CN110804177A - 一种基于赖氨酸的聚酯酰胺纳米递药体系及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于赖氨酸的聚酯酰胺纳米递药体系及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于赖氨酸的聚酯酰胺纳米递药体系及其制备方法和应用。所述聚酯酰胺聚合物的制备方法，包括以下步骤：合成二元羧酸二对硝基苯基酯单体；合成二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体；将质量比为小于或等于1：1的二元羧酸二对硝基苯基酯单体和二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体加入反应溶剂中，65～85℃搅拌条件下逐滴加入三乙胺作为反应催化剂，在60～80℃下加热反应24～96h，得到具有良好水溶性的聚酯酰胺聚合物，可高效装载传递和可控释放水溶性蛋白类药物，具有良好的生物安全性和释药性，且显著提高了蛋白类药物在体循环中的稳定性和生物利用度。

Description

一种基于赖氨酸的聚酯酰胺纳米递药体系及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域。更具体地，涉及一种适用于高效装载传递和可控释放水溶性蛋白类药物的基于赖氨酸的聚酯酰胺纳米递药体系及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病是一种由于体内血糖调节机制受损而引起高血糖的代谢性疾病。我国是糖尿病患病率增长最快的国家之一。糖尿病患者体内长期的高血糖水平会导致以眼、肾、心脏为主组织的慢性损伤和功能障碍等诸多并发症，极大地增加了患者失明、肾衰竭、心脏病以及中风的风险，对患者的生存质量产生严重影响。形成长期高血糖主要是由胰岛素分泌缺陷(胰岛素的绝对缺失)、生物利用不足(胰岛素的相对缺失)或两者共同作用引起的。定期的血糖监测和外源胰岛素注射是促使血糖维持处于正常水平的主要有效手段。但频繁地外源胰岛素注射过程中可能导致疼痛、低血糖、感染，可能会诱导皮肤坏死和神经损伤等更严重不可弥补的后果。因此，探索安全性、释药性和稳定性好的胰岛素纳米递药体系，是解决这些问题的有效方法，也是当前胰岛素皮下注射给药的技术瓶颈。
胰岛素是最为常见的水溶性蛋白多肽类药物之一。这类蛋白多肽类药物在体内代谢及作用过程复杂，其在体内的生物活性与其多级结构都相关，但生理环境中存在的大量相似物，蛋白水解酶和结合蛋白都会极大地影响药物的结构，降低药物在体内的半衰期，进而限制蛋白多肽药物自身药效的发挥，如游离胰岛素在体内的半衰期小于10分钟。蛋白多肽类药物的体内吸收通常表现出明显的给药途径依赖性，胰岛素的皮下给药是目前最方便快捷和药物生物利用度高的方式之一。但由于胰岛素在体内代谢存在的多重障碍，多次频繁给药是胰岛素治疗中必不可少的，这不仅会增加临床治疗的复杂性，更会加重患者的病痛感和经济负担。而现有的蛋白多肽类药物载体的体内外稳定性较差、易受酶解及其他环境因素影响，且其制剂过程涉及有机溶剂的使用，生产条件苛刻，制备过程复杂，另外释药不稳定，可能会存在暴释或不释现象，导致药物释放浓度过高或过低，不但可能达不到预期的效果，甚至可能会危及患者的生命，增加了病人的身体和心理负担。因此，如何使注射给药的蛋白多肽类药物更加高效稳定地发挥作用是亟待解决的问题。
聚酯酰胺高分子是一类新型的生物相容性良好的生物医用材料，在药物纳米传递领域具有良好的应用前景和广阔的发展空间。聚酯酰胺高分子的合成原料来源广泛且价廉，除了传统的醇、胺、酸，基于氨基酸的聚酯酰胺类肽高分子材料具有更高的生物相容性和侧链功能性而引起更加广泛的关注。氨基酸是构成蛋白质的基本单元，在人体内代谢和循环中发挥着一系列重要作用。氨基酸作为构建载体的原料之一，来源丰富且具有优异的生物安全性。与此同时，氨基酸自身的结构特点使不同氨基酸具有各异的亲疏水性、正负电性、氧化还原性等理化特性，这也为构建功能性的药物递送载体提供更多可能。
近年来，有些文献报道将药物合成聚合物后递送药物的研究，但是其不能很好释放出原型药物，这种方式释药量较低，且操作麻烦。申请号为CN 201310284253.1的中国发明专利，公开了一种聚酯酰胺与聚乙二醇嵌段共聚物及其制备方法。通过将具有氨基酸单元结构的聚酯酰胺与分子链末端带有氨基的聚乙二醇进行缩合反应，得到具有两亲性特性的三嵌段或多嵌段共聚物。该类嵌段共聚物具有良好的生物相容性和生物可降解性。所制备的共聚物适用于制备包载油溶性药物的纳米颗粒。然而聚酯酰胺是一种疏水性聚合物，无法自组装形成具有核壳机构的纳米颗粒进行包载药物。该方法必须将聚乙二醇引入聚酯酰胺后，才能赋予材料两亲性特点，使其具有形成纳米颗粒的能力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对上述水溶性蛋白多肽类药物递送中的问题，以胰岛素为代表，结合糖尿病治疗现状，提供一种基于赖氨酸的聚酯酰胺纳米递药体系，实现以胰岛素为代表的水溶性蛋白多肽类药物的高效传递和可控释放，提高了皮下注射胰岛素对糖尿病治疗的效果。该纳米递药体系理化性能优异，具有安全无毒、可降解吸收、结构多样性、易加工与设计、易制备等多功能性及来源广泛等优点，利用其构建的功能化载体能够全方位保护亲水性蛋白多肽类药物的生物活性，实现对亲水性蛋白多肽类药物的高效装载传递和可控释药。
