ｍｇ／ｍｌ
グルコースオキシダーゼ含有アセテート緩衝液（０，１
Ｍ、ｐＥ（９，５）中に、２０°Ｃ１９０分間浸漬後、
ポリカーボネート膜で覆う工程によって作製されている
。
ルボジイミドｐ−メチルトルエンスルホネート水溶液中
に２０°Ｃ１８０分間浸漬した後、１２．５ｍｇ／ｍｌ
グルコースオキシダーゼ含有アセテート緩衝液（０，１
Ｍ、ｐＥ（９，５）中に、２０°Ｃ１９０分間浸漬後、
ポリカーボネート膜で覆う工程によって作製されている
。
酵素を電解重合物質で固定化したバイオセンサは、１９
８６年「アナリティカルケミストリ−（Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） Ｊ ５８巻、１４号、
２９７９ページ記載のものがある。白金電極あるいはグ
ラッシーカーボン電極を用い、０．１Ｍ塩化カリウム、
０．５Ｍピロール、５００ｕｎｉｔｓ／ｍｌグルコース
オキシダーゼ水溶液中、０．６５Ｖ ｖｓ Ａｇ／Ａｇ
Ｃ１電極定電位電解して作製されている。
８６年「アナリティカルケミストリ−（Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） Ｊ ５８巻、１４号、
２９７９ページ記載のものがある。白金電極あるいはグ
ラッシーカーボン電極を用い、０．１Ｍ塩化カリウム、
０．５Ｍピロール、５００ｕｎｉｔｓ／ｍｌグルコース
オキシダーゼ水溶液中、０．６５Ｖ ｖｓ Ａｇ／Ａｇ
Ｃ１電極定電位電解して作製されている。
電極表面上を電解鍍金した後酵素を固定化したバイオセ
ンサは、１９８７年、［アナリティカルレターズ（Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ） Ｊ ２０巻、９
号、１４０７ベージ記載のものがある。白金電極表面上
（直径５０〜２００ｐｍ）に、３３ｍｇ／ｍｌ塩化白金
酸、０．６ｍｇ／ｍｌ酢酸鉛水溶液中、定電位あるいは
定電流還元によって白金鍍金した後、１．５ｍｇグルコ
ースオキシダーゼ含有リン酸緩衝液中、１０分間浸漬し
て作製されている。
ンサは、１９８７年、［アナリティカルレターズ（Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ） Ｊ ２０巻、９
号、１４０７ベージ記載のものがある。白金電極表面上
（直径５０〜２００ｐｍ）に、３３ｍｇ／ｍｌ塩化白金
酸、０．６ｍｇ／ｍｌ酢酸鉛水溶液中、定電位あるいは
定電流還元によって白金鍍金した後、１．５ｍｇグルコ
ースオキシダーゼ含有リン酸緩衝液中、１０分間浸漬し
て作製されている。
（発明が解決しようとする課題）
これら従来の酵素固定化方法によるバイオセンサには、
固定化された酵素あるいは電子移動媒体の電極表面から
の脱離による短寿命、それらの絶対量不足による狭応答
範囲の問題点があった。
固定化された酵素あるいは電子移動媒体の電極表面から
の脱離による短寿命、それらの絶対量不足による狭応答
範囲の問題点があった。
本発明は、充分量の酵素及び電子移動媒体を電極表面に
固定化し、かつ、それらの離脱を防いだ長寿命、広応答
範囲を有するバイオセンサ及びその製造方法を提供する
ことを目的としている。
固定化し、かつ、それらの離脱を防いだ長寿命、広応答
範囲を有するバイオセンサ及びその製造方法を提供する
ことを目的としている。
（問題を解決するための手段）
本発明は電極表面上に、酵素及び電子移動媒体を固定化
する方法に於て、前記電極表面上を電解鍍金した後酵素
を物理吸着させ、更にその上に電子移動媒体を電解重合
物質によって固定化することを特徴とする酵素固定化法
を提供するものである。
する方法に於て、前記電極表面上を電解鍍金した後酵素
を物理吸着させ、更にその上に電子移動媒体を電解重合
物質によって固定化することを特徴とする酵素固定化法
を提供するものである。
また、電極に酵素を固定化させたバイオセンサにおいて
、電極上に酵素及び電子移動物質を含む鍍金金属層と酵
素及び電子移動物質を含む電解重合物質から成る層とが
順次形成されてあることを特徴とするバイオセンサが得
られる。
、電極上に酵素及び電子移動物質を含む鍍金金属層と酵
素及び電子移動物質を含む電解重合物質から成る層とが
順次形成されてあることを特徴とするバイオセンサが得
られる。
さらに電極表面上を電解鍍金した後、酵素及び電子移動
媒体を電解重合物質によって固定化することを特徴とす
る酵素固定化方法によって電極上に酵素を固定化させた
バイオセンサにおいて、酵素を含む鍍金金属層と、電子
移動物質を含む電解重合物質から成る層とが順次形成さ
れてあることを特徴とするバイオセンサを得られる。
媒体を電解重合物質によって固定化することを特徴とす
