CN1795202A - 肽制备用固定于固相载体上的金属螯合物 - Google Patents

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Abstract

活化固相和与肽结合的锚定部分在固相肽合成方面的用途，其中锚定部分与活化固相配位、可逆地结合。还提供竞争性分离所述锚定部分的方法，用来纯化和再折叠所述肽。提供具有锚定部分的肽，所述锚定部分用来使所述肽与活化固相配位、可逆地结合。在优选实施方案中，肽和固相之间的连接由金属螯合物构成。固定化肽经历序列延伸(即增长肽)的合成步骤。螯合物的优选金属离子为Cu(2+)，并且树脂上的优选配体是1，10－菲咯啉。

Description

肽制备用固定于固相载体上的金属螯合物
肽的化学合成已被充分认可，主要可分为两种不同的方法。溶液合成通常非常耗时，因而不适用于科学研究，而固相载体合成允许快速优化反应循环。固相肽合成(SPPS)的可行方案基于Merrifield技术(Merrifield，R.B.，J Amer.Chem.Soc.85，1963，2149)，在不溶性固相载体上合成具有限定序列的肽，所述载体具有可以通过简单过滤而容易地分离可溶性反应物的优点。SPPS已经极其迅速地发展成多种变化方案(在此统称为Merrifield型合成)并由以下步骤组成：
1.第一步，选择合适的固相载体基质(树脂)，氨基酸衍生物通过其C端共价固定于所述载体基质上。通常借助于链接剂将待合成序列中的C端第一氨基酸锚定至固相载体。根据现有技术该第一氨基酸的氨基和侧链官能团受到保护基团的保护，一般与Fmoc-或Boc-化学相容。
2.第二步，选择性除去保护第一氨基酸N端的基团。
3.第三步，将对应于待合成序列中的第二氨基酸的下一个氨基酸衍生物偶联至第一氨基酸的游离端氨基，而其自身具有受适当保护基团保护的氨基和侧链官能团。
4.第四步，从刚偶联的氨基酸衍生物上除去N端保护基团，并且对下一氨基酸重复第三步骤。
因而，肽的固相合成包括可在固相载体上建立限定序列氨基酸的循环工艺。该过程结束时，例如通过使用三氟乙酸(包括不同的清除剂)处理而从固相载体上释放肽。同时，可以除去可能已存在于氨基酸侧链的保护基团，其中通过这些保护基团保护咪唑-、巯基-、羧基-、氨基-、醇基-或其它功能相关基团。这样得到最终的肽，这些肽通常需要在合适的色谱设备上纯化，一般使用LC/MS系统，它可以同时分离和分析组分。在肽合成的标准教科书中深入探讨了这些步骤和更多的步骤。
虽然利用SPPS技术合成小肽(至多30个单体)一般没有问题，但是对大小为40-120(甚至更多)氨基酸的肽存在局限性。它们的性质更符合术语“小蛋白质”而非术语“大肽”。
a)这种大小的肽通常不仅具有一级结构(序列)，而且还有将要构建的二级结构(例如：螺旋、β-片层)和三级结构(例如：亮氨酸-拉链、结构域的二硫桥)，然而，SPPS技术的各种变化方案的目的仅仅是建立一级结构，它们不提供任何工具来以适当的方式控制分子内二级和三级结构的形成。对于较大肽折叠的控制机制的缺乏由于以下事实而进一步加剧：同时从树脂上分离全部产物和除去保护基团导致极高的局部产物浓度。在这些条件下不仅仅发生分子内折叠。很多情况下，从树脂释放的小蛋白倾向于发生相互作用，而不是分子内折叠。当利用溶剂重构含有从LC系统洗脱的纯化产物的冻干组分时，也发生类似的问题。因而，分子内折叠和分子间相互作用发生竞争，并且没有可行的技术来充分控制这一过程。这经常导致功能失效的多分子聚集体，它们不会表现出任何期望的生物活性。
b)在大肽合成的情况下，对于每一轮合成，优选使用适当修饰(保护、部分保护或未保护)的肽片段，而非单一的氨基酸残基。一般，小片段是通过络合物形成或片段缩合技术来连接，以便使合成步骤数最少。这是由于这些循环通常不具有定量的产率并且在非常多的循环中经常产生不可接受的产率下降。此外，单一氨基酸的有问题的偶联可简单通过偶联整个片段而不是单一氨基酸来防止。在片段缩合中，在每个偶联循环中出现必须耗费相当长的偶联时间的问题。低反应速度是受扩散限制的，并且由于固定肽链的不扩散和树脂环境的孔中的片段的次优扩散行为而导致。长反应时间经常导致待偶联片段的C端氨基酸处相当大程度的外消旋作用，这导致需要使反应时间尽可能短。克服该问题的最佳方法是在溶液中偶联。经典的SPPS没有提供将两种反应配对物引入溶液中并使其在循环的下一步骤中再连接的方法，而是在合成的每一步骤中重复该过程。
c)通常难以控制起始残基在聚合物载体上的期望密度，并且将第一氨基酸载入树脂经常伴随着外消旋作用。虽然大量预负载树脂被商品化，然而这并未覆盖所有的负载，并且对于给定肽合成问题而言最佳值经常难以发现。
目前为止，金属亲和仅仅初步应用于肽合成，这记载在Comely等人的出版物中(Journal of the Chemical Society，2001，2526-2531)。这些作者利用例如存在于衍生的苯丙氨酸侧链中的芳香π电子体系，将氨基酸与铬络合。这些络合物在溶液中生成，并且随后将预先存在的铬络合物锚定至固相，成功地进行一个合成循环。虽然论证了金属络合物锚定至固相的主要适用性，但是该方法在以下方面不同于本文所述的本发明。
Comely等人首先将金属离子连接至体系的可溶部分，随后在第二步骤中将络合物锚定至固相，而本文所述的本发明基于首先将金属离子连接至固相，随后将生长肽链锚定至固相。这消除了Comely所提出的体系的一个缺点，即在所得的固相处的含铬络合物中，氨基酸侧链和铬之间的配位键要强于铬和固相载体之间的键。因而，用竞争物洗脱络合物来洗脱总是带有以化学计量连接至肽的铬的肽络合物。这既不适合于分析和分离，也不适合于肽的预期药物用途。通过本文所述的本发明形成的络合物特征在于金属离子强螯合至固相并且与肽链容易地可逆螯合。这以肽洗脱液中基本没有连接至肽的金属离子而结束。
Comely等人使用由芳香体系形成的极不常见的络合物，而本文所述的本发明使用螯合基团，其通过N、P、S或O原子配位结合金属离子。这些原子可以是标准有机基团的一部分。该基团可使用全部有机化学技能来为螯合作用和结合强度而设计和优化，并且不限于芳香体系。因而，本文所述的发明原理提供比Comely体系更大的灵活性和适用性。
就此来说，Comely所提出的体系是不利的，因为其需要惰性气氛以保护某些所用试剂。甚至在此条件下，每个步骤产率也不超过90％，这意味着不能期望长于最大十聚体的肽表现出合适的产率。本文所述的本发明及其所用的络合物化学与标准fmoc化学是相容的，并且不需要特殊的气氛或设备。Comely采用的苛刻方法既慢且释放肽时又破坏树脂(白光下在DCM中用空气48h氧化基底聚合物)。
虽然目前为止在肽化学合成领域中还没有利用金属络合物的其他用途，但是金属亲和已经在生物分子的重组生产领域中为人所公知。然而，其仅用于色谱中作为用来从粗生物混合物或生物流体中一步纯化生物分子的工具。存在使用含亚氨基二乙酸(Iminodiacetate)和氨三乙酸的琼脂糖衍生物的这种策略的专利(EP-A-253303；US-A-4877830)。适合重组产物色谱纯化的珠状琼脂糖可从市场上购得。此外，为使用侧链固定的过渡金属络合物作为给定肽的荧光标记试剂而构建含有金属亲和侧链的肽(例如WO-A-9603651A1；EPA-A-0178450)。所有这些描述证实了金属螯合物技术在生物分子的分析和/或纯化领域的适用性。然而，它们并未暗示如下所述本发明的特征及应用。
待解决的技术问题是建立用于小肽和包括120个氨基酸以上的大肽的固相合成、纯化和再折叠/解聚的合适方法。为了避开SPPS对于大肽的问题，应该使肽与固相载体可逆结合。本发明的另一目的是使具有不希望的误折叠结构和/或分子间集聚的合成肽再折叠和分离。
该问题可由权利要求1的方法解决。
提供了活化固相的用途，所述活化固相包含固相载体、共价结合至固相载体的金属螯合配体、配位结合至所述金属螯合配体的金属离子Mn+，其中n＝1-3，所述活化固相提供固相肽合成或肽纯化用的肽锚定部分配位、可逆结合的配位点。
活化固相也称为“金属亲和树脂”。
在优选实施方案中，肽为“生长中的肽”并且经历肽延伸过程。
优选的是，生长中的肽由至少一个氨基酸组成。在另一优选实施方案中，在Merrifield型顺序反应方案中，将单-或寡聚氨基酸加入到“生长中的肽”的羧基端或氨基端(C-或N-端)，优选基于fmoc化学。在另一优选实施方案中，单-或寡聚氨基酸是/或包含天然和/或非天然氨基酸。此外，可以自由选择在Merrifield型顺序反应方案的每一循环中所连接的受适当保护的氨基酸衍生物或寡聚片段。
优选的是，固相载体基于二氧化硅、玻璃或纤维素或聚合物，所述聚合物选自聚苯乙烯树脂、三聚氰胺树脂和聚乙烯醇基树脂。
本发明其它合适的载体为例如具有官能实体的聚苯乙烯，其中所述官能实体可以用合适的金属螯合配体共价衍生。该官能实体的实例为氯三苯甲基(chlorotrityl)、氨基、杂环氮、羧基、羟基、巯基和乙烯基。对于固相肽合成而言，必须保护固相载体上的游离羧基或其它活性基团，以使其不干扰肽增长过程。
在优选实施方案中，固相载体包含铁磁性颗粒。在另一优选实施方案中，合成循环期间液体和活化固相的分离是通过例如筛分、基于大小的分离、离心或磁性颗粒分离技术来实现的。可以通过与预先存在的固相载体部分反应或者在聚合物的情况下也可以通过与合适的衍生共聚物共聚合来将活性官能团引入固相载体。
在优选实施方案中，每个金属螯合配体包含至少一个氮、氧、磷或硫原子，所述原子能够建立配位的配体-金属键。
在另一优选实施方案中，每个金属螯合配体包含选自氨基、杂环氮、羧基、羟基和巯基的至少一个官能团。
金属螯合配体直接或通过连接基团共价结合至固相载体。合适的连接基团例如氨基、羧基、亚甲基、氧、亚甲二氧基、聚亚甲二氧基、亚乙二氧基和聚亚乙二二氧基。对于固相肽合成而言，必须保护金属螯合配体上的游离羧基，以使其不干扰肽增长过程。
图1a示出用5-氨基-1，10-菲咯啉衍生的固相载体的实施例。
对于本领域技术人员而言，可以很容易地例如从数据库中确定能够配位结合金属离子的大量有机基团，所述数据库可用来发现对根据本发明的金属螯合配体合适的金属螯合基团。在本发明的框架内，该现有技术可用来确定在本发明范围内的合适基团。以本文所述适合实施本发明的基团的示例性数据给出包含各自数据的数据库实例，示于下列表1：
表1：示例性配体/金属离子组合的络合常数
  结合步骤   pK
  配体   m   Mn2+   Fe2+   Co2+   Ni2+   Cu2+   Zn2+
  咪唑   1   1,25   1,81   2,44   3,01   4,21   2,55
  2   2,3   3,04   4,34   5,53   7,72   4,89
  3   3,23   5,76   7,5   10,57   7,17
  4   6,7   8,8   12,6   9,18
  1-甲基咪唑   1   1,34   2,29   3,05   4,22   2,38
  2   2,08   4,25   5,95   7,76   4,92
  3   3,08   5,32   7,61   10,65   6,6
  4   6,7   9,13   12,86   9,21
  亚氨基二乙酸   1   4,72   5,8   6,97   8,3   10,56   7,15