本发明的第一个目的是提供一种基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物的制备方法。
本发明的第二个目的是提供上述聚酯酰胺聚合物在作为或制备水溶性蛋白多肽类药物载体中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种基于上述聚酯酰胺聚合物的装载水溶性蛋白多肽类药物的纳米递药体系。
本发明的第四个目的是提供一种基于上述聚酯酰胺聚合物的装载水溶性蛋白多肽类药物的纳米递药体系的制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.合成二元羧酸二对硝基苯基酯单体(Nx)；
S2.合成二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体(Lys-y)；
S3.将质量比为小于或等于1：1的二元羧酸二对硝基苯基酯单体和二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体加入反应溶剂中，65～85℃搅拌条件下逐滴加入三乙胺作为反应催化剂，在60～80℃下加热反应24～96h，得到具有良好水溶性的聚酯酰胺聚合物(x-Lys-yPEA)，即可得到基于赖氨酸的聚酯酰胺纳米递药载体。
实验发现，本发明二元羧酸二对硝基苯基酯单体和二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体的产率分别达90％、83％以上，且纯度较好，制备出的聚酯酰胺聚合物适用于制备纳米粒溶液。若反应时间短或反应温度低可能导致单体反应不充分而产生副产物，降低聚合物产率和纯度。另外，二元羧酸二对硝基苯基酯单体和二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体两种单体材料的质量比需要小于或等于1：1，才可以保证制备出的聚酯酰胺聚合物呈线性，才能后续在溶液中制备纳米颗粒，若质量比大于1：1会制备出胶状聚合物(水凝胶材料)，不适用于再制备纳米粒溶液。在本发明较佳的实施例中，所述二元羧酸二对硝基苯基酯单体和二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体的质量比优选为1：1～10，更优选为1：1或1：2～8。
不同的聚合物结构对于载药和递送性能有不同程度的影响。蛋白类药物存在许多缺点，如：①相对分子质量大、结构复杂；②体内外稳定性差、易受酶解及其他环境因素影响；③存在显著的肝、胃肠首过效应；④大多数蛋白质在中性pH条件下生物膜穿透性差，生物利用度低；⑤存在免疫原性，生物半衰期短。本发明建立了一个结构可调控的聚合物库，所述基于赖氨酸的聚酯酰胺可以通过静电相互作用结合负载带负电的水溶性蛋白类药物，可明显改善蛋白多肽类药物的药物半衰期和提高其生物利用度，有利于胰岛素等水溶性蛋白多肽类药物在正常细胞上发挥作用，从而更好地实现了血糖水平的调控和正常血糖的维持，针对I型糖尿病展现出优良的治疗效果。
本发明所制备的基于赖氨酸的聚酯酰胺纳米递药体系库中，充分将蛋白质的相对分子质量、多维结构及功能域、分子尺寸及形状、电荷分布和亲疏水性等因素考虑在内，通过控制制备条件来调整聚酯酰胺载体材料的物理化学性质，结合注射给药的输送途径，制备出粒径合适、电荷分布和亲水性适宜的生物可降解聚酯酰胺高分子载体，再与水溶性蛋白药物复合形成纳米结构，可以实现蛋白药物的高效负载和可控释放，表现出良好的生物安全性，体内外稳定性好，可以注射给药，避免蛋白药物的显著的肝、胃肠首过效应，且释放的蛋白质仍可保持原有生物活性，同时由于本发明载药纳米颗粒表面的亲水性较大，巨噬细胞对其相对摄取率较小，其在不同程度上增强了正常细胞对于水溶性蛋白药物的利用。
在本发明较佳的实施例中，所述二元羧酸二对硝基苯基酯单体的制备方法为：将二元酰氯与2～3倍于二元酰氯当量的对硝基苯酚加入-85～-70℃的冰冻丙酮溶液中，逐滴加入2～3倍于二元酰氯当量的三乙胺，-85～-70℃搅拌反应1～5h后转至20～30℃搅拌10～16h，即可得到二元羧酸二对硝基苯基酯单体。如果反应时间不足，反应物不能充分反应，产率较低，且得到的产物易含有较多杂质和副产物。
在本发明较佳的实施例中，所述二元酰氯选自乙二酰氯、丁二酰氯或辛二酰氯中的一种或几种。
在本发明较佳的实施例中，S1还用乙腈重结晶二元羧酸二对硝基苯基酯单体2～4次进行纯化，并于50～60℃下真空干燥至恒重。
在本发明较佳的实施例中，S1的反应条件为-78℃搅拌反应2h。
