WO1991006625A1

WO1991006625A1 - Biosensor sowie verfahren zu seiner herstellung

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Publication number: WO1991006625A1
Application number: PCT/AT1990/000101
Authority: WO
Inventors: Fritz Pittner; Thomas Schalkhammer; Eva Mann-Buxbaum; Rudolf Mann
Original assignee: Fritz Pittner; Thomas Schalkhammer; Mann Buxbaum Eva; Rudolf Mann
Priority date: 1989-10-30
Filing date: 1990-10-15
Publication date: 1991-05-16
Also published as: AU6506390A; JPH05501198A; EP0493511A1; AT397512B; ATA249289A

Abstract

Biosensor zur selektiven Bestimmung von enzymatisch umsetzbaren Substanzen, wie z.B. Glucose, mit auf einem inerten Träger angeordneten Elektroden und an einer Polypyrrolschicht immobilisierter Oxidase, wie z.B. Glucoseoxidase (GOD), bei welchem die Polymerschicht wenigstens eine permselektive, poröse Schicht aus N- oder 3-substituiertem Polypyrrol enthält, deren Substitution so gewählt ist, daß die Redoxaktivität und gegebenenfalls die Leitfähigkeit gegenüber Polypyrrollschichten wesentlich verringert ist.

Description

Biosensor sowie Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor zur selektiven Bestimmung von enzymatisch umsetzbaren Substanzen, wie z.B. Glucose, mit auf einem inerten Träger angeordneten Elektroden und an einer Polypyrrolschicht immobilisierter Oxidase, wie z.B. Glucoseoxidase (GOD) , sowie auf ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Biosensors.

Für die Herstellung von Biosensoren ist es bekannt, auf einen mit Elektroden ausgestatteten Träger Enzyme, Coenzyme od.dgl. zu immobilisieren, welche in der Folge die gewünschte Um¬ setzung derjenigen Substanz bewirken, deren Konzentration gemessen werden soll. Prinzipiell können Biosensoren bei- spielsweise als resistive, kapazitive oder eine von der Konzentration abhängige Spannung bzw. einen von der Konzen¬ tration abhängigen Strom liefernde Sensoren eingesetzt werden. Zur Immobilisierung von Enzymen bzw. Coenzymen sind eine Reihe von Verfahren bekanntgeworden, bei welchen in der Regel eine Derivatisierung des Trägers zur Herstellung kovalenter Bindungen mit dem Enzym bzw. Coenzym erforderlich ist. Im speziellen Fall der Glucoseoxidase ist es bereits bekannt, die mit Elektroden ausgestatteten Träger mit einer Polypyrrolschicht zu überziehen, welche elektrisch leitfähig ist und bei welcher in der Regel zur Erhöhung der Redox- aktivität, Redoxmediatoren, wie Ferrocen, verwendet wurden. Das auf derartig beschichteten Trägern immobilisierte Enzym bildete im Fall der Glucoseoxidase entweder mit Glucose Wasserstoffperoxid als Metaboliten, welches auf Grund der Redoxaktivität rasch in Sauerstoff und Wasser zersetzt wurde oder durch ^"Elektronentransfer von FADH_ über Ferrocen auf der Elektrodenoberfläche freie Elektronen, wobei die Elektronen über das elektrisch leitfähige Beschichtungsmaterial zu den Elektroden abgeleitet wurden und entsprechend einer Messung zugeführt werden konnten. Derartige Biosensoren zur Messung von Glucosekonzentrationen sind allerdings auf Grund der hohen Redoxaktivitäten in hohem Maße störungsanfällig, und auch andere Substanzen, welche in derartigen Redoxvorgängen Elektronen liefern können, wie beispielsweise Ascorbinsäure und Glutathion aber auch Luftsauerstoff, können zu einer mehr oder minder starken Verzerrung des Meßwertes und im beson¬ deren des gemessenen Stromes führen.

Eine wesentliche Voraussetzung für die Langzeitstabilität derartiger Biosensoren besteht u.a. darin, daß die immobili- sierten Enzyme und Coenzyme ohne Aktivitätsverlust getrocknet werden können. Für die Ausbildung der erforderlichen Leit¬ fähigkeit zum Abtransport der bei der Redoxreaktion gebil¬ deten Elektronen sind in der Regel Substituenten mit kon¬ jugierten Doppelbindungen erforderlich, welche gleichzeitig die Redoxaktivität und damit die Störungsanfälligkeit für Fremdsubstanzen erhöhen.

