CN107648674A - 具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物及其制备方法，该方法包括(1)制备金属植入物；(2)利用微弧氧化法对金属植入物进行表面处理，在金属植入物表面覆盖含有钙磷元素的微弧氧化涂层；(3)将经步骤(2)处理后的金属植入物浸入2～5mg/mL的盐酸多巴胺溶液中，在30～45℃下恒温震荡20～24小时；(4)以去离子水或蒸馏水作为溶剂，加入肝素钠配制成浓度为1～5mg/mL的肝素钠溶液，再以肝素钠溶液作为溶剂，加入盐酸万古霉素配制成浓度为50～200μg/mL的盐酸万古霉素溶液；将经步骤(3)处理后的金属植入物浸入盐酸万古霉素溶液中，在30～45℃下恒温震荡3～12小时，制得该金属植入物。

Description

具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗器械领域，尤其涉及一种具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物及其制备方法。
背景技术
金属植入物在临床上被广泛使用，但是金属植入物表现出明显的生物惰性。目前，采用表面改性技术提高金属植入物的表面活性是进一步提高其应用效果的有效途径。
目前，现有技术中公开了在金属植入物的多孔表面制备钙磷涂层的方法，可以提高其骨整合性能。但是能促进骨细胞黏附、长入的生物材料表面同样也适合细菌的定殖，尤其是3D打印多孔金属骨科植入物，虽然具有骨整合能力强以及可以个体化适配于复杂形状部位的特点，但是3D打印植入物多孔的特征使得骨与假体整合表面积大大增加，这本身也会增大感染几率。而骨科内植物相关感染是骨科手术常见并发症，往往导致骨延迟愈合甚至骨不连、内植物松动，进而造成抗生素延长使用甚至手术失败。所以，我们有必要在钙磷涂层促成骨整合的基础上进一步赋予其抗菌功能，使其有效避免骨科内植物相关感染的发生，更好地应用于临床。
发明内容
(一)要解决的技术问题
针对现有技术中的金属植入物存在着在促进骨整合的同时也会增大细菌感染几率的问题，本发明提供了一种即可促进骨整合又具有优异抗菌效果的金属植入物及其制备方法。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备金属植入物；
(2)利用微弧氧化法对所述金属植入物进行表面处理，在所述植入物表面覆盖含有钙磷元素的微弧氧化涂层；
(3)将经步骤(2)处理后的金属植入物浸入2～5mg/mL的盐酸多巴胺溶液中，在30～45℃下恒温震荡20～24小时；
(4)以去离子水或蒸馏水作为溶剂，加入肝素钠溶解，配制成浓度为1～5mg/mL的肝素钠溶液，再以所述肝素钠溶液作为溶剂，加入盐酸万古霉素进行溶解，配制成浓度为50～200μg/mL的盐酸万古霉素溶液；
将经步骤(3)处理后的金属植入物浸入所述盐酸万古霉素溶液中，在30～45℃下恒温震荡3～12小时，制得具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物。
优选地，在步骤(1)中，所述金属植入物为利用3D打印技术制得的多孔金属植入物；并且所述步骤(2)中在所述多孔金属植入物的内表面和外表面均覆盖含有钙磷元素的微弧氧化涂层。
优选地，在步骤(1)中，所述金属植入物为多孔钛植入物、多孔钛合金植入物、多孔镁植入物、多孔镁合金植入物中的任一种，且孔径为600～700μm。
优选地，在步骤(4)中，所述盐酸万古霉素的浓度为50～100μg/mL。
更优选地，在步骤(4)中，所述恒温震荡的温度为37～38℃，时间为3～6小时，转速为50～150rmp，优选为100rmp。
优选地，在步骤(3)中，所述盐酸多巴胺溶液的浓度为2～3mg/mL，pH为8～10，优选为8.5；和/或
所述恒温震荡的温度为37～38℃，转速为50～150rmp，优选为100rmp。
优选地，在步骤(2)中，多孔金属植入物的外表面覆盖的微弧氧化涂层厚度为1.5～2.2μm，内表面覆盖的微弧氧化涂层厚度为0.8～1.3μm。
优选地，所述步骤(2)按照如下方式进行：
(21)将金属植入物依次用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗15～20min，然后烘干；
(22)以去离子水为溶剂配制碱性电解液，包括浓度为0.01～0.4mol/L的钙离子、0.01～0.2mol/L的磷酸根离子、0.02～0.2mol/L的EDTA-2Na和0.25～1mol/L的氢氧化钠，其中EDTA-2Na与钙离子的摩尔比大于0.5；
(23)以步骤(21)处理后的金属植入物为阳极，以不锈钢板或不锈钢电解槽为阴极，采用磁力搅拌器搅拌碱性电解液，搅拌速度为40～60次/分钟，设置微弧氧化的脉冲电压为250v，工作频率为600Hz，占空比为10％，微弧氧化时间为2～4min；
(24)将经步骤(23)处理后的金属植入物取出，采用去离子水超声清洗15～20min，烘干，完成表面处理，最终在金属植入物的表面覆盖含有钙磷元素的微弧氧化涂层。