在本发明较佳的实施例中，S2所述二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体的制备方法为：以对甲苯磺酸一水合物作为催化剂和氨基保护剂，将二元醇、2～3倍于二元醇当量的L-赖氨酸在苯中于90～130℃反应16～72h，即得二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体。如果反应时间不足，反应物不能充分反应，产率较低，且得到的产物易含有较多杂质和副产物。
在本发明较佳的实施例中，所述二元醇选自1,4-丁二醇、1,6-己二醇、1,8-辛二醇或1,10-癸二醇中的一种或几种。
在本发明较佳的实施例中，所述对甲苯磺酸一水合物的添加量为L-赖氨酸当量的2～4倍。
在本发明较佳的实施例中，S2所述反应温度为100～110℃，反应时间为24～30h。
在本发明较佳的实施例中，S2得到二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体后，将其在70～80℃(优选75℃磁力搅拌)加热搅拌条件下溶解于异丙醇中，并在2～8℃条件下析出沉淀，重复2～4次，再于50～60℃真空干燥24～48h，干燥条件优选为65℃真空干燥24～36h。
在本发明较佳的实施例中，S3所述反应溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或二甲基亚砜溶液中的一种或几种。
在本发明较佳的实施例中，S3得到聚酯酰胺聚合物溶液后，将其倒入预冷的乙酸乙酯中析出沉淀，弃上清，将产物用甲醇复溶，复提纯除杂3～4次后，将产物于50～60℃真空干燥24～48h，干燥条件优选为65℃真空干燥24～36h。真空干燥温度和时间可随具体情况调控。
本发明还涉及了上述基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物在作为或制备水溶性蛋白多肽类药物载体中的应用。该聚合物药物递送载体体系表现出良好的水溶性，避免了在药物递送体系制备过程中其他亲水成分的额外引入和有机溶剂的使用及后续复杂除杂处理，可直接制备水溶性蛋白药物递送体系水溶液，且选择赖氨酸作为原料，利用侧链氨基所带的正电性使聚合物载体可以高效负载胰岛素等呈负电性的水溶性蛋白药物，两者基于静电相互作用通过共混方式快速简便的形成纳米复合物体系用于药物的递送。
在本发明较佳的实施例中，所述水溶性蛋白多肽类药物选自胰岛素、血清白蛋白、人生长激素(DNA重组人生长激素，HGH)、干扰素、组织纤溶酶原激活物(t-PA)、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL-1～IL-38)、免疫抑制剂)、抗体、抗原多肽、或鸡卵白蛋白OVA中的一种或几种。
本发明血清白蛋白可选自如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等；干扰素可选自INF-α、IFN-β或IFN-γ中的一种或几种；白细胞介素可选自IL-1～IL-38任一白细胞介素家族的成员，且IL-1家族包括但不限于IL-1α、IL-1β、IL-1γα等；所述免疫抑制剂主要为多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体类免疫抑制剂，例如anti PD-1,anti PD-L1,antiCTLA-4等。
本发明还涉及了一种基于上述聚酯酰胺聚合物的纳米递药体系。所述纳米递药体系是由质量比为10～1000：1的所述聚酯酰胺聚合物与水溶性蛋白多肽类药物组成的球形纳米颗粒。
在本发明较佳的实施例中，所述聚酯酰胺聚合物水溶液与水溶性蛋白多肽类药物溶液的质量比为200～500：1；进一步优选为250：1。
在本发明较佳的实施例中，所述球形纳米颗粒的直径为20～200nm；优选为20～100nm。
本发明还涉及了上述纳米递药体系的制备方法，将所述聚酯酰胺聚合物水溶液与水溶性蛋白多肽类药物溶液按质量比混合后，涡旋分散1～10min，即可得到所述纳米递药体系。
在本发明较佳的实施例中，所述涡旋分散时间为3～5min。
在本发明较佳的实施例中，所述纳米递药体系的给药方式为注射给药，所述注射给药包括静脉注射、肌肉注射或皮下注射。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明基于赖氨酸设计了一类水溶性聚酯酰胺高分子，并构建了一个亲水性蛋白多肽类药物递送的载体库。该纳米递药体系库中不同载体粒径大小合适，具有结构可调控性、生物安全性等优异特点，可以负载多种亲水性蛋白多肽类药物，并在生理环境下有效释放药物，且释放的蛋白质仍可保持原有生物活性。其结构的可调控性可通过调节投料配比及其他条件参数来实现。
(2)本发明的纳米递药体系显著提高了蛋白类药物在体循环中的稳定性和生物利用度。负载胰岛素的纳米复合递药体系在体内可以增长维持血糖处于正常水平的时间，为其他蛋白多肽类药物的递送提供了参考。