Die Erfindung zielt nun darauf ab, einen Biosensor der eingangs genannten Art zu schaffen, welcher sich durch eine verringerte Stδrungsanfälligkeit gegenüber redoxsensiblen Substanzen, wie Ascorbinsäure und Glutathion, auszeichnen und gleichzeitig eine über weite Konzentrationsbereiche lineare und reproduzierbare Ansprechcharakteristik aufweisen. Im besonderen zielt die Erfindung darauf ab, einen Biosensor zur selektiven Bestimmung bestimmter, von einem bestimmten Enzym umsetzbarer Substanzen zu ermöglichen, ohne daß andere denkbare Redoxvorgänge das Ergebnis nennenswert beeinflussen. Zur Lösung dieser Aufgabe besteht die Erfindung im wesent¬ lichen darin, daß die Polymerschicht wenigstens eine perm- selektive, poröse Schicht aus N- oder 3-substituiertem Polypyrrol enthält, deren Substitution so gewählt ist, daß die Redoxaktivität und gegebenenfalls die Leitfähigkeit gegenüber Polypyrrolschichten wesentlich verringert ist. Dadurch, daß eine permselektive, poröse Schicht aus N- oder 3-substituiertem Polypyrrol verwendet wird, kann auf Grund der Substitution sowohl die Redoxaktivität als auch die Leitfähigkeit wesentlich herabgesetzt werden. Die Herab¬ setzung der Leitfähigkeit führt hiebei dazu, daß der bisher in Biosensoren zur Bestimmung der eingangs genannten Sub¬ stanzen verwendete Mechanismus der Elektronenleitung im Anschluß an eine Redoxzersetzung von H₂0₂ bzw. der direkte Elektronentransfer mit Hilfe von Mediatoren nicht verwendet wird. Für die gemessenen Werte ist somit im vorliegenden Fall nicht unmittelbar das Redoxpotential des Metaboliten am Polypyrrol, sondern die Diffusion von H₂0₂ durch die perm- selektive, poröse Schicht von Bedeutung, wobei die Zersetzung in der Folge unmittelbar an den Elektroden stattfindet, wodurch die Störeinflüsse durch andere denkbare Redoxvorgänge wesentlich herabgesetzt werden. Es wird somit insgesamt tatsächlich ausschließlich die von der jeweiligen Oxidase er- zeugte H₂0₂-Konzentration für den MeßVorgang bestimmend, und die H₂0₂-Konzentration ist bei gegebender Oxidase ein reprä¬ sentativer und selektiv der zu bestimmenden Substanz zuorden- barer Konzentrationswert, welcher zur Erzielung eines ent¬ sprechenden Meßwertes herangezogen werden kann. Die in der genannten Weise substituierte permselektive, poröse Poly¬ pyrrolschicht weist hiebei nicht nur eine konventionell, nicht mehr ohne weiteres meßbare Redoxaktivität und daher ein sehr rasches Einschwingverhalten der Elektrode auf, sondern hat auf Grund ihrer deutlichen Verringerung der Leitfähigkeit bereits dann Vorteile, wenn in weiter außen liegenden Schich¬ ten dennoch Redoxvorgänge beliebiger Art stattfinden, solange derartige Redoxvorgänge nicht zur Freisetzung von H₂0₂ führen, wie dies durch Oxidasen bewirkt wird. Erfindungsgemäß ist es somit ausreichend, wie es einer bevorzugten Ausfüh- rungsform entspricht, daß die Ausbildung so getroffen ist, daß eine poröse, elektrisch isolierende Zwischenschicht aus N- und/oder 3-substituiertem Polypyrrol angeordnet ist, wobei naturgemäß Redoxvorgänge störender Art, wie beispielsweise Redoxvorgänge mit Ascorbaten oder Glutathion, bereits dadurch nachhaltig verhindert werden können, daß diejenige Schicht, an welcher die Oxidase immobilisiert ist, unter Einsatz- bzw. Meßbedingungen keine nennenswerten Redoxaktivitäten mehr aufweist. Insgesamt ist mit Rücksicht auf die gewünschte Diffusion von H₂0₂ zu den Elektroden für die Erzielung hoher Empfindlichkeiten eine möglichst dünne Trägerzwischenschicht für die Immobilisierung der Oxidasen erstrebenswert, wobei dadurch, daß diese Zwischenschicht als poröse, permselektive Membran ausgebildet ist, mit geringen Schichtstärken das Auslangen gefunden werden kann.

Die Polymerisation von Polypyrrolen, welche in der erfin¬ dungsgemäßen Weise substituiert wurden, gestaltet sich naturgemäß mit Rücksicht auf die deutlich verringerte Leit¬ fähigkeit auf elektrochemischem Wege relativ schwierig, und es können Homopolymere aus derartigen substituierten Poly- pyrrolen in der Regel nur in extrem dünner Schichtstärke aufgetragen werden. Wenn im Hinblick auf die gewünschte Immobilisierung der relativ großen Enzyme sowie deren Coen- zyme eine bestimmte Schichtstärke angestrebt wird, wird es in der Regel erforderlich sein, diese Schichtstärke durch Abscheidung eines Copolymers aus unsubstituiertem Pyrrol und substituierten Pyrrolen aufzubauen. Eine derartige Copolymer- schicht hat in der Folge Vorteile in bezug auf die Immobili¬ sierung der Enzyme. Bedingt durch die Gefahr, daß eine derartige Copolymerschicht jedoch eine höhere Leitfähigkeit und gegebenenfalls auch noch eine meßbare Redoxaktivität auf¬ weisen kann, empfiehlt es sich in solchen Fällen, zumindest eine, wenn auch relativ dünne Schicht aus Homopolymeren mit den für die Herabsetzung der Redoxaktivität bzw. Leitfähig¬ keit erforderlichen Substituenten abzuscheiden.