  2   7,82   10,1   12,2   14,7   16,3   12,4
  3
  氨三乙酸   1   7,27   8,9   10,38   11,51   12,7   10,45
  2   10,44   11,98   14,33   16,32   17,43   14,24
  乙二胺四乙酸   1   11,1   14,3   16,5   18,4   18,8   16,5
  乙二胺   1   2,6   4,13   5,5   7,3   10,49   5,69
  2   4,5   7,32   10,1   13,44   19,6   10,64
  3   5,21   9,12   13,4   17,51   13
  1，3-丙二胺   1   6,31   9,7
  2   10,6   16,74
  3   12,9
  反式-1，2-二氨基环己烷   1   2,94   6,37   7,9   11,09   6,37
  2   5,33   11,74   14,3   20,8   11,98
  3   15,22   20   14,1
1，4，7-三氮杂环壬烷   1   5,8   11,2   13   15,6   11,5
  2   27,7
  1，4，7，10-四氮杂环十二烷   1   14,1   16,4   24,6   16,2
  吡啶   1   0,24   0,7   1,22   1,88   2,54   1,05
  2   0,9   1,8   3   4,38   1,45
  3   3,3   5,7
  4   6,03
  2，2’-联吡啶   1   2,6   4,2   5,8   7,04   8,12   5,12
  2    7,9   11,3   13,86   13,63   9,63
  3   17,2   16   20,16   17   13,3
  2，2’：6’，2″-三联吡啶   1   4,44   7,1   9,5   10,7   12,3   6
  2   20,7   18,6   21,8   19,1
  2，4，6-三(2-吡啶)-1，3，5-三嗪   1   12,3
  4-羟基吡啶-2，6-二羧酸   1   6,7   8,4   9,2   12,2
  2   16,2   17,3   22,1
1，10-菲咯啉   1   4,09   5,85   7,1   8,7   9,13   6,38
  2   7,52   11,15   13,7   16,8   15,84   12,08
  3   10,2   21   19,68   24,4   21,03   17,1
  2-甲基-1，10-菲咯啉   1   3   4,2   5,1   5,95   7,4   4,96
  2   5,5   7,9   10   11,8   13,8   9,36
  3   7,9   10,8   13,9   16,7   16,95   12,7
pK值为25℃值。pK值定义为结合常数K的以10为底的对数的负数。在每一列中，示出金属离子或其络合物MLm-1与另外的配体分子L的每一顺序结合步骤的 选自A.E.Martell，R.M.Smith，R.J.Motekaitis，“Database 46：NIST Critically Selected Stability”。
因而，关于不同金属离子与配位分子形成络合物的数据已知并且可以在一次文献和数据库中找到。表1中的数据摘自Martell及其同事的数据库(2003)并给出了相关金属离子配体相互作用的示例性综述。这些数据库可利用来将金属离子结合至固相上。这些配体也可在单或寡聚天然或非天然氨基酸的侧链中充当结合至下述不饱和金属离子的螯合基团。
在另一优选实施方案中，共价结合至固相载体的各金属螯合配体包含至少一个基团，所述至少一个基团选自三苯基膦基团、氨基嘌呤基团优选6-氨基嘌呤基团、酞菁基团、1，10-菲咯啉基团优选5-氨基-1，10-菲咯啉基团、三联吡啶基团优选4’-氨基-[2，2’；6’，2”]三联吡啶基团、三氮杂环壬烷基团优选[1，4，7]三氮杂环壬烷基团和四氮杂环十二烷基团优选[1，4，7，11]四氮杂环十二烷基团。
金属Mn+优选选自Mn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+和镧系金属离子，Mn+尤其优选为Cu2+、Ni2+、Co2+和Zn2+。
图1b示出活化固相的实例，其包含固相载体、共价结合的5-氨基-1，10-菲咯啉金属螯合配体和螯合的金属离子Cu2+。
图1c示出结合肽的实例，其包含肽残基和寡聚组氨酸基团锚定部分，其中所述锚定部分共价连接至活化固相，该活化固相包含固相载体、共价结合的5-氨基-1，10-菲咯啉金属螯合配体和螯合的金属离子Cu2+。
可以很容易地控制锚定肽和锚定(单-或寡聚-)氨基酸在活化固相载体表面上的覆盖范围，所述锚定(单-或寡聚-)氨基酸是指固相肽合成的起始点。如果活化固相的配位位点均匀散布于表面，则结合肽和起始点的密度(覆盖范围)可以根据肽合成、纯化或再折叠的具体需要来调节，并通过在第一结合步骤期间加入到树脂中的起始点的量来确定。表面覆盖范围可以由已知的表面积值和肽数量(以摩尔计)和/或直径来计算。
由于络合反应通常很快，使得在有机或含水溶剂存在下可以在几分钟内完成结合。
提供一种方法，其中肽的锚定部分通过加入竞争配体而从所述活化固相中脱离，其中所述锚定部分配位结合至所述活化固相的配位点，所述活化固相包含固相载体、共价结合至固相载体的金属螯合配体、结合至所述金属螯合配体的金属离子Mn+，n＝1-3。
根据本发明，可将竞争试剂加入到锚定肽中，以使肽的锚定部分从活化固相上竞争性解离。优选将竞争试剂加入到Merrifield型反应方案的偶联步骤的试剂混合物中。与肽锚定部分的每个单独的金属离子螯合基团对所述配位点的亲和性相比，合适的竞争性螯合剂对于活化固相上的游离配位点具有大致相同或更弱的亲和性。
在优选实施方案中，竞争试剂可溶于偶联步骤的试剂混合物中并且不与该试剂混合物的组分反应。
在图2a中，利用肽锚定部分是寡聚组氨酸残基的实例说明解离原理。
与解离相反，肽的锚定部分可以通过稀释含有活化固相、竞争试剂和非结合肽的混合物而再结合至活化固相。
在Merrifield型反应方案中的优选实施方案中，在以下漂洗步骤之前进行再结合。
在图2b中利用肽锚定部分是寡聚组氨酸残基的实例说明再结合原理。
竞争物浓度对给定肽结合至活化固相的影响的实例示于图3a，其中竞争物浓度增加的解离过程用于洗脱配位结合的肽。该过程是可逆的。
在另一所提供的方法中，竞争配体包含至少一个能够螯合金属离子的基团，优选含氮基团，选自咪唑、N-甲基咪唑、氨基嘌呤、菲咯啉、联吡啶、三联吡啶、三氮杂环壬烷和四氮杂环十二烷、亚氨基二乙酸基团、氨三乙酸基团和乙二胺四乙酸基团。
在另一优选实施方案中，竞争配体包含具有配位键用电子对的结构基团，如三苯基膦基团、6-氨基嘌呤基团或酞菁基团。
竞争配体的具体实例为谷胱甘肽、乙二胺四乙酸、咪唑、N-甲基咪唑、菲咯啉优选5-氨基-1，10-菲咯啉、氨基三联吡啶、三氮杂环壬烷或四氮杂环十二烷。
在所述方法的优选实施方案中，肽为“生长中的肽”，通过锚定部分结合金属离子，所述金属离子结合至与固相载体结合的金属螯合配体并经历肽延伸过程。
术语“生长中的”肽指肽骨架的序列增加，通常使用n-端和侧链保护的氨基酸，例如所有fmoc基肽合成方案的情况。
优选将单-或寡聚氨基酸加至Merrifield型顺序反应方案中的“生长中的肽”的C-或N-端。
如前所述，包含共价结合至锚定部分金属离子的至少一个单或寡聚氨基酸的生长中肽被作为固相肽合成的起始点。该起始点的实例是通过其羧基共价结合至金属离子络合基团的单一甘氨酸残基。
优选起始点包含至少一个侧链和/或C-端修饰，以使其可以配位至活化固相的金属离子。所述氨基酸可以是天然或非天然的。
用于固相肽合成起始点的各锚定单或寡聚氨基酸必须与肽合成方案相容。
肽的锚定部分优选包含至少一个金属离子络合基团，每个所述基团包含至少一个含氮、氧、磷或硫的能够与活化固相的金属离子配位的基团。
在优选实施方案中，每个金属离子络合基团包含1-10个所述含氮、氧、磷或硫的基团。更优选每个金属离子络合基团包含1-10个含氨基、杂环氮、氮杂、羧基、硫和磷的基团。
锚定部分的金属离子络合基团可以衍生，前提是所得衍生物与肽合成方案相容。图1c、2a和2b示出寡聚组氨酸基团，其氨端基受Fmoc化学保护。
在本发明的另一实施方案中，金属螯合配体与活化固相的金属离子的配位键强于肽锚定部分与所述金属离子的配位键。
更优选的是能够与活化固相的金属离子配位的含氮基团选自氨基、羟基、羧基、巯基、咪唑基、N-甲基咪唑基、氨基嘌呤基团、phenanthrolyl基团、吡啶基团、联吡啶基团、三联吡啶基团、三氮杂环壬烷基团、四氮杂环十二烷基团、亚氨基二乙酸基团、氨三乙酸基团和乙二胺四乙酸基团。
特别优选的所述基团包含2-10个天然或非天然氨基酸。包含金属离子络合基团的所述氨基酸的合适侧链可优选选自咪唑、氨基、羟基、羧基、巯基、菲咯啉、吡啶、联吡啶、三联吡啶、三氮杂环壬烷、四氮杂环十二烷或嘌呤基团及其依然可以形成金属络合物的衍生物。能够与金属离子形成配位键的合适有机基团可在如表1所举例示出的数据库中找到。为了确保肽延伸过程，游离羧基必须进行适当保护。
优选的是，锚定部分的单或寡聚氨基酸包含咪唑侧链，任选地N端受保护。在另一优选实施方案中，所述单或寡聚氨基酸是寡聚组氨酸或短序列(1-6个残基)非天然氨基酸，在其具有至少一个额外氨基酸的侧链中含有菲咯啉基团，其中所述额外氨基酸不干扰固相载体，如甘氨酸。
优选所述寡聚组氨酸基团包含至少2个组氨酸残基；更优选包含6-10个组氨酸残基。
在另一优选实施方案中，所述寡聚组氨酸基团含有至少2个连续L-或D-组氨酸残基、更优选6个L-或D-组氨酸残基的序列。
在另一优选实施方案中，锚定部分的所述单或寡聚氨基酸包含至少一个5-氨基-1，10-菲咯啉基团。
可以反复从活化固相上解离生长中的肽链或使生长中的肽链再结合至活化固相。在优选实施方案中，在肽合成的偶联步骤中实现解离，而再结合过程则在先于随后的去保护步骤的漂洗步骤之前通过稀释反应混合物来诱导。使用这些步骤，可以利用“过渡性”液相合成及其优点，尤其是用于通过片段缩合方法合成大肽。
所述肽链的锚定部分优选位于所述肽的C-端和/或至少一个氨基酸侧链中。
在又一优选实施方案中，所述肽的锚定部分可以通过允许进一步加工和检测肽的特定基团和/或天然和/或非天然氨基酸序列来延伸。
在优选实施方案中，在肽的C-端处锚定部分的至少一个氨基酸通过可以由检测系统检测的一个或多个氨基酸来延伸。
在优选实施方案中，将允许通过抗体简单识别最终肽链的序列加入到生长中的肽中。该标签序列的实例为myc-tag。此外，加入生物素化的氨基酸(例如：生物素化的D-、L-赖氨酸)，优选在寡聚起始点C-端处，将允许基于生物素和抗生物素蛋白类分子之间的特异性相互作用而建立最终产物的简单定量。
在又一优选实施方案中，肽的锚定部分通过提供特定蛋白酶识别位点的氨基酸序列而在其N-端延伸。
