CN103421193A

CN103421193A - 聚酯酰胺与聚乙二醇嵌段共聚物及其制备方法

Info

Publication number: CN103421193A
Application number: CN2013102842531A
Authority: CN
Inventors: 邓明虓; 杜保国; 宋丽
Original assignee: Northeast Normal University
Current assignee: Northeast Normal University
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2013-07-09
Publication date: 2013-12-04

Abstract

本发明属于生物医用高分子材料领域，涉及一类新型聚酯酰胺与聚乙二醇嵌段共聚物及其制备方法。通过将具有氨基酸单元结构的聚酯酰胺与分子链末端带有氨基的聚乙二醇进行缩合反应，得到具有两亲性特性的三嵌段或多嵌段共聚物。该类嵌段共聚物具有良好的生物相容性和生物可降解性。通过选择具有不同化学结构的氨基酸、二元醇、二元酸（或二元酰氯）及不同分子量的聚乙二醇等，可实现对共聚物力学性能、降解行为的调节，本发明方法简单，这类新型共聚物可以在水中自组装成纳米颗粒，并实现对药物的包载与控制释放。

Description

聚酯酰胺与聚乙二醇嵌段共聚物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料领域，涉及一类新型聚酯酰胺与聚乙二醇嵌段共聚物及其制备方法。

背景技术

随着药物控制释放和组织工程技术的发展，生物降解聚合物作为药物载体越来越受到人们的重视。人们不断寻求药物释放性能更优良的聚合物材料，来满足临床研究和实际应用的要求。两亲性共聚物就是其中一类可生物降解的，且有良好生物相容性的功能高分子材料。两亲性共聚物是由亲水链段与疏水链段所构成的特殊嵌段共聚物。由于两种链段溶解性的差异，在水中能够自发的组装成具有核/壳结构的纳米级聚合物纳米颗粒。以聚合物纳米颗粒作为药物载体具有多种优点：（1）纳米颗粒的亲水表面增加了其在水中的溶解性，可有效的阻止蛋白质的吸附和网状内皮细胞的吞噬，延长药物在体内的循环时间；（2）纳米颗粒的自组装行为可以阻止疏水内核的聚集，并避免了因采用乳化剂与助溶剂所带来的附加毒性；（3）纳米颗粒的疏水内核可以通过化学键合、物理包埋、静电吸附等方式包裹多种药物，扩大了纳米颗粒载药的适用范围。

聚乙二醇（PEG）既溶于水又溶于有机溶剂，通常被作为亲水链段引入两亲性共聚物。PEG具有无毒性和良好的生物相容性，虽然在体内为不可生物降解的聚合物，但低分子量的PEG可被巨噬细胞所吞噬或经肾脏排出体外。PEG不具有免疫原性和抗原性，已通过美国食品与药品管理局(FDA)认可。研究表明PEG与药物结合可以有效的增加药物的水溶性和稳定性，延长药物在体内的循环时间。生物医用PEG可选择的分子量范围在500-15000，它们具有良好的成囊和成膜的性能。PEG在应用于医药和生物材料中时不会有毒副作用，但其缺点是亲水性太强,结晶性比较强。

由氨基酸、二醇以及二酸合成的聚酯酰胺其主链既具有酯键又具有酰胺键，是一类新型的可生物降解材料。与传统的脂肪族聚酯开环聚合的合成过程相比，聚酯酰胺采用亲核和亲电两种固体单体的溶液缩聚法，聚合方法相对简便，通过合理地控制二元酸对硝基苯酚酯单体过量，可获得聚合物链末端是硝基苯酚结构的聚酯酰胺低聚物，再进一步与其它具有不同结构的亲电化合物反应，可以获得带有各种官能团的高分子。本发明也利用了聚酯酰胺溶液缩聚的特殊性，首先合成具有反应活性的聚酯酰胺低聚物，再进一步与带有氨基的聚乙二醇反应合成两亲性嵌段共聚物，整个合成过程不需要采用在合成脂肪族聚酯与聚乙二醇中使用的二环己基碳二亚胺（DCC）缩合体系，简化了合成路线，提高了合成效率。

