CN111718435B - 一种抗菌高分子聚乙烯醇材料及方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌高分子聚乙烯醇材料及方法和应用，该抗菌高分子聚乙烯醇材料以硅片为基材，在硅片上制备PVA‑TP‑CA聚合物涂层，且该聚合物涂层进一步引入Co2+离子，其具有式(1)所示结构式。本发明的材料形成了Co2+离子‑三联吡啶络合物，三联吡啶基团为生物活性钴离子的有效锚定提供了平台，很好地控制引入的Co2+离子的浓度，避免了高浓度金属离子诱导的细胞毒性反应和蛋白质吸附，而且能保证Co2+离子稳定固定在材料表面，避免被释放到细胞培养液等液体基质中。Co2+离子能提供材料表面长效的抗菌能力，并提高聚合物涂层表面的机械强度，从而具有促进骨髓间充质干细胞定向分化为骨细胞的物理刺激作用。
Figure DDA0002544366060000011

Description

一种抗菌高分子聚乙烯醇材料及方法和应用
技术领域
本发明涉及一种高分子聚乙烯醇材料，具体涉及一种抗菌高分子聚乙烯醇材料及方法和应用。
背景技术
在现代医学治疗中，对可植入装置的开发和生产的迅速增加揭示了对这些具有额外化学和物理性质的材料的迫切需求，将植入物引入病变部位建立了表面/生物界面，材料表面的物理化学特性必然会直接影响到组织的愈合，而机体环境也会作用于材料表面，对材料产生影响。
因此，在植入材料上引入功能成分将赋予这些材料，不仅仅作为简单的支架材料，还可以进一步实现伤口修复、受损组织重建、骨修复等生物功能，在组织工程中实现更广阔的应用前景。此外，可植入表面上的细菌污染在现阶段的临床应用中已成为严重的植入后问题，其可进一步发展成具有高发病率和死亡率的创伤学和骨科并发症。通过在表面修饰抗菌剂来开发具有抗菌活性的可植入材料已经获得了许多关注，这可以降低植入体中心感染的风险并防止术后感染。
近年来，随着纳米技术的发展，过渡金属离子被广泛用于生物医学目的。钴离子因其显著的生物活性而被报道为有吸引力的生物医学候选物。除了其优异的抗菌能力外，大量研究表明它也是参与生物分子结构和功能、代谢和细胞过程的必需微量元素。特别是，已经发现人间充质干细胞的增殖和矿化可以用钴离子来调节。此外，它还能增强成骨细胞相关基因的表达，从而进一步刺激骨形成。
鉴于钴离子具有显著的抗菌能力和生物功能，将钴离子引入到具有抗菌和组织修复能力的种植体表面是一种很有前途的策略。然而，高浓度金属离子诱导的细胞毒性反应和蛋白质吸附已被揭示为体内发生的主要问题。因此，开发一种在生物医学应用中保持金属离子的优点并克服其缺点的方法将是非常重要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗菌高分子聚乙烯醇材料及方法和应用，解决了现有植入材料存在术后感染的问题，具有优异的抗菌活性和良好的生物相容性，同时，聚合物涂层表面的机械强度具有促进骨髓间充质干细胞定向分化为骨细胞的物理刺激作用，能够作为骨修复植入材料。
为了达到上述目的，本发明提供了一种TP/CA基团修饰的聚乙烯醇，该聚乙烯醇具有如式(1)所示的结构式：
Figure BDA0002544366040000021
其中，p：(n-m)：(m-p)为6：90：4。通过控制该结构中三联吡啶基团的引入量，若引入量过大容易引起生物毒性，因此控制在4％。
优选地，n为135。
本发明还提供了一种所述的TP/CA基团修饰的聚乙烯醇的制备方法，该方法的合成路线为：
Figure BDA0002544366040000022
将具有如式(2)所示结构的PVA-TP-COOH聚合物与多巴胺盐酸盐进行酰胺化反应，得到如式(1)所示的结构的TP/CA基团修饰的聚乙烯醇。
优选地，所述PVA-TP-COOH聚合物与多巴胺盐酸盐在二甲基甲酰胺和MES缓冲溶液中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐为催化剂，进行酰胺化反应。
优选地，所述PVA-TP-COOH聚合物的合成路线为：
Figure BDA0002544366040000031
将具有如式(3)所示结构的PVA-COOH聚合物与具有如式(4)所示结构的氨基衍生化的三联吡啶进行酰胺化反应，得到如式(2)所示的结构的PVA-TP-COOH聚合物；所述PVA-COOH聚合物与氨基衍生化的三联吡啶在二甲亚砜中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐为催化剂，4-二甲氨基吡啶为碱，进行酰胺化反应；其中，(n-m)：m为90：10。
优选地，所述PVA-COOH聚合物的合成路线为：
Figure BDA0002544366040000032
将聚乙烯醇与丁二酸酐在二甲亚砜中加入三乙胺反应，得到具有如式(3)所示结构的PVA-COOH聚合物。
本发明还提供了一种抗菌高分子聚乙烯醇材料，该材料以硅片为基材，在硅片上含有具有式(1)所示的结构式的PVA-TP-CA聚合物的涂层，在该涂层上PVA-TP-CA聚合物中的三联吡啶配位有Co2+离子；其中，所述涂层的厚度为12～18nm。
