ES2887110T3

ES2887110T3 - Medios para cromatografía de afinidad y dispositivos para cromatografía

Info

Publication number: ES2887110T3
Application number: ES15737823T
Authority: ES
Inventors: Feng Gu; Surya Kiran Chodavarapu; James Bogdanor; Dennis Mccreary; James Neil Pryor; James Rusche; James Peyser; Thomas Pauly
Original assignee: Repligen Corp; WR Grace and Co Conn; WR Grace and Co
Current assignee: Repligen Corp; WR Grace and Co Conn; WR Grace and Co
Priority date: 2014-01-16
Filing date: 2015-01-15
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2035-01-15
Also published as: JP2017505921A; PL3094390T3; US20160332142A1; EP3094390B1; JP6853670B2; SG11201605712SA; WO2015109068A1; EP3094390A4; US11229896B2; EP3094390A1

Abstract

Medios para cromatografía que comprenden: partículas de sílice porosa que tienen una mediana de diámetro de poro d50 de desde 60 nm hasta 160 nm (de 600 Å a 1600 Å), tal como se mide mediante porosimetría de mercurio; una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,99, en los que se mide la amplitud restando el diámetro de poro d10 del diámetro de poro d90 tal como se mide mediante porosimetría de mercurio y se calcula la amplitud relativa como la razón de (d90- d10)/d50); y una superficie funcionalizada que comprende un promedio de desde más de 1 hasta 3 moléculas conectoras por nanómetro cuadrado de área de superficie de dichas partículas de sílice porosa, determinada tal como se describe en la descripción con el título "Descripción del procedimiento general para la unión de sílice", en los que cada una de dichas moléculas conectoras antes de una reacción con una proteína comprende un grupo aldehído preparado mediante (1) hacer reaccionar (i) grupos hidroxilo en dichas partículas de sílice porosa y (ii) un silano que contiene al menos un grupo epoxi para formar al menos un diol y después de eso (2) convertir dicho al menos un diol en al menos un grupo aldehído; y en los que dicha superficie funcionalizada comprende una proteína A unida covalentemente a superficies de dichas partículas de sílice porosa a través de al menos algunas de dichas moléculas conectoras.

Description

DESCRIPCIÓN

Medios para cromatografía de afinidad y dispositivos para cromatografía

Campo de la invención

La presente invención se refiere a medios para cromatografía y a dispositivos para cromatografía que contienen medios para cromatografía y a métodos de producción de medios para cromatografía.

Antecedentes de la invención

Los medios para cromatografía de afinidad comprenden generalmente un soporte sólido que tiene un ligando unido que puede interaccionar con una molécula o moléculas diana. La cromatografía de afinidad es útil porque los ligandos desplegados sobre soportes sólidos, tales como perlas, son normalmente selectivos para la molécula diana. Esta selectividad permite un buen rendimiento, así como una purificación rápida y económica de moléculas diana.

La proteína A de Staphylococcus aureaus o la proteína A recombinante que tiene afinidad específica por inmunoglobulinas es un ligando de afinidad selectivo que se une a la mayoría de las subclases de inmunoglobulinas (por ejemplo, IgG), incluyendo anticuerpos monoclonales (Acm). Boyle, M. D. P. y Reis, K. J., 1987, Biotechnology, 5: 697. Una vez inmovilizada sobre un soporte para cromatografía poroso, tal como una resina, membrana u otros medios, la proteína A es útil para la purificación y producción comercial de Acm o IgG policlonal.

El rendimiento de medios para cromatografía de afinidad puede estar determinado por factores tales como la selectividad, transferencia de masa efectiva, capacidad de unión y selectividad de permeabilidad del lecho compacto del soporte. La optimización de tales características de rendimiento está determinada por una combinación e interacción de las propiedades de la matriz de base, el tipo de modificación química usada para la unión de ligandos y las propiedades de ligandos.

Los soportes de medios usados más habitualmente son polímeros de hidratos de carbono, tales como agarosa en perlas. Estos materiales presentan una baja unión a proteína inespecífica; sin embargo, son suaves y comprimibles y, por tanto, limitados en el uso a gran escala. Los soportes sólidos a base de sílice no experimentan muchas de las deficiencias asociadas con la agarosa u otros tipos de soportes poliméricos.

Los medios de afinidad basados en sílice porosa, por ejemplo, controlled pore glass (vidrio de poro controlado - CPG), han encontrado cierta utilidad comercial debido a su alta capacidad y características de flujo a presión adecuadas. En McCue et al, 2003, Journal of Chromatography A, 989(1 ):139, se usaron perlas de vidrio de poro controlado (tamaños de partícula de 56 a 100 pm) de dos tamaños de poro diferentes: 70 nm y 100 nm (700 Á y 1000 Á) para soporte sólido de medios de afinidad de proteína A. Descubrieron que se lograban mayores capacidades estáticas y dinámicas con el material de menor tamaño de poro de 70 nm (700 Á), y esto se racionalizó como resultado de la mayor área de superficie y mayores concentraciones de ligandos asociados en la superficie. Notablemente, era una creencia común que los soportes a base de sílice porosa requieren un tamaño de poro uniforme a lo largo de una distribución estrecha de tamaño de poro. Por ejemplo, según Roberts et al (documento WO199009237) se prefiere vidrio poroso con tamaño de poro uniforme (es decir, la distribución de tamaño de poro se encuentra dentro de un intervalo estrecho, el 90 % de todos los poros tienen un diámetro de ± 10 % de la media) como medios de soporte de afinidad. Copan (documento EP0263934) también definió un intervalo estrecho de tamaño de poro para sus materiales. Los geles de sílice que tienen una distribución de tamaño de poro indefinida y amplia se consideraron, generalmente, insatisfactorios como soportes para medios de afinidad. Además, el documento US 2009/0246885 A1 da a conocer un soporte sólido adecuado para realizar cromatografía de afinidad que comprende una partícula de sílice que tiene un tamaño de poro mayor de 63 nm y menor de 100 nm y un tamaño medio de partícula de sílice mayor de 55 pm y menor de 70 pm. Puede haber un ligando de afinidad, tal como la proteína A, unido al soporte sólido. El ligando de afinidad puede acoplarse al soporte de sílice por medio de una molécula conectora. Los ejemplos mencionan perlas de vidrio funcionalizadas con proteína A. El documento US 2004/028901 A1 da a conocer una composición porosa que comprende material carbonáceo y/u óxido inorgánico que comprende agregados que comprenden partículas; y conectores discretos que conectan los agregados. Hay conectores unidos a al menos dos de los agregados y, por tanto, forman una red de agregados. Puede haber conectores unidos covalentemente a al menos uno de los agregados. Las partículas de óxido inorgánico como tales pueden ser porosas o no porosas. Los agregados tienen poros (entre partículas). Los poros de los agregados pueden tener un diámetro de 5 nm a 200 nm. El óxido inorgánico puede seleccionarse, entre muchos otros, de sílice. Los conectores pueden ser productos naturales o sintéticos, tales como moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas, polímeros y biopolímeros. Existe un gran número de conectores mencionados, incluyendo polímeros tales como poliorganosiloxanos/siliconas y proteínas. El documento US 4532232 A da a conocer un agente de separación que comprende un sólido de silicato o sílice insoluble en agua que tiene lecitina unida covalentemente al mismo mediante una cadena de alquileno de 1 a 22 átomos de carbono. La sílice puede ser porosa o no porosa. El documento US 2011/160104 A1 da a conocer partículas cerámicas que contienen microesferas y/o poros que tienen una pluralidad de microesferas y/o poros contenidos en las mismas, y en las que dichas microesferas y/o dichos poros están opcionalmente rodeados al menos parcialmente por al menos un compuesto vítreo, y una mayoría de dichas microesferas y/o poros de gas no están en contacto entre sí. El cuerpo sinterizado puede comprender al menos en parte sílice. Las partículas pueden tener una mediana de tamaño de poro d50 de 0,1 a 100 pm.

Existe una necesidad en la técnica de aumentar la productividad y la eficiencia del procedimiento en medios para cromatografía de afinidad y operaciones cromatográficas para la purificación y producción de biopolímeros.

Sumario de la invención

Ahora se ha descubierto inesperadamente que medios para cromatografía de afinidad basados en proteína A que comprenden un soporte de óxido inorgánico poroso que tiene una distribución y anchura de tamaño de poro especificadas, en combinación con una densidad de conector especificada presentan una capacidad de unión dinámica de proteína A mejorada para anticuerpos monoclonales (por ejemplo, IgG1) y buena selectividad, es decir, baja unión a proteína inespecífica para proteínas no deseadas. Particularmente, se descubrió que un soporte a base de sílice que tiene un tamaño de poro no uniforme a lo largo de una amplia distribución de tamaño de poro proporcionó unos medios de afinidad que tienen un rendimiento de capacidad de unión dinámica de proteína A comparable con medios de afinidad de proteína A conocidos previamente que comprenden un soporte de vidrio de poro controlado que tiene un menor tamaño de partícula y una distribución estrecha de tamaño de poro. Ventajosamente, los medios de afinidad de la invención proporcionan alta capacidad de unión para anticuerpos monoclonales con baja unión a proteína inespecífica mientras se minimizan los problemas asociados con la contrapresión cuando se usan en una columna para cromatografía.

Por consiguiente, la presente invención proporciona medios para cromatografía basados en sílice mejorados y dispositivos para cromatografía que contienen tales medios para cromatografía. Los dispositivos para cromatografía dados a conocer permiten una operación cromatográfica más eficiente, productiva y/o ecológica debido a una o más de las siguientes ventajas con respecto a las operaciones cromatográficas convencionales: eliminación de una etapa de relleno del dispositivo por parte del usuario; eliminación de etapas de clean-in-place (limpieza in situ - CIP); eliminación de las etapas de clean-in-place (limpieza in situ - CIP) utilizando disolución de hidróxido de sodio; eliminación de cualquier etapa de validación por parte del usuario; y uso de un dispositivo para cromatografía que comprende material biodegradable.

Según la reivindicación 1, la invención proporciona medios para cromatografía que comprenden:

partículas de sílice porosa que tienen una mediana de diámetro de poro d50 de desde 60 nm hasta 160 nm (de 600 Á a 1600 Á), tal como se mide mediante porosimetría de mercurio; una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,99, en los que se mide la amplitud restando el diámetro de poro d10 del diámetro de poro d90 tal como se mide mediante porosimetría de mercurio y se calcula la amplitud relativa como la razón de (d90-d10)/d50); y una superficie funcionalizada que comprende un promedio de desde más de 1 hasta 3 moléculas conectoras por nanómetro cuadrado de área de superficie de dichas partículas de sílice porosa, determinada tal como se describe en la descripción con el título “ Descripción del procedimiento general para la unión de sílice” .

en los que cada una de dichas moléculas conectoras antes de una reacción con una proteína comprende un grupo aldehído preparado mediante (1) hacer reaccionar (i) grupos hidroxilo en dichas partículas de sílice porosa y (ii) un silano que contiene al menos un grupo epoxi para formar al menos un diol y, después de eso, (2) convertir dicho al menos un diol en al menos un grupo aldehído; y

en los que dicha superficie funcionalizada comprende una proteína A unida covalentemente a superficies de dichas partículas de sílice porosa a través de al menos algunas de dichas moléculas conectoras.

La presente invención también se refiere a métodos de producción de medios o soporte para cromatografía.

