CN104623641A - 载艾塞那肽介孔二氧化硅纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以SBA-15介孔二氧化硅纳米粒为载体，制备载艾塞那肽介孔二氧化硅纳米粒的方法。结果表明，SBA-15介孔二氧化硅纳米粒平均粒径为（920±120）nm，载药量为（15.23±2.0）%。载艾塞那肽SBA-15介孔二氧化硅纳米粒组的t_1/2和AUC_0-t比艾塞那肽溶液组显著提高。本发明制备的艾塞那肽-SBA-15具有载药量大，持续释放时间持久等特点，可作为艾塞那肽的理想载体。

Description

载艾塞那肽介孔二氧化硅纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种以SBA-15介孔二氧化硅纳米粒为载体，制备载艾塞那肽介孔二氧化硅纳米粒的制备方法。

背景技术

艾塞那肽(exenatide)是一种天然肠促胰岛素类似物，首次从美国西南部大毒蜥在进食时所分泌的唾液中分离，由39个氨基酸残基组成，其与GLP-1氨基酸序列具有53％的同源性，是有效的GLP-1受体激动剂。艾塞那肽具有促进胰腺β细胞增殖、改善其功能，以及促进胰岛素分泌、增加机体对胰岛素的敏感性和延缓胃排空等作用，有着传统降糖药物不可比拟的优点。美国食品药品监督管理局(FDA)于2005年4月批准了艾塞那肽注射液在美国上市。由于其半衰期短，上市的注射液需每日注射2次，制约了其作为药品的开发和利用。为了提高患者用药的顺应性，有必要对艾塞那肽的缓释制剂进行研究，以达到长效缓释的目的。介孔二氧化硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticles，MSNs)作为一种新型的无机介孔材料，因其具有较大比表面积和比孔容可有效的提高载药量，介孔孔径可调节药物的释放，丰富的表面硅羟基易于修饰或改性，并且MSNs具有良好的生物相容性，使其在新型给药载体领域中具有广阔的研究前景。其中，SBA-15型MSNs具有更大的孔径，易于除去模板剂，特别适合负载多肽蛋白类药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以SBA-15介孔二氧化硅纳米粒为载体，制备载艾塞那肽介孔二氧化硅纳米粒的制备方法。

为了实现上述技术目的，本发明采用了以下技术方案：

载艾塞那肽介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)SBA-15的合成：在圆底烧瓶内加入4g三嵌段共聚物P-123，129.6g水和19.3mL浓盐酸，剧烈搅拌2h，再将烧瓶置于50℃水浴，搅拌，加入8.65g正硅酸乙酯，继续搅拌20h，随后升高温度至80℃，并让混合物静置24h；离心，水洗，在100℃下干燥12h，最后在马弗炉中500℃煅烧6h，备用；

(2)载艾塞那肽的SBA-15纳米粒的制备：在室温下，将艾塞那肽溶解于去离子水中；SBA-15溶解到多肽溶液，使其浓度为1mg/mL，将上述两种溶液混合均匀，然后将混合溶液在搅拌速度为300r/min下搅拌24h，离心，真空干燥得到载药量为(15.23±2.0)％的载艾塞那肽介孔二氧化硅纳米粒。

本发明的另一个目的在于提供一种由上述制备方法获得的载艾塞那肽的SBA-15纳米粒。

本发明通过制备SBA-15介孔二氧化硅纳米粒作为载体材料，装载大分子多肽艾塞那肽，合成的材料至关重要。SAXRD图谱显示，通过水洗和煅烧处理的SBA-15比单用水洗处理的SBA-15的孔道更加明显，通过一系列的表征表明，处理后的SBA-15孔径大，形状规整。

本发明制备得到的艾塞那肽-SBA-15载药量高达15％，与艾塞那肽微球载药量相比(约为4％)具有巨大的优势。艾塞那肽-SBA-15体外释放结果显示，SBA-15装载艾塞那肽可使药物持续释放长达14d。药动学研究表明，艾塞那肽-SBA-15显著地提高了艾塞那肽的半衰期，由原药的0.5h提高到了14.0h。经皮下注射给药后，在体内的T_max为1.53h，大于艾塞那肽溶液组的0.48h，说明药物在SBA-15内释放缓慢，达峰时间延迟，在体内持续作用时间延长。AUC_0-t由原来的1.76ng/ml·h提高到8.20ng/ml·h，说明SBA-15可促进艾塞那肽在体内的吸收。MRT表明，药物在体内的平均滞留时间大大增加。