在又一优选实施方案中，起始点通过为蛋白酶识别位点编码的短氨基酸序列而延伸。这允许在合成过程和折叠操作之后选择性除去起始点。
在优选实施方案中，通过稀释含竞争配体的Merrifield型顺序反应方案的反应混合物将肽再结合至活化固相。
与待解离的肽锚定部分的金属离子络合基团(起始点)的单一残基的亲和力相比，合适的竞争配体具有相似的对活化固相(金属亲和树脂)的亲和力，所述单一残基优选寡聚含氮基团。在寡聚组氨酸作为肽的锚定部分的情况中，合适的竞争配体是咪唑(在含水溶剂中)或N-甲基咪唑(在有机溶剂中)。通过将与结合肽相比大大过量的竞争配体(通常竞争配体比结合配体过量102-106摩尔比)加入到溶剂中来实现解离。例如在含水溶剂中100-250mM的咪唑(竞争配体)适合用来完成完全分离。相同条件下，可以通过稀释含有竞争配体的溶剂，优选稀释10-20倍来实现再结合。这导致竞争配体浓度下降并使得多齿的肽锚定部分再结合至载体。对于各自溶剂中的锚定部分和活化固相对，竞争配体与锚定部分的摩尔比率可以容易地通过从金属亲和树脂洗脱锚定部分的色谱方法来确定。
在又一优选实施方案中，用于肽合成的锚定部分(例如：寡聚组氨酸)在起始点的稀碱性或中性溶液存在下实现与活化固相的结合。
另外提供了用来纯化含锚定部分的肽的方法，所述肽任选为受保护的，所述锚定部分配位结合至活化固相的配位位点，所述活化固相包含固相载体、共价结合至固相载体的金属螯合配体、结合至所述金属螯合配体的金属离子Mn+，n＝1-3，进行漂洗以洗去杂质，如残余保护基团和清除剂或不期望的肽合成副产物。
本发明的另一优选实施方案利用在合成的最后步骤中与肽结合的螯合基团(在链的氨基端，例如甘氨酸-菲咯啉衍生物)。在这种情况下，通过色谱过程，利用肽配位结合至活化固相来从污染副产物中纯化粗产物。该原理可通过利用每个合成循环中常规封端游离未偶联的氨基基团来应用。在应用该原理的过程中，可以实现在单次色谱流程中纯化粗产物。
解离可以通过加入合适的上述竞争试剂或提高溶剂酸度至临界程度来实现，所述临界程度优选至少低于pH6，更优选pH5或更低，尤其是在水溶液中，这提供了另一极好的方法来从金属亲和树脂上解离锚定肽。
基于肽与活化固相的前述配位、可逆结合，提供了另一方法。
一种再折叠误折叠的结构和/或使任选地受保护的肽的分子间聚集体解聚的方法，其中肽的锚定部分配位、可逆地结合至活化固相，并重新建立正确折叠的肽结构，该方法包括以下步骤：
(a)将肽暴露于至少一种离液剂或变性剂中，和
(b)(b)接着暴露于一系列溶剂中，以逐渐减少离液程度并提供再折叠和重建二级和三级结构的可重复条件。
在优选实施方案中，离液剂或变性剂选自在合适溶剂中的脲、洗涤剂如十二烷基硫酸钠、高盐浓度和巯基乙醇或其混合物。
除了共价结合至合适的树脂之外，本发明还提供在偶联步骤中解离生长中肽的可能性，同时可以在以下步骤之前再结合。此外，将肽可逆锚定至活化固相的相同原理可以用来控制纯化产物的折叠。为此，将产物纯化并再结合至活化固相，其中选择结合肽分子(以摩尔计)与金属亲和树脂的表面积之比，使得结合肽不可能相互作用。这使得分子内折叠优先于分子间相互作用(集聚)。纯化和结合之后，接着用多种溶剂处理产物，所述溶剂允许逐渐折叠该分子并支持肽链的正确的分子内构象。折叠步骤可以通过在正确位置形成例如二硫键来完成。该过程的最后，通过加入竞争配体或通过增加溶剂酸度而从活化固相释放稳定产物。
以再折叠操作方案进行结合肽的再折叠。对于该方案而言，产物必须溶解于适当溶剂中。一般，最优选的溶剂是来自LC-色谱系统的洗脱溶剂，尽管产物可以在合适的溶剂中冻干和重构。由该溶液，产物与活化固相配位再结合。这可以通过包括利用基于未保护的亚氨基二乙酸和氨三乙酸的树脂来完成。这是可以的，因为再折叠通常不使用活化游离羧基的试剂。选择极低的结合密度(表面覆盖范围)以避免产物分子相互紧密接触。完成结合之后，使一系列溶剂逐步通过树脂。原则上，第一溶剂是高度变性剂和/或离液剂，以使所有产物分子处于相当的折叠状态。接下来的步骤和溶剂将逐渐接近支持分子折叠的生理条件。操作结束时，产物分子处于期望的最终溶剂中，优选含水溶剂，任选以例如二硫键封闭并且可以从活化固相释放出来。
在又一优选实施方案中，肽的二级和三级结构通过用合适试剂处理而在所述肽的反应性侧链之间形成的共价连接来保持，其中包括在将肽从活化固相上解离之前形成所述共价连接。
在再折叠肽的反应性侧链之间形成的共价连接优选是二硫键、酰胺键或稳定的芳香族或脂肪族腙。
用来闭合例如二硫桥的合适试剂可以选自不同的氧化还原试剂，如碘、氰亚铁酸盐、氧和过氧化物。在传统溶液相反应中用来闭合共价键的其它试剂也可选择。
提供一种方法，其中正确折叠的肽的二级和三级结构通过在氨基酸侧链之间形成共价连接来固定，优选通过使试剂混合物经过结合在活化固相上的再折叠产物而实现的闭合来自游离巯基的二硫键、形成酰胺键或形成稳定的芳香或脂肪族腙来固定。
还提供一种特殊方法，来合成以下序列的肽：
HHHH-XX-TIVESCNRWITFAQSIISTLT-βAla-G-G-βAla-TKKTQLQLEHLLLDLQMCLNGINN-XX  (1)
其中，X＝d-丙氨酸，βAla＝β-丙氨酸，包括在半胱氨酸残基之间形成二硫键，因而形成
Figure A20048001416300211
其中X和βAla如上所定义。
使用以上在Merrifield型顺序反应方案中描述的方法在活化固相上合成所述序列(I)的肽的特殊方法包括至少一个纯化和再折叠和在半胱氨酸残基之间形成二硫键的步骤。同样适用于其具有氨基酸缺失或氨基酸替换的肽衍生物，因为仍然存在两个cyctein残基，它们之间的距离允许形成二硫键。
此外，提供了包含锚定部分的肽，所述锚定部分优选由用来将肽配位、可逆结合至活化固相表面的非天然氨基酸构成，该锚定部分位于N-或C-端和/或肽的侧链中，包含至少一个金属离子络合基团，每个所述基团包含至少一个含氮基团，但有些肽例外，在这些肽中所述金属离子络合基团是2-5个组氨酸残基的氨基酸序列。
金属离子络合基团优选是所提供肽的含氮基团，优选将这些基团固定至N-或C-端或至少一个氨基酸的部分侧链上，并且所述基团选自氨基、羟基、羧基、巯基、咪唑基、N-甲基咪唑基、氨基嘌呤基团、phenanthrolyl基团、吡啶基团、联吡啶基团、三联吡啶基团、三氮杂环壬烷基团、四氮杂环十二烷基团或其组合。
在另一优选实施方案中，氨基酸部分包含单或寡聚天然或非天然氨基酸。
在优选实施方案中，锚定部分包含至少一个咪唑基团。更优选的是，肽的锚定部分包含1-10个咪唑基团。
在另一优选实施方案中，氨基酸包含至少两个、更优选6-10个组氨酸基团。在优选实施方案中，氨基酸部分包含至少一个咪唑基团。更优选的是，锚定部分包含1-10个咪唑基团。
关于本发明的另一优点是金属亲和树脂可以在肽合成之后再利用。这可以通过除去阳离子并将树脂重新载入相同或其它合适的阳离子来实现。由于各种阳离子的结合强度彼此不同，因此需要针对作为树脂表面和合成起始点之间桥连配体的另一阳离子而选择改进结合和再结合过程以及所得络合物稳定性的方法。
本发明还通过以下非限制性实施例来说明。
实施例：
缩写               物质
DMF                N，N-二甲基甲酰胺(肽合成级)
DCM                二氯甲烷(肽合成级)
HOBT               1-羟基苯并三唑(无水)
DBU                1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一碳-7-烯98％
PyBOP              苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-膦-六氟磷酸酯
DIPEA，DIEA        N-乙基二异丙基胺98+％
TIS                三异丙基硅烷99％
MeOH             甲醇HPLC(梯度级)
TFE                2，2，2-三氟乙醇99.8％
EDT                1，2-乙二硫醇
HCl              盐酸
NaOH             氢氧化钠溶液
THF                四氢呋喃
DMSO-d6           二甲基亚砜，氘化
br                 宽(信号峰)
s                  单
d                  双重
t                  三重
q             四重
p             五重
m             多重
TFA           三氟乙酸
NMI           N-甲基咪唑
Ni-NTA        超流动树脂(Superflow Resin)(Novagen)
实施例1：合成Fmoc-Gly-His4-Gly-OMe[TAG1]
将2mmol第一氨基酸和4mmol DIPEA溶于10ml干燥DCM中。将该溶液加入1.0g干燥的2-氯三苯甲基氯化物树脂(200-400目)中并且将该混合物在涡旋混合器上反应60分钟。反应结束时，将树脂与20ml DCM/MeOH/DIPEA反应两次每次3分钟，用20ml DCM洗涤两次并用DMF洗涤两次。随后用20ml哌啶/DMF(1∶3)处理两次，持续3/20分钟，并用20ml DMF洗涤6次。
将5mmol氨基酸、7.5mmol HOBT和10mmol DIPEA溶于15ml DMF中。5分钟后加入5mmol PyBOP和10mmol DIPEA，并将该溶液浇在树脂上。在涡旋混合器上60分钟后，将树脂用20ml DMF洗涤6次，用20ml哌啶/DMF(1∶3)处理两次，持续20/20分钟，并用20ml DMF洗涤6次。在N-端氨基酸的情况下，树脂不用哌啶/DMF处理。
结合最后的氨基酸之后，用20ml DMF洗涤树脂6次，用20ml DCM洗涤两次，接着使其与50ml TFE/DCM(2/8)反应60分钟。将树脂过滤，真空去除溶剂并使用粗肽片段而不再纯化。
将粗肽、10mmol Cl-HOBT、10mmol DIEA和20mmol DIC溶于最小量的干燥DCM中。使该溶液反应10分钟，并加入10mmol DIEA和10mmol Gly-Ome溶液。旋涡混合2h之后，加入100ml DCM并用200ml硫酸氢钠溶液(1-2mol/l)萃取3次，用200ml浓氯化钠溶液萃取3次并用200ml碳酸氢钠溶液(1-2mol/l)萃取3次。有机层经硫酸钠干燥，除去溶剂并使用粗肽而不再纯化。
将粗肽溶于50ml TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)中并使其在旋涡混合器上反应60分钟。通过与DCM共蒸发除去TFA。将粗肽溶于DMSO并在使用Kromasil RP C18柱的Gilson Nebula LCMS系统上纯化1000μl。从含TFA(0.1％)的5％乙腈水溶液经30分钟线性梯度扩展至50％乙腈(含0.085％TFA)。流速为20mL/min并在214nm处监测光吸收。
实施例2：合成Fmoc-Gly-His6-Gly-OMe[TAG3]