更优选地，在步骤(22)中，所述碱性电解液还包括0.01～0.1mol/L的锶盐。
本发明还提供了一种具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物，采用上述制备方法制得。
该植入物的表面不但具有微弧氧化涂层，从而使得该植入物能够促进骨整合，而且还通过在微弧氧化涂层的表面覆盖聚多巴胺层进行表面改性，然后以该聚多巴胺层为载体载入药物涂层，从而使得该植入物还具有优异的杀菌性能。此外，该植入物中载入的药物涂层还具有缓释作用，可对植入物周围组织血液中的细菌具有持久的杀灭能力，非常适用于自身免疫力差、患有糖尿病等易感染人群，以及由于感染翻修或者手术过程中身体其他部位存在感染的患者。
(三)有益效果
本发明的上述技术方案具有如下优点：
(1)、本发明在具有微弧氧化涂层的金属植入物的表面载入盐酸万古霉素、肝素钠和聚多巴胺层，这几种物质之间发生三重结合作用，盐酸万古霉素被牢固地吸附固定在金属植入物表面，从而使得本发明提供的金属植入物表现出更强的载药能力。尤其是对于多孔金属植入物，它的内表面和外表面均载入了盐酸万古霉素、肝素钠和聚多巴胺层，通过多重结合作用，盐酸万古霉素被牢固地吸附固定在多孔金属植入物的内表面和外表面，表现出更强的载药能力，50μg/mL的载药浓度就可以有效地杀灭细菌，而传统内植物则需要更高的载药浓度才能达到相同的杀菌效果。
(2)、本发明通过在经微弧氧化处理后的金属植入物钙磷涂层表面载入药物，使得金属植入物不但能促进骨整合，而且还可以杀灭植入物表面及周围的细菌，在较长时间内防止细菌粘附在植入物表面形成生物膜。载入内植物表面的肝素钠可以增加内植物的血液相容性，并且能促进细胞增殖与血管生成。此外，本发明通过微弧氧化制得的微米级孔大大增加了载药量，可对植入物周围组织血液中的细菌具有更好的杀灭能力。
(3)、利用本发明提供的制备方法制得的金属植入物对细胞毒性低，促成骨效果良好。
附图说明
图1a至1c显示了实施例1制备的多孔钛合金骨科植入物表面覆盖上微弧氧化涂层和载药涂层后的外观变化，其中，图1a是进行微弧氧化之前的样品，图1b是进行微弧氧化之后但未覆盖载药涂层的样品，图1c是实施例1制备的覆盖有载药涂层的样品；
图2a和2b分别为第一组对比样品与金葡菌共培养4小时后表面放大4千倍和8千倍的扫描电子显微镜图；图2c和2d分别为第二组对比样品与金葡菌共培养4小时后表面放大4千倍和8千倍的扫描电子显微镜图；图2e和2f分别为实验样品与金葡菌共培养4小时后表面放大4千倍和8千倍的扫描电子显微镜图；
图3为实施例1制得的样品和两组对比样品与含金葡菌的培养基共培养4小时后用Kit-WST检测培养基内微生物活力的结果，光密度值越高，代表微生物活力越高；其中，第一组代表第一组对比样品，第二组代表第二组对比样品，第三组代表实验样品，即实施例1制得的样品；
图4a至4c为实施例1制得的样品和两组对比样品与含金葡菌的培养基共培养24小时后的细菌死活染色检测结果，绿色的代表活菌，红色的代表死菌；其中4a为第一组对比样品，4b为第二组对比样品，4c为实验样品，即实施例1制得的样品；
图5为实施例1制得的样品和两组对比样品与含金葡菌的培养基共培养24小时后的细菌数量检测结果；其中，第一组代表第一组对比样品，第二组代表第二组对比样品，第三组代表实验样品，即实施例1制得的样品；
图6a至6c为实施例1制得的样品和两组对比样品与含细菌的培养基共培养5天后假体表面菌膜的生长状况大体图像，其中6a为第一组对比样品，6b为第二组对比样品，6c为实验样品，即实施例1制得的样品；
图7为实施例1制得的样品和两组对比样品与含细菌的培养基共培养5天后的细菌生长状况检测结果，光密度值越高，代表活菌量越高；其中，第一组代表第一组对比样品，第二组代表第二组对比样品，第三组代表实验样品，即实施例1制得的样品；
图8为实施例1制得的样品和两组对比样品的细胞增殖活力检测结果图；其中，第一组代表第一组对比样品，第二组代表第二组对比样品，第三组代表实验样品，即实施例1制得的样品；
图9为实施例1制得的样品和两组对比样品的细胞毒性-活力检测结果图；其中，第一组代表第一组对比样品，第二组代表第二组对比样品，第三组代表实验样品，即实施例1制得的样品；
图10为实施例1制得的样品和两组对比样品的细胞诱导成骨碱性磷酸酶活性检测结果图；其中，第一组代表第一组对比样品，第二组代表第二组对比样品，第三组代表实验样品，即实施例1制得的样品；
图11a至11c分别为细胞在第一组对比样品上生长14天后的不同放大倍数的扫描电镜图；
图12a至12c分别为细胞在第二组对比样品上生长14天后的不同放大倍数的扫描电镜图；
图13a至13c分别为细胞在实验样品(即实施例1制得的样品)上生长14天后的不同放大倍数的扫描电镜图；
图14a至14b分别为细胞在第一组对比样品上生长14天后的不同放大倍数的细胞死活染色图；
图15a至15b分别为细胞在第二组对比样品上生长14天后的不同放大倍数的细胞死活染色图；
