CN114748692B - 一种基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体及其制备方法与应用。本发明方法包括如下步骤：(1)将钛基植入体置于NaOH溶液中浸泡处理；(2)将介孔二氧化硅分散于无水乙醇中，并与活性多肽溶液均匀混合，进行反应；(3)向步骤(2)所得溶液中加入硅烷偶联剂；(4)将步骤(1)所得到的样品浸没在步骤(3)所得到的样品中，进行反应，得到表面功能化钛基植入体。本发明可以通过负载不同功能的活性多肽赋予钛基植入体表面生物活性，使其具有抗细菌感染、促进细胞粘附或促进骨整合等功能。所得材料具有良好的稳定性和生物相容性，可以长期缓慢释放活性多肽，从而使钛基植入体表面长期保持生物活性。

Description

一种基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体及其制备方 法与应用
技术领域
本发明属于生物材料表面改性技术领域，具体涉及一种基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，由于全球人口老龄化现象加剧和意外事故频发，人们对生活质量和健康的需求日益提高等原因，骨缺损已成为困扰人们的一大疾病，骨组织具有强大的再生和自愈合能力，但大段骨缺损的治疗仍是巨大的挑战，因此临床对骨科植入物的需求不断增加。钛基材料由于其良好的机械性能、生物相容性、抗腐蚀性能、与人体骨相近的弹性模量，自20世纪中叶以来已广泛用于骨科植入材料。然而，钛基材料因表面缺乏生物活性，面临细菌感染、血管生成不良和骨整合不足等问题，最终导致植入体失效。植入体失效具有严重后果，包括手术失败、残疾、败血症甚至患者死亡。因此亟需发明植入体表面改性的方法，使植入体表面具有生物活性。
目前临床上的常用的植入体表面改性方法是使用活性多肽。多肽因其简单的设计和优异的性能已被广泛研究和应用。例如，HHC36多肽具有广谱抗菌性和低耐药性，常用于抗菌涂层的构建；YGFGG多肽能够促进干细胞向成骨细胞分化，从而有利于骨整合；RGD多肽能够促进细胞在材料表面的粘附，有助于植入体与周围组织的整合。
传统的研究通过物理吸附或化学接枝将活性多肽构建于植入体表面，但活性多肽易被酶解，且较高浓度下具有细胞毒性。简单的物理吸附可能会导致初期多肽的爆发式释放，从而产生毒性，反而不利于骨组织的愈合；化学接枝多肽会使多肽直接暴露于体内复杂的生理环境中，易导致多肽的快速失活。通过将活性多肽加载到药物载体中或许可以实现活性多肽的局部递送和缓释，从而解决上述问题。但目前的研究很少能在钛基植入体表面构建有效的多肽缓释系统。
近年来，纳米药物载体发展迅速，其中，介孔二氧化硅纳米粒子(MSN)正成为最有效的药物递送平台之一，因为与其他纳米载体相比，它们具有高稳定性、尺寸可调、比表面积大、更容易制备修饰等优点，并且具有良好的生物相容性。由于对MSN的强吸附作用，硅烷偶联剂常被用于MSN的修饰。此外，硅烷能够与无机材料表面的羟基发生反应，常用于无机材料表面改性。在有水条件下，硅烷会水解生成Si-O网络，缩合形成不规则的硅烷多分子修饰层。
发明内容
为解决相关问题，本发明的首要目的在于提供一种基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体。该材料具有良好的生物相容性，可以负载不同的活性多肽并缓慢长期释放，从而解决植入体易发生细菌感染、骨整合不足等问题。
本发明的再一目的在于提供上述基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将钛基植入体置于NaOH溶液中浸泡处理；
(2)将介孔二氧化硅分散于无水乙醇中，并与活性多肽溶液均匀混合，进行反应；其中，所述介孔二氧化硅与活性多肽的质量比为1:1～1:10，药物体系的浓度为1～1000μg/mL；所述的药物体系是指负载多肽后的介孔二氧化硅；
(3)向步骤(2)所得溶液中加入硅烷偶联剂；其中，所述硅烷偶联剂的浓度为0.1～10mg/mL，所述硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷、γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷或γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷；
(4)将步骤(1)所得到的样品浸没在步骤(3)所得到的样品中，进行反应，得到表面功能化钛基植入体。