Mit Vorteil wird daher der erfindungsgemäße Biosensor so ausgebildet, daß auf der Elektrode Homopolymere und Copoly- mere aus substituiertem Polypyrrol in wenigstens zwei Schich¬ ten aufgebracht sind. Für die Immobilisierung von Oxidasen an Polypyrrolen und insbesondere für die Ausbildung kovalenter Bindungen zwischen den Enzymen und Coenzymen sowie der Trägerschicht sind Substituenten, wie Carboxylgruppen und N0₂-Gruppen, prinzi- piell bekannt. Mit Rücksicht auf die bisherige Aufgabenstel¬ lung, die elektrische Leitfähigkeit hoch zu halten und die Redoxaktivität zu begünstigen, wurde das Ausmaß einer der¬ artigen Substitution in der Regel auf dasjenige Ausmaß beschränkt, welches für die sichere Immobilisierung erforder- lieh war. Prinzipiell sind auch Carboxylgruppen und N0₂- Gruppen geeignet, die Leitfähigkeit und die Redoxaktivität des Polypyrrols herabzusetzen, wobei eine signifikante Erhöhung der Selektivität der Bestimmung von durch Oxidasen abbaubaren Substanzen allerdings erst dann eintritt, wenn das Ausmaß einer derartigen Carboxylierung bzw. Nitrierung weit über das Ausmaß hinausgeht, welches für die Immobilisierung des Enzymes erforderlich wäre. Erfindungsgemäß werden zum Zwecke der Herabsetzung der Redoxaktivität und der Leitfähig¬ keit sowie zum Zwecke der Erleichterung der Immobilisierung von Enzymen am Träger bevorzugt Carboxy-substituierte Poly- pyrrole aufgebracht. Da insgesamt ein linearer Zusammenhang der Glucosekonzentration mit dem gemessenen Strom bei den erfindungsgemäß erzielbaren geringen Schichtstärken mit einem modifizierten N-Alkylpolypyrrol üblicherweise im Bereich von 0 bis 9 mM als linear anzusehen ist, kann es wünchenswert werden, zur Bestimmung größerer Konzentrationen die Empfind¬ lichkeitskurve insgesamt zu verschieben, was dadurch gelingt, daß die Ausgestaltung so getroffen ist, daß das Enzymimmobi- lisat mit einer permselektiven Membrane abgedeckt ist. Die zusätzliche permselektive Membran geht zu Lasten der Empfind¬ lichkeit, wodurch insgesamt der lineare Bereich in Richtung höherer Konzentrationen verschoben wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines der- artigen Biosensors ist im wesentlichen dadurch gekennzeich¬ net, daß das N- und/oder 3-substituierte Monomer elektrochemisch auf den die Elektroden aufweisenden Träger abgeschieden wird. Die elektrochemische Abscheidung führt zum Aufbau definierter und kontrollierbarer Schichtstärken, wobei allerdings, wie bereits erwähnt, die schlechte Leitfähigkeit der Monomere hier Grenzen in der auftragbaren Schichtstärke mit sich bringt. Neben einer elektrochemischen Abscheidung sind die Biosensoren in vorteilhafter Weise auch durch Abscheidung aus der Gasphase herstellbar, wobei wenigstens ein zu polymerisierendes Pyrrol mit Hilfe eines Oxidations- mittels, insbesondere Brom bei Drücken zwischen 1.10 -5 und

0,1 mbar und Temperaturen zwischen -40 und +20°C auf dem die

Elektroden aufweisenden Träger abgeschieden wird. Im Falle von extrem schlechter Leitfähigkeit, wie sie erfindungsgemäß angestrebt wird, können durch Abscheidung aus der Gasphase größere, jedoch nicht so gut kontrollierbare Schichtstärken hergestellt werden. Der Aufwand für eine derartige, aus der Gasphase vorgenommene Abscheidung ist allerdings relativ groß, da der Dampfdruck des abzuscheidenden Pyrrols mit jenem des Oxidationsmittels bei dem Abscheidevorgang übereinstimmen muß. Jedoch bietet das Verfahren die Möglichkeit, auch auf nicht leitenden Unterlagen gut haftende Polymerschichten abzuscheiden. Derartige, durch Abscheidung aus der Gasphase beschichtete Elektroden können in der Folge in der Gasphase mit Hilfe eines Sauerstoffplasmas strukturiert bzw. geätzt werden.

Um auch auf elektrochemischem Wege eine entsprechende Min- destschichtstärke bzw. eine entsprechende mikroporöse Struk¬ tur sicher zu erreichen, kann die Abscheidung in mehreren Schichten erfolgen, wobei abwechselnd Mono- und Copolymere abgeschieden werden können. Insbesondere im Falle der Copoly¬ mere kann eines der Monomere unsubstituiertes Pyrrol oder Methylpyrrol sein, wodurch die Abscheidung größerer Schicht¬ stärken auf elektrochemischem Wege erleichtert wird. Zur Herstellung der substituierten Pyrrole wird mit Vorteil so vorgegangen, daß Pyrrol mit einer Verbindung der Formel RX, worin R -CH₂COOH, -(CH^COOH, -(CH₂)_COOH, -(CH^COOH, -(CH₂)₅COOH, -(CH₂)₁₍₎COOH, -(CgH^COOH, -CH(CH)₃CH₂COOH, -(CH₂)₂C(CH₃)₂COOH, -CH₂CH(CH₃)CH₂COOH, -CH(CH₃>COOH, -CH/CH(CH₃)₂7COOH, -CH/CH₂CH(CH₃)₂7COOH,

