CN105792852B - 葡萄糖响应性的胰岛素缀合物 - Google Patents

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Abstract

公开了包含胰岛素分子的胰岛素缀合物，所述胰岛素分子共价地连接到至少一个具有两个臂的二齿接头，每个臂独立地连接到包含糖的配体，且其中所述接头的至少一个配体的糖是岩藻糖。即使当在没有外源性多价糖结合分子（诸如Con A）存在下施用给有此需要的受试者时，所述胰岛素缀合物表现出对糖（诸如葡萄糖或α‑甲基甘露糖）的全身浓度做出响应的药代动力学(PK)和/或药效动力学(PD)特性。

Description

葡萄糖响应性的胰岛素缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年10月4日提交的美国临时申请号61/886,717的权益，且其以它的整体并入本文。
背景技术
(1) 技术领域
本发明涉及包含岩藻糖的胰岛素缀合物，即使当在没有外源性多价糖结合分子（诸如Con A）存在下施用给有此需要的受试者时，所述缀合物表现出对糖（诸如葡萄糖或α-甲基甘露糖）的全身浓度做出响应的药代动力学(PK)和/或药效动力学(PD)特性。具体地，本发明涉及包含与至少一个二齿接头共价地连接的胰岛素分子的胰岛素缀合物，其中所述接头的每个臂独立地连接到包含糖的配体，且其中至少一个配体的糖是岩藻糖。
(2) 相关技术的描述
在现有技术中已知的大多数“控释”药物递送系统(例如，Sears的美国专利号4,145,410，它描述了来自酶不稳定的胶囊的药物释放)不能以与人体中存在的分子指示剂(例如，代谢物)的量成正比的间隔和浓度给患者提供药物。在这些现有技术系统中的药物因而不是精确“受控的”，而是简单地以独立于外部或内部因素的缓释形式提供。用注射型胰岛素治疗糖尿病是一个众所周知且经过研究的例子，其中胰岛素的失控的缓释是不希望的。实际上，显而易见，简单的激素置换不足以预防与该疾病有关的病理学结局。认为这些结局的发展反映出不能提供与患者经历的不同血糖浓度成比例的外源性胰岛素。为了解决该问题，已经提出了开发更接近生理学的胰岛素递送系统的几个生物学和生物工程方案(例如，参见：Brownlee等人的美国专利号4,348,387; Taylor等人的美国专利号5,830,506、5,902,603和6,410,053，和Zion等人的美国专利申请公开号2004-0202719)。
这些系统中的每一个依赖于多价葡萄糖结合分子(例如，凝集素Con A)和被该多价葡萄糖结合分子可逆地结合的基于糖的组分的组合。不幸的是，Con A和许多其它的可容易得到的凝集素具有淋巴细胞增殖的潜力。通过结合在特定类型的淋巴细胞的表面上的碳水化合物受体，这些所谓的“促有丝分裂的”凝集素可以潜在地诱导淋巴细胞的有丝分裂，并从而造成它们增殖。包括Con A在内的大多数促有丝分裂的凝集素是选择性的T-细胞有丝分裂原。少数凝集素的选择性更低，刺激T-细胞和B-细胞。局部的或全身的促有丝分裂的凝集素体内暴露，可以导致炎症、细胞毒性、巨噬细胞消化和包括过敏反应在内的变态反应。另外，已知植物凝集素是特别免疫原性的，引起高效价的抗-凝集素特异性的抗体的生成。应当理解，促有丝分裂的凝集素因此不能以它们的天然形式用于体内方法和装置中，除非尽极大注意来防止它们的释放。例如，在美国专利号5,830,506中，Taylor突出了使用ConA所涉及的中毒风险，并强调了在药物递送装置内包含Con A的重要性和困难，所述装置也要求葡萄糖和胰岛素分子自由地扩散进出该装置。
如果能够提供不需要凝集素的替代性的受控的药物递送系统，可以显著减少这些和其它体内凝集素使用所涉及的风险和困难。
发明内容
本发明提供了包含岩藻糖的胰岛素缀合物，当在没有外源性多价糖结合分子（诸如Con A）存在下施用给有此需要的受试者时，所述缀合物表现出对糖（诸如葡萄糖或α-甲基甘露糖）的全身浓度做出响应的药代动力学(PK)和/或药效动力学(PD)特性。一般而言，所述缀合物包含胰岛素或胰岛素类似物分子，所述胰岛素或胰岛素类似物分子共价地连接到至少一个具有两个臂的支链接头(二齿接头)，每个臂独立地连接到包含糖的配体，其中所述接头的至少一个配体是岩藻糖。在特定实施方案中，所述接头是非聚合的。在特定实施方案中，缀合物可以具有1的多分散性指数和小于约20,000 Da的分子量。在特定实施方案中，所述缀合物是长效的(即，表现出比可溶性重组人胰岛素(RHI)更持久的PK特性)。
当在没有外源性糖结合分子存在下施用给有此需要的受试者时，本文中公开的缀合物表现出对血清糖的血清浓度敏感的药效动力学(PD)或药代动力学(PK)特性。在特定方面，所述血清糖是葡萄糖或α-甲基甘露糖。在其它方面，当施用给有此需要的受试者时，所述缀合物在60或70 mg/dL或更低的血清葡萄糖浓度结合内源性糖结合分子。所述缀合物与所述内源性糖结合分子的结合是对所述血清糖的血清浓度敏感的。在另一个方面，所述缀合物能够在大于60、70、80、90或100 mg/dL的血清糖浓度结合胰岛素受体。在60或70 mg/dL的血清糖浓度，所述缀合物与内源性糖结合分子的结合优先于胰岛素受体，并且随着血清糖的血清浓度从60或70 mg/dL增加，所述缀合物与内源性糖结合分子的结合减少且所述缀合物与胰岛素受体的结合增加。
因此，本发明提供了一种包含胰岛素或胰岛素类似物分子的缀合物，所述胰岛素或胰岛素类似物分子共价地连接到至少一个具有第一和第二臂的支链接头，其中所述第一臂连接至包括第一糖或由第一糖组成的第一配体，且所述第二臂连接至包括第二糖或由第二糖组成的第二配体，其中至少一个支链接头的第一糖是岩藻糖。还提供了一种组合物，其包含所述缀合物和药学上可接受的载体以及任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂（incipiants）、防腐剂、锌盐和/或表面活性剂。
在所述缀合物的特定方面，所述第二糖是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺或葡萄糖。在其它方面，所述第二配体包含二糖、三糖、四糖或支链三糖。在另一个方面，所述第二配体包含二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。在特定方面，所述第一糖和所述第二糖都是岩藻糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是支链三甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是三甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是葡萄糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是二甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是三甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是四甘露糖。
在特定方面，所述至少一个支链接头共价地连接至在以下位置处的氨基酸：所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置A1；所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置B1；所述胰岛素或胰岛素分子的位置B29；所述胰岛素类似物分子的位置B28；或所述胰岛素类似物分子的位置B3。
在所述缀合物的另一个方面，所述胰岛素或胰岛素类似物还共价地连接至包含配体的直链或支链接头，所述配体包括糖或由糖组成。在特定方面，所述糖是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺或葡萄糖。在其它方面，所述配体包含二糖、三糖、四糖或支链三糖。在另一个方面，所述配体包含二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在所述缀合物的另一个方面，所述缀合物具有通式(I)：
其中：
(i) 每次出现的表示所述缀合物的分支内的潜在重复；
(ii) 每次出现的独立地是共价键、碳原子、杂原子或任选地被取代的选自酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环的基团；
(iii) 每次出现的T独立地是共价键或二价的、直链的或支链的、饱和的或不饱和的、任选地被取代的C1-30烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基替换；
(iv) 每次出现的R独立地是氢、合适的保护基、或酰基部分、芳基烷基部分、脂族部分、芳基部分、杂芳基部分或杂脂族部分；
(v) -B是-T-LB-X，其中每次出现的X独立地是包含糖的配体，且每次出现的LB独立地是共价键或从T与X的共价缀合衍生出的基团；且，
(vi) n是1、2或3，
前提条件是，所述胰岛素或胰岛素类似物缀合至至少一个接头，其中所述配体X之一包含糖，所述糖是岩藻糖。
在所述缀合物的特定方面，至少一个接头的至少一个糖是岩藻糖且其它糖是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺或葡萄糖。在其它方面，至少一个接头的至少一个糖是岩藻糖且其它糖是二糖、三糖、四糖或支链三糖。在另一个方面，至少一个接头的至少一个糖是岩藻糖且其它糖是二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。还提供了一种组合物，其包含所述缀合物和药学上可接受的载体以及任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂（incipiants）、防腐剂、锌盐和/或表面活性剂。
在所述缀合物的一个特定方面，n是1，且第一次出现的X的糖是岩藻糖，且第二次出现的X的糖是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺或葡萄糖。在其它方面，第一次出现的X的糖是岩藻糖，且第二次出现的X的糖是二糖、三糖、四糖或支链三糖。在另一个方面，第一次出现的X的糖是岩藻糖，且第二次出现的X的糖是二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。还提供了一种组合物，其包含所述缀合物和药学上可接受的载体以及任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂（incipiants）、防腐剂、锌盐和/或表面活性剂。
在所述缀合物的一个特定方面，n是2，且第一次出现的X的糖是岩藻糖，且第二次、第三次和第四次出现的X的糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖或支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。还提供了一种组合物，其包含所述缀合物和药学上可接受的载体以及任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂（incipiants）、防腐剂、锌盐和/或表面活性剂。
在所述缀合物的一个特定方面，n是3，且第一次出现的X的糖是岩藻糖，且第二次、第三次、第四次、第五次和第六次出现的X的糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。还提供了一种组合物，其包含所述缀合物和药学上可接受的载体以及任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂（incipiants）、防腐剂、锌盐和/或表面活性剂。
在所述缀合物的另一个方面，所述缀合物包含通式(II)：
其中：
(i) 每次出现的表示所述缀合物的分支内的潜在重复；
(ii) 每次出现的独立地是共价键、碳原子、杂原子或任选地被取代的选自酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环的基团；
(iii) 每次出现的T独立地是共价键或二价的、直链的或支链的、饱和的或不饱和的、任选地被取代的C1-30烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基替换；
(iv) 每次出现的R独立地是氢、合适的保护基、或酰基部分、芳基烷基部分、脂族部分、芳基部分、杂芳基部分或杂脂族部分；
(v) -B1是-T-LB1-X1，其中X1是包含岩藻糖的配体，其中LB1是共价键或从T与X1的共价缀合衍生出的基团；
(vi) -B2是-T-LB2-X2，其中X2是包含糖的配体，所述糖可以是岩藻糖、甘露糖或葡萄糖；且LB2是共价键或从T与X2的共价缀合衍生出的基团；和，
(vii) n是1、2或3。
在所述缀合物的特定方面，X2是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖或支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。还提供了一种组合物，其包含所述缀合物和药学上可接受的载体以及任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂（incipiants）、防腐剂、锌盐和/或表面活性剂。
在所述缀合物的另一个方面，所述二齿接头具有式
其中每个X独立地是包含糖的配体，前提条件是，缀合至胰岛素或胰岛素类似物的至少一个二齿接头包含配体X，所述配体X包含在所述二齿接头的至少一个臂上的岩藻糖。还提供了一种组合物，其包含具有所述二齿接头的所述缀合物和药学上可接受的载体以及任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂（incipiants）、防腐剂、锌盐和/或表面活性剂。
在所述缀合物的另一个方面, 每个X可以独立地具有式
其中波浪线指示所述键连接至构成二齿接头的原子，前提条件是，缀合至胰岛素或胰岛素类似物的至少一个二齿接头包含在二齿接头的至少一个臂上的EDF。还提供了一种组合物，其包含所述缀合物和药学上可接受的载体以及任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂（incipiants）、防腐剂、锌盐和/或表面活性剂。
在所述缀合物的另一个方面，所述缀合物包含共价地连接到至少两个支链接头的胰岛素或胰岛素类似物分子，每个支链接头具有第一和第二臂，其中所述第一臂连接至包括第一糖的第一配体，且所述第二臂连接至包括第二糖的第二配体，其中所述第一糖是岩藻糖。在所述缀合物的特定方面，所述第二糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺或葡萄糖。在其它方面，所述第二糖独立地是二糖、三糖、四糖或支链三糖。在另一个方面，所述第二糖独立地是二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。在特定方面，所述第一糖和所述第二糖都是岩藻糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是支链三甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是三甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是葡萄糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是二甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是三甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是四甘露糖。
在以上缀合物的另一个方面，所述胰岛素或胰岛素类似物分子的选自A1、B1、B29、B28和B3的两个氨基酸位置共价地连接至所述两个接头。
在所述缀合物的另一个方面，所述缀合物包含共价地连接到至少三个支链接头的胰岛素或胰岛素类似物分子，每个支链接头具有第一和第二臂，其中所述第一臂连接至包括第一糖的第一配体，且所述第二臂连接至包括第二糖的第二配体，其中所述第一糖是岩藻糖。在所述缀合物的特定方面，所述第二糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺或葡萄糖。在其它方面，所述第二糖独立地是二糖、三糖、四糖或支链三糖。在另一个方面，所述第二糖独立地是二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。在特定方面，所述第一糖和所述第二糖都是岩藻糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是支链三甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是三甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是葡萄糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是二甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是三甘露糖。在特定方面，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是四甘露糖。
在以上缀合物的另一个方面，所述胰岛素或胰岛素类似物分子的选自A1、B1、B29、B28和B3的三个氨基酸位置共价地连接至所述三个接头。
在所述缀合物的另一个方面，所述缀合物包含共价地连接到至少两个支链接头的胰岛素或胰岛素类似物分子，每个支链接头具有第一和第二臂，其中所述第一臂连接至包括第一糖的第一配体，且所述第二臂连接至包括第二糖的第二配体，其中所述两个接头之一的第一糖是岩藻糖。
在所述缀合物的特定方面，剩余的第一糖和第二糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺或葡萄糖。在其它方面，剩余的第一糖和第二糖独立地是二糖、三糖、四糖或支链三糖。在另一个方面，剩余的第一糖和第二糖独立地是二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在特定方面，所述两个接头中的每一个的第一糖和第二糖都是岩藻糖。在特定方面，对于所述两个接头中的每一个，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是支链三甘露糖。在特定方面，对于所述两个接头中的每一个，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是三甘露糖。在特定方面，对于所述两个接头中的每一个，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是葡萄糖。在特定方面，对于所述两个接头中的每一个，所述两个接头中的每一个的第一糖是岩藻糖且所述第二糖是甘露糖。在特定方面，对于所述两个接头中的每一个，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是二甘露糖。在特定方面，对于所述两个接头中的每一个，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是三甘露糖。在特定方面，对于所述两个接头中的每一个，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是四甘露糖。
在特定方面，所述两个接头之一的第一糖和第二糖都是岩藻糖，且对于第二接头，所述第一糖和第二糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖或支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。在特定方面，对于所述两个接头之一，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是支链三甘露糖，且对于第二接头，所述第一糖和第二糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖或支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。在特定方面，对于所述两个接头之一，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是三甘露糖，且对于第二接头，所述第一糖和第二糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖或支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。在特定方面，对于所述两个接头之一，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是葡萄糖，且对于第二接头，所述第一糖和第二糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖或支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。在特定方面，对于所述两个接头之一，所述两个接头中的每一个的第一糖是岩藻糖且所述第二糖是甘露糖，且对于第二接头，所述第一糖和第二糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖或支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。在特定方面，对于所述两个接头之一，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是二甘露糖，且对于第二接头，所述第一糖和第二糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖或支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。在特定方面，对于所述两个接头之一，所述第一糖是岩藻糖且所述第二糖是三甘露糖，且对于第二接头，所述第一糖和第二糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖或支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。在特定方面，对于所述两个接头之一，所述第一糖是岩藻糖，且对于第二接头，所述第二糖是四甘露糖且所述第一糖和第二糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖或支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在以上缀合物的另一个方面，所述胰岛素或胰岛素类似物分子的选自A1、B1、B29、B28和B3的两个氨基酸位置共价地连接至所述两个接头。
在所述缀合物的另一个方面，所述缀合物包含共价地连接到至少三个支链接头的胰岛素或胰岛素类似物分子，每个支链接头具有第一和第二臂，其中所述第一臂连接至包括第一糖的第一配体，且所述第二臂连接至包括第二糖的第二配体，其中所述三个接头中的至少一个的第一糖是岩藻糖，且剩余的第一糖和第二糖独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺或葡萄糖。在其它方面，剩余的第一糖和第二糖独立地是二糖、三糖、四糖或支链三糖。在另一个方面，剩余的第一糖和第二糖是二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在以上缀合物的另一个方面，所述胰岛素或胰岛素类似物分子的选自A1、B1、B29、B28和B3的三个氨基酸位置共价地连接至所述三个接头。
还提供了缀合物或包含缀合物的组合物，所述缀合物具有如关于IOC-1、1OC-2、IOC-3、IOC-4、IOC-5、IOC-6、IOC-7、IOC-8、IOC-9、IOC-10、IOC-11、IOC-12、IOC-13、IOC-14、IOC-15、IOC-16、IOC-17、IOC-18、IOC-19、IOC-20、IOC-21、IOC-22、IOC-23、IOC-24、IOC-25、IOC-26、IOC-27、IOC-28、IOC-29、IOC-30、IOC-31、IOC-32、IOC-33、IOC-34、IOC-35、IOC-36、IOC-37、IOC-38、IOC-39、IOC-41、IOC-42、IOC-43、IOC-44、IOC-45、IOC-46、IOC-47、IOC-49、IOC-50、IOC-51、IOC-52、IOC-53、IOC-54、IOC-55、IOC-56、IOC-57、IOC-58、IOC-59、IOC-60、IOC-61、IOC-62、IOC-63、IOC-64、IOC-65、IOC-66、IOC-67、IOC-68、IOC-69、IOC-70、IOC-71、IOC-72、IOC-73、IOC-74、IOC-75、IOC-76、IOC-77、IOC-78、IOC-79、IOC-80、IOC-81、IOC-82、IOC-83、IOC-84、IOC-85、IOC-86、IOC-87、IOC-88、IOC-89、IOC-90、IOC-91、IOC-92、IOC-93、IOC-94、IOC-95、IOC-96、IOC-97、IOC-98、IOC-99或IOC-100所阐述的式。
还提供了缀合物或包含缀合物的组合物，所述缀合物具有如关于IOC-101、1OC-102、IOC-103、IOC-104、IOC-105、IOC-106、IOC-107、IOC-108、IOC-109、IOC-110、IOC-111、IOC-112、IOC-113、IOC-114、IOC-115、IOC-116、IOC-117、IOC-118、IOC-119、IOC-120、IOC-121、IOC-122、IOC-123、IOC-124、IOC-125、IOC-126、IOC-127、IOC-128、IOC-129、IOC-130、IOC-131、IOC-132、IOC-133、IOC-134、IOC-135、IOC-136、IOC-137、IOC-138、IOC-139、IOC-140、IOC-141、IOC-142、IOC-143、IOC-144、IOC-145、IOC-146、IOC-147、IOC-149、IOC-150、IOC-151、IOC-152、IOC-153、IOC-154、IOC-155、IOC-156、IOC-157、IOC-158、IOC-159、IOC-160、IOC-161、IOC-162、IOC-163、IOC-164、IOC-165、IOC-166、IOC-167、IOC-168、IOC-169、IOC-170、IOC-171、IOC-172、IOC-173、IOC-174、IOC-175、IOC-176、IOC-177、IOC-178、IOC-179、IOC-180、IOC-181、IOC-182、IOC-183、IOC-184、IOC-185、IOC-186、IOC-187、IOC-188、IOC-189、IOC-190、IOC-191或IOC-192所阐述的式。
还提供了缀合物或包含缀合物的组合物，所述缀合物具有如关于IOC-193、1OC-194、IOC-195、IOC-196、IOC-197、IOC-198、IOC-199、IOC-200、IOC-201、IOC-202、IOC-203、IOC-204、IOC-205、IOC-206、IOC-207、IOC-208、IOC-210、IOC-211、IOC-212、IOC-213、IOC-214、IOC-215、IOC-216、IOC-217、IOC-218、IOC-219、IOC-220、IOC-221、IOC-222、IOC-223、IOC-224、IOC-225、IOC-226、IOC-227、IOC-228、IOC-229、IOC-230、IOC-231、IOC-232、IOC-233、IOC-234、IOC-235、IOC-236、IOC-237、IOC-238、IOC-239、IOC-240、IOC-241、IOC-242、IOC-243、IOC-244、IOC-245、IOC-246、IOC-247、IOC-248、IOC-249、IOC-250、IOC-251、IOC-252、IOC-253、IOC-254、IOC-255、IOC-256、IOC-257、IOC-258、IOC-259、IOC-260、IOC-261、IOC-262、IOC-263、IOC-264、IOC-265、IOC-266、IOC-267、IOC-268、IOC-269、IOC-270、IOC-271或IOC-272所阐述的式。
以上缀合物还可以提供在药物配方中，所述药物配方包含药学上可接受的载体和任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂、防腐剂和/或表面活性剂。在其它方面，所述缀合物还可以包括锌和/或鱼精蛋白。所述缀合物可以提供为结晶形式。
因而，本发明还提供了一种组合物，其包含本文中一般地或特别地公开的一种或多种缀合物和药学上可接受的载体以及任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂（incipiants）、防腐剂、锌盐和/或表面活性剂。还提供了一种组合物，其包含呈结晶形式的本文中一般地或特别地公开的一种或多种缀合物和药学上可接受的载体以及任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂（incipiants）、防腐剂、锌盐、鱼精蛋白和/或表面活性剂。
在所述缀合物的其它方面，所述胰岛素分子是哺乳动物胰岛素，其在特定实施方案中可以是人胰岛素、牛胰岛素、狗胰岛素、猫胰岛素、山羊胰岛素、马胰岛素、猪胰岛素或其类似物。在特定实施方案中，所述胰岛素类似物是赖脯胰岛素或谷赖胰岛素。在其它实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物经过修饰以包含共价地连接至胰岛素或胰岛素类似物的氨基酸的聚乙二醇或脂肪酸。在特定实施方案中，所述胰岛素类似物是赖脯胰岛素、甘精胰岛素、门冬胰岛素、地特胰岛素或谷赖胰岛素。
本发明还提供了治疗糖尿病的方法，所述方法包括给糖尿病受试者施用本文中公开的缀合物或包含本文中公开的缀合物的药物制剂。本发明还提供了本文中公开的缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗糖尿病。
本发明还提供了一种组合物或药物组合物，其包含胰岛素或胰岛素类似物分子和药学上可接受的载体，所述胰岛素或胰岛素类似物分子共价地连接到至少一个具有第一臂和第二臂的支链接头以提供缀合物，其中所述第一臂连接至包括第一糖的第一配体，且所述第二臂连接至包括第二糖的第二配体，且其中所述第一糖是岩藻糖。
一般而言，所述第二糖是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在特定方面，所述支链接头共价地连接至在以下位置处的氨基酸：所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置A1；所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置B1；所述胰岛素或胰岛素分子的位置B29；所述胰岛素类似物分子的位置B28；或所述胰岛素类似物分子的位置B3。
在另一个实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物共价地连接到具有第一臂和第二臂的第二支链接头，其中所述第一臂连接至包括第三糖的第三配体，且所述第二臂连接至包括第四糖的第四配体。在特定方面，所述第二支链接头共价地连接至在以下位置处的氨基酸：所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置A1；所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置B1；所述胰岛素或胰岛素分子的位置B29；所述胰岛素类似物分子的位置B28；或所述胰岛素类似物分子的位置B3，且其没有被第一支链接头占据。
在另一个实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物共价地连接到具有第一臂和第二臂的第三支链接头，其中所述第一臂连接至包括第五糖的第五配体，且所述第二臂连接至包括第六糖的第六配体。在特定方面，所述第三支链接头共价地连接至在以下位置处的氨基酸：所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置A1；所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置B1；所述胰岛素或胰岛素分子的位置B29；所述胰岛素类似物分子的位置B28；或所述胰岛素类似物分子的位置B3，且其没有被第一支链接头和第二支链接头占据。
在以上缀合物的任何实施方案中，所述第三糖、第四糖、第五糖和第六糖各自独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在另一个方面，所述胰岛素或胰岛素类似物分子还共价地连接至包含配体的直链接头，所述配体包括糖，且所述糖可以是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在特定方面，所述胰岛素类似物分子是赖脯胰岛素、甘精胰岛素、门冬胰岛素、地特胰岛素或谷赖胰岛素。
在以上方面或实施方案中的任一个中，当在没有外源性糖结合分子存在下施用给有此需要的受试者时，所述缀合物表现出对血清糖的血清浓度敏感的药效动力学(PD)或药代动力学(PK)特性。在特定方面，所述血清糖是葡萄糖或α-甲基甘露糖。在特定方面，当施用给有此需要的受试者时，所述缀合物在60 mg/dL或更低的血清葡萄糖浓度结合内源性糖结合分子。所述内源性糖结合分子可以是人甘露糖受体1。
在所述组合物的特定方面，所述缀合物具有通式(I)：
其中：
(i) 每次出现的表示所述缀合物的分支内的潜在重复；
(ii) 每次出现的独立地是共价键、碳原子、杂原子或任选地被取代的选自酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环的基团；
(iii) 每次出现的T独立地是共价键或二价的、直链的或支链的、饱和的或不饱和的、任选地被取代的C1-30烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基替换；
(iv) 每次出现的R独立地是氢、合适的保护基、或酰基部分、芳基烷基部分、脂族部分、芳基部分、杂芳基部分或杂脂族部分；
(v) -B是-T-LB-X，其中每次出现的X独立地是包含糖的配体，且每次出现的LB独立地是共价键或从T与X的共价缀合衍生出的基团；且，
(vi) n是1、2或3，
前提条件是，至少一个X是岩藻糖。
在所述组合物的特定方面，所述缀合物包含通式(II)：
其中：
(i) 每次出现的表示所述缀合物的分支内的潜在重复；
(ii) 每次出现的独立地是共价键、碳原子、杂原子或任选地被取代的选自酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环的基团；
(iii) 每次出现的T独立地是共价键或二价的、直链的或支链的、饱和的或不饱和的、任选地被取代的C1-30烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基替换；
(iv) 每次出现的R独立地是氢、合适的保护基、或酰基部分、芳基烷基部分、脂族部分、芳基部分、杂芳基部分或杂脂族部分；
(v) -B1是-T-LB1-岩藻糖，其中LB1是共价键或从T与X的共价缀合衍生出的基团；
(vi) -B2是-T-LB2-X，其中X是包含糖的配体，所述糖可以是岩藻糖、甘露糖或葡萄糖；且LB2是共价键或从T与X的共价缀合衍生出的基团；且，
(vii) n是1、2或3。
在所述组合物的特定方面，所述二齿接头具有如上所示的式A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z、AA、AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、AI、AJ或AK，其中每个X独立地是包含糖的配体，前提条件是，缀合至胰岛素或胰岛素类似物的至少一个二齿接头包含在所述二齿接头的至少一个臂上的岩藻糖。在特定方面，每个X可以独立地具有如上所示的式EG、EM、EBM、EGA、EF、EFβ、EBM、ETM、EDG、EDF或EDM。
还提供了一种组合物，其包含具有如关于IOC-1、1OC-2、IOC-3、IOC-4、IOC-5、IOC-6、IOC-7、IOC-8、IOC-9、IOC-10、IOC-11、IOC-12、IOC-13、IOC-14、IOC-15、IOC-16、IOC-17、IOC-18、IOC-19、IOC-20、IOC-21、IOC-22、IOC-23、IOC-24、IOC-25、IOC-26、IOC-27、IOC-28、IOC-29、IOC-30、IOC-31、IOC-32、IOC-33、IOC-34、IOC-35、IOC-36、IOC-37、IOC-38、IOC-39、IOC-41、IOC-42、IOC-43、IOC-44、IOC-45、IOC-46、IOC-47、IOC-49、IOC-50、IOC-51、IOC-52、IOC-53、IOC-54、IOC-55、IOC-56、IOC-57、IOC-58、IOC-59、IOC-60、IOC-61、IOC-62、IOC-63、IOC-64、IOC-65、IOC-66、IOC-67、IOC-68、IOC-69、IOC-70、IOC-71、IOC-72、IOC-73、IOC-74、IOC-75、IOC-76、IOC-77、IOC-78、IOC-79、IOC-80、IOC-81、IOC-82、IOC-83、IOC-84、IOC-85、IOC-86、IOC-87、IOC-88、IOC-89、IOC-90、IOC-91、IOC-92、IOC-93、IOC-94、IOC-95、IOC-96、IOC-97、IOC-98、IOC-99或IOC-100所阐述的式的缀合物和药学上可接受的载体；一种组合物，其包含具有如关于IOC-101、1OC-102、IOC-103、IOC-104、IOC-105、IOC-106、IOC-107、IOC-108、IOC-109、IOC-110、IOC-111、IOC-112、IOC-113、IOC-114、IOC-115、IOC-116、IOC-117、IOC-118、IOC-119、IOC-120、IOC-121、IOC-122、IOC-123、IOC-124、IOC-125、IOC-126、IOC-127、IOC-128、IOC-129、IOC-130、IOC-131、IOC-132、IOC-133、IOC-134、IOC-135、IOC-136、IOC-137、IOC-138、IOC-139、IOC-140、IOC-141、IOC-142、IOC-143、IOC-144、IOC-145、IOC-146、IOC-147、IOC-149、IOC-150、IOC-151、IOC-152、IOC-153、IOC-154、IOC-155、IOC-156、IOC-157、IOC-158、IOC-159、IOC-160、IOC-161、IOC-162、IOC-163、IOC-164、IOC-165、IOC-166、IOC-167、IOC-168、IOC-169、IOC-170、IOC-171、IOC-172、IOC-173、IOC-174、IOC-175、IOC-176、IOC-177、IOC-178、IOC-179、IOC-180、IOC-181、IOC-182、IOC-183、IOC-184、IOC-185、IOC-186、IOC-187、IOC-188、IOC-189、IOC-190、IOC-191或IOC-192所阐述的式的缀合物和药学上可接受的载体；和一种组合物，其包含具有如关于IOC-193、1OC-194、IOC-195、IOC-196、IOC-197、IOC-198、IOC-199、IOC-200、IOC-201、IOC-202、IOC-203、IOC-204、IOC-205、IOC-206、IOC-207、IOC-208、IOC-210、IOC-211、IOC-212、IOC-213、IOC-214、IOC-215、IOC-216、IOC-217、IOC-218、IOC-219、IOC-220、IOC-221、IOC-222、IOC-223、IOC-224、IOC-225、IOC-226、IOC-227、IOC-228、IOC-229、IOC-230、IOC-231、IOC-232、IOC-233、IOC-234、IOC-235、IOC-236、IOC-237、IOC-238、IOC-239、IOC-240、IOC-241、IOC-242、IOC-243、IOC-244、IOC-245、IOC-246、IOC-247、IOC-248、IOC-249、IOC-250、IOC-251、IOC-252、IOC-253、IOC-254、IOC-255、IOC-256、IOC-257、IOC-258、IOC-259、IOC-260、IOC-261、IOC-262、IOC-263、IOC-264、IOC-265、IOC-266、IOC-267、IOC-268、IOC-269、IOC-270、IOC-271或IOC-272所阐述的式的缀合物和药学上可接受的载体。
本发明还提供了本文中公开的组合物用于治疗糖尿病的用途。在特定方面，所述糖尿病是I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病。
本发明还提供了一种用于治疗糖尿病受试者的方法，所述方法包括: 给所述受试者施用治疗糖尿病的量的组合物以治疗糖尿病，其中所述组合物包含胰岛素或胰岛素类似物分子和药学上可接受的载体，所述胰岛素或胰岛素类似物分子共价地连接到至少一个具有第一臂和第二臂的支链接头以提供缀合物，其中所述第一臂连接至包括第一糖的第一配体，且所述第二臂连接至包括第二糖的第二配体，且其中所述第一糖是岩藻糖；其中所述施用会治疗糖尿病。在特定方面，施用的组合物的量是有效量或治疗有效量。
一般而言，所述第二糖是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在特定方面，所述支链接头共价地连接至在以下位置处的氨基酸：所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置A1；所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置B1；所述胰岛素或胰岛素分子的位置B29；所述胰岛素类似物分子的位置B28；或所述胰岛素类似物分子的位置B3。
在另一个实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物共价地连接到具有第一臂和第二臂的第二支链接头，其中所述第一臂连接至包括第三糖的第三配体，且所述第二臂连接至包括第四糖的第四配体。在特定方面，所述第二支链接头共价地连接至在以下位置处的氨基酸：所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置A1；所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置B1；所述胰岛素或胰岛素分子的位置B29；所述胰岛素类似物分子的位置B28；或所述胰岛素类似物分子的位置B3，且其没有被第一支链接头占据。
在另一个实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物共价地连接到具有第一臂和第二臂的第三支链接头，其中所述第一臂连接至包括第五糖的第五配体，且所述第二臂连接至包括第六糖的第六配体。在特定方面，所述第三支链接头共价地连接至在以下位置处的氨基酸：所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置A1；所述胰岛素或胰岛素类似物分子的位置B1；所述胰岛素或胰岛素分子的位置B29；所述胰岛素类似物分子的位置B28；或所述胰岛素类似物分子的位置B3，且其没有被第一支链接头和第二支链接头占据。
在以上缀合物的任何实施方案中，所述第三糖、第四糖、第五糖和第六糖各自独立地是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在另一个方面，所述胰岛素或胰岛素类似物分子还共价地连接至包含配体的直链接头，所述配体包括糖，且所述糖可以是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在特定方面，所述胰岛素类似物分子是赖脯胰岛素、甘精胰岛素、门冬胰岛素、地特胰岛素或谷赖胰岛素。
在以上方面或实施方案中的任一个中，当在没有外源性糖结合分子存在下施用给有此需要的受试者时，所述缀合物表现出对血清糖的血清浓度敏感的药效动力学(PD)或药代动力学(PK)特性。在特定方面，所述血清糖是葡萄糖或α-甲基甘露糖。在特定方面，当施用给有此需要的受试者时，所述缀合物在60 mg/dL或更低的血清葡萄糖浓度结合内源性糖结合分子。所述内源性糖结合分子可以是人甘露糖受体1。
在所述组合物的特定方面，所述缀合物具有通式(I)：
其中：
(i) 每次出现的表示所述缀合物的分支内的潜在重复；
(ii) 每次出现的独立地是共价键、碳原子、杂原子或任选地被取代的选自酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环的基团；
(iii) 每次出现的T独立地是共价键或二价的、直链的或支链的、饱和的或不饱和的、任选地被取代的C1-30烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基替换；
(iv) 每次出现的R独立地是氢、合适的保护基、或酰基部分、芳基烷基部分、脂族部分、芳基部分、杂芳基部分或杂脂族部分；
(v) -B是-T-LB-X，其中每次出现的X独立地是包含糖的配体，且每次出现的LB独立地是共价键或从T与X的共价缀合衍生出的基团；且，
(vi) n是1、2或3，
前提条件是，至少一个X是岩藻糖。
在所述组合物的特定方面，所述缀合物包含通式(II)：
其中：
(i) 每次出现的表示所述缀合物的分支内的潜在重复；
(ii) 每次出现的独立地是共价键、碳原子、杂原子或任选地被取代的选自酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环的基团；
(iii) 每次出现的T独立地是共价键或二价的、直链的或支链的、饱和的或不饱和的、任选地被取代的C1-30烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基替换；
(iv) 每次出现的R独立地是氢、合适的保护基、或酰基部分、芳基烷基部分、脂族部分、芳基部分、杂芳基部分或杂脂族部分；
(v) -B1是-T-LB1-岩藻糖，其中LB1是共价键或从T与X的共价缀合衍生出的基团；
(vi) -B2是-T-LB2-X，其中X是包含糖的配体，所述糖可以是岩藻糖、甘露糖或葡萄糖；且LB2是共价键或从T与X的共价缀合衍生出的基团；且，
(vii) n是1、2或3。
在所述组合物的特定方面，所述二齿接头具有如上所示的式A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z、AA、AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、AI、AJ或AK，其中每个X独立地是包含糖的配体，前提条件是，缀合至胰岛素或胰岛素类似物的至少一个二齿接头包含在所述二齿接头的至少一个臂上的岩藻糖。在特定方面，每个X可以独立地具有如上所示的式EG、EM、EBM、EGA、EF、EFβ、EBM、ETM、EDG、EDF或EDM。