进一步地，所述步骤(1)中，NaOH溶液的浓度为4～8mol/L；优选为5mol/L。
进一步地，所述步骤(1)中，浸泡处理的条件为：温度50～80℃、时间20～30h；优选为温度60℃、时间24h。
进一步地，所述步骤(1)中，钛基植入体在使用前，先依次使用无水乙醇和去离子水分别超声清洗10～20分钟，用氮气吹干。
进一步地，所述步骤(2)中，反应的条件为：温度20～30℃(室温)，时间1～48h。
进一步地，所述步骤(2)中，活性多肽包括但不限于抗菌多肽，比如HHC36和Magainin I，具有促神经修复作用的多肽，比如YGFGG，以及具有促进细胞粘附作用的多肽，比如RGD。
进一步地，所述步骤(2)中，介孔二氧化硅的孔体积为0.5～2cm3/g，平均孔径为5～15nm；优选通过凝胶-溶胶法合成；更优选参考文献“Bioinspired Diselenide-BridgedMesoporous Silica Nanoparticles for Dual-Responsive Protein Delivery，DOI:10.1002/adma.201801198”记载的方法合成。
进一步地，所述步骤(2)中，介孔二氧化硅与活性多肽的质量比为1:1～1:5，药物体系的浓度为20～1000μg/mL。
进一步地，所述步骤(4)中，反应的条件为：温度20～80℃，时间1～48h。
一种基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体，通过上述制备方法制备得到。
上述基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体在制备生物医用材料中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明制备的表面修饰有基于介孔二氧化硅的活性多肽缓释系统的钛基植入体表面，可以通过负载不同功能的活性多肽赋予钛基植入体表面生物活性，使其具有抗细菌感染、促进细胞粘附或促进骨整合等功能；
(2)本发明制备的表面修饰有基于介孔二氧化硅的活性多肽缓释系统的钛基植入体表面，具有良好的稳定性，药物体系可以在表面稳定存在；
(3)本发明制备的表面修饰有基于介孔二氧化硅的活性多肽缓释系统的钛基植入体表面，可以长期缓慢释放活性多肽，从而使钛基植入体表面长期保持生物活性；
(4)本发明制备的表面修饰有基于介孔二氧化硅的活性多肽缓释系统的钛基植入体表面，具有优异的生物相容性，在一定的药物负载范围内对细胞的影响可以忽略不计。
附图说明
图1为本发明方法所用硅烷偶联剂的结构式图；其中，A为γ-氨丙基三乙氧基硅烷、B为γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，C为γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷。
图2为本发明功能化钛基植入体表面制备流程示意图。
图3为在功能化钛基植入体表面培养细胞或细菌的示意图。
图4为实施例1制备的功能化钛基植入体表面扫描电镜图。
图5为四种细菌在实施例2制备的功能化钛基植入体表面培养的存活率分析结果图。
图6为四种细菌在实施例3制备的功能化钛基植入体表面培养的存活率分析结果图。
图7为四种细菌在实施例4制备的功能化钛基植入体表面培养的存活率分析结果图。
图8为实施例4制备的功能化钛基植入体表面的体内抗菌性能检测结果图。
图9为实施例5制备的功能化钛基植入体表面的体外促成骨性能检测结果图。
图10为实施例6制备的功能化钛基植入体表面的体外促成骨性能检测结果图。
图11为实施例7制备的功能化钛基植入体表面的体外促成骨性能检测结果图。
图12为实施例8制备的功能化钛基植入体表面的生物相容性检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)依次使用无水乙醇和去离子水超声清洗钛基植入体15分钟，用氮气吹干，后浸没于5M NaOH溶液中，在60℃下处理24小时；
(2)利用凝胶-溶胶法合成一种介孔二氧化硅微球MSN 1，比表面积为523.3m2/g，孔体积为1.11cm3/g，平均孔径为8.5nm；
(3)将介孔二氧化硅分散于无水乙醇中，并与抗菌多肽HHC36溶液均匀混合，介孔二氧化硅与多肽的质量比为1:1，反应条件为室温，反应时长为2小时，药物体系的浓度为20μg/mL；