る酵素固定化方法によって電極上に酵素を固定化させた
バイオセンサにおいて、酵素を含む鍍金金属層と、電子
移動物質を含む電解重合物質から成る層とが順次形成さ
れてあることを特徴とするバイオセンサを得られる。
望ましくは電解鍍金前に電極表面に電気化学的処理を施
すと均一な鍍金金属を得られる。酵素の物理吸着は電圧
印加下で行なうと、有効に吸着できる。電解重合は溶解
度の点から非水溶液中で行うことが望ましい。
すと均一な鍍金金属を得られる。酵素の物理吸着は電圧
印加下で行なうと、有効に吸着できる。電解重合は溶解
度の点から非水溶液中で行うことが望ましい。
（作用）
電極表面上に金属が電解鍍金されると、そこに多数の微
小孔が形成される。この微小孔内に入り込んだ酵素及び
電子移動媒体は電解重合物質によって包括固定化される
。鍍金前に電極表面を電気化学的処理をすると鍍金層の
均一性が良くなる。
小孔が形成される。この微小孔内に入り込んだ酵素及び
電子移動媒体は電解重合物質によって包括固定化される
。鍍金前に電極表面を電気化学的処理をすると鍍金層の
均一性が良くなる。
電極表面上に形成された層が酵素のみを含む鍍金層及び
電子移動物質を含む電解重合物質から成る層を順次形成
されている場合、酵素が電界重合物質層によって効果的
に保護されるので、寿命の長いバイオセンサが得られる
。
電子移動物質を含む電解重合物質から成る層を順次形成
されている場合、酵素が電界重合物質層によって効果的
に保護されるので、寿命の長いバイオセンサが得られる
。
一方、酵素及び電子移動物質を含む鍍金層、電界重合物
質から成る層が形成された場合、酵素の電子移動反応が
有効に行えるため、酵素濃度に対するセンサ出力電流は
直線性にすぐれる。
質から成る層が形成された場合、酵素の電子移動反応が
有効に行えるため、酵素濃度に対するセンサ出力電流は
直線性にすぐれる。
（実施例）
以下、本発明の実施例について図面を参照して説明する
。
。
第１図は、本発明の基本的な工程図である。電極ｌの表
面上に金属２が電界鍍金され、この鍍金金属２微小孔内
に酵素３及び電子移動物質４が取りこまれ、電界重合物
質５によって包括固定されている。
面上に金属２が電界鍍金され、この鍍金金属２微小孔内
に酵素３及び電子移動物質４が取りこまれ、電界重合物
質５によって包括固定されている。
第１図（ａ）〜（ｅ）は以下の説明文の（ａ）−（ｅ）
に対応する。
に対応する。
実施例１：電極１としてサファイア基板上にチタン、金
をスパッタして作製した電極（２，３Ｘ Ｏ，４ｍｍ）
、鍍金金属２として白金、酵素３、グルコースオキシダ
ーゼ、電子移動物質４、フェロセンカルボン酸、電解重
合物質５としてポリピロールを用いた。電気化学測定は
、すべて三電極方式で行い、対極に白金電極、飽和カロ
メル電極（ＳＣＥ）を参照電極に用いた。
をスパッタして作製した電極（２，３Ｘ Ｏ，４ｍｍ）
、鍍金金属２として白金、酵素３、グルコースオキシダ
ーゼ、電子移動物質４、フェロセンカルボン酸、電解重
合物質５としてポリピロールを用いた。電気化学測定は
、すべて三電極方式で行い、対極に白金電極、飽和カロ
メル電極（ＳＣＥ）を参照電極に用いた。
（ａ）まず電極１を０．１Ｍ硫酸中に浸漬し、電極電位
を−１，５Ｖ〜＋ １．５Ｖ ｖｓ ＳＣＥ、掃引速度
２００ｍＶ／ｓで１０分間電位掃引を行なう。
を−１，５Ｖ〜＋ １．５Ｖ ｖｓ ＳＣＥ、掃引速度
２００ｍＶ／ｓで１０分間電位掃引を行なう。
（ｂ）３３ｍｇ／ｍｌ塩化白金酸、０．６ｍｇ／ｍｌ酢
酸鉛水溶液中で、１００１１Ａで１分間、２００−２２
５μＡで１０分間還元し白金２を鍍金する。
酸鉛水溶液中で、１００１１Ａで１分間、２００−２２
５μＡで１０分間還元し白金２を鍍金する。
（ｃ）２０ｍｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ３．１０
ｍＭフェロセンカルボン酸４．０．１Ｍテトラエチルア
ンモニウム−ｐ−トルエンスルホン酸、０．５ｍＭテト
ラエチルアンモニウムクロライド、０．２Ｍピロール含
有アセトニトリル中、電流密度３ｍＡ／ｃｍ２で定電流
電解重合し、ポリピロール５によって包括固定する。
ｍＭフェロセンカルボン酸４．０．１Ｍテトラエチルア
ンモニウム−ｐ−トルエンスルホン酸、０．５ｍＭテト
ラエチルアンモニウムクロライド、０．２Ｍピロール含
有アセトニトリル中、電流密度３ｍＡ／ｃｍ２で定電流
電解重合し、ポリピロール５によって包括固定する。
実施例２：電極鍍金までの行程は実施例１の場合まった
く同様である。
く同様である。
（ｄ）２０ｍｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ３含有リ
