CN108558999B - 一种改良纤维素及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改良纤维素及其制备方法和应用。一种如式（Ⅰ）所示改良纤维素，所述改良纤维素通过如式（Ⅱ）所示的长链化合物取代如式（Ⅲ）所示的纤维素中的糖羟基得到，其中，n为2~7。本发明通过具有端氨基的长链化合物来对纤维素进行取代改性，从而使得改性后的纤维素具有长链空间和端氨基，可作为固态多肽合成的基质，增加反应活性和反应空间，降低多肽合成的难度，较好的实现固态多肽合成，产率高，成本低。

Description

一种改良纤维素及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于多肽合成基质领域，具体涉及一种改良纤维素及其制备方法和应用。

背景技术

多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。现在对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，可用于研究结构与功能的关系，为多肽生物合成反应机制提供重要信息，建立模型酶以及合成新的多肽药物等。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。

经过不断的改进和完善，固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。如：固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为多肽合成的常规方法。固相合成多肽合成的基本原理是一个重复添加氨基酸的过程，合成从C 端（羧基端）向N端（氨基端）合成：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC 固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC 固相合成法。

但是要合成大量的多肽，如利用多肽链进行化学筛选鉴定多配体蛋白亲和试剂，建立在高分子树脂上标准固相多肽合成技术显得比较慢且昂贵；因为化学筛选所需多肽的质量小，但是数量巨大。近年来，固相多肽合成已在传统的树脂(如Wang树脂和Rinker树脂)的原理上，已经开发了几种不同修饰基质进行多肽合成。其中包括茶叶合成 （tea-bag），数字光刻，针（pin）合成和在纤维素上的SPOT合成。这些改进的技术以非常有效的方式使用标准肽合成化学品和构建模块，并且避免了肽的纯化和分析。与标准固相多肽合成相比，SPOT多肽合成的成本急剧下降。其中纤维素上的SPOT合成易于操作，可以手动执行，也可以使用半自动或全自动机器人，肽的数量和质量可以自由修改，肽 - 配体相互作用的检测操作简单。SPOT方法遵循标准Fmoc化学法，基于纤维素滤片上的固相肽合成。纤维素本身的使用与其他材料相比具有几个优点：它便宜并且能够耐受肽合成过程中使用的有机溶剂和酸。另外，纤维素在水溶液中是稳定的，因为它是无毒的，所以适合筛选生物样品，尽管最佳范围在6至18个氨基酸之间。

因为纤维素是由直线链数百到数万个β（1→4）连接的D-葡萄糖单元组成的多糖，其糖羟基（-OH）以及短链空间，导致直接以其为基质的固相多肽合成条件严格并且产率低。

因此，开发一种改良纤维素来作为固态多肽合成反应的基质使得固相多肽合成反应产率高且易于进行具有重要的研究意义和推广价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有纤维素作为固态多肽合成反应的基质时条件严苛，产率低的缺陷，提供一种改良纤维素。本发明提供的改良纤维素利用端部带氨基的长链取代糖羟基，克服了纤维素中糖羟基及短链空间带来的问题，可降低SPOT固相多肽合成条件，提高产率，极大降低固相多肽合成成本。

本发明的另一目的在于提供上述改良纤维素的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述改良纤维素作为基质在固态多肽合成中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种如式（Ⅰ）所示改良纤维素，所述改良纤维素通过如式（Ⅱ）所示的长链化合物取代如式（Ⅲ）所示的纤维素中的糖羟基得到，

其中，n为2~7。

本发明的发明人尝试通过长链化合物来增大纤维素的短链空间以改善纤维素的性能，长链化合物的功能团和链长的选取是关键因素。经多次研究发现，当端功能团两端都为氨基时，一个氨基端对纤维素的糖羟基进行取代，实现长链的连接；另一个氨基在长链端，提供了和氨基酸的羟基合成的空间，同时也实现同多肽合成的相同反应条件，使自动多肽合成更容易进行；另一方面，选取的长链化合物重复结构的简单程度和重复度对性能的改善也极为重要，当链长太短（如n=1）限制多肽长度；如链长太长（如（n> 7）导致多肽合成产率低。故本发明提供的改良纤维素通过如式（Ⅱ）所示的具有端氨基的长链化合物来对纤维素进行取代改性，从而使得纤维素具有长链空间和端氨基，可作为基质较好的实现固态多肽合成，产率高，条件容易。