(4)向上述溶液中加入γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，浓度为0.1mg/mL；
(5)将步骤(1)所得到的样品浸没在步骤(4)所得到的样品中，进行反应，反应温度为20℃，反应时长为4小时；
(6)将步骤(5)所得到的样品进行清洗，得到功能化钛基植入体材料。
(7)为表征样品表面的稳定性，将样品浸没于PBS中，置于37℃摇床，在第1、7、14天后分别将样品取出，通过扫描电镜观察其表面形貌；
结果如图4所示，样品在PBS中浸泡14天后，MSN的形貌较第1天无明显差异，表明药物体系可以在表面稳定存在。
实施例2
(1)依次使用无水乙醇和去离子水超声清洗钛基植入体15分钟，用氮气吹干，后浸没于5M NaOH溶液中，在60℃下处理24小时；
(2)利用凝胶-溶胶法合成一种介孔二氧化硅微球MSN 1；
(3)将介孔二氧化硅分散于无水乙醇中，并与抗菌多肽HHC36溶液均匀混合，介孔二氧化硅与多肽的质量比为1:1，反应条件为室温，反应时长为2小时，药物体系的浓度为20μg/mL；
(4)向上述溶液中加入γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，浓度为0.1mg/mL；
(5)将步骤(1)所得到的样品浸没在步骤(4)所得到的样品中，进行反应，反应温度为20℃，反应时长为4小时；
(6)将步骤(5)所得到的样品进行清洗，得到功能化钛基植入体材料。
(7)在样品表面孵育细菌，利用琼脂板计数法检测样品的体外抗菌率，具体实验步骤如下：
首先，分别将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌混于营养肉汤中培养，用PBS稀释至1×106CFU/mL浓度的细菌悬液；
其次，将步骤(6)所得到的材料置于24孔板中，向材料表面滴加10μL细菌悬液，并置于37℃霉菌培养箱中孵育2小时；
再次，向样品孔中加入PBS稀释成1×104CFU/mL浓度的细菌悬液，取10μL涂布于琼脂板上，放置于37℃霉菌培养箱中培养16小时；
最后，数取琼脂板上的菌落，计算细菌存活率；
结果如图5所示，所构建的功能化表面的四种细菌的存活率分别为纯钛表面的40.96％、36.72％、28.53％和68.65％。
实施例3
(1)依次使用无水乙醇和去离子水超声清洗钛基植入体15分钟，用氮气吹干，后浸没于5M NaOH溶液中，在60℃下处理24小时；
(2)利用凝胶-溶胶法合成介孔二氧化硅微球MSN 2，比表面积为450.6m2/g，孔体积为0.65cm3/g，平均孔径为7.6nm；
(3)将介孔二氧化硅分散于无水乙醇中，并与抗菌肽MagaininⅠ溶液均匀混合，介孔二氧化硅与多肽的质量比为1:1，反应条件为室温，反应时长为4小时，药物体系的浓度为50μg/mL；
(4)向上述溶液中加入γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，浓度为0.5mg/mL；
(5)将步骤(1)所得到的样品浸没在步骤(4)所得到的样品中，进行反应，反应温度为60℃，反应时长为8小时；
(6)将步骤(5)所得到的样品进行清洗，得到功能化钛基植入体材料。
(7)体外结果如图6所示，所构建的功能化表面的四种细菌的存活率分别为纯钛表面的21.19％、19.91％、15.76％和46.86％。
实施例4
(1)依次使用无水乙醇和去离子水超声清洗钛基植入体15分钟，用氮气吹干，后浸没于5M NaOH溶液中，在60℃下处理24小时；
(2)利用凝胶-溶胶法合成介孔二氧化硅微球MSN 3，比表面积为641.3m2/g，孔体积为1.81cm3/g，平均孔径为11.3nm；
(3)将介孔二氧化硅分散于无水乙醇中，并与抗菌多肽HHC36溶液均匀混合，介孔二氧化硅与多肽的质量比为1:5，反应条件为室温，反应时长为48小时，药物体系的浓度为1000μg/mL；
(4)向上述溶液中加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷，浓度为10mg/mL；
(5)将步骤(1)所得到的样品浸没在步骤(4)所得到的样品中，进行反应，反应温度为50℃，反应时长为24小时；
(6)将步骤(5)所得到的样品进行清洗，得到功能化钛基植入体材料。
(7)体外抗菌结果如图7所示，功能化表面的四种细菌的存活率分别为纯钛表面的1.98％、3.58％、2.99％和4.29％，使用以上条件构建的功能化植入体表面具有最佳的体外抗菌性能。
(8)选用新西兰大白兔作为体内实验动物，表征样品的体内抗菌性，具体实验步骤如下：