将2mmol第一氨基酸和4mmol DIPEA溶于10ml干燥的DCM中。将该溶液加入1.0g干燥的2-氯三苯甲基氯化物树脂(200-400目)中并且将该混合物在涡旋混合器上反应60分钟。反应结束时，将树脂与20ml DCM/MeOH/DIPEA反应两次每次3分钟，用20ml DCM洗涤两次并用DMF洗涤两次。随后用20ml哌啶/DMF(1∶3)处理两次，持续3/20分钟，并用20mlDMF洗涤6次。
将5mmol氨基酸、7.5mmol HOBT和10mmol DIPEA溶于15ml DMF中。5分钟后加入5mmol PyBOP和10mmol DIPEA，并将该溶液浇在树脂上。在涡旋混合器上60分钟后，将树脂用20ml DMF洗涤6次，用20ml哌啶/DMF(1∶3)处理两次，持续20/20分钟，并用20ml DMF洗涤6次。在N-端氨基酸的情况下，树脂不用哌啶/DMF处理。
结合最后的氨基酸之后，用20ml DMF洗涤树脂6次，用20ml DCM洗涤两次，接着使其与50ml TFE/DCM(2/8)反应60分钟。将树脂过滤，真空去除溶剂并使用粗肽片段而不再纯化。
将粗肽、10mmol Cl-HOBT、10mmol DIEA和20mmol DIC溶于最小量的干燥DCM中。使该溶液反应10分钟，并加入10mmol DIEA和10mmol Gly-Ome溶液。旋涡混合2h之后，加入100ml DCM并用200ml硫酸氢钠溶液(1-2mol/l)萃取3次，用200ml浓氯化钠溶液萃取3次并用200ml碳酸氢钠溶液(1-2mol/l)萃取3次。有机层经硫酸钠干燥，除去溶剂并使用粗肽而不再纯化。
将粗肽溶于50ml TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)中并使其在旋涡混合器上反应60分钟。通过与DCM共蒸发除去TFA。将粗肽溶于MeOH并在使用Kromasil RP C18柱的Gilson Nebula LCMS系统上纯化1000μl。从含TFA(0.1％)的5％乙腈水溶液经50分钟线性梯度扩展至80％乙腈(含0.085％TFA)。流速为20mL/min并在214nm处监测光吸收。
实施例3：合成Fmoc-Gly-His3-Gly-His3-Gly-OMe[TAG4]
将2mmol第一氨基酸和4mmol DIPEA溶于10ml干燥的DCM中。将该溶液加入到1.0g干燥的2-氯三苯甲基氯化物树脂(200-400目)中并且将该混合物在涡旋混合器上反应60分钟。反应结束时，将树脂与20ml DCM/MeOH/DIPEA反应两次每次3分钟，用20ml DCM洗涤两次并用DMF洗涤两次。随后用20ml哌啶/DMF(1∶3)处理两次，持续3/20分钟，并用20ml DMF洗涤6次。
将5mmol氨基酸、7.5mmol HOBT和10mmol DIPEA溶于15ml DMF中。5分钟后加入5mmol PyBOP和10mmol DIPEA，并将该溶液浇在树脂上。在涡旋混合器上60分钟后，将树脂用20mlDMF洗涤6次，用20ml哌啶/DMF(1∶3)处理两次，持续20/20分钟，并用20ml DMF洗涤6次。在N-端氨基酸的情况下，树脂不用哌啶/DMF处理。
结合最后的氨基酸之后，用20ml DMF洗涤树脂6次，用20ml DCM洗涤两次，接着使其与50ml TFE/DCM(2/8)反应60分钟。将树脂过滤，真空去除溶剂并使用粗肽片段而不再纯化。
将粗肽、10mmol Cl-HOBT、10mmol DIEA和20mmol DIC溶于最小量的干燥DCM中。使该溶液反应10分钟，并加入10mmol DIEA和10mmol Gly-Ome溶液。旋涡混合2h之后，加入100ml DCM并用200ml硫酸氢钠溶液(1-2mol/l)萃取3次，用200ml浓氯化钠溶液萃取3次并用200ml碳酸氢钠溶液(1-2mol/l)萃取3次。有机层经硫酸钠干燥，除去溶剂并使用粗肽而不再纯化。
将粗肽溶于50ml TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)中并使其在旋涡混合器上反应60分钟。通过与DCM共蒸发除去TFA。将粗肽溶于DMSO并在使用Kromasil RP C18柱的Gilson Nebula LCMS系统上纯化1000μl。从含TFA(0.1％)的5％乙腈水溶液经30分钟线性梯度扩展至50％乙腈(含0.085％TFA)。流速为20mL/min并在214nm处监测吸收。
实施例4：合成Fmoc-Gly-5-氨基-1，10-菲咯啉[TAG5]
将2ml DIEA、6mmol Cl-HOBt、12mmol DIC加入溶于最小量DMF中的2.56mmolFmoc-Gly-OH中。将该溶液在涡旋混合器上混合5分钟并加入溶于最小量DMF中的0.5g 5-氨基-1，10-菲咯啉。将该混合物孵育12小时并以5倍体积的乙酸乙酯稀释。用碳酸氢钠洗涤该溶液3次。粗产物沉淀，将该沉淀过滤并利用柱色谱或LCMS纯化。将该粗肽溶于DMSO并在使用Kromasil RP C18柱的Gilson Nebula LCMS系统上纯化1000μl。从含TFA(0.1％)的5％乙腈水溶液经50分钟线性梯度扩展至50％乙腈(含0.085％TFA)。流速为20mL/min并在214nm处监测吸收。
实施例5：合成(双-叔丁氧基羰基甲基-氨基)-乙酸[TAG8b]
a)合成(双-叔丁氧基羰基甲基-氨基)乙酸苯甲基酯[TAG8a]
将20mmol甘氨酸苯甲基酯对甲苯磺酸盐、40mmol溴代乙酸叔丁酯和60mmolDIEA溶于35ml干燥的DMF中。将反应混合物旋涡混合4天。滤除沉淀盐并将溶液溶于250ml乙酸乙酯中。用以下溶液萃取有机层：2×200ml 1N NaOH、3×1NNaOH/盐水1∶1。该溶液用Na2SO4干燥，真空蒸馏除去溶剂，粗产物通过快速柱色谱(乙酸乙酯/己烷1∶4)纯化。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)ppm 7.42-7.29(m，5H)，5.10(s，2H)，3.60(s，2H)，3.50(s，4H)，1.38(s，18H)；LC-MS(ESI)：(M+H)+＝394
b)合成(双-叔丁氧基羰基甲基-氨基)-乙酸[TAG8b]
将17.5mmol(双-叔丁氧基羰基甲基-氨基)-乙酸苯甲基酯溶于75ml THF中，并加入0.70g 10％附着炭上的催化剂钯。反应容器用氢气冲洗数次，在氢存在下搅拌反应混合物，直至氢消耗停止。经硅藻土滤除催化剂并真空除去溶剂。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)ppm，12.2(brs，1H)，3.46(s，2H)，3.44(s，4H)，1.40(s，18H)；LC-MS(ESI)：(M+H)+＝304
实施例6：合成4-(双-叔丁氧基羰基甲基-氨基甲酰)丁酸[TAG10b]
a)4-(双-叔丁氧基羰基甲基-氨基甲酰)丁酸苯甲基酯[TAG10a]
将24mmol戊二酸单苯甲基酯、30mmol乙二酰氯和两滴DMF溶于20ml干燥的DCM中。回流反应混合物，直至气体演变停止。将该溶液与10ml甲苯共蒸发。粗产物溶于DCM中并逐滴加入到12.0mmol(叔丁氧基羰基甲基-氨基)乙酸叔丁酯和26.4mmol DIEA的0℃的DCM溶液中。0℃下搅拌反应混合物1小时，并在室温下过夜。真空除去溶剂并将残留物溶于150ml二乙醚中。用以下溶液萃取有机层：100ml 1NHCl、100ml半浓的碳酸氢钠溶液和100ml盐水。该溶液经硫酸钠干燥并真空除去溶剂。粗产物经硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷1∶1)纯化。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)ppm 7.4-7.2(m，5H)，5.08(s，2H)，4.11(s，2H)，3.91(s，2H)，2.38(t，J＝7.4Hz，2H)，2.28(t，J＝7.3Hz，2H)，1.75(p，J＝7.4Hz，2H)，1.41(s，9H)，1.39(s，9H)；LC-MS(ESI)：(M+H)+＝450
b)合成4-(双-叔丁氧基羰基甲基-氨基甲酰)丁酸[TAG10b]
将2mmol 4-(双-叔丁氧基羰基甲基-氨基甲酰)丁酸苯甲基酯溶于20ml THF中，并加入0.09g 10％附着炭上的催化剂钯。反应容器用氢气冲洗数次，并在氢存在下搅拌反应混合物，直至氢消耗停止。
经硅藻土滤除催化剂并真空除去溶剂。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)ppm 12.1(br s，1H)，4.11(s，2H)，3.91(s，2H)，2.30-2.17(m，4H)，1.68(p，J＝7.2Hz，2H)，1.42(s，9H)，1.39(s，9H)；LC-MS(ESI)：(M+Na)+＝382
实施例7：合成4-([1，10]菲咯啉-5-基-氨基甲酰)-丁酸[TAG12b]
a)合成4-([1，10]菲咯啉-5-基-氨基甲酰)-丁酸甲酯[TAG12a]
在氩气氛中将5mmol 5-氨基-[1，10]-菲咯啉溶于25ml干燥的DMF中。加入6.5mmol DIEA并逐滴加入5.5mmol 4-氯羰基-丁酸甲酯。搅拌1小时之后通过真空蒸馏除去溶剂和过量的碱。粗产物经反相柱色谱(Merck Lobar RP18柱，洗脱剂：乙腈/碳酸氢铵，5重量％，梯度：20％-40％)纯化。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)ppm 10.11(s，1H)，9.13(dd，J＝1.6，4.3Hz，1H)，9.03(dd，J＝1.7，4.3Hz，1H)，8.60(dd，J＝1.6，8.4Hz，1H)，8.44(dd，J＝1.7，8.2Hz，1H)，8.17(s，1H)，7.82(dd，J＝4.2，8.4Hz，1H)，7.74(dd，J＝4.3，8.1Hz，1H)，3.63(s，3H)，2.59(t，J＝7.2Hz，2H)，2.46(t，J＝7.4Hz，2H)，1.95(p，J＝7.3Hz，2H)；LC-MS(ESI)：(M+H)+＝324
b)合成4-([1，10]菲咯啉-5-基-氨基甲酰)-丁酸[TAG12b]
将1.5mmol 4-([1，10]菲咯啉-5-基-氨基甲酰)-丁酸甲酯溶于15ml 1，4-二噁烷和15ml蒸馏水中。加入1.5ml 1N氢氧化钾溶液并回流该溶液1小时。真空蒸馏除去溶剂，粗产物经反相柱色谱(Merck Lobar RP18柱，洗脱剂：乙腈/碳酸氢铵，1重量％，梯度：10％-20％)纯化。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)，以钾盐形式：ppm 9.11(dd，J＝1.6，4.3Hz，1H)，9.04(dd，J＝1.6，4.4Hz，1H)，8.65(dd，J＝1.5，8.4Hz，1H)，8.41(dd，J＝1.6，8.1Hz，1H)，8.14(s，1H)，7.82(dd，J＝4.4，8.4Hz，1H)，7.74(dd，J＝4.4，8.1Hz，1H)，2.64(t，J＝7.6Hz，2H)，2.36(t，J＝7.2Hz，2H)，2.10(q，J＝7.5Hz，2H))；LC-MS(ESI)：(M+H)+＝310