本发明还提供了一种用于治疗糖尿病受试者的方法，所述方法包括：给所述受试者施用组合物以治疗所述受试者中的糖尿病，所述组合物包含具有如关于IOC-1、1OC-2、IOC-3、IOC-4、IOC-5、IOC-6、IOC-7、IOC-8、IOC-9、IOC-10、IOC-11、IOC-12、IOC-13、IOC-14、IOC-15、IOC-16、IOC-17、IOC-18、IOC-19、IOC-20、IOC-21、IOC-22、IOC-23、IOC-24、IOC-25、IOC-26、IOC-27、IOC-28、IOC-29、IOC-30、IOC-31、IOC-32、IOC-33、IOC-34、IOC-35、IOC-36、IOC-37、IOC-38、IOC-39、IOC-41、IOC-42、IOC-43、IOC-44、IOC-45、IOC-46、IOC-47、IOC-49、IOC-50、IOC-51、IOC-52、IOC-53、IOC-54、IOC-55、IOC-56、IOC-57、IOC-58、IOC-59、IOC-60、IOC-61、IOC-62、IOC-63、IOC-64、IOC-65、IOC-66、IOC-67、IOC-68、IOC-69、IOC-70、IOC-71、IOC-72、IOC-73、IOC-74、IOC-75、IOC-76、IOC-77、IOC-78、IOC-79、IOC-80、IOC-81、IOC-82、IOC-83、IOC-84、IOC-85、IOC-86、IOC-87、IOC-88、IOC-89、IOC-90、IOC-91、IOC-92、IOC-93、IOC-94、IOC-95、IOC-96、IOC-97、IOC-98、IOC-99或IOC-100所阐述的式的缀合物和药学上可接受的载体；一种用于治疗糖尿病受试者的方法，所述方法包括：给所述受试者施用组合物以治疗所述受试者中的糖尿病，所述组合物包含具有如关于IOC-101、1OC-102、IOC-103、IOC-104、IOC-105、IOC-106、IOC-107、IOC-108、IOC-109、IOC-110、IOC-111、IOC-112、IOC-113、IOC-114、IOC-115、IOC-116、IOC-117、IOC-118、IOC-119、IOC-120、IOC-121、IOC-122、IOC-123、IOC-124、IOC-125、IOC-126、IOC-127、IOC-128、IOC-129、IOC-130、IOC-131、IOC-132、IOC-133、IOC-134、IOC-135、IOC-136、IOC-137、IOC-138、IOC-139、IOC-140、IOC-141、IOC-142、IOC-143、IOC-144、IOC-145、IOC-146、IOC-147、IOC-149、IOC-150、IOC-151、IOC-152、IOC-153、IOC-154、IOC-155、IOC-156、IOC-157、IOC-158、IOC-159、IOC-160、IOC-161、IOC-162、IOC-163、IOC-164、IOC-165、IOC-166、IOC-167、IOC-168、IOC-169、IOC-170、IOC-171、IOC-172、IOC-173、IOC-174、IOC-175、IOC-176、IOC-177、IOC-178、IOC-179、IOC-180、IOC-181、IOC-182、IOC-183、IOC-184、IOC-185、IOC-186、IOC-187、IOC-188、IOC-189、IOC-190、IOC-191或IOC-192所阐述的式的缀合物和药学上可接受的载体；和一种用于治疗糖尿病受试者的方法，所述方法包括：给所述受试者施用组合物以治疗所述受试者中的糖尿病，所述组合物包含具有如关于IOC-193、1OC-194、IOC-195、IOC-196、IOC-197、IOC-198、IOC-199、IOC-200、IOC-201、IOC-202、IOC-203、IOC-204、IOC-205、IOC-206、IOC-207、IOC-208、IOC-210、IOC-211、IOC-212、IOC-213、IOC-214、IOC-215、IOC-216、IOC-217、IOC-218、IOC-219、IOC-220、IOC-221、IOC-222、IOC-223、IOC-224、IOC-225、IOC-226、IOC-227、IOC-228、IOC-229、IOC-230、IOC-231、IOC-232、IOC-233、IOC-234、IOC-235、IOC-236、IOC-237、IOC-238、IOC-239、IOC-240、IOC-241、IOC-242、IOC-243、IOC-244、IOC-245、IOC-246、IOC-247、IOC-248、IOC-249、IOC-250、IOC-251、IOC-252、IOC-253、IOC-254、IOC-255、IOC-256、IOC-257、IOC-258、IOC-259、IOC-260、IOC-261、IOC-262、IOC-263、IOC-264、IOC-265、IOC-266、IOC-267、IOC-268、IOC-269、IOC-270、IOC-271或IOC-272所阐述的式的缀合物和药学上可接受的载体。
在所述方法的前述方面或实施方案中的任一个中，所述糖尿病是I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病。
本发明还提供了一种组合物，其包含胰岛素和胰岛素类似物缀合物和药学上可接受的载体，其中所述缀合物包含至少一个岩藻糖分子且所述缀合物被表征为在巨噬细胞甘露糖受体处具有约0.5:1至约1:100、约1:1至约1:50、约1:1至约1:20、或约1:1至约1:10的通过功能性胰岛素受体磷酸化测定确定的EC50或IP与通过竞争性结合测定确定的IC50或IP之比。
在特定方面，其中所述缀合物包含胰岛素或胰岛素类似物分子，所述胰岛素或胰岛素类似物分子共价地连接到至少一个具有第一臂和第二臂的支链接头，其中所述第一臂连接至包括第一糖的第一配体，且所述第二臂连接至包括第二糖的第二配体，且其中所述第一糖是岩藻糖。在其它方面，所述第二糖是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在特定实施方案中，所述缀合物可以是本文中公开的缀合物。
本发明还提供了一种用于治疗糖尿病受试者的方法，所述方法包括：给所述受试者施用组合物以治疗糖尿病，所述组合物包含缀合物和药学上可接受的载体，所述缀合物包含岩藻糖且被表征为在巨噬细胞甘露糖受体处具有约0.5:1至约1:100、约1:1至约1:50、约1:1至约1:20、或约1:1至约1:10的通过功能性胰岛素受体磷酸化测定确定的EC50或IP与通过竞争性结合测定确定的IC50或IP之比。
在特定实施方案中，所述缀合物包含胰岛素或胰岛素类似物分子，所述胰岛素或胰岛素类似物分子共价地连接到至少一个具有第一臂和第二臂的支链接头，其中所述第一臂连接至包括第一糖的第一配体，且所述第二臂连接至包括第二糖的第二配体，且其中所述第一糖是岩藻糖。在其它方面，所述第二糖是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在特定实施方案中，所述缀合物可以是本文中公开的缀合物。
在特定方面，所述糖尿病是I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病。
定义
下面更详细地描述了在本说明书中使用的具体官能团、化学术语和一般术语的定义。为了本发明的目的，根据元素周期表（CAS版, Handbook of Chemistry and Physics,第75版, 内封面），鉴别化学元素，并如其中所述，一般地定义具体官能团。另外，有机化学的一般原理、以及具体官能部分和反应性，描述在：Organic Chemistry, Thomas Sorrell,University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March March’s AdvancedOrganic Chemistry, 第5版, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock,Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989;Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 第3版, CambridgeUniversity Press, Cambridge, 1987。
酰基- 本文使用的术语“酰基”表示具有下述通式的基团：-C(=O)RX1、-C(=O)ORX1、-C(=O)-O-C(=O)RX1、-C(=O)SRX1、-C(=O)N(RX1)2、-C(=S)RX1、-C(=S)N(RX1)2和-C(=S)S(RX1)、-C(=NRX1)RX1、-C(=NRX1)ORX1、-C(=NRX1)SRX1和-C(=NRX1)N(RX1)2，其中RX1是氢；卤素；取代的或未取代的羟基；取代的或未取代的硫醇；取代的或未取代的氨基；取代的或未取代的酰基；环状的或无环的、取代的或未取代的、分支的或未分支的脂族；环状的或无环的、取代的或未取代的、分支的或未分支的杂脂族；环状的或无环的、取代的或未取代的、分支的或未分支的烷基；环状的或无环的、取代的或未取代的、分支的或未分支的烯基；取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂族硫代氧基、杂脂族硫代氧基、烷基硫代氧基、杂烷基硫代氧基、芳基硫代氧基、杂芳基硫代氧基、单-或二-脂族氨基、单-或二-杂脂族氨基、单-或二-烷基氨基、单-或二-杂烷基氨基、单-或二-芳基氨基或单-或二-杂芳基氨基；或2个RX1基团一起形成5-6元杂环。示例性的酰基包括醛(-CHO)、羧酸(-CO2H)、酮、酰基卤、酯、酰胺、亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯和脲。酰基取代基包括、但不限于：本文所述的任意取代基，其导致形成稳定部分(例如，脂族、烷基、烯基、炔基、杂脂族、杂环、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫代氧代、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、硫醇、卤素、脂族氨基、杂脂族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷基芳基、芳基烷基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、脂族硫代氧基、杂脂族硫代氧基、烷基硫代氧基、杂烷基硫代氧基、芳基硫代氧基、杂芳基硫代氧基、酰氧基等，它们各自可以进一步被取代或未取代)。
脂族的- 本文使用的术语“脂族的”或“脂族基团”表示任选地取代的烃部分，其可以是直链的(即，未分支的)、分支的或环状的(“碳环的”)，且可以是完全饱和的，或可以含有一个或多个不饱和单元，但是它不是芳族的。除非另外指出，脂族基团含有1-12个碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1-6个碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1-4个碳原子，在其它实施方案中，脂族基团含有1-3个碳原子。合适的脂族基团包括、但不限于：直链的或分支的、烷基、烯基和炔基、及其杂合物，诸如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
烯基- 本文使用的术语“烯基”表示通过除去单个氢原子从具有至少一个碳-碳双键的直链或支链脂族部分衍生出的任选地取代的单价基团。在特定实施方案中，在本发明中采用的烯基含有2-6个碳原子。在特定实施方案中，在本发明中采用的烯基含有2-5个碳原子。在一些实施方案中，在本发明中采用的烯基含有2-4个碳原子。在另一个实施方案中，采用的烯基含有2-3个碳原子。烯基包括，例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。
烷基- 本文使用的术语“烷基”表示通过除去单个氢原子从含有1-6个碳原子的脂族部分衍生出的任选地取代的饱和的、直链或支链烃基团。在一些实施方案中，在本发明中采用的烷基含有1-5个碳原子。在另一个实施方案中，采用的烷基含有1-4个碳原子。在其它实施方案中，所述烷基含有1-3个碳原子。在另一个实施方案中，所述烷基含有1-2个碳。烷基的例子包括、但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一基、月桂基等。
炔基- 本文使用的术语“炔基”表示通过除去单个氢原子从具有至少一个碳-碳三键的直链或支链脂族部分衍生出的任选地取代的单价基团。在特定实施方案中，在本发明中采用的炔基含有2-6个碳原子。在特定实施方案中，在本发明中采用的炔基含有2-5个碳原子。在一些实施方案中，在本发明中采用的炔基含有2-4个碳原子。在另一个实施方案中，采用的炔基含有2-3个碳原子。代表性的炔基包括、但不限于：乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等。
芳基- 如本文使用的，单独地或作为更大部分的一部分（如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”中）使用的术语“芳基”表示具有共5-10个环成员的任选地取代的单环的和双环的环系统，其中该系统中的至少一个环是芳族的，且其中该系统中的每个环含有3-7个环成员。术语“芳基”可以与术语“芳基环”互换使用。在本发明的特定实施方案中，“芳基”表示芳族环系统，其包括但不限于、苯基、联苯基、萘基、蒽基等，其可以携带一个或多个取代基。
芳基烷基- 本文使用的术语“芳基烷基”表示被芳基(例如，芳族或杂芳族基团)取代的烷基。
二齿- 从共价地连接在一起的两个或更多个分子形成的作为单个单元分子的分子。
二价烃链- 本文使用的术语“二价烃链”(也称作“二价亚烷基”)是聚亚甲基，即-(CH2)z-，其中z是1-30、1-20、1-12、1-8、1-6、1-4、1-3、1-2、2-30、2-20、2-10、2-8、2-6、2-4或2-3的正整数。取代的二价烃链是这样的聚亚甲基，其中一个或多个亚甲基氢原子被取代基替换。合适的取代基包括下面关于取代的脂族基团所述的那些。
羰基- 本文使用的术语“羰基”表示含有碳-氧双键的单价或二价的部分。羰基的非限制性例子包括醛、酮、羧酸、酯、酰胺、烯酮、酰基卤、酸酐、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、硫酯、内酯、内酰胺、氧肟酸酯、异氰酸酯和氯甲酸酯。
环脂族的- 如本文使用的，单独地或作为更大部分的一部分使用的术语“环脂族的”、“碳环”或“碳环的”表示任选地取代的饱和的或部分不饱和的本文所述的具有3-10个成员的环状脂族单环的或双环的环系统。环脂族基团包括、但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基、环辛基、环辛烯基和环辛二烯基。在一些实施方案中，所述环烷基具有3-6个碳。
岩藻糖- 表示D或L形式的岩藻糖，且可以表示氧或碳连接的糖苷。
卤素- 本文使用的术语“卤代”和“卤素”表示选自氟(氟代、-F)、氯(氯代、-Cl)、溴(溴代、-Br)和碘(碘代、-I)的原子。
杂脂族的- 本文使用的术语“杂脂族的”或“杂脂族基团”表示，除了碳原子以外，具有1-5个杂原子的任选地取代的烃部分，其可以是直链的(即，未分支的)、分支的或环状的(“杂环的”)，且可以是完全饱和的，或可以含有一个或多个不饱和单元，但是它不是芳族的。除非另外指出, 杂脂族基团含有1-6个碳原子，其中1-3个碳原子任选地且独立地被选自氧、氮和硫的杂原子替换。在一些实施方案中，杂脂族基团含有1-4个碳原子，其中1-2个碳原子任选地且独立地被选自氧、氮和硫的杂原子替换。在其它实施方案中，杂脂族基团含有1-3个碳原子，其中1个碳原子任选地且独立地被选自氧、氮和硫的杂原子替换。合适的杂脂族基团包括、但不限于：直链的或分支的、杂烷基、杂烯基和杂炔基。
杂芳烷基- 本文使用的术语“杂芳烷基”表示被杂芳基取代的烷基，其中所述烷基和杂芳基部分独立地任选地被取代。
杂芳基- 如本文使用的，单独地或作为更大部分（例如，“杂芳烷基”或“杂芳烷氧基”）的一部分使用的术语“杂芳基”表示这样的任选地取代的基团，其具有5-10个环原子、优选5、6或9个环原子；具有6、10或14个在环状阵列中共享的π电子；且除了碳原子以外，具有1-5个杂原子。杂芳基包括、但不限于，噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。本文使用的术语“杂芳基”和“杂芳-”也包括这样的基团，其中杂芳族环与一个或多个芳基、碳环或杂环稠合，其中连接的基团或点是在杂芳族环上。非限制性例子包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基和四氢异喹啉基。杂芳基可以是单环的或双环的。术语“杂芳基”可以与术语“杂芳基环”、“杂芳基”或“杂芳族的”互换使用，这些术语中的任一个包括任选地被取代的环。
杂原子- 本文使用的术语“杂原子”表示氮、氧或硫，且包括氮或硫的任意氧化形式和碱性氮的任意季铵化形式。术语“氮”也包括取代的氮。
杂环- 本文使用的术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基团”和“杂环”互换地使用，表示稳定的、任选地取代的5-7元单环的或7-10元双环的杂环部分，它是饱和的或部分不饱和的，且除了碳原子以外，具有一个或多个上面定义的杂原子。杂环可以在产生稳定结构的任意杂原子或碳原子处连接到它的侧基上，且任一个环原子可以任选地被取代。这样的饱和的或部分不饱和的杂环基团的例子包括、但不限于，四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮杂䓬基、氧杂氮杂䓬基、硫杂氮杂䓬基、吗啉基和奎宁环基。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基”、“杂环部分”和“杂环基团”在本文中互换地使用，且也包括这样的基团，其中杂环基环与一个或多个芳基、杂芳基或碳环（诸如二氢吲哚基、3H-吲哚基、色满基、菲啶基或四氢喹啉基）稠合，其中连接基团或点是在杂环基环上。杂环基可以是单环的或双环的。术语“杂环基烷基”表示被杂环基取代的烷基，其中所述烷基和杂环基部分独立地任选地被取代。
不饱和的- 本文使用的术语“不饱和的”是指具有一个或多个双键或三键的部分。
部分不饱和的- 本文使用的术语“部分不饱和的”表示包含至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和的”意在包括具有多个不饱和位点的环，但是无意包括本文定义的芳基或杂芳基部分。
任选地取代的- 如本文所述，本发明的化合物可以含有“任选地取代的”部分。一般而言，无论在前面有还是没有术语“任选地”，术语“取代”是指指定的部分的一个或多个氢被合适的取代基替换。除非另有说明，“任选地取代的”基团可以具有在该基团的每个可取代的位置处的合适的取代基，且当任意给定结构中的超过一个位置可以被超过一个选自特定集合的取代基取代时，在每个位置的取代基可以是相同的或不同的。本发明预见到的取代基的组合优选地是导致形成稳定的或化学上可行的化合物的那些。本文使用的术语“稳定的”表示，当处于特定条件下时基本上不改变的化合物，所述条件允许它们的生产、检测，以及在特定实施方案中，允许它们的回收、纯化和用于一个或多个本文公开的目的。
在“任选地取代的”基团的可取代的碳原子上的合适的单价取代基独立地是卤素；-(CH2)0-4R°；-(CH2)0-4OR°；-O-(CH2)0-4C(O)OR°；-(CH2)0-4CH(OR°)2；-(CH2)0-4SR°；-(CH2)0-4Ph，其可以被R°取代；-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph，其可以被R°取代；-CH=CHPh，其可以被R°取代；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(R°)2；-(CH2)0-4N(R°)C(O)R°；-N(R°)C(S)R°；-(CH2)0-4N(R°)C(O)NR°2；-N(R°)C(S)NR°2；-(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°；-N(R°)N(R°)C(O)R°；-N(R°)N(R°)C(O)NR°2；-N(R°)N(R°)C(O)OR°；-(CH2)0-4C(O)R°；-C(S)R°；-(CH2)0-4C(O)OR°；-(CH2)0-4C(O)SR°；-(CH2)0-4C(O)OSiR°3；-(CH2)0-4OC(O)R°；-OC(O)(CH2)0-4SR-，SC(S)SR°；-(CH2)0-4SC(O)R°；-(CH2)0-4C(O)NR°2；-C(S)NR°2；-C(S)SR°；-SC(S)SR°，-(CH2)0-4OC(O)NR°2；-C(O)N(OR°)R°；-C(O)C(O)R°；-C(O)CH2C(O)R°；-C(NOR°)R°；-(CH2)0-4SSR°；-(CH2)0-4S(O)2R°；-(CH2)0-4S(O)2OR°；-(CH2)0-4OS(O)2R°；-S(O)2NR°2；-(CH2)0-4S(O)R°；-N(R°)S(O)2NR°2；-N(R°)S(O)2R°；-N(OR°)R°；-C(NH)NR°2；-P(O)2R°；-P(O)R°2；-OP(O)R°2；-OP(O)(OR°)2；SiR°3；-(C1-4直链或支链亚烷基)O-N(R°)2；或-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)O-N(R°)2，其中每个R°可以如下所定义地被取代，且独立地是氢、C1-6脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环，或者，尽管有上面的定义，2个独立地出现的R°与它们的插入原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-12元饱和的、部分不饱和的、或芳基单环或双环的环，其可以如下所定义地被取代。
在R°(或2个独立地出现的R°与它们的插入原子一起形成的环)上的合适的单价取代基独立地是卤素、-(CH2)0-2R●、-(卤代R●)、-(CH2)0-2OH、-(CH2)0-2OR●、-(CH2)0-2CH(OR●)2；-O(卤代R●)、-CN、-N3、-(CH2)0-2C(O)R●、-(CH2)0-2C(O)OH、-(CH2)0-2C(O)OR●、-(CH2)0-2SR●、-(CH2)0-2SH、-(CH2)0-2NH2、-(CH2)0-2NHR●、-(CH2)0-2NR● 2、-NO2、-SiR● 3、-OSiR● 3、-C(O)SR●、-(C1-4直链或支链亚烷基)C(O)OR●或-SSR●，其中每个R●是未取代的，或当前面具有“卤代”时，仅被一个或多个卤素取代，且独立地选自C1-4脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。在R°的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括=O和=S。
在“任选地取代的”基团的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括下述的：=O、=S、=NNR* 2、=NNHC(O)R*、=NNHC(O)OR*、=NNHS(O)2R*、=NR*、=NOR*、-O(C(R* 2))2-3O-或-S(C(R* 2))2- 3S-，其中每个独立出现的R*选自：氢、可以如下所定义地被取代的C1-6脂族、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。结合到“任选地取代的”基团的邻位可取代碳上的合适的二价取代基包括：-O(CR* 2)2-3O-，其中每个独立出现的R*选自：氢、可以如下所定义地被取代的C1-6脂族、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。
在R*的脂族基团上的合适的取代基包括卤素、-R●、-(卤代R●)、-OH、-OR●、-O(卤代R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2或-NO2，其中每个R●是未取代的，或当前面具有“卤代”时，仅被一个或多个卤素取代，且独立地是C1-4脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。
在“任选地取代的”基团的可取代的氮上的合适的取代基包括-R†、-NR† 2、-C(O)R†、-C(O)OR†、-C(O)C(O)R†、-C(O)CH2C(O)R†、-S(O)2R†、-S(O)2NR† 2、-C(S)NR† 2、-C(NH)NR† 2或-N(R†)S(O)2R†;其中每个R†独立地是氢、可以如下所定义地被取代的C1-6脂族、未取代的-OPh、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环，或者，尽管有上面的定义，2个独立地出现的R†与它们的插入原子一起形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的3-12元饱和的、部分不饱和的、或芳基单环或双环的环。
在R†的脂族基团上的合适的取代基独立地是卤素、-R●、-(卤代R●)、-OH、-OR●、-O(卤代R●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2或-NO2，其中每个R●是未取代的，或当前面具有“卤代”时，仅被一个或多个卤素取代，且独立地是C1-4脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph、或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元饱和的、部分不饱和的或芳基环。
合适的保护基- 本文使用的术语“合适的保护基”表示氨基保护基或羟基保护基（取决于它在化合物内的位置），且包括在下述文献中详述的那些：Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene和P. G. M. Wuts, 第3版, John Wiley & Sons,1999。
合适的氨基-保护基包括：氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9-芴甲氧羰酰胺(Fmoc)、9-(2-磺基)芴甲氧羰酰胺、9-(2,7-二溴)芴甲氧羰酰胺、2,7-二叔丁基-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢噻嗯烷基)]氨基甲酸甲酯(DBD-Tmoc)、4-甲氧基苯酰基氨基甲酸酯(Phenoc)、2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(Troc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、2-苯乙基氨基甲酸酯(hZ)、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(Adpoc)、1,1-二甲基-2-卤代乙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-2,2-二溴乙基氨基甲酸酯(DB-t-BOC)、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(TCBOC)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙基氨基甲酸酯(Bpoc)、1-(3,5-二叔丁基苯基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(t-Bumeoc)、2-(2’-和4’-吡啶基)乙基氨基甲酸酯(Pyoc)、2-(N,N-二环己基甲酰胺基)乙基氨基甲酸酯、叔丁基氨基甲酸酯(BOC)、1-金刚烷基氨基甲酸酯(Adoc)、乙烯基氨基甲酸酯(Voc)、烯丙基氨基甲酸酯(Alloc)、1-异丙基烯丙基氨基甲酸酯(Ipaoc)、肉桂基氨基甲酸酯(Coc)、4-硝基肉桂基氨基甲酸酯(Noc)、8-喹啉基氨基甲酸酯、N-羟基哌啶基氨基甲酸酯、烷基二硫氨基甲酸酯、苄基氨基甲酸酯(Cbz)、对甲氧基苄基氨基甲酸酯(Moz)、对硝基苄基氨基甲酸酯、对溴苄基氨基甲酸酯、对氯苄基氨基甲酸酯、2,4-二氯苄基氨基甲酸酯、4-甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯(Msz)、9-蒽基氨基甲酸甲酯、二苯基氨基甲酸甲酯、2-甲基硫代乙基氨基甲酸酯、2-甲磺酰基乙基氨基甲酸酯、2-(对甲苯磺酰基)乙基氨基甲酸酯、[2-(1,3-二噻烷基)]氨基甲酸甲酯(Dmoc)、4-甲基苯硫基氨基甲酸酯(Mtpc)、2,4-二甲基苯硫基氨基甲酸酯(Bmpc)、2-膦酰基乙基氨基甲酸酯(Peoc)、2-三苯基膦酰基异丙基氨基甲酸酯(Ppoc)、1,1-二甲基-2-氰基乙基氨基甲酸酯、间-氯-对-酰氧基苄基氨基甲酸酯、对(二羟基硼基)苄基氨基甲酸酯、5-苯并异噁唑基氨基甲酸甲酯、2-(三氟甲基)-6-色酮基氨基甲酸甲酯(Tcroc)、间硝基苯基氨基甲酸酯、3,5-二甲氧基苄基氨基甲酸酯、邻硝基苄基氨基甲酸酯、3,4-二甲氧基-6-硝基苄基氨基甲酸酯、苯基(邻硝基苯基)氨基甲酸甲酯、吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、N’-对甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、N’-苯基氨基硫代羰基衍生物、叔戊基氨基甲酸酯、S-苄基硫代氨基甲酸酯、对氰基苄基氨基甲酸酯、环丁基氨基甲酸酯、环己基氨基甲酸酯、环戊基氨基甲酸酯、环丙基氨基甲酸甲酯、对癸基氧基苄基氨基甲酸酯、2,2-二甲氧基羰基乙烯基氨基甲酸酯、邻-(N, N-二甲基甲酰胺基)苄基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲酰胺基)丙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基丙炔基氨基甲酸酯、二(2-吡啶基)氨基甲酸甲酯、2-呋喃基氨基甲酸甲酯,2-碘乙基氨基甲酸酯、异冰片基氨基甲酸酯, 异丁基氨基甲酸酯、异烟酰基氨基甲酸酯、对-(p’-甲氧基苯偶氮基)苄基氨基甲酸酯、1-甲基环丁基氨基甲酸酯、1-甲基环己基氨基甲酸酯、1-甲基-1-环丙基氨基甲酸甲酯、1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(对苯偶氮基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-苯乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯、对(苯偶氮基)苄基氨基甲酸酯、2,4,6-三-叔丁基苯基氨基甲酸酯、4-(三甲铵)苄基氨基甲酸酯、2,4,6-三甲基苄基氨基甲酸酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、吡啶酰胺、3-吡啶基羧酰胺、N-苯甲酰基苯基内氨酰基衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(N’-二硫代苄氧基羰基氨基)乙酰胺、3-(对羟基苯基)丙酰胺、3-(邻硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻苯偶氮基苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、N-乙酰蛋氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺、邻-(苯甲酰氧基甲基)苯甲酰胺、4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二硫杂琥珀酰亚胺(Dts)、N-2,3-二苯基马来酰亚胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5-取代的1,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己烷-2-酮、5-取代的1,3-二苄基-1,3,5-三氮杂环己烷-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲胺、N-烯丙胺、N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲胺(SEM)、N-3-乙酰氧基丙胺、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯啉-3-基)胺、季铵盐、N-苄基胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲胺、N-5-二苯并环庚基胺、N-三苯基甲胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基芴基胺(PhF)、N-2,7-二氯-9-芴基亚甲胺、N-二茂铁基甲氨基(Fcm)、N-2-吡啶甲基氨基N’-氧化物、N-1,1-二甲基硫代亚甲胺、N-亚苄基胺、N-对甲氧基亚苄基胺、N-二苯基亚甲胺、N-[(2-吡啶基)2,4,6-三甲苯基]亚甲胺、N-(N’,N’-二甲氨基亚甲基)胺、N,N’-亚异丙基二胺、N-对硝基亚苄基胺、N-亚水杨酰基胺、N-5-氯亚水杨酰基胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲胺、N-亚环己基胺、N-(5,5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基硼酸衍生物、N-[苯基(五羰基铬-或钨)羰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝基胺、N-亚硝胺、N-氧化胺、二苯基膦酰胺(Dpp)、二甲基硫代膦酰胺(Mpt)、二苯基硫代膦酰胺(Ppt)、二烷基氨基磷酸酯、二苄基氨基磷酸酯、二苯基氨基磷酸酯、苯次磺酰胺、邻硝基苯次磺酰胺(Nps)、2、4-二硝基苯次磺酰胺、五氯苯次磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯次磺酰胺、三苯基甲基次磺酰胺、3-硝基吡啶次磺酰胺(Npys)、对甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2,4,6-三甲基苯磺酰胺(Mts)、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(iMds)、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰胺(Pmc), 甲磺酰胺(Ms)、β-三甲基甲硅烷基乙磺酰胺(SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4’,8’-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺和苯酰基磺酰胺。
合适的羟基保护基包括甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲基硫代甲基(MTM)、叔丁基硫代甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄氧基甲基(BOM)、对甲氧基苄氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(p-AOM)、愈创木酚甲基(GUM)、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基(POM)、硅氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、二(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基S,S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1,4-二噁烷-2-基、四氢呋喃基、四氢噻吩基, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氢-7,8,8-三甲基-4,7-亚甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯基氧硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤苄基、2,6-二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧桥、二苯基甲基、p,p’-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯酰氧基苯基)二苯基甲基、4,4’,4’’-三(4,5-二氯邻苯二甲酰亚胺基苯基)甲基、4,4’,4’’-三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基、4,4’,4’’-三(苯甲酰氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)二(4’,4’’-二甲氧基苯基)甲基、1,1-二(4-甲氧基苯基)-1’-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1,3-苯并二硫戊环-2-基、苯并异噻唑基S,S-二氧桥、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三-对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基(DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4-(乙烯二硫代)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫缩醛)、特戊酸酯、金刚酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(酸酯)、烷基甲基碳酸酯、9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙基碳酸酯、2,2,2-三氯乙基碳酸烷基酯(Troc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(TMSEC)、2-(苯磺酰基)乙基碳酸酯(Psec)、2-(三苯基膦酰基)乙基碳酸酯(Peoc)、异丁基碳酸烷基酯、乙烯基碳酸烷基酯、烯丙基碳酸烷基酯、对硝基苯基碳酸烷基酯、苄基碳酸烷基酯、对甲氧基苄基碳酸烷基酯、3、4-二甲氧基苄基碳酸烷基酯、邻硝基苄基碳酸烷基酯、对硝基苄基碳酸烷基酯、S-苄基硫代碳酸烷基酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、二硫代碳酸甲酯、2-碘苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、2-(甲基硫代甲氧基)乙基、4-(甲基硫代甲氧基)丁酸酯、2-(甲基硫代甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-二(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、邻-(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N、N、N’、N’-四甲基磷二酰胺、N-苯基氨基甲酸烷基酯、硼酸酯、二甲基硫代膦基、2,4-二硝基苯基磺酸烷基酯、硫酸酯、甲磺酸盐(甲磺酸酯)、磺酸苄酯和甲苯磺酰化(Ts)。对于保护1,2-或1,3-二醇，保护基包括亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1-叔丁基亚乙基缩酮、1-苯亚乙基缩酮、(4-甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2,2,2-三氯亚乙基缩醛、丙酮化合物、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、亚苄基缩醛、对甲氧基亚苄基缩醛、2,4-二甲氧基亚苄基缩酮、3,4-二甲氧基亚苄基缩醛、2-硝基亚苄基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1-甲氧基亚乙基原酸酯、1-乙氧基亚乙基原酸酯、1,2-二甲氧基亚乙基原酸酯、α-甲氧基亚苄基原酸酯、1-(N,N-二甲氨基)亚乙基衍生物、α-(N,N’-二甲氨基)亚苄基衍生物、2-氧杂亚环戊基原酸酯、二叔丁基甲硅亚烷基(DTBS)、1,3-(1,1,3,3-四异丙基二亚硅氧烷基)衍生物(TIPDS)、四-叔丁氧基二硅氧烷-1,3-二亚基衍生物(TBDS)、环状碳酸酯、环状硼酸酯、硼酸乙基酯和硼酸苯基酯。
在显示出化学变量(例如，R基团)连接到与环键交叉的键上的任意情况下，这是指一个或多个这样的变量任选地连接到具有该交叉键的环上。在这样的环上的每个R基团可以连接在所述环上的任意合适的位置，这通常理解为是指，该基团替代氢原子连接到母体环上。这包括下述可能，即2个R基团可以连接在同一个环原子上。此外，当在环上存在超过一个R基团时，各自可以与连接的其它R基团相同或不同，且每个基团独立于可以连接在相同分子的其它位置上的其它基团进行定义，即使它们可能由相同的标识符来表示。
可生物降解的- 本文使用的术语“可生物降解的”表示在生理条件或胞内体条件下降解(即，至少丧失一些它们的共价结构)的分子。可生物降解的分子不一定可水解地降解，且可能需要酶促反应才能降解。
生物分子- 本文使用的术语“生物分子”表示在细胞和组织中常见的天然存在的或人工制备的(例如，通过合成或重组方法)分子(例如，多肽、氨基酸、多核苷酸、核苷酸、多糖、糖类、脂类、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、甾类、代谢物等)。生物分子的具体类别包括、但不限于：酶、受体、神经递质、激素、细胞因子、细胞响应修饰剂（诸如生长因子和趋化因子）、抗体、疫苗、半抗原、毒素、干扰素、核酶、反义试剂、质粒、DNA和RNA。
药物- 本文使用的术语“药物”表示改变、抑制、激活或以其它方式影响生物学事件的小分子或生物分子。例如，药物可以包括、但不限于：抗-AIDS物质，抗癌物质，抗生素，抗糖尿病物质，免疫抑制剂，抗病毒物质，酶抑制剂，神经毒素，阿片样物质，安眠药，抗-组胺，润滑剂，安神剂，抗惊厥药，肌肉松弛药和抗-帕金森物质，抗-痉挛药和肌肉收缩药（包括通道阻滞剂），缩瞳药和抗胆碱能药，抗-青光眼化合物，抗-寄生物和/或抗-原生动物化合物，细胞-胞外基质相互作用的调节剂（包括细胞生长抑制剂和抗-粘附分子），血管扩张剂，DNA、RNA或蛋白合成的抑制剂，抗高血压药，镇痛药，解热剂，甾体和非甾体抗炎药，抗-血管生成因子，反分泌因子，抗凝血药和/或抗血栓药，局部麻醉药，眼药，前列腺素，抗抑郁药，抗精神病物质，止吐药，和显像剂。适用于本发明的示例性药物的更完整的列表可以参见：Axel Kleemann和Jurgen Engel的“Pharmaceutical Substances: Syntheses,Patents, Applications”, Thieme Medical Publishing, 1999；“Merck Index: AnEncyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals”, Susan Budavari等人编, CRCPress, 1996,和美国药典-25 (United States Pharmacopeia-25)/国家处方集-20（National Formulary-20），由United States Pharmcopeial Convention, Inc.,Rockville MD, 2001公开。
外源性的- 本文使用的“外源性的”分子是在没有施用给患者之前不以显著水平存在于患者中的分子。在特定实施方案中，患者是哺乳动物，例如，人、狗、猫、大鼠、迷你猪等。如果这类患者的正常血清包含小于0.1 mM的分子，则本文使用的分子不以显著水平存在于患者中。在特定实施方案中，患者的正常血清可以包含小于0.08 mM、小于0.06 mM或小于0.04 mM的分子。
超支化的- 本文使用的“超支化的”结构是包含至少1个分支的支链的共价结构(例如，树枝状聚合的结构)。超支化的结构可以包括聚合的和/或非聚合的亚结构。
正常血清- 本文使用的“正常血清”是通过合并大约等量的来自5位或更多非糖尿病患者的凝固全血的液体部分所得到的血清。随机地选择18-30岁的非糖尿病的人患者，他们在抽血时没有呈现出糖尿病症状。
聚合物- 本文使用的“聚合物”或“聚合的结构”是包含一串共价结合的单体的结构。聚合物可以由一类单体或超过一类单体制成。因此，术语“聚合物”包括共聚物，包括嵌段共聚物，其中不同类型的单体在全部聚合物内单独成簇。聚合物可以是直链的或分支的。
多核苷酸-本文使用的“多核苷酸”是核苷酸的聚合物。术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可以互换使用。所述聚合物可以包括天然的核苷(即，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘代尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、二氢尿苷、甲基假尿苷、1-甲基腺苷、1-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷和2-硫代胞苷)、化学修饰的碱基、生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)、插入的碱基、修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、2'-O-甲基胞苷、阿拉伯糖和己糖)或修饰的磷酸酯基团(例如，硫代磷酸酯和5' -N-亚磷酰胺连接)。
多肽–本文使用的“多肽”是氨基酸的聚合物。术语“多肽”、“蛋白”、“寡肽”和“肽”可以互换使用。多肽可以含有天然的氨基酸、非天然的氨基酸(即，在自然界中不存在、但是可以掺入多肽链中的化合物)和/或氨基酸类似物，这是本领域已知的。另外，可以修饰多肽中的一个或多个氨基酸残基，例如，通过添加化学实体，诸如碳水化合物基团、磷酸酯基团、法尼基基团、异法尼基基团、脂肪酸基团、用于缀合的接头、官能化或其它修饰等。这些修饰可以包括肽的环化、D-氨基酸的掺入等。
多糖- 本文使用的“多糖”是糖的聚合物。术语“多糖”、“碳水化合物”和“寡糖”可以互换使用。聚合物可以包括天然的糖(例如，阿拉伯糖、来苏糖、核糖、木糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、甘露庚酮糖、景天庚酮糖、辛酮糖和sialose)和/或修饰的糖(例如，2´-氟核糖、2´-脱氧核糖和己糖)。示例性的二糖包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、龙胆二糖、异麦芽糖、曲二糖、昆布二糖、甘露二糖、蜜二糖、黑曲霉糖、芸香糖和木二糖。
小分子- 本文使用的术语“小分子”表示具有相对低分子量的天然存在的或人工制备的(例如，通过化学合成)分子。通常，小分子是单体的，且具有小于约1500 Da的分子量。优选的小分子是生物活性的，因为它们在动物（优选哺乳动物、更优选人）中产生局部的或全身的作用。在特定优选的实施方案中，小分子是药物。优选地，尽管不一定，药物是已经被适当的管理机构或主体认为使用安全且有效的药物。例如，美国食品药品管理局（FDA）在21 C.F.R. §§330.5、331 -361和440 -460下列出的人用药物、美国食品药品管理局（FDA）在21 C.F.R. §§500-589下列出的兽医用药物，都视作根据本发明的应用所可接受的。
治疗- 本文使用的术语“治疗”表示将本公开内容的缀合物施用给有此需要的受试者，其目的是减轻、解除、改变、改善、提高或影响病症(例如，糖尿病)、病症的一种或多种症状(例如，高血糖症)或向病症的倾向。例如，本文使用的术语“治疗糖尿病”一般表示将血糖水平维持在正常水平附近，且可以包括根据给定的情形增加或降低血糖水平。
药学上可接受的载体- 本文使用的该术语包括任何标准的药用载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(诸如油/水或水/油乳剂)和各种类型的润湿剂。该术语还包括美国联邦政府管理机构批准或美国药典中列出的用于动物(包括人类)的任何试剂。
药学上可接受的盐- 本文使用的该术语表示保留母体化合物的生物活性的化合物的盐，并且其在生物学或其它方面不是不希望的。本文公开的许多化合物能够通过氨基和/或羧基或其类似基团的存在而形成酸式盐和/或碱式盐。
可以从无机和有机碱制备药学上可接受的碱加成盐。仅作为示例，从无机碱衍生出的盐包括钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐和镁盐。从有机碱衍生的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐。
可以从无机和有机酸制备药学上可接受的酸加成盐。从无机酸衍生出的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的盐。从有机酸衍生出的盐包括乙酸、丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等的盐。
有效量或治疗有效量–如本文使用的，表示无毒的、但是足量的胰岛素类似物以提供期望的作用。例如，一种预期作用会是高血糖症的预防或治疗。“有效”的量随受试者不同而变化，取决于个体的年龄和一般状况、施用模式等。因而，不总是可能指定确切的“有效量”。但是，本领域普通技术人员使用例行实验可以确定在任何个例中的适当“有效”量。
胃肠外的- 本文使用的该术语是指不通过消化道，而是通过某些其它途径，诸如鼻内、吸入、皮下、肌肉内、椎管内或静脉内。
胰岛素- 本文使用的该术语是指胰腺的活性成分，其影响动物体内碳水化合物的代谢，且其在糖尿病的治疗中具有价值。该术语包括合成的和通过生物技术衍生出的产物，所述产物在结构、用途和预期效果方面与天然存在的胰岛素相同或类似，并且在糖尿病的治疗中具有价值。
胰岛素或胰岛素分子–该术语是表示51氨基酸异源二聚体的通用词，所述异源二聚体包含具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的A-链肽和具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的B-链肽，其中在A链的位置6和11处的半胱氨酸残基通过二硫键连接，在A链的位置7和B链的位置7处的半胱氨酸残基通过二硫键连接，且在A链的位置20和B链的位置19处的半胱氨酸残基通过二硫键连接。
胰岛素类似物或类似物-本文使用的该术语包括含有天然A-链肽和/或B-链肽的一个或多个修饰的任何异源二聚体类似物或单链类似物。修饰包括、但不限于：用一个氨基酸置换选自A4、A5、A8、A9、A10、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30的位置处的天然氨基酸；删除位置B1-4和B26-30中的任一个或全部；或直接地或通过聚合的或非聚合的接头缀合一个或多个酰基、聚乙基甘氨酸(PEG)或糖部分(多个糖部分)；或它们的任意组合。如本文中公开的N-连接的糖基化胰岛素类似物所举例说明的，该术语还包括已经经过修饰以具有至少一个N-连接的糖基化位点的任何胰岛素异源二聚体和单链类似物，和尤其是其中N-连接的糖基化位点连接至N-聚糖或被N-聚糖占据的实施方案。胰岛素类似物的例子包括、但不限于在公开的国际申请WO20100080606、WO2009/099763和WO2010080609（其公开内容通过引用并入本文）中公开的异源二聚体和单链类似物。单链胰岛素类似物的例子也包括、但不限于在公开的国际申请WO9634882、WO95516708、WO2005054291、WO2006097521、WO2007104734、WO2007104736、WO2007104737、WO2007104738、WO2007096332、WO2009132129；美国专利号5,304,473和6,630,348以及Kristensen等人,Biochem. J. 305: 981-986 (1995)（它们的公开内容各自通过引用并入本文）中公开的那些。