首先，在新西兰大白兔的股骨上钻孔并注射金黄色葡萄球菌；
其次，植入步骤(6)中所得到的材料，将切开的组织逐层缝合；
最后，植入7天后取出植入样品，利用琼脂板计数法检测其抗菌性能。
结果如图8所示，样品的体内抗菌率为纯钛的98.71％。这表明构建的功能化植入体表面具有优异的体内抗菌性能。
实施例5
(1)依次使用无水乙醇和去离子水超声清洗钛基植入体15分钟，用氮气吹干，后浸没于5M NaOH溶液中，在60℃下处理24小时；
(2)利用凝胶-溶胶法合成介孔二氧化硅微球MSN 3；
(3)将介孔二氧化硅分散于无水乙醇中，并与促成骨多肽YGFGG溶液均匀混合，介孔二氧化硅与多肽的质量比为1:2，反应条件为室温，反应时长为24小时，药物体系的浓度为20μg/mL；
(4)向上述溶液中加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷，浓度为1mg/mL；
(5)将步骤(1)所得到的样品浸没在步骤(4)所得到的样品中，进行反应，反应温度为50℃，反应时长为12小时；
(6)将步骤(5)所得到的样品进行清洗，得到功能化钛基植入体材料。
(7)在样品表面培养小鼠骨髓间充质干细胞，利用ALP活性检测试剂盒表征样品的体外促成骨性能，具体实验步骤如下：
首先，将小鼠骨髓间充质干细胞混于完全培养基中，配置1×104/mL细胞浓度的细胞悬液；
其次，将步骤(6)所得到的材料置于24孔板中，利用75％乙醇和紫外光照射消毒1小时，加入1mL细胞悬液，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中，培养1天后将培养基换为成骨诱导液，继续培养7或14天；
最后，对样品表面的细胞进行ALP活性检测。
结果如图9所示，第7天时功能化表面的ALP活性为纯钛表面的1.16倍，第14天时为1.17倍。
实施例6
(1)依次使用无水乙醇和去离子水超声清洗钛基植入体15分钟，用氮气吹干，后浸没于5M NaOH溶液中，在60℃下处理24小时；
(2)利用凝胶-溶胶法合成介孔二氧化硅微球MSN 3；
(3)将介孔二氧化硅分散于无水乙醇中，并与促成骨多肽YGFGG溶液均匀混合，介孔二氧化硅与多肽的质量比为1:2，反应条件为室温，反应时长为24小时，药物体系的浓度为200μg/mL；
(4)向上述溶液中加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷，浓度为1mg/mL；
(5)将步骤(1)所得到的样品浸没在步骤(4)所得到的样品中，进行反应，反应温度为50℃，反应时长为12小时；
(6)将步骤(5)所得到的样品进行清洗，得到功能化钛基植入体材料。
(7)对样品表面的细胞进行ALP活性检测，结果如图10所示，第7天时功能化表面的ALP活性为纯钛表面的1.66倍，第14天时为2.86倍。
实施例7
(1)依次使用无水乙醇和去离子水超声清洗钛基植入体15分钟，用氮气吹干，后浸没于5M NaOH溶液中，在60℃下处理24小时；
(2)利用凝胶-溶胶法合成介孔二氧化硅微球MSN 3；
(3)将介孔二氧化硅分散于无水乙醇中，并与促成骨多肽YGFGG溶液均匀混合，介孔二氧化硅与多肽的质量比为1:2，反应条件为室温，反应时长为24小时，药物体系的浓度为100μg/mL；
(4)向上述溶液中加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷，浓度为1mg/mL；
(5)将步骤(1)所得到的样品浸没在步骤(4)所得到的样品中，进行反应，反应温度为50℃，反应时长为12小时；
(6)将步骤(5)所得到的样品进行清洗，得到功能化钛基植入体材料。
(7)对样品表面的细胞进行ALP活性检测，结果如图11所示，第7天时功能化表面的ALP活性为纯钛表面的1.65倍，第14天时为2.86倍，说明使用以上条件构建的功能化植入体表面具有最佳的体外促成骨性能。
实施例8
(1)依次使用无水乙醇和去离子水超声清洗钛基植入体15分钟，用氮气吹干，后浸没于5M NaOH溶液中，在60℃下处理24小时；
(2)利用凝胶-溶胶法合成介孔二氧化硅微球MSN 3；
(3)将介孔二氧化硅分散于无水乙醇中，并与RGD多肽溶液均匀混合，介孔二氧化硅与多肽的质量比为1:2，反应条件为室温，反应时长为24小时，药物体系的浓度为500μg/mL；
(4)向上述溶液中加入γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，浓度为5mg/mL；