此外，含有不同于戊二酸的其它二羧酸衍生物的标签分子可以类似于本文所述方案而制备。
实施例8：合成[5-([1，10]菲咯啉-5-基-氨基甲酰)戊酰氨基]-乙酸[TAG15]
在氩气氛中将负载有Fmoc-Gly-OH(0.7mmol/g)的1mmol Wang树脂悬浮于哌啶/DMF(1∶3)并在微波炉(CEM系统“Discover”)中照射3次持续30秒。用DMF洗涤树脂3次并用DCM洗涤3次。将树脂悬浮于15ml DCM中并加入9mmol DIEA和10mmol己二酰氯。旋涡搅拌该悬浮液30分钟之后，过滤反应混合物并将树脂用DCM洗涤2次，用DMF洗涤1次。将树脂悬浮于15ml DMF中并加入3mmol 5-氨基-[1，10]-菲咯啉和5mmol DIEA的20ml DMF溶液。悬浮液旋涡搅拌过夜之后，将树脂用DMF洗涤6次，通过悬浮于TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)中来从树脂切割出产物。滤除树脂并将滤液与氯仿共蒸发几次以得到产物。
该过程也可类似应用于结合肽的其它树脂和二羧酸的其它活化衍生物。
实施例9：5-氨基-1，10-菲咯啉/2-氯三苯甲基氯化物树脂
在惰性气体下，将2mmol 5-氨基-[1，10]-菲咯啉悬浮于50ml干燥DMF中。将5g2-氯三苯甲基氯化物树脂(200-400目)加入所得混合物中并在室温下孵育该树脂2小时。滤除树脂并用DMF洗涤直至除去过量的菲咯啉。为了阻断树脂上的未反应基团，用10ml DCM/MeOH/DIEA(80∶15∶5)孵育3次持续10分钟，随后用10ml DMF洗涤3次。树脂可在室温下贮存在DMF中。为了将Ni2+离子负载到树脂上，用NiCl2的饱和DMF溶液孵育树脂30分钟。用DMF洗涤树脂直至没有NiCl2可被发现。在5次额外的DMF洗涤之后，进行以下过程：
4×5′ DMF/N-甲基咪唑(0.25mol/l)
4×15′DMF/N-甲基咪唑(0.25mol/l)
1×12h DMF/N-甲基咪唑(0.25mol/l)
2×5′DMF
1×1′异丙醇
1×15′异丙醇
1×5′DMF
1×30′DMF
1×1′异丙醇
1×15′异丙醇
1×5′DMF
1×30′DMF
1×1′异丙醇
1×15′异丙醇
1×5′DMF
1×30′DMF
实施例10：5-氨基-1，10-菲咯啉/Novasyn TG羧基树脂
将5g Novasyn TG树脂用50ml干燥DMF平衡30分钟。加入10mmol DIEA和10mmol HOBt。孵育5分钟之后加入2g 5-氨基-1，10-菲咯啉和10mmol Pybop以及10mmol DIEA并旋涡混合该混合物过夜。第二天早上，将树脂每次用50ml DMF洗涤6次。为了将镍负载在树脂上，加入10ml氯化镍饱和DMF溶液并旋涡混合30分钟。该步骤之后，除去上清液，并用50ml DMF分批洗涤树脂，直至上清液中无可见颜色。通过以下洗涤程序除去过量吸附的镍离子：
4×5′ DMF/N-甲基咪唑(0.25mol/l)
4×15′DMF/N-甲基咪唑(0.25mol/l)
1×12h DMF/N-甲基咪唑(0.25mol/l)
2×5′DMF
1×1′异丙醇
1×15′异丙醇
1×5′DMF
1×30′DMF
1×1′异丙醇
1×15′异丙醇
1×5′DMF
1×30′DMF
1×1′异丙醇
1×15′异丙醇
1×5′DMF
1×30′DMF
实施例11：合成1，4，7-三氮杂环壬烷/2-氯三苯甲基氯化物树脂
将2.5g 2-氯三苯甲基氯化物树脂(200-400目)悬浮于40ml干燥DMF中。加入500mg 1，4，7-三氮杂环壬烷三盐酸盐和2ml二异丙基乙胺。室温下孵育树脂8小时。过滤树脂并用DMF洗涤6次。为了阻断树脂上的未反应基团，用20mlDCM/MeOH/DIEA(80∶15∶5)孵育2次每次30分钟，随后用20ml DMF洗涤2次。可以根据实施例10完成树脂的镍负载。树脂在DMF保护下贮存于冰箱中。
实施例12：将标签负载至树脂上(批次实验)
将1ml相应的树脂用DMF(肽合成级)洗涤3次。将1mg标签溶于1ml DMF中并加入1滴DIEA。将50μl的该溶液用950μl水稀释并利用HPLC分析。将残余混合物加入经洗涤的树脂中并孵育30分钟。为了检测标签对树脂的附着，用950μl水稀释50μl溶液并用HPLC进行分析。
实施例12a：将TAG1负载至Ni-菲咯啉-2Cl-Trt-树脂
上清液的HPLC显示没有可检测的TAG1。
实施例12b：将TAG3负载至Ni-菲咯啉-2Cl-Trt-树脂
上清液的HPLC显示没有可检测的TAG3。具有相似保留时间的残余痕量是未结合的少量杂质。该实施例还显示出本方法用于从杂质中纯化产物的潜力。
实施例12c：将TAG4负载至Ni-菲咯啉-2Cl-Trt-树脂
上清液的HPLC显示没有可检测的TAG3。
实施例12d：将TAG3负载至Ni-菲咯啉-Novasyn-TG-树脂
上清液的HPLC显示没有可检测的TAG3。
实施例13：从树脂洗脱TAG3(批次实验)
将10ml已负载树脂用20ml混合物1洗涤3次，并将树脂分成10份。除去上清液并用以下溶液孵育树脂5分钟：
(TAG3_01)6mg谷胱甘肽(氧化型)溶于2ml混合物1(5mmol/l)
(TAG3_02)3mg谷胱甘肽(还原型)溶于2ml混合物1(5mmol/l)
(TAG3_03)2ml 1N HCl
(TAG3_04)2ml 0.1N HCl
(TAG3_05)0.68mg咪唑溶于2ml混合物1(5mmol/l)
(TAG3_06)1.36mg咪唑溶于2ml混合物1(10mmol/l)
(TAG3_07)2.72mg咪唑溶于2ml混合物1(20mmol/l)
(TAG3_08)0.82mg N-甲基咪唑溶于2ml混合物1(5mmol/l)
(TAG3_09)1.64mg N-甲基咪唑溶于2ml混合物1(10mmol/l)
(TAG3_10)3.28mg N-甲基咪唑溶于2ml混合物1(20mmol/l)
对于用更高浓度的咪唑和N-甲基咪唑洗脱的实验，通过使用来自试管(TAG3-07)和(TAG3_10)的树脂来进行实验。这些树脂用浓度逐渐增加的洗脱试剂(100mmol、200mmol、500mmol)孵育，分析上清液并用下一浓度的洗脱试剂孵育树脂5分钟。
结果：
可利用盐酸轻易实现标签的洗脱。浓度100mmol以上的咪唑或N-甲基-咪唑也可有效洗脱。
实施例14：从Ni-NTA树脂上结合和洗脱TAG3(FPLC实验)
肽：TAG3(Fmoc-(His)6-OMe，M＝1191.25g/mol)，HPLC级
树脂：Ni-NTA SuperFlow(载量约5μmol/ml)
柱：Biorad 2.0ml
FPLC设备：_kta Pharmacia
a)用N-甲基咪唑洗脱
注射1.1mg(0.92μmol)TAG3的0.75ml洗脱剂A溶液
洗脱剂A：2，2，2-三氟乙醇/H2O/二异丙基乙胺/N-甲基咪唑1∶1∶+1％∶+5mM
洗脱剂B：TFE/H2O/DIEA/NMI 1∶1∶+1％∶+500mM
流速：1ml/min
程序：注射(5mlA)→洗涤(10mlA)→梯度：洗脱剂(0％B→100％B 10ml)→保持(5ml B)→再生(8ml A)
TAG3定量结合并在100-125mM N-甲基咪唑浓度下洗脱。这种FPLC程序也可用来确定阈值浓度，在该浓度以上锚定分子受螯合剂有效竞争。阈值浓度以下，锚定分子仍然结合在树脂上。在批次程序中，混合物稀释至阈值浓度点以下将重新固定溶解的锚定分子至树脂上。
b)用盐酸洗脱
将2.4mg(2.0μmol)TAG3的0.75ml洗脱剂A溶液注射到_kta FPLC机器中。运行以下程序：
洗脱剂A1：TFE/H2O/DIEA/NMI  1∶1∶+1％∶+5mM
洗脱剂B：TFE/H2O/NMI  1∶1∶+5mM
洗脱剂A2：TFE/H2O/HCl  1∶1∶+10mM
流速：0.5-1ml/min
程序：注射(2.5ml A1)→洗涤(10ml A1)→梯度：除去DIEA(0％B→100％B 10ml)→接着“阶段梯度(Step-Gradient)”到洗脱剂A2(10mM HCl：20％、40％、60％、70％)
TAG3在60％的洗脱剂A2中洗脱。
实施例15：用Fmoc-Gly合成环
将TAG3和Fmoc-Gly偶联至TG-树脂上。
将负载有TAG3的1ml TG树脂用5ml DMF洗涤3次。为了将N端去保护，加入5ml 20％哌啶并孵育树脂30分钟。接着将树脂用DMF洗涤6次，并加入溶于最少量DMF中的1mmol Fmoc-Gly-OH、2mmol DIEA、2mmol HOBt和2mmmol DIC预活化溶液。60分钟之后，用每次5ml DMF洗涤树脂6次并用每次2ml水洗涤6次。为了从树脂上切割肽，加入1ml 1N HCl并孵育树脂30分钟。
结果：切下的肽在Vydac C18质谱柱(218MS5415)通过LCMS进行分析。采用5％-95％B的30分钟梯度和流速1ml/min(A＝水、0.1％TFA；B＝乙腈、0.085％TFA)。
未检测到离析物。混合物中唯一存在的肽表现出期望质量(M＝1247，M2+＝625)。除了HOBt，没有检测到其它明显的杂质。
实施例16：在Ni-NTA-树脂上合成TAG5-G-A-Fmoc
在1.7ml Omnifit柱中将2.65mg TAG5结合至Ni-NTA-树脂上。将树脂移入微波反应器中并用每次5ml DMF洗涤树脂6次。弃去上清液并用5ml 25％的哌啶DMF溶液孵育树脂，同时在Discovery微波炉(CEM GmbH)中暴露于3×30秒每次50W的微波脉冲。将树脂用DMF洗涤6次。制备溶于最少量溶剂(DMF)的1mM预期氨基酸(适当保护)的溶液。将2mmol DIEA、2mmol HOBt和2mmol DIC加入该溶液。孵育5分钟后，将该溶液加入去保护的树脂中并以每次50W的功率微波处理3×30秒。在连接最后的氨基酸之后，末端fmoc基团没有除去。用水(pH大于7)洗涤树脂5次。最后，将2ml 1N HCl加入树脂。孵育树脂30分钟。移除并保存上清液。将上清液直接用于LC/MS分析。收集树脂用于再循环利用。LC/MS显示在唯一可检测的肽峰上肽具有正确质量。非肽杂质为HOBt和HOBt-H2O。
实施例17：纯化IL-2 Immunomer
在Ni-NTA上用2，2，2-三氟乙醇/H2O/二异丙基乙胺/N-甲基咪唑来纯化IL-2Immunomer(DIM03A)。
肽：如实施例19所确定(M＝6237g/mol)，粗产物得自树脂切割物；
树脂：Ni-NTA SuperFlow
将溶于5ml洗脱剂A中的76.7mg(12.2μmol)肽分5次注射，见图3a-c所示。
柱：Biorad 2.0ml
洗脱剂A：TFE/H2O/DIEA/NMI  1∶1∶+1％∶+5mM
洗脱剂B：TFE/H2O/DIEA/NMI  1∶1∶+1％∶+500mM
流速：1ml/min
程序：注射(5mlA)→洗涤(10ml A)→梯度：洗脱剂(0％B→100％B 10ml)→保持(5ml B)→再生(8ml A)
预期产物以单峰形式在约125mM NMI中洗脱。用LC-MS进行确认。