本发明制备的艾塞那肽-SBA-15具有载药量大，持续释放时间持久等特点，是艾塞那肽的理想载体。

附图说明

图1是高效液相色谱图(A.艾塞那肽对照品溶液；B.空白SBA-15；C.艾塞那肽-SBA-15)。

图2是艾塞那肽的标准曲线图。

图3是SBA-15介孔二氧化硅纳米粒电镜照片(×10k)。

图4是SBA-15粉末小角度X射线衍射图。

图5是SBA-15吸附-脱附等温线和孔径分布图：吸附(+)和脱附(○)。

图6是艾塞那肽-SBA-15在pH 7.4条件下的体外释放行为示意图。

图7是大鼠皮下注射后药时曲线图：(A)艾塞那肽水溶液；(B)艾塞那肽-SBA-15(n＝8)。

具体实施例

1方法与结果

1.1测定方法的建立

1.1.1色谱条件

色谱柱：TSK-gel G2000SWXL(300mm×7.8mm，5μm)；流动相：0.13M硫酸钠∶乙腈∶三氟乙酸＝75∶25∶0.1；流速：0.8mL/min；柱温：25℃；检测波长：283nm；进样量：20μL。

1.1.2对照品贮备液的配制

精密称取减压干燥至恒重的艾塞那肽对照品适量，置于25mL容量瓶中，用超纯水溶解、定容，配制成浓度为0.5mg/mL的艾塞那肽对照品贮备液。

1.1.3专属性试验

艾塞那肽对照品溶液、空白SBA-15和1-SBA-15的色谱图，见图1，保留时间为11.897min，可见杂质峰与药物峰分离较好，SBA-15和溶剂对药物测定无干扰，色谱的专一性良好。

1.1.4标准曲线的绘制

分别精密量取“2.1.2”项下的艾塞那肽对照品贮备液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.60、3.20、6.40mL，用超纯水定容至10.00mL，摇匀，得浓度为5.00、10.00、20.00、30.00、40.00、80.00、160.00、320.00μg/mL的系列标准溶液，按“2.1.1”项下方法测定，以峰面积A(mV·s)为纵坐标，药物浓度C(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线，见图2。艾塞那肽在5.0～320.0μg/mL范围内A与C呈良好的线性关系，线性回归方程：A＝2.0751C–4.3681，r＝0.9999。

1.1.5精密度试验

配制低(10.00μg/mL)、中(80.00μg/mL)、高(160.00μg/mL)3个浓度的标准溶液适量，按“2.1.1”项下条件测定，记录峰面积，分别在1d内测定6次，计算日内精密度；每日进样1次，连续测定6d，计算日间精密度，见表1。结果表明日内、日间RSD均小于2％，符合方法学要求。

表1 精密度试验结果(n＝6)

1.1.6重复性试验

精密称取一定量的艾塞那肽溶解于水中定容，6份，按“2.1.1”项下条件测定，计算RSD为1.23％。结果见表2，表明重复性符合方法学要求。

表2 重复性试验(n＝6)

1.1.7方法回收率试验

配制低(10.00μg/mL)、中(80.00μg/mL)、高(160.00μg/mL)三个浓度的标准溶液各三份。按“2.1.1”项下条件检测，每个浓度平行测定6次，所得峰面积带入标准曲线得溶液浓度，与所配溶液进行对比，计算回收率，见表3。结果表明，回收率RSD<2％，符合方法学要求。

表3 回收率试验结果(n＝6)

1.2SBA-15的合成

在洁净的圆底烧瓶加入4g三嵌段共聚物P-123，129.6g水和19.3mL浓盐酸。剧烈搅拌2h，以确保混合均匀，再将烧瓶置于50℃水浴，搅拌，加入8.65g正硅酸乙酯，继续搅拌20h，随后升高温度至80℃，并让混合物静置24h。在完成合成后，将SBA-15的溶液离心，并用1000mL蒸馏水反复清洗和离心，在100℃下干燥12h，最后在马弗炉中500℃煅烧6h，备用。

1.3SBA-15的表征

Nano-ZS 90激光粒度分析仪测定SBA-15的粒径分布范围和电位，测得平均粒径为(920±120)nm，zeta电位(－8.19±2.96)mv。空白SBA-15的形态和介孔结构用透射电子显微镜(TEM，HT-7700，日本日立公司)进行观察，使用Formar为支撑膜的铜网，样品通过悬滴法制备。电镜图片见3，可见形态规整，大小统一，可见清晰介孔孔道。介观结构特征用小角度X射线衍射(SAXRD)进行表征，在X射线衍射仪(D8Advance，Bruker，德国)上进行，管电压40kV，管电流200mA。分别对煅烧前后的SBA-15进行了表征，分别标记为SBA-15-wash和SBA-15-wash&calcination。SAXRD图谱见图4，两份样品均在1°左右存在一个强度很大的衍射峰，特征峰(100)，次强峰(110)峰和(200)峰明显。图4(C)峰为两份样品对比图，显示水洗和煅烧处理的比水洗样品特征峰峰强更大。SBA-15的孔隙度是由氮气吸脱附试验，在MicromeriticsTristar 3020测定仪(Micromeritics公司，美国)进行测定，测量前，所有的样品在433K下真空脱附预处理24h。孔隙尺寸分布(PSD)用BJH方法计，比表面积和孔体积的计算分别采用BET和BJH方法。如图5所示，可以看出样品具有介孔材料典型的Ⅳ型吸附等温线，H1型滞后环，表示样品存在规则且孔径高度均一的介孔。BJH法计算得到SBA-15的孔径为6.2nm，孔容为0.92cm³/g，BET计算比表面积为700.93m²/g。