(3)本发明制备原料来源广泛，基于生物来源的生物相容性良好的氨基酸材料；选用的赖氨酸本身侧链带有氨基，赋予载体正电性，可以通过物理静电相互作用结合带负电的蛋白药物，构建药物递送体系过程简单；纳米复合载药体系构建操作方便易行；本发明水溶性纳米药物递送体系的制备方法，可以避免有毒有害有机溶剂的引入和清除等步骤，除此之外还具有重复性好、易于实现等优势，在医药领域，尤其是带负电的水溶性蛋白多肽类药物递送方面，具有良好的应用前景和广阔的发展空间。
附图说明
图1为不同二元羧酸二对硝基苯基酯单体、不同二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体和基于赖氨酸聚酯酰胺聚合物的合成步骤。
图2为不同二元羧酸二对硝基苯基酯单体、不同二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体和基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物的核磁图。
图3为其中N8-Lys-4(1:2)与胰岛素纳米复合载体(8-Lys-4(0.5:1)@INS)的TEM图。
图4为不同基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物和胰岛素纳米复合物在400mg/dL葡萄糖溶液下的胰岛素的释放曲线图。
图5为在400mg/dL葡萄糖中37℃下24小时后，从不同纳米复合物中释放的胰岛素和天然胰岛素的CD光谱。
图6为不同基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物和胰岛素纳米复合物的细胞相容性评价。
图7为不同基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物和胰岛素纳米复合物对HUVEC细胞利用率的影响情况。
图8为分别以N2-Lys-6(1:1)、N4-Lys-6(1:1)、N8-Lys-6(0.5:1)和N8-Lys-4(0.5:1)为载体的胰岛素纳米复合物对I型糖尿病小鼠模型治疗情况。
图9为不同载体纳米复合物递药体系治疗I型糖尿病小鼠过程中的小鼠体重变化情况。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1一种基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物药物载体的制备
1、基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)二元羧酸二对硝基苯基酯单体(Nx)的合成：
(a)称取一定量的对硝基苯酚，量取相同当量的三乙胺，加入装有足量丙酮的单口烧瓶中，室温下搅拌均匀，然后用干冰和丙酮将其保存在-78℃下；
(b)量取略小于二分之一对硝基苯酚当量的乙二酰氯(或丁二酰氯或辛二酰氯)加入适量丙酮中，混合均匀，然后逐滴加入前一步骤制备好的三乙胺冰冻溶液中，在-78℃下搅拌2h后转至25℃搅拌过夜(10～16h)；
(c)将反应后的溶液加入装有足量蒸馏水的大烧杯中，产物沉淀后过滤，洗涤，然后置于50℃的真空干燥箱中烘干；
(d)利用乙腈将产物重结晶3次进行纯化，分别得到乙二酸二对硝基苯基酯(N2)，丁二酸二对硝基苯基酯(N4)和辛二酸二对硝基苯基酯(N8)，产率分别为95％、98％、99％。
(2)二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体(Lys-y)的合成：
(a)称取适量的L-赖氨酸，并量取二分之一赖氨酸当量的丁二醇(或称取己二醇或辛二醇或癸二醇)，再称2～3倍赖氨酸当量的对甲苯磺酸一水合物，均加入三口烧瓶；
(b)将足量的苯加入三口烧瓶中，安装好冷凝装置，加热到至100℃，均匀搅拌24h；
(c)反应结束后，冷却至室温，倒出苯，得到粘稠固体；
(d)在75℃、搅拌条件下将产物溶解于异丙醇中，随后置于4℃下沉淀，重复3次，最后将产物置于60℃真空干燥箱中烘干24h，分别得到二赖氨酸二对甲苯磺酸盐丁酯(Lys-4)、二赖氨酸二对甲苯磺酸盐己酯(Lys-6)、二赖氨酸二对甲苯磺酸盐辛酯(Lys-8)、二赖氨酸二对甲苯磺酸盐癸酯(Lys-10)，产率分别为83％、86％、83％、85％。
(3)基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物的制备：
(a)根据质量比0.5：1或1：1或1：1.5或1：3或1：8或1：10，分别称取一定量的上述制备得到的二元羧酸二对硝基苯基酯单体和二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体，混合均匀放入20mL玻璃反应瓶，加入足量的反应溶剂DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，搅拌，加热至70℃，使单体完全溶解呈透明溶液；制备原料中的反应溶剂DMF可以用其它有机溶剂，如可用N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)或二甲基亚砜(DMSO)所代替；