Según la reivindicación 13, la invención proporciona un método para producir los medios para cromatografía tal como se definen en la reivindicación 1, comprendiendo dicho método: formar las partículas de sílice porosa; y

hacer reaccionar en una parte de grupos hidroxilo en la superficie de las partículas de sílice porosa con al menos un silano que contiene al menos un grupo epoxi para formar al menos un diol y, opcionalmente, un grupo hidroxilo sin reaccionar, en la superficie de las partículas de sílice;

convertir dicho al menos un diol en un grupo aldehído;

hacer reaccionar al menos un grupo aldehído con al menos un grupo amino libre en la proteína A para unir covalentemente la proteína a la superficie de las partículas de sílice porosa a través de un grupo imina;

reducir el grupo imina a un grupo amina para formar una superficie funcionalizada en las partículas de sílice porosa.

La presente invención se refiere además a dispositivos para cromatografía, que comprenden:

una carcasa de dispositivo; y

medios para cromatografía situados dentro de dicha carcasa de dispositivo; comprendiendo dichos medios para cromatografía los medios para cromatografía tal como se definen en la reivindicación 1.

Estas y otras características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes después de una revisión de la siguiente descripción detallada de las realizaciones dadas a conocer y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La presente invención se describe adicionalmente con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

la figura 1 representa una vista de un dispositivo para cromatografía a modo de ejemplo de la presente invención;

la figura 2 representa una vista de un sistema para cromatografía a modo de ejemplo que comprende la columna para cromatografía mostrada en la figura 1;

la figura 3 representa un esquema de reacción de una realización a modo de ejemplo de medios para cromatografía según la presente invención;

la figura 4 representa un gráfico de distribución de tamaño de poro de una realización a modo de ejemplo de medios para cromatografía según la presente invención;

la figura 5A representa un gráfico de unión inespecífica frente a la densidad de conector de una realización a modo de ejemplo de los medios para cromatografía de la invención usados en los ejemplos 1-8;

la figura 5B representa un gráfico de la capacidad de unión dinámica frente a la densidad de conector de una realización a modo de ejemplo de los medios para cromatografía según la invención usados en los ejemplos 1-8;

la figura 5C demuestra el cambio de la capacidad de unión inespecífica y de unión dinámica con respecto a la densidad de conector de superficie usada en los ejemplos 1 -8;

la figura 6 ilustra una comparación de las distribuciones de tamaño de poro para la sílice usada en los ejemplos 9-12; y

la figura 7 ilustra una comparación de las distribuciones de tamaño de poro para la sílice usada en el ejemplo 10 y en el ejemplo comparativo 4.

Descripción detallada de la invención

Para fomentar una comprensión de los principios de la presente invención, se presentan a continuación descripciones de realizaciones específicas de la invención y se usa un lenguaje específico para describir las realizaciones específicas. No obstante, se comprenderá que no se pretende ninguna limitación del alcance de la invención mediante el uso de lenguaje específico. Se contemplan alteraciones, modificaciones adicionales, y tales aplicaciones adicionales de los principios de la presente invención analizadas tal como se le ocurrirían normalmente a un experto en la técnica a la que pertenece la invención.

Cabe señalar que, tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un(o)” , “una” , “el” y “ la” incluyen referentes en plural, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. De este modo, por ejemplo, la referencia a “un óxido” incluye una pluralidad de tales óxidos y la referencia a “óxido” incluye la referencia a uno o más óxidos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

“Aproximadamente” que modifica, por ejemplo, la cantidad de un componente en una composición, las concentraciones, los volúmenes, las temperaturas de proceso, los tiempos de proceso, las recuperaciones o los rendimientos, las velocidades de flujo y valores similares, e intervalos de los mismos, empleados en la descripción de las realizaciones de la divulgación, se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede producirse, por ejemplo, a través de procedimientos típicos de medición y manipulación; a través de errores inadvertidos en estos procedimientos; a través de diferencias en los componentes usados para llevar a cabo los métodos; y otras consideraciones similares. El término “aproximadamente” también abarca cantidades que difieren debido al envejecimiento de una formulación con una concentración o mezcla inicial particular, y cantidades que difieren debido al mezclado o el procesamiento de una formulación con una concentración o mezcla inicial particular. Tanto si están modificados o no por el término “aproximadamente” , las reivindicaciones adjuntas incluyen equivalentes de estas cantidades.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ biomolécula” significa cualquier molécula que produce un organismo vivo, incluyendo moléculas grandes tales como proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos; y pequeñas moléculas tales como metabolitos primarios, metabolitos secundarios y productos naturales. Los ejemplos de biomoléculas incluyen células y residuos celulares; anticuerpos, proteínas y péptidos; ácidos nucleicos, tales como ADN y ARN; endotoxinas; virus; vacunas y similares. Otros ejemplos de biomoléculas incluyen aquellos citados en los documentos WO 2002/074791 y en US-5.451.660.

Tal como se usa en el presente documento, “óxidos inorgánicos” se define como compuestos binarios de oxígeno donde el componente inorgánico es el catión y el óxido es el anión. El material inorgánico incluye metales que también pueden incluir metaloides. Los metales incluyen aquellos elementos situados a la izquierda de la línea diagonal trazada del boro al polonio en la tabla periódica. Los metaloides o semimetales incluyen aquellos elementos que se encuentran a la derecha de esta línea. Los ejemplos de óxidos inorgánicos incluyen sílice, alúmina, titania, zircona, etc., y mezclas de las mismas.

Las partículas pueden tener una variedad de diferentes formas simétricas, asimétricas o irregulares, incluyendo la forma de cadena, varilla o listón. Las partículas pueden tener diferentes estructuras, incluyendo amorfas o cristalinas, etc. Las partículas pueden incluir mezclas de partículas que comprenden diferentes composiciones, tamaños, formas o estructuras físicas, o que pueden ser iguales excepto por diferentes tratamientos de superficie. La porosidad de las partículas puede ser dentro de partícula o entre partículas en los casos en los que se aglomeran partículas más pequeñas para formar partículas más grandes.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “ material poroso ordenado” se refiere a partículas porosas que tienen un orden estructural con una distribución de tamaño de poro muy estrecha, de tal manera que la distribución de tamaño de poro tiene una amplitud relativa, tal como se define en el presente documento, menor de 0,5.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “ material poroso no ordenado” se refiere a partículas porosas que presentan una distribución de tamaño de poro que no es uniforme (es decir, una distribución de tamaño de poro muy amplia que es de naturaleza multimodal), de tal manera que la distribución de tamaño de poro tiene una amplitud relativa, tal como se define en el presente documento, mayor de 0,5.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “superficie funcionalizada” significa partículas inorgánicas que se han modificado en su superficie mediante reacción con al menos un compuesto funcional para alterar la humectabilidad o la selectividad de al menos una parte de la superficie de la partícula, incluida el área de superficie en la parte externa de las partículas, y/o en el área de superficie de los poros internos. La superficie funcionalizada puede usarse para formar una fase unida (de manera covalente o iónica), una superficie recubierta (por ejemplo, unida a C18 de fase inversa), una superficie revestida (por ejemplo, revestida con carbono como en EP6), una superficie polimerizada (por ejemplo, intercambio iónico), una superficie inherente (por ejemplo, material híbrido inorgánico/orgánico) o similar. Por ejemplo, la reacción de partículas inorgánicas con octadeciltriclorosilano forma una “fase inversa” mediante la unión covalente del silano a la superficie inorgánica. En otro ejemplo, la reacción de las partículas inorgánicas con aminopropiltrimetoxisilano seguida de la cuaternización del grupo amino forma una “fase de intercambio aniónico” . En un tercer ejemplo, puede formarse una fase unida mediante reacción de las partículas inorgánicas con aminopropiltrimetoxisilano seguida de la formación de una amida con un cloruro de ácido. Otras fases unidas incluyen diol, ciano, catión, afinidad, quiral, amino, C4, C8, hydrophilic interaction (interacción hidrófila - HILIC), hydrophobic interaction (interacción hidrófoba - HIC), modo mixto, exclusión molecular, etc. Como parte de la fase unida o superficie funcionalizada, puede usarse un ligando para mostrar una interacción específica con la molécula o biomolécula diana (por ejemplo, agente de ligamiento), tal como los expuestos en el documento US-4.895.806.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ molécula conectora” o “conector” se usa indistintamente en el presente documento para definir una molécula unida a una superficie de las partículas inorgánicas porosas, en la que la molécula permite la unión de otras moléculas, tales como una biomolécula, a la superficie de las partículas inorgánicas porosas a través de la molécula conectora.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ peso molecular” se define que significa la masa molar de una única molécula de un compuesto o polímero particular.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cromatografía” significa el proceso de hacer pasar una mezcla disuelta en una fase móvil a través de una fase estacionaria (es decir, medios para cromatografía) alojada en una columna o un cartucho u otro recipiente, que separa una molécula diana de otras moléculas en la mezcla y permite que se aísle. Dependiendo del tipo de cromatografía usada, la molécula diana puede adsorberse sobre la fase estacionaria mientras los componentes no deseados se hacen pasar a través del dispositivo, o viceversa. El término “cromatografía de líquidos” es una forma de cromatografía en la que se usa un líquido como fase móvil y un sólido o un líquido sobre un soporte sólido como la fase estacionaria. El término “cromatografía ultrarrápida” significa cromatografía de líquidos que se realiza a una presión positiva (por ejemplo, hasta 2,068 x 106 Pa (300 psi)). El término “cromatografía de líquidos de alta resolución” (HPLC) significa cromatografía de líquidos que se realiza a una alta presión positiva (por ejemplo, hasta aproximadamente 3,447 x 107 PA (5000 psi)). El término “cromatografía preparativa” significa HPLC para el aislamiento y la purificación de un compuesto o una molécula diana. El término “cromatografía de líquidos de proteínas rápida” (FPLC) es una forma de HPLC útil para la separación de biomoléculas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ impurezas” significa materiales presentes en las partículas inorgánicas, distintos de los inorgánicos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ irregular” aplicado a las partículas inorgánicas significa que la forma de la partícula de una partícula a la siguiente no es uniforme (es decir, forma de partícula aleatoria) con una relación de aspecto mayor de 1,0.

Tal como se usa en el presente documento, el término “carcasa” significa un recipiente o contenedor para contener una fase estacionaria para su uso en cromatografía, e incluye cartuchos, columnas, tubos, dispositivos, lechos, bolsas, y similares.

Tal como se usa en el presente documento, el término “fase estacionaria” o “ medios para cromatografía” o “ soporte para cromatografía” significa un material que incluye una superficie funcionalizada (por ejemplo, ligandos unidos a la superficie de las partículas inorgánicas a través de algún grupo funcional) que muestra diferentes afinidades por diferentes componentes en una mezcla de muestras, que se usa en cromatografía para separar una molécula diana (por ejemplo, agentes de ligamiento) de una mezcla de una o más de otras moléculas. Las fases estacionarias incluyen materiales orgánicos e inorgánicos, o híbridos de los mismos, y pueden estar en forma de partículas, monolitos, membranas, recubrimientos, y similares.

Tal como se usa en el presente documento, el término “distribución de tamaño de poro” significa la abundancia relativa de cada tamaño de poro en un volumen representativo de partículas inorgánicas porosas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ mediana de diámetro de poro” (dsü) se usa para significar el punto medio para el diámetro del poro en el que el 50 % de los volúmenes de poro lo contribuyen poros que tienen un menor diámetro de poro que el diámetro del punto medio y el 50 % lo contribuyen poros que tienen un mayor diámetro que el diámetro del punto medio.

Tal como se usa en el presente documento, el término “volumen de poro” se define como el volumen de un líquido que se adsorbe en la estructura de poro de la muestra a la presión de vapor de saturación, suponiendo que el líquido adsorbido tiene la misma densidad que la densidad aparente del líquido. La medición de mercurio del volumen de poro y la distribución de tamaño de poro de las partículas inorgánicas porosas en la presente invención pueden obtenerse usando cualquier porosímetro de mercurio adecuado capaz de un intervalo de presión de presión atmosférica hasta aproximadamente 4,1 x 108 Pa (4100 bar), con un ángulo de contacto 0 = 140°, y una tensión superficial de mercurio de 485 dinas/cm a 25,2 0C (la densidad de Hg a tal temperatura es de 13,5335 g/ml).