ン酸緩衝液中（ｐＨ７，０）、４°Ｃ１１２時間浸漬し
グルコースオキシダーゼ３を鍍金白金２内へ取りこむ。
ン酸緩衝液中（ｐＨ７，０）、４°Ｃ１１２時間浸漬し
グルコースオキシダーゼ３を鍍金白金２内へ取りこむ。
このとき電極ｌへ電圧を印加する事により、グルコース
オキシダーゼ３の取りこみ量を制御する事も可能である
。
オキシダーゼ３の取りこみ量を制御する事も可能である
。
（ｅ）１０ｍＭフェロセンカルボン酸４．０．１Ｍテト
ラエチルアンモニウム−ｐ−）ルエンスルホン酸、０．
５ｍＭテトラエチルアンモニウムクロライド、０．２Ｍ
ビロール含有アセトニトリル中、電流密度３ｒｎＡ／ｃ
ｍ２で定電流電解重合し、ポリピロール５によって包括
固定する。
ラエチルアンモニウム−ｐ−）ルエンスルホン酸、０．
５ｍＭテトラエチルアンモニウムクロライド、０．２Ｍ
ビロール含有アセトニトリル中、電流密度３ｒｎＡ／ｃ
ｍ２で定電流電解重合し、ポリピロール５によって包括
固定する。
第２図は実施例１により作製したグルコースセンサの検
量線である。グルコース５０ｍＭまで直線性が認められ
る。従来のグルコースセンサの場合の２．５から５倍直
線範囲が拡大している。
量線である。グルコース５０ｍＭまで直線性が認められ
る。従来のグルコースセンサの場合の２．５から５倍直
線範囲が拡大している。
なお、上記実施例ではアセトアミドを電解重合溶媒とし
て用いたが、他の有機溶媒例えばニトロメタン、炭酸プ
ロピレン、Ｎ、Ｎジメチルホルムアミド、Ｎ、Ｎジメチ
ルアセトアミド、Ｎ、Ｎジメチルアセトアミド、Ｎメチ
ルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルホルム
アミド及びジメチルスルフオドキシドであれば電子移動
媒体の良い溶媒となる。あるいは水溶液であってもよい
。水溶液を用いる場合少量の界面活性剤を共存させると
よい。フェロセンカルボン酸４の代わりに１，１−ジメ
チルフェロセン、メチルフェロセン、ヒドロキシメチル
フェロセン等、他の７工ロセン誘導体であってもよい。
て用いたが、他の有機溶媒例えばニトロメタン、炭酸プ
ロピレン、Ｎ、Ｎジメチルホルムアミド、Ｎ、Ｎジメチ
ルアセトアミド、Ｎ、Ｎジメチルアセトアミド、Ｎメチ
ルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルホルム
アミド及びジメチルスルフオドキシドであれば電子移動
媒体の良い溶媒となる。あるいは水溶液であってもよい
。水溶液を用いる場合少量の界面活性剤を共存させると
よい。フェロセンカルボン酸４の代わりに１，１−ジメ
チルフェロセン、メチルフェロセン、ヒドロキシメチル
フェロセン等、他の７工ロセン誘導体であってもよい。
フェロセン誘導体を用いた理由は酵素からの電子移動反
応が起こり易いためである。またポリピロール５の代わ
りにポリーＮ、メチルビロール、ポリアニリン等、電解
重合可能な物質であればよい。
応が起こり易いためである。またポリピロール５の代わ
りにポリーＮ、メチルビロール、ポリアニリン等、電解
重合可能な物質であればよい。
また、酵素としてはグルコースオキシダーゼに限らず、
Ｄアミノ酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及び
コリン酸オキシダーゼなどのオキシダーゼ系酵素であれ
ば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を有す
るので電子移動反応を行い易いので良い。
Ｄアミノ酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及び
コリン酸オキシダーゼなどのオキシダーゼ系酵素であれ
ば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を有す
るので電子移動反応を行い易いので良い。
（発明の効果）
本発明は以上説明したように、電極表面を電解鍍金する
ことにより多数の微細孔を形成し、酵素及び電子移動物
質の充分量の固定化を可能にする効果を有する。多くの
電子移動物質は水に溶けにくい。アセトニトリルを電解
重合溶媒として用いることも、この物質の充分量の固定
化に大きく寄与している。その結果、センサの応答範囲
を２．５から５倍にも拡大する。さらに電極最外層を電
解重合物質で被覆することにより、酵素及び電子移動物
質の電極表面からの脱離をも防ぎ、センサ寿命を延ばす
効果を有する。
ことにより多数の微細孔を形成し、酵素及び電子移動物
質の充分量の固定化を可能にする効果を有する。多くの
