CN102341409A - 结晶胰岛素-缀合物 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了结晶胰岛素-缀合物。本公开内容也提供了包含这些结晶胰岛素-缀合物的制剂、它们的治疗方法、施用方法和制备方法。

Description

结晶胰岛素-缀合物

相关申请

本申请要求2009年1月28日提交的美国临时申请号 61/147,878、2009年3月12日提交的美国临时申请号 61/159,643、2009年3月20日提交的美国临时申请号 61/162,107、2009年3月25日提交的美国临时申请号 61/163,084、2009年6月24日提交的美国临时申请号 61/219,896、2009年6月24日提交的美国临时申请号61/219,897、2009年7月7日提交的美国临时申请号 61/223,572、和2009年10月19日提交的美国临时申请号 61/252,857的优先权，它们各自的内容通过引用整体并入本文。

背景技术

在现有技术中已知的大多数“控释”药物递送系统 (例如，Sears的美国专利号4,145,410，它描述了来自酶不稳定的胶囊的药物释放)不能以与人体中存在的分子指示剂(例如，代谢物)的量成正比的间隔和浓度给患者提供药物。在这些现有技术系统中的药物因而不是精确“受控的”，而是简单地以独立于外部或内部因素的缓释形式提供。

用注射型胰岛素治疗糖尿病是一个众所周知且经过研究的实例，其中胰岛素的失控的缓释是不希望的。实际上，显而易见，简单的激素置换不足以预防与该疾病有关的病理学结局。认为这些结局的发展反映出不能提供与患者经历的不同血糖浓度成比例的外源性胰岛素。为了解决该问题，已经提出了开发更接近生理学的胰岛素递送系统的几个生物学和生物工程方案 (例如，参见：Brownlee 等人的美国专利号4,348,387; Taylor 等人的美国专利号 5,830,506、5,902,603,和6,410,053，和Zion 等人的美国专利申请公开号 2004-0202719)。

这些系统中的每一个依赖于多价葡萄糖结合分子 (例如，凝集素Con A)和被该多价葡萄糖结合分子可逆地结合的基于糖的组分的组合。不幸的是，Con A和许多其它的可容易得到的凝集素具有淋巴细胞增殖的潜力。通过结合在某些类型的淋巴细胞的表面上的碳水化合物受体，这些所谓的“促有丝分裂的”凝集素可以潜在地诱导淋巴细胞的有丝分裂，并从而造成它们增殖。包括Con A在内的大多数促有丝分裂的凝集素是选择性的T-细胞有丝分裂原。少数凝集素的选择性更低，刺激T-细胞和B-细胞。局部的或全身的促有丝分裂的凝集素体内暴露，可以导致炎症、细胞毒性、巨噬细胞消化和包括过敏反应在内的变态反应。另外，已知植物凝集素是特别免疫原性的，引起高效价的抗-凝集素特异性的抗体的生成。应当理解，促有丝分裂的凝集素因此不能以它们的天然形式用于体内方法和装置中，除非尽极大注意来防止它们的释放。例如，在美国专利号5,830,506中，Taylor突出了使用Con A所涉及的中毒风险，并强调了在药物递送装置内包含Con A的重要性和困难，所述装置也要求葡萄糖和胰岛素分子自由地扩散进出该装置。

如果能够提供不需要凝集素的替代性的受控的药物递送系统，可以显著减少这些和其它体内凝集素使用所涉及的风险和困难。

发明概述

在一个方面，本公开内容提供了以响应于糖（诸如葡萄糖）的全身浓度的方式控制胰岛素的药代动力学(PK)和/或药效学(PD)特性的方法。如在实施例中所讨论的，我们已经发现：当将胰岛素缀合到高亲和力糖配体上时，甚至在没有外源性多价糖-结合分子（诸如Con A）存在下，可以使它表现出响应于糖浓度变化的PK/PD特性。该发现是意外的，并提供了史无前例的制备简单的不含凝集素的糖-响应性的胰岛素系统的机会。

常规胰岛素的持续释放制剂常用于减慢胰岛素向体循环中的释放。例如，PZI (鱼精蛋白锌胰岛素)制剂可以用于该目的。当用鱼精蛋白和锌配制常规胰岛素时，通常产生结晶的持续释放制剂。相反，当使用类似方法用鱼精蛋白和锌配制本文所述的胰岛素-缀合物时，生成无定形制剂，且需要比常规胰岛素（例如RHI）所需量远远更多的鱼精蛋白和锌来提供持续释放。我们已经令人惊讶地发现：本文所述的某些胰岛素-缀合物可以结晶。使用标准的胰岛素结晶条件，胰岛素-缀合物难以结晶，最大可能是由于它们的含糖的、空间庞大的结构。如本文所述，则可以配制本公开内容的结晶胰岛素-缀合物，以提供结晶的持续释放制剂。本公开内容提供了结晶胰岛素-缀合物及其制剂。也提供了制备和使用结晶胰岛素-缀合物的方法。胰岛素-缀合物的结晶制剂可以有利地提高批次之间的再现性、增加制剂稳定性和减少在长储存时期内的颗粒团聚。

定义

下面更详细地描述了在本说明书中使用的具体官能团、化学术语和一般术语的定义。为了本发明的目的，根据元素周期表（CAS版, Handbook of Chemistry and Physics, 第75版, 内封面），鉴别化学元素，并如其中所述，一般地定义具体官能团。另外，有机化学的一般原理、以及具体官能部分和反应性，描述在：Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March March’s Advanced Organic Chemistry, 第5版, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 第3版, Cambridge University Press, Cambridge, 1987。

酰基 – 本文使用的术语“酰基”表示具有下述通式的基团：–C(=O)R^X1、–C(=O)OR^X1、–C(=O)–O–C(=O)R^X1、–C(=O)SR^X1、–C(=O)N(R^X1)₂、–C(=S)R^X1、–C(=S)N(R^X1)₂和–C(=S)S(R^X1)、–C(=NR^X1)R^X1、–C(=NR^X1)OR^X1、–C(=NR^X1)SR^X1和–C(=NR^X1)N(R^X1)₂，其中R^X1是氢；卤素；取代的或未取代的羟基；取代的或未取代的硫醇；取代的或未取代的氨基；取代的或未取代的酰基；环状的或无环的、取代的或未取代的、分支的或未分支的脂族；环状的或无环的、取代的或未取代的、分支的或未分支的杂脂族；环状的或无环的、取代的或未取代的、分支的或未分支的烷基；环状的或无环的、取代的或未取代的、分支的或未分支的烯基；取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂族硫代氧基、杂脂族硫代氧基、烷基硫代氧基、杂烷基硫代氧基、芳基硫代氧基、杂芳基硫代氧基、单–或二–脂族氨基、单–或二–杂脂族氨基、单–或二–烷基氨基、单–或二–杂烷基氨基、单–或二–芳基氨基或单–或二–杂芳基氨基；或2个R^X1基团一起形成5–6元杂环。示例性的酰基包括醛 (–CHO)、羧酸 (–CO₂H)、酮、酰基卤、酯、酰胺、亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯和脲。酰基取代基包括、但不限于：本文所述的任意取代基，其导致稳定部分的形成(例如，脂族、烷基、烯基、炔基、杂脂族、杂环、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫代氧代、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤素、脂族氨基、杂脂族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷基芳基、芳基烷基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂族硫代氧基、杂脂族硫代氧基、烷基硫代氧基、杂烷基硫代氧基、芳基硫代氧基、杂芳基硫代氧基、酰氧基等，它们各自可以进一步被取代或未取代)。

脂族的– 本文使用的术语“脂族的”或“脂族基团”表示任选地取代的烃部分，其可以是直链的(即，未分支的)、分支的或环状的(“碳环的”)，且可以是完全饱和的，或可以含有一个或多个不饱和单元，但是它不是芳族的。除非另外指出，脂族基团含有1-12个碳原子。在有些实施方案中，脂族基团含有1-6个碳原子。在有些实施方案中，脂族基团含有1-4个碳原子，在其它实施方案中，脂族基团含有1-3个碳原子。合适的脂族基团包括、但不限于：直链的或分支的、烷基、烯基和炔基、及其杂合物，诸如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。

烯基 – 本文使用的术语“烯基”表示通过去除单个氢原子从具有至少一个碳–碳双键的直链或支链脂族部分衍生出的任选地取代的单价基团。在某些实施方案中，在本发明中采用的烯基含有2-6个碳原子。在某些实施方案中，在本发明中采用的烯基含有2-5个碳原子。在有些实施方案中，在本发明中采用的烯基含有2-4个碳原子。在另一个实施方案中，采用的烯基含有2-3个碳原子。烯基包括，例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、1–甲基–2–丁烯–1–基等。

烷基 – 本文使用的术语“烷基”表示通过去除单个氢原子从含有1-6个碳原子的脂族部分衍生出的任选地取代的饱和的、直链或支链烃基团。在有些实施方案中，在本发明中采用的烷基含有1-5个碳原子。在另一个实施方案中，采用的烷基含有1-4个碳原子。在其它实施方案中，所述烷基含有1-3个碳原子。在另一个实施方案中，所述烷基含有1-2个碳。烷基的实例包括、但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一基、月桂基等。

炔基 – 本文使用的术语“炔基”表示通过去除单个氢原子从具有至少一个碳–碳三键的直链或支链脂族部分衍生出的任选地取代的单价基团。在某些实施方案中，在本发明中采用的炔基含有2-6个碳原子。在某些实施方案中，在本发明中采用的炔基含有2-5个碳原子。在有些实施方案中，在本发明中采用的炔基含有2-4个碳原子。在另一个实施方案中，采用的炔基含有2-3个碳原子。代表性的炔基包括、但不限于：乙炔基、2–丙炔基 (炔丙基)、1–丙炔基等。

芳基 – 如本文使用的，单独地或作为更大部分的一部分（如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”中）使用的术语“芳基”表示具有共5-10个环成员的任选地取代的单环的和双环的环系统，其中该系统中的至少一个环是芳族的，且其中该系统中的每个环含有3-7个环成员。术语“芳基”可以与术语“芳基环”互换使用。在本发明的某些实施方案中，“芳基”表示芳族环系统，其包括但不限于、苯基、联苯基、萘基、蒽基等，其可以携带一个或多个取代基。

芳基烷基 – 本文使用的术语“芳基烷基”表示被芳基(例如，芳族或杂芳族基团)取代的烷基。

二价烃链 – 本文使用的术语“二价烃链” (也称作“二价亚烷基”)是聚亚甲基，即–(CH₂)_z–，其中z是1-30、1-20、1-12、1-8、1-6、1-4、1-3、1-2、2-30、2-20、2-10、2-8、2-6、2-4或2-3的正整数。取代的二价烃链是这样的聚亚甲基，其中一个或多个亚甲基氢原子被取代基替换。合适的取代基包括下面关于取代的脂族基团所述的那些。

羰基 – 本文使用的术语“羰基”表示含有碳-氧双键的单价或二价的部分。羰基的非限制性实例包括醛、酮、羧酸、酯、酰胺、烯酮、酰基卤、酸酐、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、硫酯、内酯、内酰胺、氧肟酸酯、异氰酸酯和氯甲酸酯。

环脂族的– 如本文使用的，单独地或作为更大部分的一部分使用的术语“环脂族的”、“碳环”或“碳环的”表示任选地取代的饱和的或部分不饱和的本文所述的具有3-10个成员的环状脂族单环的或双环的环系统。环脂族基团包括、但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基、环辛基、环辛烯基和环辛二烯基。在有些实施方案中，所述环烷基具有3-6个碳。

卤素 – 本文使用的术语“卤”和“卤素”表示选自氟(氟代、–F)、氯(氯代、–Cl)、溴(溴代、–Br)和碘(碘代、–I)的原子。

杂脂族的 – 本文使用的术语“杂脂族的”或“杂脂族基团”表示，除了碳原子以外，具有1-5个杂原子的任选地取代的烃部分，其可以是直链的(即，未分支的)、分支的或环状的(“杂环的”)，且可以是完全饱和的，或可以含有一个或多个不饱和单元，但是它不是芳族的。除非另外指出, 杂脂族基团含有1-6个碳原子，其中1-3个碳原子任选地且独立地被选自氧、氮和硫的杂原子替换。在有些实施方案中，杂脂族基团含有1-4个碳原子，其中1-2个碳原子任选地且独立地被选自氧、氮和硫的杂原子替换。在其它实施方案中，杂脂族基团含有1-3个碳原子，其中1个碳原子任选地且独立地被选自氧、氮和硫的杂原子替换。合适的杂脂族基团包括、但不限于：直链的或分支的、杂烷基、杂烯基和杂炔基。

杂芳烷基 – 本文使用的术语“杂芳烷基”表示被杂芳基取代的烷基，其中所述烷基和杂芳基部分独立地任选地被取代。

杂芳基 – 如本文使用的，单独地或作为更大部分（例如，“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”）的一部分使用的术语“杂芳基”表示这样的任选地取代的基团，其具有5-10个环原子、优选5、6或9个环原子；具有6、10或14个在环状阵列中共享的π电子；且除了碳原子以外，具有1-5个杂原子。杂芳基包括、但不限于，噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、

唑基、异

唑基、

二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。本文使用的术语“杂芳基”和“杂芳–”也包括这样的基团，其中杂芳族环与一个或多个芳基、碳环或杂环稠合，其中连接的基团或点是在杂芳族环上。非限制性实例包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H–喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩

嗪基、四氢喹啉基和四氢异喹啉基。杂芳基可以是单环的或双环的。术语“杂芳基”可以与术语“杂芳基环”、“杂芳基”或“杂芳族的”互换使用，这些术语中的任一个包括任选地被取代的环。

杂原子 – 本文使用的术语“杂原子”表示氮、氧或硫，且包括氮或硫的任意氧化形式和碱性氮的任意季铵化形式。术语“氮” 也包括取代的氮。

杂环– 本文使用的术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基团”和“杂环”互换地使用，表示稳定的、任选地取代的5-7元单环的或7-10元双环的杂环部分，它是饱和的或部分不饱和的，且除了碳原子以外，具有一个或多个上面定义的杂原子。杂环可以在产生稳定结构的任意杂原子或碳原子处连接到它的下垂基团上，且任一个环原子可以任选地被取代。这样的饱和的或部分不饱和的杂环基团的实例包括、但不限于，四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、

唑烷基、哌嗪基、二

烷基、二氧戊环基、二氮杂卓基、氧氮杂卓基、硫杂氮杂卓基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基”、“杂环部分”和“杂环基团”在本文中互换地使用，且也包括这样的基团，其中杂环基环与一个或多个芳基、杂芳基或碳环（诸如二氢吲哚基、3H–吲哚基、色满基、菲啶基或四氢喹啉基）稠合，其中连接基团或点是在杂环基环上。杂环基可以是单环的或双环的。术语“杂环基烷基”表示被杂环基取代的烷基，其中所述烷基和杂环基部分独立地任选地被取代。

不饱和的 – 本文使用的术语“不饱和的”是指具有一个或多个双键或三键的部分。

部分不饱和的– 本文使用的术语“部分不饱和的”表示包含至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和的”意在包括具有多个不饱和位点的环，但是无意包括本文定义的芳基或杂芳基部分。

任选地取代的– 如本文所述，本发明的化合物可以含有“任选地取代的”部分。一般而言，无论在前面有还是没有术语“任选地”，术语“取代”是指指定的部分的一个或多个氢被合适的取代基替换。除非另有说明，“任选地取代的”基团可以具有在该基团的每个可取代的位置处的合适的取代基，且当任意给定结构中的超过一个位置可以被超过一个选自特定集合的取代基取代时，在每个位置的取代基可以是相同的或不同的。本发明预见到的取代基的组合优选地是导致形成稳定的或化学上可行的化合物的那些。本文使用的术语“稳定的”表示，当处于特定条件下时基本上不改变的化合物，所述条件允许它们的生产、检测，以及在某些实施方案中，允许它们的回收、纯化和用于一个或多个本文公开的目的。

在“任选地取代的”基团的可取代的碳原子上的合适的单价取代基独立地是卤素；–(CH₂)_{0 – 4}Rº；–(CH₂)_{0 – 4}ORº；–O–(CH₂)_{0 – 4}C(O)ORº；–(CH₂)_{0 – 4}CH(ORº)₂；–(CH₂)_{0 – 4}SRº；–(CH₂)_{0 – 4}Ph，其可以被Rº取代；–(CH₂)_{0 – 4}O(CH₂)_{0 – 1}Ph，其可以被Rº取代；–CH=CHPh，其可以被Rº取代；–NO₂；–CN；–N₃；–(CH₂)_{0 – 4}N(Rº)₂；–(CH₂)_{0 – 4}N(Rº)C(O)Rº；–N(Rº)C(S)Rº；–(CH₂)_{0 – 4}N(Rº)C(O)NRº₂；–N(Rº)C(S)NRº₂；–(CH₂)_{0 – 4}N(Rº)C(O)ORº；–N(Rº)N(Rº)C(O)Rº；–N(Rº)N(Rº)C(O)NRº₂；–N(Rº)N(Rº)C(O)ORº；–(CH₂)_{0 – 4}C(O)Rº；–C(S)Rº；–(CH₂)_{0 – 4}C(O)ORº；–(CH₂)_{0 – 4}C(O)SRº；–(CH₂)_{0 – 4}C(O)OSiRº₃；–(CH₂)_{0 – 4}OC(O)Rº；–OC(O)(CH₂)_{0 – 4}SR–，SC(S)SRº；–(CH₂)_{0 – 4}SC(O)Rº；–(CH₂)_{0 – 4}C(O)NRº₂；–C(S)NRº₂；–C(S)SRº；–SC(S)SRº，–(CH₂)_{0 – 4}OC(O)NRº₂；–C(O)N(ORº)Rº；–C(O)C(O)Rº；–C(O)CH₂C(O)Rº；–C(NORº)Rº；–(CH₂)_{0 – 4}SSRº；–(CH₂)_{0 – 4}S(O)₂Rº；–(CH₂)_{0 – 4}S(O)₂ORº；–(CH₂)_{0 – 4}OS(O)₂Rº；–S(O)₂NRº₂；–(CH₂)_{0 – 4}S(O)Rº；–N(Rº)S(O)₂NRº₂；–N(Rº)S(O)₂Rº；–N(ORº)Rº；–C(NH)NRº₂；–P(O)₂Rº；–P(O)Rº₂；–OP(O)Rº₂；–OP(O)(ORº)₂；SiRº₃；–(C_{1 – 4}直链或支链亚烷基)O–N(Rº)₂；或–(C_{1 – 4}直链或支链亚烷基)C(O)O–N(Rº)₂，其中每个Rº可以如下所定义地被取代，且独立地是氢、C_{1 – 6} 脂族、–CH₂Ph、–O(CH₂)_{0 – 1}Ph或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环，或者，尽管有上面的定义，2个独立地出现的Rº与它们的插入原子一起形成具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3–12元饱和的、部分不饱和的、或芳基单环或双环的环，其可以如下所定义地被取代。

在Rº (或2个独立地出现的Rº与它们的插入原子一起形成的环)上的合适的单价取代基独立地是卤素、–(CH₂)_{0 – 2}R^●、–(卤代R^●)、–(CH₂)_{0 – 2}OH、–(CH₂)_{0 – 2}OR^●、–(CH₂)_{0 – 2}CH(OR^●)₂；–O(卤代R^●)、–CN、–N₃、–(CH₂)_{0 – 2}C(O)R^●、–(CH₂)_{0 – 2}C(O)OH、–(CH₂)_{0 – 2}C(O)OR^●、–(CH₂)_{0 – 2}SR^●、–(CH₂)_{0 – 2}SH、–(CH₂)_{0 – 2}NH₂、–(CH₂)_{0 – 2}NHR^●、–(CH₂)_{0 – 2}NR^● ₂、–NO₂、–SiR^● ₃、–OSiR^● ₃、–C(O)SR^●、–(C_{1 – 4}直链或支链亚烷基)C(O)OR^●或–SSR^●，其中每个R^●是未取代的，或当前面具有“卤代”时，仅被一个或多个卤素取代，且独立地选自C_{1 – 4} 脂族、–CH₂Ph、–O(CH₂)_{0 – 1}Ph或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。在Rº的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括=O和=S。

在“任选地取代的”基团的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括下述的：=O、=S、=NNR^* ₂、=NNHC(O)R^*、=NNHC(O)OR^*、=NNHS(O)₂R^*、=NR^*、=NOR^*、–O(C(R^* ₂))_{2 – 3}O–或–S(C(R^* ₂))_{2 – 3}S–，其中每个独立出现的R^*选自：氢、可以如下所定义地被取代的C_{1 – 6} 脂族、或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。结合到“任选地取代的”基团的邻位可取代碳上的合适的二价取代基包括：–O(CR^* ₂)_{2 – 3}O–，其中每个独立出现的R^*选自：氢、可以如下所定义地被取代的C_{1 – 6} 脂族、或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。

在R^*的脂族基团上的合适的取代基包括卤素、–R^●、–(卤代R^●)、–OH、–OR^●、–O(卤代R^●)、–CN、–C(O)OH、–C(O)OR^●、–NH₂、–NHR^●、–NR^● ₂或–NO₂，其中每个R^●是未取代的，或当前面具有“卤代”时，仅被一个或多个卤素取代，且独立地是C_{1 – 4} 脂族、–CH₂Ph、–O(CH₂)_{0 – 1}Ph、或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。

在“任选地取代的”基团的可取代的氮上的合适的取代基包括–R^†、–NR^† ₂、–C(O)R^†、–C(O)OR^†、–C(O)C(O)R^†、–C(O)CH₂C(O)R^†、–S(O)₂R^†、–S(O)₂NR^† ₂、–C(S)NR^† ₂、–C(NH)NR^† ₂或–N(R^†)S(O)₂R^†;其中每个R^†独立地是氢、可以如下所定义地被取代的C_{1 – 6} 脂族、未取代的–OPh、或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环，或者，尽管有上面的定义，2个独立地出现的R^†与它们的插入原子一起形成具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的3–12元饱和的、部分不饱和的、或芳基单环或双环的环。

在R^†的脂族基团上的合适的取代基独立地是卤素、–R^●、–(卤代R^●)、–OH、–OR^●、–O(卤代R^●)、–CN、–C(O)OH、–C(O)OR^●、–NH₂、–NHR^●、–NR^● ₂或–NO₂，其中每个R^●是未取代的，或当前面具有“卤代”时，仅被一个或多个卤素取代，且独立地是C_{1 – 4} 脂族、–CH₂Ph、–O(CH₂)_{0 – 1}Ph、或具有0–4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5–6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。

合适的保护基 – 本文使用的术语“合适的保护基”表示氨基保护基或羟基保护基（取决于它在化合物内的位置），且包括在下述文献中详述的那些：Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene和P. G. M. Wuts, 第3版, John Wiley & Sons, 1999。

合适的氨基–保护基包括：氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9–芴甲氧羰酰胺 (Fmoc)、9–(2–磺基)芴甲氧羰酰胺、9–(2,7–二溴)芴甲氧羰酰胺、2,7–二叔丁基–[9–(10,10–二氧代–10,10,10,10–四氢噻嗯烷基)]氨基甲酸甲酯 (DBD–Tmoc)、4–甲氧基苯酰基氨基甲酸酯 (Phenoc)、2,2,2–三氯乙基氨基甲酸酯(Troc)、2–三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯 (Teoc)、2–苯乙基氨基甲酸酯(hZ)、1–(1–金刚烷基)–1–甲基乙基氨基甲酸酯(Adpoc)、1,1–二甲基–2–卤代乙基氨基甲酸酯、1,1–二甲基–2,2–二溴乙基氨基甲酸酯 (DB–t–BOC)、1,1–二甲基–2,2,2–三氯乙基氨基甲酸酯(TCBOC)、1–甲基–1–(4–联苯基)乙基氨基甲酸酯(Bpoc)、1–(3,5–二叔丁基苯基)–1–甲基乙基氨基甲酸酯(t–Bumeoc)、2–(2’–和4’–吡啶基)乙基氨基甲酸酯(Pyoc)、2–(N,N–二环己基甲酰胺基)乙基氨基甲酸酯、叔丁基氨基甲酸酯 (BOC)、1–金刚烷基氨基甲酸酯 (Adoc)、乙烯基氨基甲酸酯 (Voc)、烯丙基氨基甲酸酯 (Alloc)、1–异丙基烯丙基氨基甲酸酯 (Ipaoc)、肉桂基氨基甲酸酯 (Coc)、4–硝基肉桂基氨基甲酸酯 (Noc)、8–喹啉基氨基甲酸酯、N–羟基哌啶基氨基甲酸酯、烷基二硫氨基甲酸酯、苄基氨基甲酸酯 (Cbz)、对甲氧基苄基氨基甲酸酯 (Moz)、对硝基苄基氨基甲酸酯、对溴苄基氨基甲酸酯、对氯苄基氨基甲酸酯、2,4–二氯苄基氨基甲酸酯、4–甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯 (Msz)、9–蒽基氨基甲酸甲酯、二苯基氨基甲酸甲酯、2–甲基硫代乙基氨基甲酸酯、2–甲磺酰基乙基氨基甲酸酯、2–(对甲苯磺酰基)乙基氨基甲酸酯、[2–(1,3–二噻烷基)]氨基甲酸甲酯 (Dmoc)、4–甲基苯硫基氨基甲酸酯 (Mtpc)、2,4–二甲基苯硫基氨基甲酸酯 (Bmpc)、2–膦酰基乙基氨基甲酸酯 (Peoc)、2–三苯基膦酰基异丙基氨基甲酸酯 (Ppoc)、1,1–二甲基–2–氰基乙基氨基甲酸酯、间–氯–对–酰氧基苄基氨基甲酸酯、对(二羟基硼基)苄基氨基甲酸酯、5–苯并异

唑基氨基甲酸甲酯、2–(三氟甲基)–6–色酮基氨基甲酸甲酯 (Tcroc)、间硝基苯基氨基甲酸酯、3,5–二甲氧基苄基氨基甲酸酯、邻硝基苄基氨基甲酸酯、3,4–二甲氧基–6–硝基苄基氨基甲酸酯、苯基(邻硝基苯基)氨基甲酸甲酯、吩噻嗪基–(10)–羰基衍生物、N’–对甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、N’–苯基氨基硫代羰基衍生物、叔戊基氨基甲酸酯、S–苄基硫代氨基甲酸酯、对氰基苄基氨基甲酸酯、环丁基氨基甲酸酯、环己基氨基甲酸酯、环戊基氨基甲酸酯、环丙基氨基甲酸甲酯、对癸基氧基苄基氨基甲酸酯、2,2–二甲氧基羰基乙烯基氨基甲酸酯、邻–(N,N–二甲基甲酰胺基)苄基氨基甲酸酯、1,1–二甲基–3–(N,N–二甲基甲酰胺基)丙基氨基甲酸酯、1,1–二甲基丙炔基氨基甲酸酯、二(2–吡啶基)氨基甲酸甲酯、2–呋喃基氨基甲酸甲酯, 2–碘乙基氨基甲酸酯、异冰片基氨基甲酸酯, 异丁基氨基甲酸酯、异烟酰基氨基甲酸酯、对-(p’–甲氧基苯偶氮基)苄基氨基甲酸酯、1–甲基环丁基氨基甲酸酯、1–甲基环己基氨基甲酸酯、1–甲基–1–环丙基氨基甲酸甲酯、1–甲基–1–(3,5–二甲氧基苯基)乙基氨基甲酸酯、1–甲基–1–(对苯偶氮基苯基)乙基氨基甲酸酯、1–甲基–1–苯乙基氨基甲酸酯、1–甲基–1–(4–吡啶基)乙基氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯、对(苯偶氮基)苄基氨基甲酸酯、2,4,6–三–叔丁基苯基氨基甲酸酯、4–(三甲铵)苄基氨基甲酸酯、2,4,6–三甲基苄基氨基甲酸酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3–苯基丙酰胺、吡啶酰胺、3–吡啶基羧酰胺、N–苯甲酰基苯基内氨酰基衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(N’–二硫代苄氧基羰基氨基)乙酰胺、3–(对羟基苯基)丙酰胺、3–(邻硝基苯基)丙酰胺、2–甲基–2–(邻硝基苯氧基)丙酰胺、2–甲基–2–(邻苯偶氮基苯氧基)丙酰胺、4–氯丁酰胺、3–甲基–3–硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、N–乙酰蛋氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺、邻–(苯甲酰氧基甲基)苯甲酰胺、4,5–二苯基–3–