Tal como se usa en el presente documento, el término “ amplitud relativa” se define como una medida de la anchura de la distribución de tamaño de poro. La “ amplitud” se mide restando el tamaño de poro d10 (es decir, el tamaño/diámetro de poro por debajo del cual se encuentra el 10 % del volumen de poro) del tamaño de poro dg0 (es decir, el tamaño/diámetro de poro por debajo del cual se encuentra el 90 % del volumen de poro) tal como se miden mediante porosimetría de mercurio. El término “ amplitud relativa” se define como la razón de (dg0-d10)/d50.

El término “ área de superficie” , tal como se usa en el presente documento, se determina mediante análisis de área de superficie BET. El método BET para medir el área de superficie se ha descrito en detalle por Brunauer, Emmett y Teller en J. Am. Chem. Soc. 60 (1938) 309-319.

Tal como se usa en el presente documento, el término “capacidad de unión dinámica” , en lo que se refiere a unos medios para cromatografía, se usa en el presente documento para indicar la cantidad de proteína diana a la que se unirán los medios en condiciones de flujo antes de que se produzca un avance significativo de la proteína no unida. En la práctica, se rellenan los medios para cromatografía en una columna o en un cartucho y se hace pasar una disolución de la proteína diana en tampón de baja fuerza iónica a través de la columna. La proteína no unida comenzará a salir de la columna una vez que la unión de la proteína a los medios haya alcanzado su capacidad máxima. Se generará una curva de avance y en las mismas condiciones, mientras más tiempo tarda la proteína en iniciar el avance, mayor es la capacidad de unión que tienen los medios.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ unión a proteína inespecífica” se usa en el presente documento para indicar que las proteínas de impureza se unen sobre medios de afinidad debido a interacciones inespecíficas, esta unión es indeseable y reduciría la capacidad de unión de proteínas deseadas, tales como IgG, en el caso de cromatografía de proteína A, y también conduciría a la presencia de una mayor cantidad de impurezas en los productos de cromatografía después de eluir todas las proteínas en la etapa de elución. Una de las causas habituales de unión inespecífica es la interacción de proteínas con otros tipos de grupos funcionales en los medios (tales como grupos silanol expuestos sin reaccionar en la superficie de sílice).

La presente invención se refiere a medios para cromatografía y a dispositivos para cromatografía, tales como columnas para cromatografía. La presente invención se refiere además a métodos para producir dispositivos para cromatografía. A continuación se proporciona una descripción de medios para cromatografía a modo de ejemplo, columnas para cromatografía a modo de ejemplo, métodos para producir medios para cromatografía y columnas para cromatografía, y métodos para usar medios para cromatografía y columnas para cromatografía.

La figura 1 proporciona una vista de una columna 100 para cromatografía a modo de ejemplo de la presente invención. Tal como se muestra en la figura 1, la columna 100 para cromatografía a modo de ejemplo comprende una carcasa 150 de columna; y un espacio 151 de lecho de medios situado dentro de la carcasa 150 de columna. En algunas realizaciones, los medios 151 comprenden partículas inorgánicas porosas que tienen una mediana de diámetro de poro de desde 60 hasta 160 nm (de 600 Á a 1600 Á); una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,99; y una superficie funcionalizada que comprende un promedio de desde más de 1 hasta 3 moléculas conectoras por nanómetro cuadrado de área de superficie de dichas partículas inorgánicas porosas. En algunas realizaciones, los medios 151 comprenden partículas inorgánicas porosas que tienen una mediana de diámetro de poro de desde 60 hasta 160 nm (de 600 Á a 1600 Á); una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,99; y una superficie funcionalizada que comprende una proteína A unida covalentemente a partes de superficie de dichas partículas inorgánicas porosas; teniendo dicha proteína un peso molecular que oscila entre 10.000 y 100.000 D. En algunas realizaciones, los medios 151 comprenden partículas inorgánicas porosas que tienen un área de superficie BET promedio de desde 20 m2/g hasta 100 m2/g; un volumen de poro promedio de al menos aproximadamente 1 ml/g; una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,99; una superficie funcionalizada que comprende un promedio de desde más de 1 hasta 3 moléculas conectoras por nanómetro cuadrado de área de superficie de dichas partículas inorgánicas porosas; y una proteína A unida covalentemente a al menos algunas de dichas moléculas conectoras; teniendo dicha proteína un peso molecular que oscila entre 10.000 y 100.000 D.

Tal como se muestra adicionalmente en la figura 1, la carcasa 150 de columna comprende normalmente un elemento 156 de carcasa tubular, una primera tapa 152 de extremo del elemento de carcasa tubular, una segunda tapa 153 de extremo del elemento de carcasa tubular opuesta a la tapa 152 de extremo, una entrada 154 de columna y una salida 155 de columna. La columna 100 puede rellenarse con partículas inorgánicas porosas en forma de una suspensión a través de la entrada 154 de columna, comprendiendo la entrada de columna una perforación 157 central que tiene un paso en la misma, y la boquilla 158. Puede usarse una amplia variedad de boquillas que facilitan la distribución y el relleno uniforme de la suspensión dentro del espacio de lecho. Los filtros 159 se sitúan, cada uno, en la cara interior de las tapas 152, 153 de extremo y actúan con el elemento 156 tubular para definir el espacio 151 de lecho y también para impedir la fuga del medio particulado del espacio 151 de lecho. Un canal 160 de distribución está ubicado de manera transversal a través de la cara de la primera tapa 152 de extremo y/o la segunda tapa 153 de extremo, y está en comunicación de fluido con el filtro 159. El canal 160 de distribución de fluido actúa facilitando la distribución radial del líquido. En una forma simple, el canal 160 de distribución comprende al menos una ranura circunferencial y/o radial en la cara de las tapas 152 y 153 de extremo primera y/o segunda. La ranura está situada de tal manera que afecta a la distribución circunferencial y/o radial del líquido que emana de la boquilla 158 de la entrada 154. Se comprenderá que es posible una amplia variedad de capacidades de columna, que oscilan normalmente entre 0,1 y 2000 litros, y entre 0,1 y 100 litros cuando se usa la columna como columna desechable. Véase también la publicación de la solicitud de patente estadounidense n. ° 2008/0017579.

La carcasa 150 de columna puede estar formada a partir de una variedad de materiales. Normalmente, la carcasa 150 de columna comprende un material polimérico, un material metálico, un material de vidrio, un material cerámico, o un material compuesto de los mismos, y en algunas realizaciones deseables, comprende un material polimérico biodegradable. Los materiales poliméricos adecuados para formar la carcasa 150 de columna incluyen, pero no se limitan a, cualquier sólido orgánico sintético o semisintético, tales como plásticos que son moldeables, incluyendo poliolefinas. Los materiales metálicos adecuados para formar la carcasa 150 de columna incluyen, pero no se limitan a, acero inoxidable.

La carcasa 150 de columna puede formarse usando técnicas convencionales de termoformado. Por ejemplo, el elemento 156 de carcasa tubular, la primera tapa 152 de extremo del elemento de carcasa tubular y la segunda tapa 153 de extremo del elemento de carcasa tubular de la carcasa 150 de columna pueden formarse cada uno de ellos independientemente a través de una etapa de moldeo. En algunas realizaciones, el elemento 156 de carcasa tubular y uno de entre (i) la primera tapa 152 de extremo del elemento de carcasa tubular y (ii) la segunda tapa 153 de extremo del elemento de carcasa tubular de la carcasa 150 de columna se forman a través de una única etapa de moldeo (es decir, una de las tapas de extremo se forma de manera solidaria en un extremo del elemento 156 de carcasa tubular).

Tal como se ha analizado anteriormente, los medios 151 situados dentro de la carcasa 150 de columna pueden comprender partículas inorgánicas porosas que tienen una mediana de tamaño de poro de desde 60 hasta 160 nm (de 600 Á a 1600 Á). En algunas realizaciones, las partículas inorgánicas porosas tienen una mediana de diámetro de poro de desde 80 hasta 150 nm (de 800 Á a 1500 Á) (o cualquier valor entre, e incluyendo, 100 nm (1000 Á) y 130 nm (1300 Á) en incrementos de 0,1 nm (1,0 Á) (por ejemplo, 128 nm (1280 Á)). En todavía algunas realizaciones, las partículas inorgánicas porosas tienen una mediana de diámetro de poro de desde 100 nm hasta 130 nm (de 1000 Á a 1300 Á) o cualquier intervalo de valores entre, e incluyendo, de 100 nm a 130 nm (de 1000 Á a 1300 Á) (por ejemplo, desde 108 nm hasta 126 nm (de 1080 Á a 1260 Á)).

Las partículas inorgánicas porosas tienen normalmente un volumen de poro, tal como se mide mediante porosimetría de Hg, de al menos aproximadamente 0,9 ml/g, o al menos 1,0 ml/g. En una realización a modo de ejemplo de la presente invención, las partículas inorgánicas porosas tienen un volumen de poro, tal como se mide mediante porosimetría de nitrógeno, de desde 1,0 ml/g hasta 3,0 ml/g. En otra realización a modo de ejemplo de la presente invención, las partículas inorgánicas porosas tienen un volumen de poro, tal como se mide mediante porosimetría de Hg, de desde 1,0 ml/g hasta 2,0 ml/g.

Las partículas inorgánicas porosas pueden tener una distribución de tamaño de poro de tal manera que, generalmente, al menos el 40 % del volumen total de poro tiene poros en un diámetro de entre 60 y 160 nm (de 600 Á a 1600 Á). En una realización, desde el 40 % hasta el 90 % del volumen total de poros tiene poros en un diámetro de entre 60 y 160 nm (de 600 Á a 1600 Á);.

En una realización preferida, al menos el 20 % del volumen total de poros tiene poros en un diámetro que oscila entre 100 y 160 nm (de 1000 Á a 1600 Á). En otra realización, desde el 20 % hasta el 60 % del volumen total de poros tiene poros en un diámetro de entre 100 y 160 nm (de 1000 Á a 1600 Á).

En otra realización, al menos el 15 % del volumen total de poros tiene poros en un diámetro de entre 120 y 150 nm (de 1200 Á a 1500 Á). En otras realizaciones, del 15 % al 30 % del volumen total de poros tiene poros en un diámetro de entre 120 y 150 nm (de 1200 Á a 1500 Á).

Las partículas inorgánicas porosas tienen una amplitud relativa con respecto a la distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,99, o al menos aproximadamente 1,0, o al menos aproximadamente 1,1, o al menos aproximadamente 1,2, o al menos aproximadamente 1,3, o al menos aproximadamente 1,4, o al menos aproximadamente 1,5. En algunas realizaciones, las partículas inorgánicas porosas tienen una amplitud relativa con respecto a la distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,99, o al menos aproximadamente 1,0, o al menos aproximadamente 1,1, o al menos aproximadamente 1,2, o al menos aproximadamente 1,3, o al menos aproximadamente 1,4, o al menos aproximadamente 1,5, hasta al menos aproximadamente 2,0.

Las partículas inorgánicas porosas tienen normalmente un tamaño de partícula, tal como se mide mediante mediciones de dispersión de luz, que oscilan entre 1 micrómetro (pm) y 150 pm. Las partículas inorgánicas porosas tienen normalmente una mediana de tamaño de partícula de al menos aproximadamente 1 pm, más normalmente, menor de aproximadamente 120 pm. En algunas realizaciones, las partículas inorgánicas porosas tienen una dimensión de partícula promedio de desde 10 hasta 120 pm, de manera más deseable, desde 30 hasta 120 pm. En otras realizaciones, las partículas inorgánicas porosas tienen una dimensión de partícula promedio de desde 50 hasta 90 pm. En una realización deseada, las partículas inorgánicas porosas tienen una dimensión de partícula promedio de aproximadamente 70 pm.