优选地，所述基材的厚度为0.5mm。
本发明还提供了一种所述的抗菌高分子聚乙烯醇材料的制备方法，该方法包含：将硅片置于具有式(1)所示结构式的PVA-TP-CA聚合物溶液中，使硅片表面附着PVA-TP-CA聚合物，取出干燥；将含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片置于钴盐水溶液中，静止，取出干燥，得到抗菌高分子聚乙烯醇材料。
优选地，所述PVA-TP-CA聚合物溶液为PVA-TP-CA聚合物的甲醇溶液；在制备所述含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片时，在所述PVA-TP-CA聚合物溶液中加入pH8.4的MOPs缓冲液。
优选地，所述PVA-TP-CA聚合物的甲醇溶液的浓度为3mg/mL。制备浓度过高，会导致涂层厚度过厚。
优选地，所述PVA-TP-CA聚合物溶液中加入pH8.4的MOPs缓冲液后，混合液静止4h，得到含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片。时间过长，也会导致涂层厚度过厚。
本发明还提供了一种所述的抗菌高分子聚乙烯醇材料在作为骨修复植入材料的应用。
本发明的抗菌高分子聚乙烯醇材料及方法和应用，解决了现有植入材料存在术后感染的问题，具有以下优点：
本发明的抗菌高分子聚乙烯醇材料，通过形成Co2+离子-三联吡啶络合物，一方面可以保证Co2+离子被稳定固定与聚乙烯醇材料表面，避免被释放到细胞培养液等液体基质中，另一方面，PVA-TP-CA聚合物中的三联吡啶基团为生物活性钴离子的有效锚定提供了平台，能够很好地控制引入的Co2+离子的浓度，避免了高浓度金属离子诱导的细胞毒性反应和蛋白质吸附。引入的Co2+离子，一方面可以维持材料表面长效的抗菌能力，另一方面引起了聚合物涂层表面机械强度的变化，提供了促进成骨干细胞定向分化为骨细胞的物理刺激作用。
本发明的抗菌高分子聚乙烯醇材料，Co2+离子改性后的涂层表面具有优异的抗菌活性和良好的生物相容性，对革兰氏阴性菌具有持久优异的抗菌活性，而且钴-三联吡啶配位作用引起了聚合物涂层表面机械强度的变化，进而对干细胞的粘附增殖显示出生物影响，促进骨髓间充质干细胞的粘附、扩散、增殖和成骨分化。
附图说明
图1为本发明的抗菌高分子聚乙烯醇材料的合成路线及其抗菌和细胞增殖分化的示意图。
图2为本发明实施例2制备的材料和含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片的扫描电镜图像和X射线光电子能谱。
图3为本发明实施例2制备的材料及其它样品对大肠杆菌(DH5α)的抗菌能力结果。
图4为本发明实施例2制备的材料及其它样品表面上骨髓间充质干细胞的形态及粘附结果。
图5为本发明不同金属离子涂层上细胞粘附生长4h后的形态图。
图6为本发明在不同表面培养7天后的骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶染色图像及统计结果。
图7为本发明在实施例2制备的材料及其它样品上骨髓间充质干细胞培养1天或3天后细胞的代谢能力结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种TP/CA基团修饰的聚乙烯醇的制备方法，其合成路线为：
Figure BDA0002544366040000061
具体步骤为：
(S1)将聚乙烯醇(PVA，250mg；n＝135)与丁二酸酐(35mg)在二甲亚砜(DMSO,30mL)中加入三乙胺(TEA,0.1mL)反应，得到含有10％COOH的PVA-COOH聚合物，实现将PVA中10％的羟基变成羧基；
(S2)将PVA-COOH聚合物(500mg)与氨基衍生化的三联吡啶(TP，139mg)在DMSO(30mL)中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，87mg)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，56mg)，进行酰胺化反应，得到含有4％三联吡啶的PVA-TP-COOH聚合物，实现将4％的羧基通过胺偶联反应与TP共轭；
(S3)将PVA-TP-COOH聚合物(299mg)与多巴胺盐酸盐(780mg)在二甲基甲酰胺/MES缓冲溶液中(DMF/MES Buffer solution，MES为2-(N-吗啉)乙磺酸)加入EDC·HCl(783mg)，进行酰胺化反应，得到含有4％三联吡啶且含有6％多巴胺的终产物PVA-TP-CA聚合物，即TP/CA基团修饰的聚乙烯醇，实现将6％的羧基通过胺偶联反应与多巴胺共轭。
本发明制备的PVA-TP-CA的氢谱核磁表征数据为：1H NMR(400MHz,CD3OD,293K)δ(ppm):8.64–8.58(4H),7.48–7.39(4H),7.28–7.17(12H),6.92–6.85(8H),6.74–6.70(4H),1.77–1.54(135H).