唑啉–2–酮、N–邻苯二甲酰亚胺、N–二硫杂琥珀酰亚胺 (Dts)、N–2,3–二苯基马来酰亚胺、N–2,5–二甲基吡咯、N–1,1,4,4–四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5–取代的1,3–二甲基–1,3,5–三氮杂环己烷–2–酮、5–取代的1,3–二苄基–1,3,5–三氮杂环己烷–2–酮、1–取代的3,5–二硝基–4–吡啶酮、N–甲胺、N–烯丙胺、N–[2–(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲胺 (SEM)、N–3–乙酰氧基丙胺、N–(1–异丙基–4–硝基–2–氧代–3–吡咯啉–3–基)胺、季铵盐、N–苄基胺、N–二(4–甲氧基苯基)甲胺、N–5–二苯并环庚基胺、N–三苯基甲胺 (Tr)、N–[(4–甲氧基苯基)二苯基甲基]胺 (MMTr)、N–9–苯基芴基胺 (PhF)、N–2,7–二氯–9–芴基亚甲胺、N–二茂铁基甲氨基 (Fcm)、N–2–吡啶甲基氨基 N’–氧化物、N–1,1–二甲基硫代亚甲胺、N–亚苄基胺、N–对甲氧基亚苄基胺、N–二苯基亚甲胺、N–[(2–吡啶基)2,4,6-三甲苯基]亚甲胺、N–(N’,N’–二甲氨基亚甲基)胺、N,N’–亚异丙基二胺、N–对硝基亚苄基胺、N–亚水杨酰基胺、N–5–氯亚水杨酰基胺、N–(5–氯–2–羟基苯基)苯基亚甲胺、N–亚环己基胺、N–(5,5–二甲基–3–氧代–1–环己烯基)胺、N–硼烷衍生物、N–二苯基硼酸衍生物、N–[苯基(五羰基铬–或钨)羰基]胺、N–铜螯合物、N-锌螯合物、N–硝基胺、N–亚硝胺、N–氧化胺、二苯基膦酰胺 (Dpp)、二甲基硫代膦酰胺 (Mpt)、二苯基硫代膦酰胺 (Ppt)、二烷基氨基磷酸酯、二苄基氨基磷酸酯、二苯基氨基磷酸酯、苯次磺酰胺、邻硝基苯次磺酰胺 (Nps)、2、4–二硝基苯次磺酰胺、五氯苯次磺酰胺、2–硝基–4–甲氧基苯次磺酰胺、三苯基甲基次磺酰胺、3–硝基吡啶次磺酰胺 (Npys)、对甲苯磺酰胺 (Ts)、苯磺酰胺、2,3,6–三甲基–4–甲氧基苯磺酰胺 (Mtr)、2,4,6–三甲氧基苯磺酰胺 (Mtb)、2,6–二甲基–4–甲氧基苯磺酰胺 (Pme)、2,3,5,6–四甲基–4–甲氧基苯磺酰胺 (Mte)、4–甲氧基苯磺酰胺 (Mbs)、2,4,6–三甲基苯磺酰胺 (Mts)、2,6–二甲氧基–4–甲基苯磺酰胺 (iMds)、2,2,5,7,8–五甲基色满–6–磺酰胺 (Pmc), 甲磺酰胺 (Ms)、β–三甲基甲硅烷基乙磺酰胺 (SES)、9–蒽磺酰胺、4–(4’,8’–二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺 (DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺和苯酰基磺酰胺。

合适的羟基保护基包括甲基、甲氧基甲基 (MOM)、甲基硫代甲基(MTM)、叔丁基硫代甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基 (SMOM)、苄氧基甲基 (BOM)、对甲氧基苄氧基甲基 (PMBM)、(4–甲氧基苯氧基)甲基 (p–AOM)、愈创木酚甲基 (GUM)、叔丁氧基甲基、4–戊烯基氧基甲基 (POM)、硅氧基甲基、2–甲氧基乙氧基甲基 (MEM)、2,2,2–三氯乙氧基甲基、二(2–氯乙氧基)甲基、2–(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基 (SEMOR)、四氢吡喃基 (THP)、3–溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1–甲氧基环己基、4–甲氧基四氢吡喃基 (MTHP)、4–甲氧基四氢噻喃基、4–甲氧基四氢噻喃基 S,S–二氧化物、1–[(2–氯–4–甲基)苯基]–4–甲氧基哌啶–4–基 (CTMP)、1,4–二

烷–2–基、四氢呋喃基、四氢噻吩基, 2,3,3a,4,5,6,7,7a–八氢–7,8,8–三甲基–4,7–亚甲基苯并呋喃–2–基、1–乙氧基乙基、1–(2–氯乙氧基)乙基、1–甲基–1–甲氧基乙基、1–甲基–1–苄氧基乙基、1–甲基–1–苄氧基–2–氟乙基、2,2,2–三氯乙基、2–三甲基甲硅烷基乙基、2–(苯基氧硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2,4–二硝基苯基、苄基、对甲氧基苄基、3,4–二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤苄基、2,6–二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2–吡啶甲基、4–吡啶甲基、3–甲基–2–吡啶甲基 N–氧桥、二苯基甲基、p,p’–二硝基二苯甲基、5–二苯并环庚基、三苯基甲基、α–萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4–(4’–溴苯酰氧基苯基)二苯基甲基、4,4’,4’’–三(4,5–二氯邻苯二甲酰亚胺基苯基)甲基、4,4’,4’’–三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基、4,4’,4’’–三(苯甲酰氧基苯基)甲基、3–(咪唑–1–基)二(4’,4’’–二甲氧基苯基)甲基、1,1–二(4–甲氧基苯基)–1’–芘基甲基、9–蒽基、9–(9–苯基)呫吨基、9–(9–苯基–10–氧代)蒽基、1,3–苯并二硫戊环–2–基、苯并异噻唑基 S,S–二氧桥、三甲基甲硅烷基 (TMS)、三乙基甲硅烷基 (TES)、三异丙基甲硅烷基 (TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基 (IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基 (DEIPS)、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基 (TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基 (TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三–对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基 (DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基 (TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3–苯基丙酸酯、4–氧代戊酸酯 (乙酰丙酸酯)、4,4–(乙烯二硫代)戊酸酯 (乙酰丙酰基二硫缩醛)、特戊酸酯、金刚酸酯、巴豆酸酯、4–甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2,4,6–三甲基苯甲酸酯 (

酸酯)、烷基甲基碳酸酯、9–芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙基碳酸酯、2,2,2–三氯乙基碳酸烷基酯(Troc)、2–(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(TMSEC)、2–(苯磺酰基)乙基碳酸酯(Psec)、2–(三苯基膦酰基)乙基碳酸酯(Peoc)、异丁基碳酸烷基酯、乙烯基碳酸烷基酯、烯丙基碳酸烷基酯、对硝基苯基碳酸烷基酯、苄基碳酸烷基酯、对甲氧基苄基碳酸烷基酯、3、4–二甲氧基苄基碳酸烷基酯、邻硝基苄基碳酸烷基酯、对硝基苄基碳酸烷基酯、S–苄基硫代碳酸烷基酯、4–乙氧基–1–萘基碳酸酯、二硫代碳酸甲酯、2–碘苯甲酸酯、4–叠氮基丁酸酯、4–硝基–4–甲基戊酸酯、邻–(二溴甲基)苯甲酸酯、2–甲酰基苯磺酸酯、2–(甲基硫代甲氧基)乙基、4–(甲基硫代甲氧基)丁酸酯、2–(甲基硫代甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6–二氯–4–甲基苯氧基乙酸酯、2,6–二氯–4–(1,1,3,3–四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4–二(1,1–二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(E)–2–甲基–2–丁烯酸酯、邻–(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α–萘甲酸酯、硝酸酯、烷基 N、N、N’、N’–四甲基磷二酰胺、N–苯基氨基甲酸烷基酯、硼酸酯、二甲基硫代膦基、2,4–二硝基苯基磺酸烷基酯、硫酸酯、甲磺酸盐 (甲磺酸酯)、磺酸苄酯和甲苯磺酰化 (Ts)。对于保护1,2–或1,3–二醇，保护基包括亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1–叔丁基亚乙基缩酮、1–苯亚乙基缩酮、(4–甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2,2,2–三氯亚乙基缩醛、丙酮化合物、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、亚苄基缩醛、对甲氧基亚苄基缩醛、2,4–二甲氧基亚苄基缩酮、3,4–二甲氧基亚苄基缩醛、2–硝基亚苄基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1–甲氧基亚乙基原酸酯、1–乙氧基亚乙基原酸酯、1,2–二甲氧基亚乙基原酸酯、α–甲氧基亚苄基原酸酯、1–(N,N–二甲氨基)亚乙基衍生物、α–(N,N’–二甲氨基)亚苄基衍生物、2–氧杂亚环戊基原酸酯、二叔丁基甲硅亚烷基(DTBS)、1,3–(1,1,3,3–四异丙基二亚硅氧烷基)衍生物(TIPDS)、四–叔丁氧基二硅氧烷–1,3–二亚基衍生物(TBDS)、环状碳酸酯、环状硼酸酯、硼酸乙基酯和硼酸苯基酯。

在显示出化学变量(例如，R基团)连接到与环键交叉的键上的任意情况下，这是指一个或多个这样的变量任选地连接到具有该交叉键的环上。在这样的环上的每个R基团可以连接在任意合适的位置，这通常理解为是指，该基团替代氢原子连接到母体环上。这包括下述可能，即2个R基团可以连接在同一个环原子上。此外，当在环上存在超过一个R基团时，各自可以与连接的其它R基团相同或不同，且每个基团独立于可以连接在相同分子的其它位置上的其它R基团进行定义，即使它们可能由相同的标识符来表示。

生物分子 – 本文使用的术语“生物分子”表示在细胞和组织中常见的天然存在的或人工制备的(例如，通过合成或重组方法)分子 (例如，多肽、氨基酸、多核苷酸、核苷酸、多糖、糖类、脂类、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、甾类、代谢物等)。生物分子的具体类别包括、但不限于：酶、受体、神经递质、激素、细胞因子、细胞响应修饰剂（诸如生长因子和趋化因子）、抗体、疫苗、半抗原、毒素、干扰素、核酶、反义试剂、质粒、DNA和RNA。

药物 – 本文使用的术语“药物”表示改变、抑制、激活或以其它方式影响生物学事件的小分子或生物分子。例如，药物可以包括、但不限于：抗-AIDS物质，抗癌物质，抗生素，抗糖尿病物质，免疫抑制剂，抗病毒物质，酶抑制剂，神经毒素，阿片样物质，安眠药，抗-组胺，润滑剂，安神剂，抗惊厥药，肌肉松弛药和抗-帕金森物质，抗-痉挛药和肌肉收缩药（包括通道阻滞剂），缩瞳药和抗胆碱能药，抗-青光眼化合物，抗-寄生物和/或抗-原生动物化合物，细胞-胞外基质相互作用的调节剂（包括细胞生长抑制剂和抗-粘附分子），血管扩张剂，DNA、RNA或蛋白合成的抑制剂，抗高血压药，镇痛药，解热剂，甾体和非甾体抗炎药，抗-血管生成因子，反分泌因子，抗凝血药和/或抗血栓药，局部麻醉药，眼药，前列腺素，抗抑郁药，抗精神病物质，止吐药，和显像剂。适用于本发明的示例性药物的更完整的列表可以参见：Axel Kleemann和Jurgen Engel 的“Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications”, Thieme Medical Publishing, 1999; “Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals”, Susan Budavari 等人编, CRC Press, 1996,和美国药典-25 (United States Pharmacopeia-25)/国家处方集-20（National Formulary-20），由United States Pharmcopeial Convention, Inc., Rockville MD, 2001公布。

外源性– 本文使用的“外源性的”分子是在没有施用给患者之前不以显著水平存在于患者中的分子。在某些实施方案中，患者是哺乳动物，例如，人、狗、猫、大鼠等。如果这类患者的正常血清包含小于0.1 mM的分子，则本文使用的分子不以显著水平存在于患者中。在某些实施方案中，患者的正常血清可以包含小于0.08 mM、小于0.06 mM或小于0.04 mM的分子。

多分支的 – 本文使用的“多分支的” 结构是包含至少1个分支的支链的共价结构(例如，树枝状聚合的结构)。多分支的结构可以包括聚合的和/或非聚合的亚结构。

正常血清– 本文使用的“正常血清”是通过合并大约等量的来自5位或更多非糖尿病患者的凝固全血的液体部分所得到的血清。随机地选择18-30岁的非糖尿病的人患者，他们在抽血时没有呈现出糖尿病症状。

聚合物– 本文使用的“聚合物”或“聚合的结构”是包含一串共价结合的单体的结构。聚合物可以由一类单体或超过一类单体制成。因此，术语“聚合物”包括共聚物，包括嵌段共聚物，其中不同类型的单体在全部聚合物内单独成簇。聚合物可以是直链的或分支的。

多糖 – 本文使用的“多糖”是糖的聚合物。术语“多糖”、“碳水化合物”和“寡糖”可以互换使用。聚合物可以包括天然的糖(例如，阿拉伯糖、来苏糖、核糖、木糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、甘露庚酮糖、景天庚酮糖、辛酮糖和sialose)和/或修饰的糖 (例如，2´-氟核糖、2´-脱氧核糖和己糖)。示例性的二糖包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、龙胆二糖、异麦芽糖、曲二糖、昆布二糖、甘露二糖、蜜二糖、黑曲霉糖、芸香糖和木二糖。

小分子 – 本文使用的术语“小分子”表示具有相对低分子量的天然存在的或人工制备的(例如，通过化学合成)分子。通常，小分子是单体的，且具有小于约1500 Da的分子量。优选的小分子是生物活性的，它们在动物（优选哺乳动物、更优选人）中产生局部的或全身的作用。在某些优选的实施方案中，小分子是药物。优选地，尽管不一定，药物是已经被适当的管理机构或主体认为使用安全且有效的药物。例如，美国食品药品管理局（FDA）在21 C.F.R. §§ 330.5、331 -361和440 -460下列出的人用药物、美国食品药品管理局（FDA）在21 C.F.R. §§ 500-589下列出的兽医用药物，都视作根据本发明的应用所可接受的。

治疗 – 本文使用的术语“治疗”表示将本公开内容的胰岛素-缀合物施用给有此需要的受试者，其目的是减轻、解除、改变、改善、提高或影响病症(例如，糖尿病)、病症的一种或多种症状(例如，高血糖症)或向病症的倾向。

附图说明

图1：示例性的胰岛素-缀合物框架和配体的化学结构。

图2：示例性的B29胰岛素-缀合物的结构。如在实施例中所述，这些缀合物各自用重组野生型人胰岛素(关于野生型人胰岛素的结构，参见图33)制备。因此，如图2所示，在椭圆形线内的符号“胰岛素”主要意图表示野生型人胰岛素。如本文讨论的，应当理解，除了别的以外，本公开内容也包括含有除了野生型人胰岛素以外的胰岛素分子的这些和其它缀合物形式。

图3：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠皮下注射缀合物I-7 (5 U/kg)以后的(◆)血清胰岛素和(○)血糖水平的图。数据表示n = 3只大鼠的平均值和标准差。

图4：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射缀合物I-7、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。

图5：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射缀合物I-5、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。

图6：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射缀合物I-8、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。

图7：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射缀合物I-9、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。

图8：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射缀合物I-10、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。

图9：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)皮下注射缀合物I-11、随后在15分钟后腹膜内注射α-甲基甘露糖(左图)或盐水(右图)以后，血清胰岛素和血糖水平的图。

图10：将0.4 mg/kg的(♦) RHI和(▲) 缀合物I-6静脉内注射进非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/组)，血清胰岛素浓度随时间而变化的图。使用两隔室双指数模型，拟合数据(n=3的平均值)。

图11：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射长效缀合物I-6、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4 g/kg)以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。如在实施例20中所述制备制剂：(a) 1xP-1xZ、(b) 4xP-4xZ和(c) 10xP-4xZ。

图12：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射长效缀合物I-6、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4 g/kg)以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。如在实施例21中所述制备制剂：(a) 4xP-1xZ和(b) 4xP-2xZ。

图13：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射长效缀合物I-6、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4 g/kg)以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。如在实施例21中所述制备制剂：(a) 10xP-1xZ和(b) 10xP-2xZ。

图14：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射长效缀合物I-6、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4 g/kg)以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。如在实施例22中所述制备制剂：(a) 没有甲酚和(b) 4x 甲酚。

图15：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射长效缀合物I-6、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4 g/kg)以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。如在实施例23中所述制备制剂：(a) 没有盐、(b) 3.3x盐和(c) 甘油。

图16：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射长效缀合物I-6、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4 g/kg)以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。如实施例24中所述制备含有递增量的未修饰的胰岛素的制剂：(a) 1/24、(b) 1/12和(c) 1/6。

图17：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射根据实施例25制备的长效缀合物I-6、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4 g/kg)以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。

图18：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射根据实施例26制备的长效缀合物I-6、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4 g/kg)以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。在2-8℃储存(a) 1周或(b) 2周后，注射所述物质。

图19：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射根据实施例26制备的长效缀合物I-6、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4 g/kg)以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。在室温储存(a) 1周或(b) 2周后，注射所述物质。

图20：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射根据实施例27制备的长效缀合物制剂(I-8、I-10、I-7、I-17、I-9、I-11)、随后在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4 g/kg)以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。

图21：在时间0给非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3/剂量)皮下注射根据实施例28制备的缀合物 I-6 (a)和I-5 (b) 的长效制剂、随后在240分钟腹膜内注射α-甲基甘露糖(4 g/kg) 以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。

图22：在时间0给非糖尿病的(Normals)和糖尿病的(DM’s)雄性SD大鼠皮下注射PZI 缀合物I-6以后，血糖水平的图。在5、10和20 U/kg，施用缀合物。如所示的，非糖尿病的雄性SD大鼠没有表现出任何低血糖症，而糖尿病的雄性SD大鼠的葡萄糖水平表现出明确的与剂量成比例的响应，该响应在最高剂量时持续8小时。

图23：在时间0给非糖尿病的(Normals)和糖尿病的(DM’s)雄性SD大鼠皮下注射PZI 缀合物I-6以后，在24小时内的血糖水平的图。在7、14和28 U/kg，施用缀合物。

图24：在有和没有葡萄糖或α-甲基甘露糖存在下注射缀合物I-6或RHI以后，血清胰岛素浓度随时间而变化的图。

图25：前2个图显示了在非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)中恒定静脉内(i.v.)输注RHI (3.5 mU/min)或I-6 (15 mU/min)以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。在240分钟，腹膜内注射葡萄糖(4 g/kg)。接下来的3个图对比了当在240分钟腹膜内注射葡萄糖(4、2或1 g/kg)时，在非糖尿病的、雄性SD大鼠(n=3)中恒定静脉内(i.v.)输注RHI (3.5 mU/min)或I-6 (15 mU/min)以后，血清胰岛素(♦)和血糖(○)水平的图。

图26：在有和没有葡萄糖或α-甲基甘露糖存在下，注射缀合物以后，血清胰岛素浓度随时间而变化的图。在t = -60 min和贯穿整个研究，给大鼠静脉内灌注糖溶液。在时间0在10 U/kg静脉内注射每种缀合物，并测量血清缀合物浓度。

图27：用于结晶和使用显微术的目视观察结果的指标缓冲液（Index Buffer solution）。

图28：通过混合指标缓冲液19和等体积的2.5 mg/ml缀合物在去离子水中的溶液(左：I-6; 右：I-7)形成的代表性晶体的SEM显微照片。

图29：在时间0在15 U/kg皮下注射缀合物I-6晶体分散系(没有鱼精蛋白或间甲酚)、随后在240 min进行4 g/kg腹膜内葡萄糖耐量试验 (IPGTT)，在禁食的、非糖尿病的雄性SD大鼠(n=2)中产生的(◆)血清胰岛素-缀合物浓度和(

)血糖水平的图。使用异胰岛素ELISA，测量血清胰岛素水平。将数据绘制为平均值±1个标准差。

图30：在时间0在15 U/kg皮下注射含有鱼精蛋白和间甲酚的缀合物I-6晶体分散系、随后在240 min进行4 g/kg腹膜内葡萄糖耐量试验 (IPGTT)，在禁食的、非糖尿病的雄性SD大鼠(n=2)中产生的(◆)血清胰岛素-缀合物浓度和(

)血糖水平的图。使用异胰岛素ELISA，测量血清胰岛素水平。将数据绘制为平均值±1个标准差。

图31：在时间0在15 U/kg皮下注射含有鱼精蛋白和间甲酚的缀合物I-7晶体分散系、随后在240 min进行4 g/kg腹膜内葡萄糖耐量试验 (IPGTT)，在禁食的、非糖尿病的雄性SD大鼠(n=3)中产生的(◆)血清胰岛素-缀合物浓度和(

)血糖水平的图。使用异胰岛素ELISA，测量血清胰岛素水平。将数据绘制为平均值±1个标准差。

图32：在时间0在15 U/kg皮下注射缀合物I-9晶体分散系(分散在含有鱼精蛋白和间甲酚的1x PBS中)、随后在240 min进行4 g/kg腹膜内葡萄糖耐量试验 (IPGTT)，在禁食的、非糖尿病的雄性SD大鼠(n=3)中产生的(◆)血清胰岛素-缀合物浓度和(

)血糖水平的图。使用异胰岛素ELISA，测量血清胰岛素水平。将数据绘制为平均值±1个标准差。

图33：野生型人胰岛素的结构。

具体实施方式

本申请参考了许多文件，包括专利和非专利文件。这些文件各自的所有内容通过引用并入本文。

在一个方面，本公开内容提供了以响应于糖（诸如葡萄糖）的全身浓度的方式控制胰岛素的药代动力学(PK)和/或药效学(PD)特性的方法。如本文讨论的，这些方法部分地基于下述发现：即即使在没有外源性多价糖-结合分子（诸如Con A）存在下，包含高亲和力糖配体的某些合成胰岛素-缀合物(例如，参见图1中的那些)会表现出响应于糖浓度变化的PK/PD特性。该发现是意外的，并提供了史无前例的制备简单的不含凝集素的糖-响应性的胰岛素系统的机会。

这样的胰岛素-缀合物的一个实施例（称作I-6）如图2所示。缀合物I-6包含离散的低分子量合成框架(三-琥珀酰亚胺基 (6-氨基己酰基)氨基三乙酸酯或TSAT-C6)，该框架含有2个氨基乙基三甘露糖(AETM)糖部分。所述框架通过B29 ε-氨基(野生型人胰岛素具有在位置B29处的赖氨酸残基)共价地缀合到胰岛素上。如在实施例中所讨论的，胰岛素-缀合物（诸如I-6）表现出葡萄糖-响应性的药代动力学。结果，胰岛素-缀合物（诸如I-6）的可用性和生物活性响应于内源的葡萄糖水平而变化。我们已经使用鱼精蛋白和锌(PZI制剂)制备了缀合物I-6的持续释放制剂，其提供根据需要的基础的和团注胰岛素“递送”，而不诱导低血糖症。相反，常规胰岛素是速效的(例如，RHI)或缓效的(例如，来得时)，且不会响应于葡萄糖水平的变化而改变特性。当在糖尿病的和正常的大鼠中与常规胰岛素相对比时，缀合物I-6显示出大幅提高的治疗窗，在4倍治疗量具有极微小的低血糖症风险。

重要的是，我们的研究已经证实，葡萄糖-响应性的活性不需要缀合物I-6采用的TSAT-C6框架。实际上，如在实施例中所证实的，我们已经发现：其它胰岛素-缀合的框架（诸如在图1和2中描绘的那些）可以提供类似的结果。我们的研究还提示，缀合的糖的类型和数目以及在某些情形下在胰岛素分子上的缀合点，在体内葡萄糖-响应的调节中起更重要的作用。

不希望受任何具体理论的约束，据信，通过结合内源凝集素，介导缀合物（诸如I-6）所表现出的葡萄糖-响应性。因而，我们提出下述理论：当体内的葡萄糖水平较低时，内源凝集素具有可用于结合合成的胰岛素-缀合物的葡萄糖结合部位，从而基本上灭活缀合物的胰岛素-样活性。相反，当体内的葡萄糖水平较高时，凝集素上的结合部位被内源葡萄糖饱和，因而允许合成的胰岛素-缀合物循环并发挥它的作用。图1 显示了4种糖的相对凝集素结合亲和力；在显示的4种糖中，AETM以最高的亲和力结合凝集素。我们提出下述理论：特定糖的凝集素结合亲和力至少部分地负责调节我们的合成的胰岛素-缀合物的体内葡萄糖-响应性。

常规胰岛素的持续释放制剂常用于减慢胰岛素向体循环中的释放。例如，PZI (鱼精蛋白锌胰岛素)制剂可以用于该目的。当用鱼精蛋白和锌配制常规胰岛素时，通常产生结晶的持续释放制剂。相反，当使用类似方法用鱼精蛋白和锌配制胰岛素-缀合物（诸如I-6）时，生成无定形制剂，且需要比常规胰岛素（例如RHI）所需量远远更多的鱼精蛋白和锌来提供持续释放。我们已经令人惊讶地发现：在没有诸如鱼精蛋白或锌等添加剂存在下，胰岛素-缀合物（诸如I-6）可以结晶，这不同于常规胰岛素。如本文所述，然后可以配制这些结晶胰岛素-缀合物，以提供结晶的持续释放制剂。胰岛素-缀合物的结晶制剂可以有利地提高批次之间的再现性、增加制剂稳定性和减少在长储存时期内的颗粒团聚。

缀合物

在一个方面，本公开内容提供了结晶的缀合物，其包含胰岛素分子和配体，所述配体包括第一种糖。所述一种或多种配体使得，当将所述结晶胰岛素-缀合物施用给哺乳动物时，所述缀合物的至少1种药代动力学或药效学性质对第二种糖的血清浓度是敏感的。在某些实施方案中，所述缀合物的PK和/或PD性质对内源糖（诸如葡萄糖）的血清浓度是敏感的。在某些实施方案中，所述缀合物的PK和/或PD性质对外源糖的血清浓度是敏感的，所述外源糖例如但不限于：甘露糖、L-岩藻糖、N-乙酰基葡糖胺和/或α-甲基甘露糖。

在某些实施方案中，没有胰岛素时缀合物的分子量小于约10,000 Da。例如，没有胰岛素时缀合物的分子量可以是在约250至约5,000 Da、约450至约3,500 Da、约750至约2,500 Da、或约900至约2,000 Da的范围内。

在某些实施方案中，包括胰岛素的缀合物的分子量小于约20,000 Da。例如，包括胰岛素的缀合物的分子量可以是在约2,000至约18,000 Da、约4,000至约15,000 Da、约5,000至约10000 Da、或约6,500至约8,000 Da的范围内。

在某些实施方案中，所述缀合物具有唯一分子量 (即，具有1的多分散性指数)。

PK和PD性质

在不同的实施方案中，通过糖的血清浓度的变动，可以修饰结晶胰岛素-缀合物的药代动力学和/或药效学行为。

例如，从药代动力学(PK)角度看，当糖(例如，葡萄糖)的血清浓度增加时，或当糖的血清浓度上穿阈值(例如，高于正常葡萄糖水平)时，血清浓度曲线可能向上移动。

在某些实施方案中，当施用给处于禁食和高血糖条件下的哺乳动物时，结晶胰岛素-缀合物的血清浓度曲线是基本上不同的。本文使用的术语“基本上不同的”是指，通过student t-检验(p < 0.05)测得，2条曲线是统计上不同的。本文使用的术语“禁食条件”是指，通过组合来自5个或更多个禁食的非糖尿病个体的数据所得到的血清浓度曲线。在某些实施方案中，禁食的非糖尿病个体是随机地选择的18-30岁的人，他们在在抽血时没有显现糖尿病症状，且在抽血时间的12小时内没有进食。本文使用的术语“高血糖条件”是指，通过组合来自5个或更多个禁食的非糖尿病个体的数据所得到的血清浓度曲线，其中通过同时施用缀合物和葡萄糖来诱导高血糖条件 (葡萄糖C_max比在禁食条件下观察到的平均葡萄糖浓度高至少100 mg/dL)。缀合物和葡萄糖的同时施用仅要求，在缀合物以可检测水平存在于血清中的时期内，发生葡萄糖C_max。例如，可以使葡萄糖注射(或摄入)定时发生在缀合物施用之前短时间内、同时或之后短时间内。在某些实施方案中，通过不同途径或在不同位置，施用缀合物和葡萄糖。例如，在某些实施方案中，皮下地施用缀合物，同时口服地或静脉内地施用葡萄糖。

在某些实施方案中，与禁食条件相比，在高血糖条件下缀合物的血清C_max更高。额外地或可替代地，在某些实施方案中，与禁食条件相比，在高血糖条件下缀合物的血清曲线线面积(AUC)更高。在不同的实施方案中，与禁食条件相比，在高血糖条件下缀合物的血清消除速率更慢。如在实施例中所讨论的，我们已经发现：在某些实施方案中，使用具有1个短的和1个长的半衰期的两隔室双指数模型，可以拟合缀合物的血清浓度曲线。长半衰期表现得对葡萄糖浓度特别敏感。因而，在某些实施方案中，与禁食条件相比，在高血糖条件下长半衰期更长。在某些实施方案中，禁食条件包含小于100 mg/dL (例如，80 mg/dL、70 mg/dL、60 mg/dL、50 mg/dL等)的葡萄糖C_max。在某些实施方案中，高血糖条件包含超过200 mg/dL (例如，300 mg/dL、400 mg/dL、500 mg/dL、600 mg/dL等)的葡萄糖C_max。应当理解，其它PK参数诸如平均血清停留时间(MRT)、平均血清吸收时间(MAT)等可以替代任意的前述参数使用，或一起使用。