(b)在快速搅拌下向溶液中逐滴加入适量三乙胺；
(c)待搅拌均匀，溶液颜色变黄后，停止搅拌，将反应体系置于70℃下反应24h；
(d)将反应后的溶液倒入预冷的乙酸乙酯中使产物沉淀，弃上清，将产物重新溶解于甲醇中，再用冷的乙酸乙酯使产物沉淀，再重复提纯2次，最后将产物放置于60℃真空干燥箱中烘干24h，即可得到一系列基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物N2-Lys-4(0.5：1)、N2-Lys-4(1：1)、N2-Lys-6(0.5：1)、N2-Lys-6(1：1)、N2-Lys-8(0.5：1)、N2-Lys-8(1：1)、N4-Lys-4(0.5：1)、N4-Lys-4(1：1)、N4-Lys-6(0.5：1)、N4-Lys-6(1：1)、N4-Lys-8(0.5：1)、N4-Lys-8(1：1)、N8-Lys-4(0.5：1)、N8-Lys-4(1：1)、N8-Lys-6(0.5：1)、N8-Lys-6(1：1)、N8-Lys-8(0.5：1)、N8-Lys-8(1：1)等(二元羧酸二对硝基苯基酯单体和二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体质量比为1：1.5、1：3、1：8或1：10时的产物同样按此方法命名)。
2、结果
步骤(1)、(2)、(3)的合成步骤如图1所示；其所合成的一系列基于赖氨酸的单体和聚合物的1H-NMR图谱如附图2所示(部分聚酯酰胺聚合物的1H-NMR图谱未显示)，说明本发明上述基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物的成功合成。
实施例2一种基于赖氨酸的聚酯酰胺-牛血清白蛋白(BSA)纳米复合药物递送体系(Lys-PEA@BSA)的制备
1、其制备过程包括以下步骤：
将实施例1制备得到的不同赖氨酸的聚酯酰胺聚合物水溶液与BSA水溶液按照材料与蛋白质的质量比为250：1的比例混合，涡旋分散5分钟，制备得到呈球形纳米粒的基于赖氨酸的聚酯酰胺-BSA纳米复合药物递送体系。
2、结果
(1)利用透射电镜表征所制备纳米粒的形态：纳米粒Lys-PEA@BSA呈均一、分散的球形结构，粒径小于100nm。
(2)利用动态光散射表征纳米粒的稳定性，空白纳米粒聚酯酰胺聚合物Lys-PEA及载药纳米粒Lys-PEA@BSA在PBS中均能保持长时间(7天)的稳定性。
(3)聚酯酰胺聚合物载体负载牛血清白蛋白量较多，同时能保证整个纳米药物递送体系保持一定的正电性，有利于纳米复合载药体系与呈负电性的细胞膜相互作用，使牛血清白蛋白可以更好地和体细胞膜表面受体相结合，提高了牛血清白蛋白的利用度。
实施例3一种基于赖氨酸的聚酯酰胺-胰岛素纳米复合药物递送体系(Lys-PEA@INS)的制备
1、其制备过程包括以下步骤：
将实施例1制备得到的不同赖氨酸的聚酯酰胺聚合物水溶液与胰岛素盐酸溶液按照材料与蛋白质的质量比分别为10：1、50：1、100：1、250：1、500：1、1000：1的比例混合，涡旋分散5分钟，制备得到呈球形纳米粒的基于赖氨酸的聚酯酰胺-胰岛素纳米复合药物递送体系(Lys-PEA@INS)。
2、结果
(1)利用透射电镜表征所制备纳米粒的形态：如图3所示，纳米粒Lys-PEA@INS呈均一、分散的球形结构，粒径小于100nm。
(2)利用动态光散射表征纳米粒的稳定性，空白纳米粒聚酯酰胺聚合物Lys-PEA及载药纳米粒Lys-PEA@INS在PBS中均能保持长时间(7天)的稳定性。
(3)在聚酯酰胺聚合物和其他条件相同的条件下，以聚酯酰胺聚合物与胰岛素的质量比为单变量，考察发现随着聚合物材料和胰岛素质量比的增加，纳米复合物的zeta电位会减小。当聚酯酰胺聚合物与胰岛素质量比在200～500：1之间时，聚合物载体负载胰岛素量较多，同时能保证整个纳米药物递送体系保持一定的正电性，有利于纳米复合载药体系与呈负电性的细胞膜相互作用，使胰岛素可以更好地和体细胞膜表面受体相结合，提高了胰岛素的利用度。当聚酯酰胺聚合物与胰岛素的质量比为250：1时，效果最佳。
实施例4基于赖氨酸的聚酯酰胺-蛋白质纳米复合药物递送体系性能表征及I型糖尿病治疗评价
1、基于赖氨酸的聚酯酰胺-胰岛素纳米复合物的体外释放性能评价
将一系列基于赖氨酸聚酯酰胺-FITC荧光标记的胰岛素纳米复合物(Lys-PEA@FITC-INS)置于PBS溶液或400mg dL-1葡萄糖溶液，在温度为37℃，持续搅拌速度为100r/min的条件下孵育，其中胰岛素浓度为80μg/mL，聚酯酰胺聚合物与胰岛素的质量比为250：1。在特定时间点(0min,15min,30min,1h,2h,4h,6h,8h,10h,12h,24h)，取出等分试样(100μL)以研究释放情况，并在每组中设定三组平行样品。通过荧光光度计检测荧光强度，确定释放的FITC-INS的浓度，并根据标准曲线计算样品中的胰岛素的量。