实施例18：合成后的肽修饰
封闭肽中的二硫桥
H2N-HHHHGC(Acm)GNGGGC(Trt)GSGN-COOH
Acm和Trt是保护半胱氨酸残基上SH基团的标准保护基团。肽经常规肽合成而合成并在LC-MS系统上预纯化至纯度95％以上。
将1ml负载有肽的Ni-NTA树脂用2ml MeOH洗涤3次。2小时内加入50μl碘溶液(0.5mol/l)并将该混合物在室温下再孵育2小时。将树脂用MeOH洗涤6次，用水(pH＞7)洗涤3次，随后用2ml HCl(1N)孵育。滤除树脂并用LCMS分析溶液。得到单一产物峰，显示出正确的质量。
实施例19：使用本文所提供方法的再折叠步骤合成白介素-2 Immunomer
待合成物质的化学式：
Figure A20048001416300351
X＝D-丙氨酸
βAla＝β-丙氨酸
其它字母＝标准氨基酸代码
一般策略：
在2-氯三苯甲基氯化物树脂(200-400目)上以0.2mmol/g的取代率进行合成。前7个氨基酸连接为片段。随后的氨基酸的连接通过用10倍过量的氨基酸和作为偶联添加剂的PyBOP/HOBT/DIPEA进行单、双、三重偶联来实现。生长中肽链的N端去保护是通过用哌啶/DMF(1/3)二次处理来实现。在困难情况下，用DBU/哌啶/DMF(2/2/96)进行第三次处理。所用的偶联和去保护循环数目示于以下方案中(关于困难的偶联/去保护信息通过用HPLC-MS监测每一步延伸来得到)。
RES-XXNNIGN-LCMQLDLLLHELQLQTKKTBGGB-TLTSIISQAFTIWRNCSEVITXXHHHH
偶联：      22221211111111122222222-223333333333333333333333333
去保护：    22222222222222322222222-223333333333333333333333333
1，2，3＝偶联或去保护循环数目
X＝D-丙氨酸
B＝β-丙氨酸
方案1：合成第一肽片段
将2mmol第一氨基酸和4mmol DIPEA溶于10ml干燥DCM中。将该溶液加入1.0g干燥的2-氯三苯甲基氯化物树脂(200-400目)中并使该混合物在旋涡混合器上反应60分钟。反应结束时，将树脂与20ml DCM/MeOH/DIPEA反应两次每次3分钟，用20ml DCM洗涤两次并用DMF洗涤两次。随后用20ml哌啶/DMF(1∶3)处理两次，持续3/20分钟，并用20mlDMF洗涤6次。氨基酸2-7通过以下步骤连接：将5mmol氨基酸、7.5mmol HOBT和10mmol DIPEA溶于15ml DMF中。5分钟后加入5mmolPyBOP和10ml DIPEA，并将该溶液浇在树脂上。在涡旋混合器上混合60分钟后，将树脂用20ml DMF洗涤6次，用20ml哌啶/DMF(1∶3)处理两次，持续20/20分钟，并用20ml DMF洗涤6次。在N-端氨基酸的情况下，树脂不用哌啶/DMF处理。
方案2：切割肽片段
结合最后的氨基酸之后，用20ml DMF洗涤树脂6次，用20ml DCM洗涤两次，接着使其与50ml TFE/DCM(2/8)反应60分钟。将树脂过滤，真空去除溶剂并使用粗肽片段而不再纯化。
方案3：再结合肽片段
将1mmol片段和2mmol DIPEA溶于50ml干燥DCM中。将该溶液加入5.0g干燥的2-氯三苯甲基氯化物树脂(200-400目)中并使该混合物在旋涡混合器上反应12小时。反应结束时，将树脂与50ml DCM/MeOH/DIPEA反应两次每次3分钟，用20mlDCM洗涤两次并用DMF洗涤两次。
方案4：偶联氨基酸8-57
将干燥的树脂在50ml哌啶/DMF(1∶3)中溶胀30分钟，用30ml哌啶/DMF(1∶3)处理20分钟，用30ml DBU/哌啶/DMF(2/2/96)处理20分钟并用30ml DMF洗涤6次。将10mmol氨基酸、15mmol HOBT和20mmol DIPEA溶于30ml DMF中。5分钟后加入10mmol PyBOP和20mmol DIPEA，并将该溶液浇在树脂上。在涡旋混合器上混合60分钟后，将树脂用30ml DMF洗涤2次，并重复偶联1次或(困难情况下)2次持续60分钟。随后用30ml DMF洗涤树脂6次。该树脂可直接用于偶联下一氨基酸或者一在用30ml DCM洗涤2次之后一真空干燥并在-80℃下贮存。
方案5：切割和去保护
在偶联最后的氨基酸之后，通过用30ml哌啶/DMF(1∶3)两次处理20分钟和用DBU/哌啶/DMF(2/2/96)处理20分钟除去N端保护基。用30ml DMF洗涤树脂6次，用30ml DCM洗涤2次并用50ml TFE/DCM(2/8)处理180分钟。过滤后，真空除去溶剂并通过在惰性气氛下用30ml TFA/TIS/EDT/水(94/1/2.5/2.5)处理180分钟来除去保护基。将该溶液注入300ml冷醚中，将沉淀物溶解于乙腈并用RP-HPLC(Kromasil 100C410μm，250×4.6mm)纯化肽，并所收集组分直接用于再折叠过程。
作为替代方案，IL-2Immunomer粗产物可在金属亲和柱上得到有效纯化：
IL-2粗产物，76.7mg(12.2μmol)，溶于约5ml洗脱剂A中，分5次注射(亦见图3a-c)
柱：Omnifit 1.7ml
洗脱剂A：TFE/H2O/DIEA/NMI  1∶1∶+1％∶+5mM
洗脱剂B：TFE/H2O/DIEA/NMI  1∶1∶+1％∶+500mM
流速：1ml/min
程序：注射(5ml A)→洗涤(16.5ml A)→梯度：洗脱剂(0％B→100％B 10ml)→保持(5ml B)→再生(8ml A)
方案6：再折叠步骤
精确使用与洗脱组分中相同的溶剂将各洗脱组分稀释至最终体积20ml。将该纯化产物的溶液在烧杯中于轻微搅拌下与10ml Ni-NTA SuperFlow(Qiagen)室温孵育30分钟。将Superflow颗粒装入空的FPLC柱并连接至FPLC机器。使用该机器的色谱程序，于10分钟内交换溶剂。用水形成梯度，然后经10分钟梯度将溶剂改变为水/三氟乙酸(1/1)混合物。在24小时时间内，该溶剂通过向储瓶吹氧气泡而被氧化并使用氧作为瓶内气氛以便封闭二硫桥。氧化过程中，以恒定流速0.1ml/min沿柱流动过夜，同时将洗脱液持续再循环至储瓶中。
在24小时结束时，用含150mM咪唑的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)或用0.1M乙酸盐缓冲液(pH4.5)将再折叠和封闭二硫键的最终产物洗脱。
实施例20：将(双-叔丁氧基羰基甲基-氨基)-乙酸[TAG8b]偶联至肽的N端
根据如实施例19的方案1的标准方法，在2-氯三苯甲基氯化物树脂(200-400目)上制备1mmol序列为WETGLRLAPL的肽。
为了将TAG8b偶联到肽的N端上，类似地采用偶联氨基酸的程序。将5mmolTAG8b、7.5mmol HOBT和10mmol DIPEA溶于15ml DMF中。5分钟后加入5mmolPyBOP和10mmol DIPEA并将该溶液浇注在树脂上。旋涡混合60分钟后，将树脂用20ml DMF洗涤6次，用30ml DCM洗涤2次。
根据标准程序进行肽的切割和去保护：将树脂用50ml TFE/DCM(2/8)处理180分钟。过滤后，真空除去溶剂并通过在惰性气氛中用30ml TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)处理180分钟来除去保护基团。将该溶液注入300ml冷醚中，将沉淀物溶于乙腈并且用RP-HPLC(Kromasil 100 C410μm，250×4.6mm)纯化肽。
在去保护步骤期间，切除标签Tag的叔丁酯基，从而生成肽Tag8-WETGLRLAPL。
LC-MS(ESI)：(M+H)+：1331。
实施例21：将4-(双叔丁氧基羰基甲基-氨基甲酰)-丁酸[TAG 10b]偶联至肽的N端
根据如实施例19的方案1的标准方法，在2-氯三苯甲基氯化物树脂(200-400目)上制备1mmol序列为GDQYIQQAHRSHI的肽。
为了将Tag10b偶联到肽的N端上，类似地采用偶联氨基酸的程序。将5mmolTag10b、7.5mmol HOBT和10mmol DIPEA溶于15ml DMF中。5分钟后加入5mmolPyBOP和10mmol DIPEA并将该溶液浇注在树脂上。旋涡混合60分钟后，将树脂用20ml DMF洗涤6次，用30ml DCM洗涤2次。
根据标准程序进行肽的切割和去保护：将树脂用50ml TFE/DCM(2/8)处理180分钟。过滤后，真空除去溶剂并通过在惰性气氛中用30ml TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)处理180分钟来除去保护基团。将该溶液注入300ml冷醚中，将沉淀物溶于乙腈并且用RP-HPLC(Kromasil 100 C4 10μm，250×4.6mm)纯化肽。
在去保护步骤期间，切除标签Tag的叔丁酯基，从而生成肽Tag 10-GDQYIQQAHRSHI。
LC-MS(ESI)：(M+H)+：1783。

Claims (50)

1.活化固相的用途，所述活化固相包含固相载体、共价结合至固相载体的金属螯合配体、配位结合至所述金属螯合配体上的金属离子Mn+，n＝1-3，所述活化固相提供用来使固相肽合成或肽纯化的肽锚定部分配位、可逆结合的配位位点。
2.权利要求1的用途，其中所述肽是“生长中的肽”并经历肽延伸过程。
3.权利要求1或2的用途，其中固相载体基于二氧化硅、玻璃或纤维素或选自聚苯乙烯树脂、三聚氰胺树脂和聚乙烯醇的聚合物。
4.权利要求1-3任一项的用途，其中每个金属螯合配体含有至少一个氮、氧、磷或硫原子，所述原子能够建立配位的配体-金属键。
5.权利要求1-4任一项的用途，其中每个金属螯合配体含有选自氨基、杂环氮、羧基、羟基和巯基的至少一个官能团。
6.权利要求1-5任一项的用途，其中共价结合至固相载体的每个金属螯合配体含有选自三苯基膦基团、氨基嘌呤基团优选6-氨基嘌呤基团、酞菁基团、1，10-菲咯啉基团优选5-氨基-1，10-菲咯啉基团、三联吡啶基团优选4’-氨基-[2，2’；6’，2”]三联吡啶基团、三氮杂环壬烷基团优选[1，4，7]三氮杂环壬烷基团和四氮杂环十二烷基团优选[1，4，7，10]四氮杂环十二烷基团的至少一个基团。
7.权利要求1-6任一项的用途，其中金属Mn+选自Mn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+和镧系金属离子，Mn+尤其优选为Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+。
8.一种方法，其中肽锚定部分配位结合于活化固相的配位位点，所述活化固相包含固相载体、共价结合至固相载体的金属螯合配体、结合至所述金属螯合配体上的金属离子Mn+，n＝1-3，所述肽锚定部分通过加入竞争配体而从所述活化固相上解离。
9.权利要求8的方法，其中竞争配体包含至少一个能够螯合金属离子的基团，优选含氮基团，选自咪唑、N-甲基咪唑、氨基嘌呤、菲咯啉、联吡啶、三联吡啶、三氮杂环壬烷、四氮杂环十二烷、亚氨基二乙酸基团、氨三乙酸基团和乙二胺四乙酸基团。