在人、狗、猫和大鼠中的葡萄糖浓度的正常范围是60-200 mg/dL。对于具有不同正常范围的物种(例如，在迷你猪中的葡萄糖浓度的正常范围是40-150 mg/dl)，本领域技术人员能够外推下述值。低于60 mg/dL的葡萄糖浓度被视作低血糖的。高于200 mg/dL的葡萄糖浓度被视作高血糖的。在某些实施方案中，使用葡萄糖钳（glucose clamp）方法，可以测试缀合物的PK性质，当在50和200 mg/dL、50和300 mg/dL、50和400 mg/dL、50和500 mg/dL、50和600 mg/dL、100和200 mg/dL、100和300 mg/dL、100和400 mg/dL、100和500 mg/dL、100和600 mg/dL、200和300 mg/dL、200和400 mg/dL、200和500 mg/dL、200和600 mg/dL等葡萄糖浓度施用时，缀合物的血清浓度曲线可以是基本上不同的。额外地或可替代地，在所述2个葡萄糖浓度，血清T_max、血清C_max、平均血清停留时间 (MRT)、平均血清吸收时间(MAT)和/或血清半衰期可以是基本上不同的。如下面讨论的，在某些实施方案中，100 mg/dL和300 mg/dL可以用作比较葡萄糖浓度。但是，应当理解，本公开内容包括这些实施方案中的每一个，其中比较葡萄糖浓度的替代对包括但不限于下述对中的任一对：50和200 mg/dL、50和300 mg/dL、50和400 mg/dL、50和500 mg/dL、50和600 mg/dL、100和200 mg/dL、100和400 mg/dL、100和500 mg/dL、100和600 mg/dL、200和300 mg/dL、200和400 mg/dL、200和500 mg/dL、200和600 mg/dL等。

因而，在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的C_max 更高。在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的C_max高了至少50%(例如，至少100%、至少200%或至少400%)。

在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的AUC更高。在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的AUC高了至少50%(例如，至少例如，至少100%、至少200%或至少400%)。

在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的血清消除速率更慢。在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较低浓度(例如，100相对于300 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的血清消除速率快了至少25%(例如，至少50%、至少100%、至少200%或至少400%)。

如在实施例中所讨论的，我们已经发现：在某些实施方案中，使用具有1个短的和1个长的半衰期的两隔室双指数模型，可以拟合缀合物的血清浓度曲线。长半衰期表现得对葡萄糖浓度特别敏感。因而，在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，长半衰期更长。在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，长半衰期长了至少50%(例如，至少100%、至少200%或至少400%)。

在某些实施方案中，当施用给在高血糖条件下的哺乳动物时，缀合物的血清浓度曲线与未缀合形式的胰岛素的血清浓度曲线基本上相同。本文使用的术语“基本上相同”是指，通过student t-检验 (p > 0.05)测得，2条曲线之间不存在统计差异。在某些实施方案中，当在禁食条件下施用时，缀合物的血清浓度曲线基本上不同于未缀合形式的胰岛素的血清浓度曲线。在某些实施方案中，当在高血糖条件下施用时，缀合物的血清浓度曲线与未缀合形式的胰岛素的血清浓度曲线基本上相同，且当在禁食条件下施用时，基本上不同。在某些实施方案中，所述高血糖条件包含超过200 mg/dL (例如，300 mg/dL、400 mg/dL、500 mg/dL、600 mg/dL等) 的葡萄糖C_max。在某些实施方案中，所述禁食条件包含小于100 mg/dL (例如，80 mg/dL、70 mg/dL、60 mg/dL、50 mg/dL等)的葡萄糖C_max。应当理解，可以对比任意的前述PK参数，诸如血清T_max、血清C_max、AUC、平均血清停留时间 (MRT)、平均血清吸收时间(MAT)和/或血清半衰期。

从药效动力学(PD)角度看，当葡萄糖浓度增加时，或当葡萄糖浓度上穿阈值(例如，高于正常葡萄糖水平)时，缀合物的生物活性可能增加。在某些实施方案中，与高血糖条件相比，当在禁食条件下施用时，缀合物的生物活性更低。在某些实施方案中，所述禁食条件包含小于100 mg/dL (例如，80 mg/dL、70 mg/dL、60 mg/dL、50 mg/dL等)的葡萄糖C_max。在某些实施方案中，所述高血糖条件包含超过200 mg/dL (例如，300 mg/dL、400 mg/dL、500 mg/dL、600 mg/dL等)的葡萄糖C_max。

在某些实施方案中，通过测量维持稳定葡萄糖浓度所需的葡萄糖输注速率(GIR)，可以测试缀合物的PD性质。根据这样的实施方案，当在50和200 mg/dL、50和300 mg/dL、50和400 mg/dL、50和500 mg/dL、50和600 mg/dL、100和200 mg/dL、100和300 mg/dL、100和400 mg/dL、100和500 mg/dL、100和600 mg/dL、200和300 mg/dL、200和400 mg/dL、200和500 mg/dL、200和600 mg/dL等的葡萄糖浓度施用时，缀合物的生物活性可以是基本上不同的。因而，在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的生物活性更高。在某些实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的生物活性高了至少25%(例如，至少50%或至少100%)。

在某些实施方案中，通过对比达到最小血糖浓度所需的时间(T_nadir)、血糖水平保持低于起始值的特定百分比 (例如，起始值的70%或T_70%BGL)的持续时间等，可以观察胰岛素的PD行为。

一般而言，应当理解，根据多种公开的药代动力学和药效学方法中的任一种(例如，关于适合皮下递送的方法，参见Baudys 等人, Bioconjugate Chem. 9:176-183, 1998)，可以测定在本部分中讨论的PK和PD 特征中的任一个。还应当理解，可以在任意哺乳动物(例如，人、大鼠、猫、迷你猪、狗等)中测量PK和/或PD性质。在某些实施方案中，在人中测量PK和/或PD性质。在某些实施方案中，在大鼠中测量PK和/或PD性质。在迷你猪中测量在某些实施方案中，PK和/或PD性质。在某些实施方案中，在狗中测量PK和/或PD性质。

还应当理解，尽管在葡萄糖-响应性的缀合物的背景下描述了前述内容，相同的性质和试验适用于对其它糖做出响应的缀合物，所述其它糖包括外源糖，例如甘露糖、L-岩藻糖、N-乙酰基葡糖胺、α-甲基甘露糖等。如在下面和在实施例中更详细地讨论的，替代对比在禁食和高血糖条件下的PK和/或PD性质，可以在施用和不施用外源糖的情况下，在禁食条件下，对比PK和/或PD性质。应当理解，可以将缀合物设计成响应于给定外源糖的不同C_max值。

配体

一般而言，提供的结晶胰岛素-缀合物包括至少1个配体。在某些实施方案中，所述缀合物包括单个配体。在某些实施方案中，所述缀合物包括至少2个单独的配体，例如，2、3、4、5或更多个配体。当存在超过一个配体时，所述配体可以具有相同或不同的化学结构。

在某些实施方案中，所述配体能够与糖(例如，葡萄糖或甘露糖)竞争结合内源的糖-结合分子(例如，但不限于表面活性蛋白A和D或选择蛋白家族的成员)。 在某些实施方案中，所述配体能够与糖(例如，葡萄糖或甘露糖)竞争结合细胞-表面糖受体(例如，但不限于巨噬细胞甘露糖受体、葡萄糖运载体配体、内皮细胞糖受体或肝细胞糖受体)。在某些实施方案中，所述配体能够与葡萄糖竞争结合内源的葡萄糖-结合分子(例如，但不限于表面活性蛋白 A和D或选择蛋白家族的成员)。在某些实施方案中，所述配体能够与糖竞争结合非人凝集素(例如，Con A)。在某些实施方案中，所述配体能够与葡萄糖或甘露糖竞争结合非人凝集素(例如，Con A)。示例性的结合葡萄糖的凝集素包括钙联接蛋白、钙网织蛋白、N-乙酰基葡糖胺受体、选择蛋白、无唾液酸糖蛋白受体、胶原凝集素(结合甘露糖的凝集素)、甘露糖受体、聚集蛋白聚糖、多能聚糖、豌豆凝集素(PSA)、蚕豆凝集素、兵豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素、山黧豆凝集素、驴喜豆凝集素、槐凝集素、bowringia milbraedii 凝集素、伴刀豆球蛋白A (Con A)和商陆丝裂原。

在某些实施方案中，所述配体具有式(IVa)或(IVb)：

其中：

每个R¹独立地是氢、–OR^y、–N(R^y)₂、–SR^y、–O-Y、–G-Z或–CH₂R^x；

每个R^x独立地是氢、–OR^y、–N(R^y)₂、–SR^y或–O-Y；

每个R^y独立地是–R²、–SO₂R²、–S(O)R²、–P(O)(OR²)₂、–C(O)R²、–CO₂R²或–C(O)N(R²)₂；

每个Y独立地是单糖、二糖或三糖；

每个G独立地是共价键或任选地取代的C_1-9亚烷基，其中G的一个或多个亚甲基单元任选地被下述基团替换：–O–、–S–、–N(R²) –、–C(O) –、–OC(O) –、–C(O)O–、–C(O)N(R²) –、–N(R²)C(O) –、–N(R²)C(O)N(R²) –、–SO₂–、–SO₂N(R²)–、–N(R²)SO₂–或–N(R²)SO₂N(R²)–；

每个Z独立地是卤素、–N(R²)₂、–OR²、–SR²、–N₃、–C≡CR²、–CO₂R²、–C(O)R²或–OSO₂R²；且

每个R²独立地是氢或选自下述的任选地取代的基团：C_1-6 脂族，苯基，具有1-2个选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元杂环，或具有1-4个选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳基环。

在某些实施方案中，式(IVa)或(IVb)的配体是单糖。在某些实施方案中，所述配体是二糖。在某些实施方案中，所述配体是三糖。在某些实施方案中，所述配体是四糖。在某些实施方案中，所述配体包含不超过共4个单糖部分。

如上面一般地定义的，每个R¹独立地是氢、–OR^y、–N(R^y)₂、–SR^y、–O-Y、–G-Z或–CH₂R^x。在某些实施方案中，R¹是氢。在某些实施方案中，R¹是–OH。在其它实施方案中，R¹是–NHC(O)CH₃。在某些实施方案中，R¹是–O-Y。在某些其它实施方案中，R¹是–G-Z。在有些实施方案中，R¹是–CH₂OH。在其它实施方案中，R¹是–CH₂-O-Y。在其它实施方案中，R¹是–NH₂。本领域普通技术人员会理解，式(IVa)或(IVb)中的每个R¹ 取代基可以属于(R)或(S)立体化学。

如上面一般地定义的，每个R^x独立地是氢、–OR^y、–N(R^y)₂、–SR^y或–O-Y。在有些实施方案中，R^x是氢。在某些实施方案中，R^x是–OH。在其它实施方案中，R^x是–O-Y。

如上面一般地定义的，每个R^y独立地是–R²、–SO₂R²、–S(O)R²、–P(O)(OR²)₂、–C(O)R²、–CO₂R²或–C(O)N(R²)₂。在有些实施方案中，R^y是氢。在其它实施方案中，R^y是–R²。在有些实施方案中，R^y是–C(O)R²。在某些实施方案中，R^y是乙酰基。在其它实施方案中，R^y是–SO₂R²、-S(O)R²、-P(O)(OR²)₂、-CO₂R²或–C(O)N(R²)₂。

如上面一般地定义的，Y是单糖、二糖或三糖。在某些实施方案中，Y是单糖。在有些实施方案中，Y是二糖。在其它实施方案中，Y是三糖。在有些实施方案中，Y是甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖或吡喃木糖。在有些实施方案中，Y是蔗糖、麦芽糖、松二糖、海藻糖、纤维二糖或乳糖。在某些实施方案中，Y是甘露糖。在某些实施方案中，Y是D-甘露糖。本领域普通技术人员会理解，糖Y通过异头碳连接到–O-Y的氧基团上，形成糖苷键。所述糖苷键可以属于α或β构型。

如上面一般地定义的，每个G独立地是共价键或任选地取代的C_1-9亚烷基，其中G的一个或多个亚甲基单元任选地被下述基团替换：–O–、–S–、–N(R²) –、–C(O) –、–OC(O) –、–C(O)O–、–C(O)N(R²) –、–N(R²)C(O) –、–N(R²)C(O)N(R²) –、–SO₂–、–SO₂N(R²)–、–N(R²)SO₂–或–N(R²)SO₂N(R²)–。在有些实施方案中，G是共价键。在某些实施方案中，G是–O-C_1-8亚烷基。在某些实施方案中，G是–OCH₂CH₂–。

如上面一般地定义的，每个Z独立地是卤素、–N(R²)₂、–OR²、–SR²、–N₃、–C≡CR²、–CO₂R²、–C(O)R²或–OSO₂R²。在有些实施方案中，Z是卤素或–OSO₂R²。在其它实施方案中，Z是–N₃或-C≡CR²。在某些实施方案中，Z是–N(R²)₂、-OR²或–SR²。在某些实施方案中，Z是–SH。在某些实施方案中，Z是–NH₂。在某些实施方案中，-G-Z是–OCH₂CH₂NH₂。

在有些实施方案中，在式(IVa)的C1碳上的R¹取代基是–G-Z，得到式(IVa-i)的化合物:

其中R¹、G和Z如本文所定义和所述。

在有些实施方案中，所述配体具有式(IVa-ii):

其中R¹、R^x、G和Z如本文所定义和所述。

在某些实施方案中，所述配体可以具有与葡萄糖相同的化学结构，或可以是葡萄糖的化学上有关的物质。在不同的实施方案中，配体可以有利地具有与葡萄糖不同的化学结构，例如，为了精细调节缀合物的葡萄糖响应。例如，在某些实施方案中，可以使用包含葡萄糖、甘露糖、L-岩藻糖或它们的衍生物(例如，α-L-吡喃岩藻糖苷、甘露糖胺、β-连接的N-乙酰基甘露糖胺、甲基葡萄糖、甲基甘露糖、乙基葡萄糖、乙基甘露糖、丙基葡萄糖、丙基甘露糖等)和/或它们的更高阶组合 (例如，二甘露糖、线性的和/或分支的三甘露糖等)的配体。

在某些实施方案中，所述配体包括单糖。在某些实施方案中，所述配体包括二糖。在某些实施方案中，所述配体包括三糖。在有些实施方案中，所述配体包含糖和一个或多个胺基。在某些实施方案中，所述糖和胺基被C₁-C₆烷基（例如，C₁-C₃烷基）隔开。在有些实施方案中，所述配体是氨基乙基葡萄糖(AEG)。在有些实施方案中，所述配体是氨基乙基甘露糖 (AEM)。在有些实施方案中，所述配体是氨基乙基二甘露糖 (AEBM)。在有些实施方案中，所述配体是氨基乙基三甘露糖(AETM)。在有些实施方案中，所述配体是β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)。在有些实施方案中，所述配体是氨基乙基岩藻糖 (AEF)。在某些实施方案中，糖配体属于“d”构型。在其它实施方案中，糖配体属于“l”构型。我们在下面显示了这些示例性的配体的结构。本领域技术人员会认识到其它示例性的配体。

一般而言，配体可以直接地或间接地(即，通过连接物或框架) 缀合到胰岛素分子上。如下面更详细地讨论的，配体可以天然地存在于缀合物框架内(例如，作为聚合物主链的一部分，或作为单体的侧基)。替代地(或额外地)， 可以将配体人工地掺入缀合物框架内(例如，以合成地添加到缀合物框架上的化学基团的形式)。在某些实施方案中，缀合物可以包括框架，所述框架包含5个或更多个、10个或更多个、或20个或更多个配体。在某些实施方案中，缀合物可以包含少至1、2、3、4或5个单独的配体。

在某些实施方案中，通过不同的缀合点，将至少2个单独的配体缀合到胰岛素分子上。在某些实施方案中，将至少2个单独的配体缀合到单个缀合物框架上，所述框架也缀合到胰岛素分子上。在有些实施方案中，将至少1个配体（诸如AETM、AEG、AEM、AEBM、AEGA或AEF）缀合到1个胰岛素分子上。在某些实施方案中，将至少1个AETM 配体缀合物到1个胰岛素分子上。在有些实施方案中，通过一个缀合点或多个缀合点，将至少2个配体（诸如AETM、AEG、AEM、AEBM、AEGA或AEF）缀合到1个胰岛素分子上。在某些实施方案中，所述至少2个配体不是相同的配体。在某些实施方案中，所述至少2个配体是相同的配体。在某些实施方案中，通过一个缀合点或多个缀合点，将至少2个AETM 配体缀合到1个胰岛素分子上。

在某些实施方案中，通过C1、C2或C6位置，缀合(直接地，或经由连接物间接地)在一个或多个配体内的糖。在某些实施方案中，所述缀合涉及C1位。糖的C1位也称作异头碳，且可以添加到处于α或β 构象的胰岛素分子或缀合物框架上。在某些实施方案中，所述C1位构造成α异头物。在其它实施方案中，所述C1位构造成β 异头物。

胰岛素

本文使用的术语“胰岛素”或“胰岛素分子”包括胰岛素分子的所有盐和非盐形式。应当理解，所述盐形式可以是阴离子的或阳离子的，取决于胰岛素分子。“胰岛素”或“胰岛素分子”意在包括胰岛素的野生型和修饰形式，只要它们是生物活性的(即，当体内施用时，能够造成葡萄糖的可检测的减少)。野生型胰岛素包括来自任意物种的纯化的、合成的或重组形式的胰岛素 (例如，人胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素、兔胰岛素、绵羊胰岛素等)。它们中的许多可商业得到，例如，购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。胰岛素的多种修饰形式是本领域已知的(例如参见Crotty和Reynolds, Pediatr. Emerg. Care. 23:903-905, 2007和Gerich, Am. J. Med. 113:308-16, 2002和其中引用的参考文献)。胰岛素的修饰形式可以是化学修饰的(例如，通过添加化学部分，诸如PEG基团或脂肪酰基链，如下所述)和/或突变的 (即，通过添加、删除或置换一个或多个氨基酸)。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素相差1-10 (例如，1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-9、5-8、5-7、5-6、6-9、6-8、6-7、7-9、7-8、8-9、9、8、7、6、5、4、3、2或1)个氨基酸置换、添加和/或删除。在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素仅相差氨基酸置换。在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素仅相差氨基酸添加。在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素相差氨基酸置换和添加。在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素相差氨基酸置换和删除。

在某些实施方案中，基于涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性，可以进行氨基酸置换。在某些实施方案中，置换可以是保守的，也就是说，用一个具有类似形状和电荷的氨基酸替换一个氨基酸。保守置换是本领域众所周知的，且通常包括在下述组内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；门冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和酪氨酸、苯丙氨酸。在某些实施方案中，在选择合适的突变时，可以考虑氨基酸的疏水指数。本领域通常理解疏水氨基酸指数在赋予多肽的相互作用生物功能中的重要性。或者，基于亲水性，可以有效地进行类似氨基酸的置换。本领域通常理解亲水性在赋予多肽的相互作用生物功能中的重要性。在美国专利号5,691,198中，进一步讨论了疏水指数或亲水性在设计多肽中的应用。

在下面和在图33中，显示了人胰岛素(A-链和B-链)的野生型序列。

A-链 (SEQ ID NO:1)：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN

B-链 (SEQ ID NO:2)： FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT

人胰岛素与兔、猪、牛和绵羊胰岛素的差别仅在于氨基酸A8、A9、A10和B30 (参见下表)。

在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子在B-肽序列的B28和/或B29位置处突变。例如，赖脯胰岛素(HUMALOG®)是一种速效胰岛素突变体，其中在B-肽的C-端末端上的倒数第二位的赖氨酸和脯氨酸残基已经反转(Lys^B28Pro^B29-人胰岛素)。该修饰会阻断胰岛素多聚体的形成。门冬胰岛素(NOVOLOG®)是另一种速效胰岛素突变体，其中在位置B28处的脯氨酸已经被门冬氨酸置换 (Asp^B28-人胰岛素)。该突变体也会阻止多聚体的形成。在有些实施方案中，在位置B28和/或B29处的突变伴有一个或多个在胰岛素多肽别处的突变。例如，谷赖胰岛素(APIDRA®)是另一种速效胰岛素突变体，其中在位置B3处的门冬氨酸已经被赖氨酸残基替换，且在位置B29处的赖氨酸已经被谷氨酸残基替换 (Lys^B3Glu^B29-人胰岛素)。

在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子具有与人胰岛素相比迁移的等电点。在有些实施方案中，通过将一个或多个精氨酸残基添加到胰岛素A-肽的N-端和/或胰岛素B-肽的C-端，实现等电点迁移。这样的胰岛素多肽的实例包括Arg^A0-人胰岛素、Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、Arg^A0Arg^B31Arg^B32-人胰岛素和Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素。作为其它实例，甘精胰岛素(来得时®)是一种示例性的长效胰岛素突变体，其中Asp^A21已经被甘氨酸替换，且2个精氨酸残基已经添加到B-肽的C-端。这些变化的作用是迁移等电点，产生在pH 4完全可溶的溶液。因而，在有些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含A-肽序列（其中A21是Gly）和B-肽序列（其中B31是Arg-Arg）。应当理解，本公开内容包括这些突变和本文所述的任意其它突变的所有单个和多个组合 (例如，Gly^A21-人胰岛素、Gly^A21Arg^B31-人胰岛素、Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、Arg^B31-人胰岛素)。

在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子被截短。例如，在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素多肽的B-肽序列缺少B1、B2、B3、B26、B27、B28、B29和/或B30。在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素多肽的B-肽序列缺少残基组合。例如，所述B-肽序列可以缺少残基 B(1-2)、B(1-3)、B(29-30)、B(28-30)、B(27-30)和/或B(26-30)。在有些实施方案中，这些删除和/或截短适用于任意的前述胰岛素分子 (例如，但不限于生成des(B30)-赖脯胰岛素、des(B30)-门冬胰岛素、des(B30)-谷赖胰岛素、des(B30)-甘精胰岛素等)。

在有些实施方案中，胰岛素分子含有在A或B-肽序列的N-或C-端上的额外的氨基酸残基。在有些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置A0、A21、B0和/或B31。在有些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置A0。在有些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置A21。在有些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置B0。在有些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置B31。在某些实施方案中，胰岛素分子不包含在任何额外的在位置A0、A21、B0或B31处的氨基酸残基。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子被突变，使得一个或多个酰胺化的氨基酸被酸形式替换。例如，可以用门冬氨酸或谷氨酸替换天冬酰胺。同样地，可以用门冬氨酸或谷氨酸替换谷氨酰胺。具体地，可以用门冬氨酸或谷氨酸替换Asn^A18、Asn^A21或Asn^B3或那些残基的任意组合。可以用门冬氨酸或谷氨酸替换Gln^A15或Gln^B4或二者。在某些实施方案中，胰岛素分子具有在位置A21处的门冬氨酸或在位置B3处的门冬氨酸或二者。

本领域技术人员会认识到:可能突变胰岛素分子中的其它氨基酸，同时保留生物活性。例如但不限于下述的修饰也是本领域广泛接受的：用门冬氨酸替换在位置B10的组氨酸残基(His^B10→Asp^B10)；用门冬氨酸替换在位置B1的苯丙氨酸残基(Phe^B1→Asp^B1)；用丙氨酸替换在位置B30的苏氨酸残基(Thr^B30→Ala^B30)；用丙氨酸替换在位置B26的酪氨酸残基(Tyr^B26→Ala^B26)；和用门冬氨酸替换在位置B9的丝氨酸残基(Ser^B9→Asp^B9)。

在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子具有延长的作用特性。因而，在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子可以被脂肪酸酰化。也就是说，在胰岛素分子的氨基和脂肪酸的羧酸基团之间形成酰胺键。所述氨基可以是胰岛素分子的N-端氨基酸的α-氨基，或可以是胰岛素分子的赖氨酸残基的ε-氨基。本公开内容的胰岛素分子可以在野生型胰岛素中存在的3个氨基中的一个或多个处被酰化，或可以在已经导入到野生型序列中的赖氨酸残基上被酰化。在某些实施方案中，胰岛素分子可以在位置B1处被酰化。在某些实施方案中，胰岛素分子可以在位置B29处被酰化。在某些实施方案中，所述脂肪酸选自肉豆蔻酸 (C14)、十五酸 (C15)、棕榈酸 (C16)、十七酸(C17)和硬脂酸 (C18)。例如，地特胰岛素(LEVEMIR®)是一种长效胰岛素突变体，其中Thr^B30已经被删除，且C14 脂肪酸链(肉豆蔻酸)已经添加到Lys^B29上。

在有些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子的A-肽的N-端、B-肽的N-端、位于位置B29的Lys的ε-氨基或任意其它可利用的氨基共价地连接到下述通式的脂肪酸部分上：