将Lys-PEA@INS置于400mg/dL葡萄糖溶液中，设置温度为37℃，持续搅拌速度为100r/min的条件下孵育24小时。对释放出的胰岛素进行CD光谱蛋白质结构分析，并使用具有相同浓度的天然胰岛素溶液作为对照，验证释放的胰岛素是否可以维持原有的蛋白结构。
2、人脐静脉内皮细胞HUVEC相容性和募集和利用效果评价
(1)细胞相容性实验
(a)将人脐静脉内皮细胞HUVEC接种于96孔板，待细胞贴壁后，加入已过无菌滤膜的单独赖氨酸聚酯酰胺材料或赖氨酸聚酯酰胺-胰岛素纳米复合物，设置5个浓度梯度；
(b)培养24小时后，用MTT进行细胞活性检测，将没有培养细胞的一组和未加材料的正常培养的细胞分别作为阴性对照和阳性对照；
(c)通过细胞相对增值率公式：细胞存活率＝[ODavg(实验组)-ODavg(阴性对照组)]/[ODavg(阳性对照组)-ODavg(阴性空白组)]×100％，计算不同材料对细胞性对增值率的影响。
(2)细胞对纳米复合物药物递送体系的募集和利用实验
(a)将人脐静脉内皮细胞HUVEC接种于12孔板，待细胞贴壁后，加入已过无菌滤膜的不同赖氨酸聚酯酰胺-胰岛素纳米复合物共培养；
(b)不同时间点对不同材料试验组进行观察，拍照取样，以游离的胰岛素作为对照组。
3、I型糖尿病治疗的评价
(1)I型糖尿病治疗效果评价
(a)I型糖尿病小鼠模型的建立：小鼠建模前禁食过夜，腹腔注射150mg/kg链脲佐菌素(STZ)的柠檬酸缓冲溶液，一周后检测小鼠空腹血糖大于16.7mmol/L即为建模成功，可纳入正式实验；
(b)实验前禁食过夜，给药前检测小鼠0点的空腹血糖。将实验小鼠随机分成7组，每组5只，包括正常组和分别皮下注射生理盐水、胰岛素、以及以实施例1制备得到的N2-Lys-6(1:1)、N4-Lys-6(1:1)、N8-Lys-6(0.5:1)和N8-Lys-4(0.5:1)为载体的胰岛素纳米复合物；
(c)在特定的时间点对不同试验组小鼠血糖进行检测，绘制血糖-时间曲线，观察不同实验组中小鼠血糖的变化情况。
(2)I型糖尿病小鼠治疗过程中的体重变化
每天定时给不同实验组的小鼠称量体重，并绘制体重-时间曲线。
4、结果
(1)如图4所示，本发明制备的赖氨酸聚酯酰胺纳米递药体系在400mg/dL高血糖条件下可以有效实现药物的释放。如图5所示，蛋白质的圆二色谱表征显示释放前后蛋白的结构没有发生明显变化，可以保持蛋白质原有的生物活性。
另外，实验发现，组成聚酯酰胺聚合物的两种单体所含有的碳链具有一定的疏水性，随着这两部分的碳链长度的增长，载药体系的疏水性会相对有所增加，与蛋白药物的结合在静电相互作用的基础上还存在疏水相互作用，有利于蛋白聚酯酰胺纳米体系结合力的增加和稳定性的提高。因此，拥有长链的Lys-PEA体系药物释放相对更缓慢。不同的单体比例对Lys-PEA的释放性能影响没有十分明显的差异。
(2)如附图6所示，将本发明所述基于赖氨酸聚酯酰胺的纳米递药体系库中不同的胰岛素复合物配制成0.01～1mg/mL的溶液，在MTT细胞毒性检测中，筛选出细胞相对存活率为90％～110％的蛋白聚合物复合物，说明本发明制备的负载胰岛素的赖氨酸聚酯酰胺纳米复合递药体系(Lys-PEA@INS)具有较好的生物相容性。
如附图7所示，将本发明中不同的纳米复合物体系与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共孵育，可以显著地提高人脐静脉内皮细胞HUVEC对胰岛素的募集和利用，且表现出一定的时间依赖性。而且，不同结构的基于赖氨酸聚酯酰胺递药纳米复合物对胰岛素的HUVEC细胞利用率影响程度不同，其中单体碳链更长或二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体占比高的基于赖氨酸聚酯酰胺对提高胰岛素的利用率效果更佳，包括以N2-Lys-6(1:1)、N4-Lys-6(1:1)、N8-Lys-6(0.5:1)和N8-Lys-4(0.5:1)为载体的纳米复合物递药系统。由于较长的碳链具有的相对更强的疏水性在促进递送体系与细胞膜相互作用方面起主要的影响作用，因此可以使胰岛素与细胞膜表面相关受体更好的结合以发挥正常的生理作用。对于部分Lys-PEA体系而言，不同的单体比例也会对功能有一定的影响。N2-Lys-6和N4-Lys-6 PEAs中体现较为明显，这是因为带正电氨基比例的增大导致体系内正电相互排斥作用增强，进而增加了递送体系在体内的释药性，因此N2-Lys-6(1:1)和N4-Lys-6(1:1)表现出很好的针对细胞膜的药物运载和递送效果。
选择上述4种载药和递送性能相对更优的Lys-PEA@INS递送体系，进行I型糖尿病小鼠治疗实验。如附图8所示，与对照组游离胰岛素皮下注射组相比，Lys-PEA@INS递送体系均表现出更好的延缓血糖上升的能力。
(3)如图9所示，动物实验表明，在I型糖尿病小鼠模型上，Lys-PEA@INS实验组小鼠体重均维持稳定或稍有上升，从一方面说明Lys-PEA未对小鼠产生明显的毒副作用。
上述结果说明，本发明制备的纳米递药体系具有良好的生物相容性，能够维持蛋白原有的生物活性，延长胰岛素的稳定性，并且提高胰岛素被细胞的利用度，实现血糖的有效调控，为提高治疗I型糖尿病的治疗效率提供了新的可能。