Las partículas inorgánicas porosas tienen normalmente una forma irregular, pero pueden tener cualquier forma (por ejemplo, esférica, elíptica, etc.). Independientemente de la forma, las partículas inorgánicas porosas tienen normalmente una dimensión de partícula promedio tal como se analiza en el presente documento.

Las partículas inorgánicas porosas tienen normalmente una relación de aspecto de al menos aproximadamente 1,0 tal como se mide, por ejemplo, usando técnicas de Transmission Electron Microscopy (Microscopía electrónica de transmisión - TEM). Tal como se usa en el presente documento, el término “ relación de aspecto” se usa para describir la razón entre (i) la dimensión de partícula promedio de las partículas inorgánicas porosas y (ii) la dimensión de partícula en sección transversal promedio de las partículas inorgánicas porosas, en el que la dimensión de partícula en sección transversal es sustancialmente perpendicular a la mayor dimensión de partícula de las partículas inorgánicas porosas. En algunas realizaciones de la presente invención, las partículas inorgánicas porosas tienen una relación de aspecto de al menos aproximadamente 1,1 (o al menos aproximadamente 1,2, o al menos aproximadamente 1,3, o al menos aproximadamente 1,4) hasta aproximadamente 5,0. Normalmente, las partículas inorgánicas porosas tienen una relación de aspecto de desde 1,0 hasta 1,5.

Las partículas inorgánicas porosas también pueden tener un área de superficie, tal como se mide mediante el método de adsorción de nitrógeno BET (es decir, el método de Brunauer-Emmet-Teller), de al menos aproximadamente 10 m2/g, o al menos aproximadamente 20 m2/g, o al menos aproximadamente 25 m2/g, o al menos aproximadamente 30 m2/g. En una realización a modo de ejemplo de la presente invención, las partículas inorgánicas de óxido porosas tienen un área de superficie BET de desde 20 m2/g hasta 200 m2/g, o desde 25 m2/g hasta 150 m2/g o desde 30 m2/g hasta 100 m2/g. En una realización a modo de ejemplo adicional de la presente invención, las partículas inorgánicas de óxido porosas tienen un área de superficie BET de desde 20 m2/g hasta 500 m2/g, o desde 20 m2/g hasta 200 m2/g, o desde 20 m2/g hasta 100 m2/g.

Las partículas inorgánicas porosas comprenden sílice y pueden comprender además una variedad de materiales inorgánicos incluyendo, pero sin limitarse a, alúmina, zircona, o mezclas de las mismas. Las partículas comprenden de manera deseable sílice que tiene una pureza de al menos aproximadamente el 93 % en peso de SiÜ2, o al menos aproximadamente el 93 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente el 94 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente el 95 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente el 96 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente el 97 % en peso de SÍO2, o al menos aproximadamente el 98 % en peso de SÍO2 hasta el 100 % en peso de S O basándose en el peso total de la partícula.

La presente invención también se refiere a métodos para producir los medios para cromatografía descritos en el presente documento. En un método a modo de ejemplo, el método para producir medios para cromatografía comprende partículas inorgánicas porosas, en el que las partículas inorgánicas porosas tienen una mediana de diámetro de poro de desde 60 hasta 160 nm (de 600 Angstroms (Á) a 1600 Á), y una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,99; y hacer reaccionar las partes de superficie de las partículas inorgánicas porosas con al menos un reactante para formar una superficie funcionalizada que comprende un promedio de desde más de 1 hasta 3 moléculas conectoras por nanómetro cuadrado de área de superficie de las partículas inorgánicas porosas. En otro método a modo de ejemplo, el método para producir medios para cromatografía comprende formar partículas inorgánicas porosas, en el que las partía las inorgánicas porosas tienen una mediana de diámetro de poro de desde 60 hasta 160 nm (de 600 Á a 1600 Á) y una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,99; y hacer reaccionar las partes de superficie de las partículas inorgánicas porosas con al menos un reactante para formar una superficie funcionalizada que comprende una proteína A unida covalentemente a las partes de superficie de dichas partículas inorgánicas porosas, teniendo dicha proteína un peso molecular que oscila entre 10.000 y 100.000 D. En aún otro método a modo de ejemplo, el método para producir medios para cromatografía comprende formar partículas inorgánicas porosas, en el que las partículas inorgánicas porosas tienen un área de superficie BET promedio de desde 20 m2/g hasta 100 m2/g, un volumen de poro promedio de al menos aproximadamente 1 ml/g y una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,99; y hacer reaccionar las partes de superficie de las partículas inorgánicas porosas con al menos un reactante para formar una superficie funcionalizada que comprende un promedio de desde más de 1 hasta 3 moléculas conectoras por nanómetro cuadrado de área de superficie de dichas partículas inorgánicas porosas; y una proteína A unida covalentemente a al menos algunas de dichas moléculas conectoras; teniendo dicha proteína un peso molecular que oscila entre 10.000 y 100.000 D.

Las partículas inorgánicas porosas pueden prepararse a partir de una variedad de materiales inorgánicos porosos. En otras realizaciones, las partículas inorgánicas porosas comprenden óxidos inorgánicos precipitados porosos, geles de óxidos inorgánicos y óxidos pirogénicos.

En realizaciones que comprenden geles, las partículas parentales se derivan de geles de óxidos inorgánicos porosos, tales como, pero sin limitarse a, geles que comprenden SiO2. Los geles pueden ser hidrogeles, aerogeles o xerogeles. Un hidrogel también se conoce como acuagel, que se forma en agua y como resultado sus poros se llenan de agua. Un xerogel es un hidrogel al que se le ha retirado el agua. Un aerogel es un tipo de xerogel al que se le ha retirado el líquido de tal manera que se minimiza cualquier colapso o cambio en la estructura del gel a medida que se retira el agua.

Los geles se conocen bien en la técnica. Véase “The Chemistry of Silica” de Iler, pág. 462 (1979). Las partículas de gel, por ejemplo, de gel de sílice, pueden distinguirse de las partículas de sílice coloidal o de sílice precipitada. Por ejemplo, la sílice coloidal se prepara como una suspensión de partículas de sílice densas, no porosas. Las partículas de sílice coloidal normalmente son menores de 200 nm (0,2 micrómetros). Tal como se ha mencionado anteriormente, estas partículas no tienen porosidad interna. Por otro lado, las partículas precipitadas dispersas típicas tienen cierta porosidad interna. Sin embargo, en algunos casos, la porosidad interna en partículas normalmente precipitadas colapsa en gran medida mediante la presión capilar creada por los meniscos de agua decrecientes cuando se evapora el agua durante el secado. Las condiciones para producir sílice coloidal y sílice precipitada se conocen bien.

Los geles, por otro lado, se preparan en condiciones que fomentan la coalescencia de partículas primarias (que tienen normalmente medianas de tamaño de partícula de 1 a 10 nm, tal como se miden mediante transmission electron microscopy [microscopía electrónica de transmisión], es decir, TEM) para formar una red tridimensional relativamente rígida. La coalescencia del gel se presenta a una macroescala cuando una dispersión de óxido inorgánico, por ejemplo, sílice, se endurece hasta formar una masa “de gel” o “gelificada” que tiene integridad estructural.

Los métodos de preparación de geles de óxidos inorgánicos se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, se prepara un gel de sílice mezclando una disolución acuosa de un silicato de metal alcalino (por ejemplo, silicato de sodio) con un ácido fuerte, tal como ácido nítrico o ácido sulfúrico, realizándose el mezclado en condiciones adecuadas de agitación para formar un sol de sílice transparente que se endurece para dar un hidrogel, es decir, un macrogel, en menos de aproximadamente media hora. Luego se lava el gel resultante. La concentración de óxido inorgánico, es decir, SiO2, formado en el hidrogel está habitualmente en el intervalo del 10 al 50, preferiblemente entre el 20 y el 35, y lo más preferiblemente entre el 30 y el 35 por ciento en peso, siendo el pH de ese gel de desde 1 hasta 9, preferiblemente de 1 a 4. Puede emplearse un amplio intervalo de temperaturas de mezclado, siendo normalmente este intervalo de desde 20 hasta 50 °C

Los hidrogeles recién formados se lavan simplemente mediante inmersión en una corriente de agua en movimiento continuo, que lixivia las sales indeseables, dejando aproximadamente el 99,5 por ciento en peso o más de óxido inorgánico puro.

El pH, la temperatura y la duración del agua de lavado influirán en las propiedades físicas de la sílice, tales como el surface area (área de superficie - SA) y el pore volume (volumen de poro - PV). El gel de sílice lavado a 65 90 0C a pH de 8-9 durante de 15 a 36 horas tendrá habitualmente SA de 250 a 400 m2/g y formará aerogeles con PV de 1,4 a 1,7 ml/g. El gel de sílice lavado a pH de 3-5 a de 50 a 65 0C durante de 15 a 25 horas tendrá SA de 700 a 850 m2/g y formará aerogeles con PV de 0,6 a 1,3 ml/g. Estas mediciones se generan mediante el método bien conocido de porosidad de N2. El hidrogel se seca insuflando aire a una temperatura que oscila entre 100 y 180 0C a través del lecho de hidrogel hasta que la humedad del gel es menor de aproximadamente el 20 %, preferiblemente menor de aproximadamente el 10 %, y más preferiblemente menor de aproximadamente el 5 % en peso. Pueden encontrarse procedimientos para producir xerogeles en las patentes estadounidenses n.os 6.565.905 y 5.622.743.

También puede usarse sílice precipitada reforzada tal como la descrita en la patente estadounidense n.° 4.157.920 para preparar los medios para cromatografía de la presente invención. Por ejemplo, las sílices precipitadas reforzadas pueden prepararse acidulando en primer lugar un silicato inorgánico alcalino para crear un precipitado inicial. Luego, el precipitado resultante se refuerza o se somete a “acondicionamiento posterior” mediante silicato y ácido adicionales. El precipitado resultante de la segunda adición de silicato y ácido comprende del 10 al 70 % en peso del precipitado preparado inicialmente. Se cree que la estructura reforzada de este precipitado es más rígida que la de los precipitados convencionales como resultado de la segunda precipitación. Se cree que incluso después de molienda, centrifugación y posterior secado, el silicato reforzado mantiene sustancialmente su rigidez y porosidad de red. Esto contrasta con otras sílices precipitadas, tales como aquellas dadas a conocer en la patente estadounidense 5.030.286.

En otra realización, el óxido inorgánico comprende sílice pirogénica. La sílice pirogénica puede fabricarse usando los procedimientos descritos en el documento DE 762723. La producción de sílice pirogénica también se analiza en Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A23, 1993, Capítulo 6.