10.权利要求8或9的方法，其中所述肽为生长中的肽，通过锚定部分结合金属离子，所述金属离子结合至与固相载体结合的金属螯合配体并经历肽延伸过程。
11.权利要求10的方法，其中在Merrifield型顺序反应方案中将单或寡聚氨基酸加在生长中肽的C-或N-端上。
12.权利要求8-11任一项的方法，其中肽的锚定部分包含至少一个金属离子络合结构，每个所述结构包含至少一个含氮、氧、磷或硫的基团，所述基团能与活化固相上的金属离子配位结合。
13.权利要求8-12任一项的方法，其中能与活化固相上的金属离子配位结合的含氮基团选自氨基、羟基、羧基、巯基、咪唑基、N-甲基咪唑基、氨基嘌呤基团、phenanthrolyl基团、吡啶基团、联吡啶基团、三联吡啶基团、三氮杂环壬烷基团、四氮杂环十二烷基团、亚氨基二乙酸基团、氨三乙酸基团和乙二胺四乙酸基团。
14.权利要求8-13任一项的方法，其中肽链的锚定部分位于肽的C-端和/或位于肽的至少一个氨基酸侧链内。
15.权利要求14的方法，其中位于肽C-端的锚定部分的至少一个氨基酸被一个或多个氨基酸延长，这可以用检测系统来检测。
16.权利要求8-15任一项的方法，其中肽锚定部分在其N-端由提供特定蛋白酶识别位点的氨基酸序列而延长。
17.权利要求8-16任一项的方法，其中在解离之后，通过稀释含有竞争配体的Merrifield型顺序反应方案的反应混合物来将肽再结合至活化固相上。
18.一种用来纯化含有锚定部分的肽的方法，其中所述肽任选地受到保护，所述锚定部分配位结合至活化固相的配位位点，所述活化固相包含固相载体、共价结合至固相载体的金属螯合配体、结合至所述金属螯合配体上的金属离子Mn+，n＝1-3，进行漂洗以洗去杂质，如残余保护基团和清除剂或肽合成所不希望的副产物。
19.一种再折叠误折叠结构和/或使任选地受保护的肽的分子间聚集体解聚的方法，其中肽锚定部分配位、可逆地结合至活化固相，并重建正确折叠的肽结构，该方法包括以下步骤：
(a)将肽暴露于至少一种离液剂或变性剂中，和
(b)(b)随后暴露于一系列溶剂中，以逐渐减少离液程度并提供再折叠和重建二级和三级结构的可重复条件。
20.权利要求19的方法，其中肽的二级和三级结构通过使用合适试剂处理肽而在所述肽的活性侧链之间形成共价连接得以维持，包括在肽从活化固相上解离之前形成所述共价连接。
21.权利要求20的方法，其中共价连接是二硫键、酰胺键或稳定的芳香族或脂肪族腙。
22.权利要求8、18、19和20的方法，用来合成以下序列的肽HHHH-XX-TIVESCNRWITFAQSIISTLT-βAla-G-G-βAla-TKKTQLQLEHLLLDLQMCLNGINN-XX  (I)其中，X＝d-丙氨酸，βAla＝β-丙氨酸，包括在半胱氨酸残基之间形成二硫键，从而形成
其中X和βAla如上所定义。
23.包含锚定部分的肽，所述锚定部分优选由用来使肽配位、可逆地结合至活化固相表面的非天然氨基酸组成，该锚定部分位于肽的N-或C-端和/或侧链中，含有至少一个金属离子络合结构，每个所述结构包含至少一个含氮基团，但有些肽例外，在这些肽中所述金属离子络合结构是2-5个组氨酸残基的氨基酸序列。
24.权利要求23的肽，其中金属离子络合基团，优选含氮基团，固定至N-或C-端或至少一个氨基酸的部分侧链，并且选自氨基、羟基、羧基、巯基、咪唑基、N-甲基咪唑基、氨基嘌呤基团、phenanthrolyl基团、吡啶基团、联吡啶基团、三联吡啶基团、三氮杂环壬烷基团、四氮杂环十二烷基团或其组合。
25.一种通过使生长中肽链非共价结合至活化固相而固相合成肽的方法，其中各固相的活性成分由具有游离配位位点的金属螯合物形成，从而通过存在于生长中肽链锚定部分处的螯合基团使生长中肽链非共价结合至活化固相上。
26.根据权利要求25的方法，特征在于根据权利要求1的活化固相，其中活化固相包含通过金属离子和金属螯合配体之间的络合物所形成的活性成分，所述配体直接或通过连接分子共价结合至固相。
27.根据权利要求25和/或26的方法，其中肽合成期间重复性合成循环中完全建立的金属络合物包含固相、金属螯合配体、金属离子和存在于单或寡聚氨基酸的N-或C-端处和/或侧链中的螯合基团，所述金属离子插入到金属螯合配体和肽链锚定部分的螯合基团之间，所述螯合基团形成肽链锚定部分，所述肽链基于重复性合成循环而以逐步方式增长。
28.根据权利要求25-28任一项的方法，其中金属离子与金属螯合配体的非共价、配位结合具有比结合至螯合基团的力更强的力。
29.根据权利要求25-28任一项的方法，其中金属络合物结构组成如下：
a)共价固定至固相且能够通过N、O、P和/或S原子螯合金属离子的金属螯合配体；
b)金属离子，Me[n+]，n＝1-3，优选2，所述金属离子被金属螯合配体所络合，同时游离配位位点依然保持可用；
c)天然地或经化学修饰而含有侧链或N-端或C-端修饰的单或寡聚天然或非天然氨基酸，所述氨基酸含有螯合基团，因而可以与游离配位位点络合，所述游离配位位点出a)和b)和权利要求1-4所述的在活化固相上的金属螯合配体与Men+离子的部分饱和络合物提供，由此螯合基团可以通过N、O、P和/或S原子螯合金属离子，并且由此至少一个，优选1-3个螯合基团可以存在于一个侧链中，从而形成用于结合生长中肽链的稳定锚定部分。
30.权利要求25-29任一项的方法，其中所述固相的特征在于存在选自氨基、杂环氮、羧基、羟基、硫羟基或其它官能实体的官能化学基团，所述官能化学基团本身已知存在偶联反应，由此这些官能化学基团和偶联反应用来共价衍生具有根据权利要求25-29的金属螯合配体的固相。
31.根据权利要求25-30任一项的方法，其中金属螯合配体包含可以化学偶联至根据权利要求30的固相表面处的官能化学基团的官能团，并且其中相同的金属螯合配体以及根据权利要求29的氨基酸侧链的螯合基团包含一个或多个、优选1-3个可以络合根据权利要求5的金属离子(Men+)的官能团，所述官能团选自氨基、杂环氮、氮杂基团、羧基、含硫或磷的基团。
32.根据权利要求25-31任一项的方法，其中金属离子(Men+)与固相上的金属螯合配体络合；这些金属离子选自Mn2+、Ni2+、Cu2+、Co2+或Zn2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+或镧系金属离子。
33.根据权利要求25-32任一项的方法，其中顺序反应用来将其它单或寡聚氨基酸结合至根据权利要求27的完全建立的金属络合物的C-或N-端；在每一循环中结合的适当保护的氨基酸衍生物或寡聚片段可从任意天然或非天然氨基酸中自由选择或组合。
34.权利要求25-33任一项的方法，其中将竞争螯合剂加入到Merrifield型反应方案的偶联步骤的试剂混合物中，以便在该步骤中从固相上竞争性解离生长中肽链；对于活化固相的游离配位位点，合适的竞争螯合剂具有与单或寡聚氨基酸侧链的单个螯合基团大致相同的亲和性，所述单个螯合基团用来将生长中肽链锚定至固相，竞争螯合剂可溶于偶联步骤的试剂混合物中，并且不与偶联步骤中试剂混合物的成分反应或干扰偶联步骤中试剂混合物的成分。
35.根据权利要求34的方法，其中包含竞争螯合剂的偶联步骤反应混合物在随后的洗涤步骤之前稀释，以便在随后的步骤如漂洗或洗涤步骤之前，将形成肽链锚定部分的单或寡聚氨基酸再结合至活化固相。
36.根据权利要求25-35任一项的方法，其中解离和去保护的肽合成粗产物可以与根据权利要求25-32任一项的固相形成金属络合物，所述肽合成粗产物具有单或寡聚氨基酸，在这些氨基酸的侧链或N-或C-端基具有根据权利要求29的螯合基团，并可以通过以下步骤进一步处理所述肽合成粗产物：
a)通过在使期望产物再结合至固相的条件下将粗产物溶液暴露于根据权利要求25-32的活化固相，并利用过量溶剂洗去杂质如残余保护基团和清除剂或不希望的副产物，同时选择性保留络合在活化固相上的产物，从而进行纯化，并且其进一步纯化
b)通过将结合产物暴露于离液剂或变性剂，例如脲、去污剂如十二烷基硫酸钠、高盐浓度、巯基乙醇等，由此将结合产物转变为变性状态，来消除产物可能的不希望的误折叠结构和产物分子的分子间聚集体，其特征在于破坏二级和三级结构，同时保持与固相的结合。
37.根据权利要求36的方法，其中将所述纯化、结合和变性产物暴露于一系列溶剂中，该系列溶剂为相应产物而设计和优化，以逐渐减少离液程度并产生结合产物分子再折叠的可重复条件以及可控再现二级和三级结构，同时保持产物分子结合至固相。
38.权利要求36和/或37的方法，其中通过使试剂混合物经过结合至固相的再折叠产物而实现氨基酸侧链间的共价连接，所述共价连接优选封闭来自游离巯基的二硫键、形成酰胺键或形成稳定的芳族或脂肪族腙。
39.权利要求30的方法，其中所述固相选自二氧化硅、纤维素或选自聚合物，所述聚合物优选选自用二乙烯基苯交联的聚苯乙烯树脂、氯三苯甲基树脂，选自衍生的、优选羧化的三聚氰胺颗粒，或选自衍生的、优选羧化的聚乙烯醇聚合物载体。
40.根据权利要求30和/或39的方法，其中所述树脂基体包含铁磁性颗粒并可以应用磁性颗粒分离技术。
41.根据权利要求25-33任一项的方法，其中所述单或寡聚氨基酸包含咪唑侧链，优选为不少于6个组氨酸残基、2个或更多组氨酸残基；更优选为6-10个组氨酸残基。
42.根据权利要求29和41的方法，其中所用的单或寡聚氨基酸利用提供特异蛋白酶识别位点的短氨基酸序列而在N-端延长。
43.根据权利要求29、41和/或42任一项的方法，其中修饰或未修饰(根据权利要求41)的单或寡聚氨基酸利用一个或多个氨基酸而在C-端延长，这可以通过检测系统检测，例如结合至生物素化氨基酸可以通过抗生物素蛋白类的相互作用进行检测。
44.根据权利要求34和/或35和/或41-43任一项的方法，其中所述竞争性螯合剂含有结构基团，所述结构基团包含具有用于配位咪唑基、N-甲基咪唑基、亚氨基二乙酸、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、氨基嘌呤、菲咯啉、联吡啶、三联吡啶、三氮杂环壬烷或四氮杂环十二烷衍生基团的电子对的金属螯合基团。
45.根据权利要求25-32任一项的方法，其中螯合配体包含具有用于配位键的电子对的结构基团，如三苯膦、6-氨基嘌呤、酞菁。
46.根据权利要求45的方法，其中所述配体是5-氨基-1，10-菲咯啉或氨基三联吡啶或三氮杂环壬烷或四氮杂环十二烷或其衍生物。
47.根据权利要求25-46任一项的方法，其中氨基酸侧链的螯合基团选自咪唑、氨基、羟基、羧基、硫羟基、氨三乙酸基、亚氨基二乙酸基、菲咯啉基、吡啶基、联吡啶基、三联吡啶、三氮杂环壬烷、四氮杂环十二烷或嘌呤基团或者这些基团的衍生物，所述螯合基团仍然可以形成根据权利要求25-32任一项的金属络合物。
48.根据权利要求25-47任一项的方法，其中所述方法是完全自动化的，与合成roboter兼容，并且其中在合成循环过程中，液相和固相的分离是通过原本已知的方法优选通过筛分、基于大小的分离、离心或磁性颗粒分离技术来实现的。
49.一种设备，用来根据权利要求25-48任一项的方法进行肽的固相合成。
50.锚定部分，用来根据权利要求25-49任一项的方法将生长中肽链配位锚定至活化固相，优选为由天然和/或非天然、优选非天然氨基酸组成的单或寡聚肽。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103652892A (zh) * 2013-12-03 2014-03-26 江西益佰年药业股份有限公司 乌鸡肽铁螯合物粉制备方法