其中R^F是氢或C_1-30烷基。在有些实施方案中，R^F是C_1-20烷基、C_3-19烷基、C_5-18烷基、C_6-17烷基、C_8-16烷基、C_10-15烷基或C_12-14烷基。在某些实施方案中，所述胰岛素多肽在A1位置处缀合到该部分上。在某些实施方案中，所述胰岛素多肽在B1位置处缀合到该部分上。在某些实施方案中，所述胰岛素多肽在位于位置B29的Lys的ε-氨基处缀合到该部分上。在某些实施方案中，胰岛素分子的位置B28是Lys，且Lys^B28的ε-氨基缀合到该脂肪酸部分上。在某些实施方案中，胰岛素分子的位置B3是Lys，且Lys^B3的ε-氨基缀合到该脂肪酸部分上。在有些实施方案中，所述脂肪酸链的长度是8-20个碳。在有些实施方案中，所述脂肪酸是辛酸 (C8)、壬酸 (C9)、癸酸 (C10)、十一烷酸 (C11)、十二烷酸 (C12)或十三烷酸 (C13)。在某些实施方案中，所述脂肪酸是肉豆蔻酸 (C14)、十五烷酸 (C15)、棕榈酸 (C16)、十七烷酸 (C17)、硬脂酸 (C18)、十九烷酸 (C19)或花生酸 (C20)。例如，地特胰岛素 (LEVEMIR®)是一种长效胰岛素突变体，其中Thr^B30已经被删除，且C14 脂肪酸链(肉豆蔻酸)连接到Lys^B29上。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：Lys^B28Pro^B29-人胰岛素(赖脯胰岛素)、Asp^B28-人胰岛素(门冬胰岛素)、Lys^B3Glu^B29-人胰岛素(谷赖胰岛素)、Arg^B31Arg^B32-人胰岛素(甘精胰岛素)、N^{ε B29}-肉豆蔻酰基-des(B30)-人胰岛素(地特胰岛素)、Ala^B26-人胰岛素、Asp^B1-人胰岛素、Arg^A0-人胰岛素、Asp^B1Glu^B13-人胰岛素、Gly^A21-人胰岛素、Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、Arg^A0Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、des(B30)-人胰岛素、des(B27)-人胰岛素、des(B28-B30)-人胰岛素、des(B1)-人胰岛素、des(B1-B3)-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-棕榈酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-肉豆蔻酰基-人胰岛素、N^{ε B28}-棕榈酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-肉豆蔻酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-棕榈酰基-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B30}-肉豆蔻酰基-Thr^B29Lys^B30-人胰岛素、N^{ε B30}-棕榈酰基-Thr^B29Lys^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-(N-棕榈酰基-γ-谷氨酰基)-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-(N-lithocolyl-γ-谷氨酰基)-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-(ω-羧基十七酰基)-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-(ω-羧基十七酰基)-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-辛酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-肉豆蔻酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B31-人胰岛素、N^{ε B29}-肉豆蔻酰基-Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-肉豆蔻酰基-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-肉豆蔻酰基-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-肉豆蔻酰基-Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-肉豆蔻酰基-Arg^A0Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-辛酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-辛酰基-Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-辛酰基-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-辛酰基-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-辛酰基-Arg^B0Gly^A21Asp^B3Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-辛酰基-Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-辛酰基-Arg^A0Arg^B31Arg^B32-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素多肽之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B28}-肉豆蔻酰基-Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B28}-肉豆蔻酰基-Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B30Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B28}-肉豆蔻酰基-Arg^A0Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B28}-肉豆蔻酰基-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B28}-肉豆蔻酰基-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B28}-肉豆蔻酰基-Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B28}-肉豆蔻酰基-arg^A0Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B28}-辛酰基-Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B28}-辛酰基-Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B28}-辛酰基-Arg^A0Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B28}-辛酰基-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B28}-辛酰基-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B28}-辛酰基-Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B28}-辛酰基-Arg^A0Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-十三酰基-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十三酰基-Gly^A21-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Gly^A21-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Gly^A21-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Gly^A21-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十三酰基-Gly^A21Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Gly^A21Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Gly^A21-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Gly^A21-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十三酰基-Ala^A21-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Ala^A21-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Ala^A21-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Ala^A21-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十三酰基-Ala^A21-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Ala^A21Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Ala^A21Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Ala^A21Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十三酰基-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Gln^B3-des(B30)-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-十三酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^{ε B29}-十三酰基-Ala^A21-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Ala^A21-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Ala^A21-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Ala^A21-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-十三酰基-Gly^A21Gln^B3-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Gly^A21Gln^B3-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Gly^A21Gln^B3-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Gly^A21Gln^B3-人胰岛素、N^{ε B29}-十三酰基-Ala^A21Gln^B3-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Ala^A21Gln^B3-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Ala^A21Gln^B3-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Ala^A21Gln^B3-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-十三酰基-Gln^B3-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Gln^B3-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Gln^B3-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Gln^B3-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-十三酰基-Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Glu^B30-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-十三酰基-Gly^A21Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Gly^A21Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Gly^A21Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Gly^A21Glu^B30-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-十三酰基-Gly^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Gly^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Gly^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Gly^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十三酰基-Ala^A21Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Ala^A21Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Ala^A21Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Ala^A21Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十三酰基-Ala^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Ala^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Ala^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Ala^A21Gln^B3Glu^B30-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-十三酰基-Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十四酰基-Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-Gln^B3Glu^B30-人胰岛素、N^{ε B29}-十二烷酰基-Gln^B3Glu^B30-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-甲酰基-人胰岛素、N^{α B1}-甲酰基-人胰岛素、N^{α A1}-甲酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-甲酰基-N^{α B1}-甲酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-甲酰基-N^{α A1}-甲酰基-人胰岛素、N^{α A1}-甲酰基-N^{α B1}-甲酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-甲酰基-N^{α A1}-甲酰基-N^{α B1}-甲酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-乙酰基-人胰岛素、N^{α B1}-乙酰基-人胰岛素、N^{α A1}-乙酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-乙酰基-N^{α B1}-乙酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-乙酰基-N^{α A1}-乙酰基-人胰岛素、N^{α A1}-乙酰基-N^{α B1}-乙酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-乙酰基-N^{α A1}-乙酰基-N^{α B1}-乙酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-丙酰基-人胰岛素、N^{α B1}-丙酰基-人胰岛素、N^{α A1}-丙酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-乙酰基-N^{α B1}-丙酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-丙酰基-N^{α A1}-丙酰基-人胰岛素、N^{α A1}-丙酰基-N^{α B1}-丙酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-丙酰基-N^{α A1}-丙酰基-N^{α B1}-丙酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-丁酰基-人胰岛素、N^{α B1}-丁酰基-人胰岛素、N^{α A1}-丁酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-丁酰基-N^{α B1}-丁酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-丁酰基-N^{α A1}-丁酰基-人胰岛素、N^{α A1}-丁酰基-N^{α B1}-丁酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-丁酰基-N^{α A1}-丁酰基-N^{α B1}-丁酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-戊酰基-人胰岛素、N^{α B1}-戊酰基-人胰岛素、N^{α A1}-戊酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-戊酰基-N^{α B1}-戊酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-戊酰基-N^{α A1}-戊酰基-人胰岛素、N^{α A1}-戊酰基-N^{α B1}-戊酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-戊酰基-N^{α A1}-戊酰基-N^{α B1}-戊酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-己酰基-人胰岛素、N^{α B1}-己酰基-人胰岛素、N^{α A1}-己酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-己酰基-N^{α B1}-己酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-己酰基-N^{α A1}-己酰基-人胰岛素、N^{α A1}-己酰基-N^{α B1}-己酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-己酰基-N^{α A1}-己酰基-N^{α B1}-己酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-庚酰基-人胰岛素、N^{α B1}-庚酰基-人胰岛素、N^{α A1}-庚酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-庚酰基-N^{α B1}-庚酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-庚酰基-N^{α A1}-庚酰基-人胰岛素、N^{α A1}-庚酰基-N^{α B1}-庚酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-庚酰基-N^{α A1}-庚酰基-N^{α B1}-庚酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{α B1}-辛酰基-人胰岛素、N^{α A1}-辛酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-辛酰基-N^{α B1}-辛酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-辛酰基-N^{α A1}-辛酰基-人胰岛素、N^{α A1}-辛酰基-N^{α B1}-辛酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-辛酰基-N^{α A1}-辛酰基-N^{α B1}-辛酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-壬酰基-人胰岛素、N^{α B1}-壬酰基-人胰岛素、N^{α A1}-壬酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-壬酰基-N^{α B1}-壬酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-壬酰基-N^{α A1}-壬酰基-人胰岛素、N^{α A1}-壬酰基-N^{α B1}-壬酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-壬酰基-N^{α A1}-壬酰基-N^{α B1}-壬酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-癸酰基-人胰岛素、N^{α B1}-癸酰基-人胰岛素、N^{α A1}-癸酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-N^{α B1}-癸酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-N^{α A1}-癸酰基-人胰岛素、N^{α A1}-癸酰基-N^{α B1}-癸酰基-人胰岛素、N^{ε B29}-癸酰基-N^{α A1}-癸酰基-N^{α B1}-癸酰基-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B28}-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α B1}-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-甲酰基-N^{α B1}-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-甲酰基-N^{α A1}-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-甲酰基-N^{α B1}-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-甲酰基-N^{α A1}-甲酰基-N^{α B1}-甲酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B29}-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α B1}-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-乙酰基-N^{α B1}-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B28}-乙酰基-N^{α A1}-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-乙酰基-N^{α B1}-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-乙酰基-N^{α A1}-乙酰基-N^{α B1}-乙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B28}-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α B1}-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-丙酰基-N^{α B1}-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-丙酰基-N^{α A1}-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-丙酰基-N^{α B1}-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-丙酰基-N^{α A1}-丙酰基-N^{α B1}-丙酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B28}-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α B1}-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-丁酰基-N^{α B1}-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-丁酰基-N^{α A1}-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-丁酰基-N^{α B1}-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-丁酰基-N^{α A1}-丁酰基-N^{α B1}-丁酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B28}-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α B1}-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-戊酰基-N^{α B1}-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-戊酰基-N^{α A1}-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-戊酰基-N^{α B1}-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-戊酰基-N^{α A1}-戊酰基-N^{α B1}-戊酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B28}-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α B1}-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-己酰基-N^{α B1}-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-己酰基-N^{α A1}-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-己酰基-N^{α B1}-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-己酰基-N^{α A1}-己酰基-N^{α B1}-己酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B28}-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α B1}-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-庚酰基-N^{α B1}-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-庚酰基-N^{α A1}-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-庚酰基-N^{α B1}-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-庚酰基-N^{α A1}-庚酰基-N^{α B1}-庚酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B28}-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α B1}-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-辛酰基-N^{α B1}-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-辛酰基-N^{α A1}-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-辛酰基-N^{α B1}-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-辛酰基-N^{α A1}-辛酰基-N^{α B1}-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B28}-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α B1}-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-壬酰基-N^{α B1}-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-壬酰基-N^{α A1}-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-壬酰基-N^{α B1}-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-壬酰基-N^{α A1}-壬酰基-N^{α B1}-壬酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B28}-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α B1}-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-癸酰基-N^{α B1}-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-癸酰基-N^{α A1}-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{α A1}-癸酰基-N^{α B1}-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、N^{ε B28}-癸酰基-N^{α A1}-癸酰基-N^{α B1}-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

在某些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含下述胰岛素分子之一的突变和/或化学修饰：N^{ε B29}-戊酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{α B1}-己酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{α A1}-庚酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-辛酰基-N^{α B1}-辛酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-丙酰基-N^{α A1}-丙酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{α A1}-乙酰基-N^{α B1}-乙酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-甲酰基-N^{α A1}-甲酰基-N^{α B1}-甲酰基-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-人胰岛素、N^{ε B29}-甲酰基-des(B26)-人胰岛素、N^{α B1}-乙酰基-Asp^B28-人胰岛素、N^{ε B29}-丙酰基-N^{α A1}-丙酰基-N^{α B1}-丙酰基-Asp^B1Asp^B3AspB²¹-人胰岛素、N^{ε B29}-戊酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^{α B1}-己酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^{α A1}-庚酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^{ε B29}-辛酰基-N^{α B1}-辛酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^{ε B29}-丙酰基-N^{α A1}-丙酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^{α A1}-乙酰基-N^{α B1}-乙酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^{ε B29}-甲酰基-N^{α A1}-甲酰基-N^{α B1}-甲酰基-Gly^A21-人胰岛素、N^{ε B29}-丁酰基-des(B30)-人胰岛素、N^{α B1}-丁酰基-des(B30)-人胰岛素、N^{α A1}-丁酰基-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-丁酰基-N^{α B1}-丁酰基-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-丁酰基-N^{α A1}-丁酰基-des(B30)-人胰岛素、N^{α A1}-丁酰基-N^{α B1}-丁酰基-des(B30)-人胰岛素、N^{ε B29}-丁酰基-N^{α A1}-丁酰基-N^{α B1}-丁酰基-des(B30)-人胰岛素。

本公开内容也包括非人胰岛素(例如，猪胰岛素、牛胰岛素、兔胰岛素、绵羊胰岛素等)的修饰形式，其包含任一种前述突变和/或化学修饰。

这些和其它修饰的胰岛素分子详细描述在美国专利号6,906,028、6,551,992、6,465,426、6,444,641、6,335,316、6,268,335、6,051,551、6,034,054、5,952,297、5,922,675、5,747,642、5,693,609、5,650,486、5,547,929、5,504,188、5,474,978、5,461,031和4,421,685和美国专利号 7,387,996、6,869,930、6,174,856、6,011,007、5,866,538和5,750,497中，它们的整个公开内容通过引用并入本文。

在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包括3个野生型二硫键 (即，1个在A-链的位置7和B-链的位置7之间，第2个在A-链的位置20和B-链的位置19之间，第3个在A-链的位置6和11之间)。

在有些实施方案中，修饰和/或突变胰岛素分子，以降低它对胰岛素受体的亲和力。不希望限于特定理论，据信，通过修饰 (例如，酰基化)或突变来减弱胰岛素分子的受体亲和力，可以降低从血清中消除胰岛素分子的速率。在有些实施方案中，降低的胰岛素受体亲和力在体外翻译成胰岛素-缀合物的优良体内活性。在某些实施方案中，胰岛素分子被突变，使得突变位点用作缀合点，且在突变位点处的缀合会减少与胰岛素受体的结合(例如，Lys^A3)。在某些其它实施方案中，在现有的野生型氨基酸或末端处的缀合会减少与胰岛素受体的结合(例如，Gly^A1)。在有些实施方案中，在位置A4、A5、A8、A9或B30处，缀合胰岛素分子。在某些实施方案中，通过野生型氨基酸侧链(例如，Glu^A4)，发生在位置A4、A5、A8、A9或B30处的缀合。在某些其它实施方案中，在位置A4、A5、A8、A9或B30处突变胰岛素分子，以提供缀合位点(例如，Lys^A4、Lys^A5、Lys^A8、Lys^A9或Lys^B30)。

下面描述了缀合胰岛素分子的方法。在某些实施方案中，通过A1氨基酸残基，将胰岛素分子缀合到配体或缀合物框架上。在某些实施方案中，所述A1氨基酸残基是甘氨酸。但是，应当理解，本公开内容不限于N-端缀合，且在某些实施方案中，可以通过非末端A-链氨基酸残基来缀合胰岛素分子。具体地，本公开内容包括通过在A-链的任意位置处存在的赖氨酸残基(野生型或通过定点诱变导入)的ε-胺基进行缀合。应当理解，在A-链上的不同缀合位置可以导致胰岛素活性的不同降低。具体地，本公开内容包括通过在B-链的任意位置处存在的赖氨酸残基(野生型或通过定点诱变导入)的ε-胺基进行缀合。例如，在某些实施方案中，可以通过B29 赖氨酸残基来缀合胰岛素分子。

示例性的胰岛素-缀合物

在不同的实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到一个或多个配体上的胰岛素分子，所述配体独立地选自：氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖 (AEM)、氨基乙基二甘露糖 (AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖 (AEF)。在某些实施方案中，通过Lys^B29的ε-氨基，缀合胰岛素分子。

在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到一个或多个氨基乙基葡萄糖(AEG)配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到一个或多个氨基乙基甘露糖 (AEM)配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到一个或多个氨基乙基二甘露糖 (AEBM)配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到一个或多个氨基乙基三甘露糖(AETM)配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到一个或多个β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到一个或多个氨基乙基岩藻糖 (AEF)配体上的胰岛素分子。

在不同的实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到2个或更多个单独的配体上的胰岛素分子。在有些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到2个单独的配体上的胰岛素分子。在其它实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到3个单独的配体上的胰岛素分子。在某些实施方案中，这样的结晶胰岛素-缀合物的2个或更多个单独的配体是氨基乙基葡萄糖(AEG)。在某些实施方案中，这样的结晶胰岛素-缀合物的2个或更多个单独的配体是氨基乙基甘露糖 (AEM)。在某些实施方案中，这样的结晶胰岛素-缀合物的2个或更多个单独的配体是氨基乙基二甘露糖 (AEBM)。在某些实施方案中，这样的结晶胰岛素-缀合物的2个或更多个单独的配体是氨基乙基三甘露糖(AETM)。在某些实施方案中，这样的结晶胰岛素-缀合物的2个或更多个单独的配体是β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)。在某些实施方案中，这样的结晶胰岛素-缀合物的2个或更多个单独的配体是氨基乙基岩藻糖 (AEF)。

在不同的实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到单个缀合物框架上的2个或更多个单独的配体，所述框架也缀合到胰岛素分子上。在有些实施方案中，这样的结晶胰岛素-缀合物的2个或更多个单独的配体和胰岛素分子各自位于单个分支的缀合物框架的单独分支上。在有些实施方案中，这样的结晶胰岛素-缀合物的2个或更多个单独的配体和胰岛素分子各自位于单个分支的缀合物框架的单独分支的末端上。

在不同的实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到氨基乙基葡萄糖(AEG)上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含通过Lys^B29的ε-氨基缀合到氨基乙基葡萄糖(AEG)上的胰岛素分子。

在不同的实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到氨基乙基甘露糖 (AEM)上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含通过Lys^B29的ε-氨基缀合到氨基乙基甘露糖 (AEM)上的胰岛素分子。

在不同的实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到氨基乙基二甘露糖 (AEBM)上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含通过Lys^B29的ε-氨基缀合到氨基乙基二甘露糖 (AEBM)上的胰岛素分子。

在不同的实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到氨基乙基三甘露糖(AETM)上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含通过Lys^B29的ε-氨基缀合到氨基乙基三甘露糖(AETM)上的胰岛素分子。

在不同的实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含通过Lys^B29的ε-氨基缀合到β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)上的胰岛素分子。

在不同的实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含缀合到氨基乙基岩藻糖 (AEF)上的胰岛素分子。在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物包含通过Lys^B29的ε-氨基缀合到氨基乙基岩藻糖 (AEF)上的胰岛素分子。

缀合物框架

本部分描述了一些示例性缀合物框架。在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物可以具有通式(I)：

其中：

每次出现的

表示缀合物内的潜在分支；

每次出现的表示缀合物分支内的潜在重复；

每次出现的

独立地是共价键、碳原子、杂原子或选自下述的任选地取代的基团：酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环；

每次出现的T独立地是共价键或二价的、直链的或分支的、饱和的或不饱和的、任选地取代的C_1-30烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被下述基团替换：-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R)SO₂-、-SO₂N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基；

每次出现的R独立地是氢、合适的保护基或酰基部分、芳基烷基部分、脂族部分、芳基部分、杂芳基部分或杂脂族部分；

–B是–T–L^B–X；

每次出现的X独立地是配体，所述配体包括糖；

每次出现的L^B独立地是共价键或通过将T与X共价缀合衍生出的基团；

–D是–T–L^D–W^I；

W^I是胰岛素分子；

每次出现的L^D独立地是共价键或通过将T与W^I 共价缀合衍生出的基团；

k是1-12的整数，包括端值；

每次出现的p独立地是1-5的整数，包括端值；且

每次出现的n独立地是0-5的整数，包括端值；且

每次出现的m独立地是1-5的整数，包括端值；且

每次出现的v独立地是0-5的整数，包括端值，条件是：在每个k-分支内，n的至少1次出现是≥ 1，且v的至少1次出现是≥ 1。

应当理解，通式(I) (和本文中的其它通式)没有特别地列出每个氢。例如，如果中央的

是C₆芳基且k < 5，应当理解，在C₆芳基环上的开放位置包括氢。

一般而言，应当理解，每次出现的

表示潜在的分支节点，且在每个节点处的分支的数目由k（对于中央的）和n（对于未出现在中央的

）的值决定。普通技术人员会理解，因为每次出现的n可以是0-5的整数，本公开内容预见到这些缀合物的线性的、分支的和多分支的(例如，树枝状聚合物-样)实施方案。要求的条件是：在每个k-分支内，n的至少1次出现是≥ 1，且v的至少1次出现是≥ 1，从而确保每种缀合物包括B(即，配体)的至少1次出现。

在某些实施方案中，在p-括号的部分中每次出现的

被许多 n-括号的部分取代，对应着n ≥ 1的值。例如，当在2个k-分支中k = 2且p = 2时，所述缀合物可以具有式(Ia):

。

在其它实施方案中，在p-括号的部分中仅在末端出现的

被许多 n-括号的部分取代，对应着n ≥ 1的值。例如，当在2个k-分支中k = 2且p = 2(且对于在2个k-分支中的第一个p-括号的部分，n = 0)时，所述缀合物可以具有式(Ib):

。

在某些实施方案中，在m-括号的部分中每次出现的被许多 B部分取代，对应着v ≥ 1的值。例如，当k = 2、每次出现的p = 1且每次出现的m = 2时，所述缀合物可以具有式(Ic):

。

在其它实施方案中，在m-括号的部分中仅在末端出现的

被许多 B部分取代，对应着v ≥ 1的值。例如，当k = 2、每次出现的p = 1且每次出现的m = 2 (且对于在每个n-分支中的第一个m-括号的部分，v = 0)时，所述缀合物可以具有式(Id):

。

作为其它实例，当在前式的2个k-分支中n = 1时，所述缀合物可以具有式(Ie):

。

或者，当在前式的2个k-分支中n = 2时, 所述缀合物可以具有式(If):

。

示例性基团的描述

(节点)

在某些实施方案中，每次出现的

是选自下述的任选地取代的基团：酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环。在有些实施方案中，每次出现的

是相同的。在有些实施方案中，中央的

不同于所有其它出现的

。在某些实施方案中，除了中央的

以外，所有出现的

是相同的。

在有些实施方案中，

是任选地取代的芳基或杂芳基。在有些实施方案中，

是6元芳基。在某些实施方案中，

是苯基。

在某些实施方案中，是选自N、O或S的杂原子。在有些实施方案中，

是氮原子。在有些实施方案中，

是氧原子。在有些实施方案中，

是硫原子。在有些实施方案中，

是碳原子。

T (间隔物)

在某些实施方案中，每次出现的T独立地是二价的、直链的或分支的、饱和的或不饱和的、任选地取代的C_1-20烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被下述基团替换：-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R)SO₂-、-SO₂N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基。在某些实施方案中，T的1、2、3、4或5个亚甲基单元任选地且独立地被替换。在某些实施方案中，T是从C_1-10、C_1-8、C_1-6、C_1-4、C_2-12、C_4-12、C_6-12、C_8-12或C_10-12烃链构建，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被下述基团替换：-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R)SO₂-、-SO₂N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基。在有些实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被杂环基替换。在有些实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被三唑部分替换。在某些实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被-C(O)-替换。在某些实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被-C(O)N(R)-替换。在某些实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被-O-替换。

在有些实施方案中，T是

。

在有些实施方案中，T是

。

在有些实施方案中，T是

。

在有些实施方案中，T是

。

在有些实施方案中，T是。

在有些实施方案中，T是

。

在某些实施方案中，每次出现的T是相同的。

在某些实施方案中，每次出现的T (在基团B和D之外)是共价键，且所述缀合物具有通式(II):

其中

、B、D、v、m、n、p、k和j如本文所定义和所述。

在通式(II)的某些实施方案中，每次出现的

（除了中央的以外）是共价键，每次出现的v = 1，且所述缀合物具有式(III):

其中

、B、D、q、k和j如本文所定义和所述。

在式(III)的某些这样的实施方案中，k = 1。

在其它实施方案中，k = 2。

在其它实施方案中，k = 3。

在有些实施方案中，本公开内容提供了通式(IIIa)的缀合物:

其中B和D如本文所定义和所述。

例如，在有些实施方案中，本公开内容提供了下式的缀合物:

；

；或

。

其中W^I和X如本文所定义和所述。

在有些实施方案中，本公开内容提供了通式(IIIb)的缀合物:

其中B和D如本文所定义和所述。

例如，在有些实施方案中，本公开内容提供了下式的缀合物：

；

；

；或

，

其中W^I和X如本文所定义和所述。

例如，在有些实施方案中，本公开内容提供了下式的缀合物：

；

；或

，

其中W^I和X 如本文所定义和所述。

在有些实施方案中，本公开内容提供了通式(IIIc)的缀合物:

其中B和D如本文所定义和所述。

例如，在有些实施方案中，本公开内容提供了下式的缀合物：

；或

，

其中W^I和X 如本文所定义和所述。

在有些实施方案中，本公开内容提供了通式(IIId)和(IIIe)的缀合物:

其中B和D如本文所定义和所述。

例如，在有些实施方案中，本公开内容提供了下式的缀合物：

，

其中W^I和X如本文所定义和所述。

B (配体)

–B是–T–L^B–X，其中X是包括糖在内的配体；且L^B是共价键或通过给X共价缀合T 衍生出的基团。本文描述了示例性的配体和它们的糖组分。

D (胰岛素)

–D是–T–L^D–W^I，其中W^I是胰岛素分子，且L^D是共价键或通过给W^I共价缀合T 衍生出的基团。本文描述了示例性的胰岛素分子。

L^B和L^D (共价缀合)

普通技术人员会理解，许多种缀合化学可以用于给X共价缀合T和/或给W^I共价缀合T (通常称作“组分”)。这样的技术是本领域广泛已知的，下面讨论了示例性的技术。组分可以直接地键合(即，没有插入化学基团)或经由间隔物(例如，偶联剂或共价链，其提供缀合的元件和缀合物框架的其它部分之间的某种物理分隔) 间接地键合。应当理解，组分可以通过任意数目的化学键共价地结合到缀合物框架上，所述化学键包括但不限于酰胺、胺、酯、醚、硫醚、异脲、亚胺等键。在某些实施方案中，L^B和/或L^D (对于本部分的目的，通常称作“L”)是共价键。在有些实施方案中，L是通过给T的任选地取代的羰基-反应性的、硫醇-反应性的、胺-反应性的或羟基-反应性的部分缀合X或W^I的羧基、硫醇、胺或羟基而衍生出的任选地取代的部分。在有些实施方案中，L是通过给X或W^I的任选地取代的羧基-反应性的、硫醇-反应性的、胺-反应性的或羟基-反应性的部分缀合T的羧基、硫醇、胺或羟基而衍生出的任选地取代的部分。在有些实施方案中，L是

。在有些实施方案中，L是琥珀酰亚胺部分。

在不同的实施方案中，使用本领域已知的“点击化学”（click chemistry）反应，可以使组分共价地结合到缀合物框架上。这些反应包括，例如，环化加成反应、亲核的开环反应和添加 到碳-碳重键上 (例如，参见Kolb和Sharpless, Drug Discovery Today 8:1128-1137, 2003和其中引用的参考文献，以及Dondoni, Chem. Asian J. 2:700-708, 2007和其中引用的参考文献)。如上面所讨论的，在不同的实施方案中，所述组分可以经由天然的或化学添加的下垂基团结合到缀合物框架上。一般而言，应当理解，一对反应基团的第一个和第二个成员(例如，羧基和胺基，它们反应生成酰胺键)可以存在于所述组分和框架的任一个上(即，2个成员的相对位置是无关的，只要它们反应生成缀合物)。下面更详细地讨论示例性的连接。

在不同的实施方案中，使用Kim 等人, Biomaterials 24:4843-4851 (2003)所述的方法，可以将携带羧基(或反应性的酯)的组分缀合到携带-OH的框架(OBF)上。简而言之，将OBF与携带羧基的组分一起溶解在DMSO中，并借助于N’,N’-二环己基碳二亚胺 (DCC)和4-二甲氨基吡啶 (DMAP)催化剂，在干燥气氛下反应。使用碳二亚胺 (EDAC)偶联方法，可以将携带羧基的组分缀合到携带-NH₂的框架(NBF)上。使用该方法，通过在pH 5缓冲液中与EDAC反应，随后加入NBF，将携带羧基的组分官能化。在这些情况的任一种中(和在下述情况的任一种中)，通过任意数目的本领域技术人员可利用的方法，可以纯化得到的产物，所述方法包括，但不限于、尺寸排阻色谱法、反相色谱法、硅胶色谱法、离子交换色谱法、超滤和选择性沉淀。

在不同的实施方案中，可以将携带胺的组分偶联到携带-COOH 的框架(CBF)上。CBF使用活化的酯部分(例如，参见Hermanson的Bioconjugate Techniques, 第2版, Academic Press, 2008和其中引用的参考文献)。简而言之，将具有末端活化的羧酸酯（诸如–NHS、–SSC、–NPC等）的CBF溶解在无水有机溶剂（诸如DMSO或DMF）中。然后加入希望的当量数的携带胺的组分，并在室温混合几小时。也可以将携带胺的组分缀合到CBF上，以生成稳定的酰胺键，如Baudys 等人, Bioconj. Chem. 9:176-183, 1998所述。通过在无水条件下，向CBF和携带胺的组分在二甲基亚砜 (DMSO)中的溶液中加入三丁胺(TBA)和氯甲酸异丁基酯，可以实现该反应。或者，通过氰化作用（cyanalation），可以将携带胺的组分偶联到OBF上，所述氰化作用使用下述试剂，包括但不限于、溴化氰 (CNBr)、N-氰基三乙基铵四氟硼酸盐 (CTEA)、1-氰基-4-(二甲氨基)-吡啶

四氟硼酸盐 (CDAP)和对硝基苯基氰酸酯 (pNPC)。CNBr反应可以在弱碱性pH的水溶液中进行。CDAP反应在弱碱性pH的DMSO和水的混合物中进行，使用三乙胺(TEA)作为催化剂。在某些实施方案中，可以将携带胺的组分缀合到NBF上，例如，通过在含有吡啶的缓冲的水溶液中的戊二醛偶联，随后用甘氨酸猝灭。在某些实施方案中，使用希夫碱偶联方法，可以将携带胺的组分缀合到携带醛的框架上，然后还原(例如，参见Hermanson的Bioconjugate Techniques, 第2版, Academic Press, 2008和其中引用的参考文献，以及Mei 等人的Pharm. Res. 16：1680-1686, 1999和其中引用的参考文献)。简而言之，将具有末端活化的醛 (例如，乙醛、丙醛、丁醛等)的框架溶解在水性缓冲液中，所述缓冲液具有中性或更低的pH，以防止不希望的醛水解。然后加入希望的当量数的携带胺的组分，并在室温混合，然后加入过量的合适的还原剂(例如，硼氢化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、吡啶硼烷、三乙胺硼烷等)。

在不同的实施方案中，根据二乙烯基砜(DVS)方法，可以将携带羟基的组分缀合到OBF上。使用该方法，将OBF加入到pH 11.4碳酸氢盐缓冲液中，并用DVS活化，随后加入携带羟基的组分，然后加入甘氨酸，以中和和猝灭反应。使用上述的活化的酯部分，也可以将携带羟基的组分偶联到OBF上，以生成酯键。

在不同的实施方案中，使用相对温和的方法，可以将携带巯基的组分偶联到携带马来酰亚胺的框架(MBF)上，以生成硫醚键(例如，参见Hermanson的Bioconjugate Techniques, 第2版, Academic Press, 2008和其中引用的参考文献)。因为马来酰亚胺基对水解的敏感度比活化的酯低很多，该反应可以在水性条件下进行。简而言之，将MBF溶解在pH 6.5-7.5的缓冲的水溶液中，随后加入希望的当量数的携带巯基的组分。在室温混合几小时以后，可以纯化硫醚偶联的缀合物。根据Thoma 等人, J. Am. Chem. Soc. 121:5919-5929, 1999所述的方法，也可以将携带巯基的组分缀合到NBF上。该反应包括将NBF悬浮于无水二甲基甲酰胺 (DMF)中，随后加入2,6-二甲基吡啶和酸酐，随后纯化反应中间体。然后将携带巯基的组分加入中间体在含有三乙胺的DMF中的溶液中。

在不同的实施方案中，使用铜(I)-催化的现代版的Huisgen-型叠氮化物–炔烃环加成，可以将携带叠氮化物的组分偶联到携带炔烃的框架(ABF)上，得到1,4-二取代的1,2,3-三唑 (例如，参见Dondoni, Chem. Asian J. 2:700 – 708, 2007和其中引用的参考文献，以及Dedola 等人, Org. Biomol. Chem. 5：1006–1017, 2007)。该反应通常称作“点击”反应，可以在例如纯的THF中进行，其中使用N,N-二异丙基乙胺和Cu(PPh₃)₃Br作为催化剂系统 (例如，参见Wu 等人, Chem. Commun. 5775-5777, 2005)。该反应也可以在3:1 (THF:水)混合物中进行，其中使用抗坏血酸钠和CuSO₄·5H₂O作为催化剂系统 (例如，参见Wu 等人, 同上)。在任一种情况下，以希望的当量数，将携带叠氮化物的组分加入到ABF中，随后在室温混合12-48小时。或者，使用与上述完全相同的条件，可以将携带炔烃的组分缀合到携带叠氮化物的框架上。