Una vez formadas las partículas porosas, se muelen a continuación. Las condiciones generales de molienda pueden variar dependiendo del material de alimentación, el tiempo de residencia, las velocidades del impulsor y el tamaño de partícula de los medios de molienda. Estas condiciones pueden variarse para obtener el tamaño deseado dentro del intervalo de 1 a 120 micrómetros. Las técnicas para seleccionar y modificar estas condiciones para obtener el tamaño de partícula deseado las conocen los expertos en la técnica. Los equipos de molienda usados para moler las partículas inorgánicas de óxido porosas deben ser del tipo capaz de moler y reducir estrictamente los materiales a partículas que tengan tamaños de 1 a 120 micrómetros, por ejemplo, a través de acción mecánica. Tales molinos están disponibles comercialmente, siendo los molinos de martillos y los de arena particularmente adecuados para este fin. Los molinos de martillos confieren la acción mecánica necesaria a través de cuchillas metálicas de alta velocidad, y los molinos de arena confieren la acción a través de agitación rápida de medios tales como perlas de zircona o arena. También pueden usarse molinos de impacto. Tanto los molinos de impacto como los molinos de martillos reducen el tamaño de partícula por el impacto del óxido inorgánico con cuchillas metálicas. Otros molinos adecuados para su uso en esta invención incluyen, pero no se limitan a, el Air Classifying Mill (Molino con clasificador de aire - ACM) o el Fluid Energy Mill (Molino con energía de fluido - FEM). Las partículas inorgánicas de óxido molidas pueden clasificarse usando un clasificador de aire si no se realiza durante el proceso de molienda.

En una realización de la presente invención, las partículas inorgánicas porosas molidas se tratan después de manera hidrotérmica a de 100 a 400 0C durante de 2 a 20 horas y a un pH de 8 a 10. Como alternativa, el tratamiento hidrotérmico puede realizarse tal como se expone en las patentes estadounidenses n.os 5.976.479, 4.732.887, y 4.104.363. Las condiciones del tratamiento hidrotérmico afectan al volumen de poro, al área de superficie, al tamaño de poro y a la integridad estructural de las partículas.

Las partículas inorgánicas de óxido porosas pueden modificarse en su superficie (es decir, funcionalizarse) para potenciar selectivamente la unión de un material deseado a la superficie de partícula inorgánica de óxido. Por ejemplo, las partículas inorgánicas de óxido porosas pueden comprender además una química de superficie en forma de uno o más restos químicos unidos a las mismas para unirse selectivamente a uno o más materiales dentro de un fluido dado procesado a través de, por ejemplo, una columna para cromatografía, lo que se denomina en el presente documento superficie funcionalizada. Pueden unirse entidades químicas, tales como ligandos bifuncionales, etc., a la superficie de la partícula, por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 7.166.213 cedida a W. R. Grace & Co.-Conn. En una realización, esta fase estacionaria/unida, o medios para cromatografía, incluye un grupo activo o ligando como parte de la superficie funcionalizada de la partícula y normalmente se une covalentemente a la partícula mediante alguna unión. El ligando puede ser cualquier especie química que muestra interacción específica con otro componente molecular, en este caso, la biomolécula diana. Los ligandos conocidos incluyen, pero no se limitan a, grupos cargados (tales como ácido sulfónico, amonio cuaternario, dietilaminoetilo, carboximetilo); colorantes sintéticos; compuestos de alquilo y arilo (tales como boronato de fenilo, octilo); proteínas; lectinas; anticuerpos; antígenos, enzimas, etcétera. Los agentes de ligamiento, es decir, compuestos que pueden separarse mediante técnicas cromatográficas, incluyen una amplia variedad de biomoléculas tales como proteínas; enzimas; péptidos; anticuerpos; antígenos; lectinas; ADN; ARN; antibióticos; etc.

En una realización de la presente invención, el método para producir medios para cromatografía comprende hacer reaccionar partes de superficie de las partículas inorgánicas porosas con al menos un reactante para formar una superficie funcionalizada. En una realización, las partes de superficie de las partículas inorgánicas de óxido se tratan con un silano para proporcionar una superficie funcionalizada que comprende un producto de reacción resultante de una reacción entre (i) grupos hidroxilo (por ejemplo, grupos silanol) en las partículas inorgánicas porosas y (ii) el silano para proporcionar un promedio de desde más de 1 a 3 moléculas conectoras por nanómetro cuadrado de área de superficie de dichas partículas inorgánicas porosas. En algunas realizaciones, el método para producir medios para cromatografía comprende hacer reaccionar partes de superficie de las partículas inorgánicas porosas con al menos un reactante para formar una superficie funcionalizada, en el que el al menos un reactante comprende un epoxi-silano. Véase, por ejemplo, la figura 3. La superficie funcionalizada resultante comprende un producto de reacción resultante de una reacción entre grupos hidroxilo en las partículas inorgánicas porosas y un epoxi-silano. En una realización deseada, el método para producir medios para cromatografía comprende hacer reaccionar partes de superficie de las partículas inorgánicas porosas con al menos un reactante para formar una superficie funcionalizada, en el que al menos un reactante comprende un epoxi-silano que comprende (3-glicidiloxipropil)-trimetoxisilano. En esta realización, la superficie funcionalizada resultante comprende un producto de reacción resultante de una reacción entre grupos hidroxilo en las partículas inorgánicas porosas y (3-glicidiloxipropil)-trimetoxisilano.

En otra realización de la presente invención, las superficies funcionalizadas de las partículas inorgánicas porosas comprenden un diol. En esta realización, el método para producir medios para cromatografía puede comprender convertir al menos un grupo funcional (anillo de epoxi) en el silano en dos grupos hidroxilo para formar un diol. Véase, por ejemplo, la figura 3. En esta realización, la superficie funcionalizada resultante comprende de manera deseable (i) un diol y (ii) grupos hidroxilo sin reaccionar en las partículas inorgánicas porosas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el grupo diol de superficie presente en una cantidad que oscila entre 30 y 150 pmol/g (o cualquier cantidad entre, e incluyendo, 30 y 150 pmol/g, en incrementos de 1,0 pmol/g, o cualquier intervalo de cantidades entre, e incluyendo, 30 y 150 pmol/g, por ejemplo, desde 32 hasta 45 pmol/g) de las partículas inorgánicas porosas. En algunas realizaciones, el grupo diol de superficie presente en una cantidad que oscila entre 50 y 100 pmol/g de las partículas inorgánicas porosas.

En otra realización de la presente invención, las superficies funcionalizadas de las partículas inorgánicas porosas comprenden un aldehído. En esta realización, el método para producir medios para cromatografía puede comprender formar al menos un grupo diol en la superficie de la sílice usando el método tal como se mencionó anteriormente en el presente documento, convertir al menos un diol en un grupo aldehído, hacer reaccionar al menos un grupo aldehído con al menos un grupo amino libre en la proteína deseada para formar un grupo imina y reducir el grupo imina a una amina. Véase, por ejemplo, la figura 3.

En otra realización adicional de la presente invención, las superficies funcionalizadas de las partículas inorgánicas porosas comprenden una proteína A unida covalentemente a las superficies de dichas partículas inorgánicas porosas (por ejemplo, a través de al menos algunas de las moléculas conectoras). En estas realizaciones, el método para producir medios para cromatografía puede comprender además la unión covalente de una proteína a la superficie funcionalizada a través del grupo amina. Véase, por ejemplo, la figura 3. La superficie funcionalizada resultante comprende de manera deseable (i) una proteína A unida covalentemente a las superficies de las partículas inorgánicas porosas y (ii) grupos hidroxilo sin reaccionar en las partículas inorgánicas porosas. En una realización deseada, el método para producir medios para cromatografía comprende la unión covalente de la proteína A recombinante (rProA) a la superficie funcionalizada a través del grupo amina. La superficie funcionalizada resultante comprende proteína A recombinante (rProA) unida covalentemente a las superficies de las partículas inorgánicas porosas. Cuando está presente, la proteína está presente normalmente en una cantidad que oscila entre 4,0 y 16 mg/ml de las partículas inorgánicas porosas. En una realización deseada, la proteína está presente en una cantidad que oscila entre 5,0 a 12 mg/ml de las partículas inorgánicas porosas.

Generalmente, los medios para cromatografía de la presente invención descritos anteriormente tienen una superficie funcionalizada que comprende un promedio de desde más de 1 hasta 3 moléculas conectoras por nanómetro cuadrado de área de superficie de dichas partículas inorgánicas porosas. En algunas realizaciones, los medios comprenden una superficie funcionalizada que comprende un promedio de desde 1,1 hasta 2,5 moléculas conectoras por nanómetro cuadrado de área de superficie de dichas partículas inorgánicas porosas. En otras realizaciones, los medios comprenden una superficie funcionalizada que comprende un promedio de desde 1,3 hasta 2,0 moléculas conectoras por nanómetro cuadrado de área de superficie de dicha partícula inorgánica porosa.

Cuando se usan en una columna de afinidad, en algunas realizaciones deseadas, los medios para cromatografía de la presente invención descritos anteriormente tienen un nivel de unión a proteína inespecífica menor de aproximadamente 20,0 ng/ml (o cualquier valor menor de, e incluyendo 20,0 ng/ml, en incrementos de 0,1 ng/ml, por ejemplo, 4,8 ng/ml, o cualquier intervalo de valores por debajo de, e incluyendo 20,0 ng/ml, por ejemplo, desde mayor de 0 hasta 10 ng/ml), tal como se muestra en la figura 5A. En una realización, los medios para cromatografía, cuando se usan en una columna de afinidad, tienen un nivel de unión a proteína inespecífica menor de aproximadamente 5,0 ng/ml.

En algunas realizaciones deseadas, los medios para cromatografía de la presente invención descritos anteriormente, cuando se usan en una columna de afinidad, también tienen una capacidad de unión dinámica de al menos 30 mg/ml (o cualquier valor por encima de, e incluyendo, 30 mg/ml, en incrementos de 0,1 mg/ml, por ejemplo, 60,8 mg/ml, o cualquier intervalo de valores por encima de, e incluyendo, 30 mg/ml, por ejemplo, desde 41,2 hasta 85,2 mg/ml), tal como se muestra en la figura 5B. En una realización, los medios para cromatografía, cuando se usan en una columna de afinidad, tienen una capacidad de unión dinámica de desde 30 hasta 90 mg/ml.

Tal como se analizó anteriormente, la presente invención se refiere además a dispositivos para cromatografía, tales como la columna 100 para cromatografía mostrada en las figuras 1-2. En una realización, el dispositivo para cromatografía de la presente invención comprende: una carcasa de dispositivo; y medios para cromatografía situados dentro de la carcasa de dispositivo, en el que los medios para cromatografía comprenden los medios para cromatografía descritos en el presente documento. La carcasa de dispositivo del dispositivo para cromatografía comprende un elemento de carcasa tubular, y al menos una tapa de extremo del elemento de carcasa tubular independiente y acoplable. La carcasa de dispositivo puede comprender un material polimérico, un material metálico, un material de vidrio, un material cerámico, o un material compuesto de los mismos. En una realización, la carcasa de dispositivo comprende un material polimérico biodegradable. En otra realización, la carcasa de dispositivo comprende un material metálico tal como acero inoxidable.

En algunas realizaciones, el dispositivo para cromatografía comprende una columna desechable rellena previamente.

En algunas realizaciones deseadas de la presente invención, el dispositivo para cromatografía comprende medios para cromatografía que tienen un nivel de unión a proteína inespecífica menor de aproximadamente 20,0 ng/ml. En algunas realizaciones deseadas de la presente invención, el dispositivo para cromatografía comprende medios para cromatografía que tienen un nivel de unión a proteína inespecífica menor de aproximadamente 5,0 ng/ml. En algunas realizaciones deseadas de la presente invención, el dispositivo para cromatografía comprende medios para cromatografía que tienen una capacidad de unión dinámica de al menos 30 mg/ml. En algunas realizaciones deseadas de la presente invención, el dispositivo para cromatografía comprende medios para cromatografía que tienen una capacidad de unión dinámica de desde 30 hasta 90 mg/ml.

En algunas realizaciones deseadas de la presente invención, el dispositivo para cromatografía comprende una columna de afinidad. De manera deseable, el dispositivo para cromatografía tiene una contrapresión del dispositivo menor de 5 x 105 Pa (5,0 bar) cuando los medios para cromatografía se hacen pasar a una velocidad lineal de aproximadamente 1000 cm/h.

