CN1869099A

CN1869099A - 由聚肽－b－聚四氢呋喃－b－聚肽三嵌段共聚物制备纳米及微米级自组装体

Info

Publication number: CN1869099A
Application number: CNA2006100787737A
Authority: CN
Inventors: 冯增国; 田振; 李海宾; 张爱英
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing University of Technology; Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2006-05-12
Filing date: 2006-05-12
Publication date: 2006-11-29
Anticipated expiration: 2026-05-12
Also published as: CN100389140C

Abstract

本发明是一种由ABA型聚肽－b－聚四氢呋喃－b－聚肽三嵌段共聚物制备纳米及微米级组装体的方法。本发明中所用的三嵌段共聚物是以端氨基聚四氢呋喃为引发剂引发由保护基保护的氨基酸与三光气生成的α－氨基酸－N－羧基内酸酐(NCA)进行开环聚合，然后再经过脱保护基反应得到的。根据NCA与引发剂的摩尔投料比，以及大分子引发剂分子量的不同，能够制备不同组成的ABA型三嵌段共聚物，其中B段为低玻璃化温度的疏水性聚四氢呋喃嵌段，A段为亲水性聚肽均聚物嵌段。所得到的三嵌段共聚物可以溶解于不同pH和盐浓度的水溶液中得到粒径不同的纳米及微米级自组装体。该自组装体可用于药物控释，基因转染治疗，诊断试剂，纳米反应器，化学污染物回收处理，食品及化妆品等行业。

Description

由聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物制备纳米及微米级自组装体

技术领域

本发明主要涉及一类由聚四氢呋喃为中心嵌段的聚醚聚肽三嵌段共聚物制备纳米及微米级自组装体的方法。

背景技术

所谓自组装就是在没有人为干预的条件下体系自动将各组件组织成图案或结构的过程，从而获得具有特殊功能的材料与器件。有机合成高分子的自组装是当前纳米科学与技术领域的重要研究内容之一。相对于小分子表面活性剂而言，两亲性嵌段共聚物具有临界胶束浓度低、分子结构可设计性强等一系列优点，因而其自组装行为格外引人关注。近年来，人们在对溶液中两亲性聚合物自组装行为进行大量基础研究的同时，也在不断寻求将其用于药物控释，基因转染治疗，疾病诊断，纳米反应器，化学污染物回收处理，以及食品及化妆品等行业(Prog.Polym.Sci.2003，28：1107；Prog.Polym.Sci.2005，30：691)。

化学合成聚氨基酸或聚肽化合物具有与天然蛋白质或多肽相似的结构与性质，显示出与细胞和组织良好的生物相容性；同时由于聚肽主链上存在大量肽键，在机体内极易受到酶的作用，从而能降解生成无毒的小肽或氨基酸产物，能够被机体吸收和代谢，因而具有优良的生物降解性和安全性。由于聚氨基酸具有丰富的二级结构，其自组装体在不同外界环境刺激下可以表现出不同的形态与功能。因此，含有多肽组分的自组装体的制备与应用愈来愈受到人们的青睐。林嘉平等(Macromo.Rapid.Commun，2004，25：1241)用三乙胺引发γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧基内酸酐制备了均聚(γ-苄基-L-谷氨酸)，然后通过酯交换反应将亲水性嵌段聚乙二醇接枝在均聚肽链上，并研究了其自组装行为。Jeong等(Polymer，2003，44：583)制备了两亲性可生物降解的聚天冬氨酸-g-聚己内酯共聚物，并制备出相应的聚合物胶束。这些两亲性聚肽嵌段共聚物呈现出优异的生物相容性、可降解性，以及自组装性质，预示着它们在生物医用材料领域中将有着广泛的用途。