某些组分可以天然地具有超过一个相同的化学反应部分。在有些实施例中，选择化学反应类型和条件以在那些位点中的仅一个处选择性地反应组分是可能的。例如，在通过反应性的胺缀合胰岛素的情况下，在某些实施方案中，N-端 α-Phe-B1是比N-端 α-Gly-A1和ε-Lys-B29更优选的连接位点，以保留胰岛素生物活性 (例如，参见Mei 等人, Pharm. Res. 16：1680-1686, 1999和其中引用的参考文献，以及Tsai 等人, J. Pharm. Sci. 86：1264-1268, 1997)。在胰岛素和十六醛(醛-封端的分子)之间的一个示例性反应中，研究人员发现：在有氰基硼氢化钠存在下，以1:6 (胰岛素:醛 mol/mol)的比例，在含有54%异丙醇的1.5M pH6.8水杨酸钠水溶液中混合2种组分过夜，导致向单取代的Phe-B1仲胺-缀合的产物的超过80%转化率 (Mei 等人, Pharm. Res. 16:1680-1686, 1999)。他们的研究证实，溶剂、pH和胰岛素:醛比的选择都影响反应的选择性和产率。但是，在大多数情况下，难以通过化学反应条件的选择来实现选择性。因此，在某些实施方案中，可以有利地选择性地保护组分(例如，胰岛素)的除了希望发生反应的位点以外的所有位点，然后在已经反应和纯化物质以后，进行去保护步骤。例如，在文献中可得到许多选择性地保护胰岛素胺基的实例，包括在酸性(BOC)、弱酸性(柠康酸酐)和碱性(MSC)条件下可以去保护的那些(例如，参见Tsai 等人, J. Pharm. Sci. 86：1264-1268, 1997; Dixon 等人, Biochem. J. 109：312-314, 1968;和Schuettler 等人, D. Brandenburg Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 360：1721, 1979)。在一个实施例中，可以用叔丁氧基羰基(BOC)选择性地保护Gly-A1和Lys-B29 胺，然后通过在90%三氟醋酸 (TFA)/10%苯甲醚溶液中在4℃温育1小时进行缀合后，除去该BOC。在一个实施方案中，将胰岛素干粉溶解在无水DMSO中，随后加入过量的三乙胺。向该溶液中，缓慢地加入大约2当量的二碳酸二叔丁酯在THF中的溶液，然后将该溶液混合30-60分钟。反应后，将粗溶液倒入过量的丙酮中，随后逐滴加入稀HCl，以沉淀反应过的胰岛素。将沉淀物离心，用丙酮洗涤，并在真空下彻底干燥。使用制备反相HPLC或离子交换色谱法 (例如，参见Tsai 等人, J. Pharm. Sci. 86：1264-1268, 1997)，可以从未反应的胰岛素、不希望的二-BOC 异构体和单-BOC和三-BOC副产物中，分离出希望的二-BOC保护的产物。在反相HPLC的情况下，将粗产物在含有0.1%TFA的70%水/30%乙腈中的溶液装载上C8柱，并用递增的乙腈梯度洗脱。收集希望的二-BOC峰，旋转蒸发以去除乙腈，并低压冻干，以得到纯产物。

k

k是1-12的整数，包括端值。在某些实施方案中，k = 1-6，例如，1、2或3。

p和m

每次出现的p独立地是1-5的整数，包括端值。在某些实施方案中，每次出现的p是相同的。在某些实施方案中，p = 1、2或3。在某些实施方案中，p = 1。

每次出现的m独立地是1-5的整数，包括端值。在某些实施方案中，每次出现的m是相同的。在某些实施方案中，m = 1、2或3。在某些实施方案中，m = 1。

n和v

每次出现的n独立地是0-5的整数，包括端值，条件是：在每个k-分支内，n的至少1次出现是≥ 1。在给定的k-分支内的分支在本文中称作n-分支。

在某些实施方案中，在p-括号的部分中每次出现的

被许多 n-括号的部分取代，对应着n ≥ 1的值，例如，参见上面的式(Ia)。在有些这样的实施方案中，缀合物中每次出现的n是相同的。在有些这样的实施方案中，n = 1或2。

在其它实施方案中，在p-括号的部分中仅在末端出现的

被许多 n-括号的部分取代，对应着n ≥ 1的值，例如，参见上面的式(Ib)。在某些实施方案中，每个k-分支包括仅一次出现的n ≥ 1 (即，所有其它出现的n = 0)。在有些这样的实施方案中，缀合物中每次出现的n是相同的。在有些这样的实施方案中，n = 1或2。

每次出现的v独立地是0-5的整数，包括端值，条件是：在每个k-分支内，至少1次出现的v是≥ 1。

在某些实施方案中，在m-括号的部分中每次出现的被许多 B部分取代，对应着v ≥ 1的值，例如，参见上面的式(Ic)。在有些这样的实施方案中，在缀合物中每次出现的v是相同的。在有些这样的实施方案中，v = 1或2。

在其它实施方案中，在m-括号的部分中仅在末端出现的

被许多 B部分取代，对应着v ≥ 1的值，例如，参见上面的式(Id)。在某些实施方案中，每个k-分支包括仅一次出现的v ≥ 1 (即，所有其它出现的v = 0)。在有些这样的实施方案中，在缀合物中每次出现的v是相同的。在有些这样的实施方案中，v = 1或2。在某些实施方案中，每个n-分支包括至少1次出现的v ≥ 1。在某些实施方案中，每个n-分支包括仅一次出现的v ≥ 1 (即，所有其它出现的v = 0)。在有些这样的实施方案中，在缀合物中每次出现的v是相同的。在有些这样的实施方案中，v = 1或2。

药物负载

一般而言，通过调节缀合物框架的分子量和/或化学活化的水平(即，当将下垂基团添加到框架上时)，可以控制负载到缀合物上的药物的量。在不同的实施方案中，药物负载水平可以是在5-99%w/w（药物相对于缀合物）的范围内。在不同的实施方案中，可以使用在50-99%的更窄范围内（例如，在80-99%的范围内）的负载水平。

其它

应当理解，尽管前述部分在单独的标题下描述了缀合物的组分(例如，配体、药物、框架)，本公开内容包括含有任一种和所有公开的配体、药物和框架的缀合物。

制备胰岛素 - 缀合物的方法

如在实施例中所述，我们已经例证了制备前述缀合物的方法，其中使用人重组胰岛素（作为示例性的胰岛素分子）和氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖 (AEM)、氨基乙基二甘露糖 (AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、氨基乙基岩藻糖 (AEF)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和/或氨基葡萄糖(GA)（作为示例性的配体）。使用三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)、三-琥珀酰亚胺基氨基三乙酸酯 (TSAT)、三-琥珀酰亚胺基-1,3,5-苯三羧化物 (TSB)和苯-1, 3, 5-三羧基-(N-4-丁酸-NHS-酯)酰胺 (TSB-C4)作为缀合物框架（但不限于这些），可以制备缀合物，其在每个缀合位点具有2个配体，且在所有框架组分之间具有短距离。如果需要框架组分之间更多的距离，则可以使用琥珀酰亚胺基 (6-氨基己酰基)氨基三乙酸酯 (TSAT-C6)、琥珀酰亚胺基 (6-氨基(PEO-6))氨基三乙酸酯 (TSAT-PEO-6)、苯-1, 3, 5-三羧基-(N-6-氨基己酸-NHS 酯)酰胺 (TSB-C6)和苯-1, 3, 5-三羧基-(N-10-氨基癸酸-NHS 酯)酰胺 (TSB-C10)。与TSAT-PEO-6相比，TSAT-C6 间隔物臂化学赋予缀合物更多的疏水特性。

例如，为了例证目的，在一个实施方案中，配体(例如，AEG、AEM、AEMB和AETM)和胰岛素都可以通过末端活化的酯与TSAT-C6框架反应，生成胰岛素-TSAT-C6-AEG-2、胰岛素-TSAT-C6-AEM-2、胰岛素-TSAT-C6-AEMB-2和胰岛素-TSAT-C6-AETM-2 缀合物。如在实施例中所讨论的，事先合成各种配体。在有些实施方案中，胰岛素的A1和B29氨基是如在实施例中所述BOC-保护的，使得每个胰岛素仅可以在Phe-B1 α-氨基处反应。在有些实施方案中，胰岛素的B1和B29氨基是如在实施例中所述BOC-保护的，使得每个胰岛素仅可以在Gly-A1 α-氨基处反应。将大约1当量的BOC-胰岛素（作为40-50 mg/ml的在DMSO中的溶液）在室温加入到50 mg/ml 的TSAT-C6在DMSO中的溶液（含有过量的三乙胺）中，并反应大约1小时。接着，加入过量的AEG、AEM、AEBM和/或AETM (2-10当量) （作为100 mg/ml 在DMSO中的溶液），并反应另外2小时。反应后，将DMSO溶液在pH 5 盐水缓冲液中超稀释（superdilute）10倍，然后将pH调至8.0，并使溶液穿过Biogel P2柱，以去除低分子反应物和盐。使用3K 超滤装置，浓缩在空隙级分中洗脱的物质，然后将它注射到制备级反相HPLC柱 (C8，含有0.1%TFA的乙腈/水流动相)上，以从未反应的BOC2-胰岛素中纯化希望的产物。合并收集的希望的洗脱峰，并旋转蒸发，以去除乙腈，随后低压冻干，以得到干粉。最后，如下去除BOC保护基：将冻干粉溶解在4℃的90%TFA/10%苯甲醚中1小时，随后在含有0.150 M NaCl的HEPES pH 8.2缓冲液中10倍超稀释。使用NaOH溶液，将pH调至7.0-8.0，然后使物质穿过Biogel P2柱，以去除苯甲醚、BOC和任意其它污染盐。然后将去保护的、纯化的缀合物水溶液浓缩至希望的水平，并在4℃储存备用。

在另一个方面，使用在碳酸盐缓冲液中的未保护的胰岛素，可以在B29 ε-氨基处发生反应，因为在那些条件下，B29氨基是在野生型胰岛素中存在的3个氨基中最有反应性的。在一个示例性的合成中，以60 mM，将含有N-端活化的酯的框架溶解在无水DMSO中，随后加入三乙胺 (TEA)。在室温快速搅拌该溶液10分钟。平行地，在适当体积的无水DMSO中，制备448 mM配体溶液。溶解后，在10分钟时间段内，逐滴加入足够的配体溶液，以提供等于（框架上活化的酯基团的数目N减去1）x1.5的反应当量数。例如，如果每个框架上存在N=3 个起始活化的酯基团，则加入(3x(3-1)x60 mM/370 mM)=0.973 ml 配体溶液。如果每个框架上存在N=4个起始活化的酯基团，则加入 (3x(4-1)x60 mM/370 mM)=1.46 ml 配体溶液，以此类推。加入配体溶液以后，在室温搅拌该溶液1小时。

然后在17.2 mM，单独地将胰岛素分子溶解在碳酸钠缓冲液(0.1 M, pH 11)中，随后用1.0 N 氢氧化钠，将pH调至10.8。溶解后，在75分钟时间段内，向胰岛素/碳酸盐缓冲溶液中逐滴加入整个框架/DMSO/配体/TEA溶液。在加入过程中，在必要时，使用稀HCl或NaOH，每5分钟将得到的混合物的pH调至10.8。在滴加以后，将溶液搅拌另外15分钟，以确保完全反应。

然后在含有0.150 M NaCl的20 mM pH 5.0 HEPES缓冲的盐水溶液中，将得到的溶液超稀释10倍，随后用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约40 ml。使用制备反相HPLC，进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。收集后，旋转蒸发该溶液，以去除乙腈，并低压冻干，以得到纯的缀合物。

在另一个方面，使用与在美国专利号7,402,565中所报道的那些类似的方法，使用N-端保护氨基酸序列，合成B29-单取代的胰岛素-缀合物。具体地，将N-端肽序列工程化到胰岛素A-链和B-链上，使得保护氨基酸序列含有Arg^A0和Arg^B0，得到胰岛素中间体。缀合发生在胰岛素中间体上的Lys^B29处，同时N-端被保护免于生成缀合副产物。用胰蛋白酶处理缀合的胰岛素中间体，以切割N-端保护氨基酸序列，得到胰岛素-缀合物，其中仅Lys^B29被缀合。在有些实施方案中，所述胰岛素中间体源自在美国专利号7,402,565中所述的单链胰岛素前体。在有些实施方案中，所述胰岛素中间体是含有除了Lys^B29以外的缀合位点的突变体，并进行与关于Lys^B29所述类似的合成。

应当理解，这些示例性的方法可以用于生产具有不同的配体和胰岛素分子、不同的缀合化学、框架组分之间的不同隔离和/或不同配价的其它缀合物，其中用如下所述的不同框架取代TSAT-C6框架。

例如，如果需要框架组分之间更远的距离和/或需要在缀合位点处保留电荷，则可以将适当尺寸的携带胺的二乙基缩醛 (例如，氨基丙醛二乙基缩醛(APDA)或氨基丁醛二乙基缩醛(ABDA))缀合到本文列出的框架上的反应基团之一上，随后使剩余的反应基团与目标配体 (例如AEM、AEBM或AETM)彻底反应。然后可以在酸性条件下，从二乙基缩醛暴露出反应性的醛基，然后用胰岛素进行还原胺化，以完成胰岛素缀合步骤，然后可以采用ABDA-TSAT、ABDA-LCTSAT等。

在另一个实施例中，可以使用四-(N-琥珀酰亚胺基羧基丙基)季戊四醇(TSPE)来向每个缀合位点添加3个配体，实现增加的多价。本领域技术人员还会理解，任一种上述教导可以用于生成具有甚至更高阶配价的多分支的(例如，树枝状聚合物-样)缀合物。例如，在Topics in Current Chemistry. 217：202-238, 2001中，Röckendorf 和Lindhorst提供了用于生产多分支的结构的流行方案的综述。

此外，根据上述方法，又可以使已经含有预定多价程度的配体反应，生成甚至更高阶的配体多样性。例如，可以如下制备含有末端反应性胺的二价的AEM-2、AEBM-2或AETM-2分子：向也缀合了反应性胺的合适框架上，缀合2个每种配体。可以如下制备含有末端反应性胺的三价的AEM-3、AEBM-3或AETM-3分子：向也缀合了反应性胺的合适框架上，缀合3个每种配体。可以使NH₂-二价的糖与上述的相同框架反应，以生成胰岛素-缀合物，其中每个胰岛素分子具有4和6个配体。可以使NH₂-三价的糖与上述的相同框架反应，以生成药物缀合物，其中每个胰岛素分子具有6和9个配体。

在所有情况下，应当认识到，通过调节框架化学、配价和配体:框架化学计量，可以经由多价框架将不同配体的混合物缀合到同一个胰岛素分子上。例如，根据该混合的配体方法，胰岛素-AEM-1-AEBM-1、胰岛素-AEBM-1-AETM-1、胰岛素-AEM-2-AETM-2和胰岛素-AEM-1-AETM-2都可以合成。

在某些情况下，可能希望通过不同的方法，将配体缀合到框架（而不是胰岛素分子）上。例如，二价的马来酰亚胺/单价的活化的酯官能化的框架(例如，琥珀酰亚胺基-3,5-二马来酰亚胺基苯基苯甲酸酯 (SDMB))可以用于在单独的步骤中缀合2个巯基官能化的配体和1个胰岛素分子。例如，使用本文所述的方法，可以将胰岛素分子缀合到框架的活化的酯部分上。在单独的步骤中，通过与4-亚氨基硫醇烷反应，可以将氨基乙基糖(AEM、AEBM、AETM) 转化成携带末端巯基的配体。最后，可以将框架-二-马来酰亚胺-胰岛素缀合物与过量的巯基-官能化的糖混合，生产得到的二价的-配体-胰岛素缀合物。

胰岛素 - 缀合物的结晶

已经令人惊讶地发现：无需使用诸如鱼精蛋白或锌等添加剂，可以使本文所述的某些胰岛素-缀合物结晶。胰岛素-缀合物的结晶制剂可以有利地提高批次之间的再现性、增加制剂稳定性和减少在长储存时期内的颗粒团聚。

如在实施例中所述，可以进行筛选实验，以确定适当的结晶条件。通常，将要结晶胰岛素-缀合物溶液溶解在水中，并悬浮在缓冲液上面，观察溶液的结晶迹象。然后可以使用在筛选实验中鉴别出的适当的缓冲液，以更大的规模制备结晶胰岛素-缀合物。

在某些实施方案中，结晶胰岛素-缀合物的框架缀合在Lys^B29位置处。在某些实施方案中，所述结晶胰岛素-缀合物是图2所示的缀合物之一。在某些实施方案中，所述结晶胰岛素-缀合物是I-6、I-7或I-9。

在某些实施方案中，用于结晶的缓冲液具有大于7的pH。在某些实施方案中，所述缓冲液具有约7.5至约8.5的pH。在某些实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐、TRIS或HEPES缓冲液。

在某些实施方案中，用于结晶的缓冲液是磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，所述缓冲液具有比钠更高的钾浓度。在某些实施方案中，所述缓冲液具有比磷酸二氢钠更高的磷酸氢二钾浓度。在某些实施方案中，所述缓冲液具有在约6至9范围内的pH。在某些实施方案中，所述缓冲液具有约8的pH。在某些实施方案中，所述缓冲液具有约8.2的pH。在某些实施方案中，所述缓冲液是磷酸二氢钠一水合物、磷酸氢二钾，具有约8.2的pH。

在某些实施方案中，在有一种或多种添加剂存在下，发生结晶。在某些实施方案中，所述添加剂是间甲酚、苯酚、鱼精蛋白、聚(精氨酸)、甘油、氯化锌或乙酸锌。在某些实施方案中，所述添加剂是聚乙二醇。

在某些实施方案中加入有机溶剂，以促进结晶。在某些实施方案中，所述有机溶剂是甲醇、乙醇或异丙醇。在某些实施方案中，在最终制备药物组合物之前，去除有机溶剂。

结晶胰岛素 - 缀合物的制剂

如在实施例中所讨论的，在某些实施方案中，可能有利地以持续方式 (即，以表现出比可溶的重组人胰岛素更持久的吸收特性的形式)施用结晶胰岛素-缀合物，从而提供持续的缀合物水平，该水平对葡萄糖波动做出响应的时标(timscale)与典型葡萄糖波动时标更密切相关(即，小时，而不是分钟)。在某些实施方案中，当施用给在非高血糖条件 (即，禁食条件)下的哺乳动物时，所述持续释放制剂可以表现出缀合物的零级释放。

应当理解，可以使用能提供持续吸收特性的任意制剂。在某些实施方案中，通过组合结晶胰岛素-缀合物和减慢它向体循环中的释放性质的其它成分，可以实现持续吸收。例如，PZI (鱼精蛋白锌胰岛素)制剂可以用于该目的。如在实施例中所述，我们已经发现：在某些实施方案中，用无定形的胰岛素-缀合物制备的PZI制剂的吸收特性和稳定性对在制剂中包含的鱼精蛋白和锌的绝对和相对量是敏感的。例如，鉴于商业的PZI和NPH (中性鱼精蛋白锌)胰岛素制剂仅需要约0.05至约0.2 mg鱼精蛋白/mg胰岛素，有些PZI-缀合物制品需要约1至约5 mg鱼精蛋白/mg缀合物，以便有效地维持吸收特性。此外，尽管商业的鱼精蛋白胰岛素制品含有约0.006 mg锌/mg胰岛素，我们已经发现：在某些实施方案中，与鱼精蛋白浓度一起增加锌浓度，可以产生更稳定的、容易分散的制剂。在某些情况下，锌含量是在约0.05至约0.5 mg锌/mg缀合物的范围内。此外，我们还意外地发现：在某些实施方案中，与在B29-胺基处被取代的胰岛素-缀合物相比，在B1-胺基处被取代的胰岛素-缀合物需要更多的鱼精蛋白和锌，以有效地维持释放特性。

在某些实施方案中，使预结晶胰岛素-缀合物分散系与鱼精蛋白混合，以形成结晶胰岛素-缀合物鱼精蛋白制剂。在有些实施方案中，在配制过程中，将分散系中和至生理缓冲液强度。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含约0.05至约10 mg鱼精蛋白/mg缀合物。例如，约0.2至约10 mg鱼精蛋白/mg缀合物，例如，约1至约5 mg鱼精蛋白/mg缀合物。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含约0.006至约0.5 mg锌/mg缀合物。例如，约0.05至约0.5 mg锌/mg缀合物，例如，约0.1至约0.25 mg锌/mg缀合物。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含比例(w/w)在约100:1至约5:1（例如，约50:1至约5:1，例如，约40:1至约10:1）范围内的鱼精蛋白和锌。在某些实施方案中，本公开内容的PZI制剂包含比例(w/w)在约20:1至约5:1（例如，约20:1至约10:1、约20:1至约15:1、约15:1至约5:1、约10:1至约5:1、约10:1至约15:1）范围内的鱼精蛋白和锌。

在某些实施方案中，将一种或多种下述组分加入到制剂中：抗微生物防腐剂、等渗剂和/或未缀合的胰岛素分子。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含抗微生物防腐剂 (例如，间甲酚、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)。在某些实施方案中，所述抗微生物防腐剂是间甲酚。例如，在某些实施方案中，制剂可以包括约0.1至约1.0%v/v 间甲酚。例如，约0.1至约0.5%v/v 间甲酚，例如，约0.15至约0.35%v/v 间甲酚。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含多元醇作为等渗剂 (例如，甘露醇、丙二醇或甘油)。在某些实施方案中，所述等渗剂是甘油。在某些实施方案中，所述等渗剂是盐，例如NaCl。例如，制剂可以包含约0.05至约0.5 M NaCl，例如，约0.05至约0.25 M NaCl或约0.1至约0.2 M NaCl。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含一定量的未缀合的胰岛素分子。在某些实施方案中，制剂包含摩尔比在约100:1-1:1（例如，约50:1-2:1或约25:1-2:1）范围内的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子。

在某些实施方案中，本公开内容提供了包含本公开内容的结晶的缀合物的持续释放制剂，其中所述制剂包含鱼精蛋白和锌。在某些实施方案中，结晶胰岛素-缀合物的框架缀合在Lys^B29位置处。在某些实施方案中，所述结晶胰岛素-缀合物是图2所示的缀合物之一。在某些实施方案中，所述结晶胰岛素-缀合物是I-6、I-7或I-9。

在某些实施方案中，所述制剂包含约1至约5 mg鱼精蛋白/mg缀合物;和约0.1至约0.25 mg锌/mg缀合物。

在某些实施方案中，所述制剂包含比例(w/w)在约40:1至约10:1范围内的鱼精蛋白和锌。

在某些实施方案中，所述制剂另外包含一定量的未缀合的胰岛素分子。在某些实施方案中，所述制剂包含摩尔比在约25:1至约2:1范围内的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子。

在某些实施方案中，所述制剂另外包含抗微生物防腐剂。在某些实施方案中，所述抗微生物防腐剂是间甲酚。在某些实施方案中，所述制剂包含约0.15至约0.35%v/v 间甲酚。

在某些实施方案中，所述制剂另外包含等渗剂。 在某些实施方案中，所述等渗剂是甘油。在某些实施方案中，所述等渗剂是NaCl。在某些实施方案中，所述制剂包含约0.1至约0.2 M NaCl。

在某些实施方案中，所述制剂包含：

比例(w/w)在约40:1至约10:1范围内的鱼精蛋白和锌；

摩尔比在约25:1至约2:1范围内的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子；

约0.15至约0.35%v/v 间甲酚；和

甘油或约0.1至约0.2 M NaCl。

在某些实施方案中，所述制剂包含：

约3.6 mg鱼精蛋白/mg缀合物；和

约0.2 mg锌/mg缀合物。

在某些实施方案中，所述制剂包含：

约3.6 mg鱼精蛋白/mg缀合物；

约0.2 mg锌/mg缀合物；和

摩尔比为约5:1的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子。

在某些实施方案中，所述制剂包含：

约3.6 mg鱼精蛋白/mg缀合物；

约0.2 mg锌/mg缀合物；

摩尔比为约5:1的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子；和

约0.2%v/v 间甲酚。

在某些实施方案中，所述制剂包含：

约3.6 mg鱼精蛋白/mg缀合物；

约0.2 mg锌/mg缀合物；

摩尔比为约5:1的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子；

约0.2%v/v 间甲酚；且

甘油或 约0.15 M NaCl。

结晶胰岛素 - 缀合物的应用

在另一个方面，本公开内容提供了使用结晶胰岛素-缀合物的方法。一般而言，所述结晶的缀合物可以用于响应于糖(例如，葡萄糖或本文所述的外源糖，诸如甘露糖、α-甲基甘露糖、L-岩藻糖等)可控地提供生物活性的胰岛素。本公开内容包括通过施用本公开内容的结晶胰岛素-缀合物来治疗疾病或病症。尽管所述缀合物可以用于治疗任意患者 (例如，狗、猫、牛、马、绵羊、猪、小鼠等)，它们最优选地用于治疗人。可以通过各种途径，将结晶胰岛素-缀合物施用给患者。一般而言，最适当的给药途径取决于多种因素，包括要治疗的疾病或病症的性质、患者的状况等。一般而言，本公开内容包括通过下述途径给药：口服、肌肉内、皮下、透皮、直肠、阴道内、腹膜内、局部 (作为散剂、软膏剂或滴剂)、经颊或作为口或鼻喷雾剂或气雾剂。用于这些不同途径的药物组合物的配制和生产的一般考虑因素，可以参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第19版, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995。在不同的实施方案中，结晶胰岛素-缀合物悬浮液可以皮下给药，例如，通过注射。悬浮液载体可以是水溶液，包括，但不限于无菌水、盐水或缓冲的盐水。

一般而言，施用治疗有效量的结晶胰岛素-缀合物。“治疗有效量”是指：足以在合理的收益/风险比（这包括平衡缀合物的效能和毒性）治疗疾病或病症的结晶胰岛素-缀合物的量。一般而言，通过标准的药理学方法，可以在细胞培养物中或使用实验动物测定治疗效能和毒性，例如，通过计算ED₅₀ (在50%的治疗受试者中治疗上有效的剂量)和LD₅₀ (在50%的治疗受试者中致死的剂量)。ED₅₀/LD₅₀表示胰岛素的治疗指数。尽管一般而言，大的治疗指数是优选的，如本领域众所周知的，在严重疾病或病症的情况下，特别是在缺少替代治疗选择的情况下，更小的治疗指数可能是可接受的。在临床试验过程中，确定给人施用的适当剂量范围的最终选择。

在不同的实施方案中，胰岛素的平均日剂量是在10-200 U的范围内，例如，25-100 U (其中1单位的胰岛素是~ 0.04 mg)。在某些实施方案中，在每天基础上，施用具有这些胰岛素剂量的量的缀合物。在某些实施方案中，在每周基础上，施用具有5-10倍这些胰岛素剂量的量的缀合物。在某些实施方案中，在每两周基础上，施用具有10-20倍这些胰岛素剂量的量的缀合物。在某些实施方案中，在每月基础上，施用具有20-40倍这些胰岛素剂量的量的缀合物。

在某些实施方案中，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物可以用于治疗患者(例如，哺乳动物患者)的高血糖症。在某些实施方案中，所述患者是糖尿病患者。但是，本发明的方法不限于治疗糖尿病患者。例如，在某些实施方案中，缀合物可以用于治疗具有与受损的血糖控制（glycemic control）有关的感染的患者的高血糖症。在某些实施方案中，结晶胰岛素-缀合物可以用于治疗糖尿病。

在某些实施方案中，当将本公开内容的结晶胰岛素-缀合物或其制剂施用给患者 (例如，哺乳动物患者)时，它比未缀合形式的胰岛素分子诱导更少的低血糖症。在某些实施方案中，与包含未缀合形式的胰岛素分子的制剂相比，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物制剂在患者 (例如，哺乳动物患者)中诱导更低的HbA1c值。在某些实施方案中，与包含未缀合形式的胰岛素分子的制剂相比，所述制剂产生的HbA1c值降低了至少10% (例如，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%)。在某些实施方案中，所述制剂产生小于7%（例如，在约4至约6%的范围内）的HbA1c值。在某些实施方案中，包含未缀合形式的胰岛素分子的制剂产生超过7%（例如，约8至约12%）的HbA1c值。

应该理解，为任意给定患者提供的缀合物的总日用量由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任意特定患者的具体治疗有效量取决于多种因素，包括待治疗的疾病或病症；采用的具体胰岛素分子的活性；采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；给药时间，给药途径和采用的具体胰岛素分子的排泄速率；治疗持续时间；与采用的具体胰岛素分子组合或同时使用的药物；和医学领域众所周知的类似因素。在不同的实施方案中，本公开内容的缀合物可以施用于超过一个位置。例如，本公开内容具体地包括这样的方法，其中按照连续的时间表(例如，每天1次、每2天1次、每周1次、每2周1次、每月1次等)，将结晶胰岛素-缀合物悬浮液通过皮下注射施用给患者。

在不同的实施方案中，可以将本公开内容的结晶胰岛素-缀合物施用给正在接受至少1种额外治疗的患者。在不同的实施方案中，所述至少1种额外治疗意在治疗与施用的缀合物相同的疾病或障碍。

胰岛素敏化剂 (例如双胍类诸如二甲双胍、格列酮类)通过增加患者对给定量的胰岛素的响应来起作用。正在接受胰岛素敏化剂的患者因此需要比相同患者在未接受胰岛素敏化剂时更低剂量的本公开内容的结晶胰岛素-缀合物。因而，在某些实施方案中，可以将结晶胰岛素-缀合物施用给也正在用胰岛素敏化剂治疗的患者。在不同的实施方案中，可以以高达在没有胰岛素敏化剂存在时所需的正常剂量的75%，施用本公开内容的结晶胰岛素-缀合物。在不同的实施方案中，可以施用高达正常剂量的50、40、30或20%。

胰岛素抗性是这样的障碍，其中正常量的胰岛素不足以产生正常的胰岛素响应。例如，胰岛素-抗性的患者可能需要高剂量的胰岛素，以便克服它们的抗性，并提供足够的葡萄糖降低效应。在这些情况下，在更低抗性的患者中通常诱导低血糖症的胰岛素剂量在高抗性患者中不会发挥葡萄糖降低效应。类似地，当他们在合适的时间范围内提供高水平的生物活性的胰岛素时，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物仅对于该患者亚类是有效的。在某些实施方案中，通过组合2个方案，可以促进该患者亚类的治疗。因而，在某些实施方案中，传统的基于胰岛素的治疗被用于提供胰岛素的基线水平，并在患者需要时施用本发明的结晶胰岛素-缀合物来提供生物活性的胰岛素的受控补充。因而，在某些实施方案中，可以将结晶胰岛素-缀合物施用给也正在用胰岛素治疗的患者。在不同的实施方案中，可以以高达在没有本公开内容的缀合物存在时所需的正常剂量的75%，施用胰岛素。在不同的实施方案中，可以施用高达正常剂量的50、40、30或20%。应当理解，该组合方案也可以用于正在接受胰岛素促分泌剂(例如磺酰脲、GLP-1、exendin-4等)和/或胰岛素敏化剂 (例如双胍诸如二甲双胍、格列酮)的胰岛素抗性的患者。