该术语还包括单链和异源二聚体多肽分子，所述分子对胰岛素受体几乎不具有或根本不具有可检测的活性，但是其已经经过修饰以包括一个或多个氨基酸修饰或置换从而对胰岛素受体具有的活性是天然胰岛素对胰岛素受体的活性的至少1%、10%、50%、75%或90%，且其还包括至少一个N-连接的糖基化位点。在特定方面，所述胰岛素类似物是部分激动剂，所述部分激动剂对胰岛素受体的活性是天然胰岛素的1/2至1/100。在其它方面，所述胰岛素类似物对胰岛素受体具有增强的活性，例如，在公开的国际申请WO2010080607 (其通过引用并入本文)中公开的IGFB16B17衍生物肽。这些胰岛素类似物（其对胰岛素生长激素受体具有降低的活性且对胰岛素受体具有增强的活性）包括异源二聚体和单链类似物。
单链胰岛素或单链胰岛素类似物- 本文使用的该术语包括一组在结构上相关的蛋白，其中A-链肽或功能类似物和B-链肽或功能类似物通过2-35个氨基酸的肽或多肽或非肽聚合的或非聚合的接头共价地连接，且其对胰岛素受体具有的胰岛素活性是天然胰岛素的至少1%、10%、50%、75%或90%。单链胰岛素或胰岛素类似物还包括三个二硫键：第一个二硫键是在A-链或其功能类似物的位置6和11处的半胱氨酸残基之间，第二个二硫键是在A-链或其功能类似物的位置7和B-链或其功能类似物的位置7处的半胱氨酸残基之间，且第三个二硫键是在A-链或其功能类似物的位置20和B-链或其功能类似物的位置19处的半胱氨酸残基之间。
连接肽或C-肽- 本文使用的该术语表示单链前胰岛素原-样分子的B-C-A多肽序列的连接部分“C”。具体地，在天然的胰岛素链中，C-肽连接在B-链的位置30处的氨基酸和在A-链的位置1处的氨基酸。该术语可以表示天然胰岛素C-肽(SEQ ID NO:30)、猴C-肽和将B-链连接至A-链的3-35个氨基酸的任意其它肽，因而意在包括在单链胰岛素类似物(参见例如，美国公开的申请号20090170750和20080057004和WO9634882)中和在胰岛素前体分子（诸如公开于WO9516708和美国专利号7,105,314中）中将B-链肽连接至A-链肽的任何肽。
氨基酸修饰- 本文使用的该术语表示氨基酸的置换，或者通过向/从氨基酸添加和/或除去化学基团而对氨基酸的衍生化，并且包括用在人蛋白质中常见的20种氨基酸中的任一种以及非典型的或非天然存在的氨基酸置换。非典型氨基酸的商业来源包括Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), ChemPep Inc. (Miami, FL)和Genzyme Pharmaceuticals(Cambridge, MA)。非典型氨基酸可以购自商业供应商、从头合成、或者从天然存在的氨基酸进行化学修饰或衍生化。
氨基酸置换–如本文使用的，表示用不同的氨基酸残基替换一个氨基酸残基。
保守的氨基酸置换- 本文使用的该术语在本文中被定义为以下五组中的一组内的互换：
I. 小脂族的、非极性的或弱极性的残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II. 极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：
Asp、Asn、Glu、Gln、半胱磺酸和高半胱磺酸；
III. 极性的、带正电荷的残基：
His、Arg、Lys；鸟氨酸(Orn)
IV. 大的、脂族的、非极性的残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、高半胱氨酸
V. 大的、芳族残基：
Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸。
附图说明
图1：0.69 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-2的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图2：0.17 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-3的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图3：0.17 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-8的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图4：0.17 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-9的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图5:0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-16的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图6:0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-22的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图7：0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-23的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图8：0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-46的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图9：0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-48的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图10:0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-52的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图11:0.69 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-56的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图12:0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-60的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图13:0.69 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-75的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图14:0.17 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-76的血清浓度图。在每个实验中，给动物输注(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或(●) PBS。将数据绘图为平均值，其用从二隔室、双指数模型衍生出的曲线拟合。
图15: 在(●) PBS输注或(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)的条件下，在以0.69 nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-2以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图16: 在(●) PBS输注或(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)的条件下，在以0.17 nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-3以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图17: 在(●) PBS输注或(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)的条件下，在以0.35 nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-16以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图18: 在(●) PBS输注或(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)的条件下，在以0.35 nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-22以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图19: 在(●) PBS输注或(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)的条件下，在以0.35 nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-23以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图20: 在(●) PBS输注或(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)的条件下，在以0.35 nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-52以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图21: 在(●) PBS输注或(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)的条件下，在以0.69 nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-56以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图22: 在(●) PBS输注或(□)静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)的条件下，在以0.35 nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-60以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
具体实施方式
本发明提供了以对糖（诸如葡萄糖）的全身浓度做出响应的方式控制胰岛素的药代动力学(PK)和/或药效动力学(PD)特性的方法。所述方法部分地基于在美国公开的申请号2011/0301083中公开的发现：当修饰特定胰岛素缀合物以包括高亲和力糖配体诸如支链三甘露糖时，即使在没有外源性多价糖结合分子诸如凝集素伴刀豆球蛋白A (Con A)存在下，也可以使它们表现出对糖浓度变化做出响应的PK/PD特性。
一般而言，本发明的胰岛素缀合物包含胰岛素或胰岛素类似物分子，所述胰岛素或胰岛素类似物分子共价地连接到至少一个支链接头，所述接头具有两个臂或由两个臂组成，每个臂独立地共价地连接到包含糖或由糖组成的配体，其中所述接头的至少一个配体包括糖岩藻糖。在特定实施方案中，所述配体能够与糖(例如，葡萄糖或α-甲基甘露糖)竞争结合内源性糖结合分子。在特定实施方案中，所述配体能够与葡萄糖或α-甲基甘露糖竞争对Con A的结合。在特定实施方案中，所述接头是非聚合的。在特定实施方案中，所述缀合物可以具有1的多分散性指数和小于约20,000 Da的分子量。在特定实施方案中，所述缀合物具有如在本文中定义和描述的式(I)或(II)。在特定实施方案中，所述缀合物是长效的(即，表现出比可溶性重组人胰岛素(RHI)更持久的PK特性)。
本文使用的术语“胰岛素缀合物”包括：(i)包含胰岛素分子的胰岛素缀合物，所述胰岛素分子具有胰岛素的天然或野生型氨基酸序列，和(ii)包含胰岛素类似物分子的胰岛素缀合物，其中所述胰岛素类似物包含与天然或野生型胰岛素氨基酸序列相差至少一个氨基酸置换、删除、重排或添加的氨基酸序列。该术语还包括缀合至聚乙二醇或脂肪酸分子的胰岛素或胰岛素类似物分子。所述胰岛素分子可以是人胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素、兔胰岛素、绵羊胰岛素等或其类似物。这些胰岛素分子中的许多可商业得到，例如，从Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。胰岛素的多种修饰形式是本领域已知的(例如，参见Crotty和Reynolds, Pediatr. Emerg. Care. 23:903-905, 2007和Gerich, Am. J. Med. 113:308-16, 2002和其中引用的参考文献)。胰岛素的修饰形式可以是化学修饰的(例如，如下所述，通过添加化学部分诸如PEG基团或脂肪酰基链)和/或突变的(即，通过添加、删除或置换一个或多个氨基酸)。
胰岛素缀合物
在一个方面，本发明提供了包含胰岛素或胰岛素类似物分子的胰岛素缀合物，所述胰岛素或胰岛素类似物分子共价地连接到至少一个具有两个臂的支链接头(二齿接头)，其中所述二齿接头的每个臂独立地共价地连接至包含糖或由糖组成的配体，且其中所述二齿接头的第一配体包含第一糖或由第一糖组成，所述第一糖是岩藻糖。所述二齿接头的第二配体包含第二糖或由第二糖组成，所述第二糖可以是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺或葡萄糖。在特定方面，所述第二配体包含二糖、三糖、四糖或支链三糖或者由二糖、三糖、四糖或支链三糖组成。在特定方面，所述第二配体包含二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在特定方面，所述胰岛素或胰岛素类似物分子缀合至1、2、3或4个二齿接头，其中每个二齿接头的每个臂独立地共价地连接至包含糖或由糖组成的配体，且其中所述二齿接头的第一配体包含第一糖或由第一糖组成，所述第一糖是岩藻糖，且所述二齿接头的第二配体包含第二糖或由第二糖组成，所述第二糖可以是岩藻糖、甘露糖或葡萄糖。在特定方面，所述第二配体包含二糖、三糖、四糖或支链三糖或者由二糖、三糖、四糖或支链三糖组成。在特定方面，所述第二配体包含二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖或者由二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖组成。
在特定方面，所述胰岛素或胰岛素类似物分子缀合至1、2、3或4个二齿接头，其中每个二齿接头的每个臂独立地共价地连接至包含糖或由糖组成的配体，且其中对于所述二齿接头中的至少一个，所述二齿接头的第一配体包含第一糖或由第一糖组成，所述第一糖是岩藻糖，且所述二齿接头的第二配体包含第二糖或由第二糖组成，所述第二糖可以是岩藻糖、甘露糖或葡萄糖。在特定方面，所述第二配体包含二糖、三糖、四糖或支链三糖或者由二糖、三糖、四糖或支链三糖组成。在特定方面，所述第二配体包含二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖或者由二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖组成。对于第二个、第三个和第四个二齿接头，所述第一糖和第二糖可以独立地是岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在特定方面，所述胰岛素或胰岛素类似物分子缀合至(i)一个二齿接头，其中每个二齿接头的每个臂独立地共价地连接至包含糖或由糖组成的配体，其中所述二齿接头的第一配体包含第一糖或由第一糖组成，所述第一糖是岩藻糖，且所述二齿接头的第二配体包含第二糖或由第二糖组成，所述第二糖可以是岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
在特定方面，本文中公开的胰岛素缀合物的胰岛素或胰岛素类似物分子还共价地连接到至少一个直链接头，所述接头具有一个包含糖或由糖组成的配体，所述糖可以是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺或葡萄糖。在特定方面，所述配体包含二糖、三糖、四糖或支链三糖或者由二糖、三糖、四糖或支链三糖组成。在特定方面，所述配体包含二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖或者由二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖组成。
在特定方面，本文中公开的胰岛素或胰岛素类似物分子缀合物还共价地连接到至少一个三齿接头，其中所述三齿接头的每个臂独立地共价地连接至包含糖或由糖组成的配体，所述糖可以是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺或葡萄糖。在特定方面，所述配体包含二糖、三糖、四糖或支链三糖或者由二糖、三糖、四糖或支链三糖组成。在特定方面，所述配体包含二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖或者由二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖组成。
当将胰岛素缀合物施用给哺乳动物时，所述缀合物的至少一种药代动力学或药效动力学性质对糖的血清浓度是敏感的。在特定实施方案中，所述缀合物的PK和/或PD性质对内源糖（诸如葡萄糖）的血清浓度是敏感的。在特定实施方案中，所述缀合物的PK和/或PD性质对外源糖（例如，但不限于，甘露糖、L-岩藻糖、N-乙酰基葡糖胺和/或α-甲基甘露糖）的血清浓度是敏感的。
PK和PD性质
在不同的实施方案中，通过糖的血清浓度的变动，可以改变胰岛素缀合物的药代动力学和/或药效动力学行为。例如，从药代动力学(PK)角度看，当糖(例如，葡萄糖)的血清浓度增加时，或当糖的血清浓度上穿阈值(例如，高于正常葡萄糖水平)时，血清浓度曲线可能向上移动。
在特定实施方案中，当施用给处于禁食和高血糖条件下的哺乳动物时，缀合物的血清浓度曲线是基本上不同的。本文使用的术语“基本上不同的”是指，通过student t-检验(p < 0.05)测得，2条曲线是统计上不同的。本文使用的术语“禁食条件”是指，通过组合来自5个或更多个禁食的非糖尿病个体的数据得到血清浓度曲线。在特定实施方案中，禁食的非糖尿病个体是随机地选择的18-30岁的人，他们在抽血时没有显现糖尿病症状，且在抽血时间的12小时内没有进食。本文使用的术语“高血糖条件”是指，通过组合来自5个或更多个禁食的非糖尿病个体的数据所得到的血清浓度曲线，其中通过同时施用缀合物和葡萄糖来诱导高血糖条件(葡萄糖Cmax比在禁食条件下观察到的平均葡萄糖浓度高至少100 mg/dL)。缀合物和葡萄糖的同时施用仅要求，在缀合物以可检测水平存在于血清中的时期内，发生葡萄糖Cmax。例如，可以使葡萄糖注射(或摄入)定时发生在缀合物施用之前短时间内、同时或之后短时间内。在特定实施方案中，通过不同途径或在不同位置，施用缀合物和葡萄糖。例如，在特定实施方案中，皮下地施用缀合物，同时口服地或静脉内地施用葡萄糖。
在特定实施方案中，与禁食条件相比，在高血糖条件下缀合物的血清Cmax更高。额外地或可替代地，在特定实施方案中，与禁食条件相比，在高血糖条件下缀合物的血清曲线线面积(AUC)更高。在不同的实施方案中，与禁食条件相比，在高血糖条件下缀合物的血清消除速率更慢。在特定实施方案中，使用具有1个短的和1个长的半衰期的两隔室双指数模型，可以拟合缀合物的血清浓度曲线。长半衰期表现得对葡萄糖浓度特别敏感。因而，在特定实施方案中，与禁食条件相比，在高血糖条件下长半衰期更长。在特定实施方案中，禁食条件包含小于100 mg/dL (例如，80 mg/dL、70 mg/dL、60 mg/dL、50 mg/dL等)的葡萄糖Cmax。在特定实施方案中，高血糖条件包含超过200 mg/dL (例如，300 mg/dL、400 mg/dL、500 mg/dL、600 mg/dL等)的葡萄糖Cmax。应当理解，其它PK参数诸如平均血清停留时间(MRT)、平均血清吸收时间(MAT)等可以替代任意的前述参数使用，或一起使用。
在人、狗、猫和大鼠中的葡萄糖浓度的正常范围是60-200 mg/dL。对于具有不同正常范围的物种(例如，在迷你猪中的葡萄糖浓度的正常范围是40-150 mg/dl)，本领域技术人员能够外推下述值。低于60 mg/dL的葡萄糖浓度被视作低血糖的。高于200 mg/dL的葡萄糖浓度被视作高血糖的。在特定实施方案中，可以使用葡萄糖钳（glucose clamp）方法测试缀合物的PK性质(参见实施例)，且当在50和200 mg/dL、50和300 mg/dL、50和400 mg/dL、50和500 mg/dL、50和600 mg/dL、100和200 mg/dL、100和300 mg/dL、100和400 mg/dL、100和500 mg/dL、100和600 mg/dL、200和300 mg/dL、200和400 mg/dL、200和500 mg/dL、200和600 mg/dL等葡萄糖浓度施用时，缀合物的血清浓度曲线可以是基本上不同的。额外地或可替代地，在所述2个葡萄糖浓度，血清Tmax、血清Cmax、平均血清停留时间(MRT)、平均血清吸收时间(MAT)和/或血清半衰期可以是基本上不同的。如下面讨论的，在特定实施方案中，100mg/dL和300 mg/dL可以用作比较葡萄糖浓度。但是，应当理解，本公开内容包括这些实施方案中的每一个，其中比较葡萄糖浓度的替代对包括但不限于下述对中的任一对：50和200mg/dL、50和300 mg/dL、50和400 mg/dL、50和500 mg/dL、50和600 mg/dL、100和200 mg/dL、100和400 mg/dL、100和500 mg/dL、100和600 mg/dL、200和300 mg/dL、200和400 mg/dL、200和500 mg/dL、200和600 mg/dL等。
因而，在特定实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的Cmax更高。在特定实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的Cmax高了至少50%(例如，至少100%、至少200%或至少400%)。
在特定实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的AUC更高。在特定实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的AUC高了至少50%(例如，至少例如，至少100%、至少200%或至少400%)。
在特定实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的血清消除速率更慢。在特定实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较低浓度(例如，100相对于300 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的血清消除速率快了至少25%(例如，至少50%、至少100%、至少200%或至少400%)。
在特定实施方案中，使用具有1个短的和1个长的半衰期的两隔室双指数模型，可以拟合缀合物的血清浓度曲线。长半衰期表现得对葡萄糖浓度特别敏感。因而，在特定实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，长半衰期更长。在特定实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，长半衰期长了至少50%(例如，至少100%、至少200%或至少400%)。
在特定实施方案中，本公开内容提供了这样的方法，其中在两种不同的葡萄糖浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)，得到缀合物的血清浓度曲线；使用具有一个短的和一个长的半衰期的两隔室双指数模型，拟合2条曲线；并对比在2种葡萄糖浓度下得到的长半衰期。在特定实施方案中，该方法可以用作测试或对比一种或多种缀合物的葡萄糖敏感性的试验。
在特定实施方案中，本公开内容提供了这样的方法，其中在相同条件(例如，禁食条件)下，得到缀合的药物(例如，本公开内容的胰岛素缀合物)和未缀合的药物形式(例如，RHI)的血清浓度曲线；使用具有一个短的和一个长的半衰期的两隔室双指数模型，拟合2条曲线；并对比缀合的和未缀合的药物得到的长半衰期。在特定实施方案中，该方法可以用作鉴别比未缀合的药物更迅速地清除的缀合物的试验。
在特定实施方案中，当施用给在高血糖条件下的哺乳动物时，缀合物的血清浓度曲线与未缀合形式的药物的血清浓度曲线基本上相同。本文使用的术语“基本上相同”是指，通过student t-检验(p > 0.05)测得，2条曲线之间不存在统计差异。在特定实施方案中，当在禁食条件下施用时，缀合物的血清浓度曲线基本上不同于未缀合形式的药物的血清浓度曲线。在特定实施方案中，当在高血糖条件下施用时，缀合物的血清浓度曲线与未缀合形式的药物的血清浓度曲线基本上相同，且当在禁食条件下施用时，基本上不同。
在特定实施方案中，所述高血糖条件包含超过200 mg/dL (例如，300 mg/dL、400mg/dL、500 mg/dL、600 mg/dL等)的葡萄糖Cmax。在特定实施方案中，所述禁食条件包含小于100 mg/dL (例如，80 mg/dL、70 mg/dL、60 mg/dL、50 mg/dL等)的葡萄糖Cmax。应当理解，可以对比任意的前述PK参数，诸如血清Tmax、血清Cmax、AUC、平均血清停留时间(MRT)、平均血清吸收时间(MAT)和/或血清半衰期。
从药效动力学(PD)角度看，当葡萄糖浓度增加时，或当葡萄糖浓度上穿阈值(例如，高于正常葡萄糖水平)时，缀合物的生物活性可能增加。在特定实施方案中，与高血糖条件相比，当在禁食条件下施用时，缀合物的生物活性更低。在特定实施方案中，所述禁食条件包含小于100 mg/dL (例如，80 mg/dL、70 mg/dL、60 mg/dL、50 mg/dL等)的葡萄糖Cmax。在特定实施方案中，所述高血糖条件包含超过200 mg/dL (例如，300 mg/dL、400 mg/dL、500 mg/dL、600 mg/dL等)的葡萄糖Cmax。
在特定实施方案中，通过测量维持稳定葡萄糖浓度所需的葡萄糖输注速率(GIR)，可以测试缀合物的PD性质。根据这样的实施方案，当在50和200 mg/dL、50和300 mg/dL、50和400 mg/dL、50和500 mg/dL、50和600 mg/dL、100和200 mg/dL、100和300 mg/dL、100和400 mg/dL、100和500 mg/dL、100和600 mg/dL、200和300 mg/dL、200和400 mg/dL、200和500 mg/dL、200和600 mg/dL等的葡萄糖浓度施用时，缀合物的生物活性可以是基本上不同的。因而，在特定实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的生物活性更高。在特定实施方案中，当在2种葡萄糖浓度中的较高浓度(例如，300相对于100 mg/dL葡萄糖)施用给哺乳动物时，缀合物的生物活性高了至少25%(例如，至少50%或至少100%)。
在特定实施方案中，所述缀合物包括胰岛素分子作为药物。根据这样的实施方案，通过对比达到最小血糖浓度所需的时间(Tnadir)、血糖水平保持低于起始值的特定百分比(例如，起始值的70%或T70%BGL)的持续时间等，可以观察胰岛素的PD行为。
一般而言，应当理解，根据多种公开的药代动力学和药效动力学方法中的任一种(例如，关于适合皮下递送的方法，参见Baudys等人, Bioconjugate Chem. 9:176-183,1998)，可以测定在本部分中讨论的PK和PD特征中的任一个。还应当理解，可以在任意哺乳动物(例如，人、大鼠、猫、迷你猪、狗等)中测量PK和/或PD性质。在特定实施方案中，在人中测量PK和/或PD性质。在特定实施方案中，在大鼠中测量PK和/或PD性质。在特定实施方案中，在迷你猪中测量PK和/或PD性质。在特定实施方案中，在狗中测量PK和/或PD性质。
还应当理解，尽管在葡萄糖-响应性的缀合物的背景下描述了前述内容，相同的性质和试验适用于对其它糖做出响应的缀合物，所述其它糖包括外源糖，例如甘露糖、L-岩藻糖、N-乙酰基葡糖胺、α-甲基甘露糖等。如在下面和在实施例中更详细地讨论的，替代对比在禁食和高血糖条件下的PK和/或PD性质，可以在施用和不施用外源糖的情况下，在禁食条件下，对比PK和/或PD性质。应当理解，可以将缀合物设计成响应于给定外源糖的不同Cmax值。
配体
一般而言，所述胰岛素缀合物包含胰岛素或胰岛素类似物分子，所述胰岛素或胰岛素类似物分子共价地连接到至少一个具有两个配体的二齿接头，其中所述配体中的至少一个(第一配体)包含糖或由糖组成，所述糖是岩藻糖，且其它配体(第二配体)包含一个或多个糖或者由一个或多个糖组成。在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物还可以包括一个或多个直链接头，每个接头包含单个配体，所述配体包含一个或多个糖或者由一个或多个糖组成。在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物还可以包括一个或多个支链接头，每个接头包括至少2、3、4、5个或更多个配体，其中每个配体独立地包含一个或多个糖或者由一个或多个糖组成。当存在超过一个配体时，所述配体可以具有相同的或不同的化学结构。
在特定实施方案中，所述配体能够与糖(例如，葡萄糖、α-甲基甘露糖或甘露糖)竞争结合内源的糖-结合分子(例如，但不限于表面活性蛋白A和D或选择蛋白家族的成员)。在特定实施方案中，所述配体能够与糖(例如，葡萄糖、α-甲基甘露糖或甘露糖)竞争结合细胞-表面糖受体(例如，但不限于巨噬细胞甘露糖受体、葡萄糖运载体配体、内皮细胞糖受体或肝细胞糖受体)。在特定实施方案中，所述配体能够与葡萄糖竞争结合内源的葡萄糖-结合分子(例如，但不限于表面活性蛋白A和D或选择蛋白家族的成员)。在特定实施方案中，所述配体能够与葡萄糖或α-甲基甘露糖竞争结合人巨噬细胞甘露糖受体1 (MRC1)。在特定实施方案中，所述配体能够与糖竞争结合非人凝集素(例如，Con A)。在特定实施方案中，所述配体能够与葡萄糖、α-甲基甘露糖或甘露糖竞争结合非人凝集素(例如，Con A)。示例性的结合葡萄糖的凝集素包括钙联接蛋白、钙网织蛋白、N-乙酰基葡糖胺受体、选择蛋白、无唾液酸糖蛋白受体、胶原凝集素(结合甘露糖的凝集素)、甘露糖受体、聚集蛋白聚糖、多能聚糖、豌豆凝集素(PSA)、蚕豆凝集素、兵豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素、山黧豆凝集素、驴喜豆凝集素、槐凝集素、bowringia milbraedii凝集素、伴刀豆球蛋白A (Con A)和商陆丝裂原。
在特定实施方案中，除了包含糖岩藻糖或由糖岩藻糖组成的第一配体以外的配体可以具有与葡萄糖相同的化学结构，或可以是葡萄糖的化学上有关的物质，例如，葡糖胺。在不同的实施方案中，配体可以有利地具有与葡萄糖不同的化学结构，例如，为了精细调节缀合物的葡萄糖响应。例如，在特定实施方案中，可以使用包含葡萄糖、甘露糖、L-岩藻糖或它们的衍生物(例如，α-L-吡喃岩藻糖苷、甘露糖胺、β-连接的N-乙酰基甘露糖胺、甲基葡萄糖、甲基甘露糖、乙基葡萄糖、乙基甘露糖、丙基葡萄糖、丙基甘露糖等)和/或它们的更高阶组合(例如，二甘露糖、直链的和/或分支的三甘露糖等)的配体。
在特定实施方案中，所述配体包括单糖。在特定实施方案中，所述配体包括二糖。在特定实施方案中，所述配体包括三糖。在一些实施方案中，所述配体包含糖和一个或多个胺基。在一些实施方案中，所述配体包含糖和乙基。在特定实施方案中，所述糖和胺基被C1-C6烷基（例如，C1-C3烷基）隔开。在一些实施方案中，所述配体是氨基乙基葡萄糖(AEG)。在一些实施方案中，所述配体是氨基乙基甘露糖(AEM)。在一些实施方案中，所述配体是氨基乙基二甘露糖(AEBM)。在一些实施方案中，所述配体是氨基乙基三甘露糖(AETM)。在一些实施方案中，所述配体是β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)。在一些实施方案中，所述配体是氨基乙基岩藻糖(AEF)。在特定实施方案中，所述糖属于“D”构型，且在其它实施方案中，所述糖属于“L”构型。下面是具有胺基的示例性糖的结构，所述胺基与所述糖被C2乙基隔开，其中R可以是氢或接头的羰基。本领域技术人员会认识到其它示例性的配体。
胰岛素
本文使用的术语“胰岛素”或“胰岛素分子”包括胰岛素分子的所有盐和非盐形式。应当理解，所述盐形式可以是阴离子的或阳离子的，取决于胰岛素分子。“胰岛素”或“胰岛素分子”意在包括野生型胰岛素和胰岛素的修饰形式，只要它们是生物活性的(即，当体内施用时，能够造成葡萄糖的可检测的减少)。野生型胰岛素包括来自任意物种的纯化的、合成的或重组形式的胰岛素(例如，人胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素、兔胰岛素、绵羊胰岛素等)。它们中的许多可商业得到，例如，购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。胰岛素的多种修饰形式是本领域已知的(例如参见Crotty和Reynolds, Pediatr. Emerg. Care. 23:903-905, 2007和Gerich, Am. J. Med. 113:308-16, 2002和其中引用的参考文献)。胰岛素的修饰形式(胰岛素类似物)可以是化学修饰的(例如，通过添加化学部分，诸如PEG基团或脂肪酰基链，如下所述)和/或突变的(即，通过添加、删除或置换一个或多个氨基酸)。
在特定实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素相差1-10 (例如，1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-9、5-8、5-7、5-6、6-9、6-8、6-7、7-9、7-8、8-9、9、8、7、6、5、4、3、2或1)个氨基酸置换、添加和/或删除。在特定实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素仅相差氨基酸置换。在特定实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素仅相差氨基酸添加。在特定实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素相差氨基酸置换和添加。在特定实施方案中，本公开内容的胰岛素分子与野生型胰岛素相差氨基酸置换和删除。
在特定实施方案中，基于涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性，可以进行氨基酸置换。在特定实施方案中，置换可以是保守的，也就是说，用一个具有类似形状和电荷的氨基酸替换一个氨基酸。保守置换是本领域众所周知的，且通常包括在下述组内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；门冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和酪氨酸、苯丙氨酸。在特定实施方案中，在选择合适的突变时，可以考虑氨基酸的疏水指数。本领域通常理解疏水氨基酸指数在赋予多肽的相互作用生物功能中的重要性。或者，基于亲水性，可以有效地进行类似氨基酸的置换。本领域通常理解亲水性在赋予多肽的相互作用生物功能中的重要性。在美国专利号5,691,198中，进一步讨论了疏水指数或亲水性在设计多肽中的应用。
在下面显示了人胰岛素(A-链和B-链)的野生型序列。
在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子在B-肽序列的B28和/或B29位置处突变。例如，赖脯胰岛素(HUMALOG®)是一种速效胰岛素突变体，其中在B-肽的C-端末端上的倒数第二位的赖氨酸和脯氨酸残基已经反转(LysB28ProB29-人胰岛素) (SEQ ID NO:3)。该修饰会阻断胰岛素多聚体的形成。门冬胰岛素(NOVOLOG®)是另一种速效胰岛素突变体，其中在位置B28处的脯氨酸已经被门冬氨酸置换(AspB28-人胰岛素) (SEQ ID NO:4)。该突变体也会阻止多聚体的形成。在一些实施方案中，在位置B28和/或B29处的突变伴有一个或多个在胰岛素多肽别处的突变。例如，谷赖胰岛素(APIDRA®)是另一种速效胰岛素突变体，其中在位置B3处的门冬氨酸已经被赖氨酸残基替换，且在位置B29处的赖氨酸已经被谷氨酸残基替换(LysB3GluB29-人胰岛素) (SEQ ID NO:5)。
在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子具有与人胰岛素相比迁移的等电点。在一些实施方案中，通过将一个或多个精氨酸残基添加到胰岛素A-肽的N-端和/或胰岛素B-肽的C-端，实现等电点迁移。这样的胰岛素多肽的例子包括ArgA0-人胰岛素、ArgB31ArgB32-人胰岛素、GlyA21ArgB31ArgB32-人胰岛素、ArgA0ArgB31ArgB32-人胰岛素和ArgA0GlyA21ArgB31ArgB32-人胰岛素。作为其它例子，甘精胰岛素(来得时®)是一种示例性的长效胰岛素突变体，其中AspA21已经被甘氨酸替换(SEQ ID NO:6)，且2个精氨酸残基已经添加到B-肽的C-端(SEQ ID NO:7)。这些变化的作用是迁移等电点，产生在pH 4完全可溶的溶液。因而，在一些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包含A-肽序列（其中A21是Gly）和B-肽序列（其中B31和B32是Arg-Arg）。应当理解，本公开内容包括这些突变和本文所述的任意其它突变的所有单个和多个组合(例如，GlyA21-人胰岛素、GlyA21ArgB31-人胰岛素、ArgB31ArgB32-人胰岛素、ArgB31-人胰岛素)。
在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子被截短。例如，在特定实施方案中，本公开内容的胰岛素多肽的B-肽序列缺少B1、B2、B3、B26、B27、B28、B29和/或B30。在特定实施方案中，本公开内容的胰岛素多肽的B-肽序列缺少残基组合。例如，所述B-肽序列可以缺少残基B(1-2)、B(1-3)、B(29-30)、B(28-30)、B(27-30)和/或B(26-30)。在一些实施方案中，这些删除和/或截短适用于任意的前述胰岛素分子(例如，但不限于生成des(B30)-赖脯胰岛素、des(B30)-门冬胰岛素、des(B30)-谷赖胰岛素、des(B30)-甘精胰岛素等)。
在一些实施方案中，胰岛素分子含有在A或B-肽序列的N-或C-端上的额外的氨基酸残基。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置A0、A21、B0和/或B31。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置A0。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置A21。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置B0。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸残基位于位置B31。在特定实施方案中，胰岛素分子不包含在任何额外的在位置A0、A21、B0或B31处的氨基酸残基。
在特定实施方案中，本公开内容的胰岛素分子被突变，使得一个或多个酰胺化的氨基酸被酸形式替换。例如，可以用门冬氨酸或谷氨酸替换天冬酰胺。同样地，可以用门冬氨酸或谷氨酸替换谷氨酰胺。具体地，可以用门冬氨酸或谷氨酸替换AsnA18、AsnA21或AsnB3或那些残基的任意组合。可以用门冬氨酸或谷氨酸替换GlnA15或GlnB4或二者。在特定实施方案中，胰岛素分子具有在位置A21处的门冬氨酸或在位置B3处的门冬氨酸或二者。
本领域技术人员会认识到：可能突变胰岛素分子中的其它氨基酸，同时保留生物活性。例如但不限于下述的修饰也是本领域广泛接受的：用门冬氨酸替换在位置B10的组氨酸残基(HisB10→AspB10)；用门冬氨酸替换在位置B1的苯丙氨酸残基(PheB1→AspB1)；用丙氨酸替换在位置B30的苏氨酸残基(ThrB30→AlaB30)；用丙氨酸替换在位置B26的酪氨酸残基(TyrB26→AlaB26)；和用门冬氨酸替换在位置B9的丝氨酸残基(SerB9→AspB9)。
在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子具有延长的作用特性。因而，在特定实施方案中，本公开内容的胰岛素分子可以被脂肪酸酰化。也就是说，在胰岛素分子的氨基和脂肪酸的羧酸基团之间形成酰胺键。所述氨基可以是胰岛素分子的N-端氨基酸的α-氨基，或可以是胰岛素分子的赖氨酸残基的ε-氨基。本公开内容的胰岛素分子可以在野生型人胰岛素中存在的3个氨基中的一个或多个处被酰化，或可以在已经导入到野生型人胰岛素序列中的赖氨酸残基上被酰化。在特定实施方案中，胰岛素分子可以在位置B1处被酰化。在特定实施方案中，胰岛素分子可以在位置B29处被酰化。在特定实施方案中，所述脂肪酸选自肉豆蔻酸(C14)、十五烷酸(C15)、棕榈酸(C16)、十七烷酸(C17)和硬脂酸(C18)。例如，地特胰岛素(LEVEMIR®)是一种长效胰岛素突变体，其中ThrB30已经被删除，且C14脂肪酸链(肉豆蔻酸)已经添加到LysB29上。
在一些实施方案中，本公开内容的胰岛素分子的A-肽的N-端、B-肽的N-端、位于位置B29的Lys的ε-氨基或任意其它可利用的氨基共价地连接到下述通式的脂肪酸部分上：
其中RF是氢或C1-30烷基。在一些实施方案中，RF是C1-20烷基、C3-19烷基、C5-18烷基、C6-17烷基、C8-16烷基、C10-15烷基或C12-14烷基。在特定实施方案中，所述胰岛素多肽在A1位置处缀合到该部分上。在特定实施方案中，所述胰岛素多肽在B1位置处缀合到该部分上。在特定实施方案中，所述胰岛素多肽在位于位置B29的Lys的ε-氨基处缀合到该部分上。在特定实施方案中，胰岛素分子的位置B28是Lys，且LysB28的ε-氨基缀合到该脂肪酸部分上。在特定实施方案中，胰岛素分子的位置B3是Lys，且LysB3的ε-氨基缀合到该脂肪酸部分上。在一些实施方案中，所述脂肪酸链的长度是8-20个碳。在一些实施方案中，所述脂肪酸是辛酸(C8)、壬酸(C9)、癸酸(C10)、十一烷酸(C11)、十二烷酸(C12)或十三烷酸(C13)。在特定实施方案中，所述脂肪酸是肉豆蔻酸(C14)、十五烷酸(C15)、棕榈酸(C16)、十七烷酸(C17)、硬脂酸(C18)、十九烷酸(C19)或花生酸(C20)。
在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素分子包括3个野生型二硫键(即，1个在A-链的位置7和B-链的位置7之间，第2个在A-链的位置20和B-链的位置19之间，第3个在A-链的位置6和11之间)。在特定实施方案中，胰岛素分子被突变，使得突变位点用作缀合点，且在突变位点处的缀合会减少与胰岛素受体的结合(例如，LysA3)。在特定其它实施方案中，在现有的野生型氨基酸或末端处的缀合会减少与胰岛素受体的结合(例如，GlyA1)。在一些实施方案中，在位置A4、A5、A8、A9或B30处，缀合胰岛素分子。在特定实施方案中，通过野生型氨基酸侧链(例如，GluA4)，发生在位置A4、A5、A8、A9或B30处的缀合。在特定其它实施方案中，在位置A4、A5、A8、A9或B30处突变胰岛素分子，以提供缀合位点(例如，LysA4、LysA5、LysA8、LysA9或LysB30)。
下面描述了缀合胰岛素分子的方法。在特定实施方案中，通过A1氨基酸残基，将胰岛素分子缀合至接头。在特定实施方案中，所述A1氨基酸残基是甘氨酸。但是，应当理解，本公开内容不限于N-端缀合，且在特定实施方案中，可以通过非末端A-链氨基酸残基来缀合胰岛素分子。具体地，本公开内容包括通过在A-链的任意位置处存在的赖氨酸残基(野生型或通过定点诱变导入)的ε-胺基进行缀合。应当理解，在A-链上的不同缀合位置可以导致胰岛素活性的不同降低。在特定实施方案中，通过B1氨基酸残基，将胰岛素分子缀合至接头。在特定实施方案中，所述B1氨基酸残基是苯丙氨酸。但是，应当理解，本公开内容不限于N-端缀合，且在特定实施方案中，可以通过非末端B-链氨基酸残基来缀合胰岛素分子。具体地，本公开内容包括通过在B-链的任意位置处存在的赖氨酸残基(野生型或通过定点诱变导入)的ε-胺基进行缀合。例如，在特定实施方案中，可以通过B29赖氨酸残基来缀合胰岛素分子。在谷赖胰岛素的情况下，可以通过B3赖氨酸残基缀合到至少1个配体上。应当理解，在B-链上不同的缀合位置可以导致胰岛素活性的不同降低。
在特定实施方案中，配体缀合到胰岛素分子的超过一个缀合点上。例如，胰岛素分子可以缀合在A1 N-端和B29赖氨酸处。在一些实施方案中，在碳酸盐缓冲液中进行酰胺缀合，以缀合在B29和A1位置，而不是在B1位置。在其它实施方案中，胰岛素分子可以缀合在A1N-端、B1 N-端和B29赖氨酸处。在其它实施方案中，使用保护基，使得缀合发生在B1和B29或B1和A1位置处。应当理解，可以采用在胰岛素分子上的缀合点的任意组合。在一些实施方案中，至少1个缀合点是突变的赖氨酸残基，例如，LysA3。
示例性的胰岛素缀合物
在不同的实施方案中，本公开内容的胰岛素缀合物包含缀合至至少一个二齿接头的胰岛素或胰岛素类似物分子，其中所述二齿接头的至少一个臂连接到配体氨基乙基岩藻糖(AEF)。所述二齿接头的其它臂可以缀合至配体AEF和/或一个或多个独立地选自以下的配体：氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)。在特定实施方案中，所述胰岛素分子通过A1氨基酸残基进行缀合。在特定实施方案中，所述胰岛素分子通过B1氨基酸残基进行缀合。在特定实施方案中，所述胰岛素分子通过LysB29的ε-氨基进行缀合。在特定实施方案中，所述胰岛素分子是包含在位置B28处的赖氨酸(LysB28)的类似物，且所述胰岛素分子通过LysB28的ε-氨基进行缀合，例如，通过LysB28的ε-氨基缀合的赖脯胰岛素。在特定实施方案中，所述胰岛素分子是包含在位置B3处的赖氨酸(LysB3)的类似物，且所述胰岛素分子通过LysB3的ε-氨基进行缀合，例如，通过LysB3的ε-氨基缀合的谷赖胰岛素。
在特定实施方案中，以上胰岛素缀合物的胰岛素或胰岛素分子可以缀合至一个或多个另外的接头，所述接头连接到一个或多个配体，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)配体、氨基乙基三甘露糖(AETM)配体、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)。所述另外的接头可以是直链的、二齿的、三齿的、四齿的等，其中所述接头的每个臂包含配体，所述配体可以独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)配体、氨基乙基三甘露糖(AETM)配体、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)。