含有聚肽的两亲性嵌段共聚物，根据化学组成和所处溶液环境的不同，可以自组装成纳米及微米级囊泡、胶束、线、带等不同形态的自组装体(J.Am.Chem.Soc.，2005，127：12423)。聚肽的自组装行为为开发新型药物载体提供了巨大的发展空间，能够赋予药物可控释、靶向输送、不溶性药物吸收率大大提高等诸多优点。经脱除保护基处理后的聚肽更是提供了大量可供进一步进行化学修饰的反应基团，如氨基，羧基，羟基等，在这些基团上接枝上像紫杉醇，阿霉素等抗癌药物可制成大分子前体药物，不仅能够大大降低抗癌药物的毒性，而且还可提高药物在肿瘤部位的蓄积浓度，明显改善药物的治疗效果(Angew.Chem.Int.Ed，2006，45：1198)。另外，聚赖氨酸及其共聚物等在基因转染中扮演着高分子载体的作用，通过与外源性基因复合形成纳米颗粒，通过细胞壁的胞饮作用进入细胞核内而发挥治疗作用，在治疗与遗传有关的疑难病症以及癌症治疗方面将发挥重要作用。合成聚肽材料作为药物控释和基因转染载体材料，已成为目前合成生物医用高分子研究领域的重要方向(Nature Review Drug Discovery，2005，4：581)。

囊泡是由两亲分子所构成的一种有序结构，具有由密闭双分子层所形成的球形或椭球形的单室或多室结构。由于它在生命体中可以自发形成，所以这种有序体有着独特的生理性质和超分子结构，如它有一个水溶性的内核，其密闭层非常类似于细胞膜，因而可以用来进行细胞膜的生物模拟。囊泡特殊的双层膜结构也使其成为理想的体内药物载体(CN1475205，2004)，其既可以携带水溶性药物，将药物包封在微水相内，同时也可以携带油溶性或难溶性药物，将药物增溶在双层膜内。与胶束、微乳液等体系相比，囊泡作为药物载体还具有药物负载量大、结构相对稳定、尺寸和药物渗透率易调等优点(Science，2002，297：967)。另外囊泡在诊断试剂(CN101775，1988)和食品与化妆品行业(日用化学工业，1998，28(5)：8；CN1308624，2001)中也显示出良好的应用前景。

本发明的目的在于通过ABA型聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物的自组装作用制备得到一种尺寸可调、pH值稳定的纳米及微米级自组装体。该组装体一般为囊泡结构。

发明内容

本发明目的旨在提供一种由ABA型聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物制备纳米及微米级自组装体的方法。具体制备步骤如下：

a)以无水四氢呋喃为溶剂，将保护基保护的氨基酸及其衍生物与三光气反应生成相应的NCA，然后产物用无水石油醚沉淀，过滤，干燥。

b)以无水N，N-二甲基甲酰胺、三氯甲烷、四氢呋喃等为溶剂，在无水、无氧条件下以端氨基聚四氢呋喃为大分子引发剂引发相应氨基酸的NCA开环聚合形成ABA型聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，再用相应的沉淀剂沉淀出产物，然后真空干燥。通过调节端氨基聚四氢呋喃大分子引发剂的分子量及其与不同氨基酸NCA的摩尔投料比，可以得到不同分子量、不同组成的三嵌段共聚物。

c)根据b)中合成的三嵌段共聚物的不同，采取相应的脱保护基方法，制得相应的三嵌段共聚物。

d)把由c)制得的三嵌段共聚物在搅拌条件下，溶于不同pH值和盐浓度的水中，或者是先溶解于有机溶剂中，然后在不同pH值和盐浓度的水溶液中进行透析，最终制得纳米及微米级自组装体。

上述制备方法中，不同氨基酸及其衍生物首先通过重结晶得到纯度符合聚合要求的原料。

上述制备方法中，不同氨基酸NCA的制备，温度一般可控制在25℃～65℃反应，时间为0.5～6小时。

上述制备方法中，不同氨基酸NCA分别用无水乙酸乙酯/无水石油醚重结晶多次，熔点与文献值相符，元素分析实测值与理论值相差小于3‰。真空条件下保存待用。

上述制备方法中，端氨基聚四氢呋喃大分子引发剂在60℃～140℃下真空干燥2～12小时，然后降至室温。

上述制备方法中，端氨基聚四氢呋喃引发NCA开环聚合反应时间为48～96小时，反应温度范围20℃～60℃。

上述制备方法中，沉淀剂的选择可以是甲醇、乙醚或者水。沉淀出的ABA型聚肽b-聚四氢呋喃-b-聚肽嵌段共聚物，然后在20℃～60℃下真空干燥24小时，得最终产物。

上述制备方法中，脱保护基的方法对于聚肽嵌段为谷氨酸，天门冬氨酸及其衍生物的聚合物来说，可以是酸解、碱解或者是催化加氢。对于聚肽嵌段为赖氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，精氨酸及其衍生物的聚合物来说可以是酸解或者碱解。保护基脱除率大于95％。