CN104607245A (zh) * 2015-01-03 2015-05-13 浙江理工大学 一种纤维素基仿生催化纤维及制备方法
CN104624238A (zh) * 2015-01-03 2015-05-20 浙江理工大学 一种聚丙烯腈基仿生催化纤维及制备方法
CN104624237B (zh) * 2015-01-03 2017-06-16 浙江理工大学 具有高催化活性的仿生催化碳纤维材料及制备方法
CN107759799A (zh) * 2017-09-21 2018-03-06 中山大学 一种三联吡啶钌‑赖氨酸聚合物固相合成方法
CN108299565A (zh) * 2018-04-18 2018-07-20 东莞理工学院 一种Wang linker修饰的改良纤维素及其制备方法和应用
CN108359018A (zh) * 2018-04-18 2018-08-03 东莞理工学院 一种Rink Amide linker修饰的改良纤维素及其制备方法和应用
CN108558999A (zh) * 2018-04-18 2018-09-21 东莞理工学院 一种改良纤维素及其制备方法和应用
WO2019200764A1 (zh) * 2018-04-18 2019-10-24 东莞理工学院 改良纤维素及其制备方法和应用
CN111718435A (zh) * 2020-06-17 2020-09-29 西北大学 一种抗菌高分子聚乙烯醇材料及方法和应用
CN113015740A (zh) * 2018-10-05 2021-06-22 德克萨斯大学系统董事会 固相n-末端肽的捕获和释放

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050261475A1 (en) * 2004-02-13 2005-11-24 Harvard Medical School Solid-phase capture-release-tag methods for phosphoproteomic analyses
WO2006056443A2 (en) * 2004-11-24 2006-06-01 Aplagen Gmbh Method for solid-phase peptide synthesis and purification
CA2651070A1 (en) * 2006-05-03 2007-11-15 Mallinckrodt Inc. Composition and method for the release of protected peptides from a resin
GB0610479D0 (en) * 2006-05-26 2006-07-05 Ge Healthcare Bio Sciences Ab A method for generating metal chelating affinity ligands
WO2009008802A1 (en) * 2007-07-09 2009-01-15 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for preparation of a biomolecule adsorbent
EP2183049B2 (en) 2007-08-06 2019-03-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Use of immobilized chelator for purification of recombinant proteins by immobilized metal ion chromatography and method of purifying recombinant proteins
CN103965285B (zh) * 2013-02-06 2016-12-28 北京大学 一种以超顺磁纳米颗粒为固相进行多肽合成及同步构建多肽磁纳米探针的方法
EP3137115B1 (en) * 2014-05-01 2020-10-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method for synthesis of reactive conjugate clusters
WO2018227053A1 (en) * 2017-06-09 2018-12-13 Bristol-Myers Squibb Company Non-chromatographic purification of macrocyclic peptides by a resin catch and release
CN114456192A (zh) * 2018-12-17 2022-05-10 3M创新产权公司 化合物、聚合物、配体官能化基材及用途
CN113993548A (zh) 2019-06-18 2022-01-28 马克思—普朗克科学促进协会公司 标记物和/或载体与靶分子例如带His-标签的蛋白质通过金属配合物试剂的位点特异性动力学惰性缀合
CN114324658B (zh) * 2021-12-30 2023-11-14 福州大学 三聚氰胺的分散固相萃取-高效液相色谱联用检测方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5047513A (en) * 1986-07-10 1991-09-10 Hoffmann-La Roche Inc. Metal chelate resins
CA1304886C (en) * 1986-07-10 1992-07-07 Heinz Dobeli Metal chelate resins
EP0583894A3 (en) * 1992-07-29 1995-09-06 Hybritech Inc Method of immobilizing and orienting molecules by use of metal chelating moieties to facilitate atomic force microscopy of proteins and molecular scale manipulation
WO2002087304A2 (de) * 2001-04-30 2002-11-07 Frohnhofen, Wilfried Il2-peptide; von interleukin 2 abgeleitete peptide und peptid-dimere
CA2493019A1 (en) * 2002-08-06 2004-02-19 Aplagen Gmbh Binding molecules
EP1479688A1 (en) * 2003-05-23 2004-11-24 AplaGen GmbH Solid-phase peptide synthesis using non-covalent attachment of the growing peptide chain

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103652892B (zh) * 2013-12-03 2015-07-08 江西益佰年药业股份有限公司 乌鸡肽铁螯合物粉制备方法
CN103652892A (zh) * 2013-12-03 2014-03-26 江西益佰年药业股份有限公司 乌鸡肽铁螯合物粉制备方法
CN104607245A (zh) * 2015-01-03 2015-05-13 浙江理工大学 一种纤维素基仿生催化纤维及制备方法
CN104624238A (zh) * 2015-01-03 2015-05-20 浙江理工大学 一种聚丙烯腈基仿生催化纤维及制备方法
CN104624237B (zh) * 2015-01-03 2017-06-16 浙江理工大学 具有高催化活性的仿生催化碳纤维材料及制备方法
CN104624238B (zh) * 2015-01-03 2017-06-16 浙江理工大学 一种聚丙烯腈基仿生催化纤维及制备方法
CN104607245B (zh) * 2015-01-03 2017-06-16 浙江理工大学 一种纤维素基仿生催化纤维及制备方法
CN107759799B (zh) * 2017-09-21 2020-10-23 中山大学 一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法
CN107759799A (zh) * 2017-09-21 2018-03-06 中山大学 一种三联吡啶钌‑赖氨酸聚合物固相合成方法
CN108299565A (zh) * 2018-04-18 2018-07-20 东莞理工学院 一种Wang linker修饰的改良纤维素及其制备方法和应用
CN108558999A (zh) * 2018-04-18 2018-09-21 东莞理工学院 一种改良纤维素及其制备方法和应用
CN108359018B (zh) * 2018-04-18 2019-07-30 东莞理工学院 一种Rink Amide linker修饰的改良纤维素及其制备方法和应用
CN108558999B (zh) * 2018-04-18 2019-07-30 东莞理工学院 一种改良纤维素及其制备方法和应用
WO2019200764A1 (zh) * 2018-04-18 2019-10-24 东莞理工学院 改良纤维素及其制备方法和应用
CN108359018A (zh) * 2018-04-18 2018-08-03 东莞理工学院 一种Rink Amide linker修饰的改良纤维素及其制备方法和应用
CN113015740A (zh) * 2018-10-05 2021-06-22 德克萨斯大学系统董事会 固相n-末端肽的捕获和释放
CN111718435A (zh) * 2020-06-17 2020-09-29 西北大学 一种抗菌高分子聚乙烯醇材料及方法和应用
CN111718435B (zh) * 2020-06-17 2021-12-28 西北大学 一种抗菌高分子聚乙烯醇材料及方法和应用

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Publication number Publication date
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DE602004006254T2 (de) 2008-01-10
US20070027303A1 (en) 2007-02-01
CN1795202B (zh) 2010-05-26
AU2004240766A1 (en) 2004-12-02
CA2524693A1 (en) 2004-12-02
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