因而，在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含一个二齿接头或由一个二齿接头组成，其中所述二齿接头的至少一个臂连接到配体氨基乙基岩藻糖(AEF)，所述配体氨基乙基岩藻糖(AEF)缀合至：在胰岛素或胰岛素类似物的位置A1处的氨基；或在胰岛素或胰岛素类似物的位置B1处的氨基；或在胰岛素类似物的位置B3处的氨基；或在胰岛素类似物的位置B28处的氨基；或在胰岛素或胰岛素类似物的位置B29处的氨基。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含两个二齿接头或由两个二齿接头组成，其中第一个二齿接头缀合至在位置A1处的氨基，所述第一个二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体，且第二个二齿接头缀合至在位置B1、B3、B28或B29处的氨基，所述第二个二齿接头连接到一个或多个配体，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含两个二齿接头或由两个二齿接头组成，其中第一个二齿接头缀合至在位置B1处的氨基，所述第一个二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体，且第二个二齿接头缀合至在位置A1、B3、B28或B29处的氨基，所述第二个二齿接头连接到一个或多个配体，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含两个二齿接头或由两个二齿接头组成，其中第一个二齿接头缀合至在位置B3处的氨基，所述第一个二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体，且第二个二齿接头缀合至在位置B1、A1、B28或B29处的氨基，所述第二个二齿接头连接到一个或多个配体，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含两个二齿接头或由两个二齿接头组成，其中第一个二齿接头缀合至在位置B28处的氨基，所述第一个二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体，且第二个二齿接头缀合至在位置B1、B3、A1或B29处的氨基，所述第二个二齿接头连接到一个或多个配体，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含两个二齿接头或由两个二齿接头组成，其中第一个二齿接头缀合至在位置B29处的氨基，所述第一个二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体，且第二个二齿接头缀合至在位置B1、B3、B28或A1处的氨基，所述第二个二齿接头连接到一个或多个配体，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含三个二齿接头或由三个二齿接头组成，其中第一个二齿接头缀合至在位置A1处的氨基，所述第一个二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体；第二个二齿接头缀合至在位置B1处的氨基，所述第二个二齿接头连接到一个或多个配体，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)；且，第三个二齿接头缀合至在位置B3、B28或B29处的氨基，所述第三个二齿接头连接到一个或多个配体，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含四个二齿接头或由四个二齿接头组成，其中第一个二齿接头缀合至在位置A1处的氨基，所述第一个二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体；第二个二齿接头缀合至在位置B1处的氨基，所述第二个二齿接头连接到一个或多个配体，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)；第三个二齿接头缀合至在位置B3处的氨基，所述第三个二齿接头连接到一个或多个配体，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)；且第四个二齿接头缀合至在位置B28或B29处的氨基，所述第四个二齿接头连接到一个或多个配体，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含以下接头或由以下接头组成：(a)二齿接头，其中所述二齿接头的至少一个臂连接到配体氨基乙基岩藻糖(AEF)，所述二齿接头缀合至在位置A1处的氨基；或在位置B1处的氨基；或在位置B3处的氨基；或在位置B28处的氨基；或在位置B29处的氨基，和(b)连接到一个或多个配体的直链或三齿接头，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)，所述直链或三齿接头缀合至在位置A1处的氨基；或在位置B1处的氨基；或在位置B3处的氨基；或在位置B28处的氨基；或在位置B29处的氨基，无论哪个没有被所述二齿接头占据的位置。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含以下接头或由以下接头组成：(a)二齿接头，所述二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体，所述二齿接头缀合至在位置A1处的氨基，和(b)连接到一个或多个配体的直链或三齿接头，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)，所述直链或三齿接头缀合至在位置B1、B3、B28或B29处的氨基。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含以下接头或由以下接头组成：(a)二齿接头，所述二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体，所述二齿接头缀合至在位置B1处的氨基，和(b)连接到一个或多个配体的直链或三齿接头，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)，所述直链或三齿接头缀合至在位置A1、B3、B28或B29处的氨基。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含以下接头或由以下接头组成：(a)二齿接头，所述二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体，所述二齿接头缀合至在位置B3处的氨基，和(b)连接到一个或多个配体的直链或三齿接头，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)，所述直链或三齿接头缀合至在位置B1、A1、B28或B29处的氨基。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含以下接头或由以下接头组成：(a)二齿接头，所述二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体，所述二齿接头缀合至在位置B28处的氨基，和(b)连接到一个或多个配体的直链或三齿接头，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)，所述直链或三齿接头缀合至在位置B1、B3、A1或B29处的氨基。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含以下接头或由以下接头组成：(a)二齿接头，所述二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体，所述二齿接头缀合至在位置B29处的氨基，和(b)连接到一个或多个配体的直链或三齿接头，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)，所述直链或三齿接头缀合至在位置B1、B3、B28或A1处的氨基。
在特定实施方案中，所述胰岛素缀合物可以包含以下接头或由以下接头组成：(a)二齿接头，所述二齿接头具有连接到所述第一个二齿接头的一个臂的配体氨基乙基岩藻糖(AEF)和连接到所述二齿接头的其它臂的选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)的配体；(b)连接到一个或多个配体的第一个直链或三齿接头，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)；和(c)连接到一个或多个配体的第二个直链或三齿接头，每个配体独立地选自氨基乙基葡萄糖(AEG)、氨基乙基甘露糖(AEM)、氨基乙基二甘露糖(AEBM)、氨基乙基三甘露糖(AETM)、β-氨基乙基-N-乙酰基葡糖胺(AEGA)和氨基乙基岩藻糖(AEF)，其中每个接头各自缀合至在位置A1、B1、B3、B28或B29处的氨基，前提条件是，每个接头占据单独的位置，使得总计三个位置被占据。
胰岛素缀合物
该部分描述了一些示例性的胰岛素或胰岛素类似物缀合物。
在特定实施方案中，提供了包含至少一个岩藻糖的胰岛素和胰岛素类似物缀合物，其中所述缀合物被表征为对巨噬细胞甘露糖受体具有约0.5:1至约1:100、约1:1至约1:50、约1:1至约1:20、或约1:1至约1:10的通过功能性胰岛素受体磷酸化测定确定的EC50或IP与通过竞争性结合测定确定的IC50或IP之比。在其它方面，以上缀合物包含胰岛素或胰岛素类似物分子，所述胰岛素或胰岛素类似物分子共价地连接到至少一个具有第一臂和第二臂的支链接头，其中所述第一臂连接至包括第一糖的第一配体，且所述第二臂连接至包括第二糖的第二配体，且其中所述第一糖是岩藻糖，且其中所述缀合物被表征为对巨噬细胞甘露糖受体具有约0.5:1至约1:100、约1:1至约1:50、约1:1至约1:20、或约1:1至约1:10的通过功能性胰岛素受体磷酸化测定确定的EC50或IP与通过竞争性结合测定确定的IC50或IP之比。在特定方面，所述第二糖是岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、支链三糖、二甘露糖、三甘露糖、四甘露糖或支链三甘露糖。
术语“IP”表示拐点，它是曲线上的一个点，在该点处，曲率或凹度的符号从正变负或从负变正。一般而言，IP经常等于EC50或IC50。
在特定方面，通过竞争性结合测定确定的对巨噬细胞甘露糖受体的IC50或IP可以小于约100 nM和大于约0.5 nM。在特定方面，所述IC50或IP小于约50 nM且大于约1 nM；小于约25 nM且大于约1 nM；或小于约20 nM且大于约1 nM。在特定方面，通过功能性胰岛素受体磷酸化测定确定的IC50或IP可以小于约100 nM且大于约0.5 nM。在特定方面，所述IC50或IP小于约50 nM且大于约1 nM；小于约25 nM且大于约1 nM；或小于约20 nM且大于约1 nM。
在不同的实施方案中，所述缀合物可以具有通式(I)：
其中：
每次出现的表示所述缀合物的分支内的潜在重复；
每次出现的独立地是共价键、碳原子、杂原子或任选地被取代的选自酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环的基团；
每次出现的T独立地是共价键或二价的、直链的或支链的、饱和的或不饱和的、任选地被取代的C1-30烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基替换；
每次出现的R独立地是氢、合适的保护基、或酰基部分、芳基烷基部分、脂族部分、芳基部分、杂芳基部分或杂脂族部分；
-B是-T-LB-X；
每次出现的X独立地是配体；
每次出现的LB独立地是共价键或从T与X的共价缀合衍生出的基团；且，
其中n是1、2或3，前提条件是，所述胰岛素缀合至至少一个接头，其中所述配体之一是岩藻糖。
在特定方面，前述缀合物可以被表征为对巨噬细胞甘露糖受体具有约0.5:1至约1:100、约1:1至约1:50、约1:1至约1:20、或约1:1至约1:10的通过功能性胰岛素受体磷酸化测定确定的EC50或IP与通过竞争性结合测定确定的IC50或IP之比。
在特定实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物缀合物可以具有通式(II)：
其中：
每次出现的表示所述缀合物的分支内的潜在重复；
每次出现的独立地是共价键、碳原子、杂原子或任选地被取代的选自酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环的基团；
每次出现的T独立地是共价键或二价的、直链的或支链的、饱和的或不饱和的、任选地被取代的C1-30烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基替换；
每次出现的R独立地是氢、合适的保护基、或酰基部分、芳基烷基部分、脂族部分、芳基部分、杂芳基部分或杂脂族部分；
-B1是-T-LB1-岩藻糖
其中LB1是共价键或从T与X的共价缀合衍生出的基团；
-B2是-T-LB2-X
其中X是包含糖的配体，所述糖可以是岩藻糖、甘露糖或葡萄糖；且LB2是共价键或从T与X的共价缀合衍生出的基团；且，
其中n是1、2或3。
在特定方面，前述缀合物可以被表征为对巨噬细胞甘露糖受体具有约0.5:1至约1:100、约1:1至约1:50、约1:1至约1:20、或约1:1至约1:10的通过功能性胰岛素受体磷酸化测定确定的EC50或IP与通过竞争性结合测定确定的IC50或IP之比。
示例性基团的描述
(节点)
在特定实施方案中，每次出现的独立地是任选地被取代的选自酰基、脂族、杂脂族、芳基、杂芳基和杂环的基团。在一些实施方案中，每次出现的是相同的。在一些实施方案中，中央不同于所有其它出现的。在特定实施方案中，除了中央以外，所有出现的是相同的。
在一些实施方案中，是任选地被取代的芳基或杂芳基。
在一些实施方案中，是2、3、4、6或8元芳基或杂芳基。在一些实施方案中，是5或6元杂环基团。在特定实施方案中，是选自N、O或S的杂原子。在一些实施方案中，是氮原子。在一些实施方案中，是氧原子。在一些实施方案中，是硫原子。在一些实施方案中，是碳原子。在一些实施方案中，是结构。
T (间隔物)
在特定实施方案中，每次出现的T独立地是二价的、直链的或分支的、饱和的或不饱和的、任选地取代的C1-20烃链，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被下述基团替换：-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基。在特定实施方案中，T的1、2、3、4或5个亚甲基单元任选地且独立地被替换。在特定实施方案中，T是从C1-10、C1-8、C1-6、C1-4、C2-12、C4-12、C6-12、C8-12或C10-12烃链构建，其中T的一个或多个亚甲基单元任选地且独立地被下述基团替换：-O-、-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、杂环基、芳基或杂芳基。在一些实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被杂环基替换。在一些实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被三唑部分替换。在特定实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被-C(O)-替换。在特定实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被-C(O)N(R)-替换。在特定实施方案中，T的一个或多个亚甲基单元被-O-替换。
在特定实施方案中，T可以是结构
。
在特定实施方案中，本公开内容提供了包含1、2或3个二齿接头的胰岛素或胰岛素类似物缀合物，所述二齿接头各自独立地选自：
其中每个X独立地是包含糖的配体，前提条件是，缀合至胰岛素或胰岛素类似物的至少一个二齿接头包含在所述二齿接头的至少一个臂上的岩藻糖。在特定实施方案中，每个X可以独立地是
其中波浪线指示所述键连接至构成二齿接头的原子。EG是乙基葡萄糖，EM是乙基甘露糖，EF是乙基岩藻糖，ETM是乙基三甘露糖，EBM是乙基二甘露糖，EGA是乙基葡糖胺，EDG是乙基脱氧葡萄糖，EDF是乙基脱氧岩藻糖，且EDM是乙基脱氧甘露糖。
普通技术人员会理解，许多种缀合化学可以用于给X共价缀合T和/或给W共价缀合T (通常称作“组分”)。这样的技术是本领域广泛已知的，下面讨论了示例性的技术。组分可以直接地键合(即，没有插入化学基团)或经由间隔物(例如，偶联剂或共价链，其提供缀合的元件和接头的其它部分之间的某种物理分隔)间接地键合。应当理解，组分可以通过任意数目的化学键共价地结合到接头，所述化学键包括但不限于酰胺、胺、酯、醚、硫醚、异脲、亚胺等键。
在不同的实施方案中，使用本领域已知的“点击化学”（click chemistry）反应，可以使组分共价地结合到接头上。这些反应包括，例如，环化加成反应、亲核的开环反应和添加到碳-碳多重键上(例如，参见Kolb和Sharpless, Drug Discovery Today 8:1128-1137,2003和其中引用的参考文献，以及Dondoni, Chem. Asian J. 2:700-708, 2007和其中引用的参考文献)。如上面所讨论的，在不同的实施方案中，所述组分可以经由天然的或化学添加的侧基结合到接头上。一般而言，应当理解，一对反应基团的第一个和第二个成员(例如，羧基和胺基，它们反应生成酰胺键)可以存在于所述组分和接头的任一个上(即，2个成员的相对位置是无关的，只要它们反应生成缀合物)。下面更详细地讨论示例性的连接。
特定组分可以天然地具有超过一个相同的化学反应部分。在一些实例中，选择化学反应类型和条件以在那些位点中的仅一个处选择性地反应组分是可能的。例如，在通过反应性的胺缀合胰岛素的情况下，在特定实施方案中，N-端α-Phe-B1可能是比N-端α-Gly-A1和ε-Lys-B29更合乎需要的连接位点，以保留胰岛素生物活性(例如，参见Mei等人,Pharm. Res. 16:1680-1686, 1999和其中引用的参考文献，以及Tsai等人, J. Pharm. Sci. 86:1264-1268, 1997)。在胰岛素和十六醛(醛-封端的分子)之间的一个示例性反应中，研究人员发现：在有氰基硼氢化钠存在下，以1:6 (胰岛素:醛mol/mol)的比例，在含有54%异丙醇的1.5M pH6.8水杨酸钠水溶液中混合2种组分过夜，导致向单取代的Phe-B1仲胺-缀合的产物的超过80%转化率(Mei等人, Pharm. Res. 16:1680-1686, 1999)。他们的研究证实，溶剂、pH和胰岛素:醛比的选择都影响反应的选择性和产率。但是，在大多数情况下，难以通过化学反应条件的选择来实现选择性。因此，在特定实施方案中，可以有利地在除了希望发生反应的位点以外的所有位点选择性地保护组分(例如，胰岛素)，然后在已经反应和纯化物质以后，进行去保护步骤。例如，在文献中可得到许多选择性地保护胰岛素胺基的例子，包括在酸性(BOC)、弱酸性(柠康酸酐)和碱性(MSC)条件下可以去保护的那些(例如，参见Tsai等人, J. Pharm. Sci. 86:1264-1268, 1997; Dixon等人, Biochem. J.109:312-314, 1968;和Schuettler等人, D. Brandenburg Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 360:1721, 1979)。在一个实例中，可以用叔丁氧基羰基(BOC)选择性地保护Gly-A1和Lys-B29胺，然后通过在90%三氟醋酸(TFA)/10%苯甲醚溶液中在4℃温育1小时进行缀合后，除去该BOC。在一个实施方案中，将胰岛素干粉溶解在无水DMSO中，随后加入过量的三乙胺。向该溶液中，缓慢地加入大约2当量的二碳酸二叔丁酯在THF中的溶液，然后将该溶液混合30-60分钟。反应后，将粗溶液倒入过量的丙酮中，随后逐滴加入稀HCl，以沉淀反应过的胰岛素。将沉淀物离心，用丙酮洗涤，并在真空下彻底干燥。
使用制备反相HPLC或离子交换色谱法(例如，参见Tsai等人, J. Pharm. Sci.86:1264-1268, 1997)，可以从未反应的胰岛素、不希望的二-BOC异构体和单-BOC和三-BOC副产物中，分离出希望的二-BOC保护的产物。在反相HPLC的情况下，将粗产物在含有0.1%TFA的70%水/30%乙腈中的溶液装载上C8柱，并用递增的乙腈梯度洗脱。收集希望的二-BOC峰，除去乙腈，并低压冻干以得到产物。
在特定实施方案中，所述胰岛素寡糖缀合物可以包含胰岛素或胰岛素类似物和至少一个具有第一臂和第二臂的二齿接头，其中所述第一臂连接至包括第一糖的第一配体，且所述第二臂连接至包括第二糖的第二配体，且其中对于至少一个二齿接头，所述第一糖是岩藻糖，且其中至少一个二齿接头缀合至胰岛素或胰岛素类似物的A-链或B-链的N-端氨基酸的α氨基或缀合至胰岛素或胰岛素类似物的A-链或B-链的赖氨酸残基的ε氨基。在特定实施方案中，所述缀合物可以包括至少两个接头，其中至少一个接头是包含岩藻糖的二齿接头。在特定实施方案中，所述缀合物可以包括至少三个接头，其中至少一个接头是包含岩藻糖的二齿接头。
在特定实施方案中，所述至少一个二齿接头可以具有如上所示的式A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z、AA、AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、AI、AJ或AK，其中X是糖；前提条件是，对于至少一个二齿接头，所述至少一个二齿接头的至少一个臂上的X是岩藻糖。在特定实施方案中，X具有如上所示的式EG、EM、EBM、EGA、EF、EFβ、EBM、ETM、EDG、EDF或EDM。
在特定实施方案中，所述胰岛素类似物可以包含：含有GIVEQCCX1SICSLYQLENYCX2(SEQ ID NO: 8)的序列的A链序列；和含有X3LCGX4X5LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 9)或X8VNQX3LCGX4X5LVEALYLVCGERGFFYTX6X7 (SEQ ID NO: 10)的序列的B链序列，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2是天冬酰胺或甘氨酸；
X3选自组氨酸和苏氨酸；
X4选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X5选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸；
X6是天冬氨酸-赖氨酸二肽、赖氨酸-脯氨酸二肽或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X7是苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽；且
X8选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸。
在特定实施方案中，所述A-链可以具有在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列，且所述B-链可以具有在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述胰岛素类似物是desB30胰岛素类似物、desB29-B30胰岛素类似物、des B28-B30胰岛素类似物、des B27-B30胰岛素类似物或des B26-B30胰岛素类似物。
在特定实施方案中，本发明的胰岛素寡糖缀合物可以具有下式
其中R1、R2和R3各自独立地是H (氢)、或在其上面具有包括糖的配体的直链接头、或具有第一臂和第二臂的二齿接头，其中所述第一臂连接至包括第一糖的第一配体，且所述第二臂连接至包括第二糖的第二配体，前提条件是，R1、R2或R3中的至少一个是二齿接头，其中所述第一糖是岩藻糖。在一个特定实施方案中，R1、R2或R3各自独立地是H (氢)或具有如上所示的式A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z、AA、AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、AI、AJ或AK的二齿接头，其中X是糖；前提条件是，R1、R2或R3中的至少一个是二齿接头，且至少一个二齿接头的至少一个臂上的X是岩藻糖。在特定实施方案中，X具有如上所示的式EG、EM、EBM、EGA、EF、EFβ、EBM、ETM、EDG、EDF或EDM。
示例性的本发明的人胰岛素寡糖缀合物(IOC)包括具有下述结构的IOC。
持续释放制剂
在特定实施方案中，可能有利地以持续方式(即，以表现出比可溶性重组人胰岛素更持久的吸收特性的形式)施用胰岛素缀合物。这将提供持续的缀合物水平，该水平对葡萄糖波动做出响应的时标(timscale)与典型葡萄糖波动时标更密切相关(即，小时，而不是分钟)。在特定实施方案中，当施用给在非高血糖条件(即，禁食条件)下的哺乳动物时，所述持续释放制剂可以表现出缀合物的零级释放。
应当理解，可以使用提供持续吸收特性的任意制剂。在特定实施方案中，这可以通过组合所述缀合物和减慢它向全身循环中的释放性质的其它成分来实现。例如，PZI (鱼精蛋白锌胰岛素)制剂可以用于该目的。本公开内容包括这些PZI制剂的无定形形式和结晶形式。
因而，在特定实施方案中，本公开内容的制剂包含约0.05至约10 mg鱼精蛋白/mg缀合物。例如，约0.2至约10 mg鱼精蛋白/mg缀合物，例如，约1至约5 mg鱼精蛋白/mg缀合物。
在特定实施方案中，本公开内容的制剂包含约0.006至约0.5 mg锌/mg缀合物。例如，约0.05至约0.5 mg锌/mg缀合物，例如，约0.1至约0.25 mg锌/mg缀合物。
在特定实施方案中，本公开内容的制剂包含比例(w/w)在约100:1至约5:1（例如，约50:1至约5:1，例如，约40:1至约10:1）范围内的鱼精蛋白和锌。在特定实施方案中，本公开内容的PZI制剂包含比例(w/w)在约20:1至约5:1（例如，约20:1至约10:1、约20:1至约15:1、约15:1至约5:1、约10:1至约5:1、约10:1至约15:1）范围内的鱼精蛋白和锌。
可以在PZI制剂中包括一种或多种下述组分：抗微生物防腐剂、等渗剂和/或未缀合的胰岛素分子。
在特定实施方案中，本公开内容的制剂包含抗微生物防腐剂(例如，间甲酚、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)。在特定实施方案中，所述抗微生物防腐剂是间甲酚。例如，在特定实施方案中，制剂可以包括约0.1至约1.0%v/v间甲酚。例如，约0.1至约0.5%v/v间甲酚，例如，约0.15至约0.35%v/v间甲酚。
在特定实施方案中，本公开内容的制剂包含多元醇作为等渗剂(例如，甘露醇、丙二醇或甘油)。在特定实施方案中，所述等渗剂是甘油。在特定实施方案中，所述等渗剂是盐，例如NaCl。例如，制剂可以包含约0.05至约0.5 M NaCl，例如，约0.05至约0.25 M NaCl或约0.1至约0.2 M NaCl。
在特定实施方案中，本公开内容的制剂包含一定量的未缀合的胰岛素分子。在特定实施方案中，制剂包含摩尔比在约100:1-1:1（例如，约50:1-2:1或约25:1-2:1）范围内的缀合的胰岛素分子与未缀合的胰岛素分子。
本公开内容也包括使用小分子制剂领域众所周知的标准的持续的(也称作延长的)释放制剂(例如，参见Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第19版, MackPublishing Co., Easton, PA, 1995)。本公开内容也包括使用依赖于泵或阻碍扩散来逐步递送缀合物的装置。在特定实施方案中，通过使用修饰的胰岛素分子，可以(额外地或可替代地)提供长效制剂。例如，在制备缀合物时，可以使用甘精胰岛素(来得时®)或地特胰岛素(LEVEMIR®)来替代野生型人胰岛素。甘精胰岛素是一种示例性的长效胰岛素类似物，其中在A-链的位置A21处的Asn已经被甘氨酸替代，且2个精氨酸残基是在B-链的C-端处。这些变化的作用是迁移等电点，从而产生在生理pH不溶的、但是在pH 4可溶的胰岛素。地特胰岛素是另一种长效胰岛素类似物，其中在B-链的位置B30处的Thr已经被删除，且C14脂肪酸链已经连接到在位置B29处的Lys。
缀合物的用途
在另一个方面，本公开内容提供了使用胰岛素缀合物的方法。一般而言，所述胰岛素缀合物可以用于响应于糖(例如，葡萄糖或外源性糖诸如甘露糖、α-甲基甘露糖、L-岩藻糖等)可控地给需要的个体提供胰岛素。本公开内容包括通过施用本公开内容的胰岛素缀合物来治疗糖尿病。尽管所述胰岛素缀合物可以用于治疗任意患者(例如，狗、猫、牛、马、绵羊、猪、小鼠等)，它们最优选地用于治疗人。可以通过任意途径将胰岛素缀合物施用给患者。一般而言，本公开内容包括通过下述途径给药：口服、静脉内、肌肉内、动脉内、皮下、心室内、透皮、直肠、阴道内、腹膜内、局部(作为散剂、软膏剂或滴剂)、经颊或作为口或鼻喷雾剂或气雾剂。用于这些不同途径的药物组合物的配制和生产的一般考虑因素，可以参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第19版, Mack Publishing Co., Easton,PA, 1995。在不同的实施方案中，所述缀合物可以皮下给药，例如，通过注射。所述胰岛素缀合物可以溶解在载体中，以便于递送。例如，所述载体可以是水溶液，包括，但不限于无菌水、盐水或缓冲的盐水。
一般而言，施用治疗有效量的胰岛素缀合物。术语“治疗有效量”是指：足以在合理的收益/风险比（这包括胰岛素缀合物的效能和毒性的平衡）治疗糖尿病的胰岛素缀合物的量。在不同的实施方案中，胰岛素的平均日剂量是在10-200 U的范围内，例如，25-100 U(其中1单位的胰岛素是~ 0.04 mg)。在特定实施方案中，在每天基础上，施用具有这些胰岛素剂量的量的缀合物。在特定实施方案中，在每周基础上，施用具有5-10倍于这些胰岛素剂量的量的缀合物。在特定实施方案中，在每两周基础上，施用具有10-20倍于这些胰岛素剂量的量的缀合物。在特定实施方案中，在每月基础上，施用具有20-40倍于这些胰岛素剂量的量的缀合物。
在特定实施方案中，本公开内容的缀合物可以用于治疗患者(例如，哺乳动物或人患者)的高血糖症。在特定实施方案中，所述患者是糖尿病患者。但是，本发明的方法不限于治疗糖尿病患者。例如，在特定实施方案中，缀合物可以用于治疗具有与受损的血糖控制有关的感染的患者的高血糖症。在特定实施方案中，缀合物可以用于治疗糖尿病。
在特定实施方案中，当将本公开内容的胰岛素缀合物或制剂施用给患者(例如，哺乳动物患者)时，它比未缀合形式的胰岛素分子诱导更少的低血糖症。在特定实施方案中，与包含未缀合形式的胰岛素分子的制剂相比，本公开内容的制剂在患者(例如，哺乳动物或人患者)中诱导更低的HbA1c值。在特定实施方案中，与包含未缀合形式的胰岛素分子的制剂相比，所述制剂产生的HbA1c值降低了至少10%(例如，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%)。在特定实施方案中，所述制剂产生小于7%（例如，在约4至约6%的范围内）的HbA1c值。在特定实施方案中，包含未缀合形式的胰岛素分子的制剂产生超过7%（例如，约8至约12%）的HbA1c值。
外源性触发剂
如以前所述的，本文所述的方法、缀合物和组合物不限于葡萄糖响应性的缀合物。如在实施例中所证实的，几种示例性的胰岛素缀合物也对外源糖（诸如α-甲基甘露糖）有响应。因此，应当理解，在特定实施方案中，通过外源性地施用除了葡萄糖以外的糖（诸如α-甲基甘露糖）或可以改变缀合物的PK或PD性质的任意其它糖，可以触发胰岛素缀合物。
一旦已经如上所述施用缀合物(例如，作为持续释放制剂)，通过施用合适的外源糖，可以触发它。在特定实施方案中，施用触发量的外源糖。本文使用的外源糖的“触发量”是足以造成缀合物的至少一种PK和/或PD性质(例如，前面讨论的Cmax、AUC、半衰期等)的变化的量。应当理解，缀合物的任一种前述施用方法同样适用于外源糖。还应当理解，缀合物和外源糖的施用方法可以是相同的或不同的。在不同的实施方案中，施用方法是不同的(例如，为了例证目的，可以在每周基础上，通过皮下注射，施用缀合物，同时在每天基础上，口服施用外源糖)。外源糖的口服施用具有特别的价值，因为它会促进患者顺应性。一般而言，应当理解，缀合物的PK和PD性质与外源糖的PK特性有关。因而，通过控制外源糖的PK特性，可以调节（tailor）缀合物PK和PD性质。如本领域众所周知的，基于使用的剂量、途径、频率和制剂，可以调节外源糖的PK特性。例如，如果需要缀合物的短且强烈的活化，则可以使用口服立即释放制剂。相反，如果需要缀合物的更长的、强烈程度更低的活化，则可以改为使用口服延长释放制剂。立即和延长释放制剂的配制和生产的一般考虑因素，可以参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第19版, Mack Publishing Co., Easton,PA, 1995。
还应当理解，本公开内容的缀合物和外源糖的相对施用频率可以是相同的或不同的。在特定实施方案中，比缀合物更频繁地施用外源糖。例如，在特定实施方案中，可以每天施用缀合物，同时每天施用外源糖超过1次。在特定实施方案中，可以每周2次、每周1次、每2周1次或每月1次地施用缀合物，同时每天施用外源糖。在特定实施方案中，每月施用缀合物，并每周2次、每周1次或每2周1次地施用外源糖。本领域技术人员会认识到这些方案的其它变化，并随使用的缀合物和制剂的性质而变化。
以下实施例意图促进对本发明的进一步理解。
实施例
一般规程
所有化学物质购自商业来源，除非另外指出。使用无水溶剂和试剂在氮气或氩气下执行对水分或空气敏感的反应。通过分析型薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法-质谱法(HPLC-MS)或超高效液相色谱法-质谱法(UPLC-MS)监测反应的进程。在用硅胶60F-254（层厚度0.25 mm）预包被的E. Merck TLC平板上执行TLC。使用254 nm UV和/或通过暴露于钼酸铵铈(CAM)或对-茴香醛染色溶液随后炭化，使平板显影。使用Supelco AscentisExpress C18 2.7 μm 3.0x100 mm柱，在Agilent 1100系列HPLC上进行高效液相色谱法(HPLC)，用梯度10:90-99:1 v/v CH3CN/H2O + v 0.05%TFA历时4.0 min，然后在98:2 v/vCH3CN/H2O + v 0.05%TFA保持0.75 min；流速1.0 mL/min, UV范围200-400 nm (LC-MS方法A)。以阳离子检测模式用电喷射电离在Waters Micromass®ZQTM上执行质量分析，且质荷比的扫描范围是170-900或500-1500。使用Waters Acquity™UPLC®BEH300 C4 1.7 μm2.1x100 mm柱在Waters Acquity™UPLC®系统上执行超高效液相色谱法(UPLC)，用梯度10:90-90:10 v/v CH3CN/H2O + v 0.1%TFA历时4.0 min和90:10-95:5 v/v CH3CN/H2O + v0.1%TFA历时0.5 min；流速0.3 mL/min, UV波长200-300 nm (UPLC方法A)。替代性的UPLC条件记录为UPLC方法B (Waters Acquity™UPLC®BEH C18 1.7 μm 2.1x100 mm柱，用梯度10:90-70:30 v/v CH3CN/H2O + v 0.1%TFA历时4.0 min和70:30-95:5 v/v CH3CN/H2O + v0.1%TFA历时40秒；流速0.3 mL/min, UV波长200-300 nm), UPLC方法C (Waters Acquity™UPLC®BEH C18 1.7 μm 2.1x100 mm柱，用梯度60:40-100:0 v/v CH3CN/H2O + v 0.1%TFA历时4.0 min和100:0-95:5 v/v CH3CN/H2O + v 0.1%TFA历时40秒；流速0.3 mL/min, UV波长200-300 nm), UPLC方法D (Waters Acquity™UPLC®BEH300 C4 1.7 μm 2.1x100 mm柱，用梯度10:90-50:50 v/v CH3CN/H2O + v 0.1%TFA历时4.3 min和50:50-70:30 v/v CH3CN/H2O + v 0.1%TFA历时0.5 min；流速0.3 mL/min, UV波长200-300 nm), UPLC方法E(Waters Acquity™UPLC®BEH C18 1.7 μm 2.1x100 mm柱，用梯度10:90-60:40 v/vCH3CN/H2O + v 0.1%TFA历时4.3 min和60:40-90:10 v/v CH3CN/H2O + v 0.1%TFA历时0.5min；流速0.3 mL/min, UV波长200-300 nm), UPLC方法F (Waters Acquity™UPLC®BEHC18 1.7 μm 2.1x100 mm柱，用梯度60:40-100: 0 v/v CH3CN/H2O + v 0.1%TFA历时4.0min和100: 0-95:5 v/v CH3CN/H2O + v 0.1%TFA历时0.4 min；流速0.3 mL/min, UV波长200-300 nm),和UPLC方法G (Waters Acquity™UPLC®BEH C8 1.7 μm 2.1x100 mm柱，用梯度10:90-55:45 v/v CH3CN/H2O + v 0.1%TFA历时4.2 min和100: 0-95:5 v/v CH3CN/H2O+ v 0.1%TFA历时0.4 min；流速0.3 mL/min, UV波长200-300 nm。以阳离子检测模式用电喷射电离在Waters Micromass®LCT Premier™XE上执行质量分析，且质荷比的扫描范围是300-2000。通过将理论分子量与使用UPLC-MS测量的实验值进行对比，证实生产的胰岛素缀合物的身份。为了确定糖修饰的位置，具体地，将胰岛素缀合物进行DTT处理(对于a/b链)或Glu-C消化(用还原和烷基化)，然后通过LC-MS分析得到的肽。基于测量的质量，推断糖位置。
使用Biotage Flash Chromatography设备(Dyax Corp.)或CombiFlash®Rf仪器(Teledyne Isco)，执行快速色谱法。在指出大小的预填充筒内的硅胶(20-70 μm, 60Å孔径)上进行正相色谱法。在指出大小的预填充筒内的C18-结合的硅胶(20-60 μm, 60-100Å孔径)上进行反相色谱法。使用Waters Delta Pak C4 15 μm, 300Å, 50x250 mm柱或Kromasil®C8 10 μm, 100Å, 50x250 mm柱，流速85 mL/min，以指出的梯度，在Gilson 333-334二元系统上执行制备级HPLC。在旋转蒸发器上在减压下进行溶液的浓缩，或在VirTisFreezemobile Freeze Dryer (SP Scientific)上冷冻干燥。
在500 MHz (或另外指定)波谱仪中在指出的氘化溶剂中获取1H NMR谱。以百万份数(ppm)报告化学位移。使用四甲基硅烷(TMS)或氘化溶剂的残余质子峰作为内部参照。以赫兹(Hz)为单位报告偶合常数(J)。
缩写：乙酸(AcOH)，乙腈(AcCN)，水性的(aq)，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐) (HATU)，乙酸乙酯(EtOAc)，二乙基醚(乙醚或Et2O)，N,N-二异丙基乙胺或Hünig氏碱(DIPEA)，(4-二甲基氨基)吡啶(DMAP)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，乙酸乙酯(EtOAc)，N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，克(g)，1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)，小时(h或hr)，质谱图(ms或MS)，微升(μL)，毫克(mg)，毫升(mL)，毫摩尔(mmol)，分钟(min)，五氟苯酚-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(PFTU)，石油醚(PE)，保留时间(Rt)，室温(rt)，饱和的(sat.或sat’d)，饱和的氯化钠水溶液(盐水)，三乙胺(TEA)，三氟乙酸(TFA)，四氢呋喃(THF),和N,N,N’,N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲鎓四氟硼酸盐(TSTU)。
实施例1
描述了具有以下结构的寡糖接头6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)-6-氧代己酰胺(ML-1)的合成。
步骤A: 6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酸苄酯
在0℃向6-(苄氧基)-6-氧代己酸(3.3 g, 13.97 mmol)在DMF (50 mL)中的溶液中加入TSTU (4.3 g, 14.28 mmol)和DIPEA (2.5 mL, 14.31 mmol)。在0℃搅拌1小时以后，将反应混合物在Et2O和水之间分配。将有机层分离，并将水层用乙醚(2x150 mL)进一步萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到标题化合物。UPLC方法B：C17H19NO6的计算值333.12，观察到的m/e: 334.10 [M+1]; Rt = 3.75 min。1H NMR(CDCl3) δ 7.40-7.30 (5H, m), 5.10 (2H, s), 2.80 (4H, s), 2.62-2.58 (2H, m),2.41- 2.37 (2H, m), 1.80-1.72 (4H, m)。
步骤B: 6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸苄酯
在0℃向2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷(1.23 g, 2.247 mmol, WO 2010/088294 A1)在DMF (20 mL)中的溶液中加入6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酸苄酯(1.02 g, 3.06 mmol)和TEA (0.5 mL, 3.59 mmol)。在0℃搅拌1小时以后，将反应混合物浓缩，并通过C18反相硅胶柱(275 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-40%的AcCN在H2O中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B：C33H51NO19的计算值765.31，观察到的m/e = 766.26 [M+1]; Rt = 4.04min。1H NMR (D2O) δ 7.43-7.37 (5H, m), 5.14 (2H, s), 5.07-5.06 (1H, m), 4.82-4.81 (1H, m), 4.77-4.76 (1H, m), 4.06-4.01 (2H, m), 3.96-3.92 (2H, m), 3.87-3.81 (5H, m), 3.79-3.77 (1H, m), 3.74-3.67 (5H, m), 3.65-3.60 (4H, m), 3.53-3.49 (1H, m), 3.37-3.35 (2H, m), 2.43-2.40 (2H, m), 2.22-2.19 (2H, m), 1.62-1.52 (4H, m)。
步骤C: 6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸
将6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸苄酯(1.15 g, 1.502 mmol)和Pd/C (80mg, 0.075 mmol)在水(10 mL)中的混合物在H2气球下在室温搅拌16小时。将催化剂滤出，并用H2O (3x10 mL)洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物。UPLC方法B：C26H45NO19的计算值675.26，观察到的m/e: 676.21 [M+1]; Rt = 3.50 min。
步骤D: 6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→ 3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)-6-氧代己酰胺
在0℃向6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸(1.55 g, 2.294 mmol)在DMF (22mL)中的溶液中加入TSTU (760 mg, 2.52 mmol)和DIPEA (0.52 mL, 2.98 mmol)。在0℃搅拌1小时以后，通过加入TFA (371 μL, 4.82 mmol)淬灭反应物，并将得到的混合物浓缩至约3 mL。将残余物经由自动移液器逐滴转移至含有无水乙腈(45mL)的试管。将白色沉淀物通过离心(3000 rpm, 15 min，在4℃)进行收集，用无水AcCN (1 mL)洗涤，并干燥以产生标题化合物。UPLC方法B：C30H48N2O21的计算值772.27，观察到的m/e: 773.23 [M+1]; Rt =3.65 min。1H NMR (D2O) δ 5.07-5.06 (1H, m), 4.84-4.83 (1H, m), 4.79-4.78 (1H,m), 4.06-4.01 (2H, m), 3.96-3.93 (2H, m), 3.87-3.83 (5H, m), 3.80-3.78 (1H,m), 3.75-3.69 (5H, m), 3.67-3.61 (4H, m), 3.57-3.52 (1H, m), 3.41-3.38 (2H,m), 2.91 (4H, s), 2.75-2.71 (2H, m), 2.29-2.25 (2H, m), 1.75-1.58 (4H, m)。
实施例2
描述了具有以下结构的寡糖接头6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-(2-{[3-O-(α-D-吡喃型甘露糖基)-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)-6-氧代己酰胺(ML-2)的合成。
步骤A: 2-叠氮基乙基2,4-二-O-苯甲酰基-6-O-三苯甲基-β-D-吡喃甘露糖苷
在250 ml圆底烧瓶中，将2-叠氮基乙基2,4-二-O-苯甲酰基-α-D-吡喃甘露糖苷(1.0 g, 2.186 mmol；参见WO 2010/088294 A1, 通过引用并入本文)溶解在吡啶(50 mL)中。向以上溶液中加入DMAP (13 mg, 0.109 mmol)，随后加入三苯甲基氯(762 mg, 2.73mmol)。在80℃搅拌18小时以后，将反应混合物浓缩。通过硅胶(40 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-50%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法C: m/e=722.2955, [M+Na]; Rt=4.50。1H NMR (CDCl3) δ 7.0-8.3 (m, 25H), 5.8 (t, 1H), 5.5(m, 1H), 5.2 (s, 1H), 4.3 (m, 1H), 4.1 (m, 2H), 4.0 (m, 1H), 3.5 (m, 1H), 3.4(m, 2H), 3.2 (dd, 1H), 2.7 (d, 1H)。
步骤B: 2-叠氮基乙基2,4-二-O-苯甲酰基-3-O-(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D- 吡喃型甘露糖基)-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃甘露糖苷
在100 mL圆底烧瓶中加入2-叠氮基乙基2,4-二-O-苯甲酰基-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(400 mg, 0.572 mmol)、2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-1-O-(2,2,2-三氯乙亚胺酰基(ethanimidoyl))-α-D-吡喃型甘露糖(508 mg, 0.686 mmol)和4Å分子筛(300 mg)。向以上混合物中加入CH2Cl2 (5 mL)。将反应混合物冷却至-78℃，向其中加入TMSOTf (10.33µL, 0.057 mmol)。使混合物逐渐温热至0℃并搅拌30 min。然后将反应物用饱和NaHCO3淬灭，并穿过硅藻土垫过滤。将滤液用CH2Cl2 (20 mL)稀释，用盐水和水洗涤。将有机相经MgSO4干燥，并浓缩。通过硅胶(80 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-100%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题产物。LC-MS方法A: m/e = 1278.80 [M+1]; Rt = 3.14 min。1HNMR (CDCl3) δ 7.1-8.3 (m, 30H), 6.0 (t, 1H), 5.8 (t, 1H), 5.7 (m, 2H), 5.4(s, 1H), 5.38 (m, 1H), 5.2 (s, 1H), 4.7 (dd, 1H), 4.6 (dd, 1H), 4.45 (m, 1H),4.35 (dd, 1H), 3.9-4.0 (m, 2H), 3.8 (m, 2H), 3,7 (m, 1H), 3.4 (m, 2H)。
步骤C: 2-叠氮基乙基2,4-二-O-苯甲酰基-3-O-(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D- 吡喃型甘露糖基)-α-D-吡喃甘露糖苷
在50 mL圆底烧瓶中加入2-叠氮基乙基2,4-二-O-苯甲酰基-3-O-(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基)-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(450 mg, 0.352mmol)和CH2Cl2 (3 mL)。向以上溶液中加入TFA (3 mL, 38.9 mmol)。在25℃搅拌1小时以后，将反应混合物用CH2Cl2 (10 mL)稀释，用水(3x15 mL)和盐水(10 mL)洗涤。将有机相经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶(40 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-100%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题产物。LC-MS方法A: m/e = 1053.57 [M+18]; Rt = 2.73min。1H NMR (CDCl3) δ 7.0-8.5 (m, 45H), 6.1 (t, 1H), 6.0 (t, 1H), 5.7 (m, 2H),5.4 (s, 1H), 5.3 (s, 1H), 5.25 (s, 1H), 4.6 (m, 2H), 4.5 (m, 1H), 4.3 (m,1H), 4.0-4.2 (m, 3h), 3.8 (m, 1H), 3.3-3.5 (m, 3H)。