上述制备方法中，最终所制得的自组装体一般具有囊泡结构。通过控制不同的嵌段组成和选取自组装的环境，制得的自组装体尺寸在1nm～500μm可调。

下面的实施方式举例，可以使相关人员更加深入的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。

具体实施方式

实施例1

聚(L-赖氨酸)-b-聚四氢呋喃-b-聚(L-赖氨酸)(PLL-PTHF-PLL)自组装体的制备

首先将0.13mmol端氨基聚四氢呋喃(数均分子量为1100g/mol)加到烧瓶中，在120℃下真空干燥2小时，自然冷却至室温，然后加入20mlN，N-二甲基甲酰胺溶解。然后在无水、惰性气体保护下，使干燥后的端氨基聚四氢呋喃与溶于40ml N，N-二甲基甲酰胺中的7.8mmolγ-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧基内酸酐(BZL-Lys NCA)混合。在室温下，连续搅拌反应72小时。反应结束后将反应液缓慢滴加到过量的无水乙醚中，有白色沉淀生成，过滤，洗涤，40℃下真空干燥24h，得到聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)₃₀-b-聚四氢呋喃-b-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)₃₀(PZLL₃₀-PTHF-PZLL₃₀)。将0.2g PZLL₃₀-PTHF-PZLL₃₀溶于2ml三氟乙酸中，加入0.75ml 33％的HBr的乙酸溶液，室温下搅拌一个小时。将所得溶液加入到无水乙醚中，得到淡黄色固体。过滤后，用无水甲醇溶解滤出物，再用乙醚沉淀。得到的产物用去离子水透析三天后，冷冻干燥，得到脱除保护基的嵌段共聚物PLL₃₀-PTHF-PLL₃₀。利用类似的方法，调节投料比例，可以制备出不同嵌段长度的共聚物，结果如表1所示。

表1 合成PZLL-PTHF-PZLL的分析表征结果

表1中M/I指单体BZL-Lys NCA与端氨基聚四氢呋喃的摩尔比；产率为聚合物重量与端氨基聚四氢呋喃和BZL-Lys NCA单体投料总重量之比；DP(PZLL)为由¹H-NMR测定得到的聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)嵌段的聚合度；

为由¹H-NMR测定得到的PZLL-PTHF-PZLL三嵌段聚合物的数均分子量；

由¹H-NMR测定得到的脱除保护基后PLL-PTHF-PLL三嵌段聚合物的数均分子量。

将得到的三嵌段共聚物溶于1000倍的蒸馏水中，室温下剧烈搅拌48hr，得到含有自组装体的溶液。经仔细制样后在透射电镜下观察为半径20～25nm的空心球结构。

实施例2

聚(L-谷氨酸)-b-聚四氢呋喃-b-聚(L-谷氨酸)(PLGA-PTHF-PLGA)自组装体的制备

首先将0.15mmol端氨基聚四氢呋喃(数均分子量为1100g/mol)加到烧瓶中，在120℃真空干燥2小时，自然冷却至室温，然后加入20mlN，N-二甲基甲酰胺溶解。然后在无水、惰性气体保护下，使之与3.0mmol的γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧基内酸酐(BLG-NCA)的40ml N，N-二甲基甲酰胺溶液混合。在室温下，连续搅拌反应72小时。反应结束后将反应液缓慢滴加到过量的无水甲醇中，有白色沉淀生成，过滤，洗涤，40℃下真空干燥24h，得到聚(γ-苄基-L-谷氨酸)₈-b-聚四氢呋喃-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸)₈(PBLG₈-PTHF-PBLG₈)。将1.0gPBLG₈-PTHF-PBLG₈溶于30ml DMF∶THF＝1∶1的混合溶剂中，然后将50mg Pd/C和15mL甲醇的悬浊液加入上述溶液中。剧烈搅拌下，通氢气鼓泡3天。然后过滤除去Pd/C粉末，将溶液倒入过量的乙醚中，所得沉淀物在40℃下真空干燥24h，得三嵌段共聚物PLGA₈-PTHF-PLGA₈。利用类似的方法，调节投料比例，可以制备不同嵌段长度的共聚物PLGA-PTHF-PLGA，结果如表2所示。