聚酯酰胺的溶液缩聚反应，受水和氧气的影响较小，不需要特殊的反应装置，从而降低的聚合物的合成成本。聚酯酰胺的分子结构特点，决定了这种聚合物即具有聚酰胺的易加工性能，又具有聚酯的生物可降解性能，并表现出独特的生物学特征，例如具有很低的免疫水平，能够促进内皮细胞黏附并增殖等。然而其分子结构也同时决定了聚酯酰胺是一种疏水性聚合物，无法自组装形成具有核壳机构的纳米颗粒进行包载药物。将聚乙二醇引入聚酯酰胺后，赋予了材料两亲性特点，并使其具有形成纳米颗粒的能力。

癌症一直是人类难以攻克的难题，发病率逐年攀升。目前治疗癌症的手段比较有限，并且在治疗过程中会带来其他毒副作用。阿霉素是一种广谱高效的抗肿瘤药物，对乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等都具有较显著的治疗效果，但其也有较高的心脏毒性和骨髓抑制毒性，在化疗过程中，有时甚至会危及患者的生命。因此开发安全的、具有生物相容性和可降解性的药物载体，对阿霉素的临床应用具有重大的意义。将阿霉素等疏水性药物包载于本发明提供的聚合物纳米颗粒中，既可以提高其药效，又可以减小毒副作用，并有望扩大阿霉素在临床上的治疗范围。

发明内容

本发明的目的是公开一种聚乙二醇-聚酯酰胺-聚乙二醇两亲性三嵌段共聚物，其中聚酯酰胺嵌段的聚合度是1-50，分子量范围在100- 30000；聚乙二醇单甲醚的聚合度是2-250，分子量范围在80-11000；共聚物的总分子量范围在1000-1000000。

本发明的另一个目的是公开一种聚酯酰胺与聚乙二醇两亲性交替多嵌段共聚物，其中聚酯酰胺嵌段的聚合度是1-50，分子量范围在100- 30000；聚乙二醇的聚合度是2-250，分子量范围在80-11000；共聚物的聚合度是1-100，总分子量范围在1000-1000000。

本发明的第三个目的是公开上述两种两亲性嵌段共聚物的制备方法，该合成过程首先将亲核单体与亲电单体进行预聚，再与具有末端氨基的聚乙二醇单甲醚或具有双末端氨基的聚乙二醇进行缩合反应。

本发明的第四个目的是提供一种上述嵌段共聚物的用途，即将嵌段共聚物制备成具有核壳结构的纳米颗粒，并对抗癌药物阿霉素进行包载的方法。

本发明解决问题采用的技术方案是：

1. 聚乙二醇-聚酯酰胺-聚乙二醇两亲性三嵌段共聚物的合成方法，其特征是包括以下合成步骤：（1）将分子量为80-11000的聚乙二醇单甲醚的端羟基化学修饰成氨基；（2）二元醇、氨基酸与对苯二甲酸在甲苯中回流6-48小时，过滤除去甲苯，将制得的二元醇二氨基酸酯对甲苯磺酸盐（亲核单体）重结晶2-6次，30-80℃下真空干燥至恒重；（3）将二元酰氯丙酮溶液滴入含有过量对硝基苯酚与三乙胺在丙酮溶液中，反应在搅拌条件下进行6-48小时，过滤后将得到的二元酸对硝基苯酚酯（亲电单体）重结晶2-6次，再次过滤后30-80℃下真空干燥至恒重；（4）将摩尔投料比例为1：2至49：50的亲核单体与亲电单体加入三乙胺的二甲基乙酰胺溶液中，在40-100℃下进行溶液预聚4-48小时，得到的聚酯酰胺预聚物的聚合度是1-50，分子量范围在100-30000，在预聚物溶液中进一步加入其2倍物质的量的末端氨基聚乙二醇单甲醚，在40-100℃下继续反应4-48小时制备得到聚乙二醇-聚酯酰胺-聚乙二醇两亲性三嵌段共聚物，将制备得到的嵌段共聚物沉淀于乙酸乙酯，过滤后30-80℃下真空干燥至恒重。