步骤D: 2-叠氮基乙基3-O-α-D-吡喃型甘露糖基-α-D-吡喃甘露糖苷
在50 mL圆底烧瓶中加入2-叠氮基乙基2,4-二-O-苯甲酰基-3-O-(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基)-α-D-吡喃甘露糖苷(350 mg, 0.338 mmol)和CH3OH (5mL)。向以上溶液中逐滴加入NaOCH3 (浓)直到pH >10。将反应混合物在25℃搅拌6小时。向以上溶液中加入Dowex H+ (50W x 8-200)树脂直到pH ~ 7。将固体树脂滤出，并将滤液浓缩，得到标题化合物。LC-MS方法A: m/e = 434.00 [M+1]; Rt = 0.44 min。
步骤E: 2-氨基乙基3-O-α-D-吡喃型甘露糖基-α-D-吡喃甘露糖苷
在50 mL圆底烧瓶中，将2-叠氮基乙基3-O-α-D-吡喃型甘露糖基-α-D-吡喃甘露糖苷(139 mg, 0.338 mmol)溶解在水/CH3OH (v/v 1:1, 5 mL)中。向以上溶液中加入Pd/C(10%, 36 mg, 0.034 mmol)。将反应混合物在H2气球下在25℃搅拌18小时。将混合物穿过硅藻土垫过滤，并将滤液浓缩，得到标题化合物。LC-MS方法A: m/e = 386.08 [M+1]; Rt =0.24 min。
步骤F: 6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-(2-{[3-O-(α-D-吡喃型甘露糖 基)-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)-6-氧代己酰胺
使用与关于ML-1所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用2-氨基乙基3-O-α-D-吡喃型甘露糖基-α-D-吡喃甘露糖苷替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e =611.201 [M+1]: Rt = 1.82 min。
实施例3
描述了具有以下结构的寡糖接头6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-(2-{[6-O-(α-D-吡喃型甘露糖基)-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)-6-氧代己酰胺(ML-3)的合成。
步骤A: 2-叠氮基乙基2,3,4-三-O-苯甲酰基-6-三苯甲基-α-D-吡喃甘露糖苷
在250 ml圆底烧瓶中，将2-叠氮基乙基2,4-二-O-苯甲酰基-α-D-吡喃甘露糖苷(1.0 g, 1.429 mmol)溶解在吡啶(20 mL)中。在0℃向以上溶液中加入苯甲酰氯(166 μL,1.429 mmol)。在室温搅拌18小时以后，将混合物浓缩，并将残余物溶解在EtOAc (20 mL)中，用水(10 mL)和盐水(10 mL)洗涤。将有机相经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶(40 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-50%EtOAc在己烷中的溶液洗脱，得到标题化合物。LC-MS方法A: m/e = 804.44 [M+1]; Rt = 2.88 min。1H NMR (CDCl3) δ 7.0-8.2 (m, 30H),6.1 (t, 1H), 5.8(dd, 1H), 5.2 (d, 1H), 4.2-4.3 (m, 1H), 4.0-4.1 (m, 1H), 3.8(m, 1H), 3.6 (m, 1H), 3.5 (m, 1H), 3.4 (dd, H), 3.3 (dd, 1H)。
步骤B: 2-叠氮基乙基2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃甘露糖苷
在100 mL圆底烧瓶中，将2-叠氮基乙基2,3,4-三-O-苯甲酰基-6-三苯甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(1.1 g, 1.368 mmol)溶解在CH2Cl2 (10 mL)中。向以上溶液中加入TFA (10mL, 130 mmol)。在25℃搅拌18小时以后，将混合物用CH2Cl2 (20 mL)稀释，用盐水(10mL)和饱和NaHCO3洗涤直到pH ~ 7。将有机相经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶(40 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-100%EtOAc在己烷中的溶液洗脱，得到标题化合物。LC-MS方法A:m/e = 579.12 [M+18]和584.10 [M+Na]; Rt = 2.22 min。1H NMR (CDCl3) δ 7.2-8.2 (m,15H), 6.0 (dd, 1H), 5.9(t, 1H), 5.7 (m, 1H), 5.2 (br-s, 1H), 4.1-4.2 (m, 2H),3.85 (m, 1H), 3.7-3.8 (m, 2H), 3.6 (m, 1H, 3,5 (m, 1H)。
步骤C: 2-叠氮基乙基2,3,4-三-O-苯甲酰基-6-O-(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α- D-吡喃型甘露糖基)-α-D-吡喃甘露糖苷
在100 mL圆底烧瓶中加入2-叠氮基乙基2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃甘露糖苷(720 mg, 1.282 mmol)、2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-1-O-(2,2,2-三氯乙亚胺酰基(ethanimidoyl))-α-D-吡喃型甘露糖(1.14 g, 1.539 mmol)和4Å分子筛(300 mg)。向以上混合物中加入CH2Cl2 (10 mL)。将反应混合物冷却至-78℃。向以上混合物中加入TMSOTf(23.2µL, 0.128 mmol)。使混合物逐渐温热至0℃并搅拌30 min。然后用饱和NaHCO3淬灭反应，并将混合物穿过硅藻土垫过滤。将滤液用CH2Cl2 (20 mL)稀释，用盐水和水洗涤。将有机相经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶(80 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-100%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题产物。LC-MS方法A: m/e = 1157.64 [M+18]和1163.52[M+Na]; Rt = 3.01 min。1H NMR (CDCl3) δ 7.2-8.3 (m, 25H), 6.0 (t, 1H), 5.8 (t,1H), 5.7 (m, 2H), 5.4 (s, 1H), 5.38 (m, 1H), 5.2 (s, 1H), 4.7 (dd, 1H), 4.6(dd, 1H), 4.45 (m, 1H), 4.35 (dd, 1H), 3.9-4.0 (m, 2H), 3.8 (m, 2H), 3,7 (m,1H), 3.4 (m, 2H)。
步骤D: 6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-(2-{[6-O-(α-D-吡喃型甘露糖 基)-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)-6-氧代己酰胺
使用与关于ML-2所述的那些规程类似的规程，在步骤D中用2-叠氮基乙基2,3,4-三-O-苯甲酰基-6-O-(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基)-α-D-吡喃甘露糖苷替换2-叠氮基乙基2,4-二-O-苯甲酰基-3-O-(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基)-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 611.202 [M+1]; Rt = 1.88min。
实施例4
描述了具有以下结构的寡糖接头6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-6-氧代己酰胺(ML-4)的合成。
使用与关于ML-1所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(Bilstein J. Org. Chem. 2010, 6, 699-703)替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 433.14 [M+1]; Rt = 2.14 min。
实施例5
描述了具有以下结构的寡糖接头6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-[2-(α-D-吡喃型甘露糖基氧基)乙基]-6-氧代己酰胺(ML-5)的合成。
使用与关于ML-1所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用2-氨基乙基α-D-吡喃甘露糖苷(Eur. J. Org. Chem. 2002, 79-86)替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e= 449.14 [M+1], Rt = 1.90 min。
实施例6
描述了具有以下结构的寡糖接头N,N-双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]-6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰胺(ML-6)的合成。
步骤A: 6-[双(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)氨基]-6-氧代己酸苄酯
在室温向6-(苄氧基)-6-氧代己酸(1.5 g, 6.35 mmol)在DMF (50 mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA (2.218 mL, 12.70 mmol)、HOBt (1.945 g, 12.7 mmol)、EDC (2.434g, 12.7 mmol)和2,2’-亚氨基二乙酸二叔丁酯(2.34 g, 9.52 mmol)。在室温搅拌16小时以后，将反应混合物用H2O (30 mL)稀释，并用CH2Cl2 (2x 30 mL)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。通过硅胶(80 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-40%EtOAc在己烷中的溶液洗脱，得到标题化合物。LC-MS方法A: m/e = 464.04 [M+1]; Rt =2.47 min。1H NMR (CDCl3) δ 7.32 (m, 5H), 5.07 (s, 2H), 4.02 (s, 2H), 3.96 (s,2H), 2.35 (s, 2H), 2.26 (s, 2H), 1.66 (s, 4H), 1.42-1.44 (bs, 18H)。
步骤B: 2,2’-{[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]亚氨基}二乙酸
在室温向6-[双(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)氨基]-6-氧代己酸苄酯(5.9 g, 12.73mmol)在CH2Cl2 (30 mL)中的搅拌溶液中加入TFA (30 mL, 12.73 mmol)。在室温搅拌16小时以后，将混合物浓缩。通过C18反相硅胶上的快速色谱法纯化残余物，得到标题化合物。LC-MS方法A: m/e = 486 [M+1]; Rt = 2.53 min。1H NMR (CD3OD) δ 7.30 (m, 5H), 5.06(s, 2H), 4.81 (s, 4H), 4.19 (s, 2H), 4.07 (s, 2H), 2.34 (q, 4H, J = 7.03)。
步骤C: 6-{双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨 基}-6-氧代己酸苄酯
在室温向2,2’-{[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]亚氨基}二乙酸(800 mg, 2.277mmol)在DMF (12 mL)中的搅拌溶液中加入2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(1.132 g, 5.46mmol)、DMAP (834 mg, 6.83 mmol)和EDC (1.528 g, 7.97 mmol)。在室温搅拌16小时以后，将反应混合物浓缩，并通过C18反相硅胶(120 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-40%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。LC-MS方法A: m/e = 730.26 [M+1]; Rt = 1.42min。
步骤D: 6-{双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨 基}-6-氧代己酸
在室温向6-{双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-6-氧代己酸苄酯(900 mg, 1.233 mmol)在H2O (5 mL)中的搅拌溶液中加入二羟基钯(866 mg, 1.233 mmol)。将混合物脱气，然后在H2气球下搅拌。在室温在H2下搅拌16小时以后，将反应混合物穿过硅藻土垫过滤，并用CH3OH (3x10 mL)洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物。LC-MS方法A: m/e = 640.17 [M+1]; Rt = 0.98 min。
步骤E: N,N-双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]- 6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰胺
在0℃向6-{双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-6-氧代己酸(160 mg, 0.250 mmol)在DMF (3.0 mL)中的搅拌溶液中加入TSTU (94mg, 0.313 mmol)在DMF (2 mL)中的溶液，并在5 min以后，加入DIPEA (53 μL, 0.300mmol)。在0℃搅拌1.5 h以后，将混合物逐滴加入在离心管内的Et2O (30 mL)中。在3500rpm离心30 min以后，将上清液倾析并将固体残余物溶解在H2O中，将其冷冻干燥，得到标题产物。UPLC方法B: m/e = 737 [M+1]; Rt = 2.19 min。
实施例7
描述了具有以下结构的寡糖接头2,2'-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]亚氨基}双(N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}乙酰胺) (ML-7)的合成。
步骤A: 2,2'-[(2-{[6-(苄氧基)-6-氧代己基]氨基}-2-氧代乙基)亚氨基]二乙 酸
在0℃向6-(苄氧基)-6-氧代己烷-1-铵(aminium) 4-甲基苯磺酸盐(2.0 g, 5.08mmol)在DMF (10 mL)中的溶液中加入K2CO3 (738 mg, 5.34 mmol)。在0℃搅拌2小时以后，将反应混合物的上清液加入0℃的3-(2,6-二氧代吗啉-4-基)丙酸(1.10 g, 6.35 mmol)在DMF (10 mL)中的溶液中。在0℃搅拌30 min以后，将反应混合物在室温搅拌1小时，然后冷却至0℃，随后加入水(10 mL)。将得到的混合物浓缩并将残余物悬浮于水(10 mL)中。在0℃搅拌16小时以后，将固体通过过滤进行收集，并干燥以得到标题化合物。1H NMR (CD3OD) δ7.36-7.30 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 3.56 (s, 4H), 3.43 (s, 2H), 3.23 (t, J =6.7, 2H), 2.39 (t, J = 7.3, 2H), 1.68-1.62 (m, 2H), 1.57-1.51 (m, 2H), 1.40-1.35 (m, 2H)。
步骤B: 6-[({双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基] 氨基}乙酰基)氨基]己酸苄酯
向2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(7.88 g, 38.04 mmol)和2,2'-[(2-{[6-(苄氧基)-6-氧代己基]氨基}-2-氧代乙基)亚氨基]二乙酸(2.5 g, 19.02 mmol)在DMF (10 mL)中的溶液中加入HOBt (2.43 g, 15.85 mmol)和EDC (3.04 g, 15.85 mmol)。在室温搅拌16小时以后，将反应混合物浓缩，并通过C18反相硅胶(120 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-50%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 773.292 [M+1]; Rt= 3.74 min。
步骤C: 2,2'-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2- 氧代乙基]亚氨基}双(N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}乙酰胺)
使用与关于ML-6所述的那些规程类似的规程，在步骤D中用6-[({双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}乙酰基)氨基]己酸苄酯替换6-{双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-6-氧代己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 780.265 [M+1]; Rt = 2.39 min。
实施例8
描述了具有以下结构的寡糖接头N,N-双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]甘氨酰-β-丙氨酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-8)的合成。
步骤A: 2,2'-[(2-{[3-(苄氧基)-3-氧代丙基]氨基}-2-氧代乙基)亚氨基]二乙 酸
向3-氨基丙酸苄酯盐酸盐(4.49 g, 20.8 mmol)在DMF (30 mL)中的冰浴冷却溶液中加入K2CO3 (3.02 g, 21.84 mmol)，并将得到的混合物在0℃搅拌2小时。然后将混合物过滤，并将滤液加入2-(2,6-二氧代吗啉代)乙酸(4.47 g, 25.8 mmol)在DMF (30 mL)中的冰浴冷却溶液中。将得到的混合物在0℃搅拌30 min，然后在室温搅拌2小时。通过加入水(30 mL)淬灭反应，并将得到的混合物浓缩。将残余物与水(40 mL)一起搅拌，并将得到的沉淀物通过过滤进行收集，并干燥以得到标题化合物。1H NMR (DMSO-d6) δ 2.53 (t, J =6.8, 2H), 3.27 (s, 2H), 3.36 (q, J = 6.2, 2H), 3.42 (m,m 2H), 3.49 (s, 2H),5.09 (s, 2H), 7.28 (m, 4H), 8.16 (m, 1H), 12.45 (br s, 2H)。
步骤B: N,N-双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基] 甘氨酰-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-7所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用2,2'-[(2-{[3-(苄氧基)-3-氧代丙基]氨基}-2-氧代乙基)亚氨基]二乙酸替换2,2'-[(2-{[6-(苄氧基)-6-氧代己基]氨基}-2-氧代乙基)亚氨基]二乙酸，制备标题化合物。UPLC方法E: m/e = 738.2149[M+1; Rt = 1.77 min。
实施例9
描述了具有以下结构的寡糖接头N,N-双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]甘氨酰甘氨酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-9)的合成。
使用与关于ML-7所述的那些规程类似的规程，在步骤A中用甘氨酸苄酯替换6-(苄氧基)-6-氧代己烷-1-铵(aminium) 4-甲基苯磺酸盐，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e =724.23 [M+1]; Rt = 1.10 min。
实施例10
描述了具有以下结构的寡糖接头15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-3-[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]-5,15-二氧代-9,12-二氧杂-3,6-二氮杂十五烷-1-酰胺(ML-10)的合成。
使用与关于ML-7所述的那些规程类似的规程，在步骤A中用3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酸苄酯替换6-(苄氧基)-6-氧代己烷-1-铵(aminium) 4-甲基苯磺酸盐，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 825.812 [M+1]; Rt = 2.17 min。
实施例11
描述了具有以下结构的寡糖接头6-{[双({3-氧代-3-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]-2-氧代乙基}氨基)丙基]氨基}-6-氧代己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-11)的合成。
步骤A: 3,3'-{[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]亚氨基}二丙酸
在0℃向3,3'-亚氨基二丙酸(2.59 g, 7.76 mmol)在DMF (20 mL)中的溶液中历时15min逐份加入6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酸苄酯(2.59 g, 7.76mmol)在DMF (3 mL)中的溶液，然后历时10 min逐滴加入TEA (951 μL, 6.83 mmol)。将得到的混悬液在室温搅拌16小时。将不溶物通过过滤除去，并将滤液浓缩。通过C18反相硅胶(150 g)上的快速色谱法纯化残余物，用5-50%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 380.177 [M+1]; Rt = 3.46 min。
步骤B: 6-{[双({3-氧代-3-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]-2-氧代乙基}氨基)丙 基]氨基}-6-氧代己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-6所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用3,3'-{[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]亚氨基}二丙酸替换2,2'-{[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]亚氨基}二乙酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 765.36 [M+1]; Rt = 2.15 min。
实施例12
描述了具有以下结构的寡糖接头1-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-1-氧代己烷-2-基]-N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-N'-[(2S)-6-{[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]氨基}己烷二酰胺(ML-12)的合成。
步骤A: N 2 -[(苄氧基)羰基]-N 6 -[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨 基)-6-氧代己酰基]-L-赖氨酸
在250 mL圆底烧瓶中加入N 2-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸(194 mg, 0.694 mmol)和DMF (10 mL)。向以上溶液中逐滴加入ML-4 (300 mg, 0.694 mmol)在DMF (5 mL)中的溶液，随后加入DIPEA (121 μL, 0.694 mmol)。在室温搅拌18小时以后，将反应混合物浓缩。通过C18反相硅胶上的快速色谱法纯化残余物，用0-40%的AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题产物。UPLC方法B: m/e = 598.2997 [M+1]; Rt = 2.99 min。
步骤B: N 6 -[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]- L-赖氨酸
在100 mL烧瓶中，将N 2-[(苄氧基)羰基]-N 6-[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]-L-赖氨酸(200 mg, 0.335 mmol)溶解在水(5 mL)中。将烧瓶脱气并用N2填充。向以上混合物中加入PdOH2(48.7 mg, 0.069 mmol)。将混合物在H2气球下搅拌2小时。将混合物穿过硅藻土垫过滤，并将滤液浓缩，得到标题化合物。UPLC方法B:m/e = 464.2697 [M+1]; Rt = 2.61 min。
步骤C: 6-({N 2 ,N 6 -双[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代 己酰基]-L-赖氨酰基}氨基)己酸苄酯
在40 mL瓶中加入N 6-[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]-L-赖氨酸(150 mg, 0.324 mmol)和DMF (5 mL)。将溶液冷却至0℃。向以上溶液中逐滴加入ML-4 (140 mg, 0.324 mmol)在DMF (2 mL)中的溶液，随后加入TEA (45µL,0.324 mmol)。将反应混合物温热至室温并搅拌1h。向得到的混合物中加入TSTU (97 mg,0.324 mmol)，随后加入TEA (45µL, 0.324 mmol)。将混合物在室温搅拌20 min。向得到的混合物中加入6-(苄氧基)-6-氧代己烷-1-铵(aminium) 4-甲基苯磺酸盐(127 mg, 0.324mmol)在DMF (1.0 mL)中的溶液。在室温搅拌18小时以后，将混合物浓缩。通过快速色谱法纯化残余物，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 984.5469 [M+1]; Rt = 3.37 min。
步骤D: 1-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-1-氧代己 烷-2-基]-N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-N'-[(2S)-6-{[6-({2-[(α-L-吡喃半 乳糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]氨基}己烷二酰胺
使用与关于ML-1所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用6-({N 2,N 6-双[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]-L-赖氨酰基}氨基)己酸苄酯替换6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e =991.5182 [M+1]; Rt = 2.41 min。
实施例13
描述了具有以下结构的寡糖接头2 N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-N'-[(5S)-6-{[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己基]氨基}-5-({8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-8-氧代辛酰基}氨基)-6-氧代己基]己烷二酰胺(ML-13)的合成。
步骤A: N 2 -{8-(苄氧基)-8-氧代辛酰基}-N 6 -[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧 基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]-L-赖氨酸
在0℃向N 6-[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]-L-赖氨酸(310 mg, 0.669 mmol)在DMF (20 mL)中的溶液中加入8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-8-氧代辛酸苄酯(242 mg, 0.669 mmol)，随后加入DIPEA (0.117 ml, 0.669mmol)。将反应物温热至25℃，并在该温度搅拌18小时。将反应混合物浓缩，并通过C18反相硅胶上的快速色谱法纯化残余物，用0-30%CAN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 710.423 [M+1]; Rt = 4.59 min。
步骤B: 8-({(12S)-1,26-双[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]-4,11,18,23-四氧代- 3,10,17,24-四氮杂二十六烷-12-基}氨基)-8-氧代辛酸苄酯
在40 mL瓶中加入N 2-{8-(苄氧基)-8-氧代辛酰基}-N 6-[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]-L-赖氨酸(100 mg, 0.141 mmol)和DMF (5 mL)。在0℃向以上溶液中加入EDC (40.5 mg, 0.211 mmol)和HOBt (23.7 mg, 0.155 mmol)。将反应物温热至室温并在室温搅拌20 min。向以上混合物中加入6-氨基-N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}己酰胺(45.1 mg, 0.141 mmol)。在室温搅拌18小时以后，将混合物浓缩。通过快速色谱法纯化残余物，用0-40%的AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 1012.6348 [M+1]; Rt = 3.28 min。
步骤C: N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-N'-[(5S)-6-{[6-({2-[(α-L- 吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己基]氨基}-5-({8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1- 基)氧基]-8-氧代辛酰基}氨基)-6-氧代己基]己烷二酰胺。
使用与关于ML-1所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用8-({(12S)-1,26-双[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]-4,11,18,23-四氧代-3,10,17,24-四氮杂二十六烷-12-基}氨基)-8-氧代辛酸苄酯替换6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 1019.588 [M+1]; Rt = 2.38 min。
实施例14
描述了具有以下结构的寡糖接头N-{(5S)-5-({8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-8-氧代辛酰基}氨基)-6-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-6-氧代己基}-N’-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}己烷二酰胺(ML-14)的合成。
步骤A: N 2 -[(苄氧基)羰基]-N 6 -[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨 基)-6-氧代己酰基]-L-赖氨酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-1步骤A所述的规程类似的规程，用N 2-{8-(苄氧基)-8-氧代辛酰基}-N 6-[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]-L-赖氨酸替换6-(苄氧基)-6-氧代己酸酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 695.213 [M+1]; Rt =3.98 min。
步骤B: N 2 -[(苄氧基)羰基]-N 6 -[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨 基)-6-氧代己酰基]-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→ 6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)-L-赖氨酰胺
在40 mL瓶中，将2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷(883 mg, 1.612 mmol)溶解在DMF (10 mL)中。在0℃向以上溶液中逐滴加入N 2-[(苄氧基)羰基]-N 6-[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]-L-赖氨酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(700 mg, 1.008 mmol)在DMF(10 mL)中的溶液。在室温搅拌18小时以后，将混合物浓缩。通过HPLC (waters Delta PakC4 300 A, 15 um, 50 x 250 mm柱, 流速85 ml/min, 梯度8-30%ACN/水，25 min)纯化残余物，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 1127.335 [M+1]; Rt = 2.83 min。
步骤C: N-{(5S)-5-氨基-6-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘 露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-6-氧代己基}-N'-{2-[(α-L-吡 喃型岩藻糖基)氧基]乙基}己烷二酰胺
在100 mL烧瓶中，将N 2-[(苄氧基)羰基]-N 6-[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)-L-赖氨酰胺(950 mg, 0.843 mmol)溶解在水(10 mL)中。将烧瓶脱气并用N2填充。向得到的混合物中加入Pd/C (10%, 179 mg,0.169 mmol)。将混合物在H2气球下搅拌18小时。将混合物穿过硅藻土垫过滤，并将滤液浓缩，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 993.326 [M+1]; Rt = 1.37 min。
步骤D: N-{(5S)-5-({8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-8-氧代辛酰基}氨 基)-6-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型 甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-6-氧代己基}-N’-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}己 烷二酰胺
使用与关于ML-12描述的那些规程类似的规程，在步骤C中用N-{(5S)-5-氨基-6-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-6-氧代己基}-N'-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}己烷二酰胺替换N 6-[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]-L-赖氨酸，制备标题化合物：UPLC方法B: m/e = 1218.418 [M+1]; Rt = 2.25 min。
实施例15
描述了具有以下结构的寡糖接头2,2'-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]亚氨基}双[N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)乙酰胺] (ML-15)的合成。
使用与关于ML-7所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷替换2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 1460.58 [M+1]; Rt = 1.53min。
实施例16
描述了具有以下结构的寡糖接头N,N'-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰基}吡咯烷-顺式-3,4-二甲酰胺(ML-16)的合成。
使用与关于ML-6所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用吡咯烷-顺式-3,4-二甲酸替换2,2'-{[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]亚氨基}二乙酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 763.38 [M+1]; Rt = 2.12 min。
实施例17
描述了具有以下结构的寡糖接头1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰基}-N,N’-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}哌啶-顺式-3,5-二甲酰胺(ML-17)的合成。
步骤A: N,N’-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}吡啶-3,5-二甲酰胺
在室温向3,5-吡啶二甲酸(311 mg, 1.861 mmol)在DMF (30 mL)中的搅拌溶液中加入2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(2.077 g, 9.30 mmol)、DMAP (568 mg, 4.65 mmol)和EDC (1784 mg, 9.30 mmol)。在室温搅拌16小时以后，将反应混合物浓缩。通过C18反相硅胶(300 g)上的快速色谱法纯化残余物，用AcCN水洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e= 578.31 [M+1]; Rt = 0.25 min。
步骤B: N,N’-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}哌啶-顺式-3,5-二甲酰 胺
在室温向N,N’-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}吡啶-3,5-二甲酰胺(550 mg, 0.952 mmol)在H2O (12 mL)中的搅拌溶液中加入PtO2 (64.9 mg, 0.286 mmol)。将混合物脱气，然后在H2气球下在室温搅拌4小时。然后将反应混合物穿过硅藻土垫过滤，并将滤液浓缩，并再溶解在CH3OH中，离心以沉淀固体催化剂。将上清液浓缩，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 584.27 [M+1]; Rt = 1.14 min。
步骤C: 6-[顺式-3,5-双({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨甲酰基)哌 啶-1-基]-6-氧代己酸苄酯
在室温向6-(苄氧基)-6-氧代己酸(125 mg, 0.529 mmol)在DMF (3 mL)中的搅拌溶液中加入DMAP (64.6 mg, 0.529 mmol)、EDC (203 mg, 1.058 mmol)和N,N’-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}哌啶-顺式-3,5-二甲酰胺(438 mg, 0.794 mmol)在DMF (2mL)中的溶液。在室温搅拌过夜后，将反应混合物浓缩，并通过C18反相硅胶上的快速色谱法纯化残余物，用0-50%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法F: m/e = 770.48[M+1]; Rt = 1.38 min。
步骤D: 1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰基}-N,N’-双{2- [(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}哌啶-顺式-3,5-二甲酰胺
使用与关于ML-6所述的那些规程类似的规程，在步骤D中用6-[顺式-3,5-双({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨甲酰基)哌啶-1-基]-6-氧代己酸苄酯替换6-{双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-6-氧代己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法F: m/e = 777.35 [M+1]; Rt = 2.23 min。
实施例18
描述了具有以下结构的寡糖接头N 1,N 5-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-N 2-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰基}-L-谷氨酰胺(glutamamide)(ML-18)的合成。
步骤A: [(2S)-1,5-二氧代-1,5-双({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨 基)戊烷-2-基]氨基甲酸苄酯
向N-[(苄氧基)羰基]-L-谷氨酸(1.1 g, 3.91 mmol)和2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(2.026 g, 9.78 mmol)在DMF (10 mL)中的溶液中加入EDC (3.00 g, 15.64 mmol)和DMAP (0.048 g, 0.391 mmol)。在室温搅拌24小时以后，将反应混合物浓缩，并通过硅胶(80 g)上的快速色谱法纯化残余物，用100%EtOAc洗脱5个柱体积，然后用等度EtOAc:AcCN:MeOH 6:1:1洗脱，得到标题化合物。1H NMR (CD3OD) δ 7.38-7.29 (m, 5H), 5.13-5.05(m, 2H), 4.76 (s, 2H), 4.09 (dd, J = 5.3, 8.6, 1H), 3.95-3.91 (m, 2H), 3.74-3.65 (m, 6H), 3.53-3.25 (m, 8H), 2.30 (t, J = 7.5, 2H), 2.06-2.04 (m, 1H),1.92-1.89 (m, 1H), 1.19 (d, J = 6.5, 6H)。
步骤B: 2-[(N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-L-α-谷氨酰基)氨基]乙 基α-L-吡喃岩藻糖苷
将[(2S)-1,5-二氧代-1,5-双({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)戊烷-2-基]氨基甲酸苄酯(940 mg, 1.425 mmol)和Pearlman氏催化剂(20 mg, 0.028 mmol)在CH3OH (20 mL)中的混悬液在30 Psi的H2下在室温摇动。16小时以后，将催化剂滤出并将滤液浓缩成标题化合物。
步骤C: {[(2S)-1,5-二氧代-1,5-双({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨 基)戊烷-2-基]氨基}-6-氧代己酸苄酯
在0℃向6-(苄氧基)-6-氧代己酸(260 mg, 1.1 mmol)在DMF (10 mL)中的溶液中加入TSTU (348 mg, 1.155 mmol)，随后加入DIPEA (202 μL, 1.155 mmol)。在0℃搅拌1小时以后，将反应混合物在Et2O (100 mL)和盐水(100 mL)之间分配。将有机相分离，用盐水(2x100 mL)进一步洗涤，经MgSO4干燥，并浓缩。将残余物再溶解在DMF (5 mL)中，加入到0℃的2-[(N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-L-α-谷氨酰基)氨基]乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(368 mg, 1.103 mmol)在DMF (10 mL)中的溶液中，随后加入Et3N (154 μL, 1.103mmol)。在0℃搅拌30 min以后，将反应混合物逐渐地温热至室温并搅拌2 h。将反应混合物用CH3OH (10 mL)稀释，并通过HPLC (梯度6-30%的0.1%TFA在水中的溶液，历时34 min，50x250 mm C4 15 um, 300A, 100 mL/min流速)纯化。1H NMR (CD3OD) δ 8.18 (m, 1H),7.35-7.30 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 4.76 (d, J = 3.6, 2H), 4.30 (dd, J = 5.5,8.6, 1H), 3.93 (dd, J = 6.5, 13.1, 2H), 3.74-3.71 (m, 4H), 3.65 (s, 2H),3.54-3.25 (m, 6H), 2.40 (t, J = 6.7, 2H), 2.29-2.26 (m, 4H), 2.07-2.03 (m,2H), 1.93-1.88 (m, 2H), 1.65-1.64 (m, 4H), 1.19 (d, J = 6.5, 6H)。
步骤D: {[(2S)-1,5-二氧代-1,5-双({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨 基)戊烷-2-基]氨基}-6-氧代己酸