图16a至16b分别为细胞在实验样品(即实施例1制得的样品)上生长14天后的不同放大倍数的细胞死活染色图；
图17为不同载药浓度的样品与金葡菌共培养24小时后的外观图；
图18为实施例1制得的样品中的万古霉素释放曲线；
图19为实施例1制得的样品和两组对比样品的血液相容性检测结果图；其中，空白组代表人去血小板血浆，第一组代表第一组对比样品浸入15分钟后的血浆，第二组代表第二组对比样品浸入15分钟后的血浆，第三组代表实验样品(即实施例1制得的样品)浸入15分钟后的血浆。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的制备方法包括如下步骤：
为了解决上述技术问题，本发明提供了具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备金属植入物；
(2)利用微弧氧化法对所述金属植入物进行表面处理，在所述金属植入物的表面覆盖含有钙磷元素的微弧氧化涂层；
(3)将经步骤(2)处理后的金属植入物浸入2～5mg/mL的盐酸多巴胺溶液中，在30～45℃下恒温震荡20～24小时；
(4)以去离子水或蒸馏水作为溶剂，加入肝素钠溶解，配制成浓度为1～5mg/mL的肝素钠溶液，再以所述肝素钠溶液作为溶剂，加入盐酸万古霉素进行溶解，配制成浓度为50～200μg/mL的盐酸万古霉素溶液；
将经步骤(3)处理后的金属植入物浸入所述盐酸万古霉素溶液中，在35～45℃下恒温震荡3～12小时，制得具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物。
对于一些实施例，在步骤(1)中，所述金属植入物为利用3D打印技术制得的多孔金属植入物；并且所述步骤(2)中在所述多孔金属植入物的内表面和外表面均覆盖含有钙磷元素的微弧氧化涂层。
对于一些实施例，在步骤(1)中，所述金属植入物为多孔钛植入物、多孔钛合金植入物、多孔镁植入物、多孔镁合金植入物中的任一种，且孔径为600～700μm。
本发明提供的制备方法中，通过将金属植入物浸入盐酸多巴胺溶液中进行恒温震荡，在金属植入物的表面覆盖上具有超强黏性的聚多巴胺层。然后，将覆盖有聚多巴胺层的金属植入物浸入肝素钠和万古霉素的混合溶液中，恒温震荡一段时间，将万古霉素牢固地吸附在金属植入物的表面。
通过上述描述可知，本发明提供的制备方法不但在金属植入物的表面载入微弧氧化涂层，而且还载入了药物涂层，从而使得金属植入物不但能促进骨整合，而且还可以杀灭植入物表面的细菌，在较长时间内防止细菌粘附在金属植入物表面形成生物膜。此外，本发明通过上述方法还实现了药物的缓释，可对金属植入物周围组织血液中的细菌具有持久的杀灭能力。
具体来说，其载入药物涂层的原理如下：
第一结合作用：盐酸万古霉素与多巴胺直接作用，从而固定在金属植入物表面。
盐酸万古霉素的伯氨基通过和多巴胺发生席夫碱反应，将盐酸万古霉素吸附固定在多巴胺上。
第二结合作用：肝素钠首先通过共价结合固定在多巴胺上，其次肝素钠表面带负电荷的基团(羧基和硫基)由于有较强的蛋白结合能力，所以也会与盐酸万古霉素联接，起到固定盐酸万古霉素的作用。
第三结合作用：由于微弧氧化在材料表面形成的羟基磷灰石带负电荷，所以也可以吸附带正电的万古霉素分子，并且形成的微孔可以增加载药量。
在上述三重结合作用的保证下，盐酸万古霉素被牢固地吸附固定在金属植入物的表面，从而使得本发明提供的金属植入物表现出更强的载药能力。尤其是对于多孔金属植入物，它的内表面和外表面均载入了盐酸万古霉素、肝素钠和聚多巴胺层，通过多重结合作用，盐酸万古霉素被牢固地吸附固定在多孔金属植入物的内表面和外表面，表现出更强的载药能力，50μg/mL的载药浓度就可以有效地杀灭细菌，而传统内植物则需要更大的载药浓度才能达到相同的杀菌效果。
为了确保在金属植入物表面载入分布均匀的药物涂层，控制肝素钠和万古霉素的用量非常重要。尤其是当金属植入物为多孔金属植入物时，由于多孔金属植入物的多孔结构，又覆盖上了微弧氧化涂层和聚多巴胺层，从而使得药物在金属植入物孔隙内的流动性降低，而且聚多巴胺层还具有超强黏性，这使得药物在孔隙内更不易均匀分布。为此，在本发明提供的制备方法中，当金属植入物为多孔金属植入物时，所述盐酸万古霉素溶液按照如下方式配制：以去离子水或蒸馏水作为溶剂，加入肝素钠溶解，配制成肝素钠溶液，然后，以肝素钠溶液作为溶剂，加入盐酸万古霉素进行溶解，其中，所述肝素钠溶液的浓度为1～5mg/mL(例如，可以为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL)，所述混合溶液中，所述盐酸万古霉素的浓度为50～100μg/mL(例如，可以为50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL)。通过严格控制肝素钠和盐酸万古霉素的用量，肝素钠和盐酸万古霉素在多孔金属植入物的内表面和外表面均匀分布。
此外，为了进一步确保药物涂层在多孔金属植入物内表面和外表面的均匀分布，在一些实施例中，步骤(4)中的所述恒温震荡的温度为37～38℃，时间为3～6小时，转速为50～150rmp，优选为100rmp。