Las columnas para cromatografía de la presente invención, tales como la columna 100 para cromatografía a modo de ejemplo, pueden adaptarse para su uso en una aplicación dada. Independientemente de la aplicación, las columnas para cromatografía de la presente invención, tales como la columna 100 para cromatografía a modo de ejemplo, pueden tener un tamaño que permita que puedan insertarse en una variedad de sistemas para cromatografía. La figura 2 representa una vista de un sistema 200 para cromatografía a modo de ejemplo que comprende la columna para cromatografía mostrada en la figura 1.

Tal como se muestra en la figura 2, el sistema 200 para cromatografía a modo de ejemplo comprende los siguientes componentes: columna 100 para cromatografía, depósito 201 de disolvente, bomba 202, precolumna 203, orificio 204 de inyección, detector 206, registrador/monitor 207 y colector 208 de residuos. Aunque no se muestra en la figura 2, la columna 100 para cromatografía puede usarse en combinación con otros componentes del sistema adecuados para su uso en sistemas para cromatografía, tales como el sistema 200 para cromatografía a modo de ejemplo, en el que los otros componentes del sistema incluyen, pero no se limitan a, múltiples depósitos 201 de disolvente, una bomba de vacío, un divisor de flujo, un manómetro, un desgasificador, un colector de fracciones, etc.

La presente invención también se refiere a métodos para producir dispositivos para cromatografía. En una realización, el método para producir un dispositivo para cromatografía comprende incorporar los medios para cromatografía descritos en el presente documento en una carcasa de dispositivo (por ejemplo, columna). El método para producir un dispositivo para cromatografía puede comprender además una o más etapas adicionales. Las etapas adicionales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, formar la carcasa de dispositivo a través de una etapa de termoformado (por ejemplo, cualquier etapa de moldeo, por ejemplo, moldeo por inyección); limpiar las partículas inorgánicas de óxido porosas situadas dentro de la carcasa de columna exponiendo las partículas inorgánicas de óxido porosas a una disolución que no sea de NaOH; validar la columna para cromatografía a través de uno o más ensayos de validación; y envasar la columna para cromatografía limpiada y validada en un recipiente transportable.

En los métodos dados a conocer, la etapa de formación de la carcasa de dispositivo a través de una etapa de termoformado puede comprender someter un elemento de carcasa tubular y al menos una tapa de extremo del elemento de carcasa tubular independiente y acoplable al termoformado. En algunas realizaciones, la etapa de termoformado comprende someter al termoformado (i) un elemento de carcasa tubular que tiene un primer extremo abierto y un extremo opuesto cerrado (es decir, una tapa de extremo formada de manera solidaria que tiene una salida de carcasa de columna en la misma), y (ii) una primera tapa de extremo del elemento de carcasa tubular que es independiente y acoplable al extremo abierto del elemento de carcasa tubular. En otras realizaciones, la etapa de termoformado comprende someter al termoformado (i) un elemento de carcasa tubular que tiene extremos abiertos opuestos, (ii) una primera tapa de extremo del elemento de carcasa tubular independiente y acoplable a un primer extremo abierto del elemento de carcasa tubular, y (iii) una segunda tapa de extremo del elemento de carcasa tubular independiente y acoplable a un segundo extremo abierto del elemento de carcasa tubular, siendo la segunda tapa de extremo del elemento de carcasa tubular acoplable a la tapa de extremo del elemento de carcasa tubular opuesta a la primera tapa de extremo del elemento de carcasa tubular.

La presente solicitud describe además métodos para usar los medios para cromatografía y dispositivos para cromatografía descritos en el presente documento. En una realización, el método para usar los medios para cromatografía descritos en el presente documento comprende la etapa de incorporar los medios para cromatografía en una columna de afinidad. En una realización, el método para usar los dispositivos para cromatografía descritos en el presente documento comprende la etapa de situar el dispositivo para cromatografía dentro de una posición operativa de un sistema para cromatografía, tal como un sistema tal como se muestra en la figura 2. Los métodos para usar los medios para cromatografía y dispositivos para cromatografía descritos en el presente documento pueden comprender además el procesamiento de un fluido a través de la columna de afinidad o del dispositivo para cromatografía. En algunas realizaciones, el método para usar los medios para cromatografía y los dispositivos para cromatografía descritos en el presente documento comprende el procesamiento de un fluido que contiene una o más biomoléculas a través de la columna de afinidad o del dispositivo para cromatografía. Por ejemplo, el fluido puede comprender una proteína, un péptido, un oligonucleótido, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal), un virus, una vacuna o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, la fase móvil o el líquido que contiene uno o más analitos (molécula diana) o sustancias para la separación en la columna 100 se añade a través de la entrada 154 de columna. La fase móvil que sale de la salida 158 hacia el espacio 151 de lecho se distribuirá uniformemente a través del canal 160 de distribución, pasará a través del filtro 159 y después se eluirá uniformemente a través del lecho de medio particulado 151. La fase móvil finalmente saldrá de la columna a través de la salida 155 de columna.

Los métodos dados a conocer para usar un dispositivo para cromatografía de la presente invención, tal como la columna 100 para cromatografía a modo de ejemplo, no comprenden ventajosamente una etapa de limpieza in situ dentro del sistema para cromatografía (por ejemplo, el sistema 200 para cromatografía a modo de ejemplo mostrado en la figura 2). Dicho de otro modo, pueden realizarse múltiples pasadas en un sistema para cromatografía dado, tal como el sistema 200 para cromatografía a modo de ejemplo mostrado en la figura 2, sin necesidad de tener una etapa de limpieza in situ. En su lugar, cuando se ha usado una columna para cromatografía determinada y es necesario limpiarla, la columna para cromatografía usada se reemplaza por una columna para cromatografía de sustitución, y el sistema para cromatografía sigue funcionando sin los retrasos asociados a una etapa de limpieza in situ.

Los métodos dados a conocer para usar los dispositivos para cromatografía dados a conocer de la presente invención también pueden comprender la etapa de proporcionar el dispositivo para cromatografía a un usuario, en los que la etapa de provisión comprende proporcionar una columna para cromatografía rellena previamente y validada al usuario. Esta etapa elimina la necesidad de que el usuario realice una o más etapas de preparación de la columna, y adicionalmente permite un uso eficiente del tiempo y la capacidad de procesamiento del usuario.

Pueden ser adecuados métodos para usar columnas para cromatografía desechables para separar una o más biomoléculas de una muestra. Aunque no se limitan a ninguna aplicación particular, los métodos para usar columnas para cromatografía desechables de la presente invención pueden usarse para separar una o más biomoléculas de una muestra, en los que la una o más biomoléculas se seleccionan de al menos una proteína, un péptido, oligonucleótido, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, metabolitos, virus, vacunas, o cualquier combinación de los mismos.

En realizaciones a modo de ejemplo, los medios para cromatografía de la presente invención pueden usarse en una variedad de aplicaciones que incluyen todas las fases unidas mencionadas en el presente documento, por ejemplo, tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de afinidad, la exclusión molecular, y similares. La cromatografía de intercambio iónico se usa frecuentemente en protocolos para el aislamiento de inmunoglobulinas. En la cromatografía de intercambio aniónico, las cadenas laterales de aminoácidos con carga negativa de la inmunoglobulina interaccionarán con ligandos con carga positiva de una matriz para cromatografía. Por otro lado, en la cromatografía de intercambio catiónico, las cadenas laterales de aminoácidos con carga positiva de la inmunoglobulina interaccionarán con ligandos con carga negativa de una matriz para cromatografía. La hydrophobic interaction chromatography (cromatografía de interacción hidrófoba - HIC) es otro método descrito y usado en protocolos para el aislamiento de inmunoglobulinas. Si el objeto es obtener un producto de inmunoglobulina de gran pureza, habitualmente se recomienda combinar la HIC con una o más etapas adicionales. En la HIC, para hacer que la inmunoglobulina se una eficazmente a la matriz de HIC, se requiere la adición de sales liotrópicas a la fase móvil. La inmunoglobulina unida se libera posteriormente de la matriz mediante la disminución de la concentración de sal liotrópica. La cromatografía de afinidad se basa en interacciones específicas entre una biomolécula diana y un ligando biespecífico en un principio de reconocimiento cerradura-llave. Por tanto, la diana y el ligando constituirán un par de afinidad, tal como antígeno/anticuerpo, enzima/receptor, etc. Los ligandos de afinidad basados en proteínas se conocen bien, tales como la cromatografía de afinidad de proteína A, proteína G y proteína L, que son métodos muy extendidos para el aislamiento y la purificación de anticuerpos. Se conoce bien que la cromatografía de proteína A proporciona una especificidad excepcional, particularmente con respecto a anticuerpos monoclonales y, por consiguiente, se obtienen altas purezas. Usados en combinación con las etapas de intercambio iónico, interacción hidrófoba, filtración en gel y/o de hidroxiapatita, los métodos basados en proteína A se han convertido en el método de elección para purificar anticuerpos para muchas empresas biofarmacéuticas, véanse, por ejemplo, la publicación de patente internacional WO8400773 y la patente estadounidense n.° 5.151.350.

En realizaciones a modo de ejemplo, los medios para cromatografía de la presente invención pueden usarse en una variedad de aplicaciones, tales como matrices o medios de separación de modo mixto o multimodales. El término medios de separación “ multimodal” se refiere a una matriz capaz de proporcionar al menos dos sitios diferentes, pero cooperativos, que interaccionan con el compuesto que ha de unirse. Por ejemplo, uno de estos sitios puede proporcionar un tipo atractivo de interacción carga-carga entre el ligando y la sustancia de interés. El otro sitio puede proporcionar una interacción aceptor-donador de electrones y/o interacciones hidrófobas y/o hidrófilas. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.714.112. Además, las partículas porosas de la presente invención pueden usarse en adsorción en lecho expandido (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.620.326); como parte de una membrana para mejorar el rendimiento de purificación (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2011/0049042); usarse en aplicaciones con adsorción en lecho fluidizado (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0269257), y en cualquier otra aplicación adecuada para la purificación o adsorción usando materiales de poro ancho.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no debe considerarse que impongan en modo alguno limitaciones al alcance de la misma.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos describen (i) procedimientos según la presente invención para preparar medios para cromatografía que tienen superficies funcionalizadas, a saber, sílice con proteína A unida, y (ii) la evaluación de los materiales incluyendo el relleno de columna y el uso de columnas. Una realización de la presente invención mostrada en los ejemplos se refiere a partículas de sílice funcionalizadas que se prepararon mediante un procedimiento que consistió en las siguientes etapas: unir sílice de poro grande con (3-glicidiloxipropil)trimetoxisilano, seguido de hidrólisis con ácido sulfúrico para formar un producto intermedio de diol-silano unido inicialmente; convertir grupos diol en grupos aldehído mediante oxidación con peryodato de sodio; incubar la proteína A con la sílice funcionalizada; y finalmente aminación reductora. Tal procedimiento es tal como se muestra en la figura 3.

Se determinaron las medianas de tamaño de partícula indicadas en los ejemplos mediante dispersión de luz usando un instrumento Malvern Mastersizer 2000 disponible de Malvern Instruments Ltd. según la norma ASTM B822-10. Se midieron las distribuciones de mediana de tamaño de poro mediante intrusión de mercurio usando un instrumento Autopore IV 9520 disponible de Micromeritics Instrument Corp. Los volúmenes de poro a los que se hace referencia en el presente documento representan una intrusión de mercurio en poros de un tamaño de 10 1000 nm (100-10,000 Á). Se obtuvieron las áreas de superficie BET a partir del análisis de sorción de nitrógeno.