電子移動物質は水に溶けにくい。アセトニトリルを電解
重合溶媒として用いることも、この物質の充分量の固定
化に大きく寄与している。その結果、センサの応答範囲
を２．５から５倍にも拡大する。さらに電極最外層を電
解重合物質で被覆することにより、酵素及び電子移動物
質の電極表面からの脱離をも防ぎ、センサ寿命を延ばす
効果を有する。
第１図（ａ）、 （ｂ）、 （ｃ）、 （ｄ）、 （ｅ
）はこの発明の工程図、第２図は第１図（ａ）、 （ｂ
）、 （ｃ）の工程により得られたグコースセンサの検
量線である。 １：電極、 ２：鍍金金属、 ３：酵素、 ４：電子移動物 質、 ５：電解重合物質
）はこの発明の工程図、第２図は第１図（ａ）、 （ｂ
）、 （ｃ）の工程により得られたグコースセンサの検
量線である。 １：電極、 ２：鍍金金属、 ３：酵素、 ４：電子移動物 質、 ５：電解重合物質
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）電極表面上に酵素及び電子移動媒体を固定化する方
法に於て、前記電極表面上を電解鍍金した後酵素を物理
吸着させ、更にその上に電子移動媒体を電解重合物質に
よって固定化することを特徴とする酵素固定化法。 ２）電極上に酵素を固定化させたバイオセンサにおいて
、電極上に酵素及び電子移動物質を含む鍍金金属層と酵
素及び電子移動物質を含む電解重合物質から成る層とが
順次形成されてあることを特徴とするバイオセンサ。 ３）電極表面上に、酵素及び電子移動媒体を固定化する
方法に於て、前記電極表面上を電解鍍金した後、酵素及
び電子移動媒体を電解重合物質によって固定化すること
を特徴とする酵素固定化方法。 ４）電極上に酵素を固定化させたバイオセンサにおいて
、酵素を含む鍍金金属層と、電子移動物質を含む電解重
合物質から成る層とが順次形成されてあることを特徴と
するバイオセンサ。 ５）電解鍍金前に、電極表面を電気化学的処理する請求
項１及び４記載の酵素固定化方法。 ６）酵素の物理吸着を電圧印加下で行なう請求項１、２
記載の酵素固定化方法及びバイオセンサ。 ７）電解重合を非水溶液中で行なう請求項１及び４記載
の酵素固定化方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63282721A JPH02128152A (ja) | 1988-11-08 | 1988-11-08 | 酵素固定化方法及びバイオセンサ |
| DE1989613144 DE68913144T2 (de) | 1988-11-08 | 1989-11-06 | Verfahren zur Immobilisierung eines Enzyms auf einer Elektrodenoberfläche. |
| EP89120516A EP0368209B1 (en) | 1988-11-08 | 1989-11-06 | A process for immobilizing an enzyme on an electrode surface |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63282721A JPH02128152A (ja) | 1988-11-08 | 1988-11-08 | 酵素固定化方法及びバイオセンサ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02128152A true JPH02128152A (ja) | 1990-05-16 |
Family
ID=17656179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63282721A Pending JPH02128152A (ja) | 1988-11-08 | 1988-11-08 | 酵素固定化方法及びバイオセンサ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0368209B1 (ja) |
| JP (1) | JPH02128152A (ja) |
| DE (1) | DE68913144T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100973042B1 (ko) * | 2008-03-18 | 2010-07-29 | 연세대학교 산학협력단 | 셀센서 및 이를 이용하여 세포의 상태를 실시간으로모니터링하는 방법 |