2. 聚酯酰胺与聚乙二醇两亲性交替多嵌段共聚物的合成方法，其特征是包括以下合成步骤：（1）将分子量为80-11000的聚乙二醇的双端羟基化学修饰成氨基；（2）采用上述得到的亲核单体与亲电单体按照摩尔投料比例为1：2至49：50的亲核单体与亲电单体加入三乙胺的二甲基乙酰胺溶液中，在40-100℃下进行溶液预聚4-48小时，得到的聚酯酰胺预聚物的聚合度是1-50，分子量范围在100-30000，在预聚物溶液中进一步加入与其等物质的量的双末端氨基聚乙二醇，在40-100℃下继续反应4-48小时制备得到聚酯酰胺与聚乙二醇两亲性交替多嵌段共聚物，将制备得到的嵌段共聚物沉淀于乙酸乙酯，过滤后30-80℃下真空干燥至恒重。

3. 包载阿霉素的嵌段共聚物纳米颗粒的制备方法，其特征是包括以下步骤：将上述合成的嵌段共聚物与阿霉素盐酸盐溶于含有三乙胺的二甲基甲酰胺中，搅拌1-4小时后，将溶液缓慢的滴入超纯水中，再持续搅拌4-48小时，将获得的纳米颗粒通过透析袋透析12-48小时，高速离心分离，将产物进行冷冻干燥。

本发明的优点是：

1. 采用溶液缩聚法先合成聚酯酰胺低聚物，该低聚物不需要进行分离提纯，通过进一步在原反应体系中加入分子链末端带有氨基的聚乙二醇即可获得两亲性嵌段共聚物，合成方法合理、且步骤简单。

2. 本发明提供的共聚物材料新颖，具有良好的生物可降解性和生物相容性，各种性能可以通过改变共聚物组分的方法进行方便且有效的调节。这些特有的性能扩大了材料的应用范围，克服了传统脂肪族聚酯-聚乙二醇共聚物结构与性能单一的缺点。

3. 利用共聚物的两亲性特点，可以将其制备成纳米颗粒。进一步包载阿霉素等药物后，可增加药物的溶解性和体内循环时间，有利于降低药物的毒副作用，实现药物的长期恒量释放。

附图说明

图1是聚酯酰胺（嵌段分子量2000）与mPEG₄₅-NH₂（分子量2000的末端氨基聚乙二醇单甲醚）合成两亲性三嵌段共聚物的反应方程式；

图2是聚酯酰胺（嵌段分子量2000）与mPEG₄₅-PEA-mPEG₄₅的¹H NMR 对比谱图；

图3是聚酯酰胺（嵌段分子量2000）与mPEG₄₅-PEA-mPEG₄₅的红外光谱对比谱图；

图4是纳米颗粒包载芘后的荧光激发光谱I₃₄₀/I₃₃₆强度比与mPEG₄₅-PEA-mPEG₄₅浓度对数（Log C）的关系；

图5是阿霉素载药颗粒在37 ℃的PBS缓冲溶液中的药物累积释放曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护产生任何限制。

实施例1：具有末端氨基的聚乙二醇的合成。

分子量为2000的聚乙二醇单甲醚（mPEG₄₅-OH）末端羟基修饰成氨基。具体的合成方法是：

取30 g mPEG₄₅-OH加入300 mL甲苯中共沸除水，4小时后蒸馏出多余甲苯，向反应瓶中加入干燥的200 mL二氯甲烷及10.50 mL三乙胺，在搅拌条件下通过恒压滴液漏斗加入4.65 mL甲基磺酰氯的25 mL二氯甲烷溶液，反应进行24小时后，过滤除去产生的三乙胺盐酸盐，将反应溶液用NaCl溶液洗涤三次，分液，用无水NaSO₄干燥溶液，过滤，旋转蒸发浓缩后用乙醚沉降得到聚乙二醇单甲醚甲磺酸酯（mPEG₄₅-Ms），40℃下真空干燥至恒重，产率为91%