将{[(2S)-1,5-二氧代-1,5-双({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)戊烷-2-基]氨基}-6-氧代己酸苄酯(380 mg, 0.511 mmol)和Pearlman氏催化剂(50 mg,0.071 mmol)在甲醇(30 mL)中的混悬液在50 Psi的H2下在室温在Parr振荡器上搅拌。16小时以后，将催化剂滤出并将滤液浓缩，得到标题化合物。1H NMR (CD3OD) δ 4.76-4.75 (m,2H), 4.32-4.29 (m, 1H), 3.96-3.91 (m, 2H), 3.76-3.66 (m, 5H), 3.55-3.27 (m,9H), 2.34-2.27 (m, 6H), 2.09-2.04 (m, 1H), 1.99-1.88 (m, 1H), 1.67-1.61 (m,4H), 1.20 (d, J = 6.7, 6H)。
步骤E: N 1 ,N 5 -双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-N 2 -{6-[(2,5-二氧代吡 咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰基}-L-谷氨酰胺(glutamamide)
在0℃向{[(2S)-1,5-二氧代-1,5-双({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)戊烷-2-基]氨基}-6-氧代己酸(289 mg, 0.422 mmol)在DMF (5.0 mL)中的混悬液中加入TSTU (140 mg, 0.464 mmol)，随后加入Hunig氏碱(810 μL, 0.464 mmol)。搅拌1小时以后，将混合物浓缩，得到标题产物，将其不经进一步纯化地使用。UPLC方法B: m/e = [M+1];Rt= 1.82 min。
实施例19
描述了具有以下结构的寡糖接头N 1,N 4-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-N 2-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰基}-L-天冬氨酰胺(ML-19)的合成。
使用与关于ML-18所述的那些规程类似的规程，在步骤A中用N-[(苄氧基)羰基]-L-天冬氨酸替换N-[(苄氧基)羰基]-L-谷氨酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e =737.3126 [M+1]; Rt = 2.04 min。
实施例20
描述了具有以下结构的寡糖接头N 2-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰基}-N 5-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-N 1-{2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}-L-谷氨酰胺(glutamamide) (ML-20)的合成。
步骤A: N 2 -[(苄氧基)羰基]-N-{2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型 甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}-L-谷氨酰胺苄酯
向Z-Glu-γ-Bn (1.0 g, 2.69 mmol)和2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷(2.21 g, 4.04 mmol)在DMF (10mL)中的溶液中加入EDC (1.29 g, 6.73 mmol)、HOBt (41 mg, 0.269 mmol)和Et3N (38 μL, 0.269 mmol)。在室温搅拌16小时以后，通过HPLC (50x250 mm, C4, 流速85 mL/分钟,25-35%的含有0.1%TFA的AcCN在H2O中的溶液梯度，历时30 min)纯化混合物，得到标题化合物。1H NMR (CD3OD) δ 8.12-8.10 (m, 1H), 7.38-7.26 (m, 10H), 5.50-5.04 (m, 5H),4.81 (s, 1H), 4.73 (s, 1H), 4.16-4.13 (m, 1H), 4.06 (s, 1H), 3.99-3.3.97 (m,1H), 3.93-3.37 (m, 20H), 2.48 (t, J = 7.6, 2H), 2.15-2.10 (m, 1H), 1.97-1.90(m, 1H)。
步骤B: N-{2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]- α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}-L-谷氨酰胺
将N 2-[(苄氧基)羰基]-N-{2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}-L-谷氨酰胺苄酯(1.41 g, 1.57 mmol)和Pearlman氏催化剂(110 mg, 0.157 mmol)在H2O (30 mL)中的混合物在50 Psi H2下在Parr振荡器上在室温搅拌。16小时以后，将催化剂滤出，并将滤液冷冻干燥，得到标题化合物。1H NMR (D2O) δ 5.07 (s, 1H), 4.87 (s, 1H), 4.81 (s, 1H), 4.08-3.55 (m,22H), 3.41-3.36 (m, 1H), 2.32 (t, J = 7.5, 2H), 2.10-2.06 (m, 2H)。
步骤C: N 2 -[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]-N-{2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)- [α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}-L-谷氨酰胺
使用与关于ML-18描述的规程类似的规程，在步骤C中用N-{2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}-L-谷氨酰胺替换2-[(N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-L-α-谷氨酰基)氨基]乙基α-L-吡喃岩藻糖苷，制备标题化合物。1H NMR (CD3OD) δ 8.09-8.06 (m, 1H), 7.35-7.30 (m,5H), 5.11 (s, 2H), 5.08 (s, 1H), 4.79 (m, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.34-4.31 (m,1H), 4.06-3.37 (m, 22H), 2.42-2.36 (m, 4H), 2.29-2.26 (m, 2H), 2.09-2.05 (m,1H), 1.93-1.88 (m, 1H), 1.65-1.62 (m, 4H)。
步骤D: N 2 -[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]-N 5 -{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙 基}-N 1 -{2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型 甘露糖基)氧基]乙基}-L-谷氨酰胺(glutamamide)
向N 2-[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]-N-{2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}-L-谷氨酰胺(500 mg, 0.559mmol)和2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(116 mg, 0.559 mmol)在DMF (10 mL)中的溶液中加入EDC (161 mg, 0.838 mmol)和HOBt (8.56 mg, 0.056 mmol)。在室温搅拌16小时以后，通过HPLC (50x250 mm，C4，流速85 mL/分钟，25-35%的含有0.1%TFA的AcCN在H2O中的溶液梯度，历时30 min)纯化混合物，得到标题化合物。1H NMR (CD3OD) δ 8.12-8.08 (m,1H), 7.35-7.29 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 5.08 (s, 1H), 4.80 (s, 1H), 4.77 (s,1H), 4.72 (s, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.12-3.26 (m, 30H), 2.42-2.39 (m, 2H),2.30-2.26 (m, 4H), 2.09-2.04 (m, 1H), 1.93-1.88 (m, 1H), 1.65-1.64 (m, 4H),1.19 (d, J = 6.7, 3H)。
步骤E: N 2 -{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰基}-N 5 -{2-[(α-L- 吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-N 1 -{2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖 基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}-L-谷氨酰胺(glutamamide)
使用与关于ML-18所述的那些规程类似的规程，在步骤D中用N 2-[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]-N 5-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-N 1-{2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}-L-谷氨酰胺(glutamamide)替换{[(2S)-1,5-二氧代-1,5-双({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)戊烷-2-基]氨基}-6-氧代己酸苄酯，制备标题化合物。1H NMR (CD3OD) δ 5.08 (s,1H), 4.80 (s, 1H), 4.77 (s, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.33-4.30 (m, 1H), 4.06-3.33(m, 30H), 2.84-2.82 (m, 4H), 2.69-2.66 (m, 2H), 2.34-2.27 (m, 4H), 2.10-2.02(m, 1H), 1.94-1.89 (m, 1H), 1.76-1.74 (m, 4H), 1.20 (d, J = 6.5, 3H)。
实施例21
描述了具有以下结构的寡糖接头N 2-[5-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-5-氧代戊酰基]-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)-L-谷氨酰基甘氨酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-21)的合成。
步骤A: (S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)- [α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-5-氧代戊酸苄酯
在0℃向2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷(2.6 g, 4.75 mmol)和(S)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酸(2.0 g, 5.39mmol)在DMF (36 mL)中的溶液中加入DMAP (580 mg, 4.75mmol)和EDC (3.64 g, 19.00 mmol)。将反应混合物逐渐温热至室温。搅拌16小时以后，将反应混合物浓缩，并通过C18反相硅胶(275g)上的快速色谱法纯化残余物，用10-55%的AcCN在H2O中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B：C40H56N2O21的计算值900.34，观察到的m/e: 901.26 [M+1]; Rt = 2.46 min。
步骤B: (S)-2-氨基-5-((2-((α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖 基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基)乙基)氨基)-5-氧代戊酸
将(S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-5-氧代戊酸苄酯(1.0g, 1.11 mmol)和Pd/C (118 mg, 0.111 mmol)在水(10 mL)中的混合物在H2气球下在室温搅拌16小时。将催化剂滤出，并用H2O (3x10 mL)洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物。UPLC方法B：C25H44N2O19的计算值676.25，观察到的m/e: 677.21 [M+1]; Rt = 0.86 min。
步骤C: 5-氧代-5-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)戊酸-2,5-二氧 代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-4所述的规程类似的规程，用5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酸苄酯替换6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B：C17H26N2O10的计算值418.16，观察到的m/e: 419.11 [M+1]; Rt = 2.00min。
步骤D: (S)-5-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→ 6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-5-氧代-2-[5-氧代-5-({2-[(α-L-吡喃型岩 藻糖基)氧基]乙基}氨基)戊烷酰氨基]戊酸
在0℃向(S)-2-氨基-5-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-5-氧代戊酸(350 mg, 4.75 mmol)在DMF (5 mL)中的溶液中加入5-氧代-5-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)戊酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(216 mg, 0.517 mmol, 根据实施例4、ML-4、步骤A制备，用5-(苄氧基)-5-氧代戊酸替换6-(苄氧基)-6-氧代己酸和TEA (0.2 mL, 1.435 mmol)。在0℃搅拌2小时以后，将反应混合物浓缩，并通过C18硅胶(150g)上的快速色谱法纯化残余物，用5-40%的AcCN在H2O中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B：C38H65N3O26的计算值979.39，观察到的m/e: 980.31 [M+1]; Rt = 0.92 min。
步骤E: (S)-5-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→ 6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-5-氧代-2-[5-氧代-5-({2-[(α-L-吡喃型岩 藻糖基)氧基]乙基}氨基)戊烷酰氨基]戊酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
在0℃向(S)-5-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-5-氧代-2-[5-氧代-5-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)戊烷酰氨基]戊酸(366 mg, 0.373 mmol)在DMF (2 mL)中的溶液中加入TSTU (115 mg, 0.381 mmol)和DIPEA (0.1 mL, 0.573 mmol)。在0℃搅拌1小时以后，用TFA (60 μL, 0.784 mmol)淬灭反应。将反应混合物经由自动移液器逐滴转移至含有AcCN (45 mL)的试管。将得到的白色混悬液离心(3000 rpm, 15分钟，在4℃)以产生澄清上清液和白色沉淀物。将上清液抛弃，并将白色沉淀物用AcCN (1 mL)洗涤，并干燥以产生标题化合物UPLC方法B：C42H68N4O28的计算值1076.40，观察到的m/e: 1077.28 [M+1]; Rt =0.90 min。
步骤F: N 2 -[5-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-5-氧代戊酰基]- N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖 基]氧基}乙基)-L-谷氨酰基甘氨酸苄酯
在0℃向(S)-5-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-5-氧代-2-[5-氧代-5-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)戊烷酰氨基]戊酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(0.35 g, 0.325mmol)在DMF (4 mL)中的溶液中加入2-(苄氧基)-2-氧代乙氯化铵(77 mg, 0.382 mmol)和TEA (0.15 mL, 1.076 mmol)。在室温搅拌24小时以后，将反应混合物浓缩，并通过C18反相硅胶(150 g)上的快速色谱法纯化残余物，用5-40%的AcCN在H2O中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B：C47H74N4O27的计算值1126.45，观察到的m/e: 1127.39 [M+1]; Rt = 2.84min。
步骤G: N 2 -[5-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-5-氧代戊酰基]- N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖 基]氧基}乙基)-L-谷氨酰基甘氨酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-1所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用N 2-[5-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-5-氧代戊酰基]-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)-L-谷氨酰基甘氨酸苄酯替换6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B：C44H71N5O29的计算值1133.42，观察到的m/e: 1134.34 [M+1]; Rt = 2.17 min。
实施例22
描述了具有以下结构的寡糖接头2-{(2S)-8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-1-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-1,8-二氧代辛烷-2-基}-N’-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}己烷二酰胺(ML-22)的合成。
步骤A: (2S)-8-(苄氧基)-2-{[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨 基)-6-氧代己酰基]氨基}-8-氧代辛酸
在0℃向ML-4 (300 mg, 0.694 mmol)在DMF中的溶液中加入(S)-2-氨基-8-(苄氧基)-8-氧代辛酸(194 mg, 0.694 mmol)，随后加入DIPEA (121µL, 0.694 mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后浓缩。通过C18反相硅胶上的快速色谱法纯化残余物，用5-28%的AcCN在H2O中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 597.226 [M+1]; Rt =3.45 min。
步骤B: N-{(2S)-8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-1-[(2-{[α-D-吡喃型甘露 糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-1, 8-二氧代辛烷-2-基}-N’-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}己烷二酰胺
使用与关于ML-1所述的那些规程类似的规程，在步骤A中用(2S)-8-(苄氧基)-2-{[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酰基]氨基}-8-氧代辛酸替换苄基6-(苄氧基)-6-氧代己酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e: 1133.312 [M+1]; Rt= 2.23 min。
实施例23
描述了具有以下结构的寡糖接头1-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]-13-{2-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-2-氧代乙基}-4,11,15-三氧代-3,10,13,16-四氮杂二十二烷-22-酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-23)的合成。
步骤A: (6-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基}-6-氧代己基)氨基甲酸苄酯
在室温向2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(3.0 g, 14.48 mmol)在DMF (80 mL)中的溶液中加入6-{[(苄氧基)羰基]氨基}己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(6.3 g, 17.37mmol)，并在1小时以后加入TEA (4.44 mL, 31.8 mmol)。搅拌16 h以后，将反应混合物浓缩，并通过C18反相硅胶(230g)上的快速色谱法纯化残余物，用5-40%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 455.2568 [M+1]; Rt = 2.86 min。
步骤B: 6-氨基-N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}己酰胺
向(6-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基}-6-氧代己基)氨基甲酸苄酯(1.72g, 3.79 mmol)在H2O (20 mL)中的溶液中加入Pd/C (23 mg, 0.217 mmol)。将混合物脱气并在H2气球下搅拌。2 h以后，将反应混合物穿过硅藻土垫过滤，并将滤液冷冻干燥以产生标题化合物。1H NMR (CD3OD) δ 1.21 (d, 3 H), 1.40-1.38 (m, 2 H), 1.62-1.60 (m, 4H), 2.23 (t, 2 H), 2.76 (t, 2 H), 3.28-3.27 (m, 1 H), 3.44-3.43 (m, 1 H),3.54-3.52 (m, 1 H), 3.66 (s, 1 H), 3.75-3.74 (m, 2 H), 3.94-3.93 (m, 1 H),4.76 (d, 1 H)。UPLC方法B: m/e = 321.2323 [M+1]; Rt =3.02 min。
步骤C: [(2-{[6-(苄氧基)-6-氧代己基]氨基}-2-氧代乙基)(2-{[6-({2-[(α-L- 吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]乙酸
在0℃向2,2'-[(2-{[6-(苄氧基)-6-氧代己基]氨基}-2-氧代乙基)氮烷二基]二乙酸(1.0 g, 2.54 mmol)在CH2Cl2 (30 mL)中的混悬液中加入三氟乙酸酐(448 μL, 3.17mmol)。在0℃搅拌3小时以后，将混合物冷却至-30℃，向其中历时30分钟逐滴加入Et3N(848 μL, 6.08 mmol)在DMF (20 mL)中的溶液。在-30℃搅拌30 min以后，加入6-氨基-N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}己酰胺(812 mg, 2.54 mmol)在DMF (30 mL)中的混合物，并将得到的混合物在室温搅拌。搅拌16小时以后，将混合物浓缩，并通过C18反相硅胶(42g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-40%的AcCN在水中的溶液洗脱，产生标题化合物。UPLC方法B: m/e = 697.3876 [M+1]; Rt = 3.398 min。1H NMR (CD3OD) δ 1.23 (3 H, d,J = 6.59), 1.39-1.36 (4 H, m), 1.56 (6 H, s), 1.67 (6 H, d, J = 10.32), 2.23(2 H, t, J = 7.50), 2.41 (2 H, t, J = 7.37), 3.24 (6 H, m), 3.42 (4 H, s),3.49 (2 H, s), 3.57-3.52 (3 H, m), 3.68 (1 H, s), 3.77 (3 H, t, J = 1.65),3.98-3.94 (1 H, m), 4.77 (1 H, s), 5.14 (2 H, s), 7.38 (5 H, d, J = 4.43)。
步骤D: 1-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]-13-{2-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1 →3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-2-氧代乙 基}-4,11,15-三氧代-3,10,13,16-四氮杂二十二烷-22-酸苄酯
向[(2-{[6-(苄氧基)-6-氧代己基]氨基}-2-氧代乙基)(2-{[6-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]乙酸(800 mg,1.148 mmol)在DMF (15 mL)中的溶液中加入2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)]-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷(1.89 g, 3.44 mmol)、HOBt (17.6mg, 0.115 mmol)和EDC (770 mg, 4.02 mmol)。在室温搅拌16 h以后，将反应混合物浓缩，并通过C18反相硅胶(50 g)上的快速色谱法纯化残余物，用10-40%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 1226.5990 [M+1]; Rt = 2.96 min。1H NMR (CD3OD)δ 1.23 (3 H, d, J = 6.58), 1.38 (6 H, s), 1.56 (6 H, s), 1.69-1.65 (6 H, m),2.23 (2 H, t, J = 7.44), 2.41 (2 H, t, J = 7.35), 3.27-3.23 (6 H, m), 3.37 (1H, s), 3.37 (1 H, s), 3.38 (1 H, s), 3.45 (1 H, s), 3.47 (1 H, s), 3.47 (1 H,s), 3.54 (3 H, s), 3.60 (1 H, s), 3.62 (2 H, s), 3.64 (1 H, s), 3.65 (1 H,s), 3.67 (2 H, s), 3.68 (3 H, s), 3.88-3.72 (20 H, m), 4.07 (1 H, s), 4.76 (1H, s), 4.78 (1 H, s), 4.84 (1 H, d, J = 1.69), 5.10 (1 H, s), 5.14 (2 H, s),7.38 (5 H, d, J = 4.37)。
步骤E: 13-(2-((2-(((([α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)]-[α-D-吡喃型甘露糖基- (1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基-氧基-(1-O→2))-乙基氨基)-2-氧代乙基)-4,11,15-三氧 代-1-(((2-(α-L-吡喃型岩藻糖基-氧基)-(1-O→2)))氧基)-3,10,13,16-四氮杂二十二 烷-22-酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-6所述的那些规程类似的规程，在步骤D中用1-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]-13-{2-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-2-氧代乙基}-4,11,15-三氧代-3,10,13,16-四氮杂二十二烷-22-酸苄酯替换6-{双[2α-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-6-氧代己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 1233.6006 [M+1]; Rt = 2.223 min。
实施例21
描述了具有以下结构的寡糖接头N-(2-{[6-({2-[(6-脱氧-α-L-吡喃半乳糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己基]氨基}-2-氧代乙基)-N-[2-({6-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]甘氨酰-β-丙氨酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-21)的合成。
步骤A: {6-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→ 6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-6-氧代己基}氨基甲酸苄酯
在0℃向2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷(1.8 g, 3.29 mmol)在DMF (50 mL)中的搅拌溶液中加入{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-己基}氨基甲酸苄酯(1.787 g, 4.93 mmol)，并在30分钟以后加入Et3N (1.146 mL, 8.22 mmol)。搅拌16 h以后，将反应混合物浓缩，并将得到的残余物通过C18反相硅胶(240 g)上的快速色谱法纯化，用5-40%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。1H NMR (CD3OD) δ 1.35 (br s, 2 H), 1.52 (br s, 2 H), 1.63 (br s, 2H), 2.21 (s, 2 H), 3.12 (s, 2 H), 3.37 (s, 1 H), 3.51-3.37 (br m, 5 H), 3.81-3.69 (br m, 14 H), 3.98 (s, 1 H), 4.06 (s, 1 H), 4.72 (s, 1 H), 4.81 (s, 2H), 5.07 (s, 2 H), 7.35 (s, 5 H)。UPLC方法B: m/e = 795.303 [M+1]; Rt = 2.49min。
步骤B: 6-氨基-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1 →6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)己酰胺
使用与关于ML-23描述的那些规程类似的规程吗，在步骤B中用{6-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-6-氧代己基}氨基甲酸苄酯替换(6-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基}-6-氧代己基)氨基甲酸苄酯，制备标题化合物。1H NMR (CD3OD) δ 1.40 (2 H, d, J = 7.97),1.63 (4 H, d, J = 12.78), 2.23 (2 H, t, J = 7.37), 2.82 (2 H, q, J = 8.46),3.44-3.37 (2 H, m), 3.53-3.46 (1 H, m), 3.63-3.61 (4 H, m), 3.72-3.70 (6 H,m), 3.80 (5 H, dd, J = 9.96, 4.52), 3.83 (2 H, s), 3.90 (1 H, dd, J = 11.05,5.87), 3.97 (1 H, s), 4.03 (1 H, s), 4.72 (1 H, s), 4.81 (1 H, s), 5.06 (1 H,s)。UPLC方法B: m/e 661.3543 [M+1]; Rt = 3.89 min。
步骤C: N-(2-{[6-({2-[(6-脱氧-α-L- 吡喃型岩藻糖基 )氧基]乙基}氨基)-6-氧 代己基]氨基}-2-氧代乙基)-N-[2-({6-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型 甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙 基]甘氨酰-β-丙氨酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-23描述的那些规程类似的规程，在步骤C中分别用6-氨基-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)己酰胺和N,N-双(羧甲基)甘氨酰-β-丙氨酸苄酯替换2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷和2,2’-[(2-{[6-(苄氧基)-6-氧代己基]氨基}-2-氧代乙基)亚氨基]二乙酸，并且在步骤D中用6-氨基-N-{2-[(6-脱氧-α-L-吡喃半乳糖基)氧基]乙基}己酰胺替换6-氨基-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)己酰胺，制备标题化合物。UPLC方法E: m/e = 1304.444 [M+1]; Rt = 1.76 min。
实施例25
描述了具有以下结构的寡糖接头1-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]-13-[2-({6-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]-4,11,15-三氧代-3,10,13,16-四氮杂二十二烷-22-酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-25)的合成。
使用与关于ML-23所述的那些规程类似的规程，用2,2’-[(2-{[6-(苄氧基)-6-氧代己基]氨基}-2-氧代乙基)亚氨基]二乙酸替换N,N-双(羧甲基)甘氨酰-β-丙氨酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法E: m/e = 1346.5950 [M+1]; Rt = 2.29 min。
实施例26
描述了具有以下结构的寡糖接头1-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]-11-[2-({4-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-4-氧代丁基}氨基)-2-氧代乙基]-4,9,13-三氧代-3,8,11,14-四氮杂二十烷-20-酸- 2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-26)的合成。
步骤A: {4-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→ 6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-4-氧代丁基}氨基甲酸苄酯
向2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)]-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷(790 mg, 1.44 mmol)和4-{[(苄氧基)羰基]氨基}丁酸(342 mg, 1.443mmol)在DMF (5 mL)中的混合物中加入EDC (553 mg, 2.89 mmol)和DMAP (176 mg)。在室温搅拌过夜以后，将反应混合物浓缩，并通过C18反相硅胶(43g)上的快速色谱法纯化残余物，用5-40%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 767.2084 [M+1]; Rt = 2.56 min。
步骤B: 4-氨基-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1 →6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)丁酰胺
向氮气冲洗的{4-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-4-氧代丁基}氨基甲酸苄酯(955 mg, 1.25mmol)在水(6 mL)中的溶液中加入10%炭载钯(133 mg)，并将得到的混合物在H2气球下搅拌4小时。将反应混合物穿过硅藻土垫过滤，并将滤液冷冻干燥，得到标题化合物。UPLC方法B:m/e = 633.2224 [M+1]; Rt = 0.78 min。
步骤C: 4-氨基-N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}丁酰胺
使用与关于ML-26所述的规程类似的规程，在步骤A中用2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)]-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法E: m/e= 1248.365 [M+1]; Rt = 1.37 min。
步骤D: 11-[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-1-[(α-L-吡喃型岩藻糖 基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D- 吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)-4,9,13-三氧代-3,8,11,14- 四氮杂十八烷-18-酰胺
使用与关于ML-23所述的那些规程类似的规程，分别在步骤C中用4-氨基-N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}丁酰胺替换6-氨基-N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}己酰胺和在步骤D中用4-氨基-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)丁酰胺替代2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)]-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法E: m/e = 1290.4012 [M+1]; Rt = 2.03 min。
实施例27
描述了具有以下结构的寡糖接头N-(2-{[4-({2-[(6-脱氧-α-L-吡喃半乳糖基)氧基]乙基}氨基)-4-氧代丁基]氨基}-2-氧代乙基)-N-[2-({4-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-4-氧代丁基}氨基)-2-氧代乙基]甘氨酰-β-丙氨酸- 2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-27)的合成。
使用与关于ML-23所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用{4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁基}氨基甲酸苄酯替换{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基甲酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法E: m/e = 1248.365 [M+1]; Rt =1.37 min。
实施例28
描述了具有以下结构的寡糖接头N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-11-[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]-1-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}-4,9,13-三氧代-3,8,11,14-四氮杂二十烷-20-酰胺(ML-28)的合成。
使用与关于ML-23所述的那些规程类似的规程，在步骤D中用4-氨基-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)丁酰胺替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)]-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法E: m/e = 1318.4270 [M+1]; Rt =2.19 min。
实施例29
描述了具有以下结构的寡糖接头6-({[(2-氧代-2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]-2-氧基乙基}氨基)({2-氧代-2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]-2-氧代乙基}氨基)乙基]氨基}乙酰氨基)-6-氧代己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-29)的合成。
使用与关于ML-23所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷替换6-氨基-N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}己酰胺，制备标题化合物。UPLC方法A: m/e = 1120.30 [M+1]; Rt = 1.90 min。
实施例30
描述了具有以下结构的寡糖接头2-({[(2-氧代-2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]-2-氧基乙基}氨基)({2-氧代-2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]-2-氧代乙基}氨基)乙基]氨基}乙酰氨基)乙酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-30)的合成。
使用与关于ML-23所述的那些规程类似的规程，分别在步骤C中用N,N-双(羧甲基)甘氨酰甘氨酸苄酯替换2,2'-((2-((6-(苄氧基)-6-氧代己基)氨基)-2-氧代乙基)亚氨基)二乙酸和用2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷替换6-氨基-N-(2-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基)己酰胺，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 1064.25 [M+1]; Rt = 2.65 min。
实施例31
描述了具有以下结构的寡糖接头2-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基][2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基}乙基)乙酰胺(ML-31)的合成。
步骤A: {2-[(4,6-O-亚苄基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]乙基}氨基甲酸苄酯
向[2-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)乙基]氨基甲酸苄酯(10 g, 28.0 mmol,Beilstein J. Org. Chem. 2010, 6, 699)在AcCN (150 mL)中的溶液中加入苯甲醛二甲基缩醛(5 mL, 31.6 mmol)和对甲苯磺酸一水合物(60 mg, 0.315 mmol)。搅拌24小时以后，将反应混合物浓缩。通过硅胶(330 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-20%CH3OH在CH2Cl2中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B：C23H27NO8的计算值445.17，观察到的m/e: 446.06 [M+1]; Rt = 3.21 min。1H NMR (CDCl3) δ 7.50-7.45 (2H, m), 7.35-7.25(8H, m), 5.50 (1H, s), 5.10 (2H, s), 4.40-4.36 (1H, m), 4.31-4.26 (1H, m),3.95-3.85 (1H, m), 3.80-3.70 (2H, m), 3.55-3.40 (4 H, m), 3.40-3.30 (2H, m)。
步骤B: {2-[(2-O-苯甲酰基-4,6-O-亚苄基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]乙基}氨基 甲酸苄酯
将{2-[(4,6-O-亚苄基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]乙基}氨基甲酸苄酯(4.5 g,10.10 mmol)和二丁基锡烷酮(stannanone) (3 g, 12.05 mmol)在甲苯(50 mL)中的搅拌混合物回流5小时。将得到的混合物冷却至室温并用苯甲酰氯(1.3 mL, 11.19 mmol)处理。在室温搅拌1小时以后，将混合物浓缩。通过硅胶上的快速色谱法(330 g，用0-10%丙酮在CH2Cl2中的溶液洗脱)纯化残余物，得到标题化合物。UPLC方法B：C30H31NO9的计算值549.20，观察到的m/e: 572.09 [M+Na]; Rt = 3.94 min。1H NMR (CDCl3) δ 8.05-8.00 (2H, m),7.55-7.45 (3H, m), 7.40-7.25 (10H, m), 5.55 (1H, s), 5.18-5.12 (1H, m), 5.04-5.00 (1H, m), 4.93-4.89 (1H, m), 4.66-4.63 (1H, m), 4.38-4.32 (1H, m), 4.05-4.00 (1H, m), 3.90-3.85 (1H, m), 3.82-3.77 (1H, m), 3.70-3.60 (2H, m), 3.55-3.45 (1H, m), 3.40-3.25 (2H, m)。通过1H-1H 2D COSY实验证实区域化学。