-CH ^"CH(CH₃)C₂H₅JCOOH, -CH(CH₂C_gH₅)COOH, -(CH₂)₄CH( H₂)COOH, -CH(CH₂OH)COOH, -CH(CH₂SH)COOH, -CH(CH₃)CONHCH(CH )COOH, -CH₂CONHCH₂COOH, -CH₂CONHCH(CH₃)COOH, -CH_jCH(OC₂H₅)₂, -CH₂CH(OC₂H₄)₂ -CH₂CH(OCH₃)₂, -CH₂CH(OC₃H_?)₂,

-CH₂CH(OC₄H_g)₂, -CH₂CH(OC₃H₆)₂, -C^CH(OC₄Hg) oder -CH₂CH(OCH_)₂ bedeutet und X eine Abgangsgruppe, gewählt aus der Gruppe F, Cl, Br, I oder Tosyl bedeutet, mit einem Phasentransferkatalysator und/oder einem Kronenether in Anwesenheit einer starken Base, insbesondere NaOH oder KOH, umgesetzt wird, wobei in vorteilhafter Weise als Phasentrans- ferkatalysatoren Tetraalkylammoniumsalze der Formel /N(R) -7 X, worin n 1 oder 2 bedeutet, die Substituenten R gleich oder voneinander verschieden sein können und gerad- kettige oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 20 C-Atomen bedeuten und X F, Cl, Br, I, CK>₄, BF₄, PF_g S0₄ oder SO- bedeutet, eingesetzt werden. Durch Einsatz derartiger Tetra¬ alkylammoniumsalze als Phasentransferkatalysatoren werden die gewünschten substituierten Pyrrole in besonders hohen Aus- beuten und ohne die weitere Umsetzung störende Nebenprodukte erhalten. Weiters ist es durch Umsetzung der Ausgangsmate¬ rialien mit einem Phasentransferkatalysator oder einem Kronenether möglich, auch säurelabile Substituenten an das Pyrrolmolekül zu binden.

Analoge Ergebnisse werden bei Einsatz eines Kronenethers zur

Herstellung der substituierten Pyrrole erzielt, wobei jedoch für diese Umsetzung nur jene Kronenether geeignet sind, in welchen das Kation der verwendeten starken Base, d.h. ins-

+ + besondere Na oder K , aufgenommen werden kann. Bei einem anderen Verfahren zur Herstellung der substituier¬ ten Pyrrole wird mit Vorteil so vorgegangen, daß substitu¬ ierte oder unsubstituierte S^-Aminocarbonsäuren, Aminosäuren oder Peptide mit bis zu 5 Monomereinheiten mit Di ethoxy- tetrahydrofuran in saurer Lösung umgesetzt werden, wobei vorzugsweise als substituierte oder unsubstituierte Amino- carbonsäuren, ß-Aminopropionsäure, f'-Aminobuttersäure, '-Aminovaleriansäure, i -Aminocapronsäure, ω -Aminoundecan- säure, Aminobenzoesäure, mit F, Cl, Br und/oder Methyl substituierte Aminocarbonsäuren, insbesondere 3-Amino- 3-methylpropansäure, 2-Fluoraminoessigsäure, 2-Bromamino- essigsäure, ^'-Amino-2-chlorbuttersäure, fr-Amino-2-fluor- buttersäure, .^-Amino-2-brombuttersäure, fr -Amino-2,2-di- methylbuttersäure, fr -Amino-2-chlor-2-methylbuttersäure, l-Amino-l₇3-propyldicarbonsäure, ^-Amino-3-methylbutter- säure, als die Redoxaktivität vermindernde Substituenten eingesetzt werden bzw. als Aminosäuren Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Prolin, Lysin, Serin, Cystein und Arginin sowie Derivate dieser Aminosäuren als die Redoxaktivität vermindernde Substituenten eingesetzt werden. Als die Redoxaktivität und die Leitfähigkeit vermindernde Substituenten sind, wie oben erwähnt, auch Peptide mit zu 5 Monomereinheiten mit Vorteil zu verwenden, welche, wie es einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Ver- fahrens entspricht, durch Kondensation von gleichen oder verschiedenen Aminosäuren gewonnen werden können. Als Peptide dieser Art können insbesondere Alanylalanin, Glycylglycin, Alanylglycin, Ala-Ala-Ala, Gly-Ala-Gly und Gly-Gly-Ala, sowie Derivate dieser Peptide eingesetzt werden.

Um die Redoxaktivität weiter herabzusetzen, können die Pyrrole mit Vorteil auch 2-Buten-substituiert eingesetzt werden, wobei derartige 2-Butene wiederum weitere Substi¬ tuenten, wie beispielsweise SO-H~, Br~, Pyrrol, Pyridin, 3-Methylpyridin oder Nicotinamid tragen können. Auch mit 3-Methylpyridin oder Nicotinamid substituierte Pyrrole haben eine deutliche Verringerung der Redoxaktivität gezeigt und sich als brauchbar erwiesen. In besonders vorteilhafter Weise können folgende substituierten Pyrrole als homopolymere Schicht auf den Träger abgeschieden werden: 2-(l - Pyrrolo) - acetylglycin