实验例
(1)考察步骤(1)二元羧酸二对硝基苯基酯单体(Nx)合成的反应时间对产物的影响
其它条件与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：以反应时间为单因素变量，将步骤(1)二元羧酸二对硝基苯基酯单体(Nx)的合成的反应时间分别设置为6h,10h,12h,14h,16h,18h,24h和48h。
结果发现，反应时间为14h的乙二酸二对硝基苯基酯(N2)，丁二酸二对硝基苯基酯(N4)和辛二酸二对硝基苯基酯(N8)的产率均达到最高，分别为95％、98％、99％。反应时间为10h,12h,16h,18h的产物产率有所下降(80～90％)，而反应时间为6h时，由于反应时间短，单体反应尚不能彻底，反应产率低于80％；对于反应时间为24h和48h的产物，反应产率不但没有上升，反而由于反应时间过长导致副产物的生成降低产率，同时还造成一定程度的能源浪费。
(2)考察步骤(2)二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体(Lys-y)合成的反应温度对产物的影响
其它条件与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：以反应温度为单因素变量，将步骤(2)二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体(Lys-y)的合成的反应温度分别设置为80℃，100℃，120℃和130℃。
结果发现，反应温度为100℃的二赖氨酸二对甲苯磺酸盐丁酯(Lys-4)、二赖氨酸二对甲苯磺酸盐己酯(Lys-6)、二赖氨酸二对甲苯磺酸盐辛酯(Lys-8)、二赖氨酸二对甲苯磺酸盐癸酯(Lys-10)的产率最高，分别为83％、86％、83％、85％。反应温度为80℃时，难以稳定维持溶剂苯的持续沸腾，使单体放映不够充分而导致产率降低(小于75％)；当反应温度为120℃和130℃时，反应温度过高会导致副反应发生，减小了终产物的纯度。
(3)考察步骤(2)二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体(Lys-y)合成的提纯次数对产物的影响
其它条件与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：以提纯次数为单因素变量，将步骤(2)二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体(Lys-y)的合成产物分别提纯2次，3次，4次，5次，6次。
结果发现，提纯次数为3次时，二赖氨酸二对甲苯磺酸盐丁酯(Lys-4)、二赖氨酸二对甲苯磺酸盐己酯(Lys-6)、二赖氨酸二对甲苯磺酸盐辛酯(Lys-8)、二赖氨酸二对甲苯磺酸盐癸酯(Lys-10)的产率最高，分别为83％、86％、83％、85％。提纯次数2次的产物，还存在少量三乙胺的残留。而提纯5次以上后，不同赖氨酸衍生的单体产率均显著减少到50％以下。
(4)考察步骤(3)基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物的合成中，单体二元羧酸二对硝基苯基酯单体(Nx)与二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体(Lys-y)的质量比对产物的影响
其它条件与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：以质量比为单因素变量，将步骤(3)基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物的合成中，单体二元羧酸二对硝基苯基酯单体(Nx)与二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体(Lys-y)质量比分别设置为1:2、1:1、5:4、6:5、3:2和2:1。
结果发现，单体二元羧酸二对硝基苯基酯单体(Nx)与二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体(Lys-y)比例为1:2和1:1时，反应物呈现均匀澄澈的溶液状，可以得到线性高分子产物；而当单体二元羧酸二对硝基苯基酯单体(Nx)与二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体(Lys-y)比例为5:4、6:5、3:2和2:1时，反应终产物呈现胶块状，得到网络状交联的聚合产物，该聚合产物难以直接溶于水中，而且也不利于其与蛋白多肽类药物在水溶液中通过静电作用相互结合，难以制备成药物递送纳米粒。