1.4载艾塞那肽的SBA-15纳米粒的制备

在室温下，将艾塞那肽溶解于去离子水中，SBA-15溶解到多肽溶液(1mg/mL)，将溶液在制备前超声处理3次，以保证均匀，然后将混合溶液在搅拌速度为300r/min下搅拌24h，离心，并真空干燥得到载艾塞那肽的ETX-SBA-15。载药量是通过热重(TG)分析(20℃/min，800℃，氮气200mL/min，TGA，SDT Q600，TA仪器)测定^[7]，测得的载药量为(15.23±2.0)％。

1.5体外释放研究

精密称取一定量的艾塞那肽-SBA-15，放置在含有1.5mLPBS 7.4的微量离心管中，在37℃，150r/min孵育振荡。以10000r/min离心15min后移除原来的释放介质，并将残留物换上新鲜释放介质。残留的SBA-15冷冻干燥24h，干燥后处理。艾塞那肽浓度用HPLC法测定，计算累计释放量，绘制体外释放曲线，见图6。在pH 7.4的PBS介质中，ETX-SBA-15在第一天释放了将近35％，一直到第14d持续有药物释放且释放缓慢。

1.6药动学研究

正常雄性SD大鼠16只，给药前禁食12h，随机分成两组。皮下注射游离艾塞那肽溶液(50μg/kg)作为对照组，记为A；载艾塞那肽的SBA-15皮下注射(350μg/kg)作为实验组，记为B。分别于一定时间间隔由眼眶后静脉丛取血约0.5mL，在3000r/min下离心30min，取上清保存在－70℃冰箱，备用。艾塞那肽浓度的定量测定采用Exendin-4ELISA试剂盒，测定方法根据试剂盒使用说明书进行操作并绘制药动学曲线(图7)；药动学参数采用PK solver2.0计算(表4)。

表4 大鼠皮下注射后药动学参数(n＝8)

本发明制备得到的艾塞那肽-SBA-15载药量高达15％，与艾塞那肽微球载药量相比(约为4％)具有巨大的优势。艾塞那肽-SBA-15体外释放结果显示，SBA-15装载艾塞那肽可使药物持续释放长达14d。药动学研究表明，艾塞那肽-SBA-15显著地提高了艾塞那肽的半衰期，由原药的0.5h提高到了14.0h。经皮下注射给药后，在体内的T_max为1.53h，大于艾塞那肽溶液组的0.48h，说明药物在SBA-15内释放缓慢，达峰时间延迟，在体内持续作用时间延长。AUC_0-t由原来的1.76ng/ml·h提高到8.20ng/ml·h，说明SBA-15可促进艾塞那肽在体内的吸收。MRT表明，药物在体内的平均滞留时间大大增加。

本发明制备的艾塞那肽-SBA-15具有载药量大，持续释放时间持久等特点，是艾塞那肽的理想载体。

Claims (2)

1.载艾塞那肽介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)SBA-15的合成：在圆底烧瓶内加入4g三嵌段共聚物P-123，129.6g水和19.3mL浓盐酸，剧烈搅拌2h，再将烧瓶置于50℃水浴，搅拌，加入8.65g正硅酸乙酯，继续搅拌20h，随后升高温度至80℃，并让混合物静置24h；离心，水洗，在100℃下干燥12h，最后在马弗炉中500℃煅烧6h，备用；

(2)载艾塞那肽的SBA-15纳米粒的制备：在室温下，将艾塞那肽溶解于去离子水中；SBA-15溶解到多肽溶液，使其浓度为1mg/mL，将上述两种溶液混合均匀，然后将混合溶液在搅拌速度为300r/min下搅拌24h，离心，真空干燥得到载药量为(15.23±2.0)％的载艾塞那肽介孔二氧化硅纳米粒。

2.由权利要求1所述制备方法获得的载艾塞那肽介孔二氧化硅纳米粒。