外源性触发剂

如以前所述的，本文所述的方法、缀合物和组合物不限于葡萄糖响应性的缀合物。如在实施例中所证实的，几种示例性的葡萄糖-响应性的缀合物也对外源糖（诸如α-甲基甘露糖和L-岩藻糖）有响应。因此，应当理解，在某些实施方案中，通过外源性地施用除了葡萄糖以外的糖（诸如α-甲基甘露糖和L-岩藻糖）或可以改变缀合物的PK或PD性质的任意其它糖，可以触发缀合物。

在已经如上所述施用缀合物(例如，作为持续释放制剂) 以后，通过施用合适的外源糖，可以触发它。在某个实施方案中，施用触发量的外源糖。本文使用的外源糖的“触发量”是足以造成缀合物的至少1种PK和/或PD性质(例如，前面讨论的C_max、AUC、半衰期等)的变化的量。应当理解，缀合物的任一种前述施用方法同样适用于外源糖。还应当理解，缀合物和外源糖的施用方法可以是相同的或不同的。在不同的实施方案中，施用方法是不同的(例如，为了例证目的，可以在每周基础上，通过皮下注射，施用结晶胰岛素-缀合物，同时在每天基础上，口服施用外源糖)。外源糖的口服施用具有特别的价值，因为它会促进患者顺应性。一般而言，应当理解，结晶胰岛素-缀合物的PK和PD性质与外源糖的PK特性有关。因而，通过控制外源糖的PK特性，可以调节（tailor）缀合物PK和PD性质。如本领域众所周知的，基于剂量、途径、频率和使用的制剂，可以调节外源糖的PK特性。例如，如果需要缀合物的短且强烈的活化，则可以使用口服立即释放制剂。相反，如果需要缀合物的更长的、强烈程度更低的活化，则可以改为使用口服延长释放制剂。立即和延长释放制剂的配制和生产的一般考虑因素，可以参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第19版, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995。

还应当理解，本公开内容的结晶胰岛素-缀合物和外源糖的相对施用频率可以是相同的或不同的。在某些实施方案中，比缀合物更频繁地施用外源糖。例如，在某些实施方案中，可以每天施用缀合物，同时每天施用外源糖超过1次。在某些实施方案中，可以每周2次、每周1次、每2周1次或每月1次地施用缀合物，同时每天施用外源糖。在某些实施方案中，每月施用缀合物，并每周2次、每周1次或每2周1次地施用外源糖。本领域技术人员会认识到这些方案的其它变化，并随使用的缀合物和制剂的性质而变化。

实施例

在图2中显示了在实施例中描述和使用的示例性缀合物 I-5至I-11和I-17的结构。

应当理解：可以改进这些方法以生成落入本发明范围内的其它缀合物。

实施例1 – 叠氮基乙基葡萄糖(AzEG)的合成

a. 溴乙基葡萄糖的合成

用去离子水洗涤DOWEX 50Wx4树脂 (Alfa Aesar, Ward Hill, MA)以去除颜色。用2.2 L 2-溴乙醇 (30.5 mol, 25当量; 124.97克/mol; 1.762克/mL; BP = 150 C; Alfa Aesar)处理225克D-葡萄糖(1.25 mol; 1当量, Alfa Aesar)和140克DOWEX 50Wx4的混合物，并将搅拌的混合物加热至80℃4小时。通过TLC (20%甲醇/二氯甲烷 (DCM))，监测反应。在约4小时后，反应结束，将它冷却至室温。过滤溶液以去除树脂，并用乙酸乙酯和DCM洗涤树脂。在旋转蒸发器中将得到的滤液蒸发（strip）成琥珀色油。蒸发后得到共400克。

以下述方式，在硅胶 (4 kg 二氧化硅，包装在DCM中)上纯化该琥珀色油。将粗产物溶解于 DCM中，并装载上柱，然后用2 x 4L 10%甲醇/DCM、2 x 4L 15%甲醇/DCM和3 x 4L 20%甲醇/DCM洗脱。合并含有产物的级分(基于TLC)，并蒸发至干燥，得到 152克1-α-溴乙基-葡萄糖(42%)。

b. 溴乙基葡萄糖向叠氮基乙基葡萄糖(AzEM)的转化

给5L圆底3颈烧瓶（配有加热套、高架搅拌器和温度计）装载150克溴乙基葡萄糖(525 mmol)。将该油溶解于 2 L 水中，并用68.3克叠氮化钠 (1.05 mol, 2当量; 65克/mol; Alfa-Aesar)处理，随后用7.9克碘化钠 (52.5 mmol, 0.08当量; 149.89克/mol; Alfa-Aesar)处理，并将该溶液温热至50℃，搅拌过夜。将该溶液冷却至室温，并在旋转蒸发器上浓缩至干燥。用在40℃的3 x 500 ml 5:1体积的CHCl₃:MeOH消化固体残余物。过滤合并的有机部分，并蒸发至干燥，得到叠氮基乙基葡萄糖(86克)，为灰白色固体。TLC (20%MeOH/DCM; 用H₂SO₄烧焦)：单个斑点，与原料不可辨别。

c. 叠氮基乙基葡萄糖的再纯化

将32克叠氮基乙基葡萄糖放入100 mL 水中。通过玻璃微纤维过滤器(Whatman GF/B)，过滤浑浊的溶液。在旋转蒸发器上，将金色的滤液蒸发成固体。将该固体放入甲醇 (100 mL)中，并通过玻璃微纤维过滤器再次过滤浑浊的溶液。在真空下，将得到的淡黄色滤液蒸发成固体。

将该固体放入微量甲醇(50 mL)中，并在搅拌下，缓慢地加入乙酸乙酯(150 mL)。冷却并过滤该浓料浆。将固体风干(吸水的)，并放入60℃烘箱过夜。TLC具有极其微量的起始物。产量15.4 g。在真空下蒸发母液，得到黄色胶质。在此时，不尝试进一步纯化该物质。

实施例2 – 叠氮基乙基甘露糖 (AzEM)的合成

a. 溴乙基甘露糖的合成

用去离子水洗涤DOWEX 50Wx4树脂 (Alfa Aesar, Ward Hill, MA)，以去除颜色。用2.2 L 2-溴乙醇 (30.5 mol, 25当量; 124.97克/mol; 1.762克/mL; BP = 150 C; Alfa Aesar)处理225克D-甘露糖 (1.25 mol; 1当量, Alfa Aesar)和140克DOWEX 50Wx4的混合物，并将搅拌的混合物加热至80℃4小时。通过TLC (20%甲醇/二氯甲烷 (DCM))，监测反应。在约4小时后，反应结束，然后冷却至室温。过滤溶液以去除树脂，并用乙酸乙酯和DCM洗涤树脂。在旋转蒸发器中将得到的滤液蒸发成琥珀色油。

以下述方式，在硅胶 (4 kg 二氧化硅，包装在DCM中)上纯化该琥珀色油。将粗产物溶解于 DCM中，并装载上柱，然后用2 x 4L 10%甲醇/DCM、2 x 4L 15%甲醇/DCM、和3 x 4L 20%甲醇/DCM洗脱。合并含有产物的级分(基于TLC)，并蒸发至干燥，得到 152克1-α-溴乙基-甘露糖 (42%)。

b. 溴乙基甘露糖向叠氮基乙基甘露糖 (AzEM)的转化

给5L圆底3颈烧瓶（配有加热套、高架搅拌器和温度计）装载150克溴乙基甘露糖 (525 mmol)。将该油溶解于 2 L 水中，并用68.3克叠氮化钠 (1.05 mol, 2当量; 65克/mol; Alfa-Aesar)处理，随后用7.9克碘化钠 (52.5 mmol, 0.08当量; 149.89克/mol; Alfa-Aesar)处理，并将该溶液温热至50℃，搅拌过夜。将该溶液冷却至室温，并在旋转蒸发器上浓缩至干燥。用在40℃的3 x 500 ml 5:1体积的CHCl₃:MeOH消化固体残余物。过滤合并的有机部分，并蒸发至干燥，得到叠氮基乙基甘露糖，为灰白色固体。

c. 叠氮基乙基甘露糖的再纯化

将32克叠氮基乙基甘露糖放入100 mL 水中。通过玻璃微纤维过滤器(Whatman GF/B)，过滤浑浊的溶液。在旋转蒸发器上，将滤液蒸发成固体。将该固体放入甲醇 (100 mL)中，并通过玻璃微纤维过滤器再次过滤浑浊的溶液。在真空下，将得到的淡黄色滤液蒸发成固体。

将该固体放入微量甲醇(50 mL)中，并在搅拌下，缓慢地加入乙酸乙酯(150 mL)。冷却并过滤该浓料浆。将固体风干(吸水的)，并放入60℃烘箱过夜。在真空下蒸发母液，得到黄色胶质。

实施例3 – 叠氮基乙基甘露二糖 (AzEBM)的合成

使用苯二甲醚，选择性地保护来自实施例2的AzEM 化合物，通过柱色谱法纯化，随后与苄基溴反应，得到 1-α-(2-叠氮基乙基)-4,6-苯甲醛二缩醛-3-苄基-吡喃甘露糖苷。随后使用三氟甲基磺酸银化学法，在严格无水条件下，用1-α-溴-2,3,4,6-四苯甲酰基吡喃甘露糖苷，糖基化产物，得到受保护的-叠氮基乙基甘露二糖产物。然后将中间产物去保护，以去除苯甲酰基，得到AzEBM。

实施例4 –叠氮基乙基甘露三糖 (AzETM)的合成

a. 1-α-溴-2,3,4,6-四苯甲酰基-甘露糖

向含有搅拌棒和氮入口的500 mL 3-颈烧瓶中加入40克(60.9 mmol) 五苯甲酰基甘露糖和80 mL 二氯甲烷。将得到的溶液在冰浴中冷却至< 5℃，并以维持反应温度 < 10℃的速率，通过加料漏斗，加入80 mL 33%HBr-乙酸溶液。在加入结束后(~ 30 min.)，去除冰浴，并继续搅拌3小时。

用等体积 (160 mL)的DCM稀释反应液，并连续用水 (2x 500 mL)、饱和碳酸氢盐 (2x 50 mL)和盐水(1x50 mL)萃取，经硫酸镁干燥，蒸发溶剂，得到 41克稳定的泡沫 (理论产量40.1克)，并在冰箱中在N₂下储存。该物质不经进一步纯化地使用。通过TLC，监测反应：硅胶 (己烷/乙酸乙酯, 7/3) 原料 R_f 0.65，产物R_f 0.8 紫外显影。¹H NMR (CDCl₃) δ 8.11(d, 2H),8.01(m, 4H), 7.84(d, 2H), 7.58(m, 4H), 7.41(m, 6H), 7.28(t, 2H), 6.58(s, 1H), 6.28(m, 2H), 5.8(m, 1H), 4.75(dd, 1H) 4.68 (dd, 1H) 4.5(dd, 1H)。

b. 1-叠氮基乙基-2,4-二苯甲酰基甘露糖

向含有搅拌棒、氮入口和300 ml 无水乙腈的1.0L 3-颈烧瓶中加入25克1-叠氮基乙基甘露糖 (100.4 mmol)和50 mL 邻苯甲酸三乙基酯 (220 mmol, 2.2当量)。在室温搅拌得到的料浆，并加入0.8mL (10 mmol)纯的三氟醋酸 (TFA)。该溶液在10分钟内澄清，并继续搅拌另外2小时，然后加入25 ml 10% TFA水溶液，并继续搅拌另外2小时，以将中间体水解成酯异构体。在真空下蒸发溶剂成粘稠的油，与50 mL DCM一起研磨，并再次蒸发成粘稠的油。

将甲苯 (70 mL)加入残余物中，给该粘稠的溶液接种2,4-二苯甲酰基叠氮基乙基甘露糖。在15分钟内形成细微的沉淀物，继续在室温搅拌过夜。将得到的浓悬浮液在冰箱中放置2-4小时，然后过滤，并用冰冷的甲苯 (2x10 mL)洗涤固体。将固体风干至恒重，得到 21克(总产量22.85克，在50%异构体纯度) ~95%异构体纯度。将产物放入40 mL甲苯中，搅拌1小时，然后在冰箱中放置另外2小时。过滤固体，并用冰冷的甲苯(2x10 mL) 洗涤，风干至恒重，以83%产率得到 18.5克单一异构体产物2,4-二苯甲酰基叠氮基乙基甘露糖。母液含有不希望的异构体和小量希望的异构体。通过TLC，监测反应：SG (己烷/乙酸乙酯7/3) 原料 R_f 0.0, 原酸酯中间体R_f 0.9. (己烷/乙酸乙酯：8/2) SM R_f 0.8，希望的异构体R_f 0.4，不希望的异构体R_f 0.2 ¹H NMR 300MHz (CDCl₃) δ 8.12(t, 4H), 7.66(t, 2H), 7.5(m, 4H), 5.56(t, 1H), 5.48(m, 1H), 5.14(m, 1H), 4.5(dd, 1H), 4.0(m, 2H), 3.8(m, 3H), 3.56(m, 1H), 3.44(m, 1H)。

c. 高苯甲酰化的-甘露(α-1,3)-甘露(α-1.6)-α-1-叠氮基乙基吡喃甘露糖苷

向具有搅拌棒、氮入口的1.0 L 3-颈烧瓶中加入在185 mL DCM 中的41克粗的1-溴-四苯甲酰基甘露糖 (60.9 mmol, ~2.5当量)。向其中加入11.2克2,4-二苯甲酰基叠氮基乙基甘露糖 (24.5 mmol)，随后加入11.2克4A筛。将料浆在室温搅拌10分钟，在甲醇/冰浴中冷却至–15℃。

在一个单独的深色罐中加入190 mL甲苯，随后加入15.1克三氟甲磺酸银 (AgOTf) (58.8 mmol, 2.4当量)，并在暗处搅拌成溶液。将该溶液转移至大加料漏斗，逐滴加入到搅拌的悬浮液中，同时保护反应避光。通过调节AgOTf加入速率，维持反应温度< -10℃。在加入结束后(~30分钟)，去除冷却浴，将反应物搅拌另外2小时，直到通过TLC (SG, 己烷/乙酸乙酯：7/3, 溴 R_f 0.9, 叠氮基 R_f 0.4, trios产物R_f 0.5, 紫外显影)证实保留单一产物。

加入三乙胺 (7 mL, 5.0当量)，随后加入200 mL DCM。通过硅胶和硅藻土垫，过滤得到的料浆，并用2x 75 mL DCM洗涤。在真空下蒸发溶剂，并将残余物放入乙酸乙酯中，依次用水 (2x100 mL)、碳酸氢盐 (2x50 mL)、盐水(1x75 mL)洗涤，并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，得到39克稳定的泡沫 (总产量39.5克)。¹H NMR 300MHz (CDCl₃) δ 8.3(d, 2H), 8.2(m, 8H), 7.85(d, 4H), 7.75(dd, 4H), 7.3-7.65(m, 30H), 7.2(t, 2H), 6.05(m, 4H), 5.9(t, 2H), 5.63(m, 2H), 5.38(s, 2H), 5.18(d, 1H), 4.65(m, 4H), 4.5(m, 2H), 4.35(m, 4H), 3,8(m, 2H), 3.54(m, 2H)。

d. 甘露(α-1,3)-甘露(α-1.6)-α-1-叠氮基乙基吡喃甘露糖苷

向搅拌的3.0克高苯甲酰化的-甘露(α-1,3)-甘露(α-1.6)-α-1-叠氮基乙基吡喃甘露糖苷 (1.86 mmol)在40 mL 甲醇中的悬浮液中加入0.2 mL 4.28M甲醇钠的甲醇溶液。将得到的悬浮液在室温搅拌20小时，得到澄清的溶液。通过TLC (SG, 己烷/乙酸乙酯：8/2 SM R_f 0.4，产物R_f 0.0)，监测反应结束。

在真空下蒸发甲醇，得到油状半固体。将残余物放入乙酸乙酯 (50 mL)中，并搅拌3小时。过滤固体，用新鲜的乙酸乙酯 (2x20 mL)洗涤，并风干至恒重，得到 1.09克(总产量1.07克)产物。母液含有残余的苯甲酸甲酯，即去保护副产物。

实施例5 – 从叠氮基乙基-糖 (AzEG、AzEM、AzEBM、AzETM)合成氨基乙基-糖 (AEG、AEM、AEBM、AETM)

使用钯/碳催化剂、小量醋酸和乙醇溶剂，在室温容易地氢化来自实施例 1-4的叠氮基-封端的化合物，得到对应的胺-封端的化合物。图1 显示了AEG、AEM、AEBM、AETM的化学结构。该过程与下面关于AETM所述的过程相同，除了本领域技术人员会理解：试剂、溶剂等的量应当与要氢化的糖-配体的摩尔数匹配。

a. 甘露(α-1,3)-甘露(α-1.6)-α-1-氨基乙基吡喃甘露糖苷 (“氨基乙基三甘露糖”, AETM)

向5.3克(9.25 mmol) 甘露(α-1,3)-甘露(α-1.6)-α-1-叠氮基乙基吡喃甘露糖苷在100 mL 水和50 mL 乙醇中的溶液中加入0.8克5%Pd/C。在30-40 psi，氢化该剧烈搅拌的悬浮液48小时，或直到通过TLC (SG, 甲醇, SM R_f 0.75, Pdt R_f 0.0, PMA显影)证实没有原料。悬浮液经硅藻土过滤，用乙醇 (2x50 mL)冲洗，并在真空下浓缩滤液。

该物质的HPLC (C18, 3%乙腈/97%0.1%H₃P0_4, 220 nm, 2 ml/min) 产生注射柱空隙物质的紫外吸收，Rt 2.5分钟，指示苯甲酸酯。

用70 mL 水和12 ml 1N NaOH 稀释滤液，并在室温搅拌溶液过夜 (HPLC：没有紫外物质在柱空隙 Rt 2.5 min.，在Rt 10.5分钟的紫外物质与苯甲酸一起洗脱)。加入2克脱色炭，将搅拌的悬浮液加热至80℃，冷却至室温，并经硅藻土过滤。用2N HCl，将滤液pH调至8.0，并在在真空下浓缩无色溶液至约50%体积。

将溶液装载上树脂柱 (Dowex 50W, 50克)，并用水(6x75 mL)洗涤，直到洗脱级分是中性pH，去除任何残余的酸副产物。用0.25N 氢氧化铵 (6x75 mL)，从柱洗掉胺产物，合并含有胺产物的级分（茚三酮检测），并在真空下浓缩至25-30 mL。将该浓缩的溶液逐滴加入300 mL搅拌的乙醇中，并继续搅拌另外2小时。过滤产物，用新鲜的乙醇 (2x50 mL)洗涤，并风干至恒重。将得到的白色无定形固体在真空干燥箱中在80℃进一步干燥5小时，得到 4.1克白色颗粒状固体(总产量5.1克)。NMR证实没有任何芳族质子。¹H NMR 300 MHz (D₂O) δ 5.08(s, 1H), 4.87(s, 1H), 4.81(s, 1H), 4.8-3.6(m, 18H)、2.9(m, 2H)。

实施例6 – NH₂-B29-BOC2(A1,B1)-胰岛素的合成

a. Fmoc-1-(B29)-胰岛素

在典型合成中，将4克胰岛素粉末(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)溶解于在室温的100 ml 无水DMSO中，随后加入4 ml 三乙胺 (TEA)。将该溶液在室温搅拌30分钟。接着，将1.2当量的9-芴基甲基 N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-NHS) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)（作为1.0 M Fmoc-NHS在THF中的溶液）缓慢地加入该胰岛素-TEA溶液中。将反应物混合大约1小时。如下猝灭反应：通过加入4 ml 储备溶液（含有在5 ml DMSO中的250 ul乙醇胺），随后混合5分钟。猝灭后，将整个溶液倒入1600 ml丙酮中，并用药刀简单混合。接着，将18.9%HCl:水溶液的8 x 400 µl等分试样逐滴加到混合物的表面上，以沉淀反应过的胰岛素。然后将沉淀物离心，并将上清液倾析进第二个烧杯中，同时将沉淀饼留出。向上清液中，将18.9%HCl:水溶液的另外8 x 400 µl等分试样逐滴加到混合物的表面上，以得到反应过的胰岛素的第二份沉淀物。将该第二份沉淀物离心，并抛弃上清液。用丙酮洗涤来自2个沉淀步骤的合并的离心饼1次，随后在真空下在室温干燥，得到粗粉末，其通常含有20%的Fmoc1产物、65%的Fmoc2产物和15%的未反应的胰岛素。

使用制备反相HPLC方法来从粗粉末分离纯的希望的Fmoc1-胰岛素。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在25 mg/ml，将粗粉末溶解在70%A/30%B 混合物中，并通过注射器式滤器过滤，然后注射到柱上。在纯化之前，使用Waters DeltraPrep 600 系统，在15 ml/分钟，用70%A/30%B 流动相平衡柱 (Waters SymmetryPrep C18, 7 um, 19 x 150 mm)。在5分钟时间段内，以15 ml/分钟的流速，将大约5 ml粗粉末溶液注射到柱上，然后在接下来的3.5分钟时间段内，采用70%A/30%B至62%A/38%B的线性梯度，并保留另外2.5分钟。使用该方法，在未反应的RHI 峰之后，希望的Fmoc1 峰在大约3分钟洗脱，后面紧跟着Fmoc2-胰岛素峰。收集后，旋转蒸发该溶液，以去除乙腈，并低压冻干，以得到纯的Fmoc1-胰岛素粉末。通过LC-MS (HT Laboratories, San Diego, CA)证实身份（identity），并通过N-端测序 (Western Analytical, St. Louis, MO)，测定缀合部位。

b. BOC2(A1,B1)-Fmoc-(B29)-胰岛素

在典型合成中，将1 g Fmoc1-(B29)-胰岛素溶解于在室温的25 ml 无水DMSO中，随后加入1 ml 三乙胺 (TEA)。将该溶液在室温搅拌30分钟。接着，将0.379 ml (2.2当量)的二-叔丁基-二碳酸酯/THF溶液 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)缓慢地加入该胰岛素-TEA溶液中，并混合大约1小时。如下猝灭反应：通过加入1 ml 储备溶液（含有在5 ml DMSO中的250 ul乙醇胺），随后混合5分钟。猝灭后，将整个溶液倒入400 ml 丙酮中，并用药刀简单混合。接着，将18.9%HCl:水溶液的8 x 100 µl 等分试样逐滴加到混合物的表面上，以沉淀反应过的胰岛素。然后将沉淀物离心，并将上清液倾析进第二个烧杯中，同时将沉淀饼留出。向上清液中，将18.9%HCl:水溶液的另外8 x 100 µl 等分试样逐滴加到混合物的表面上，以得到反应过的胰岛素的第二份沉淀物。将该第二份沉淀物离心，并抛弃上清液。用丙酮洗涤来自2个沉淀步骤的合并的离心饼1次，随后在真空下在室温干燥，得到粗粉末，其通常含有大于90%的希望的BOC2-Fmoc-1产物。

使用制备反相HPLC方法来从粗粉末分离纯的BOC2-Fmoc-1-胰岛素。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在25 mg/ml，将粗粉末溶解在70%A/30%B 混合物中，并通过注射器式滤器过滤，然后注射到柱上。在纯化之前，使用Waters DeltraPrep 600 系统，在15 ml/分钟，用70%A/30%B 流动相平衡柱 (Waters SymmetryPrep C18, 7 um, 19 x 150 mm)。在5分钟时间段内，以15 ml/分钟的流速，将大约5 ml粗粉末溶液注射到柱上，然后在接下来的3.5分钟时间段内，采用70%A/30%B至62%A/38%B的线性梯度，并保留另外2.5分钟。使用该方法，在Fmoc1-胰岛素原料之后，希望的BOC2-Fmoc-1 峰在大约5分钟洗脱。收集后，旋转蒸发该溶液，以去除乙腈，并低压冻干，以得到纯的BOC2(A1,B1)-Fmoc(B29)-胰岛素粉末。通过LC-MS (HT Laboratories, San Diego, CA)证实身份，并通过N-端测序 (Western Analytical, St. Louis, MO)，测定缀合部位。

c. NH₂-(B29)-BOC2(A1,B1)-胰岛素

如下去除BOC2(A1,B1)-Fmoc(B29)的Fmoc保护基：将根据前述步骤得到的冻干粉溶解在4℃的20%哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中30分钟，然后在含有0.150 M NaCl的25 mM HEPES pH 8.2缓冲液中10倍超稀释。使用NaOH溶液，将pH调至7.0-8.0，然后使物质穿过Biogel P2柱，以去除Fmoc、DMF和任意其它污染盐。在需要时，将NH₂-(B29)-BOC2(A1,B1)-胰岛素低压冻干成粉末，或在需要时直接地在水溶液中使用。

实施例7 – 在有机溶剂中用多价活化的酯进行胰岛素缀合

在60 mM，将含有N末端活化的酯的框架溶解在1 ml 无水DMSO中，随后加入400 ul (过量)三乙胺 (TEA)。将该溶液在室温迅速搅拌10分钟。平行地，在适当体积的无水DMSO中，制备122 mM配体溶液。溶解后，在10分钟的时间段内逐滴加入足够的配体溶液，以提供精确地等于框架上活化的酯基团的数目N减去1的反应当量数。例如，如果框架上存在N=3个活化的酯基团，则加入(1x(3-1)x60mM/122 mM)=0.98 ml 配体溶液。如果框架上存在N=4个活化的酯基团，则加入(1x(4-1)x60mM/122 mM)=1.5 ml 配体溶液，以此类推。加入配体溶液后，将该溶液在室温搅拌2小时。

然后以8.1 mM的浓度，单独地将胰岛素溶解在7.5 ml 无水DMSO中。溶解后，在1分钟时间段内，将整个胰岛素溶液加入到框架/DMSO/配体/TEA溶液中，然后在室温混合另外2小时，以确保完全反应。

然后将得到的溶液在含有0.150 M NaCl的20 mM pH 5.0 HEPES缓冲的盐水溶液中10倍超稀释，再用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约10 ml。使用制备反相HPLC（在Waters SymmetryPrep C18, 7 um柱, 19 x 150 mm上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用Waters DeltraPrep 600系统，在15 ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡柱。在2分钟时间段内，以15 ml/分钟的流速，将大约5 ml 粗产物溶液注射到柱上，然后在接下来的5分钟内采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。目标峰的保留时间随使用的胰岛素分子、框架和配体而异。收集后，旋转蒸发该溶液，以去除乙腈，并低压冻干，以得到纯的缀合物，其身份可以通过LC-MS (HT Laboratories, San Diego, CA)予以证实。

实施例8 – 在有机溶剂中从未保护的胰岛素生成的含有多价糖的B29-胰岛素缀合物

本实施例利用下述事实，即在未保护的胰岛素中，Lys-B29 ε-氨基部分是最有反应性的胺，其次是A1，然后是B1。因此，当使用未保护的胰岛素时，得到的缀合物应当主要在Lys-B29位置被取代。使用在实施例7中所述的方法和重组人胰岛素(分子量=5808 Da, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)，使用购自Molecular Biosciences (Boulder, CO)的TSAT-C6活化的酯框架，制备下述胰岛素缀合物。如前所述，合成AEM和AETM。适当尺寸的尺寸排阻介质是Biogel P2 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)，适当尺寸的超滤膜分子量截止值是3kDa。

根据N-端测序，大约85 %的含有AEM的框架通过Lys-B29缀合到胰岛素上，大约87 %的含有AETM的框架通过Lys-B29缀合到胰岛素上。

实施例9 – 在水性溶剂中用多价活化的酯进行胰岛素缀合

本实施例描述了在实施例7中所述的方法的替代方法，其中在替代有机溶剂的水性溶剂中进行反应。

以60 mM，将含有N 末端活化的酯的框架溶解在6.25 ml 无水DMSO中，随后加入2 ml (过量)三乙胺 (TEA)。在室温快速搅拌该溶液10分钟。平行地，在适当体积的无水DMSO中，制备448 mM配体溶液。溶解后，在10分钟时间段内，逐滴加入足够的配体溶液，以提供等于（框架上活化的酯基团的数目N减去1）*1.5的反应当量数。例如，如果框架上存在N=3个活化的酯基团，则加入(1.5x(3-1)x60mM/ 448 mM)x 6.25ml = 2.5 ml 配体溶液。如果框架上存在N=4个活化的酯基团，则加入(1.5x(4-1)x60mM/448 mM)x6.25ml = 3.8 ml 配体溶液，以此类推。加入配体溶液后，将该溶液在室温搅拌1小时。

然后以17.2 mM，单独地将胰岛素分子溶解在2.67 ml 0.1M、pH 11碳酸钠缓冲液中，随后用1.0 N 氢氧化钠，将pH调至10.8。溶解后，在75分钟时间段内，向胰岛素/碳酸盐缓冲溶液中逐滴加入整个框架/DMSO/配体/TEA溶液。在加入过程中，在必要时，使用稀HCl或NaOH，每5分钟将得到的混合物的pH调至10.8。在滴加以后，将溶液搅拌另外15分钟，以确保完全反应。