El particle size (tamaño de partícula - PS) se define como la mediana de tamaño de partícula por distribución de volumen. PS50 representa el tamaño de partícula en el punto medio en el que el 50 % de las partículas son más pequeñas que el tamaño de partícula en el punto medio y el 50 % son más grandes que el tamaño de partícula en el punto medio. Del mismo modo, PS90 representa un punto de tamaño de partícula en el que el 90 % de las partículas son más pequeñas y el 10 % son más grandes que el punto de tamaño de partícula. En algunos ejemplos, se utilizó gel de sílice que tenía una mediana de tamaño de partícula (PS50) de aproximadamente 70 pm. La mediana de diámetro de poro (PD50) se define como el punto medio en el cual el 50 % de los volúmenes de poro lo contribuyen los poros más pequeños y el 50 % lo contribuyen los poros más grandes. El término “ amplitud relativa” se define como una medida de la anchura de la distribución de tamaño de poro. La “amplitud” se mide restando el PD10 (es decir, el diámetro de poro por debajo del cual se encuentra el 10 % del volumen de poro) del diámetro de poro PD90 (es decir, el diámetro de poro por debajo del cual se encuentra el 90 % del volumen de poro) tal como se mide mediante porosimetría de mercurio. El término “ amplitud relativa” se define como la razón de (PD90 - PD10)/PD50 (figura 4).

Se prepararon los geles de sílice usando el siguiente procedimiento: Se pusieron 190 g de una disolución de ácido sulfúrico al 19 % en un reactor equipado con un agitador superior y se enfriaron bruscamente hasta 5 0C. Por separado, también se enfriaron bruscamente 263 g de una disolución de silicato de sodio (el 22,9 % en peso de SiO2) hasta 5 °C. Posteriormente, se añadió la disolución de silicato de sodio a la disolución de ácido sulfúrico a través de una bomba a una velocidad tal que se añadiera toda la cantidad de silicato en 15 minutos. Durante la adición, se mantuvo la temperatura en 5 °C. Una vez completada la adición, se calentó el reactor hasta temperatura ambiente y se permitió que gelificase el contenido sin agitación. Tras la gelificación, se cortó la masa de gel en trozos pequeños y se sumergieron en agua para retirar el sulfato de sodio formado durante la reacción. Se comprobó periódicamente el nivel de sulfato de sodio que quedaba en el material, a medida que se drenaba el agua de lavado y se añadía nueva agua al gel. Cuando el nivel disminuyó por debajo del 1 %, se suspendió el gel en agua y se ajustó el pH del líquido a pH=9,7 y se calentó la disolución hasta 67 °C. Se mantuvo la temperatura durante 20 horas y 20 minutos. Al final del periodo de calentamiento, se recuperó el gel por filtración y se secó en un horno a 160 °C hasta que el contenido de humedad del gel fue menor de aproximadamente el 5 % en peso.

El gel de sílice así obtenido tenía un área de superficie BET por nitrógeno de 325 m2/g y un volumen de poro por nitrógeno de 1,24 ml/g. Suponiendo poros cilíndricos y usando la ecuación: Diámetro de poro (Angstroms) = 40000 X PV/SA, este material presentó un tamaño de poro tal como se describió anteriormente. Posteriormente, se muele el gel hasta obtener el tamaño de partícula deseado (70 micrómetros) usando un ACM y luego se trata de manera hidrotérmica en un autoclave a 300 0C hasta que se logra el tamaño de poro deseado.

Se realizó un análisis elemental del contenido de carbono usando un analizador de carbono LECO SC-632 disponible de LECO Corp. Se midió la pureza de la sílice mediante plasma acoplado inductivamente (ICP) usando un instrumento ICPE-9000 disponible de Shimadzu Corp.

Se examinó la distribución de diámetro de poro de las partículas de gel de sílice de la presente invención mediante los métodos expuestos en el presente documento.

Se determinó la capacidad de unión dinámica rellenando los medios para cromatografía (en suspensión en disolución de NaCl 100 mM) en una columna Omnifit de 0,66 cm de diámetro (Kinesis, EE. UU.) con una altura de lecho final de 10 cm. Se cargó una disolución de IgG policlonal humana (hIgG) 2,0 mg/ml (disponible comercialmente de Sigma Aldrich Corporation) en tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10 mM (pH 7,4) en la columna a una velocidad de flujo lineal de 200 cm/h usando un sistema de FPLC AKTA Explorer de G e Healthcare (GEHC). Se midió el avance de las hIgG mediante la señal de UV-Vis a 280 nm usando un instrumento UV900 (GEHC) y se registraron los cromatogramas y se representaron gráficamente con el software Unicorn de GEHC. Se determinó la capacidad dinámica al 5 % de avance después de corregir la fracción no retenida de IgG3 no unida y el volumen de retención del sistema.

Se usaron columnas grandes (2,2 x 20 cm2 o 20 ml) para evaluar la disminución de presión (contrapresión) de las columnas rellenas con materiales inorgánicos porosos modificados. Normalmente, se obtuvieron las presiones a una velocidad lineal de 1000 cm/h de disolución de NaCl 100 mM en agua desionizada con el sistema AKTA.

Determinación de unión a proteína inespecífica

Se determinó la cantidad de unión a proteína de superficie inespecífica para la interacción del ligando de proteína A haciendo interaccionar sílice derivatizada con proteína A con proteína estreptavidina conjugada con enzima Horseradish peroxidase (peroxidasa de rábano picante - HRP) (disponible comercialmente de Life Technologies). Se mezclaron 100 pl de proteína A-sílice con 83 ng de estreptavidina-HRP en un phosphate saline buffer (tampón de solución salina tamponada con fosfato - PBS), pH 7,5 a la temperatura ambiental durante 30 minutos. Se lavó la muestra repetidamente con PBS para retirar la estreptavidina-HRP residual de la disolución. Se prepararon por separado diluciones de estreptavidina-HRP para su uso como patrones. Se añadió sustrato de tetrametilbencidina-HRP (TMB) (disponible de Life Technologies) a muestras y patrones preparados y se incubó a la temperatura ambiental durante 4 minutos mientras se mezclaba. Se detuvo la reacción mediante la adición de ácido fosfórico 1 N. Se determinó la cantidad de estreptavidina-HRP restante en cada muestra midiendo la conversión del sustrato a la forma oxidada a una longitud de onda de 450 nm usando un lector de microplacas SpectraMax M2 de Molecular Devices usando la curva patrón preparada. También se comprobaron los materiales unidos iniciales (antes de la unión de la proteína A) para determinar la unión a proteína inespecífica de la proteína-HRP con procedimientos similares a los descritos.

Descripción del procedimiento general para la unión de sílice

Unión de conector (unión inicial): Se prepararon muestras de partículas de sílice porosa funcionalizadas tratando las partículas de sílice con (3-glicidoxipropil)trimetoxisilano (disponible comercialmente de Sigma Aldrich Corporation o Gelest Inc.). Se cargó un matraz de fondo redondo con sílice porosa y se añadió la cantidad de (3-glicidoxipropil)trimetoxisilano al matraz. Se permitió que la mezcla se hiciera rodar durante la noche a temperatura ambiente. Después, se empapó la sílice con ácido sulfúrico 1 M durante 30 minutos y se filtró. Luego, se lavó con agua desionizada cinco veces, se filtró y se secó a 70 0C durante la noche. Se sometieron las muestras resultantes a un análisis elemental (LECO) para determinar el porcentaje de carbono sobre sílice, respectivamente. El cálculo de la superficie funcionalizada que comprende las moléculas conectoras se basó en el % de C con la siguiente fórmula:

% de 01.000.000

Contenido de molécula conectara (por ejemplo, diol) = ------------------------- (umol/g)

100 ^* 6 ^* 12

% de C * A N

Densidad de molécula conectara ---------------------------------------------------- imero de moléculas por nm2 de

100 * 6 * 12 * SA * 1E 18

superficie)

Mientras que AN = número de Avogadro = 6,022 x 1023 (moléculas por mol)

SA = área de superficie (en m2/g)

nm=nanómetro (10-9 metros)

Se inmovilizó proteína A a las partículas de sílice funcionalizada usando una química muy conocida (por ejemplo, el documento WO199009237) que implica la oxidación de grupos diol de superficie con NalO4 para producir un aldehído, seguido de la formación de base de Schiff de grupos amina libres en la cadena de proteína A con los grupos aldehído de superficie (la proteína A era una proteína A recombinante obtenida de Repligen Bioprocessing con el nombre comercial rSPA). Se añadió borohidrato de sodio para reducir los productos intermedios de base de Schiff (imina) (aminación reductora) en enlaces de amina secundaria estables y aldehídos sin reaccionar en grupos alcohol. (Figura 3).

Se determinó la cantidad de proteína A inmovilizada restando la cantidad de proteína A sin reaccionar de la cantidad total de proteína A usada en la reacción. Se midió la concentración de proteína A mediante UV-Vis a 280 nm con un espectrofotómetro.

[Ejemplos 1-8]

Los ejemplos 1-8 demuestran una cantidad diferente de grupos conectores de superficie y su influencia sobre la capacidad de unión a IgG y la unión a proteína inespecífica (figura 5). En los ejemplos, se usó el mismo lote de gel de sílice, y todas las demás condiciones del procedimiento se mantuvieron iguales. La mediana de distribución de partículas (PS50) de los geles de sílice fue de 70 um, la mediana de diámetro de poro (PD50) de la sílice fue de aproximadamente 1150 Á y se incorporó la misma cantidad de proteína A para cada muestra.

Los resultados para estas muestras se registraron en la tabla 1 a continuación:

Tabla 1

Resultados de cobertura de superficie, capacidad de unión dinámica y unión a proteína inespecífica

A partir de la tabla 1 y las figuras 5A, 5B y 5C, puede observarse que la DBC comenzó a disminuir a medida que la población de conectores es mayor de 1,8. Por otro lado, las uniones a proteínas inespecíficas para materiales unidos a conectores son mucho mayores con una cantidad menor de densidad de moléculas conectoras.

Ejemplo comparativo 1

Se rellenó la columna con el gel de sílice no modificado usado en los ejemplos 1-8 y se midió la unión a proteína inespecífica. La muestra presentó una alta unión a proteína inespecífica de aproximadamente 76 ng/ml.

Ejemplos 9-12

Para comparar los efectos de la mediana de diámetro de poro y la distribución de diámetro de poro sobre la capacidad de unión a IgG, la mediana de tamaño de partícula (aproximadamente 70 pm), se modificaron las partículas de gel de sílice usando el procedimiento descrito anteriormente. Los resultados para los ejemplos 9-12 se muestran en la tabla 2 a continuación:

Tabla 2

Resultados de la capacidad de unión dinámica para partículas que tienen diversas medianas de diámetro de poro y distribuciones de volumen de poro

% de PV1 = (Volumen de poro de poros de 60-160 nm (600-1.600 Á))/(volumen de 10-1000 nm (100

10.000 Á)) (en %)

% de PV2 = (Volumen de poro de poros de 100-160 nm (1.000-1.600 Á))/(volumen de 10-1000 nm (100

10.000 Á)) (en %)

% de PV3 = (Volumen de poro de poros de 120-150 nm (1.200-1.500 Á))/(volumen de 10-1000 nm (100

10.000 Á)) (en %)

La figura 6 muestra la distribución de poros para la sílice tal como se usa en cada uno de los ejemplos 9-12. A partir de la tabla 2 y la figura 6, puede concluirse que las partículas de sílice porosa funcionalizadas (tal como se muestra en el ejemplo 10) que tienen un % de PV1, % de PV2 y % de PV3 del 70 %, 40 % y el 19 %, respectivamente, proporcionaron la mayor capacidad de unión de 41 mg/ml.