步骤C: {2-[(2-O-苯甲酰基-4-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]乙基}氨基甲酸 苄酯
在0℃向{2-[(2-O-苯甲酰基-4,6-O-亚苄基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]乙基}氨基甲酸苄酯(2.58 g, 4.69 mmol)和硼烷四氢呋喃络合物(40 mL, 40.0 mmol, 1.0 M在THF中)中的溶液中逐滴加入二丁基(((三氟甲基)磺酰基)氧基)硼烷的溶液(6 mL, 6.00mmol, 1.0 M在CH2Cl2中)。在0℃搅拌2小时以后，将TEA (0.5 mL)加入反应混合物中，并随后小心地加入CH3OH直到H2的产生已经停止。将反应混合物浓缩，并通过硅胶(330 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-100%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。TLC: 硅胶, 己烷类/EtOAc: 35/65, Rf = 0.5。1H NMR (CDCl3) δ 8.05-8.00 (2H, m), 7.55-7.25 (13H, m), 5.05-4.98 (3H, m), 4.86-4.82 (1H, m), 4.78-4.74 (1H, m), 4.60-4.58 (1H, m), 3.95-3.90 (2H, m), 3.85-3.80 (1H, m), 3.75-3.65 (2H, m), 3.61-3.58 (1H, m), 3.45-3.40 (1H, m), 3.35-3.30 (2H, m)。通过1H-1H COSY和1H-13C一键关联(HSQC) 2D NMR实验证实区域化学。
步骤D: (2-{[2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6- 四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2-O-苯甲酰基-4-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖 基]氧基}乙基)氨基甲酸苄酯
在-30℃向{2-[(2-O-苯甲酰基-4-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]乙基}氨基甲酸苄酯(1.47 g, 2.67 mmol)、三氯乙酰亚氨酸-2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃型甘露糖基酯(4.15 g, 5.60 mmol, Organic Letters, 2003, 5, 4041)和4Å分子筛在CH2Cl2 (40mL)中的混合物中逐滴加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(0.25 mL, 1.384 mmol)。将混合物逐渐温热至室温。搅拌6小时以后，用TEA (0.4 mL, 2.87 mmol)淬灭反应。将反应混合物过滤并将滤液浓缩。通过硅胶(330 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-75%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。TLC: 硅胶, 己烷类/EtOAc 3/2, Rf = 0.5。1H NMR(CDCl3) δ 8.20-7.95 (8H, m), 7.85-7.75 (8H, m), 7.65-7.60 (3H, m), 7.55-7.40(8H, m), 7.38-7.18 (24H, m), 7.15-7.05 (4H, m), 6.00-5.95 (1H, m), 5.88-5.85(1H, m), 5.75-5.65 (3H, m), 5.48-5.46 (1H, m), 5.35-5.25 (2H, m), 5.22-5.20(1H, m), 5.07-5.05 (1H, m), 4.95-4.85 (2H, m), 4.78-4.75 (1H, m), 4.70-4.60(1H, m), 4.60-4.55 (2H, m), 4.40-4.30 (2H, m), 4.27-4.23 (1H, m), 4.20-4.10(2H, m), 3.95-3.90 (1H, m), 3.80-3.75 (1H, m), 3.75-3.70 (3H, m), 3.60-3.55(1H, m), 3.51-3.48 (1H, m), 3.40-3.25 (2H, m)。
步骤E: (2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-4- O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基}乙基)氨基甲酸苄酯
向(2-{[2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2-O-苯甲酰基-4-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基}乙基)氨基甲酸苄酯(3.39 g, 1.984 mmol)在CH3OH (30 mL)中的溶液中加入NaOCH3(0.4 mL, 0.2 mmol, 0.5 M在CH3OH中)。在室温搅拌24小时以后，将amberlite IR 120(H)离子交换树脂(用3x30 mL CH3OH预洗涤过)加入反应混合物中。将得到的混合物搅拌另外15 min。将树脂滤出，并用CH3OH (3x5 mL)洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物。UPLC方法B：C35H49NO18的计算值771.29，观察到的m/e: 772.42 [M+1]; Rt = 2.51 min。
步骤F: 2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→ 6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷
将(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-4-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基}乙基)氨基甲酸苄酯(0.96 g, 1.244 mmol)和Pd/C (124mmol)在水(20 mL)中的混合物在H2气球下在室温搅拌16 h。将催化剂滤出，并用H2O (3x10mL)洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物。UPLC方法B：C20H37NO16的计算值547.21，观察到的m/e: 548.29 [M+1]; Rt = 0.87 min。1H NMR (D2O) δ 5.20-5.19 (1H, m), 4.88-4.87(1H, m), 4.51-4.49 (1H, m), 4.05 (1H, m), 4.00-3.90 (4H, m), 3.85-3.70 (9H,m), 3.70-3.60 (5H, m), 3.40-3.30 (1H, m), 3.05-3.00 (2H, m)。
步骤G: 2-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧 代乙基][2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-N-(2-{[α- D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基}乙 基)乙酰胺
使用与关于ML-29描述的那些规程类似的规程，用2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B：C44H71N5O29的计算值1133.42，观察到的m/e: 1134.34 [M+1]; Rt = 2.17min。
实施例32
描述了具有以下结构的寡糖接头2-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基][2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基}乙基)乙酰胺(ML-32)的合成。
步骤A: 2-氯乙基3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-氟-D-吡喃葡萄糖苷
在-30℃向2-氯乙醇(1.0 mL, 14.92 mmol)、三氯乙酰亚氨酸-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-氟-D-吡喃葡萄糖基酯(1.4 g, 3.09 mmol, Angew. Chem. Int. Ed. 2010,49, 8724)和4Å分子筛在CH2Cl2 (50 mL)中的溶液中逐滴加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(0.25 mL, 1.384 mmol)。将混合物逐渐温热至室温。搅拌2小时以后，用TEA (0.13 mL,0.933 mmol)淬灭反应。将得到的混合物过滤并将滤液浓缩。通过硅胶(80 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-60%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。将该端基异构的混合物不经进一步纯化直接用在下一步中。TLC: 硅胶, 己烷/EtOAc: 3/1, Rf = 0.35。
步骤B: 2-氯乙基2-脱氧-2-氟-D-吡喃葡萄糖苷
向2-氯乙基3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-氟-D-吡喃葡萄糖苷(0.85 g,2.293mmol)在CH3OH (10 mL)中的溶液中加入NaOCH3 (0.46 mL, 0.230mmol, 0.5 M在CH3OH中)。将得到的混合物在室温搅拌2小时。将Dowex 50wx2-200 (H)离子交换树脂(用3x10 mL CH3OH预洗涤过)加入反应混合物中。搅拌15 min以后，将树脂滤出并将滤液浓缩，得到标题化合物。将该端基异构的混合物不经进一步纯化直接用在下一步中。TLC: 硅胶, 己烷/EtOAc: 1/1, Rf = 0.2。
步骤C: 2-氯乙基4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄糖苷
向2-氯乙基2-脱氧-2-氟-D-吡喃葡萄糖苷(0.55 g, 2.248 mmol)在AcCN (10mL)中的溶液中加入苯甲醛二甲基缩醛(540 μL, 3.6 mmol)和对甲苯磺酸一水合物(6 mg,0.032 mmol)。搅拌3小时以后，将反应混合物浓缩。通过硅胶(80 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-60%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。1H NMR (CD3OD) δ 7.50-7.47 (2 H, m), 7.35-7.32 (3 H, m), 5.58 (1 H, s), 4.76-4.72 (1 H, m), 4.32-4.28 (1 H, m), 4.16-4.02 (2 H, m), 3.95-3.85 (2 H, m), 3.80-3.74 (1 H, m),3.70-3.66 (2 H, m), 3.52-3.48 (2 H, m)。通过1H-13C一键关联(HSQC)和1H-1H NOE(NOESY) 2D NMR实验证实β端基异构的立体化学。TLC: 硅胶, 己烷/EtOAc: 7/3, Rf =0.5。
步骤D: 2-氯乙基4-O-苄基-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄糖苷
在0℃向2-氯乙基4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄糖苷(422 mg,1.268 mmol)在硼烷四氢呋喃络合物(9 mL, 9.0 mmol, 1.0 M在THF中)中的溶液中逐滴加入二丁基{[(三氟甲基)磺酰基]氧基}硼烷的溶液(1.27 mL, 1.270 mmol, 1.0 M在CH2Cl2中)。在0℃搅拌2h以后，将TEA (0.5 mL)加入反应混合物中，并随后小心地加入CH3OH直到H2的产生已经停止。将反应混合物浓缩，并通过硅胶(40 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-60%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。TLC: 硅胶, 己烷/EtOAc: 1/1, Rf =0.6。1H NMR (CDCl3) δ 7.38-7.28 (5 H, m), 4.84-4.71 (2H, m), 4.56-4.53 (1H, m),4.22-4.04 (2H, m), 3.93-3.83 (3 H, m), 3.77-3.71 (1 H, m), 3.67-3.63 (2H, m),3.55-3.50 (1H, m), 3.40-3.37 (1 H, m)。通过1H-13C一键关联(HSQC)、1H-13C多键关联(HMQC)和1H-1H NOE (NOESY) 2D NMR实验证实区域化学。
步骤E: 2-叠氮基乙基4-O-苄基-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄糖苷
在室温向2-氯乙基4-O-苄基-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄糖苷(1.53 g, 4.57mmol)在DMF (45 mL)中的溶液中加入叠氮化钠(360 mg, 5.54 mmol)。在70℃搅拌16小时以后，将反应混合物冷却至室温并倒在冰水(200 mL)上，并用CH2Cl2 (3x100 mL)萃取。将有机层合并，并用盐水(2x100 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶(120 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-100%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。TLC: 硅胶, 己烷/EtOAc: 1/1, Rf = 0.55。1H NMR (CDCl3) δ 7.37-7.28 (5 H, m), 4.84-4.71(2H, m), 4.55-4.52 (1 H, m), 4.22-4.07 (1H, m), 4.03-3.98 (1H, m), 3.94-3.86(2H, m), 3.79-3.71 (2H, m), 3.56-3.51 (1H, m), 3.48-3.36 (3H, m)。
步骤F: 2-叠氮基乙基2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)- [2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-4-O-苄基-2-脱氧-2-氟-β-D-吡 喃葡萄糖苷
在-30℃向2-叠氮基乙基4-O-苄基-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄糖苷(1.23 g,3.6 mmol)、三氯乙酰亚氨酸-2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃型甘露糖基酯(5.35 g,7.22 mmol, Organic Letters, 2003, 5, 4041)、和4Å分子筛在CH2Cl2 (60 mL)中的溶液中逐滴加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(0.25 mL, 1.384 mmol)。使混合物逐渐升高到室温。搅拌6h以后，用TEA (0.4 mL, 2.87 mmol)淬灭反应。将得到的混合物过滤并将滤液浓缩。通过硅胶(330 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-75%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。1H NMR (CDCl3) δ 8.20-7.70 (16 H, m), 7.60-7.05 (29H, m),6.14-5.98 (2H, m), 5.90-5.80 (2H, m), 5.79-5.77 (1H, m), 5.66-5.64 (1H, m),5.42-5.41 (1H, m), 5.23-5.22 (1H, m), 5.03-5.02 (1H, m), 4.91-4.89 (1 H, m),4.70-4.60 (3H, m), 4.57-4.55 (1H, m), 4.50-4.48 (1H, m), 4.40-4.22 (3H, m),4.10-4.00 (2H, m), 3.80-3.70 (3H, m), 3.55-3.45 (2H, m), 3.44-3.38 (1H, m),3.36-3.30 (1H, m)。
步骤G: 2-叠氮基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→ 6)]-4-O-苄基-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄糖苷
向2-叠氮基乙基2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-4-O-苄基-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄糖苷(5.0 g, 3.34 mmol)在CH3OH (40 mL)中的溶液中加入NaOCH3 (1.0 mL, 0.5 mmol,0.5 M在CH3OH中)。在室温搅拌24小时以后，将amberlite IR 120 (H)离子交换树脂(用3x30 mL CH3OH预洗涤过)加入反应混合物中。15 min以后，将树脂滤出，并用CH3OH (3x5mL)洗涤。将滤液浓缩，将残余物溶解在EtOAc (50 mL)中并搅拌2小时。将固体过滤，并用EtOAc (3x15 mL)洗涤和干燥，得到标题化合物。UPLC方法B：C27H40FN3O15的计算值665.24，观察到的m/e: 666.35 [M+1]; Rt = 2.03 min.。
步骤H: 2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→ 6)]-4-O-苄基-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄糖苷
将2-叠氮基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-4-O-苄基-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄糖苷(1.77 g, 2.66 mmol)和Pd/C (0.133 mmol)在水(30 mL)中的混合物在H2气球下在室温搅拌16 h。将催化剂滤出，并用H2O (3x10 mL)洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物。UPLC方法B：C20H36FNO15的计算值549.21，观察到的m/e:550.29 [M+1]; Rt = 0.86 min。1H NMR (D2O) δ 5.16-5.14 (1H, m), 4.88-4.86 (1H,m), 4.80-4.76 (1H, m), 4.30-4.16 (1H, m), 4.06-4.03 (1H, m), 3.98-3.88 (4H,m), 3.86-3.72 (9H, m), 3.70-3.62 (5H, m), 2.94-2.88 (2H, m)。
步骤I: 2-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧 代乙基][2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-N-(2-{[α- D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄 糖基]氧基}乙基)乙酰胺
使用与关于ML-29所述的那些规程类似的规程，用2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-4-O-苄基-2-脱氧-2-氟-β-D-吡喃葡萄糖苷替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B：C44H71N5O29的计算值1133.42，观察到的m/e: 1134.34[M+1]; Rt = 2.17 min。
实施例33
描述了具有以下结构的寡糖接头2-{[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基][2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-N-[2-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)乙基]乙酰胺(ML-33)的合成。
使用与关于ML-23所述的那些规程类似的规程，分别在步骤C中用2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷替换6-氨基-N-(2-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基)己酰胺和在步骤D中用2-氨基乙基α-D-吡喃葡萄糖苷替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 796.38 [M+1]; Rt= 1.87 min。
实施例34
描述了具有以下结构的寡糖接头N,N-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰胺(ML-34)的合成。
步骤A: 丙-2-烯-1-基2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷
在0℃向1,2,3,4-四-O-苯甲酰基-L-吡喃岩藻糖苷(70.34 g, 121 mmol,Organic Letters 2007, 9, 1227-30)在CH2Cl2 (300 mL)中的搅拌溶液中加入烯丙醇(12.36 mL, 182 mmol)，随后历时1小时逐滴加入三氟化硼二乙基乙醚络合物(44.9 mL,363 mmol)，同时保持内部温度低于20℃。在室温搅拌16小时以后，将反应混合物冷却至0℃，向其中缓慢地加入饱和NaHCO3 (600 mL, 121 mmol)。搅拌16小时以后，将反应混合物用CH2Cl2 (2x400 mL)萃取。将有机相用水(200 mL)、饱和NaHCO3 (3x100 mL)和盐水(200mL)洗涤。将有机相分离，经MgSO4干燥和过滤。将滤液浓缩，并将残余物分成五等份，将它们分别通过硅胶(330 g)上的快速色谱法纯化，用0-60%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。(α异构体Rf = 0.63 30:70 EtOAc:己烷类)。1H NMR (CDCl3) δ 1.32 (3H, t, J= 6.77), 2.09 (1H, s), 4.15-4.14 (1H, m), 4.33-4.31 (1H, m), 4.51-4.49 (1H,m), 5.22 (1H, d, J = 10.52), 5.39-5.38 (2H, m), 5.73 (1H, dd, J = 10.74,3.67), 5.82 (1H, d, J = 3.30), 5.92-5.91 (1H, m), 6.04 (1H, dd, J = 10.75,3.43), 7.44 (3H, dt, J = 22.64, 7.61), 7.48-7.57 (5H, m), 7.65 (1H, d, J =7.49), 7.84 (2H, d, J = 7.84), 8.04 (2H, d, J = 7.84), 8.15 (2H, d, J =7.79)。
步骤B: 2-氧代乙基2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷
向丙-2-烯-1-基2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷(6.06 g, 11.73mmol)在丙酮(94 mL)和水(23.5 mL)中的溶液中加入4-甲基吗啉4-氧化物(2.75 g, 23.46mmol)，随后加入2.5%OsO4在水中的溶液(5.97 g, 0.587mmol)。将混合物在室温搅拌16小时。然后向得到的混合物中加入NaIO4 (5.40 g, 23.46 mmol)在水(100 mL)中的溶液。搅拌另外6小时以后，将沉淀物过滤，并用丙酮(200 mL)洗涤。使滤液的体积减小至最初体积的大约1/3，然后用EtOAc (200 mL)萃取。将有机相分离，用饱和NaHCO3 (200 mL)洗涤。将水相用EtOAc (3x100 mL)萃取。将有机相合并，并用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并浓缩。通过硅胶(220 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-100%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。1H NMR (CDCl3) δ 1.33-1.29 (3H, m), 3.27 (1H, s), 3.41 (1H, s), 4.35-4.31 (1H, m), 5.51-5.45 (1H, m), 5.75-5.69 (1H, m), 5.81 (1H, dd, J = 13.91,3.57), 6.05-5.98 (1H, m), 7.42 (2H, d, J = 7.76), 7.53 (5H, d, J = 8.61),7.67-7.63 (2H, m), 7.84-7.81 (2H, m), 8.01 (2H, t, J = 8.82), 8.14-8.12 (2H,m), 9.77-9.77 (1H, m)。
步骤C: {2-[(2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基甲酸苄 酯
在0℃向1,2,3,4-四-O-乙酰基-L-吡喃型岩藻糖(200 g, 601.86 mmol)在AcCN(100 mL)和(2-羟基乙基)氨基甲酸苄酯(140.96 g, 722.08 mmol)中的搅拌溶液中历时2小时逐滴加入BF3∙Et2O (427.7 g, 3.01 mol)。在室温搅拌16小时以后，将反应混合物冷却至0℃并随后加入Et3N (130 mL)。将得到的混合物浓缩，并将残余物溶解在CH2Cl2 (2.0 L)中，将其随后用饱和NaHCO3 (2x500 mL)、水(2x500 mL)和盐水(500 mL)洗涤。将有机相分离，经Na2SO4干燥，并浓缩。通过硅胶上的快速色谱法纯化残余物，用EtOAc/石油醚(1:3)洗脱，得到标题化合物。1H NMR (CDCl3) δ 7.33-7.37(5H,m), 5.12-5.32(5H,m), 4.99-5.04(1H,m), 4.42-4.45 (1H, d), 3.87-3.94 (1H, m), 3.78-3.84 (1H, m), 3.66-3.70(1H, m), 3.42-3.44 (2H, m), 2.19 (3H, s), 2.05-2.12(6H, m), 1.25-1.30 (3H,d)。
步骤D: 2-氨基乙基2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷
向{2-[(2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基甲酸苄酯(1.0 g, 2.139 mmol)在水(10 mL)中的溶液中加入Pd/C (68 mg, 0.642 mmol)。将得到的混悬液脱气并在H2气球下在室温搅拌。1小时以后，将反应混合物穿过硅藻土垫过滤，并将滤液低压冻干，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 334.1563 [M+1]; Rt = 1.43 min。
步骤E: 2-(苄基氨基)乙基2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷
向2-氨基乙基2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷(8.56 g, 25.7 mmol)在CH2Cl2 (100 mL)中的溶液中加入苯甲醛(2.197 ml, 21.67 mmol)、乙酸(372 μL, 6.50mmol)和NaCNBH3 (3.40 g, 54.2 mmol)。在室温搅拌16小时以后，将反应混合物浓缩，并将残余物在EtOAc (50 mL)和饱和NaHCO3 (50 mL)之间分配。将有机相分离，用饱和NaHCO3(2x100 mL)、盐水(100 mL)洗涤，经MgSO4干燥，并浓缩。通过C18反相硅胶(130 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-100%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e =424.2089 [M+1]; Rt=3.42 min。
步骤F: 2-(苄基{2-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基} 氨基)乙基2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷
向2-(苄基氨基)乙基2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷(1.021 g, 2.411mmol)在CH2Cl2 (50 mL)中的溶液中加入2-氧代乙基2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷(1.25 g, 2.411 mmol)、乙酸(41 μL, 0.723 mmol)和NaCNBH3 (227 mg, 3.62mmol)。在室温搅拌16小时以后，将反应混合物浓缩，并将残余物在EtOAc (50 mL)和饱和NaHCO3 (50 mL)之间分配。将有机相分离，用饱和的NaHCO3 (2 x 100 mL)和盐水(100 mL)洗涤，经MgSO4干燥，并浓缩。通过硅胶上的快速色谱法(120g，用0-100 EtOAc在己烷类中的溶液洗脱)纯化残余物。将含有标题化合物的级分合并和浓缩。通过C18反相硅胶(130 g)上的快速色谱法进一步纯化残余物，用0-100%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: me/e = 926.3234 [M+1]; Rt = 1.947min。1H NMR (CDCl3) δ 1.12 (3H, d, J =6.54), 1.27 (3H, d, J = 6.57), 2.00 (6H, d, J = 5.40), 2.20 (3H, s), 2.78(2H, q, J = 5.85), 2.85 (2H, t, J = 5.72), 3.48-3.46 (1H, m), 3.77-3.59 (4H,m), 3.87-3.85 (1H, m), 4.09 (1H, d, J = 6.63), 4.39 (1H, d, J = 6.71), 5.02(1H, d, J = 3.71), 5.14 (1H, dd, J = 10.82, 3.68), 5.30 (1H, d, J = 3.36),5.37-5.34 (2H, m), 5.65 (1H, dd, J = 10.72, 3.66), 5.77 (1H, d, J = 3.49),5.98 (1H, dd, J = 10.70, 3.47), 7.29 (6H, s), 7.36 (3H, t, J = 7.74), 7.45(1H, t, J = 7.59), 7.52 (3H, t, J = 7.73), 7.64 (1H, t, J = 7.46), 7.81 (2H,dd, J = 8.00, 1.41), 7.97 (2H, dd, J = 8.07, 1.40), 8.14-8.12 (2H, m)。
步骤G: 2-(苄基{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)乙基6-α-L-吡喃岩 藻糖苷
向2-(苄基{2-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)乙基2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷(432.9 mg, 0.468 mmol)在CH3OH (10 mL)中的溶液中加入NaOCH3 (0.087 μL, 0.468 mmol, 1.0 M)。搅拌16小时以后，将反应混合物浓缩，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 488.2324 [M+1]; Rt = 2.106 min。
步骤H: 2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)乙基α-L-吡喃岩藻糖苷
向2-(苄基{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)乙基6-α-L-吡喃岩藻糖苷(220 mg, 0.451 mmol)在水(10 mL)中的溶液中加入Pd/C (14.41 mg, 0.135 mmol)。将混合物脱气和在H2气球下搅拌。1小时以后，将反应混合物穿过硅藻土垫过滤，并将滤液低压冻干，得到标题化合物。UPLC方法: m/e = 398.2161 [M+1]; Rt = 1.119 min。1H NMR(CD3OD) δ 1.24 (6H, d, J = 6.58), 2.91-2.89 (4H, m), 3.56 (2H, ddd, J =10.66, 6.64, 4.66), 3.70-3.69 (2H, m), 3.80-3.75 (4H, m), 3.86 (2H, dt, J =10.61, 4.53), 3.98 (2H, q, J = 6.63), 4.80 (2H, d, J = 3.45)。
步骤I: 6-(双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸苄酯
在室温向6-(苄氧基)-6-氧代己酸(40 mg, 0.169 mmol)、EDC (114 mg, 0.593mmol)和HOBt (2.59 mg, 0.017 mmol)在DMF (5 mL)中的溶液中加入2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(190 mg, 0.478 mmol)。搅拌16小时以后，将反应混合物浓缩，并通过C18反相硅胶(50 g)上的快速色谱法纯化残余物，用5-40%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 616.2923 [M+1]; Rt =3.114 min。1H NMR (CD3OD) δ 1.24 (6H, d, J = 6.58), 1.72-1.64 (4H, m), 2.45(2H, t, J = 7.11), 2.53 (2H, t, J = 7.32), 3.91-3.55 (17H, m), 4.78-4.75 (2H,m), 5.14 (2H, s), 7.38-7.37 (5H, m)。
步骤J: N,N-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-6-[(2,5-二氧代吡咯烷- 1-基)氧基]-6-氧代己酰胺
使用与关于ML-1描述的那些规程类似的规程，在步骤C中用6-(双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸苄酯替换6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 623.2853 [M+1]; Rt = 2.155 min。
实施例35
描述了具有以下结构的寡糖接头2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(ML-35)的合成。
步骤A: 6-(双{2-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨 基)己酸苄酯
向2-氧代乙基2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷(1.25 g, 2.411 mmol)在CH2Cl2 (50 mL)中的溶液中加入6-(苄氧基)-6-氧代己烷-1-铵(aminium) 4-甲基苯磺酸盐、乙酸(17 μL, 0.300 mmol)和NaCNBH3 (189 mg, 3.00 mmol)。在室温搅拌16小时以后，将反应混合物浓缩，并将残余物在EtOAc (50 mL)和饱和NaHCO3 (50 mL)之间分配。将有机相分离，用饱和NaHCO3 (2x100 mL)、盐水(100 mL)洗涤，经MgSO4干燥，并浓缩。通过硅胶(120g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-100%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱。将含有标题化合物的级分合并和浓缩。通过C18反相硅胶(50 g)上的快速色谱法进一步纯化残余物，用0-100%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 1226.4591 [M+1]; Rt= 3.310 min。1H NMR (CDCl3) δ 1.29 (5H, d, J = 6.62), 2.36-2.31 (2H, m), 2.75(3H, d, J = 23.31), 3.53 (2H, d, J = 9.26), 3.78-3.76 (1H, m), 4.45 (1H, d, J= 6.66), 5.13 (2H, s), 5.35 (1H, d, J = 3.64), 5.64 (2H, dd, J = 10.69,3.63), 5.79 (2H, d, J = 3.48), 5.98 (1H, dd, J = 10.71, 3.44), 7.26 (4H, t, J= 7.64), 7.56-7.40 (14H, m), 7.64 (2H, t, J = 7.72), 7.82-7.80 (5H, m), 7.99-7.97 (5H, m), 8.19-8.12 (5H, m)。
步骤B: 6-(双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)己酸甲酯
使用与关于ML-34所述的那些规程类似的规程，在步骤G中用6-(双{2-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)己酸苄酯替换2-(苄基{2-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)乙基2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 526.2852 [M+1]; Rt = 2.112 min。
步骤C: 6-(双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)己酸
向6-(双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)己酸甲酯(45 mg, 0.086mmol)在水(10 mL)中的溶液中加入NaOH (0.086 μL, 0.086 mmol, 1.0 M)。搅拌16小时以后，将反应混合物用0.01 M HCl中和，并将得到的溶液低压冻干，得到标题化合物。UPLC方法B: m/e = 512.2866 [M+1]; Rt = 1.709 min。
步骤D: 2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1- 基)氧基]-6-氧代己基}氨基)乙基α-L-吡喃岩藻糖苷
使用与关于ML-1步骤D所述的那些规程类似的规程，用6-(双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)己酸替换6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 609.2808 [M+1]; Rt = 2.088 min.。
实施例36
描述了具有以下结构的寡糖2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}[3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基]氨基)乙基2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(ML-36)的合成。
步骤A: 3-(2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)-1-丙烯
在0℃向1,2,3,4-四-O-乙酰基-α-L-吡喃型岩藻糖(12 g, 36.1 mmol)和烯丙基三甲基硅烷(11.48 mL, 72.2 mmol)在AcCN (60 mL)中的溶液中加入TMS-OTf (3.52 mL,19.50 mmol)。将反应混合物在0℃搅拌18小时，然后在室温搅拌6小时。将得到的红色溶液用CH2Cl2 (250 mL)稀释，并小心地加入饱和NaHCO3 (150 mL)。将水层分离，并用CH2Cl2(2x50 mL)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶(220 g)上的快速色谱法纯化残余物，用15%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。1H NMR (CDCl3,400 MHz) δ 1.16 (d, J = 6.4, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.18 (s, 3H),2.34 (m, 1H), 2.57 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 4.29 (dt, J = 10.4, 7.3, 1H), 5.13(m, 2H), 5.23 (dd, J = 10.0, 3.4, 1H), 5.30 (dd, J = 3.4, 1.9, 1H), 5.35 (dd,J = 10.0, 5.6, 1H), 5.77 (m, 1H)。
步骤B: 3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)-1-丙烯
向3-(2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)-1-丙烯(10.65 g, 33.9 mmol)在CH3OH (50 mL)中的搅拌溶液中加入NaOCH3 (183 mg, 3.4 mmol)。在室温搅拌2小时以后，将反应混合物用Amberlite IR120 (用3x25 mL甲醇预洗涤过)中和。将树脂滤出并将滤液浓缩以得到白色固体，将其从EtOAc (~200 mL)重结晶，得到标题化合物。1H NMR (CDCl3,400 MHz) δ 1.22 (d, J = 6.5, 3H), 2.41 (m, 1H), 2.47 (m, 1H), 3.73 (m, 2H),3.85 (qd, J = 6.5, 2.0, 1H), 3.90 (dd, J = 8.9, 5.5, 1H), 3.99 (m, 1H), 5.07(m, 1H), 5.15 (dq, J = 17.2, 1.7, 1H), 5.85 (m, 1H)。
步骤C: 3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)-1-丙烯
在室温向NaH (3.91 g, 60%在油中的分散体, 98 mmol)在DMF (120 mL)中的搅拌混悬液中逐份加入3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)-1-丙烯(4.6 g, 24.44 mmol)。2小时以后，向得到的混合物中加入四丁基碘化铵(451 mg, 1.22 mmol)，随后缓慢地加入苄基溴(13.1mL, 110 mml)。在室温搅拌16小时以后，将反应混合物浓缩，并将残余物在水(300 mL)和Et2O (150 mL)之间分配。将水层用Et2O (3x150 mL)萃取。将合并的有机层用盐水(100 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶(220 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-40%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.34 (d, J= 6.6, 3H), 2.33 (m, 1H), 2.42 (m, 1H), 3.82 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 4.12 (m,1H), 4.58 (d, J = 11.8, 1H), 4.64 (d, J = 11.8, 2H), 4.69 (d, J = 12.0, 1H),4.76 (dd, J = 12.0, 8.9, 2H), 5.05, 5.07和5.11 (m, 2H), 5.80 (m, 1H), 7.30-7.40 (m, 15H)。
步骤D: 3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙醇
在0℃将3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)-1-丙烯(10.4 g, 22.68mmol)在THF (100 mL)中的溶液缓慢地加入9-BBN (58.5 mL，29.3 mmol, 0.5 M在THF中)。将混合物温热至室温，然后回流3小时。然后将反应混合物冷却至室温，并逐滴加入乙醇(4.4 mL, 75 mmol)，随后加入NaOH (11.51 ml, 46 mmol, 4.0 M在水中的溶液)。将得到的混合物冷却至0℃并加入35%过氧化氢(10 mL, 115 mmol)。将得到的混悬液在室温搅拌过夜。将反应混合物用盐水(125 mL)和乙醚(200 mL)稀释。将有机层用盐水(2x125 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶(330 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-100%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.33 (d, J= 6.6, 3H), 1.67 (m, 3H), 1.70 (m, 1H), 3.65 (m, 2H), 3.80 (m, 3H), 3.98 (m,1H), 4.02 (m, 1H), 4.56 (d, J = 11.8, 1H), 4.63 (t, J = 12.2, 2H), 4.69 (d, J= 12.0, 1H), 4.78 (dd, J = 12.1, 2.1, 2H), 7.27-7.40 (m, 15H)。
步骤E: 3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙醛
在0℃向3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙醇(8.4 g, 17.62 mmol)在CH2Cl2 (100 mL)中的溶液中加入戴斯-马丁过碘烷(11.21 g, 26.4 mmol)。将得到的混合物在0℃搅拌1小时，然后在室温搅拌2小时。TLC指示仍然存在一些开始的醇，所以加入另外的戴斯-马丁过碘烷(5 g, 11.8 mmol)并将混合物在室温搅拌另外2小时。将得到的混合物用饱和NaHCO3 (3x150 mL)、盐水(50 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶(220g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-80%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。1HNMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.26 (d, J = 6.6, 3H), 1.82 (m, 1H), 2.06 (m, 1H),2.40-2.58 (m, 2H), 3.80 (m, 2H), 3.84 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 3.99 (dt, J =10.9, 3.8, 1H), 4.55 (d, J = 11.8, 1H), 4.65 (d, J = 11.8, 1H), 4.70 (t, J =12.0, 2H), 4.79 (dd, J = 12.0, 9.2, 2H), 7.28-7.40 (m, 15H)。