然后在含有0.150 M NaCl的20 mM pH 5.0 HEPES缓冲的盐水溶液中，将得到的溶液超稀释10倍，随后用稀HCl调节pH至最终的pH8.0。首先使用适当的固相，通过尺寸排阻，纯化水溶液，用于希望的缀合的和未缀合的物质的分离。然后使用适当尺寸的超滤膜，将穿过柱空体积的溶液浓缩至大约40 ml。使用制备反相HPLC（在Waters SymmetryPrep C18, 7 um, 19 x 150 mm柱上），进一步纯化该溶液，以得到希望的产物。缓冲液A是含有0.1%TFA的去离子水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈。在纯化之前，使用Waters DeltraPrep 600系统，在15 ml/分钟，用80%A/20%B流动相平衡柱。在2分钟时间段内，以15 ml/分钟的流速，将大约5 ml 粗产物溶液注射到柱上，然后在接下来的5分钟内采用80%A/20%B至75%A/25%B的线性梯度，继之以在接下来的22分钟内75%A/25%B至62%A/38%B的更慢的线性梯度。目标峰的保留时间随使用的胰岛素分子、框架和配体而异。收集后，旋转蒸发该溶液，以去除乙腈，并低压冻干，以得到纯的缀合物，其身份可以通过LC-MS (HT Laboratories, San Diego, CA)予以证实。

实施例10 – 在水性溶剂中从未保护的胰岛素合成的B29-AEM-2-胰岛素缀合物I-7

本实施例利用下述事实，即在未保护的胰岛素中，Lys-B29 ε-氨基部分是最有反应性的胺，其次是A1，然后是B1。因此，当使用未保护的胰岛素时，得到的缀合物应当主要在Lys-B29位置被取代。使用在实施例9中所述的方法和和重组人胰岛素(分子量 = 5808, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)，使用购自Molecular Biosciences (Boulder, CO)的TSAT-C6活化的酯框架，制备AEM-2胰岛素缀合物。如前所述，合成用作胰岛素类似物的AEM。适当尺寸的尺寸排阻介质是Biogel P2 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)，适当尺寸的超滤膜分子量截止值是3 kD。发现终产物 (通过HPLC测得，95%纯度)具有希望的分子量6729 g/mol (LC-MS)，这代表每个胰岛素缀合了共2.0个AEM 分子，大于85%的缀合物分子缀合在Lys-B29位点(N-端测序)。

实施例11 – 使用来自诸如牛和猪等其它物种的天然胰岛素制备的缀合物

使用用于缀合重组人胰岛素的任意方法，可以偶联来自其它物种的含有至少1个反应性胺官能团的胰岛素(例如，牛和猪胰岛素)。本领域技术人员会理解，从牛或猪胰岛素制成的目标缀合物的分子量与从重组人胰岛素制成的那些相差在下表中列出的量。

本领域技术人员还理解：从牛或猪胰岛素制成的目标缀合物的色谱峰保留时间可能稍微不同于从人胰岛素制成的那些缀合物，这是由于胰岛素之间结构的较小差异。

实施例12 –用诸如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、谷赖胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素等胰岛素类似物制备的缀合物

使用用于缀合重组人胰岛素的任意方法，可以偶联含有至少1个反应性胺官能团的所有已知的胰岛素类似物(例如，赖脯胰岛素、门冬胰岛素、谷赖胰岛素、甘精胰岛素和地特胰岛素)。本领域技术人员会理解：从胰岛素类似物制成的目标缀合物的分子量与从重组人胰岛素制成的那些相差在下表中列出的量。

本领域技术人员还理解：从胰岛素类似物制成的目标缀合物的色谱峰保留时间可能稍微不同于从人胰岛素制成的那些缀合物，这是由于胰岛素之间结构的较小差异。

实施例13 – AEM-2-TSAT-C6-胰岛素缀合物的B29-取代形式的PK和生物活性

本实施例描述了皮下施用的示例性缀合物所得到的血清胰岛素和血糖抑制特性。使用TSAT-C6（作为框架）、AEM（作为配体）和重组人胰岛素，合成示例性缀合物（图2中的I-7），用于生产B29-取代的缀合物。在该情况下，以5 U/kg，将缀合物注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley, 400-500 g, n = 3)的颈后。在0分钟和注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(人胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素浓度。从图3可以看出，B29-取代的缀合物被迅速吸收到血清中，并在皮下注射后，迅速从血清中消除。

实施例14 – a-MM 对PK和生物活性的影响随着配体亲和力而变化

在本实施例中，使用TSAT-C6框架，并根据在实施例9中所述的方法，合成下述缀合物(注：氨基葡萄糖-HCl或GA-HCl购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)，并不经进一步纯化而使用):

。

根据N-端测序, 大约90%的每个含有糖的框架通过Lys-B29缀合到胰岛素上。TSAT-C6-AEM-2 (B29)和TSAT-C6-GA-2 (B29)在图2中分别显示为缀合物 I-7和I-5。

将缀合物 (5 U/kg)注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley, 400-500克, n = 3)的颈后。延迟15分钟后，腹膜内地注射4g/kg剂量的a-MM。在0分钟和初次缀合物注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(ISO胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素浓度。在15分钟后，通过注射替代a-MM的盐水，制作对照。

图4和5显示了当腹膜内注射施用a-MM、并在15分钟后分别皮下注射I-7和I-5时得到的结果。如证实的，与盐水注射对照组相比，对于缀合物I-7而言，由注射a-MM导致的PK/PD特性的增加是非常显著的(p<0.05)。I-5 缀合物特性不受a-MM 注射的影响。

实施例15 – a-MM 对PK和生物活性的影响随着配体配价而变化

在本实施例中，我们开始确定已经共价连接了递增数量的示例性的糖配体的缀合物的药代动力学和药效动力学行为。根据在实施例9中所述的方法，使用下面指定的框架和糖配体，合成所有缀合物:

。

根据N-端测序, 大约90%的每个含有糖的框架通过Lys-B29缀合到胰岛素上。缀合物在图2中显示为I-8、I-9、I-10和I-11。

对于在上表中描述的缀合物，重复在实施例14中所述的相同类型的实验。在每种情况下，将相同剂量的缀合物(5 U/kg)注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley, 400-500克, n = 3)的颈后。延迟15分钟后，腹膜内地注射4g/kg剂量的a-MM。在0分钟和初次缀合物注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(ISO胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素浓度。在15分钟后，通过注射替代a-MM的盐水，制作对照。

图6和7显示了当腹膜内注射施用a-MM、并在15分钟后分别皮下注射I-8和I-9时得到的结果。如证实的，与盐水注射对照组相比，对于I-9而言，由注射a-MM导致的PK/PD特性的增加是非常显著的(p<0.05)，对于I-8，则显著性更低。

图8和9显示了当腹膜内注射施用a-MM、并在15分钟后分别皮下注射I-10和I-11时得到的结果。如证实的，与盐水注射对照组相比，对于I-11而言，由注射a-MM导致的PK/PD特性的增加是非常显著的(p<0.05)，对于I-10，则显著性稍低。

实施例16 – 体内半衰期/消除速率对比

使用示例性缀合物进行下述实验，以测定与未缀合的胰岛素相比，它们在体内从血清清除的速率。根据在实施例9中所述的一般方法，合成在本研究中使用的所有缀合物。

在每种情况下，在0.4 mg缀合物/kg体重，将可溶的缀合物施用到双颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic, JV/JV, 350-400g, n=3)中。通过1个颈静脉插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。第2个插管用于在 t = 0 (给药前)和在给药后1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟时收集血样。

使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(异胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素或血清缀合物浓度。

图10 显示了RHI或TSAT-C6-AETM-2 缀合物（在图2中显示为I-6）的血清浓度随着静脉内注射后的时间而变化。显然，与RHI相比，I-6更迅速地从血清中消除。使用具有下述通式的两隔室双指数模型，最佳地拟合数据：C(t) = A_o EXP(-at) + B_o EXP(-bt)，其中t是时间，C(t)是随着时间而变化的在血清中的浓度，A_o是第一隔室浓度常数，a是第一隔室指数时间常数，B_o是第二隔室浓度常数，且b是第二隔室指数时间常数。与每个隔室有关的消除半衰期(分钟) 是：t1/2(a) = 0.693/a，t1/2(b) = 0.693/b。在图10中，对于RHI，t1/2(a) = 0.76，t1/2(b) = 11.46，且对于I-6，t1/2(a) = 0.47，t1/2(b) = 2.87。换而言之，I-6的t1/2(b)比RHI的t1/2(b)短约4倍。

下表总结了使用与上述完全相同的方法测试的许多缀合物(结构显示在图2中)的t1/2参数:

。

该数据与下述假设相一致，即示例性缀合物比未缀合的胰岛素更迅速地从血清中消除，其程度由特定缀合物对内源凝集素的亲和力和每种缀合物取代的配体的数目决定。

实施例17 – 在葡萄糖输注下的体内半衰期/消除速率

在本实施例中，进一步假设生理浓度的葡萄糖的存在可以抑制示例性缀合物的清除速率。为了测定在高血糖条件下所述缀合物在体内从血清中清除的速率，进行下述实验。在每种情况下，以0.4 mg缀合物/kg体重，将I-7施用进双颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic, JV/JV, 350-400g, n=3)中。

在开始实验之前1小时，将1个大鼠插管连接至含有无菌的50%w/v葡萄糖溶液的注射器输液泵。由实验人员调节泵输注速率，以确保在实验期间的所有时间，动物中的血糖水平保持高于300 mg/dL。使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖。在一个典型实验中，发现保持动物高于300 mg/dL所需的泵输注速率通常大于85 uL/min。在t = 0 min，采取血样，然后通过第2个大鼠插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。用肝素-盐水另外冲洗插管线以后，第2个插管用于在给药后t = 1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟收集血样。

在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清，随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(异胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素或血清缀合物浓度。根据两隔室模型（其中t1/2(a) = (ln 2)/k_a，且t1/2(b) = (ln 2)/k_b），使用2个独立衰减指数之和(C(t) = a exp(-k_at) + b exp(-k_bt))，最佳拟合相对于时间数据的胰岛素或缀合物血清浓度。下表总结了使用和不使用葡萄糖输注时的I-7的t1/2参数以及来自实施例16的RHI所得到的那些参数：

。

我们从这些数据可以得到结论，即葡萄糖能够抑制该缀合物的加速的血清消除，由此使b期消除半衰期从2.77倍增至5.11分钟。

实施例18 –在a-MM 输注下的体内半衰期/消除速率

在本实施例中，进一步假设任意高浓度的抑制性糖（葡萄糖除外，诸如α-甲基-甘露糖 (a-MM)）的存在可以抑制胰岛素-缀合物的清除速率。为了测定在a-MM存在下，示例性缀合物在体内从血清清除的速率，进行下述实验。在每种情况下，以0.4 mg缀合物/kg体重，将可溶的缀合物施用进双颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic, JV/JV, 350-400g, n=3)中。

在开始实验之前1小时，将1个大鼠插管连接至含有无菌的25%w/v a-MM溶液的注射器输液泵。由实验人员调节泵输注速率，但是通常设定在85 uL/min。在t = 0 min，采取血样，然后通过第2个大鼠插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。用肝素-盐水另外冲洗插管线以后，第2个插管用于在给药后t = 1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟收集血样。

另外，使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖。在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清，随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(异胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素或血清缀合物浓度。根据两隔室模型（其中t1/2(a) = (ln 2)/k_a，且t1/2(b) = (ln 2)/k_b），使用2个独立衰减指数之和(C(t) = a exp(-k_at) + b exp(-k_bt))，最佳拟合相对于时间数据的胰岛素或缀合物血清浓度。下表总结了使用和不使用a-MM 输注时的TSAT-C6-AEM-2 缀合物的t1/2参数以及来自实施例17的葡萄糖输注所得到的那些参数和来自实施例16的没有糖输注的RHI所得到的那些参数：

。

我们从这些数据可以得到结论，即a-MM不仅会抑制该缀合物的加速的血清消除，而且其抑制程度甚至大于葡萄糖。在该情况下，b期消除半衰期从2.77几乎增加到4倍至10.09分钟。

实施例19 –使用鱼精蛋白、锌和其它赋形剂的长效胰岛素缀合物

为了制备长效缀合物，我们从基于实施例9的方法制备的B29-取代的缀合物，制备了PZI (鱼精蛋白锌胰岛素)制剂。在这些制剂中使用的赋形剂包括鱼精蛋白、锌、间甲酚和盐，它们都商业上购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。可以改变这些组分的浓度，以便得到最佳平坦的、持久的吸收速率。另外，在有些情况下，发现加入小量未修饰的胰岛素有助于稳定化该制剂。在这些情况下，改变样品中含有的未修饰的胰岛素的浓度，以得到最佳平坦的、持久的吸收速率。在测试的所有制剂中，使用下述配方：

。

除非另外指出，在以上表中所述的次序加入所述组分制备出制剂以后，将它们轻轻混合30分钟，然后进行体内试验。

为了测试给定的制剂的持续释放特性以及葡萄糖-响应的PK特性，进行下述实验。在预定的剂量 (在大多数情况下，~ 15 U/kg，除非另外指出)，将制剂注射到禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley, 400-500克, n = 3)的颈后。延迟240分钟后，腹膜内地注射葡萄糖剂量(4 g/kg)。在0分钟和初次缀合物注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(异胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素浓度。根据生产商的试验说明书，异胰岛素ELISA与大鼠胰岛素具有71%交叉反应性。将血清样品稀释10倍，以便使在每个样品中检测到的内源大鼠胰岛素的量最小化，但是不能完全排除大鼠胰岛素检测的可能性。因此，结果通常被报告为“测量的胰岛素”，其可以由一定量的内源大鼠胰岛素以及缀合物或RHI（取决于实验）组成。尽管如此，同样地处理在每个下述实施例中收集的所有样品，并可以直接对比性能的差异。

实施例20 – 鱼精蛋白浓度对长效胰岛素缀合物性能的影响

本实施例的目的是证实鱼精蛋白浓度对示例性缀合物的时间作用（time action）和葡萄糖-响应的PK特性的影响。在本实施例中，使用在实施例19中所述的一般制剂和体内方法，测试了根据在实施例9中描述的方法合成的I-6:

。

通过施用剂量为15 U/kg (体重克数/1.87 = 注射体积微升数)的上述三种制剂中的每一种，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4 g/kg)实验。在图11a-c中显示的结果证实：随着制剂中的鱼精蛋白浓度增加，在4小时葡萄糖注射以后，目标制剂延长更多，且测得的血清胰岛素特性的增加更显著。在紧随在注射以后的短时间段内，1xP-1xZ制剂释放出胰岛素缀合物负荷的主要部分，使得在腹膜内葡萄糖攻击后检测出非常微小的信号。另一方面，10xP-4xZ制剂在前4小时内释放出低基础量的胰岛素，没有低血糖症，并随后在紧随在腹膜内葡萄糖注射以后，实现测得的胰岛素浓度增加超过4倍。

实施例21 – 锌浓度对长效胰岛素缀合物性能的影响

本实施例的目的是证实锌浓度对示例性缀合物的制剂稳定性、时间作用和葡萄糖-响应的PK特性的影响。在本实施例中，使用在实施例19中所述的一般（generalized）制剂和体内方法，测试了根据在实施例9中描述的方法合成的I-6:

。

通过施用剂量为15 U/kg (体重克数/1.87 = 注射体积微升数)的上述四种制剂中的每一种，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4 g/kg)实验。在图12a-b和13a-b中显示的结果证实：在实验误差内，锌的浓度对制剂的总体持续释放性质或葡萄糖-响应特性没有显著影响。在所有情况下，在腹膜内葡萄糖注射以后，观察到测得的胰岛素浓度的统计上显著的增加。如在实施例20中所证实的，无论锌浓度如何，与更低的鱼精蛋白(4xP)制剂相比，更高的鱼精蛋白(10xP)制剂随着时间释放更少的缀合物。但是，当将制剂在室温放置超过24小时时，两种10xP制剂从容易分散的微粒溶液转化成粘性的、团聚的两相溶液。对应的10xP-4xZ制剂没有发生该现象。类似地，发现4xP-1xZ制剂以与10xP-1xZ制剂相同的方式转化，而4xP-2xZ在室温可相对稳定数周。因此，可以调节对于给定鱼精蛋白浓度的锌浓度，以制备在长时间段内稳定的容易分散的制剂。

实施例22 – 间甲酚浓度对长效胰岛素缀合物性能的影响

本实施例的目的是证实间甲酚浓度对示例性缀合物的时间作用和葡萄糖-响应的PK特性的影响。在本实施例中，使用在实施例19中所述的一般制剂和体内方法，测试了根据在实施例9中描述的方法合成的I-6:

。

通过施用剂量为15 U/kg (体重克数/1.87 = 注射体积微升数)的上述两种制剂，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4 g/kg)实验。在图14a-b中显示的结果证实：间甲酚的存在会维持更延长的制剂。在紧随在注射以后的短时间段内，不含甲酚的制剂释放出胰岛素缀合物负荷（payload）的相当一部分，使得当用腹膜内葡萄糖攻击时观察到测得的胰岛素浓度的非常微小的增加。另一方面，4x 甲酚制剂在前4小时内释放出低基础量的胰岛素，没有低血糖症，并随后在紧随在腹膜内葡萄糖注射以后，实现测得的胰岛素浓度增加3-4倍。

实施例23 –盐/等渗剂浓度对长效胰岛素缀合物性能的影响

本实施例的目的是证实盐浓度和等渗剂的选择对示例性缀合物的时间作用和葡萄糖-响应的PK特性的影响。在本实施例中，使用在实施例19中所述的一般制剂和体内方法，测试了根据在实施例9中描述的方法合成的I-6:

。

通过施用剂量为15 U/kg (体重克数/1.87 = 注射体积微升数)的上述三种制剂中的每一种，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4 g/kg)实验。在图15a-c中显示的结果证实：盐在制剂中的存在会维持更延长的制剂。不含盐的制剂在实验的前4小时内释放出胰岛素缀合物负荷的相当一部分，使得当用腹膜内葡萄糖攻击时观察到测得的胰岛素浓度的非常微小的增加。另一方面，3.3x盐制剂在前4小时内释放出低基础量的缀合物，没有低血糖症，并随后在紧随在腹膜内葡萄糖注射以后，实现测得的胰岛素浓度增加约4倍。该性能类似于使用来自实施例20的10xP-4xZ制剂所得到的结果，后者与3.3x盐制剂完全相同，但是含有大约1/3的盐浓度(1.5 M，相对于5.0 M)。最后，用甘油替代NaCl作为等渗剂，似乎不会不利地影响制剂的延长性质。

实施例24 –未修饰的胰岛素浓度对长效胰岛素缀合物性能的影响

本实施例的目的是证实包含不同浓度的未修饰的胰岛素对示例性缀合物的时间作用和葡萄糖-响应的PK特性的影响。在本实施例中，使用在实施例19中所述的一般制剂和体内方法，测试了根据在实施例9中描述的方法合成的I-6:

。

通过施用剂量为15 U/kg (体重克数/1.87 = 注射体积微升数)的上述三种制剂中的每一种，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4 g/kg)实验。在图16a-c中显示的结果证实：未修饰的胰岛素在制剂中的存在有益地产生更延长的制剂，在腹膜内葡萄糖注射以后测得的胰岛素浓度大幅增加。此外，未修饰的胰岛素的存在有助于保持制剂性能，甚至在室温温育几周以后(参见下面的实施例26)。

实施例25 – 长效胰岛素缀合物 – 剂量响应效应

在本实施例中，我们评价了长效示例性缀合物的特定制剂的剂量-响应效应。使用在实施例19中所述的一般制剂和体内方法，测试了根据在实施例9中描述的方法合成的缀合物I-6:

。

通过施用剂量为5或15 U/kg (体重克数/1.87 = 注射体积微升数)的上述制剂，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4 g/kg) 实验。

如图17所示，在注射葡萄糖之前，缀合物表现出平坦的PK特性。在腹膜内葡萄糖攻击以后，测得的胰岛素浓度的增加是急剧的和剂量-依赖性的(对比用5 U/kg (左图)和15 U/kg (右图)剂量的缀合物得到的数据)。

实施例26 –示例性的长效、葡萄糖-响应的缀合物的稳定性

在本实施例中，我们以2倍规模，合成了完全相同的来自实施例25的长效制剂。将一半所述物质在2-8℃储存并将另一半在室温储存1周或2周。在指定的储存时间以后，以15 U/kg剂量(体重克数/1.87 = 注射体积微升数)，使用在实施例25中所述的相同的4小时腹膜内葡萄糖注射方法，重新分配和测试所述物质。如图18-19所示，甚至在冷冻(图18)或在室温(图19)储存至少2周后，该制剂表现出类似的性能。

实施例27 –从具有不同配体亲和力和多价的缀合物制备的长效缀合物的性能

在本实施例中，我们开始确定从不同类型和数目的配体构建的缀合物的长效制剂的时间作用和葡萄糖-响应的PK特性。使用下面指定的框架和糖配体，根据在实施例9中所述的方法，合成用于本实施例的所有缀合物:

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对于每种缀合物，使用下述长效制剂:

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通过施用剂量为15 U/kg (体重克数/1.87 = 注射体积微升数)的上述缀合物中的每一种，进行4小时腹膜内葡萄糖注射(4 g/kg)实验。如图20所示，所有缀合物表现出延长的吸收特性，在4小时葡萄糖注射以后，测得的血清胰岛素浓度具有一定程度的增加。在注射长效TSPE-AETM-3 缀合物I-11以后的前4小时，似乎存在一些显著的缀合物吸收。但是，所有其它缀合物表现出平坦的吸收特性，象用TSAT-C6-AETM-2 缀合物所观察到的特性一样。这些结果与下述事实紧密相关，即这些缀合物的半衰期都小于在实施例 16-17中所述的未修饰的胰岛素，且它们各自表现出如在实施例 14-15中所述的a-MM-诱导的PK/PD特性的增加。

实施例28 – 长效缀合物在腹膜内a-MM测试条件下的性能

在本实施例中，我们测试了从TSAT-C6-AETM-2 (I-6)和TSAT-C6-GA-2 (I-5) 缀合物构建的缀合物长效制剂的a-MM-响应特性。根据在实施例9中所述的一般方法，制备两种缀合物。另外，对于每种缀合物，使用下述长效制剂:

。

为了测试制剂的持续释放性质以及a-MM-响应的 PK特性，进行下述实验。以15 U/kg (体重克数/1.87 = 注射体积微升数)，将制剂注射在禁食的正常非糖尿病大鼠(雄性Sprague-Dawley, 400-500克, n = 3)的颈后。延迟240分钟后，腹膜内地注射a-MM剂量(4 g/kg)。在0分钟和初次缀合物注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(异胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素浓度。

如图21a所示，在腹膜内a-MM 注射以后，长效TSAT-C6-AETM-2 (I-6)制剂的峰:基线血清浓度比值甚至高于当用葡萄糖替代a-MM时用相同制剂观察到的结果。此外，在a-MM攻击以后，TSAT-C6-GA-2 (I-5)制剂(图21b)没有表现出血清缀合物浓度的任何增加。这些结果与下述事实紧密相关，即TSAT-C6-GA-2 (I-5) 缀合物的消除半衰期与未修饰的胰岛素几乎相同(实施例16)，且它没有表现出a-MM-诱导的PK变化 (实施例14)。

实施例29 – 在糖尿病患者和非糖尿病患者中的长效缀合物

为了证实长效TSAT-C6-AETM-2 (I-6)制剂的体内效用，我们将它 (5、10和20 U/kg)施用给正常的和STZ-诱导的糖尿病的大鼠(雄性Sprague-Dawley, 400-500 克, n = 6)。使用下述方法，制备所述制剂:

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没有使用葡萄糖的外部腹膜内注射来触发缀合物的生物活性。相反，我们依赖于大鼠中的内源葡萄糖水平来控制缀合物制剂的PK和PD特性。在最初缀合物注射后的不同时间点，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖值。如图22所示，对于正常的或糖尿病的大鼠，在早期或晚期时间点，没有观察到低血糖症。用糖尿病的大鼠观察到的葡萄糖特性是急剧的，并证实：所述缀合物被更高的葡萄糖浓度活化，并在长时间段内(在最高剂量，在8小时内)以与剂量成比例的方式发挥它们的葡萄糖降低效应。

使用不同的剂量(7、14和28 U/kg)和更长的时间段 (24小时)，重复该实验。来自该实验的结果如图23所示。

实施例30 – 体内半衰期/消除速率对比

为了测定在有或没有抑制性糖（诸如葡萄糖或a-MM）存在下I-6缀合物在体内从血清中清除的速率，进行下述实验。在每种情况下，，将可溶的缀合物(或作为对照的RHI) 以0.4 mg缀合物/kg体重的剂量施用至双颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic, JV/JV, 350-400g, n=3)中。

为了测定在有升高的葡萄糖水平存在下的消除速率，在开始实验之前1小时，将1个大鼠插管连接至含有无菌的50%w/v葡萄糖溶液的注射器输液泵。由实验人员调节泵输注速率，以确保在实验期间的所有时间，动物中的血糖水平保持高于300 mg/dL。使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖。在一个典型实验中，发现保持动物高于300 mg/dL所需的泵输注速率通常大于85 uL/min。在t = 0 min，采取血样，然后通过第2个大鼠插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。用肝素-盐水另外冲洗插管线以后，第2个插管用于在给药后t = 1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟收集血样。

为了测定在有a-MM存在下的消除速率，在开始实验之前1小时，将1个大鼠插管连接至含有无菌的25%w/v a-MM溶液的注射器输液泵。由实验人员调节泵输注速率，但是通常设定在85 uL/min。在t = 0 min，采取血样，然后通过第2个大鼠插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。用肝素-盐水另外冲洗插管线以后，第2个插管用于在给药后t = 1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟收集血样。

贯穿整个实验，使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖。在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清，随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(异胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素或血清缀合物浓度。根据两隔室模型（其中t1/2(a) = (ln 2)/k_a，且t1/2(b) = (ln 2)/k_b），使用2个独立衰减指数之和(C(t) = a exp(-k_at) + b exp(-k_bt))，最佳拟合相对于时间数据的胰岛素或缀合物血清浓度。结果如图24所示。左图证实了在没有a-MM或葡萄糖存在下，I-6 缀合物比RHI 明显更高的(> 5x)消除速率。右图表明：在有葡萄糖存在下(G400 输注)，消除速率稍微降低(~ 50%)，且在有a-MM存在下(a-MM 输注)，降低幅度非常大(~ 400%)。

实施例31 – I-6静脉内输注的葡萄糖-响应的PK

在本实施例中，将在实施例30中所述的静脉内消除速率实验从单次静脉内团注（bolus）0.4 mg缀合物/kg体重修改成连续静脉内输注。本实验的目的是维持恒定的缀合物(或作为对照的RHI)的输入速率6小时，并在4小时时间点施用腹膜内注射的葡萄糖，以测定对血清缀合物(或RHI)浓度产生的影响。在每个实验中使用双颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic, JV/JV, 350-400g, n=3)中，使得1条颈静脉线用于缀合物或RHI 输注，另一条用于血液收集。

对于RHI，通过0.2 um 过滤膜，无菌过滤50 mU/ml溶液，并在0.07 ml/min输注，以提供3.5 mU/min的恒定输入速率，持续整个6小时实验。在t = 0 min，采取血样，然后开始恒定静脉内输注。第2个插管用于在t = 30、60、120、180和240 min时收集血样。在t = 240 min，通过腹膜内注射，施用4 g/kg剂量的葡萄糖，然后在t = 255、270、300、330和360 min进行血液收集。

对于I-6 缀合物，通过0.2 um 过滤膜，无菌过滤150 mU/ml溶液，并在0.10 ml/min输注，以提供15 mU/min的恒定输入速率，持续整个6小时实验。在t = 0 min，采取血样，然后开始恒定静脉内输注。第2个插管用于在t = 30、60、120、180和240 min时收集血样。在t = 240 min，通过腹膜内注射，施用1、2或4 g/kg剂量的葡萄糖，然后在t = 255、270、300、330和360 min进行血液收集。

贯穿整个实验，使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖。在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清，随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(异胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素或血清缀合物浓度。

图25的前2幅图对比了在4 g/kg腹膜内葡萄糖注射之前和之后，3.5 mU/min 输注RHI和15 mU/min 输注I-6的血糖和血清胰岛素/缀合物浓度特性。在葡萄糖注射之前，与I-6 输注相比，RHI 输注造成显著的低血糖症。在腹膜内葡萄糖注射之后，随着血糖浓度增加，测得的I-6的血清胰岛素浓度立即增加了超过300%，然后随着葡萄糖浓度降低，快速返回基线水平。另一方面，对于RHI而言，在相同的实验条件下，在腹膜内葡萄糖注射以后，测得的血清胰岛素浓度没有显著变化。图25的接下来的3幅图表明：在腹膜内葡萄糖注射期间测得的胰岛素浓度的增加程度与施用的葡萄糖的剂量和得到的血糖水平直接相关。例如，对于1 g/kg葡萄糖注射，仅观察到血清胰岛素浓度的50%峰至基线变化，而对于4 g/kg剂量，观察到300%峰至基线变化。

实施例32 – 含有和不含糖的胰岛素-缀合物的体内消除速率

为了测定在有或没有抑制性糖（诸如葡萄糖或a-MM）存在下I-9 缀合物在体内从血清清除的速率，进行下述实验。在每种情况下，将可溶的缀合物(或作为对照的RHI) 以0.4 mg缀合物/kg体重的剂量施用进双颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic, JV/JV, 350-400g, n=3)中。