当金属植入物为非孔金属植入物时，本发明将盐酸万古霉素的浓度控制在100～200μg/mL(例如，可以为100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)，将非孔金属植入物浸入这一浓度的盐酸万古霉素溶液中，并恒温震荡6～12小时，确保非孔金属植入物的表面能够载入分布均匀的药物涂层。
为了在多孔金属植入物的表面均匀地覆盖聚多巴胺层，在一些实施例中，步骤(3)中的所述盐酸多巴胺溶液的浓度优选为2～3mg/mL，pH为8～10，优选为8.5；和/或
所述恒温震荡的温度为37～38℃，转速为50～150rmp，优选为100rmp。
在一些实施例中，在步骤(2)中，多孔金属植入物的外表面覆盖的微弧氧化涂层厚度为1.5～2.2μm，内表面覆盖的微弧氧化涂层厚度为0.8～1.3μm。
本发明利用微弧氧化法对所述多孔金属植入物进行表面处理，从而在多孔金属植入物的内表面及外表面覆盖含有钙磷元素的微弧氧化涂层。这一方法能够促进多孔金属植入物内外的成骨活性、增加骨长入，提高多孔金属植入物整体的骨整合能力。
在一些实施例中，所述步骤(2)按照如下方式进行：
(21)将金属植入物依次用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗15～20min，然后烘干；
(22)以去离子水为溶剂配制碱性电解液，包括浓度为0.01～0.4mol/L的钙离子、0.01～0.2mol/L的磷酸根离子、0.02～0.2mol/L的EDTA-2Na和0.25～1mol/L的氢氧化钠，其中EDTA-2Na与钙离子的摩尔比大于0.5；
(23)以步骤(21)处理后的金属植入物为阳极，以不锈钢板或不锈钢电解槽为阴极，采用磁力搅拌器搅拌碱性电解液，搅拌速度为40～60次/分钟，设置微弧氧化的脉冲电压为250v，工作频率为600Hz，占空比为10％，微弧氧化时间为2～4min；
(24)将经步骤(23)处理后的金属植入物取出，采用去离子水超声清洗15～20min，烘干，完成表面处理，最终在金属植入物的表面覆盖含有钙磷元素的微弧氧化涂层。
在本发明提供的制备方法中，微弧氧化层作为中间涂层位于植入物表面和聚多巴胺层之间。它一方面将生物惰性的金属植入物转变成具有生物活性的金属植入物，促进金属植入物与宿主骨的骨整合；另一方面，它还需参与后续制备步骤，作为载体与多巴胺接触。因此，如何确保微弧氧化涂层的有效性也是本发明考虑的一个问题。在本发明中，不但对微弧氧化电解液进行了研究，而且还对微弧氧化的工艺参数进行了相应的研究，确定电解液以去离子水为溶剂，含有0.01～0.4mol/L的钙离子、0.01～0.2mol/L的磷酸根离子、0.02～0.2mol/L的EDTA-2Na和0.25～1mol/L的氢氧化钠，并使得EDTA-2Na与钙离子的摩尔比大于0.5，在一些实施例中，还可以根据实际需要加入0.01-0.1mol/L的锶盐制备掺锶的微弧氧化涂层；微弧氧化工艺参数为：采用磁力搅拌器搅拌碱性电解液，搅拌速度为40～60次/分钟，设置微弧氧化的脉冲电压为250v，工作频率为600Hz，占空比为10％，微弧氧化时间为3min，制得均一的含钙、磷的微弧氧化涂层。结果表明，当金属植入物为多孔金属植入物时，利用该方法制得的多孔金属植入物的外表面覆盖的微弧氧化涂层厚度为1.5～2.2μm，内表面覆盖的微弧氧化涂层厚度为0.8～1.3μm。
在上述碱性电解液中，钙离子选自乙酸钙、硝酸钙、草酸钙或氯化钙等钙盐中的一种，优选为乙酸钙。磷酸根离子选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钙、磷酸二氢钾中的一种，优选为磷酸二氢钠。
本发明还提供了一种具有抗菌促进骨整合功能的金属植入物，其采用上述制备方法制得。
下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步说明。
实施例1
(1)利用3D打印技术制得具有相互连通孔隙的金属植入物。
利用瑞典ARCAM公司生产的型号为EBM S12的电子束融熔设备打印出个体化适配的多孔Ti-6Al-4V植入物，孔径为640μm，支柱直径为400μm，具有钻石晶格孔隙结构。
(2)利用微弧氧化法对所述多孔Ti-6Al-4V植入物进行表面处理，在该植入物的外表面覆盖有2.1μm的微弧氧化涂层，内表面覆盖有1.1μm的微弧氧化涂层。
(21)使用去离子水配制含乙酸钙0.065mol/L，磷酸二氢钠0.03mol/L，EDTA-2Na0.04mol/L，氢氧化钠0.5mol/L的碱性电解液；
(22)以步骤(1)制得的多孔Ti-6Al-4V植入物为阳极，不锈钢为阴极，采用磁力搅拌器搅拌碱性电解液，搅拌速度为40次/分钟；采用直流脉冲电源进行微弧氧化。设置电压为250V，占空比10％，频率600Hz；采用循环水冷系统保持电解液温度不高于50℃，微弧氧化时间为3min；