1-Dodecylpyrrol

1-(4-Carbσxybenzyl)- pyrrol

1-(4-Nitrophenyl) pyrrol

1-(4-Carboxyphenyl) pyrrol

3-Carboxymethyl-4-methyl-pyrrol

1-o-Tosylpyrrol 1-p-Tosylpyrrol

1-Benzolsulfonylpyrrol

4-(3-Pyrrolo)-4-hydroxybuttersäure

4-(3-Pyrrolo)-4-ketobuttersäure

3-((Hydroxy 4-Nitrophenyl) methyl) pyrrol

3-((Keto 4-Nitrophenyl) methyl) pyrrol Zur Erzielung der gewünschten mikroporösen, permselektiven Struktur mit einer für eine Membran hinreichenden Schicht¬ stärke und sterisch besonders günstigen Voraussetzungen für die Immobilisierung der gewünschten Mindestmenge an Enzym kann mit Vorteil so vorgegangen werden, daß die elektro- chemische Abscheidung in wenigstens zwei aufeinanderfolgenden Schritten erfolgt, wobei in wenigstens einem Schritt die Abscheidung eines Homopolymers mit substituierten Pyrrolen vorgenommen wird. Eine besonders gute Reproduzierbarkeit der aufzutragenden Schichtstärke läßt sich hiebei dadurch er- zielen, daß die elektrochemische Abscheidung unter Anwendung eines Cyclovoltametrischen Verfahrens vorgenommen wird, wobei insbesondere unter Anwendung einer Spannungsänderung von

50-200 mVs -1, vorzugsweise etwa 100 mVs-1, gearbeitet werden kann. Das Cyclovoltametrische Verfahren kann bevorzugt im Spannungsbereich von -500 mV bis +1800 mV durchgeführt werden, wodurch auch im Falle leicht leitender Monomere eine relativ rasche und den Erfordernissen entsprechend homogene

Abscheidung größerer Schichtstärken gelingt.

Insgesamt wird auf diese Weise ein Biosensor mit hoher Selektivität und geringer Störungsanfälligkeit geschaffen. welcher abweichend von den bekannten Biosensoren auf Poly- pyrrolbasis ein anderes Meßprinzip anwendet und insbesondere die Messung störende Zusätze, wie Redoxmediatoren, keines¬ falls enthält.

Besonders vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen und den Zeichnungsfiguren näher erläutert.

Beispiel 1: Herstellung eines Polypyrrol-Biosensors

A) Herstellung der Elektroden

Glasblättchen einer Dicke von 100 bis 300 μm wurden gereinigt und dienten als Trägermaterial für die Elektroden. Im Hoch¬ vakuum wurde eine 50 bis 100 nm dicke Metallschicht (Ti, Pt, Pd, Au oder Rh) auf den Glaskörper aufgedampft. Die Metall¬ schichten wurden anschließend strukturiert mit 3 μm dicken Siliziumnitridschichten isoliert und geätzt.

B) Reinigung der Elektrode

Eine nach dem beschriebenen Verfahren hergestellte Pt-Elek- trode mit einer Oberfläche von 0,64 mm² wurde in destillier- tem Wasser mit Ultraschall gereinigt, mit Aceton abgespült und unter staubfreien Bedingungen getrocknet. Die Elektrode wurde anschließend in eine Lösung von 2,5% LiClO. in Acetonitril getaucht und unter Verwendung einer Elektroden¬ konfiguration mit 3 Elektroden gegen Ag/AgCl einer cyclischen Spannungsänderung zwischen -500 und +1800 mV unterworfen. Die Spannung wurde hiebei jeweils um 100 mV pro Sekunde geändert. Die Pt-Elektrode wird 5 derartigen voItametrischen Zyklen unterworfen.

C) Beschichten mit substituierten Polypyrrolen Eine 0,5%-ige Lösung der folgenden Verbindung:

in einer Mischung aus Acetonitril und Dimethylsulfoxid, welches zusätzlich 2,5% LiC10₄ enthielt, wurde mehrere Stunden über Na₂S0₄ oder CaCl₂ getrocknet. Die klare Lösung

10 wurde in eine Glaszelle gefüllt und 10 min mit Argon gespült. Die wie unter B) gereinigte Pt-Elektrode wurde in die Lösung eingebracht und das System wurde 30 Spannungszyklen zwischen -300 und +1600 mV mit einer Spannungsänderung von 100 mV pro Sekunde unterworfen. Nach Beendigung des Abscheidungsver-

15 fahrens konnte eine dünne, braune Polymerschicht auf der Elektrode beobachtet werden.

Auf analoge Weise könnten auch Polymerbeschichtungen der folgenden Verbindungen auf der Pt-Oberfläche erhalten werden:

20 l-(Ω-Carboxymethyl) - pyrrol l-(Ω-Carboxyethyl) - pyrrol l-(Ω-Carboxypropyl) - pyrrol l-(Ω-Carboxypentyl) - pyrrol l-(Ω-Carboxydecyl) - pyrrole

1-(1,3 Dicarboxypropyl) - pyrrol l-((l-Carboxy 3-methyl)butyl) - pyrrol 25 2-(l - Pyrrolo) - acetylglycin