为了测定在有升高的葡萄糖水平存在下的消除速率，在开始实验之前1小时，将1个大鼠插管连接至含有无菌的50%w/v葡萄糖溶液的注射器输液泵。由实验人员调节泵输注速率，以确保在实验期间的所有时间，动物中的血糖水平保持高于300 mg/dL。使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖。在一个典型实验中，发现保持动物高于300 mg/dL所需的泵输注速率通常大于85 μL/min。在t = 0 min，采取血样，然后通过第2个大鼠插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。用肝素-盐水另外冲洗插管线以后，第2个插管用于在给药后t = 1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟收集血样。

为了测定在有a-MM存在下的消除速率，在开始实验之前1小时，将1个大鼠插管连接至含有无菌的25%w/v a-MM溶液的注射器输液泵。由实验人员调节泵输注速率，但是通常设定在85 uL/min。在t = 0 min，采取血样，然后通过第2个大鼠插管，静脉内地注射无菌的缀合物溶液或对照胰岛素，随后立即注射肝素-盐水追加液，以确保所有缀合物剂量都施用进动物中。用肝素-盐水另外冲洗插管线以后，第2个插管用于在给药后t = 1、2、4、8、15、30、60、90、120和180分钟收集血样。

贯穿整个实验，使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖。在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清，随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(异胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素或血清缀合物浓度。根据两隔室模型（其中t1/2(a) = (ln 2)/k_a，且t1/2(b) = (ln 2)/k_b），使用2个独立衰减指数之和(C(t) = a exp(-k_at) + b exp(-k_bt))，最佳拟合相对于时间数据的胰岛素或缀合物血清浓度。图26的第一幅图表明：在有糖(葡萄糖G400或a-MM)存在下，未修饰的胰岛素的消除速率未受影响。为了对比，从实施例31结果重新绘制图26的最后一幅图，它显示了具有糖输注的缀合物I-6。图26的中间的图表明，与I-6 缀合物相比，在有葡萄糖存在下(G400 输注)，具有糖输注的缀合物I-9显示出显著得多的消除速率降低 (~ 350%相对于~ 50%)。与I-6 缀合物相比，在有a-MM存在下(a-MM 输注)，缀合物I-9 也表现出更显著的消除速率降低(~ 700%相对于~ 400%)。

实施例33 - 缀合物溶液在水性缓冲液中的结晶

通过光学和扫描电子显微术，证实了根据实施例 25-27合成的长效缀合物的分散系是无定形的(非结晶的)。另一方面，在类似条件下配制的常规的未缀合的胰岛素分散系通常是结晶的。胰岛素缀合物的结晶制剂可以有利地提高批次之间的再现性、增加制剂稳定性和减少在长储存时期内的颗粒团聚。因此，我们开始确定是否存在能够结晶我们的缀合物的水性条件的适当集合。

与特殊设计的悬滴蒸汽扩散（Hanging Drop Vapor Diffusion）平板一起，从Hampton Research, Inc. (Alta Vista, CA)购买一组48种结晶筛选溶液(HR2-144)。简而言之，将一小滴（a thin bead of）盖玻片密封剂施用于2个平板各自上的24个蓄池中的每一个的上边缘。将1 ml指标试剂1移液至蓄池A1，将1 ml指标试剂2移液至蓄池A2，以此类推。将2微升在去离子水中的2.5 mg/ml 缀合物溶液加到清洁的硅化处理过的22 mm直径圆形盖玻片的中心，并与2微升来自蓄池1的指标试剂1混合。反转盖玻片，并在A1 蓄池上面密封，使得微滴悬在蓄池溶液的上面。对于测试的所有48种指标溶液，重复这整个过程，并将平板在室温静置过夜，然后通过光学显微镜观察。

在图27中总结了筛选实验的结果。48种指标溶液中的大多数没有产生结晶颗粒，或根本没有该物质的任何沉淀物。指标缓冲液19 (pH 8.2, 0.056 M 磷酸二氢钠一水合物 + 1.344 M 磷酸氢二钾)清楚地产生最大量的良好确定的晶体。使用指标缓冲液19的进一步测试揭示：TSAT-C₆-AEM-2 (B29)和TSPE-AEM-3 (B29) 缀合物 I-6和I-9形成大量晶体。这些化合物的结构如图2所示。图28显示了使用含有TSAT-C₆-AETM-2 (B29)和TSAT-C₆-AEM-2 (B29) 缀合物 I-6和I-7的缓冲液19形成的代表性晶体的扫描电子显微照片(SEM)图像。

实施例34 – 来自预结晶的缀合物的长效中性鱼精蛋白制剂

制备了放大批次的使用50/50 v/v 混合物(0.5 ml 2.5 mg/ml TSAT-C₆-AETM-2 (B29) 缀合物I-6和0.5 ml 指标缓冲液19)合成的晶体，并在室温放置24小时，以实现充分和完全的结晶。向0.5 ml 得到的分散系中加入0.0795 ml 3%间甲酚溶液，随后加入0.097 ml 50 mg/ml鱼精蛋白溶液 (pH调至7.0)。在施用给大鼠之前，将得到的分散系轻轻混合大约2小时。

进行下述实验，以测试结晶的分散系(没有加入鱼精蛋白或间甲酚)以及上述的含有鱼精蛋白/甲酚的分散系的持续释放和葡萄糖-响应的PK特性。在禁食的非糖尿病的大鼠(雄性Sprague-Dawley, 400-500克，每组n = 2)的颈后，以等于动物的体重(按克计算)/2.19的体积(按微升计算)，注射无鱼精蛋白的晶体分散系，并以等于动物的体重 (按克计算)/1.62的体积(按微升计算)，注射含有鱼精蛋白/甲酚的晶体分散系。延迟240分钟后，腹膜内地注射葡萄糖剂量(4 g/kg)。在0分钟和初次缀合物注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(异胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素浓度。

如图30所示，含有鱼精蛋白/间甲酚的晶体表现出非常平坦的、延长的吸收特性，在4小时葡萄糖注射以后，血清浓度存在显著的葡萄糖-响应性的增加。但是，不含有鱼精蛋白和间甲酚的结晶的分散系在注射后立即表现出缀合物的大量释放，然后在4小时葡萄糖注射以后，血清浓度存在某种葡萄糖-响应性的增加 (图29)。这些结果指示鱼精蛋白和间甲酚与所述晶体的组合用于维持希望的长效药代动力学特性的价值。

使用TSAT-C₆-AEM-2 (B29) 缀合物I-7，重复该相同实验。制备了放大批次的使用50/50 v/v 混合物(1.0 ml 2.5 mg/ml 缀合物+ 1.0 ml 指标缓冲液19)合成的晶体，并在室温放置24小时，以实现充分和完全的结晶。向1.0 ml得到的每种缀合物的分散系中加入0.159 ml 3%间甲酚溶液，随后加入0.194 ml 50 mg/ml鱼精蛋白溶液 (pH调至7.0)。在施用给大鼠之前，将得到的分散系轻轻混合大约2小时。

在禁食的非糖尿病的大鼠(雄性Sprague-Dawley, 400-500 克，每组n = 3)的颈后，以等于动物的体重 (按克计算)/1.62的体积(按微升计算)，注射含有鱼精蛋白/甲酚的晶体分散系。延迟240分钟后，腹膜内地注射葡萄糖剂量(4 g/kg)。在0分钟和初次缀合物注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(异胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素浓度。根据生产商的试验说明书，异胰岛素ELISA与大鼠胰岛素具有71%交叉反应性。将血清样品稀释10倍，以便将在每个样品中检测到的内源大鼠胰岛素的量最小化，但是不能完全排除大鼠胰岛素检测的可能性。因此，结果通常被报告为“测量的胰岛素”，其可以由一定量的内源大鼠胰岛素以及缀合物组成。

如图31所示，含有鱼精蛋白/甲酚的晶体表现出非常平坦的、延长的吸收特性，在4小时葡萄糖注射以后，测量的血清胰岛素浓度显著增加。

上述的鱼精蛋白/甲酚晶体分散系不需要加入未缀合的游离胰岛素来维持稳定性和提高随时间的性能。我们已经发现：甚至在冷藏储存数周以后，每种结晶的分散系的表现与新鲜制备的物质相同。

实施例35 – 以生理缓冲液强度，来自预结晶的缀合物的长效中性鱼精蛋白制剂

上述的含有鱼精蛋白/甲酚的结晶的分散系仍然含有远远高于生理浓度的钾和磷酸盐，它们在重复给药后，可能潜在地导致不希望的注射位点炎症。进行下述实验，以确定晶体在形成后在含有鱼精蛋白和甲酚的生理盐水中是否是稳定的。将3.0 ml TSPE-AEM-3 (B29) 缀合物I-9 (2.5 mg/ml)与3.0 ml 缓冲液19相混合，并在室温静置过夜，以实现充分和完全的结晶。次日，将0.956 ml 3%间甲酚溶液和1.164 ml 50 mg/ml鱼精蛋白溶液 (pH 7.0)加入到得到的分散系中，并在4℃放置过夜。次日，以1,000 g离心分散系3分钟，然后通过在5.6 ml 1x 磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重新分散，去除7.5 ml 上清液。向2.8 ml 得到的分散系中加入0.447 ml 3%间甲酚溶液、0.204 ml 1x PBS和0.338 ml 50 mg/ml鱼精蛋白溶液 (pH 7.0)。在用于大鼠中测试之前，将得到的分散系在4℃储存数周。

在禁食的非糖尿病的大鼠(雄性Sprague-Dawley, 400-500克, n = 3)的颈后，以等于动物的体重 (按克计算)/1.62的体积(按微升计算)注射老化的结晶的分散系。延迟240分钟后，腹膜内地注射葡萄糖剂量(4 g/kg)。在0分钟和初次缀合物注射后30、60、90、120、150、180、210、240和300分钟，通过尾静脉抽血，收集血样。使用可商业得到的测试条 (Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)，测量血糖值。另外，在4℃离心来自每个时间点的血液，以收集血清。随后使用可商业得到的ELISA 试剂盒(异胰岛素ELISA, Mercodia, Uppsala, Sweden)，测量血清胰岛素浓度。如图32所示，在含有甲酚和鱼精蛋白的1x PBS中分散和老化的晶体表现出非常平坦的、延长的吸收特性，在4小时葡萄糖注射以后，血清浓度中存在显著的葡萄糖-响应性的增加。

其它实施方案

在考虑本文公开的本发明的说明或实践以后，本发明的其它实施方案对本领域技术人员是显而易见的。意图是说明和实施例应当视作仅是示例性的，本发明的真实范围和精神由下述的权利要求书指示。

序列表

<110> Lancaster, Thomas M.

Zion, Todd C.

<120> 结晶胰岛素-缀合物

<130> 2005700-0032

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn

20

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

20 25 30

Claims (168)

1.式(I)的结晶胰岛素-缀合物:

其中：

每次出现的

表示缀合物内的潜在分支；

每次出现的表示缀合物分支内的潜在重复；

每次出现的独立地是共价键、碳原子、杂原子或选自下述的任选地取代的基团：酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环；

每次出现的T独立地是共价键或二价的、直链的或分支的、饱和的或不饱和的、任选地取代的C_1-30烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被下述基团替换：-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R)SO₂-、-SO₂N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基；

每次出现的R独立地是氢、合适的保护基、或酰基部分、芳基烷基部分、脂族部分、芳基部分、杂芳基部分或杂脂族部分；

–B是–T–L^B–X；

每次出现的X独立地是配体，所述配体包括糖；

每次出现的L^B独立地是共价键或通过将T与X共价缀合衍生出的基团；

–D是–T–L^D–W^I；

W^I是胰岛素分子；

每次出现的L^D独立地是共价键或通过将T与W^I共价缀合衍生出的基团；

k是1-12的整数，包括端值；

每次出现的p独立地是1-5的整数，包括端值；且

每次出现的n独立地是0-5的整数，包括端值；且

每次出现的m独立地是1-5的整数，包括端值；且

每次出现的v独立地是0-5的整数，包括端值，条件是：在每个k-分支内，n的至少1次出现是≥ 1，且v的至少1次出现是≥ 1。

2.如权利要求1所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIa):

。

3.如权利要求2所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIa-1):

。

4.如权利要求2所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIa-2):

。

5.如权利要求2所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIa-3):

。

6.如权利要求1所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIb):

。

7.如权利要求6所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIb-1):

。

8.如权利要求6所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIb-2):

。

9.如权利要求6所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIb-3):

。

10.如权利要求6所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIb-4):

。

11.如权利要求6所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIb-5):

。

12.如权利要求6所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIb-6):

。

13.如权利要求6所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIb-7):

。

14.如权利要求1所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIc):

。

15.如权利要求14所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIc-1):

。

16.如权利要求14所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物具有式(IIIc-2):

。

17.如权利要求2、6或14所述的结晶胰岛素-缀合物，其中每次出现的T独立地是二价的、直链的或分支的、饱和的或不饱和的、任选地取代的C_1-20烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被下述基团替换：-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R)SO₂-、-SO₂N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基。

18.如权利要求17所述的结晶胰岛素-缀合物，其中T的1、2、3、4或5个亚甲基单元任选地且独立地被下述基团替换：-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R)SO₂-、-SO₂N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基。

19.如权利要求17所述的结晶胰岛素-缀合物，其中T从C_1-10烃链构建，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被下述基团替换：-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)₂-、-N(R)SO₂-、-SO₂N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基。

20.如权利要求17所述的结晶胰岛素-缀合物，其中T的一个或多个亚甲基单元被-C(O)-替换。

21.如权利要求17所述的结晶胰岛素-缀合物，其中T的一个或多个亚甲基单元被-C(O)N(R)-替换。

22.如权利要求17所述的结晶胰岛素-缀合物，其中T的一个或多个亚甲基单元被-O-替换。

23.如权利要求17所述的结晶胰岛素-缀合物，其中每次出现的T是相同的。

24.如权利要求2、6或14所述的结晶胰岛素-缀合物，其中L^B和/或L^D是共价键。

25.如权利要求2、6或14所述的结晶胰岛素-缀合物，其中L^B和/或L^D是如下衍生出的任选地取代的部分：将T的任选地取代的羰基-反应性的、硫醇-反应性的、胺-反应性的或羟基-反应性的部分与X或W^I的羧基、硫醇、胺或羟基缀合。

26.如权利要求2、6或14所述的结晶胰岛素-缀合物，其中L^B和/或L^D是如下衍生出的任选地取代的部分：将X或W^I的任选地取代的羧基-反应性的、硫醇-反应性的、胺-反应性的或羟基-反应性的部分与T的羧基、硫醇、胺或羟基缀合。

27.如权利要求1-26中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子选自：人胰岛素、猪胰岛素和牛胰岛素。

28.如权利要求1-26中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子选自：赖脯胰岛素、门冬胰岛素和谷赖胰岛素。

29.如权利要求1-26中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子是甘精胰岛素或地特胰岛素。

30.如权利要求1-26中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子包含3个二硫键。

31.如前述权利要求中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子通过Lys^B29的ε-氨基进行缀合。

32.如权利要求1-26中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子是通过Lys^B29的ε-氨基缀合的人胰岛素。

33.如权利要求1-32中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中每次出现的X是配体，所述配体包括二甘露糖。

34.如权利要求1-32中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中每次出现的X是配体，所述配体包括三甘露糖。

35.如权利要求1-32中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中每次出现的X是配体，所述配体包括线性的三甘露糖。

36.如权利要求1-32中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中每次出现的X是配体，所述配体包括分支的三甘露糖。

37.如权利要求1-32中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中每次出现的X是配体，所述配体包括糖和胺基。

38.如权利要求37所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述糖和胺基被C₁-C₆烷基隔开。

39.如权利要求38所述的结晶胰岛素-缀合物，其中每次出现的X独立地是配体，所述配体包括氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖 (AEM)、氨基乙基二甘露糖 (AEBM)或氨基乙基三甘露糖(AETM)。

40.如权利要求39所述的结晶胰岛素-缀合物，其中每次出现的X是配体，所述配体包括氨基乙基三甘露糖(AETM)。

41.如权利要求40所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述缀合物包括2或3次出现，其中X是配体，所述配体包括氨基乙基三甘露糖(AETM)。

42.如前述权利要求中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中每次出现的X是配体，所述配体包括通过异头碳缀合的糖。

43.如权利要求42所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述异头碳是α异头物。

44.如权利要求1-30中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中每次出现的X是通过α异头碳缀合到缀合物框架上的氨基乙基三甘露糖(AETM)；且W^I是通过Lys^B29的ε氨基缀合到缀合物框架上的胰岛素分子。

45.式(IIIb-3)的结晶胰岛素-缀合物:

其中：

W^I是胰岛素分子；且

每次出现的-X是

或

。

46.式(IIIc-2)的结晶胰岛素-缀合物:

其中：

W^I是胰岛素分子；且

每次出现的-X是

或

。

47.式(IIId-1)的结晶胰岛素-缀合物:

其中：

W^I是胰岛素分子；且

每次出现的-X是

或

。

48.如权利要求45、46或47所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子选自：人胰岛素、猪胰岛素和牛胰岛素。

49.如权利要求45、46或47所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子选自：赖脯胰岛素、门冬胰岛素和谷赖胰岛素。

50.如权利要求45、46或47所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子是甘精胰岛素或地特胰岛素。

51.一种结晶胰岛素-缀合物，其包含缀合到一个或多个配体上的胰岛素分子，所述配体独立地选自：氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖 (AEM)、氨基乙基二甘露糖 (AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖 (AEF)。

52.如权利要求51所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子通过Lys^B29的ε-氨基进行缀合。

53.如权利要求52所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述一个或多个配体是氨基乙基葡萄糖(AEG)。

54.如权利要求52所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述一个或多个配体是氨基乙基甘露糖 (AEM)。

55.如权利要求52所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述一个或多个配体是氨基乙基二甘露糖 (AEBM)。

56.如权利要求52所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述一个或多个配体是氨基乙基三甘露糖(AETM)。

57.如权利要求52所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述一个或多个配体是β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)。

58.如权利要求52所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述一个或多个配体是氨基乙基岩藻糖 (AEF)。

59.如权利要求51所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子缀合到2个或更多个单独的配体上。

60.如权利要求59所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子缀合到2个单独的配体上。

61.如权利要求59所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子缀合到3个单独的配体上。

62.如权利要求59所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体缀合到单个缀合物框架上，所述框架也缀合到该胰岛素分子上。

63.如权利要求59所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体和胰岛素分子各自位于单个分支的缀合物框架的单独分支上。

64.如权利要求59所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体和胰岛素分子各自位于单个分支的缀合物框架的单独分支的末端上。

65.如权利要求59-64中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体是氨基乙基葡萄糖(AEG)。

66.如权利要求59-64中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体是氨基乙基甘露糖 (AEM)。

67.如权利要求59-64中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体是氨基乙基二甘露糖 (AEBM)。

68.如权利要求59-64中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体是氨基乙基三甘露糖(AETM)。

69.如权利要求59-64中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体是β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)。

70.如权利要求59-64中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述2个或更多个单独的配体是氨基乙基岩藻糖 (AEF)。

71.一种结晶胰岛素-缀合物，其包含缀合到氨基乙基葡萄糖(AEG)上的胰岛素分子。

72.一种结晶胰岛素-缀合物，其包含缀合到氨基乙基甘露糖 (AEM)上的胰岛素分子。

73.一种结晶胰岛素-缀合物，其包含缀合到氨基乙基二甘露糖 (AEBM)上的胰岛素分子。

74.一种结晶胰岛素-缀合物，其包含缀合到氨基乙基三甘露糖(AETM)上的胰岛素分子。

75.一种结晶胰岛素-缀合物，其包含缀合到β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)上的胰岛素分子。

76.一种结晶胰岛素-缀合物，其包含缀合到氨基乙基岩藻糖 (AEF)上的胰岛素分子。

77.如权利要求71-76中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物，其中所述胰岛素分子通过Lys^B29的ε-氨基进行缀合。

78.下式的结晶胰岛素-缀合物：

。

79.下式的结晶胰岛素-缀合物：

。

80.下式的结晶胰岛素-缀合物：

。

81.下式的结晶胰岛素-缀合物：

。

82.下式的结晶胰岛素-缀合物：

。

83.下式的结晶胰岛素-缀合物：

。

84.下式的结晶胰岛素-缀合物：

。

85.下式的结晶胰岛素-缀合物：

。

86.一种持续释放制剂，其包含前述权利要求中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物。

87.如权利要求86所述的制剂，其中当施用给在禁食条件下的哺乳动物时，所述制剂表现出缀合物的零级释放。

88.如权利要求86所述的制剂，其中当皮下施用给在禁食条件下的哺乳动物时，所述制剂表现出缀合物的零级释放。

89.如权利要求86所述的制剂，其中所述制剂包含鱼精蛋白。

90.如权利要求86所述的制剂，其中所述制剂包含鱼精蛋白和锌。

91.如权利要求90所述的制剂，其中所述制剂包含约0.05至约10 mg鱼精蛋白/mg缀合物。

92.如权利要求90所述的制剂，其中所述制剂包含约1至约5 mg鱼精蛋白/mg缀合物。

93.如权利要求90所述的制剂，其中所述制剂包含约0.006至约0.5 mg锌/mg缀合物。

94.如权利要求90所述的制剂，其中所述制剂包含约0.1至约0.25 mg锌/mg缀合物。

95.如权利要求90所述的制剂，其中所述制剂包含比例(w/w)在约100:1至约5:1范围内的鱼精蛋白和锌。

96.如权利要求90所述的制剂，其中所述制剂包含比例(w/w)在约40:1至约10:1范围内的鱼精蛋白和锌。

97.如权利要求86-96中任一项所述的制剂，其中所述制剂另外包含抗微生物防腐剂。

98.如权利要求97所述的制剂，其中所述抗微生物防腐剂选自：间甲酚、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。

99.如权利要求97所述的制剂，其中所述抗微生物防腐剂是间甲酚。

100.如权利要求99所述的制剂，其中所述制剂包含约0.1至约1.0%v/v 间甲酚。

101.如权利要求99所述的制剂，其中所述制剂包含约0.15至约0.35%v/v 间甲酚。

102.如权利要求86-96中任一项所述的制剂，其中所述制剂另外包含等渗剂。

103.如权利要求102所述的制剂，其中所述等渗剂是多元醇。

104.如权利要求103所述的制剂，其中所述等渗剂选自：甘露醇、丙二醇和甘油。

105.如权利要求104所述的制剂，其中所述等渗剂是甘油。

106.如权利要求102所述的制剂，其中所述等渗剂是盐。

107.如权利要求106所述的制剂，其中所述盐是NaCl。

108.如权利要求107所述的制剂，其中所述制剂包含约0.05至约0.5 M NaCl。

109.如权利要求108所述的制剂，其中所述制剂包含约0.1至约0.2 M NaCl。

110.如权利要求86-96中任一项所述的制剂，其中所述制剂另外包含一定量的未缀合的胰岛素分子。

111.如权利要求110所述的制剂，其中所述制剂包含摩尔比在约100:1至约1:1范围内的结晶胰岛素-缀合物与未缀合的胰岛素分子。

112.如权利要求110所述的制剂，其中所述制剂包含摩尔比在约25:1至约2:1范围内的结晶胰岛素-缀合物与未缀合的胰岛素分子。

113.如权利要求86-112中任一项所述的制剂，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求78-85所述的结晶胰岛素-缀合物中的任一种。

114.如权利要求113所述的制剂，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求79、80或82所述的结晶胰岛素-缀合物。

115.如权利要求114所述的制剂，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求79所述的结晶胰岛素-缀合物。

116.一种泵递送系统，其包含如权利要求1-85中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物的悬浮液，其中所述泵递送系统通过将结晶胰岛素-缀合物悬浮液输注进哺乳动物中而起作用。

117.如权利要求116所述的泵，其中所述泵通过皮下地或腹膜内地输注结晶胰岛素-缀合物悬浮液而起作用。

118.如权利要求116或117所述的泵，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求78-85所述的结晶胰岛素-缀合物中的任一种。

119.如权利要求118所述的泵，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求79、80或82所述的结晶胰岛素-缀合物。

120.如权利要求119所述的泵，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求79所述的结晶胰岛素-缀合物。

121.一种治疗高血糖症的方法，所述方法包括将如权利要求1-115中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物或其制剂施用给有此需要的哺乳动物患者。

122.如权利要求121所述的方法，其中所述患者是糖尿病患者。

123.如权利要求121所述的方法，其中所述患者具有与受损的血糖控制有关的感染。

124.如权利要求121所述的方法，其中所述制剂不包含凝集素。

125.如权利要求121所述的方法，其中通过皮下注射来施用所述制剂。

126.如权利要求121所述的方法，其中所述患者是人。

127.如权利要求121-126中任一项所述的方法，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求78-85所述的结晶胰岛素-缀合物中的任一种。

128.如权利要求127所述的方法，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求79、80或82所述的结晶胰岛素-缀合物。

129.如权利要求128所述的方法，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求79所述的结晶胰岛素-缀合物。

130.如权利要求121所述的方法，其中施用所述结晶胰岛素-缀合物或其制剂，使得胰岛素分子的平均日剂量是在10-200 U范围内。

131.如权利要求130所述的方法，其中每天施用所述结晶胰岛素-缀合物或其制剂。

132.如权利要求130所述的方法，其中每周施用所述结晶胰岛素-缀合物或其制剂。

133.如权利要求130所述的方法，其中每月施用所述结晶胰岛素-缀合物或其制剂。

134.如权利要求130所述的方法，其中所述患者还正在接受胰岛素敏化剂。

135.如权利要求130所述的方法，其中所述患者还正在接受胰岛素促分泌剂。

136.一种方法，其包括将如权利要求1-115中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物或其制剂施用给有此需要的哺乳动物患者。

137.如权利要求136所述的方法，其中与未缀合形式的胰岛素分子相比，所述结晶胰岛素-缀合物诱导更低的低血糖症。

138.如权利要求136或137所述的方法，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求78-85所述的结晶胰岛素-缀合物中的任一种。

139.如权利要求138所述的方法，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求79、80或82所述的结晶胰岛素-缀合物。

140.如权利要求138所述的方法，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求79所述的结晶胰岛素-缀合物。

141.一种方法，其包括将如权利要求86-96中任一项所述的制剂施用给有此需要的哺乳动物患者。

142.如权利要求141所述的方法，其中与包含未缀合形式的胰岛素分子的制剂相比，所述制剂诱导更低的低血糖症。

143.如权利要求141所述的方法，其中与包含未缀合形式的胰岛素分子的制剂相比，所述制剂诱导更低的HbA1c。

144.如权利要求141-143中任一项所述的方法，其中所述制剂包含如权利要求78-85中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物。

145.如权利要求144所述的方法，其中所述制剂包含如权利要求79、80或82所述的结晶胰岛素-缀合物。

146.如权利要求145所述的方法，其中所述制剂包含如权利要求79所述的结晶胰岛素-缀合物。

147.如权利要求136-146中任一项所述的方法，所述方法另外包括将触发量的外源糖施用给患者。

148.如权利要求147所述的方法，其中所述外源糖是甘露糖。

149.如权利要求147所述的方法，其中所述外源糖是L-岩藻糖。

150.如权利要求147所述的方法，其中所述外源糖是N-乙酰基葡糖胺。

151.如权利要求147所述的方法，其中所述外源糖是α-甲基甘露糖。

152.如权利要求147所述的方法，其中通过不同途径，将所述缀合物或制剂和外源糖施用给哺乳动物。

153.如权利要求147所述的方法，其中皮下地施用所述缀合物或制剂，并口服地施用外源糖。

154.如权利要求147所述的方法，其中皮下地施用所述缀合物或制剂，并静脉内地施用外源糖。

155.一种制备如权利要求1-85中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物的方法，所述方法包括从磷酸盐缓冲液结晶出胰岛素-缀合物。

156.如权利要求155所述的方法，其中所述缓冲液具有比钠更高的钾浓度。

157.如权利要求155所述的方法，其中所述缓冲液具有比磷酸氢二钠更高的磷酸二氢钾浓度。

158.如权利要求155所述的方法，其中所述缓冲液具有在约6至9范围内的pH。

159.如权利要求155所述的方法，其中所述缓冲液具有约8的pH。

160.如权利要求155所述的方法，其中所述缓冲液具有8.2的pH。

161.如权利要求155所述的方法，其中所述结晶胰岛素-缀合物缀合在Lys^B29处。

162.如权利要求155所述的方法，其中所述结晶胰岛素-缀合物是如权利要求79、80或82所述的结晶胰岛素-缀合物。

163.如权利要求155所述的方法，其中加入一种或多种添加剂，其中所述添加剂选自：甲酚、苯酚、鱼精蛋白、聚(精氨酸)、甘油、氯化锌或乙酸锌。

164.如权利要求155所述的方法，其中加入聚乙二醇。

165.如权利要求155所述的方法，其中加入有机溶剂以促进结晶。

166.如权利要求155所述的方法，其中所述有机溶剂是甲醇、乙醇或异丙醇。

167.一种制备如权利要求1-85中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物的方法，所述方法包括从HEPES缓冲液结晶出胰岛素-缀合物。

168.一种制备如权利要求1-85中任一项所述的结晶胰岛素-缀合物的方法，所述方法包括从TRIS缓冲液结晶出胰岛素-缀合物。

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