(23)将微弧氧化反应后的多孔Ti-6Al-4V植入物用去离子水超声清洗20min，于40℃烘箱烘干，即在多孔钛合金植入物的外表面生成2.1μm的含有钙、磷的微纳米微弧氧化涂层，内表面生成1.1μm的含有钙、磷的微纳米微弧氧化涂层。
(3)将盐酸多巴胺溶于Tris-HCl缓冲液中(10mM，pH＝8.5)，配制成浓度为2mg/mL的盐酸多巴胺溶液，然后，将经微弧氧化处理后的多孔Ti-6Al-4V植入物浸入该溶液中，利用恒温震荡器恒温震荡24小时，其中，恒温震荡的温度设置为37℃，转速为100rpm。
(4)以蒸馏水作为溶剂，加入肝素钠进行溶解，配制成浓度为1mg/mL的肝素钠溶液，再以该浓度的肝素钠溶液作为溶剂，加入盐酸万古霉素进行溶解，配制得到浓度为50μg/mL的盐酸万古霉素溶液；
然后，将经步骤(3)处理后的多孔金属植入物浸入该溶液，利用恒温震荡器恒温震荡6小时，其中，恒温震荡的温度设置为37℃，转速为100rpm，制得具有抗菌促进骨整合功能的多孔Ti-6Al-4V植入物。
该实施例制得的多孔金属植入物作为实验样品。
本发明还提供了实施例1的两组对比样品。这两组对比样品同样采用电子束融熔技术以钛合金为原料制备的多孔金属支架，区别在于：第一组对比样品不进行微弧氧化，所制得的金属植入物不含有微弧氧化涂层，即，第一组对比样品的制备方法不包含步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)；第二组对比样品进行微弧氧化，但不进行载药涂层的操作，即，第二组对比样品的制备方法不包含步骤(3)和步骤(4)。
图1a至1c显示出多孔金属植入物表面覆盖上微弧氧化涂层和载药涂层后的外观变化。其中，图1a是进行微弧氧化之前的样品，图1b是进行微弧氧化之后，但未覆盖载药涂层的样品，图1c是实施例1制备的覆盖有载药涂层的样品。由图可以看出，微弧氧化后的植入物失去金属光泽，表面颜色显示为灰色，而当进一步覆盖上载药涂层后，植入物的颜色变成更深的灰黑色。
一、抗菌性能检测
将三组样品与含金黄色葡萄球菌(即金葡菌)的培养基共培养4小时、24小时、5天后分别检测植入物接触杀菌性能。
(1)、共培养4小时
定性检测结果：将植入物脱水固定，在扫描电子显微镜下观察。图2a和2b分别为第一组对比样品放大4千倍和8千倍的扫描电子显微镜图；图2c和2d分别为第二组对比样品放大4千倍和8千倍的扫描电子显微镜图；图2e和2f分别为实验样品表面放大4千倍和8千倍的扫描电子显微镜图。由图可以看出，在进行微弧氧化后，多孔金属植入物的表面生成了均匀的、致密的、具有微纳米多孔结构的微弧氧化涂层，进一步覆盖上载药涂层后，多孔金属植入物的表面仍具有微孔结构。三组样品与金萄菌共培养4小时后，两组对比样品表面均有细菌菌落生长。第二组对比样品中，植入物的孔隙结构中有大量细菌定殖。而在实验样本中，放大4千倍和8千倍的图中均没有观察到细菌定殖。
定量检测结果：采用Kit-WST进行微生物活力检测，检测结果如图3所示。从两图中的检测结果可以看出，实验样品的抗菌性能明显优于两组对比样品，这与图2a至2f显示的结果相一致。
(2)共培养24小时
定性检测结果：利用BacLightTM染色法对细菌进行死活染色来检测细菌活力，其中绿色代表活菌，红色代表死菌。检测结果如图4a至4c所示，其中图4a为第一组对比样品的检测结果，图4b为第二组对比样品的检测结果，图4c为实验样品的检测结果。
定量检测结果：采用Kit-WST进行微生物活力检测，检测结果如图5所示。
从定性检测和定量检测的数据可以看出，上述两个检测结果相一致，实验样品的抗菌性能明显优于两组对比样品。
(3)共培养5天
假体与金葡菌共培养5天后假体表面菌膜生长状况大体图像如图6a～6c所示。其中图6a为第一组对比样品，图6b为第二组对比样品，图6c为实验样品。仔细分辨，我们可以看到，第一组和第二组的对比样品的假体表面有菌膜长出，而实验样品并没有存在明显的菌膜生长。
采用结晶紫染色法检测假体与细菌共培养5天后的细菌生长状况如图7所示。其中，光面密度值(OD值)越高，说明细菌繁殖越多。由此可以间接反映出实验样品具有明显的抗菌效果，并且抗菌效果远远优于两组对比样品。
二、细胞增殖活力检测
将骨髓间充质干细胞(hMSCs)2×106/mL接种复合3组样品(分别为第一组对比样品、第二组对比样品和实验样品)，22h换液，分别培养1d、7d和14d(d代表天数)。
CCK-8细胞活性检测：PBS洗2次，加900μL基础培养基100μLCCK-8(总体积10％)，37℃培养1.5h，吸100μL，450nm测OD值，结果如图8所示，其中A组为第一组对比样品，B组为第二组对比样品，C组为实验样品。
每时间点1个样本重复3次，每组共用9个样品。
检测结果表1、表2和图8所示：
表1细胞增殖检测结果
因变量：OD
表2细胞增殖组间分析
因变量：OD
均值差值在0.05级别上较显著。
从表1和图8的数据可以看出，培养1d、7d和14d，hMSCs在实验样本上均能够很好的增殖。细微差别在于：培养1d、7d三组间细胞增殖无差异；培养14d，第二组对比样本的细胞增殖活性高于第一组对比样本和实验样本(p＝0.009，p＝0.036，均<0.05)，第一组对比样本和实验样本之间无差异(p＝0.519)。