1-Dodecylpyrrol

1-(4-Carboxybenzy1)- pyrrol

1-(4-Nitrophenyl) pyrrol

1-(4-Carboxypheny1) pyrrol

3-Carboxymethyl-4-methyl-pyrrol

4-(3-Pyrrolo)-4-hy roxybuttersäure -,_n 4-(3-Pyrrolo)-4-ketobuttersäure

3-((Hydroxy 4-Nitrophenyl) methyl) pyrrol

3-((Keto 4-Nitrophenyl) methyl) pyrrol wobei als Leitsalz auch R₄BF₄ oder NR₄PF_g, worin R H, Methyl, Ethyl oder Butyl bedeutet, eingesetzt werden konnte. Die Anzahl der Spannungszyklen konnte zwischen 10 und 30 35 varriert werden. D) Beschichten mit copolymerisierten, substituierten Pyrrolen

über die unter C) beschriebene Schicht aus polymerisierten, substituierten Pyrrolen wird eine weitere copolymere Schicht aus Pyrrol und dem unter C) angeführten substituierten Pyrrol aufgebracht. Zu einer der unter C) beschriebenen Lösung entsprechenden Lösung des substituierten Pyrrols werden 0,05% Pyrrol zugesetzt und diese Lösung wurde 10 Spannungszyklen zwischen -300 und +1200 mV mit einer Spannungsänderung von 100 mV pro Sekunde unterworfen. Nach Beendigung des Verfah¬ rens konnte eine dunkel gefärbte Polymerschicht mit variabler Dicke auf der Elektrode beobachtet werden. Die beobachtete Polymerschicht bestand hiebei aus einem Copolymer aus sub¬ stituiertem Pyrrol und aus unsubstituiertem Pyrrol, wobei das Verhältnis Pyrrol zu substituiertem Pyrrol in dem Copolymer etwa 10:1 betrug.

Auf analoge Weise konnten auch Copolymere aus Methylpyrrol und den unter C) angeführten substituierten Polypyrrolen erhalten werden.

E) Kopplung der Enzyme

Die Polypyrrol beschichteten Elektroden wurden 60 min bei 25°C ohne Rühren oder Schütteln in eine gesättigte Lösung von N-Cyclohexyl-N* -[2-(N-methylmorpholino)-ethyl7-carbodiimid-4- -toluolsulfonat eingebracht. Danach wurden die Elektroden mehrmals mit Wasser gespült und sofort anschließend mit einer Lösung, welche 5 mg/ml Glucoseoxidase, in einem Phosphat- puffer (pH = 7,0? 0,1 M) enthielt, 2 h umgesetzt. Die so erhaltenen Biosensoren wurden mit Pufferlösung und Wasser gespült und bei 4°C gelagert.

Auf analoge Weise konnten folgende Enzyme an die mit Poly- pyrrol beschichtete Elektrode gekoppelt werden: Galactoseoxidase, Aminosäureoxidase, Xanthinoxidase, Cholesterinoxidase und Ascorbatoxidase und gekoppelte Enzymsysteme.

Eine schematische Zeichnung eines erhaltenen Pyrrol-N- -Buttersäurepyrrol-Copolymers mit an der Carboxylgruppe der Buttersäure gekoppeltem Enzym ist in Fig. 1 dargestellt.

F) Aufbringen einer Deckschicht auf die Biosensoren

Um die Empfindlichkeit des Biosensors herabzusetzen und gleichzeitig den Meßbereich des Biosensors zu erhöhen, kann eine Deckschicht auf den Biosensor aufgebracht werden.

1 ml einer Lösung eines perfluorierten und sulfonierten Polymers wurde durch Zusatz von 20 μl Triethylamin und 25 μl Essigsäure gepuffert. Die Biosensoren wurden entweder durch Eintauchen in die Lösung oder durch Aufsprühen der Lösung auf die Oberfläche der Biosensoren beschichtet. Anschließend wurden die Biosensoren 30 min bei Raumtemperatur getrocknet und dann wieder bei 4°C gelagert.

Beispiel 2: Polymerisation von Pyrrol durch Gasphasenab- scheidung

Entsprechend dem Verfahren der Schritte A) und B) von Bei¬ spiel 1 vorbereitete, mit Gold beschichtete Elektroden wurden in eine Glas-Vakuumkammer eingebracht, Brom und das Gemisch aus substituiertem Pyrrol und Pyrrol wurden jeweils in getrennten Kammern 10 min auf -180°C gekühlt und die gesamte

_3 Apparatur wurde evakuiert (1,3.10 mbar) . Alle Ventile des

Systems wurden geschlossen und die Pyrrolkammer kontrolliert auf 0°C aufgewärmt. Gleichzeitig wurde die Brom enthaltende

Kammer auf -30°C gebracht. Indem abwechselnd ein Brom- und Pyrroldruck in der Vakuumkammer aufgebaut wurde und zwischen jedem Druckaufbau evakuiert wurde, konnten qualitativ hochwertige Schichten von Pyrrol-Copolymeren auf der Elektrode erhalten werden.

Auf analoge Weise können sowohl Homopolymere als auch ver- 5 schiedene copolymere Schichten abgeschieden werden.

Beispiel 3: Herstellung der substituierten Pyrrole durch Phasentransferkatalyse

10 0,05 M Pyrrol in 20 ml Dichlormethan und 8 g KOH werden mit 10 ml einer 10% wäßrigen Lösung von Tetramethylammonium- hydroxid versetzt. Zu dieser Mischung wird unter heftigem Rühren langsam eine 0,05 molare Lösung von Br-CH_-CH(0-C₂H_t.) _ (1-Bromacetacetal) in 40 ml Dichlormethan bei Raumtemperatur

15 zugetropft. Während dem Reaktionsablauf tritt eine leichte Gelbfärbung auf. Nach Beendigung der Reaktion wird die wäßrige Phase abgetrennt, das Lösungsmittel der organischen Phase sowie nicht umgesetzte Ausgangsmaterialien unter vermindertem Druck abgezogen.