实施例2
一种抗菌高分子聚乙烯醇材料的制备方法，如图1所示，为本发明的抗菌高分子聚乙烯醇材料的合成路线及其对抗菌和细胞增殖分化的示意图，该方法包含：
(S10)将实施例1制备的PVA-TP-CA聚合物溶解于甲醇中配制3mg/mL的PVA-TP-CA聚合物溶液；
(S20)将6片1cm*1cm硅片(silicon wafer)置于两个小培养皿中，在培养皿中分别加入1mL步骤(S10)制备的PVA-TP-CA聚合物溶液，再加入2mL pH8.4的MOPs(3-吗啉丙磺酸)缓冲液，混合液静止4h；
(S30)取出硅片，用双蒸水洗涤三次，用氮气吹干，制备得到含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片，在硅片上形成了致密均匀的PVA-TP-CA聚合物涂层；
(S40)将步骤(S30)制备的含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片置于小培养皿中，加入1mL 1mg/mL的CoCl2水溶液，静止4h；
(S50)取出硅片，用双蒸水洗涤三次，用氮气吹干，制备得到含有Co2+离子和PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片，即抗菌高分子聚乙烯醇材料。
本发明的PVA-TP-CA聚合物中的邻苯二酚基团在有机和无机表面有强粘附活性，能够被有效地构建在硅片表面。PVA-TP-CA聚合物中的三联吡啶基团和Co2+离子(Co ions)之间具有强配位相互作用，通过形成Co2+离子-三联吡啶络合物，Co2+离子可以稳定在PVA-TP-CA聚合物涂层上，可以避免Co2+离子被释放。而且，PVA-TP-CA聚合物中的三联吡啶基团为生物活性钴离子的有效锚定提供了平台，能够很好地控制引入的Co2+离子的浓度，一方面避免了高浓度金属离子诱导的细胞毒性反应和蛋白质吸附，另一方面保持对骨形成的刺激作用。Co2+离子改性后的涂层表面具有良好的生物相容性和对革兰氏阴性菌持久优异的抗菌活性。钴-三联吡啶配位进一步改变了聚合物涂层表面的机械强度，有效地促进了骨髓间充质干细胞在涂层表面的粘附、扩散、增殖和成骨分化。如图1所示，在合成的涂层表面上，人骨髓间充质干细胞(hBMSCs，Human Bone Mesenchymal Stem Cells)能够增殖分化为成骨细胞(osteoblast)，并且合成的涂层表面可以抑制E.coli细菌的粘附和增殖。
如图2所示，为本发明实施例2制备的材料和含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片的扫描电镜图像和X射线光电子能谱(XPS)，a和b为含PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片，c和d为PVA-TP-CA/Co材料(实施例2制备的材料)，d中的插图是Co2p的放大的XPS光谱。从图中可以看出，图2的b中显示的XPS结果清楚地证明了在制备的材料表面中存在碳、氮和氧，进一步证实了在硅片上形成了致密均匀的PVA-TP-CA聚合物涂层。图2中c的致密性略有提高，图2中a和c显示材料表面的接触角从50°降至30°。图2中d显示材料表面中存在钴离子，在光谱中观察到对应于钴(ⅱ)的780.0电子伏的峰，这是在涂层中引入钴离子的直接证据，而且图2中d中Co2p的放大的XPS光谱显示钴离子的原子百分比为0.1％。
试验例1抗菌活性
制备大肠杆菌(细菌型号：DH5α)在磷酸缓冲液中的悬浮液(105CFU/mL)，取0.5mL上述菌液置于实施例2制备的材料(PVA-TP-CA/Co)的48孔板内。未修饰的硅片(Silicon)和只含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片(PVA-TP-CA)分别作为对照组进行同样的操作。
上述含有不同硅片样品和菌液的48孔板均放于37℃培养箱中培养24小时后，用平板计数法记录相应的细菌数量。