其中，A为第一组对比样品，B为第二组对比样品，C为实验样品。
三、细胞毒性-活力分析
细胞活力采用如下公式进行计算：
式中，
A(加药):细胞、CCK-8、支架；
A(空白)：培养基、CCK-8，没细胞；
A(O加药)：具有细胞、CCK-8，没支架；
检测结果如表3、表4和图9所示：
表3细胞毒性-活力检测结果
因变量：活性
表4细胞毒性-活力组间分析
因变量：活性
从表3、表4和图9的数据可以看出，培养1d、7d和14d，hMSCs在实验样本上均具有良好的活力，三组样品间细胞活性无差异(p>0.05)。也就是说，实验样品对人骨髓来源间充质干细胞无明显细胞毒性。
四、细胞诱导成骨碱性磷酸酶活性检测
将骨髓间充质干细胞(hMSCs)2×106/ml复合3组样品(A为第一组对比样品；B为第二组对比样品；C为实验样品)。观察时间点：诱导成骨化培养7d。消化细胞，一份计数，一份加入试剂盒缓冲液与基质液各500ul，37℃15min后加入显色剂1500ul，同时配制标准管。200ul到96孔板中，酶标仪405nm测吸光值，通过标准曲线获得酶活性。单位为pg/cell。每次2个样本(1个计数、1个检测)，重复3次，共6个样本。
检测结果如表5、表6和图10所示。
表5ALP活性检测结果
第一组对比样本 第一组对比样本 实验样本
7d 1.19±0.165 1.57±0.115 1.37±0.052
表6ALP活性组间分析
因变量：ALP活性
由表5、表6和图10的数据可以看出，虽然实验样品的ALP水平较第二组对比样品略有降低，但是仍然高于第一组对比样品。并且可以看到实验样品对细胞成骨分化无不良影响。
五、复合培养扫描电镜观察
将骨髓间充质干细胞(hMSCs)2×106/mL接种复合3组样品(分别为第一组对比样品、第二组对比样品和实验样品)，22h换液，培养14天，分别进行扫描电镜观察和细胞死活染色观察(用共聚焦显微镜进行细胞死活染色观察)。
扫描电镜观察结果见图11a至11c、图12a至12c和图13a至13c。在三图中，黑色箭头所指之处为复合在样品上的细胞。从图中可以看出，与细胞共培养时，细胞可在本发明提供的植入物表面增殖。
细胞死活染色观察结果见图14a、图14b、图15a、图15b、图16a和图16b，图中绿色部分代表活细胞。从图中可以看出，细胞可以在三组样品上良好的存活。其中，实验样品上的细胞生长状况更好，细胞数量更多。
六、最低载药浓度检测
通过微量稀释法测定最低载药浓度，具体过程如下：用不同浓度盐酸万古霉素(10,20,30,40,50,60μg/mL)制得6种多孔金属植入物的实验样品，将其分别与2mL的金黄色葡萄球菌溶液(1×106CFU/mL)在37℃下共培养24个小时。之后通过肉眼观察6组溶液的浑浊度来判断其对细菌生长的抑制程度，选出能抑制细菌生长的最低载药浓度。
从图17中可以看出，从左至右所对应的载药浓度依次是10,20,30,40,50,60μg/mL，第5个瓶中溶液开始变清澈，即细菌生长得到了很好的抑制，所以50μg/mL为多孔金属植入物的最低载药浓度。
七、万古霉素释放曲线检测
实验样品：实施例1制得的样品；对照样品：制备方法同实施例1基本上相同，不同之处在于：不包含微弧氧化步骤。
将实验样品和对照样品分别浸泡到2mL的pbs溶液(pH7.4)中，用高效液相色谱仪在236nm波长下测pbs溶液中盐酸万古霉素的浓度，间隔特定时长后换等量pbs溶液测量，根据检测数据绘制出盐酸万古霉素的释放曲线，监测其释放动力学。
检测结果如图18所示，从图中可以看出，利用本发明提供的载药方法制得的植入物在释放盐酸万古霉素时，前期爆释较弱，有利于长久持续抗菌；而且可持续释放盐酸万古霉素达19天。而无微弧氧化的样品(也就是对照样品)，其释放量较少。
八、血液相容性检测
采用常规检测方法，分别检测实验样品和对比样品的活化部分凝血酶时间(即ATPP)、凝血酶原时间(即PT)和凝血酶时间(即TT)。
空白组代表人去血去血小板血浆，第一组代表第一组对比样品浸入15分钟后的血浆，第二组代表第二组对比样品浸入15分钟后的血浆，第三组代表实验样品(即实施例1制得的样品)浸入15分钟后的血浆。
结果见图19。从图19中可以看出，实验样品的APTT值、PT值和TT值明显优于两组对比样品。这说明实验样品有着良好的抗凝血效果，血液相容性好。
实施例2
(1)利用EBM S12电子束融熔设备打印出个体化适配的多孔钛植入物，孔径为600μm，支柱直径为500μm，具有十二面体孔隙结构。
(2)利用微弧氧化法对所述多孔钛植入物进行表面处理，在该植入物的外表面覆盖有1.5μm的微弧氧化涂层，内表面覆盖有0.8μm的微弧氧化涂层。
(21)使用去离子水或配制含乙酸钙0.01mol/L，磷酸二氢钠0.01mol/L，EDTA-2Na0.02mol/L，氢氧化钠0.25mol/L的碱性电解液；