Ejemplos 13-16

Para comparar los efectos de la mediana de tamaño de partícula sobre la capacidad de unión a IgG y la contrapresión de la columna, se modificaron partículas de gel de sílice con diferente mediana de tamaño de partícula, pero la misma mediana de diámetro de poro y distribución que el ejemplo 10, usando el procedimiento general descrito anteriormente. Los resultados para los ejemplos 13-16 se muestran en la tabla 3 a continuación:

Tabla 3

Efecto de la mediana de tamaño de partícula sobre la capacidad de unión dinámica

Tal como se muestra en la tabla 3 anterior, el ejemplo 15 con una mediana de tamaño de partícula de 69 pm proporcionó una DBC de más de 40 mg/ml y una contrapresión menor de 4 x 105 Pa (4,0 bar) a una velocidad lineal de 1000 cm/h.

[Ejemplos comparativos 2-4]

Para comparar la sílice de diferentes medianas de diámetro de poro, volúmenes de poro, amplitud relativa, distribución de diámetro de poro, se han tratado gel de sílice disponible comercialmente o partículas de vidrio de poro controlado con los procedimientos descritos anteriormente para unir la sílice e inmovilizar la proteína A. Se enumeran las propiedades de estas sílices en la tabla 4 y los resultados se resumen en la tabla 5 a continuación.

Tabla 4

Propiedades de los geles de sílice en los ejemplos comparativos

10.000 Á)) (en %)

En la tabla 4, la sílice A es un gel de sílice que se fabrica y comercializa actualmente por Daiso Co. LTD. con el nombre comercial Daisogel™ SP-2000-40/60. Esta sílice tiene un intervalo de tamaño de partícula de 40-60 pm.

La sílice B es un gel de sílice que se fabrica y comercializa actualmente por Fuji Silysia Chemical Ltd. con el nombre comercial Chromatorex® MB800-40/75. Esta sílice tiene un intervalo de tamaño de partícula de 40-75 pm.

La sílice C son partículas de vidrio de poro controlado (CPG®) 1000 que se fabrican y comercializan actualmente por Millipore Ireland Ltd. Esta sílice tiene un tamaño de partícula promedio de aproximadamente 60 pm. La figura 7 demuestra las diferencias en la distribución de tamaño de poro del ejemplo 10 y del ejemplo comparativo 4.

Tabla 5

Resultados de los ejemplos comparativos con geles porosos

Aunque la invención se ha descrito con un número limitado de realizaciones, estas realizaciones específicas no pretenden limitar el alcance de la invención tal como se describe y se reivindica por lo demás en el presente documento. Puede resultar evidente para los expertos en la técnica tras la revisión de las realizaciones a modo de ejemplo del presente documento que son posibles modificaciones, equivalentes y variaciones adicionales. Todas las partes y porcentajes en los ejemplos, así como en el resto de la memoria descriptiva, son en peso a menos que se especifique de otro modo. Además, se pretende que cualquier intervalo de números citados en la memoria descriptiva o las reivindicaciones, tal como el que representa un conjunto particular de propiedades, unidades de medida, condiciones, estados físicos o porcentajes, incorpore literal y expresamente en el presente documento como referencia o de cualquier otra manera, cualquier número que se encuentre dentro de tal intervalo, incluido cualquier subconjunto de números dentro de cualquier intervalo citado de este modo. Por ejemplo, siempre que se describa un intervalo numérico con un límite inferior, Ri, y un límite superior, Rs, se da a conocer específicamente cualquier número R que se encuentre dentro del intervalo. En particular, se dan a conocer específicamente los siguientes números R dentro del intervalo: R = Ri k(Rs -Ri), donde k es una variable que oscila entre el 1 % y el 100 % con un incremento del 1 %, por ejemplo, k es el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %. ... 50 %, 51 %, 52 %. ... 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %. Además, también se da a conocer específicamente cualquier intervalo numérico representado por dos valores cualesquiera de R, tal como se calculó anteriormente. Cualquiera modificación de la invención, además de las mostradas y descritas en el presente documento, resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y los dibujos adjuntos. Se pretende que tales modificaciones estén dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Medios para cromatografía que comprenden:

partículas de sílice porosa que tienen una mediana de diámetro de poro d50 de desde 60 nm hasta 160 nm (de 600 Á a 1600 Á), tal como se mide mediante porosimetría de mercurio; una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,99, en los que se mide la amplitud restando el diámetro de poro d10 del diámetro de poro d90 tal como se mide mediante porosimetría de mercurio y se calcula la amplitud relativa como la razón de (d *-d10)/d50); y una superficie funcionalizada que comprende un promedio de desde más de 1 hasta 3 moléculas conectoras por nanómetro cuadrado de área de superficie de dichas partículas de sílice porosa, determinada tal como se describe en la descripción con el título “ Descripción del procedimiento general para la unión de sílice” ,

en los que cada una de dichas moléculas conectoras antes de una reacción con una proteína comprende un grupo aldehído preparado mediante (1) hacer reaccionar (i) grupos hidroxilo en dichas partículas de sílice porosa y (ii) un silano que contiene al menos un grupo epoxi para formar al menos un diol y después de eso (2) convertir dicho al menos un diol en al menos un grupo aldehído; y

en los que dicha superficie funcionalizada comprende una proteína A unida covalentemente a superficies de dichas partículas de sílice porosa a través de al menos algunas de dichas moléculas conectoras.
2. Medios para cromatografía según la reivindicación 1, en los que las partículas de sílice porosa tienen un área de superficie BET promedio de desde 20 m2/g hasta 100 m2/g, tal como se determina mediante el método de análisis de adsorción de nitrógeno del área de superficie de Brunauer, Emmett y Teller; y

un volumen de poro promedio de al menos aproximadamente 1 ml/g, tal como se mide mediante porosimetría de mercurio.
3. Los medios para cromatografía según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en los que dichas partículas de sílice porosa tienen una amplitud relativa de distribución de tamaño de poro de desde 1,0 hasta 1,3.
4. Los medios para cromatografía según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en los que al menos el 40^ % del volumen total de poros está en poros que tienen un diámetro de entre 60 nm y 160 nm (de 600 Á a 1600 Á), preferiblemente desde el 40 % hasta el 90 % del volumen total de poros, y/o en los que al menos el 20 0% del volumen total de poros tiene poros en un diámetro que oscila entre 100 nm y 160 nm (de 1000 Á a 1600 Á), preferiblemente desde el 20 % hasta el 60 % del volumen total de poros, y/o en los que al menos el 15 % del volumen total de poros tiene poros en un diámetro que oscila entre 120 nm y 150 nm (de 1200 Á a 1500 Á), preferiblemente desde el 15 % hasta el 30 % del volumen total de poros.
5. Los medios para cromatografía según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 4, en los que dichas partículas de sílice porosa tienen un área de superficie BET promedio mayor de aproximadamente 10 m2/g preferiblemente de desde 20 m2/g hasta 200 m2/g, más preferiblemente desde 25 m2/g hasta 100 m2/g.
6. Los medios para cromatografía según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, en los que dichas partículas de sílice porosa tienen un volumen de poro promedio de al menos aproximadamente 1 ml/g.
7. Los medios para cromatografía según la reivindicación 6, en los que dichas partículas de sílice porosa tienen una dimensión de partícula promedio de desde 310 pm hasta 120 pm, preferiblemente desde 50 pm hasta 90 pm, más preferiblemente de 70 pm, tal como se determina mediante dispersión de luz.
8. Los medios para cromatografía según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en los que dichas partículas de sílice porosa comprenden preferiblemente sílice que tiene al menos el 97 % en peso de SiÜ2 basándose en el peso total de dichas partículas de sílice porosa.
9. Los medios para cromatografía según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en los que el epoxisilano es (3-glicidiloxipropil)-trimetoxisilano.
10. Los medios para cromatografía según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en los que dicha superficie funcionalizada comprende (i) dicha proteína unida covalentemente a partes de superficie de dichas partículas de sílice porosa, y (ii) grupos hidroxilo sin reaccionar en dichas partículas de sílice porosa.
11. Los medios para cromatografía según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en los que dicha proteína comprende preferiblemente una proteína A recombinante (rProA), en los que dicha proteína está presente preferiblemente en una cantidad que oscila entre 4,0 y 16 mg/ml de dichas partículas de sílice porosa, más preferiblemente entre 5,0 y 12 mg/ml de dichas partículas de sílice porosa, en los que la cantidad de proteína A inmovilizada se determina restando la cantidad de proteína A sin reaccionar de la cantidad total de proteína A usada en la reacción de inmovilización con la concentración de proteína A medida mediante UV-Vis a 280 nm con un espectrofotómetro.
12. Los medios para cromatografía según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en los que dichos medios para cromatografía, cuando se usan en una columna de afinidad, tienen un nivel de unión a proteína inespecífica menor de aproximadamente 20,0 ng/ml, preferiblemente menor de aproximadamente 5,0 ng/ml, y/o tienen una capacidad de unión dinámica de al menos 30 mg/ml, preferiblemente desde 30 hasta 90 mg/ml, que se determina tal como se describe en el presente documento con el título “ Determinación de unión a proteína inespecífica” .
13. Un método para producir los medios para cromatografía según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, comprendiendo dicho método:

formar las partículas de sílice porosa; y

hacer reaccionar en una parte de grupos hidroxilo en la superficie de las partículas de sílice porosa con al menos un silano que contiene al menos un grupo epoxi para formar al menos un diol y, opcionalmente, un grupo hidroxilo sin reaccionar, en la superficie de las partículas de sílice; convertir dicho al menos un diol en un grupo aldehído;

hacer reaccionar al menos un grupo aldehído con al menos un grupo amino libre en la proteína A para unir covalentemente la proteína a la superficie de las partículas de sílice porosa a través de un grupo imina;

reducir el grupo imina a un grupo amina para formar una superficie funcionalizada en las partículas de sílice porosa.
14. El método según la reivindicación 13, en el que dicha etapa de formación comprende formar partículas de sílice porosa a través de un proceso de formación de partículas seleccionado del grupo que consiste en gelificación, precipitación, agregación, o combinaciones de las mismas, preferiblemente a través de un proceso de gelificación.
15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, en el que el silano que contiene al menos un grupo epoxi es (3-glicidiloxipropil)-trimetoxisilano.
16. El método según la reivindicación 13 o 14, en el que el diol está presente en la superficie en una cantidad que oscila entre 30 y 150 pmol/g de las partículas de sílice porosa, preferiblemente entre 50 y 100 pmol/g de las partículas de sílice porosa.
17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que la superficie funcionalizada comprende una proteína unida covalentemente a superficies de las partículas de sílice porosa y también comprende preferiblemente grupos hidroxilo sin reaccionar en las partículas de sílice porosa.
18. Un dispositivo para cromatografía que comprende:

una carcasa de dispositivo; y

medios para cromatografía situados dentro de la carcasa de dispositivo, comprendiendo dichos medios para cromatografía los medios para cromatografía según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
19. El dispositivo para cromatografía según la reivindicación 18, en el que dicha carcasa de dispositivo comprende un elemento de carcasa tubular y al menos una tapa de extremo del elemento de carcasa tubular independiente y acoplable.
20. El dispositivo para cromatografía según la reivindicación 18 o 19, en el que dicha carcasa de dispositivo comprende un material polimérico, un material metálico, un material de vidrio, un material cerámico, o un material compuesto de los mismos, preferiblemente un material polimérico biodegradable, o un material metálico, preferiblemente acero inoxidable.
21. El dispositivo para cromatografía según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que dicho dispositivo para cromatografía comprende una columna de afinidad, y/o en el que dicho dispositivo para cromatografía tiene una contrapresión de dispositivo menor de 5,0 bar cuando dichos medios para cromatografía se hacen pasar a una velocidad lineal de aproximadamente 1000 cm/h.