如图3所示，为本发明实施例2制备的材料及其它样品对大肠杆菌(DH5α)的抗菌能力结果(数据以平均标准差表示，n＝3，与空白对照组(Blank)相比，同期的统计显著性差异为**p<0.01)，a为单次试验结果，b为重复抗菌试验结果，从图3中a可以看出，本发明实施例2制备的抗菌高分子聚乙烯醇材料显示出良好的抗菌活性，对革兰氏阴性菌大肠杆菌(DH5α)的抗菌率超过99.99％，而裸硅片(Silicon)和不含Co离子的PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片(PVA-TP-CA)未显示抗菌行为。而且，从图3中b可以看出，聚合物涂层(PVA-TP-CA/Co)的长效抗菌性能，即使在三次重复的抗菌循环后，本发明实施例2制备的抗菌高分子聚乙烯醇材料的抗菌活性仍可保持，这是由于Co离子与三联吡啶之间的强结合亲和力，使得所引入的Co离子在抗菌试验期间是稳定的，可作为耐用的抗菌材料。这些结果表明，三联吡啶与钴(ⅱ)离子之间的配位作用足够稳定，能够在近似生理条件下保持钴(ⅱ)的抗菌性能等，这对于在体外和体内显示其生物活性是至关重要的。
试验例2细胞粘附
1、Co离子对涂层在细胞粘附及生长的影响
制备人骨髓间充质干细胞在细胞培养基(含有10％牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中的悬浮液，随后种植于放有实施例2制备的材料(PVA-TP-CA/Co)的48孔板内(细胞密度：104每个孔)。未修饰的硅片(Silicon)和只含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片(PVA-TP-CA)分别作为对照组进行同样的操作。
上述含有不同硅片样品和细胞的48孔板均放于37℃培养箱中培养4h后，取出材料后对粘附在硅片上的细胞进行染色，细胞肌动蛋白纤维用阴茎海绵体素(红色)染色，细胞核用DAPI(蓝色)染色，观察骨髓间充质干细胞的形态。
如图4所示，为本发明实施例2制备的材料及其它样品表面上骨髓间充质干细胞的形态及粘附结果(误差条对应于三个不同实验，n＝3，的平均标准偏差；与空白对照组相比，同期的统计显著性差异用**p<0.01表示)，其中，a为裸硅片，b为实施例2制备的材料，c为只含PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片，d为细胞在三种不同材料上的细胞铺展面积结果，e为细胞在三种不同材料上的细胞铺展的纵横比。结果显示，与只含PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片和裸硅片相比，实施例2制备的材料上的细胞具有更致密肌动蛋白纤维的伸长细胞和更稳定的粘附。此外，实施例2制备的材料上的细胞显示出最大的铺展面积、纵横比和焦点粘附面积，表明钴离子在调节涂层对骨髓间充质干细胞粘附中起着重要作用。
2、不同离子对涂层在细胞粘附方面的影响
实验操作同上述Co离子对涂层在细胞粘附及生长的影响，只是对照组为只含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片(PVA-TP-CA)和含Fe2+离子和PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片(PVA-TP-CA/Fe)。
如图5所示，为本发明金属离子对涂层上的细胞形态图，Fe2+也可以与PVA-TP-CA聚合物中的三联吡啶基团螯合形成非常稳定的涂层，从细胞实验数据可以看出，细胞在PVA-TP-CA/Fe涂层和PVA-TP-CA/Co涂层上生长情况类似。与无金属涂层相比，Fe2+处理的PVA-TP-CA/表面也能促进细胞粘附，这些数据表明与Co离子本身对细胞生长的活性作用相比，由Co离子与三联吡啶络合进而导致的涂层表面的机械强度的变化，对细胞粘附生长化学影响更大，在较硬的PVA-TP-CA/Co涂层上的细胞比在较软的PVA-TP-CA表面上的细胞表现出更高的细胞张力。
如图7所示，为本发明在实施例2制备的材料及其它样品上骨髓间充质干细胞培养1天或3天的代谢能力结果，可以看出，骨髓间充质干细胞在材料上贴壁生长1天和3天后在492nm处的吸光值逐渐增长，且从吸光值上可以得出材料具有良好的生物相容性。
试验例3碱性磷酸酶活性
制备人骨髓间充质干细胞在成骨诱导分化培养基(StemProTM)中的悬浮液，随后种植于放有实施例2制备的材料(PVA-TP-CA/Co)的48孔板内(细胞密度：8000个每个孔)。未修饰的硅片(Silicon)和只含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片(PVA-TP-CA)分别作为对照组进行同样的操作。
将上述含有不同硅片样品和细胞的48孔板均放于37℃培养箱中培养7天和14天，其中三天更换一次新鲜培养基。取出材料，进行碱性磷酸酶染色。