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Beispiel 4:

0,05 M Dimethoxytetrahydrofuran und 0,05 M 4-Methylamino- benzoesäure werden gemeinsam mit 30 ml Essigsäure 30 min bei

25 70°C auf dem Wasserbad gerührt. Während der Reaktion tritt hiebei eine leichte Braunfärbung auf. Nach Ablauf der Reak¬ tionszeit wird die Reaktionsmischung abkühlen gelassen und zum Auskristallisieren des Produktes über Nacht auf einer Temperatur von etwa 5°C gehalten. Anschließend werden die

30 abgeschiedenen Kristalle abfiltriert und im Vakuum getrock¬ net. Das Produkt konnte in nahezu quantitativer Ausbeute erhalten werden.

In der beiliegenden Zeichnung sind in Fig. 2 Meßwerte, welche

35 mit einem Monolayer-Biosensor nach dem Stand der Technik und welche mit einem erfindungsgemäßen Biosensor erhalten werden, verglichen. Auf der Ordinate ist jeweils der gemessene Strom in nA angegeben. Das an den beiden Elektroden immobilisierte Enzym war jeweils Glucoseoxidase und es sollte daher in einer 0,1M Phosphatpufferlösung bei 25°C und einem Potential von 500 mV der Glucosegehalt der Lösung gemessen werden. Beide Lösungen enthielten jeweils 4 mM/1 Glucose, 1 mM/1 Glutathion, 10 mg/1 Ascorbat und 1% eines Hefemediums. Mit dem Monolayer-Biosensor (1) wurde ein Respons von 10 nA für Glucose, von 50 nA für Ascorbat, von 7,3 nA für Glutathion und von 2,3 nA für das Hefemedium gemessen. Daraus folgt, daß das Stδrsignal, welches auf den Ascorbatgehalt in der Lösung zurückzuführen ist, etwa 5-mal so stark wie das Glucosesignal ist. Mit dem erfindungsgemäßen, mit substituiertem Polypyrrol beschichteten Biosensor (2) wurde ein Glucoserespons von 210 nA, ein Ascorbatrespons von 14 nA, ein Respons für das Hedemedium von 2,3 nA und für das Glutathion von 1,7 nA gemessen. Es wird somit mit dem erfindungsgemäßen Biosen¬ sor (2) nicht nur ein etwa 10-mal so hoher Respons für Glucose erhalten, sondern es sind mit Ausnahme des Signals für Glucose auch alle anderen Signale, welche von die Messung störenden Verbindungen stammen, deutlich verringert, womit eine bedeutend genauere Messung des Glucosegehaltes einer Lösung mit dem mit einem substituierten Polypyrrol beschich¬ teten Biosensor (2) ermöglicht wird.

Claims

Patentansprüche:

1. Biosensor zur selektiven Bestimmung von enzymatisch umsetzbaren Substanzen, wie z.B. Glucose, mit auf einem inerten Träger angeordneten Elektroden und an einer Poly¬ pyrrolschicht immobilisierter Oxidase, wie z.B. Glucose¬ oxidase (GOD) , dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerschicht wenigstens eine permselektive, poröse Schicht aus N- oder 3-substituiertem Polypyrrol enthält, deren Substitution so gewählt ist, daß die Redoxaktivität und gegebenenfalls die Leitfähigkeit gegenüber Polypyrrolschichten wesentlich verringert ist.

2. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine poröse, elektrisch weitgehend isolierende Zwischen¬ schicht aus N- und/oder 3-substituiertem Polypyrrol ange¬ ordnet ist.

3. Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Elektrode Homopolymere und Copolymere aus substi¬ tuiertem Polypyrrol in wenigstens zwei Schichten aufgebracht sind.

4. Biosensor nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn- zeichnet, daß Carboxy-substituierte Polypyrrole aufgebracht sind.

5. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzymimmobilisat mit einer perm- selektiven Membrane abgedeckt ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines Biosensors nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein zu polymerisierendes Pyrrol mit Hilfe eines Oxidationsmit- tels, insbesondere Brom, bei Drücken zwischen 1.10 —5 und 0,1 mbar und Temperaturen zwischen -40 und +20°C auf dem die Elektroden aufweisenden Träger abgeschieden wird.