(5)将步骤(1)所得到的样品浸没在步骤(4)所得到的样品中，进行反应，反应温度为40℃，反应时长为48小时；
(6)将步骤(5)所得到的样品进行清洗，得到功能化钛基植入体材料。
(7)在样品表面培养小鼠骨髓间充质干细胞，利用CCK-8检测试剂盒表征样品的生物相容性，具体实验步骤如下：
首先，将小鼠骨髓间充质干细胞混于完全培养基中，配置1×104/mL细胞浓度的细胞悬液；
其次，将步骤(6)所得到的材料置于24孔板中，利用75％乙醇和紫外光照射消毒1小时，加入1mL细胞悬液，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中，培养1、3和5天；
最后，将样品转移至新的24孔板，加入CCK-8工作液，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育2小时，利用酶标仪检测材料表面的细胞数量。
结果如图12所示，第1、3、5天功能化植入体表面的细胞数量分别为纯钛表面的1.23倍、1.22倍和1.23倍，说明功能化植入体表面能够促进细胞的粘附，具有良好的生物相容性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将钛基植入体置于NaOH溶液中浸泡处理；
(2)将介孔二氧化硅分散于无水乙醇中，并与活性多肽溶液均匀混合，进行反应；其中，所述介孔二氧化硅与活性多肽的质量比为1:1～1:10，负载活性多肽的介孔二氧化硅的浓度为1～1000μg/mL；
(3)向步骤(2)所得溶液中加入硅烷偶联剂；其中，所述硅烷偶联剂的浓度为0.1～10mg/mL，所述硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷、γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷或γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷；
(4)将步骤(1)所得到的样品浸没在步骤(3)所得到的溶液中，进行反应，得到表面功能化钛基植入体；
所述步骤(1)中，NaOH溶液的浓度为4～8mol/L；
所述步骤(1)中，浸泡处理的条件为：温度50～80℃、时间20～30h；
所述步骤(2)中，反应的条件为：温度20～30℃，时间1～48h；
所述步骤(2)中，介孔二氧化硅的孔体积为0.5～2cm3/g，平均孔径为5～15nm；
所述步骤(4)中，反应的条件为：温度20～80℃，时间1～48h。
2.根据权利要求1所述的基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，NaOH溶液的浓度为5mol/L；
所述步骤(1)中，浸泡处理的条件为：温度60℃、时间24h。
3.根据权利要求1～2任一项所述的基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体的制备方法，其特征在于：
所述步骤(2)中，活性多肽包括但不限于抗菌多肽，具有促神经修复作用的多肽，以及具有促进细胞粘附作用的多肽。
4.根据权利要求3所述的基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体的制备方法，其特征在于：
所述步骤(2)中，活性多肽为HHC36、Magainin I、YGFGG和RGD中的任意一种或多种。
5.根据权利要求3所述的基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体的制备方法，其特征在于：
所述步骤(2)中，介孔二氧化硅通过凝胶-溶胶法合成。
6.根据权利要求1～2任一项所述的基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，钛基植入体在使用前，先依次使用无水乙醇和去离子水分别超声清洗10～20分钟，用氮气吹干。
7.一种基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体，其特征在于：通过权利要求1～6任一项中所述的制备方法制备得到。
8.权利要求7中所述的基于介孔二氧化硅的表面功能化钛基植入体在制备生物医用材料中的应用。
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