(22)以步骤(1)制得的多孔钛植入物为阳极，不锈钢为阴极，采用磁力搅拌器搅拌碱性电解液，搅拌速度为60次/分钟；采用直流脉冲电源进行微弧氧化。设置电压为250V，占空比10％，频率600Hz；采用循环水冷系统保持电解液温度不高于50℃，微弧氧化时间为2min；
(23)将微弧氧化反应后的多孔金属支架用去离子水超声清洗15min，于40℃烘箱烘干，即在多孔钛植入物的外表面生成1.5μm的含有钙、磷的微纳米微弧氧化涂层，在内表面生成0.8μm的含有钙、磷的微纳米微弧氧化涂层。
(3)将盐酸多巴胺溶于Tris-HCl缓冲液中(10mM，pH＝8)，配制成浓度为2.5mg/mL的盐酸多巴胺溶液，然后，将经微弧氧化处理后的植入物浸入该溶液中，利用恒温震荡器恒温震荡24小时，其中，恒温震荡的温度设置为38℃，转速为150rpm。
(4)以去离子水作为溶剂，加入肝素钠进行溶解，配制成浓度为2mg/mL的肝素钠溶液，再以该浓度的肝素钠溶液作为溶剂，加入盐酸万古霉素进行溶解，配制得到浓度为60μg/mL的盐酸万古霉素溶液；
然后，将经步骤(3)处理后的金属植入物浸入该溶液，利用恒温震荡器恒温震荡6小时，其中，恒温震荡的温度设置为38℃，转速为150rpm，制得具有抗菌促进骨整合功能的多孔钛植入物。
实施例3
(1)利用EBM S12电子束融熔设备打印出个体化适配的多孔钛合金植入物，孔径为700μm，支柱直径为450μm，具有蜂窝状孔隙结构。
(2)利用微弧氧化法对所述金属植入物进行表面处理，在该植入物的外表面覆盖有2.2μm的微弧氧化涂层，内表面覆盖有1.3μm的微弧氧化涂层。
(21)使用去离子水配制含乙酸钙0.35mol/L，磷酸二氢钠0.2mol/L，EDTA-2Na0.2mol/L，氢氧化钠1mol/L的碱性电解液；
(22)以步骤(1)制得的多孔钛合金植入物为阳极，不锈钢为阴极，采用磁力搅拌器搅拌碱性电解液，搅拌速度为45次/分钟；采用直流脉冲电源进行微弧氧化。设置电压为250V，占空比10％，频率600Hz；采用循环水冷系统保持电解液温度不高于50℃，微弧氧化时间为4min；
(23)将微弧氧化反应后的多孔金属支架用去离子水超声清洗20min，于40℃烘箱烘干，即在多孔钛合金植入物的外表面生成2.2μm的含有钙、磷的微纳米微弧氧化涂层，内表面生成1.3μm的含有钙、磷的微纳米微弧氧化涂层。
(3)将盐酸多巴胺溶于Tris-HCl缓冲液中(10mM，pH＝10)，配制成浓度为3mg/mL的盐酸多巴胺溶液，然后，将经微弧氧化处理后的植入物浸入该溶液中，利用恒温震荡器恒温震荡21小时，其中，恒温震荡的温度设置为38℃，转速为50rpm。
(4)以蒸馏水作为溶剂，加入肝素钠进行溶解，配制成浓度为3mg/mL的肝素钠溶液，再以该浓度的肝素钠溶液作为溶剂，加入盐酸万古霉素进行溶解，配制得到浓度为70μg/mL的盐酸万古霉素溶液；
然后，将经步骤(3)处理后的多孔金属植入物浸入该溶液，利用恒温震荡器恒温震荡5小时，其中，恒温震荡的温度设置为38℃，转速为50rpm，制得具有抗菌促进骨整合功能的多孔钛合金植入物。
实施例4
实施例4的步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：
在步骤(3)中，盐酸多巴胺溶液的浓度为4mg/mL；恒温震荡的温度为38℃，时间为20h；
在步骤(4)中，肝素钠溶液的浓度为3mg/mL，盐酸万古霉素溶液的浓度为80μg/mL，恒温震荡的温度为38℃，时间为4h。
实施例5
实施例5的步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：
在步骤(3)中，盐酸多巴胺溶液的浓度为3mg/mL；在步骤(4)中，肝素钠溶液的浓度为5mg/mL，盐酸万古霉素溶液的浓度为100μg/mL，恒温震荡的时间为3h。
实施例6
实施例6的步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：
步骤(1)中，利用EBM S12电子束熔融设备制备出个体化适配的无孔镁植入物。
步骤(21)中，使用去离子水配制含氯化钙0.05mol/L，磷酸二氢钾0.02mol/L，EDTA-2Na 0.04mol/L，氢氧化钠0.4mol/L的碱性电解液。
步骤(3)中，盐酸多巴胺溶液的浓度为3mg/mL，恒温震荡的温度为45℃，时间为20小时。
步骤(4)中，肝素钠的浓度为2mg/mL，盐酸万古霉素的浓度为100μg/mL，恒温震荡的温度为45℃，时间为12h。
实施例7
实施例7的步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：
步骤(1)中，利用EBM S12电子束熔融设备出个体化适配的无孔镁合金植入物。
步骤(21)中，使用去离子水或蒸馏水配制含氯化钙0.09mol/L，磷酸二氢钾0.1mol/L，EDTA-2Na 0.09mol/L，氢氧化钠1mol/L的碱性电解液。
步骤(3)中，盐酸多巴胺的浓度为4mg/mL，恒温震荡的温度为30℃，时间为20h。