优选地，所述纤维素为纸质纤维素。

更为优选地，所述纤维素为滤纸。

优选地，n为3。

本发明提供一种上述改良纤维素的制备方法，所述方法包括如下步骤：

S1：将纤维素和对甲苯磺酰氯的吡啶溶液混合，振荡，洗涤后风干；

S2：加入式（Ⅱ）所示长链化合物，振动至反应完全后，洗涤，风干即得所述改良纤维素。

优选地，S1的对甲苯磺酰氯的吡啶溶液中对甲苯磺酰氯的质量浓度为350~400g/L。

更为优选地，S1的对甲苯磺酰氯的吡啶溶液中甲苯磺酰氯的质量浓度为380g/L。

优选地，S1步骤前还包括对纤维素进行无水处理的步骤。

优选地，S2中洗涤的溶剂为二甲基甲酰胺和二氯甲烷。

上述改良纤维素作为基质在固态多肽合成中的应用也在本发明的保护范围内。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过具有端氨基的长链化合物来对纤维素进行取代改性，从而使得改性后的纤维素具有长链空间和端氨基，可作为固态多肽合成的基质，增加反应活性和反应空间，降低多肽合成的难度，较好的实现固态多肽合成，产率高，成本低。

附图说明

图1是纸质纤维素的糖结构；

图2是实施例1提供的改良的纸质纤维素及其制备过程示意图；

图3是纸质纤维素功能化改良和多肽合成示意图；

图4是（A）合成的多肽序列，（B）Intavis多肽合成仪和改良后的纸质纤维素为基质的合成多肽在紫外光线的吸收和（C）Western Blotting结果。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种改良纤维素，其结构式如下：

。

如图2，本发明提供的改良纤维素通过如下制备方法制备得到：

（1）准备好一定尺寸的实验室过滤纸（Whatman 50，其结构式如图1），放入不锈钢容器中，向不锈钢容器中加入足量的二甲基甲酰胺（DMF）（洗涤步骤），轻轻震荡1小时，然后倒入溶剂（重复3次）；然后加入足量二氯甲烷（ DCM）到不锈钢容器中，轻轻震荡10分钟，然后倒入溶剂（重复3次），风干；

（2）将风干纸质纤维素膜置于不锈钢容器中，向不锈钢容器中加入足量对甲苯磺酰氯的吡啶溶液 （380g甲苯磺酰氯溶于1 L吡啶），室温下轻轻震荡15分钟，向不锈钢容器中加入足量DMF（洗涤步骤），轻轻震荡20 分钟，然后倒入溶剂（重复3次）；加入足量的DCM不锈钢容器中，轻轻摇动10分钟，然后倒入溶剂（重复3次），风干纸质纤维素；

（3）将风干纸质纤维素膜置于不锈钢容器中，加入足量的4,7,10三氧-1,13-十三烷二胺(TTDDA)，在室温下轻轻摇动过夜；向不锈钢容器中加入足量的二甲基甲酰胺（DMF）（洗涤步骤），轻轻震荡1小时，然后倒入溶剂（重复3次）；加入足量二氯甲烷（ DCM）到不锈钢容器中，轻轻震荡10分钟，然后倒入溶剂（重复3次），即得所述改良纤维素。

实施例2

本实施例提供一种改良纤维素，其结构式如下：

。

本发明提供的改良纤维素通过如下制备方法制备得到：

（1）准备好一定尺寸的实验室过滤纸（Whatman 50），放入不锈钢容器中，向不锈钢容器中加入足量的二甲基甲酰胺（DMF）（洗涤步骤），轻轻震荡1小时，然后倒入溶剂（重复3次）；然后加入足量二氯甲烷（ DCM）到不锈钢容器中，轻轻震荡10分钟，然后倒入溶剂（重复3次），风干；

（2）将风干纸质纤维素膜置于不锈钢容器中，向不锈钢容器中加入足量对甲苯磺酰氯的吡啶溶液 （350g甲苯磺酰氯溶于1 L吡啶），室温下轻轻震荡15分钟，向不锈钢容器中加入足量DMF（洗涤步骤），轻轻震荡20 分钟，然后倒入溶剂（重复3次）；加入足量的DCM不锈钢容器中，轻轻摇动10分钟，然后倒入溶剂（重复3次），风干纸质纤维素；

（3）将风干纸质纤维素膜置于不锈钢容器中，加入足量的双（3-氨基丙氧基）乙烷(Bis(3-Aminopropoxy)ethane)，在室温下轻轻摇动过夜；向不锈钢容器中加入足量的二甲基甲酰胺（DMF）（洗涤步骤），轻轻震荡1小时，然后倒入溶剂（重复3次）；加入足量二氯甲烷（ DCM）到不锈钢容器中，轻轻震荡10分钟，然后倒入溶剂（重复3次），即得所述改良纤维素。