上述实施例中，所述水溶性蛋白多肽类药物除可以选择胰岛素、牛血清白蛋白外，也可以选择人血清白蛋白、人生长激素、干扰素(INF-α、INF-β、INF-γ)、组织纤溶酶原激活物(t-PA)、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL-1～IL-38)、免疫抑制剂(anti PD-1,anti PD-L1,anti CTLA-4等)、抗体、抗原多肽、鸡卵白蛋白OVA等水溶性蛋白类药物，亦能实现这些药物的高效装载传递和可控释药，其构建的功能化纳米递药体系能够保护亲水性蛋白多肽类药物的构象和生物活性免受外界环境破坏，可明显改善蛋白多肽类药物的药物半衰期和提高其生物利用度。实际应用中，可根据具体病症选择相应的水溶性蛋白类药物与基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物按照本发明的方法合成纳米递药体系，增强蛋白质药物的治疗效果的有效性、可控性和安全性。
申请人声明，以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.合成二元羧酸二对硝基苯基酯单体；
S2.合成二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体；
S3.将质量比为小于或等于1：1的二元羧酸二对硝基苯基酯单体和二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体加入反应溶剂中，65～85℃搅拌条件下逐滴加入三乙胺作为反应催化剂，在60～80℃下加热反应24～96h，得到具有良好水溶性的聚酯酰胺聚合物。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S1所述二元羧酸二对硝基苯基酯单体的制备方法为：将二元酰氯与2～3倍于二元酰氯当量的对硝基苯酚加入-85～-70℃的冰冻丙酮溶液中，逐滴加入2～3倍于二元酰氯当量的三乙胺，-85～-70℃搅拌反应1～5h后转至20～30℃搅拌10～16h，即可得到二元羧酸二对硝基苯基酯单体。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述二元酰氯选自乙二酰氯、丁二酰氯或辛二酰氯中的一种或几种；S1得到二元羧酸二对硝基苯基酯单体后，还用乙腈重结晶二元羧酸二对硝基苯基酯单体2～4次进行纯化，并于50～60℃下真空干燥至恒重。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2所述二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体的制备方法为：以对甲苯磺酸一水合物作为催化剂和氨基保护剂，将二元醇、2～3倍于二元醇当量的L-赖氨酸在苯中于90～130℃反应16～72h，即得二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体；
所述二元醇选自1,4-丁二醇、1,6-己二醇、1,8-辛二醇或癸二醇中的一种或几种；
所述对甲苯磺酸一水合物的添加量为L-赖氨酸当量的2～4倍。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，S2所述反应温度为100～110℃，反应时间为24～30h；S2得到二赖氨酸二对甲苯磺酸盐酯单体后，将其在70～80℃加热搅拌条件下溶解于异丙醇中，并在2～8℃条件下析出沉淀，重复2～4次，再于50～60℃真空干燥24～48h。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S3所述反应溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或二甲基亚砜溶液中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，S3得到聚酯酰胺聚合物溶液后，将其倒入预冷的乙酸乙酯中析出沉淀，弃上清，将产物用甲醇复溶，复提纯除杂3～4次后，将产物于50～60℃真空干燥24～48h。
8.权利要求1～7任一所述基于赖氨酸的聚酯酰胺聚合物在作为或制备水溶性蛋白多肽类药物载体材料中的应用。
9.一种基于权利要求1～7中任一所述聚酯酰胺聚合物的装载水溶性蛋白多肽类药物的纳米递药体系，其特征在于，所述纳米递药体系是由质量比为10～1000：1的聚酯酰胺聚合物与水溶性蛋白多肽类药物组成的球形纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述纳米递药体系，其特征在于，将所述聚酯酰胺聚合物水溶液与水溶性蛋白多肽类药物溶液按质量比混合后，涡旋分散1～10min，即可得到所述纳米递药体系；
所述水溶性蛋白多肽类药物选自胰岛素、血清白蛋白、生长激素、干扰素、组织纤溶酶原激活物、促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素、免疫抑制剂、抗体或抗原多肽中的一种或几种；
所述球形纳米颗粒的直径为20～200nm。
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