步骤(4)中，肝素钠的浓度为3mg/mL，盐酸万古霉素的浓度为150μg/mL，恒温震荡的温度为35℃，时间为8h。
实施例8
实施例8的步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：
步骤(1)中，利用EBM S12电子束熔融设备制备出个体化适配的无孔钛合金植入物。步骤(21)中，使用去离子水或蒸馏水配制含乙酸钙0.065mol/L，磷酸二氢钠0.03mol/L，EDTA-2Na 0.04mol/L，氢氧化钠0.5mol/L，乙酸锶0.01-0.1mol/L的碱性电解液。
步骤(3)中，盐酸多巴胺的浓度为5mg/mL，恒温震荡的温度为40℃，时间为20h。
步骤(4)中，肝素钠的浓度为5mg/mL，盐酸万古霉素的浓度为200μg/mL，恒温震荡的温度为40℃，时间为6h。
上述各个实施例的制备条件如下表7所示，其中实施例9为第一组对比样品，实施例10为第二组对比样品。
表7各实施例制备条件
总之，利用本发明提供的制备方法制得的植入物抗菌效果显著，对细胞毒性低，还具有良好的促成骨效果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备金属植入物；
(2)利用微弧氧化法对所述金属植入物进行表面处理，在所述金属植入物表面覆盖含有钙磷元素的微弧氧化涂层；
(3)将经步骤(2)处理后的金属植入物浸入2～5mg/mL的盐酸多巴胺溶液中，在30～45℃下恒温震荡20～24小时；
(4)以去离子水或蒸馏水作为溶剂，加入肝素钠配制成浓度为1～5mg/mL的肝素钠溶液，再以所述肝素钠溶液作为溶剂，加入盐酸万古霉素，配制成浓度为50～200μg/mL的盐酸万古霉素溶液；
将经步骤(3)处理后的金属植入物浸入所述盐酸万古霉素溶液中，在30～45℃下恒温震荡3～12小时，制得具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述金属植入物为利用3D打印技术制得的多孔金属植入物；并且所述步骤(2)中在所述多孔金属植入物的内表面和外表面均覆盖含有钙磷元素的微弧氧化涂层。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述金属植入物为多孔钛植入物、多孔钛合金植入物、多孔镁植入物、多孔镁合金植入物中的任一种，且孔径为600～700μm。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述盐酸万古霉素的浓度为50～100μg/mL。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述恒温震荡的温度为37～38℃，时间为3～6小时，转速为50～150rmp，优选为100rmp。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述盐酸多巴胺溶液的浓度为2～3mg/mL，pH为8～10，优选为8.5；和/或
所述恒温震荡的温度为37～38℃，转速为50～150rmp，优选为100rmp。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，多孔金属植入物的外表面覆盖的微弧氧化涂层厚度为1.5～2.2μm，内表面覆盖的微弧氧化涂层厚度为0.8～1.3μm。
8.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)按照如下方式进行：
(21)将金属植入物依次用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗15～20min，然后烘干；
(22)以去离子水为溶剂配制碱性电解液，包括浓度为0.01～0.4mol/L的钙离子、0.01～0.2mol/L的磷酸根离子、0.02～0.2mol/L的EDTA-2Na和0.25～1mol/L的氢氧化钠，其中EDTA-2Na与钙离子的摩尔比大于0.5；
(23)以步骤(21)处理后的金属植入物为阳极，以不锈钢板或不锈钢电解槽为阴极，采用磁力搅拌器搅拌碱性电解液，搅拌速度为40～60次/分钟，设置微弧氧化的脉冲电压为250v，工作频率为600Hz，占空比为10％，微弧氧化时间为2～4min；
(24)将经步骤(23)处理后的金属植入物取出，采用去离子水超声清洗15～20min，烘干，完成表面处理，最终在金属植入物的表面覆盖含有钙磷元素的微弧氧化涂层。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤(22)中，所述碱性电解液还包括0.01～0.1mol/L的锶盐。
10.一种具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物，其特征在于，采用权利要求1～9任一项的制备方法制得。
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