实施例3

本实施例提供一种改良纤维素，其结构式如下：

。

本发明提供的改良纤维素通过如下制备方法制备得到：

（1）准备好一定尺寸的实验室过滤纸（Whatman 50），放入不锈钢容器中，向不锈钢容器中加入足量的二甲基甲酰胺（DMF）（洗涤步骤），轻轻震荡1小时，然后倒入溶剂（重复3次）；然后加入足量二氯甲烷（ DCM）到不锈钢容器中，轻轻震荡10分钟，然后倒入溶剂（重复3次），风干；

（2）将风干纸质纤维素膜置于不锈钢容器中，向不锈钢容器中加入足量对甲苯磺酰氯的吡啶溶液 （400gg甲苯磺酰氯溶于1 L吡啶），室温下轻轻震荡15分钟，向不锈钢容器中加入足量DMF（洗涤步骤），轻轻震荡20 分钟，然后倒入溶剂（重复3次）；加入足量的DCM不锈钢容器中，轻轻摇动10分钟，然后倒入溶剂（重复3次），风干纸质纤维素；

（3）将风干纸质纤维素膜置于不锈钢容器中，加入足量的庚（乙二醇）双（3-氨丙基）(Hepta(ethylene glycol) bis(3-aminopropyl)，在室温下轻轻摇动过夜；向不锈钢容器中加入足量的二甲基甲酰胺（DMF）（洗涤步骤），轻轻震荡1小时，然后倒入溶剂（重复3次）；加入足量二氯甲烷（ DCM）到不锈钢容器中，轻轻震荡10分钟，然后倒入溶剂（重复3次），即得所述改良纤维素。

应用例

以实施例1提供的改良纤维素为例，将其作为基质进行固相多肽合成，并对合成结果利用紫外光吸收和蛋白质印迹法（Western Blotting）对其性能进行测试。

利用多肽合成仪从C端到N端进行合成。合成的示意过程如图3所示。合成的多肽结构，如图4A。生物活性肽6重复组氨酸（HHHHHH）为合成和检测的阳性对照。合成的多肽是以酪氨酸-丝氨酸-脯氨酸-苏氨酸-丝氨酸-脯氨酸-丝氨酸（YSPTSPS）和重复结构（YSPTSPSYSPTSPS）以及其中2，5，7位-丝氨酸被磷脂酰丝氨酸（s）取代的序列多肽。图4B为合成的多肽在紫外光的吸收结果，皆为阳性结果；因为合成多肽结构相似，在紫外下均有吸收，并无大的差别。图4C为蛋白质印迹法（Western Blotting）检测结果，因多肽的氨基酸序列的不同，生物活性不同，在Western Blotting检测中，显示出因修饰氨基酸（磷脂酰丝氨酸）位置不同而有明显的差异；甚至在2，5位磷脂酰丝氨酸的多肽（YsPTsPS）和其重复结构（YsPTsPSYsPTsPS）也显示出了差异。从图可知，本实施例提供的改良纤维素可作为固态多肽合成的基质，成功合成了多肽，合成的产率和产量，适合多肽活性扫描。

Claims (9)

1.一种如式（Ⅰ）所示改良纤维素，其特征在于，所述改良纤维素通过如式（Ⅱ）所示的长链化合物取代如式（Ⅲ）所示的纤维素中的6-位糖羟基得到，

其中，n为2~7。

2.根据权利要求1所述改良纤维素，其特征在于，所述纤维素为纸质纤维素。

3.根据权利要求2所述改良纤维素，其特征在于，所述纤维素为滤纸。

4.根据权利要求1所述改良纤维素，其特征在于，n为3。

5.权利要求1~4任一所述改良纤维素的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1：将纤维素和对甲苯磺酰氯的吡啶溶液混合，振荡，洗涤后风干；

S2：加入式（Ⅱ）所示的长链化合物，振动至反应完全后，洗涤，风干即得所述改良纤维素。

6.根据权利要求5所述改良纤维素的制备方法，其特征在于，S1所述对甲苯磺酰氯的吡啶溶液中对甲苯磺酰氯的质量浓度为350~400g/L。

7.根据权利要求6所述改良纤维素的制备方法，其特征在于，S1所述对甲苯磺酰氯的吡啶溶液中对甲苯磺酰氯的质量浓度为380g/L。

8.根据权利要求5所述改良纤维素的制备方法，其特征在于，S1步骤前还包括对纤维素进行无水处理的步骤。

9.权利要求1~4任一所述改良纤维素作为基质在固态多肽合成中的应用。