将得到的25 g mPEG₄₅-Ms加入溶解有30 g氯化铵的500 mL浓氨水溶液中，40℃进行氨解72小时，反应结束后向溶液中加入氯化钠至饱和，用75 mL氯仿萃取三次，将氯仿溶液用无水硫酸镁干燥，旋转蒸发浓缩后用乙醚沉降得到具有末端氨基的聚乙二醇单甲醚（mPEG₄₅-NH₂），40℃下真空干燥至恒重，产率为89%。

以分子量为2000的聚乙二醇（OH-PEG₄₅-OH）制备双末端氨基聚乙二醇（NH₂-PEG₄₅-NH₂）的合成方法与上述方法相同。其中Ms-PEG₄₅-Ms的产率为83%，NH₂-PEG₄₅-NH₂的产率为76%。

实施例2：用于制备聚酯酰胺低聚物的癸二酸对硝基苯酚酯（亲电单体）与1,6-己二醇二苯丙氨酸酯对甲苯磺酸盐（亲核单体）的合成。

癸二酸对硝基苯酚酯（亲电单体）按如下所示合成路线合成。具体的合成方法是：

取对硝基苯酚43.00 g和43.13 mL三乙胺溶解于500 mL 丙酮中，将溶液置于0℃冰水浴中冷却。将28.54 mL癸二酰氯溶解于100 mL 丙酮中，滴入对硝基苯酚溶液中，反应逐渐升温至室温在搅拌条件下进行12小时。反应结束后，倒入2000 mL 蒸馏水中析出产物，抽滤，用乙酸乙酯重结晶3次，40℃下真空干燥至恒重，产率为75%。

1,6-己二醇二苯丙氨酸酯对甲苯磺酸盐（亲核单体）按如下所示合成路线合成。具体的合成方法是：

取25.00g苯丙氨酸、31.70 g一水合对甲苯磺酸和8.80 g 1,6-己二醇加入装有300 mL 甲苯的圆底烧瓶中，烧瓶上端接有分水器。反应在搅拌条件下回流24小时后降温至室温，抽滤后，用蒸馏水重结晶3次，40℃下真空干燥至恒重，产率为79%。

实施例3：聚酯酰胺与mPEG₄₅-NH₂两亲性三嵌段共聚物（mPEG₄₅-PEA-mPEG₄）的合成。

通过溶液缩聚，采用改变亲核与亲电单体的物质的量比例，实现对聚酯酰胺链段的分子量进行控制。本实施例中所合成的聚酯酰胺链段分子量为2000，具体的合成方法是：

在氮气保护下，取1,6-己二醇二苯丙氨酸酯对甲苯磺酸盐0.50 g、癸二酸对硝基苯酚酯0.37 g （亲核与亲电单体物质的量比4：5）加入10 mL反应瓶中，将0.20 mL 三乙胺与0.13 mL 二甲基乙酰胺加入反应瓶，在搅拌条件下升温至80℃，反应12小时，将0.66 g mPEG₄₅-NH₂加入反应瓶继续反应12小时后，将反应温度降至室温，向反应瓶中加入4 mL二甲基甲酰胺使聚合物完全溶解，将溶液滴入冷却的乙酸乙酯中使聚合物沉淀，抽滤分离后，将聚合物溶解于氯仿中，再次沉淀于乙酸乙酯中，过滤后，40℃下真空干燥至恒重，产率为65%。反应方程式如附图1所示。在如附图2所示的共聚物核磁共振谱图中，出现了属于聚酯酰胺链段和聚乙二醇单甲醚的峰，证实了三嵌段共聚物的化学结构。同时，附图3所示的共聚物红外光谱中，1100波数处出现了聚乙二醇醚键的吸收峰。