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| US5264105A (en) * | 1989-08-02 | 1993-11-23 | Gregg Brian A | Enzyme electrodes |
| US5262035A (en) * | 1989-08-02 | 1993-11-16 | E. Heller And Company | Enzyme electrodes |
| US5264104A (en) * | 1989-08-02 | 1993-11-23 | Gregg Brian A | Enzyme electrodes |
| AT397512B (de) * | 1989-10-30 | 1994-04-25 | Pittner Fritz | Biosensor sowie verfahren zu seiner herstellung |
| US5262305A (en) * | 1991-03-04 | 1993-11-16 | E. Heller & Company | Interferant eliminating biosensors |
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| JP3394262B2 (ja) | 1997-02-06 | 2003-04-07 | セラセンス、インク． | 小体積インビトロ被検体センサー |
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| US5932799A (en) * | 1997-07-21 | 1999-08-03 | Ysi Incorporated | Microfluidic analyzer module |
| US6293012B1 (en) | 1997-07-21 | 2001-09-25 | Ysi Incorporated | Method of making a fluid flow module |
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| US6103033A (en) | 1998-03-04 | 2000-08-15 | Therasense, Inc. | Process for producing an electrochemical biosensor |
| US9066695B2 (en) | 1998-04-30 | 2015-06-30 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring device and methods of use |
| US8480580B2 (en) | 1998-04-30 | 2013-07-09 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring device and methods of use |
| US8974386B2 (en) | 1998-04-30 | 2015-03-10 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring device and methods of use |
| US8346337B2 (en) | 1998-04-30 | 2013-01-01 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring device and methods of use |
| US8465425B2 (en) | 1998-04-30 | 2013-06-18 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring device and methods of use |
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-
1988
- 1988-11-08 JP JP63282721A patent/JPH02128152A/ja active Pending
-
1989
- 1989-11-06 EP EP89120516A patent/EP0368209B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-06 DE DE1989613144 patent/DE68913144T2/de not_active Expired - Fee Related
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