如图6所示，为本发明在不同表面培养7天和14天后的骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶染色图像及统计结果，其中，a为裸硅片，b为只含PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片，c为实施例2制备的材料，d为7天后碱性磷酸酶活性，e为14天后碱性磷酸酶活性。与裸硅片和只含PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片表面相比，含PVA-TP-CA/Co涂层的硅片表面的碱性磷酸酶的相对活性更高。在第1周培养后，PVA-TP-CA聚合物涂层和PVA-TP-CA/Co涂层表面的碱性磷酸酶活性值没有统计学差异。但是在培养2周后，PVA-TP-CA聚合物涂层和PVA-TP-CA/Co涂层表面表面有显著性差异，PVA-TP-CA/Co涂层表面的碱性磷酸酶活性显著高于PVA-TP-CA聚合物涂层。
综上所述，本发明的PVA-TP-CA/Co涂层可以为初始细胞粘附、扩散、增殖和成骨分化提供平台，以促进体外新骨形成。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (9)

1.一种抗菌高分子聚乙烯醇材料，其特征在于，该材料以硅片为基材，在硅片上含有具有如式(1)所示的结构式的PVA-TP-CA聚合物的涂层，在该涂层上PVA-TP-CA聚合物中的三联吡啶配位有Co2+离子；
其中，所述涂层的厚度为12～18nm；
Figure FDA0003332507830000011
其中，p：(n-m)：(m-p)为6：90：4。
2.根据权利要求1所述的抗菌高分子聚乙烯醇材料，其特征在于，n为135。
3.一种如权利要求1中所述的抗菌高分子聚乙烯醇材料的制备方法，其特征在于，该方法包含：将硅片置于具有如权利要求1中式(1)所示结构式的PVA-TP-CA聚合物溶液中，使硅片表面附着PVA-TP-CA聚合物，取出干燥；将含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片置于钴盐水溶液中，静止，取出干燥，得到抗菌高分子聚乙烯醇材料。
4.根据权利要求3所述的抗菌高分子聚乙烯醇材料的制备方法，其特征在于，所述PVA-TP-CA聚合物溶液为PVA-TP-CA聚合物的甲醇溶液；在制备所述含有PVA-TP-CA聚合物涂层的硅片时，在所述PVA-TP-CA聚合物溶液中加入pH 8.4的MOPs缓冲液。
5.根据权利要求3所述的抗菌高分子聚乙烯醇材料的制备方法，其特征在于，所述PVA-TP-CA聚合物的合成路线为：
Figure FDA0003332507830000021
将具有如式(2)所示结构的PVA-TP-COOH聚合物与多巴胺盐酸盐进行酰胺化反应，得到如式(1)所示的结构的PVA-TP-CA聚合物。
6.根据权利要求5所述的抗菌高分子聚乙烯醇材料的制备方法，其特征在于，所述PVA-TP-COOH聚合物与多巴胺盐酸盐在二甲基甲酰胺和MES缓冲溶液中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐为催化剂，进行酰胺化反应。
7.根据权利要求5所述的抗菌高分子聚乙烯醇材料的制备方法，其特征在于，所述PVA-TP-COOH聚合物的合成路线为：
Figure FDA0003332507830000022
将具有如式(3)所示结构的PVA-COOH聚合物与具有如式(4)所示结构的氨基衍生化的三联吡啶进行酰胺化反应，得到如式(2)所示的结构的PVA-TP-COOH聚合物；
所述PVA-COOH聚合物与氨基衍生化的三联吡啶在二甲亚砜中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐为催化剂，4-二甲氨基吡啶为碱，进行酰胺化反应；
其中，(n-m)：m为90：10。
8.根据权利要求7所述的抗菌高分子聚乙烯醇材料的制备方法，其特征在于，所述PVA-COOH聚合物的合成路线为：
Figure FDA0003332507830000031
将聚乙烯醇与丁二酸酐在二甲亚砜中加入三乙胺反应，得到具有如式(3)所示结构的PVA-COOH聚合物。
9.一种如权利要求1或2所述的抗菌高分子聚乙烯醇材料在作为骨修复植入材料的应用。
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