实施例4：聚酯酰胺与NH₂-PEG₄₅-NH₂两亲性交替多嵌段共聚物的合成。

本实施例中所合成的聚酯酰胺链段分子量为3000，具体的合成方法是：

在氮气保护下，取1,6-己二醇二苯丙氨酸酯对甲苯磺酸盐1.50 g、癸二酸对硝基苯酚酯1.06 g （亲核与亲电单体物质的量比5：6）加入25 mL反应瓶中，将1.2 mL 三乙胺与1.8 mL 二甲基乙酰胺加入反应瓶，在搅拌条件下升温至80℃，反应12小时，将0.79 g NH₂-PEG₄₅-NH₂加入反应瓶继续反应12小时后，将反应温度降至室温，向反应瓶中加入4 mL二甲基乙酰胺使聚合物完全溶解，将溶液滴入冷却的乙酸乙酯中使聚合物沉淀，抽滤分离后，加入氯仿溶解，再加入乙酸乙酯使聚合物沉淀，抽滤后，40℃下真空干燥至恒重。

实施例5：mPEG₄₅-PEA-mPEG₄₅三嵌段共聚物纳米颗粒的制备及临界胶束浓度（CMC）的测定。

将10 mg实例3制备的mPEG₄₅-PEA-mPEG₄₅三嵌段共聚物溶于2 mL二甲基甲酰胺中，室温下搅拌1小时，然后在搅拌条件下以5秒/滴的速度缓慢滴入3 mL超纯水中，再持续搅拌12小时后，将获得的纳米颗粒通过透析袋透析24小时以除去溶剂，最后定容至10 mL，得到浓度为1 mg/mL的纳米颗粒溶液。

以芘为荧光探针，将上述制备好的纳米颗粒逐步稀释成一系列浓度（按照1×（1/2）^n-1梯度稀释，其中n=1-15）每个浓度中所加芘的浓度都为6×10^-7mol/L。固定最大发射波长为390nm，扫描芘的激发光谱。测试设置三次重复，所得数据取平均值。结合激发光谱，计算每个浓度的340nm和336nm处吸收峰的强度比，即I₃₄₀/I₃₃₆。将每个浓度下的I₃₄₀/I₃₃₆与相对应浓度的对数作图，得到如附图4所示的S型曲线。CMC数值可由水平切线和斜线切线的交点确定，本发明所得三嵌段共聚物的CMC值为5.12×10^-3mg/mL。

实施例6：mPEG₄₅-PEA-mPEG₄₅三嵌段共聚物载阿霉素纳米颗粒的制备。

将50 mg实例3制备的mPEG₄₅-PEA- mPEG₄₅三嵌段共聚物和10 mg阿霉素盐酸盐溶于2 mL二甲基甲酰胺中，再持续搅拌1小时,将溶液以5秒/滴的速度缓慢滴入3 mL超纯水中，再搅拌12小时后，将获得的纳米颗粒通过透析袋透析24小时，高速离心分离，将产物进行冷冻干燥。

实施例7：纳米颗粒作为阿霉素载体的载药量、包封率及体外药物释放性能评价

取阿霉素配制成1 mg/mL的二甲基甲酰胺溶液，并按照1×（1/2）^n-1（n=1-15）将溶液稀释成一系列浓度梯度，将溶液进行紫外光谱测定并计算光谱中485 nm处的吸收峰强度变化，得到标准曲线。将实例6得到的载有阿霉素的纳米颗粒配成1 mg/mL的二甲基甲酰胺溶液，测定紫外光谱中485 nm处的吸收峰强度，参考标准曲线得到纳米颗粒中阿霉素的质量，将所测得的数据代入以下两方程得到载药量和包封率。实验所获得的载药量为88.29%、包封率为14.72%。

取实例6得到的载药纳米颗粒10 mg，用PBS缓冲溶液（pH=7.4）稀释至1 mg/mL，将溶液转移至截留分子量为3600的透析袋中，使其浸没于90 mL PBS缓冲溶液后，放置于37 ℃的振荡器中进行震荡，按照预先设定的时间间隔，抽取2.0 mL透析袋外缓冲溶液进行紫外光谱测定，以485 nm处的吸收峰强度计算阿霉素释放量，所得结果如附图5所示。