7. Verfahren zur Herstellung eines Biosensors nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das N- und/ oder 3-substituierte Monomer elektrochemisch auf dem die Elektroden aufweisenden Träger abgeschieden wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der substituierten Pyrrole Pyrrol mit einer

Verbindung der Formel RX, worin R -CH₂C00H, -(CH₂)₂COOH, -(CH₂)₃COOH, -(CH₂)₄COOH, -(CH^COOH, -(CH₂)_1QCOOH, -(C_gH₄)COOH, -CH(CH)₃CH₂COOH, -(CH₂)₂C(CH₃)₂COOH, -CH₂CH(CH₃)CH₂COOH, -CH(CH₃)COOH, -CH CH(CH₃)₂7COOH, -CH?CH₂CH(CH₃)₂ COOH, -CH/CH(CH₃)C₂H₅7COOH, -CH(CH₂C_gH₅)COOH, -(CH₂)₄CH(NH₂)COOH, -CH(CH₂OH)COOH, -CH(CH₂SH)COOH, -CH(CH )CONHCH(CH₃)COOH, -CH CONHCH₂COOH, -CH₂CONHCH(CH₃)COOH, -CH₂CH(OC₂H₅)₂, -CH₂CH(OC₂H₄)₂ -CH₂CH(OCH₃)₂, -CH₂CH(OC₃H_?)₂, -CH₂CH(OC₄H_g)₂, -CH₂CH(OC₃H_g)₂, -CH₂CH(OC₄H_g)₂ oder -CH₂CH(OCH₂)₂ bedeutet und X eine Abgangsgruppe, gewählt aus der Gruppe F, Cl, Br, I oder Tosyl bedeutet, mit einem Phasentransferkatalysator und/oder einem Kronenether in Anwesenheit einer starken Base, insbesondere NaOH oder KOH, umgesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Phasentransferkatalysatoren Tetraalkylammoniumsalze der Formel Z~N(R)₄7 X, worin n 1 oder 2 bedeutet, die Substitu¬ enten R gleich oder voneinander verschieden sein können und geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 20 C-Atomen bedeuten und X F, Cl, Br, I, C10₄, BF₄, PF_g, S0₄ oder SO- bedeutet, eingesetzt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der substituierten Pyrrole substituierte oder unsubstituierte fr -Aminocarbonsäuren, Aminosäuren oder Peptide mit bis zu 5 Monomereinheiten mit Dimethoxytetra¬ hydrofuran in saurer Lösung umgesetzt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als substituierte oder unsubstituierte Aminocarbonsäuren, ß-Aminopropansäure, fr -Aminobuttersäure, fr-Aminovalerian- säure, £ -Aminocapronsäure, _* ^*- -Aminoundecansäure, Amino- benzoesäure, mit F, Cl, Br und/oder Methyl substituierte Aminocarbonsäuren, insbesondere 3-Amino-3-methylpropansäure, 2-Fluoraminoessigsäure, 2-Bromaminoessigsäure, fr -Amino-2-

-chlorbuttersäure , fr -Amino-2-fluorbuttersäure, ^"-Amino-2-

-brombuttersäure, fr-Amino-2,2-dimethylbuttersäure, fr -Amino-2-chlor-2-methylbuttersäure, l-Amino-l,3-propyl- dicarbonsäure, fr -Amino-3-methylbuttersäure, als die Redox- aktivität vermindernde Substituenten eingesetzt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Aminosäuren Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Prolin, Lysin, Serin, Cystein und Arginin sowie Derivate dieser Aminosäuren als die Redoxaktivität vermin¬ dernde Substituenten eingesetzt werden.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Peptide mit bis zu 5 Monomereinheiten Peptide, die durch Kondensation von gleichen oder verschiedenen Aminosäuren gewonnen werden, insbesondere Alanylalanin, Glycylglycin, Alanylglycin, Ala-Ala-Ala, Gly-Ala-Gly und Gly-Gly-Ala, sowie Derivate dieser Peptide als die Redoxaktivität vermindernde Substituenten eingesetzt werden.

14. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß durch gegebenenfalls mit S0₃H , Br^", Pyrrol, Pyridin, 3-Methylpyridin oder Nicotinamid substituierte 2-Butene substituierte Pyrrole als die Redoxaktivität vermindernde Substituenten eingesetzt werden.

15. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß folgende substituierten Pyrrole als homopolymere Schicht auf den Träger abgeschieden werden:

2-(l - Pyrrolo) - acetylglycin l-Dodecylpyrrol

1-(4-Carboxybenzyl)- pyrrol

1-(4-Nitrophenyl) pyrrol

1-(4-Carboxyphenyl) pyrrol

3-Carboxymethyl-4-methyl-pyrrol.

1-o-Tosylpyrrol

1-p-Tosylpyrrol 10 1-Benzolsulfonylpyrrol

4-(3-Pyrrolo)-4-hydroxybuttersäure

4-(3-Pyrrolo)-4-ketobuttersäure

3-((Hydroxy 4-Nitrophenyl) methyl) pyrrol

3-((Keto 4-Nitrophenyl) methyl) pyrrol

15 16. Verfahren nach Anspruch 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrochemische Abscheidung in wenigstens zwei auf¬ einanderfolgenden Schritten erfolgt, wobei in wenigstens einem Schritt die Abscheidung eines Homopolymers mit substi¬ tuierten Pyrrolen vorgenommen wird.

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17. Verfahren nach Anspruch 7 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrochemische Abscheidung unter Anwendung eines Cyclovoltametrischen Verfahrens vorgenommen wird.

25 18. Verfahren nach Anspruch 7 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Cyclovoltametrische Verfahren unter Anwendung einer

Spannungsänderung von 50-200 mVs~ , vorzugsweise etwa

-1 100 mVs , vorgenommen wird.

30 19. Verfahren nach Anspruch 7 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Cyclovoltametrische Verfahren im Spannungsbereich von -500 mV bis +1800 mV durchgeführt wird.

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