表2 合成PLGA-PTHF-PLGA的分析表征结果

上表中M/I指单体BLG-NCA与端氨基聚四氢呋喃的摩尔比；产率为聚合物重量与端氨基聚四氢呋喃和BLG-NCA单体投料总重量之比；DP(PBLG)为由¹H-NMR测定得到的聚(γ-苄基-L-谷氨酸)的聚合度；为由¹H-NMR测定得到的PBLG-PTHF-PBLG三嵌段聚合物的数均分子量；

由¹H-NMR测定得到的脱除保护基后PLGA-PTHF-PLGA三嵌段聚合物的数均分子量。

将0.5g三嵌段共聚物溶于100ml DMF中，配成5mg/ml的溶液.在剧烈搅拌下以10～15s/滴的速度缓慢加入约相当于原溶液25％的H₂O，继续搅拌24h，然后一次性加入约25ml H₂O，将溶液加入透析袋(透析袋的截留分子量为1000)，用蒸馏水透析48hr，得含有自组装体的溶液。

Claims

1、一种由ABA型聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物制备纳米及微米级自组装体的方法，此方法包括：

(a)共聚物中间嵌段部分为低玻璃化温度的疏水性聚四氢呋喃。

(b)共聚物两端的嵌段部分为聚肽均聚物。该嵌段是由端氨基聚四氢呋喃作为大分子引发剂引发由保护基保护的氨基酸-N-羧基内酸酐(NCA)进行开环聚合，然后再经过脱除保护基反应后得到的。可以通过NCA与引发剂摩尔投料比变化来控制该嵌段的分子量或嵌段长度。

(c)将该聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物溶解于不同pH和盐浓度的水溶液中，通过自组装相互作用即可得到不同粒径的纳米及微米级自组装体。

该自组装体可用于药物控释，基因转染治疗，诊断试剂，纳米反应器，化学污染物回收处理，食品及化妆品等行业。

2、根据权利要求1的聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中所述的端氨基聚四氢呋喃的分子量范围从800至10,000可变。

3、根据权利要求1的聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中聚肽嵌段可由保护基保护的氨基酸-N-羧基内酸酐通过开环聚合及脱除保护基反应制备得到。而氨基酸-N-羧基内酸酐可由各种保护基保护的氨基酸及其衍生物与三光气反应制备得到，所涉及到的氨基酸及其衍生物包括有赖氨酸(Lys)及其衍生物，如ε-苄氧羰基赖氨酸，ε-叔丁氧羰基赖氨酸，ε-芴甲氧羰基赖氨酸，ε-三氟乙酰基赖氨酸等；谷氨酸(Glu)及其衍生物，如γ-苄基谷氨酸酯，γ-甲基谷氨酸酯，γ-乙基谷氨酸酯等；还包括有天门冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、精氨酸(Arg)及其衍生物等。

4、根据权利要求1的聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中该共聚物中聚肽嵌段的分子量范围从1000至50,000可变。

5、根据权利要求1的聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，在制备过程中其保护基的脱除方法随所用单体的不同而变化，包括酸解、碱解、催化加氢等方法。

6、根据权利要求1的由聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物制备纳米及微米级自组装体的方法包括直接将三嵌段共聚物溶解于不同pH值或不同盐浓度水溶液，或者是先溶解于有机溶剂中，然后在不同pH值和盐浓度的水溶液中进行透析。

7、根据权利要求1的自组装体可以存在于不同pH值的水溶液中。其中水溶液中氢离子的浓度范围是0～30mol/L。

8、根据权利要求1的自组装体可以存在于不同浓度的盐溶液中。其中的盐是可在水中电离为化合价为+1～+3的金属离子和化合价为-3～-1的阴离子所组成。盐的浓度为0～30mol/L。

9、根据权利要求1的自组装体在溶剂去除之后，仍可以以干态形式存在。

10、根据权利要求1的自组装体一般为尺寸1nm～500μm的中空囊泡，该囊泡的囊泡壁内外两层由聚肽嵌段组成，中间层由聚四氢呋喃嵌段构成。