Claims

1.一种聚乙二醇-聚酯酰胺-聚乙二醇的两亲性三嵌段共聚物，其特征是:嵌段共聚物具有如下式所示的ABA结构：

R₁为碳链长度为C₁～C₂₀的烷基；

R₂为碳链长度为C₁～C₂₀的烷基；

m为1-50的整数；

n为2-250的整数；

R为氨基酸残基；

A为聚酯酰胺嵌段；

B为聚乙二醇单甲醚嵌段。

2.根据权利要求1、所述的嵌段共聚物，其特征是A或A`嵌段的重复单元数m为1-50，分子量范围在100-30000；B或B`嵌段的重复单元数n为2-250，分子量范围在80-11000；嵌段共聚物的总分子量范围在1000-1000000，构成聚酯酰胺A或A`嵌段来自于二元羧酸和二元醇的R₁与R₂基团是由1-20个碳原子组成的直链或支链的饱和或不饱和烷基。

3.根据权利要求1、所述的嵌段共聚物，其特征是用于制备A或A`嵌段所涉及到的氨基酸及其衍生物包括有：亮氨酸Leu、丙氨酸Ala、色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe、异亮氨酸Ile、甘氨酸Gly、精氨酸Arg、缬氨酸Val、甲硫氨酸Met、γ-苄基-L-谷氨酸酯、γ-甲基-L-谷氨酸酯、β-苄基-L-天门冬氨酸酯、β-甲基-L-天门冬氨酸酯、O-苄基-L-丝氨酸、N(ε)-苄氧羰基-赖氨酸、N(ε)-叔丁氧羰基-赖氨酸等。

4.根据权利要求1所述的嵌段共聚物的制备方法，其特征是该制法包括以下步骤：

a.二元醇、氨基酸与对苯二甲酸在回流条件下制备得到二元醇二氨基酸酯对甲苯磺酸盐亲核单体；

b.二元酰氯与对硝基苯酚在溶液中制备得到二元酸对硝基苯酚酯亲电单体；

c.合成具有末端氨基的聚乙二醇单甲醚；

d.将计算量的亲核单体与亲电单体在溶液中预聚4-48小时，所得到的聚酯酰胺低聚物不需要从反应溶液中分离，进一步加入具有末端氨基的聚乙二醇单甲醚继续反应4-48小时制备得到聚乙二醇-聚酯酰胺-聚乙二醇ABA两亲性三嵌段共聚物。

5.一种聚酯酰胺-聚乙二醇两亲性交替多嵌段共聚物，其特征是:嵌段共聚物具有如下式所示的(A`B`)x结构：

R₁为碳链长度为C₁～C₂₀的烷基；

R₂为碳链长度为C₁～C₂₀的烷基；

m为1-50的整数；

n为2-250的整数；

R为氨基酸残基；

A`为聚酯酰胺嵌段；

B`为聚乙二醇嵌段；

x为嵌段重复数。

6.根据权利要求5所述的嵌段共聚物，其特征是A或A`嵌段的重复单元数m为1-50，分子量范围在100-30000；B或B`嵌段的重复单元数n为2-250，分子量范围在80-11000；嵌段共聚物的总分子量范围在1000-1000000，是构成聚酯酰胺A或A`嵌段来自于二元羧酸和二元醇的R₁与R₂基团是由1-20个碳原子组成的直链或支链的饱和或不饱和烷基。

7.根据权利要求5所述的嵌段共聚物，其特征是用于制备A或A`嵌段所涉及到的氨基酸及其衍生物包括有：亮氨酸Leu、丙氨酸Ala、色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe、异亮氨酸Ile、甘氨酸Gly、精氨酸Arg、缬氨酸Val、甲硫氨酸Met、γ-苄基-L-谷氨酸酯、γ-甲基-L-谷氨酸酯、β-苄基-L-天门冬氨酸酯、β-甲基-L-天门冬氨酸酯、O-苄基-L-丝氨酸、N(ε)-苄氧羰基-赖氨酸、N(ε)-叔丁氧羰基-赖氨酸等。

8.根据权利要求1所述的嵌段共聚物的制备方法，其特征是该制法包括以下步骤：

c.合成具有末端氨基的聚乙二醇单甲醚；

9.根据权利要求1所述的嵌段共聚物用于制备包载油溶性药物的纳米颗粒。

10.根据权利要求5所述的嵌段共聚物用于制备包载油溶性药物的纳米颗粒。