步骤F: 2-{[3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基]氨基}乙基2-(乙 酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷
向3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙醛(800 mg, 1.69 mmol)和2-氨基乙基3,4,6-三-O-乙酰基-2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(987 mg, 2.53mmol)在CH2Cl2 (15 mL)中的混合物中加入乙酸(29 μL, 0.506 mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(893 mg, 4.21 mmol)。在室温搅拌过夜以后，将反应混合物浓缩，并将残余物溶解于EtOAc (70 mL)中，用饱和NaHCO3 (2x100 mL)、盐水(30 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物溶解于CH3OH (8 mL)中，向其中加入NaOCH3 (27 mg, 0.506 mmol)。在室温搅拌2小时以后，将得到的混合物浓缩，并通过C18反相硅胶(120 g)上的快速色谱法纯化残余物，用5-100%AcCN在水中的溶液洗脱，得到标题化合物。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.30(d, J = 6.6, 3H), 1.50 (m, 1H), 1.60 (m, 1H), 1.68 (m, 1H), 2.02 (s, 3H),2.64 (m, 2H), 2.81 (m, 2H), 3.39 (m, 1H), 3.57 (m, 2H), 3.69 (m, 1H), 3.78-3.85 (m, 4H), 3.92 (m, 2H), 4.00 (m, 2H), 4.45 (d, J = 7.7, 1H), 4.52 (d, J =11.9, 1H), 4.62 (d, J = 11.8, 1H), 4.68 (d, J = 12.1, 1H), 4.79 (d, J = 12.0,2H), 7.28-7.38 (m, 15H), 7.65 (s, 1H)；[M+H/e]+=723.3925。
步骤G: 6-{[3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基](2-{[2-(乙酰基 氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基}乙基)氨基}己酸苄酯
向6-氧代己酸苄酯(170 mg, 0.77 mmol)和2-{[3-(2,3,4-三-O-苄氧基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基]氨基}乙基2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷(558 mg,0.77 mmol)在CH2Cl2 (8 mL)中的混合物中加入乙酸(13 μL, 0.232 mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(327 mg, 1.54 mmol)，并将得到的混合物在室温搅拌2小时。加入另外的6-氧代己酸苄酯(170 mg, 0.77 mmol)并继续搅拌过夜。将混合物蒸发，并将残余物在EtOAc (40mL)和饱和NaHCO3 (60 mL)之间分配；将有机层用盐水(30 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶(40g)上的快速色谱法纯化残余物，用5-20%MeOH在CH2Cl2中的溶液洗脱，得到标题化合物。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 1.27-1.38 (m, 5H), 1.48 (m, 1H), 1.62-1.75 (m, 4H), 1.80 (m, 1H), 2.09 (s, 3H)；2.37 (t, J = 7.3, 2H), 2.90-3.02 (m,4H), 3.04 (m, 1H), 3.13 (m, 1H), 3.42 (m, 1H), 3.59 (t, J = 8.9, 1H), 3.65-3.75 (m, 3H), 3.78 (d, J = 4.9, 2H), 3.86 (m, 1H), 3.87-4.05 (m, 4H), 4.15(d, J = 11.2, 1H), 4.49 (d, J = 11.9, 1H), 4.62 (d, J = 11.8, 1H), 4.66 (d, J= 11.7, 1H), 4.69 (m, 2H), 4.74 (d, J = 11.8, 1H), 4.78 (d, J = 12.0, 1H),5.12 (s, 2H), 7.25-7.38 (m, 15H), 8.36 (s, 1H)；UPLC-MS [M+H/e]+=927.5049。
步骤H: 2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}[3-(α-L-吡喃型 岩藻糖基)丙基]氨基)乙基2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷
使用与关于实施例1、ML-1所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用6-{[3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基](2-{[2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基}乙基)氨基}己酸苄酯替换6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基-6-氧代己酸苄酯”，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 664.3474 [M+1]; Rt = 1.08 min。
实施例37
描述了具有以下结构的寡糖接头2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}[3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基]氨基)乙基β-D-吡喃葡萄糖苷(ML-37)的合成。
使用与关于ML-36所述的那些规程类似的规程，在步骤F中用2-氨基乙基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷替换2-氨基乙基3,4,6-三-O-乙酰基-2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 623.3277 [M+1]; Rt =1.11 min。
实施例38
描述了具有以下结构的寡糖接头2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}[3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基]氨基)乙基α-D-吡喃葡萄糖苷(ML-38)的合成。
使用与关于ML-36所述的那些规程类似的规程，在步骤F中用2-氨基乙基2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖苷替换2-氨基乙基3,4,6-三-O-乙酰基-2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 623.3336 [M+1]; Rt =1.11 min。
实施例39
描述了具有以下结构的寡糖接头6-{[3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基][2-(α-D-吡喃葡萄糖基)丙基]氨基}己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-39)的合成。
步骤A: 甲基2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖苷
向NaH (5.19 g 60%在油中的分散体, 130 mmol)在DMF (150 mL)中的混悬液中逐份加入甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4.2 g, 21.6 mmol)。将得到的混合物在室温搅拌2小时，向其中加入四丁基溴化铵(800 mg, 2.16 mmol)，随后逐滴加入苄基溴(11.58 mL, 97mmol)。在室温搅拌过夜以后，将混合物浓缩，并将残余物悬浮于水，并用乙醚(3x150 mL)萃取。将合并的乙醚层用盐水(200 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶(330 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-30%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。1H NMR(CDCl3, 400 MHz) δ 3.44 (s, 3H), 3.62 (dd, J = 9.6, 3.5, 1H), 3.66-3.72 (m,2H), 3.75-3.82 (m, 2H), 4.04 (t, J = 9.3, 1H), 4.51-4.55 (m, 2H), 4.66 (d, J= 12.1, 1H), 4.69 (d, J = 3.5, 1H), 4.72 (d, J = 12.1, 1H), 4.83-4.90 (m,3H), 5.04 (d, J = 11.0, 1H), 7.19 (m, 2H), 7.30-7.43 (m, 18H)。
步骤B: 3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)-1-丙烯
使用与关于ML-36所述的规程类似的规程，在步骤A中，用甲基2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖苷替换1,2,3,4-四-O-乙酰基-α-L-吡喃型岩藻糖，制备标题化合物。1HNMR (CDCl3) δ 2.48-2.60 (m, 2H), 3.64-3.70 (m, 3H), 3.76 (dd, J = 10.5, 3.2,1H), 3.80-3.88 (m, 2H), 4.18 (m, 1H), 4.52 (d, J = 10.5, 2H), 4.68 (d, J =13.7, 2H), 4.74 (d, J = 11.6, 1H), 4.86 (dd, J = 10.6, 3.3, 2H), 4.98 (d, J =11.0, 1H), 5.11-5.18 (m, 2H), 5.84-5.90 (m, 1H), 7.18 (m, 2H), 7.29-7.41 (m,18H)。
步骤C: 3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)丙醇
使用与关于ML-36所述的规程类似的规程，在步骤D中，用3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)-1-丙烯替换3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)-1-丙烯，制备标题化合物。1H NMR (CDCl3) δ 1.70 (m, 2H), 1.85 (m, 2H), 3.61 (m, 1H), 3.65 -3.76 (m, 2H), 3.76-3.86 (m, 2H), 4.91 (m, 1H), 4.52 (d, J = 10.8, 1H), 4.55(d, J = 12.3, 1H), 4.65 (d, J = 12.1, 1H), 4.67 (d, J = 11.8, 1H), 4.75 (d, J= 11.7, 1H), 4.86 (d, J = 11.3, 2H), 4.98 (d, J = 11.0, 1H), 7.18 (m, 2H),7.29-7.40 (m, 18H)。
步骤D: 甲磺酸-3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)丙酯
在0℃向3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)丙醇(3.35 g, 5.75 mmol)在CH2Cl2 (30 mL)中的溶液中加入DIPEA (1.25 mL, 7.19 mmol)，随后逐滴加入甲磺酰氯(538 μL, 6.9 mmol)。在0℃搅拌1小时以后，将反应混合物倒入水(50 mL)中。将有机层分离，并用饱和NaHCO3 (50 mL)、盐水(30 mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到标题化合物。1H NMR (CDCl3) δ 1.76-1.90 (m, 3H), 1.90-1.99 (m, 2H), 3.00 (s, 3H), 3.58-3.66 (m, 2H), 3.68 -3.74 (m, 2H), 3.77-3.85 (m, 2H), 4.06 (m, 1H), 4.52 (d, J= 10.7, 1H), 4.54 (d, J = 12.1, 1H), 4.65 (d, J = 12.1, 1H), 4.66 (d, J =11.6, 1H), 4.76 (d, J = 11.6, 1H), 4.85 (d, J = 10.9, 1H), 4.98 (d, J = 10.9,1H), 7.18 (m, 2H), 7.30-7.40 (m, 18H)。
步骤E: 3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)丙基叠氮化物
向甲磺酸-3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)丙酯(3.78 g, 5.72mmol)在AcCN (50 mL)中的溶液中加入四丁基叠氮化铵(1.66 g, 5.83 mmol)。将得到的混合物回流过夜。冷却至室温以后，将反应混合物浓缩。将残余物溶解在乙醚(50 mL)中，将其用水(2x50 mL)、盐水(25 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶上的快速色谱法(120 g，用0-30%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱)纯化残余物，得到标题化合物。1H NMR(CDCl3) δ 1.58-1.68 (m, 2H), 1.74-1.86 (m, 2H), 3.32-3.41 (m, 2H), 3.58 -3.76(m, 4H), 3.76-3.85 (m, 2H), 4.40 (m, 1H), 4.52 (t, J = 10.4, 2H), 4.65 (dd, J= 11.7, 2.5, 2H), 4.75 (d, J = 11.7, 1H), 4.86 (m, 2H), 4.97 (d, J = 10.8,1H), 7.16 (m, 2H), 7.28-7.40 (m, 18H)。
步骤F: 3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)丙胺
向氮气冲洗的3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)丙基叠氮化物(3 g,4.94 mmol)在CH3OH (100 mL)中的溶液中加入10%Pd/C (525 mg)。将得到的混合物在H2气球下搅拌过夜。将反应混合物穿过硅藻土垫过滤并将滤液浓缩，得到标题化合物。1H NMR(CDCl3) δ 1.48 (m, 1H), 1.59 (m, 1H), 2.23 (m, 1H), 2.30 (m, 2H), 3.66-3.76(m, 5H), 4.00 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 4.38 (d, J = 10.0, 1H), 4.50 (d, J =12.1, 1H), 4.61 (d, J = 11.7, 1H), 4.68 (d, J = 11.8, 1H), 4.70 (d, J = 12.0,1H), 4.79 (d, J = 10.0, 1H), 4.86 (d, J = 11.2, 1H), 5.02 (d, J = 11.2, 1H),7.00 (m, 2H), 7.25-7.40 (m, 18H), 8.06 (s, 2H)。
步骤G: 6-{[3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基][2-(α-D-吡喃葡萄糖基)丙基]氨基} 己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-36所述的那些规程类似的规程，在步骤F中用3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)丙胺替换2-氨基乙基3,4,6-三-O-乙酰基-2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 621.3424 [M+1]; Rt = 1.08min。
实施例40
描述了具有以下结构的寡糖接头6-{[3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基][2-(β-D-吡喃葡萄糖基)丙基]氨基}己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-40)的合成。
步骤A: 2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基溴
在室温向β-D-葡萄糖五乙酸酯(5 g, 12.81 mmol)中加入33%HBr在乙酸中的溶液(30 mL, 192 mmol)。搅拌40 min以后，将混合物用CH2Cl2 (150 mL)稀释，并用冰冷的水洗涤直到洗液为中性pH。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到标题化合物。1H NMR(CDCl3) δ 2.06 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 4.15 (d, J= 11.1, 1H), 4.31-4.37 (m, 2H), 4.86 (dd, J = 9.9, 4.0, 1H), 5.19 (t, J =9.8, 1H), 5.58 (t, J = 9.8, 1H), 6.63 (d, J = 4.0, 1H)。
步骤B: 3-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-丙烯
在0℃向烯丙基溴化镁溶液(100 mL, 100 mmol, 1.0 M在乙醚中)中历时1小时逐滴加入2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基溴(4.45 g, 10.82 mmol)在乙醚(60 mL)中的溶液。加入结束后，使混合物温热并在室温搅拌过夜。向得到的混合物中小心地加入水(200 mL)并随后加入乙酸以溶解镁盐。将有机层分离并浓缩。将残余物用乙酸酐(70 mL,740 mmol)和吡啶(100 mL)处理。在室温搅拌过夜以后，将混合物浓缩，并将残余物溶解于EtOAc (200 mL)中，并用饱和NaHCO3 (5x300 mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶上的快速色谱法(120 g，用0-100%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱)纯化残余物，得到标题化合物。1H NMR (CDCl3) δ 2.00 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.09 (s, 3H),2.26-2.37 (m, 2H), 3.51 (m, 1H), 3.65 (m, 1H), 4.10 (dd, J = 12.2, 2.2, 1H),4.24 (dd, J = 12.2, 5.0, 1H), 4.93 (t, J = 9.4, 1H), 5.07 (m, 2H), 5.09 (s,1H), 5.17 (t, J = 9.4, 1H), 5.83 (m, 1H)。
步骤C: 3-(β-D-吡喃葡萄糖基)-1-丙烯
向3-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-丙烯(4.15 g, 11.14 mmol)在CH3OH (50 mL)中的溶液中加入NaOCH3 (0.56 mL, 2.2 mmol, 4.0 M在CH3OH中)。在室温搅拌2小时以后，使用Dowex 50W (酸性形式)中和反应混合物。将树脂滤出并将滤液浓缩，得到标题化合物。1H NMR (DMSO-d6) δ 2.09 (m, 1H), 2.49 (m, 1H), 2.88 (t, J =8.9, 1H), 2.98-3.07 (m, 3H), 3.11 (m, 1H), 3.39 (dd, J = 11.4, 4.7, 1H), 3.60(d, J = 11.6, 1H), 4.99 (dd, J = 10.3, 0.9, 1H), 5.06 (d, J = 17.2, 1H), 5.90(m, 1H)。
步骤D: 3-(2,3,4,6-四-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-丙烯
使用与关于ML-36所述的规程类似的规程，在步骤C中，用3-(β-D-吡喃葡萄糖基)-1-丙烯替换3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)-1-丙烯，制备标题化合物。1H NMR (CDCl3) δ 2.39(m, 1H), 2.65 (m, 1H), 3.41 (m, 2H), 3.49 (m, 1H), 3.68 (t, J = 9.5, 1H),3.72-3.82 (m, 3H), 4.72 (dd, J = 10.8, 2.1, 1H), 4.89 (d, J = 10.7, 1H),4.94-500 (m, 3H), 5.16 (m, 2H), 6.03 (m, 1H), 7.25 (m, 2H), 7.32-7.44 (m,18H)。
步骤E: 3-(2,3,4,6-四-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-丙醇
使用与关于ML-36所述的规程类似的规程，在步骤D中，用3-(2,3,4,6-四-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-丙烯替换3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)-1-丙烯，制备标题化合物。1H NMR (CDCl3) δ 1.60 (m, 1H), 1.76 (m, 2H), 2.04 (m, 1H), 2.36(t, J = 5.7, 1H), 3.35 (m, 2H), 3.49 (m, 1H), 3.62-3.72 (m, 4H), 3.72-3.77(m, 2H), 4.58 (d, J = 12.2, 1H), 4.60 (d, J = 10.7, 1H), 4.65 (d, J = 12.2,1H), 4.70 (d, J = 10.8, 1H), 4.86 (d, J = 10.8, 1H), 4.95 (m, 3H), 7.21 (m,2H), 7.31-7.41 (m, 18H)。
步骤F: 6-{[3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基][2-(β-D-吡喃葡萄糖基)丙基]氨基} 己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-39所述的那些规程类似的规程，在步骤D中用3-(2,3,4,6-四-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-丙醇替换3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)丙醇，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 621.3412 [M+1]; Rt = 1.08 min。
实施例41
描述了具有以下结构的寡糖接头2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}[3-(α-D-吡喃型甘露糖基)丙基]氨基)乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(ML-41)的合成。
步骤A: 3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃型甘露糖基)-1-丙烯
使用与关于ML-39所述的规程类似的规程，在步骤B中，用甲基2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃甘露糖苷替换甲基2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖苷，制备标题化合物，作为α和β端基异构体的混合物。将这些端基异构体通过手性SFC色谱法(柱：AD-H (50X250cm)，用30%IPA (0.1%DEA)/CO2洗脱, 100巴，200 mL/min, 220 nm；注射体积: 1.0 mL，在162mg/mL 4:1 v/v IPA/CH2Cl2的浓度)分离，得到作为α端基异构体的主要产物。1H NMR(CDCl3) δ 2.38 (m, 2H), 3.68 (dd, J = 4.6, 3.2, 1H), 3.76 (dd, J = 10.4, 3.7,1H), 3.83 (m, 2H), 3.90 (m, 2H), 4.10 (m, 1H), 4.55-4.62 (m, 4H), 4.62-4.65(m, 3H), 4.75 (d, J = 11.3, 1H), 5.06 (d, J = 4.6, 1H), 5.08 (s, 1H), 5.80(m, 1H), 7.25 (m, 2H), 7.30-7.42 (m, 18H)。
步骤B: 3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃型甘露糖基)-1-丙醇
使用与关于ML-39所述的规程类似的规程，在步骤C中，用3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃型甘露糖基)-1-丙烯替换3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)-1-丙烯，制备标题化合物。1H NMR (CDCl3) δ 1.85-2.00 (m, 2H), 2.53 (m, 1H), 2.60 (m, 1H),3.62 (dd, J = 6.0, 2.4, 1H), 3.73 (dd, J = 10.2, 4.2, 1H), 3.78-3.87 (m, 3H),3.90 (m, 1H), 3.98 (m, 1H), 4.54-4.62 (m, 7H), 4.67 (d, J = 11.5, 1H), 7.25(m, 2H), 7.28-7.40 (m, 18H), 9.79 (s, 1H)。
步骤C: 2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}[3-(α-D-吡喃型 甘露糖基)丙基]氨基)乙基α-L-吡喃岩藻糖苷
使用与关于ML-36所述的那些规程类似的规程，在步骤E中用3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃型甘露糖基)-1-丙醇替换3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙醇和在步骤F中用2-氨基乙基(2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷)替换2-氨基乙基(3,4,6-三-O-乙酰基-2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷)，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 623.3235 [M+1]; Rt = 1.13 min。
实施例42
描述了具有以下结构的寡糖接头6-{[3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基][2-(α-D-吡喃型甘露糖基)丙基]氨基}己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-42)的合成。
使用与关于ML-39描述的那些规程类似的规程，在步骤D中用3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃型甘露糖基)-1-丙醇替换3-(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃葡萄糖基)丙醇，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 621.3358 [M+1]; Rt = 1.11 min。
实施例43
描述了具有以下结构的寡糖接头3-({6-[({双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}乙酰基)氨基]己基}氨基)-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-D-丙氨酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-43)的合成。
步骤A: 6-[({双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基] 氨基}乙酰基)氨基]己酸五氟苯酯
在0℃向6-[({双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}乙酰基)氨基]己酸(1.0 g, 1.465 mmol)在DMF (7.7 mL)中的搅拌溶液中加入PFTU(627 mg, 1.465 mmol)，并在5 min以后加入DIPEA (256 μL, 1.465 mmol)。使混合物逐渐温热至室温。搅拌16小时以后，将反应混合物浓缩，并通过硅胶(40 g)上的快速色谱法纯化残余物，用300 mL EtOAc洗脱以洗出非极性的混合物，然后用混合溶剂(v/v EtOAc/H2O/MeOH/AcCN: 6/1/1/1), = 6:1:1:1)洗脱，得到标题产物。LC-MS方法A: m/e = 849.50 [M+1]; Rt = 1.94 min。
步骤B: 3-氨基-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酸盐酸盐
向3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-D-丙氨酸(1.0 g,2.35 mmol)在CH2Cl2 (11.72 mL)中的搅拌溶液中加入HCl (4.0 M在二氧杂环己烷中的溶液, 11.72 mL, 46.9 mmol)。搅拌16小时以后，将反应混合物浓缩，得到标题产物，将其不经进一步纯化地使用。LC-MS方法A: m/e = 327.19 [M+1]; Rt = 1.73 min。
步骤C: 3-({6-[({双[2-氧代-2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基) 乙基]氨基}乙酰基)氨基]己酰基}氨基)-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酸
在0℃向6-[({双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}乙酰基)氨基]己酸五氟苯酯(270 mg, 0.318 mmol)在DMF中的搅拌溶液中加入3-氨基-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酸盐酸盐(303 mg, 0.306 mmol)，并在5 min以后加入DIPEA (111µL, 0.636 mmol)。在0℃搅拌2小时以后，将反应混合物浓缩，并通过硅胶(22 g)上的快速色谱法纯化残余物，首先用100 mL EtOAc洗脱，然后用0-20%的溶剂B在溶剂A中的溶液(溶剂A: v/v EtOAc/MeOH/AcCN/H2O: 6/1/1/1；溶剂B v/v EtOAc/MeOH/AcCN/H2O: 2/1/1/1)洗脱，得到标题化合物。LC-MS方法A: m/e = 991.66 [M+1]; Rt =1.84 min。
步骤D: 3-({6-[({双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代 乙基]氨基}乙酰基)氨基]己基}氨基)-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-D-丙氨酸-2,5-二氧 代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-1所述的那些规程类似的规程，在步骤D中用3-({6-[({双[2-氧代-2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)乙基]氨基}乙酰基)氨基]己酰基}氨基)-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酸替换6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸，制备标题化合物。LC-MS方法A: m/e = 1088.9 [M+1]; Rt = 1.96 min。
实施例44
描述了具有以下结构的寡糖接头3-({6-[({双[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}乙酰基)氨基]己基}氨基)-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-44)的合成。
使用与关于ML-43所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酸替换3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-D-丙氨酸，制备标题化合物。LC-MS方法A: m/e = 1088.9 [M+1];Rt = 1.96 min。
实施例45
描述了具有以下结构的寡糖接头2,2'-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]亚氨基}双(N-{[1-(α-D-吡喃型甘露糖基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基}乙酰胺) (ML-45)的合成。
步骤A: 6-[({双[2-氧代-2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙基]氨基}乙酰基)氨基]己酸 苄酯
使用与关于ML-1步骤B所述的规程类似的规程，用炔丙胺替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.32 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 4.014 (s, 4H), 3.298(m, 4H), 3.23 (m, 2H), 3.21 (m, 2H), 2.32 (m, 2H), 2.22 (s, 2H), 1.63 (m,2H), 1.51 (m, 2H), 1.33 (m, 2H)。
步骤B: 6-[({双[2-氧代-2-({[1-(α-D-吡喃型甘露糖基)-1H-1,2,3-三唑-4-基] 甲基}氨基)乙基]氨基}乙酰基)氨基]己酸苄酯
向6-[({双[2-氧代-2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙基]氨基}乙酰基)氨基]己酸苄酯(546 mg, 1.165 mmol)和α-D-吡喃型甘露糖基叠氮化物(598 mg, 2.91 mmol)在DMF (5.8mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA (1.0 mL, 5.83 mmol)和Cu(I)碘化物(222 mg, 1.165mmol)。将反应混合物在60℃搅拌30 min直到所有CuI溶解，然后在室温搅拌1小时。将反应混合物用10倍体积的CH3OH稀释。将沉淀的无机物滤出。将滤液浓缩，并通过硅胶(40 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0-60%溶剂B在溶剂A中的溶液(溶剂A: v/v EtOAc/MeOH/AcCN/H2O: 6/1/1/1；溶剂B v/v EtOAc/MeOH/AcCN/H2O: 2/1/1/1)洗脱，得到标题化合物。LC-MS方法A: m/e = 879.31 [M+1]; Rt = 0.98 min。
步骤C: 2,2'-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2- 氧代乙基]亚氨基}双(N-{[1-(α-D-吡喃型甘露糖基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基}乙酰胺)
使用与关于ML-1描述的那些规程类似的规程，在步骤C中用6-[({双[2-氧代-2-({[1-(α-D-吡喃型甘露糖基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基}氨基)乙基]氨基}乙酰基)氨基]己酸苄酯替换6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法A: m/e= 886.2 [M+1]; Rt = 2.02 min。
实施例46
描述了具有以下结构的寡糖接头2,2'-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]亚氨基}双(N-{2-[(β-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}乙酰胺) (ML-46)的合成。
使用与关于ML-7所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用2-氨基乙基β-L-吡喃岩藻糖苷替换2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e =780.361 [M+1]; Rt = 2.09 min。
实施例47
描述了具有以下结构的寡糖接头6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]-N-{2-[(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)氨基]-2-氧代乙基}-6-氧代己酰胺(ML-47)的合成。
使用与关于ML-29描述的那些规程类似的规程，用2,2’-{[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]亚氨基}二乙酸替换2,2’-[(2-{[6-(苄氧基)-6-氧代己基]氨基}-2-氧代乙基)亚氨基]二乙酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 1070.33 [M+1]; Rt = 3.08 min。
实施例48
描述了具有以下结构的寡糖接头2-{[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基][2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-N-[2-(α-D-吡喃型甘露糖基氧基)乙基]乙酰胺(ML-48)的合成。
使用与关于ML-23所述的那些规程类似的规程，分别在步骤C中用2-氨基乙基α-L-吡喃岩藻糖苷替换6-氨基-N-(2-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基)己酰胺和在步骤D中用2-氨基乙基α-D-吡喃甘露糖苷替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B m/e = 796.37 [M+1]; Rt =1.87 min。
实施例49
描述了具有以下结构的寡糖接头2-{[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基][2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-N-[2-(β-D-吡喃型甘露糖基氧基)乙基]乙酰胺(ML-49)的合成。
步骤A: {2-[(3,6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)氧基]乙基}氨基甲酸苄酯
向2-({2-[(β-D-吡喃半乳糖基)氧基]乙基}氨基)氨基甲酸苄酯(15.5 g, 43.4mmol, Beilstein J. Org. Chem. 2010, 6, 699)和4Å分子筛在甲苯(150 mL)中的溶液中加入二丁基锡烷酮 (23.4 g, 94 mmol)。回流5小时以后，将反应混合物缓慢地冷却至0℃，向其中逐滴加入苯甲酰氯(11 mL, 95 mmol)。将得到的混合物逐渐温热至室温。在室温搅拌24小时以后，将反应混合物过滤并将滤液浓缩。通过硅胶(330 g)上的快速色谱法纯化残余物，用0 -75%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。TLC: 硅胶, 己烷/EtOAc:1/1, Rf = 0.35。UPLC方法B：C30H31NO10的计算值565.19，观察到的m/e = 566.21 [M+1];Rt = 1.87 min。1H NMR (CDCl3) δ 8.05-7.95 (4 H, m), 7.60-7.25 (11H, m), 5.10-5.05 (1H, m), 5.02 (2H, s), 4.60-4.55 (1H, m), 4.50-4.45 (1H, m), 4.40-4.35(1H, m), 4.20-4.15 (1H, m), 4.05-4.00 (1H, m), 3.90-3.80 (2H, m), 3.75-3.70(1H, m), 3.45-3.30 (1H, m), 3.35-3.25 (1H, m)。通过1H-13C一键关联(HSQC)、1H-13C多键关联(HMBC)和1H-1H NOE (NOESY) 2D NMR实验证实区域化学。
步骤B: {2-[(3,6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基甲酸苄 酯
在-20℃向{2-[(3,6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)氧基]乙基}氨基甲酸苄酯(1.17 g, 2.069 mmol)在CH2Cl2 (26 mL)中的搅拌溶液中加入吡啶(2.4 mL, 29.7mmol)，并在5 min以后逐滴加入三氟甲基磺酸酐(1.1 mL, 6.51 mmol)。将混合物历时2小时从-20℃缓慢地温热至0℃。将得到的混合物用CH2Cl2 (75 mL)稀释，将其用冷1.0 M HCl(100 mL)、冷饱和NaHCO3 (100 mL)、冷水(100 mL)和冷盐水(100 mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并在低温浓缩。将残余物溶解在AcCN (20 mL)中，向其中加入四丁基亚硝酸铵(3.0 g, 10.40 mmol)在AcCN (6mL)中的溶液。在50℃搅拌6小时以后，将反应混合物浓缩，并通过硅胶(330 g)上的快速柱色谱法纯化残余物，用0-75%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物。TLC: 硅胶, 己烷/乙酸乙酯: 1/1, Rf = 0.33。UPLC方法B：C30H31NO10的计算值565.19，观察到的m/e = 566.22 [M+1]; Rt = 1.84 min。1H NMR (CDCl3) δ 8.10-8.00 (4 H, m), 7.55-7.25 (11H, m), 5.05-5.00 (3H, m), 4.72-4.68 (1H, m),4.64-4.58 (2H, m), 4.24-4.20 (1H, m), 4.17- 4.12 (1H, m), 3.93-3.87 (1H, m),3.77-3.72 (1H, m), 3.65-3.60 (1H, m), 3.46-3.34 (2H, m)。通过1H-13C一键关联(HSQC)、1H-13C多键关联(HMBC)和1H-1H NOE (NOESY) 2D NMR实验证实立体化学。
步骤C: [2-(β-D-吡喃型甘露糖基氧基)乙基]氨基甲酸苄酯
向{2-[(3,6-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基甲酸苄酯(287 mg, 0.507 mmol)在CH3OH (5 mL)中的搅拌溶液中加入NaOCH (0.1 mL, 0.05 mmol,0.5 M在CH3OH中)。4小时以后，将Amberlite IR 120 (H)离子交换树脂(用3x5mL CH3OH预洗涤过)加入搅拌的反应混合物中。15 min以后，将树脂滤出，并用CH3OH (3x5 mL)洗涤。将滤液浓缩，并通过C18反相硅胶(50 g)上的快速色谱法纯化残余物，用5-60%的AcCN在H2O中的溶液洗脱，得到标题化合物。UPLC方法B：C16H23NO8的计算值357.14，观察到的m/e = 358.16[M+1]; Rt = 1.40 min。1H NMR (CD3OD) δ 7.35-7.24 (5H, m), 5.04 (2H, s), 4.50-4.48 (1H, m), 3.90-3.82 (3H, m), 3.74-3.60 (2H, m), 3.55-3.50 (1H, m), 3.42-3.37 (1H, m), 3.36-3.30 (2H, m), 3.18-3.12 (1H, m)。
步骤D: 2-氨基乙基β-D-吡喃甘露糖苷
将[2-(β-D-吡喃型甘露糖基氧基)乙基]氨基甲酸苄酯(133 mg, 0.372 mmol)和Pd/C (20 mg, 0.019 mmol)在水(5 mL)中的混合物在H2气球下在室温搅拌4小时。将催化剂滤出，并用H2O (3x5 mL)洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物。1H NMR (CD3OD) δ 4.53-4.52 (1H, m), 3.93-3.85 (3H, m), 3.72-3.64 (2H, m), 3.53-3.49 (1H, m), 3.44-3.42 (1H, m), 3.22-3.18 (1H, m), 2.92-2.85 (2H, m)。
步骤E: 2-{[2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基][2- ({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-N-[2-(β- D-吡喃型甘露糖基氧基)乙基]乙酰胺
使用与关于ML-48所述的那些规程类似的规程，用2-氨基乙基β-D-吡喃甘露糖苷替换2-氨基乙基α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 796.37 [M+1];Rt = 2.19 min。
实施例50
描述了具有以下结构的寡糖接头2-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基][2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-N-(2-{1[α-D-吡喃型甘露糖基],4[α-D-吡喃型甘露糖基]-氧基}丁基)乙酰胺(ML-50)的合成。
步骤A: (1[2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基],4[2,3,4,6-四-O-苯 甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基]-二羟基丁-2-基)氨基甲酸苄酯
向含有4Å分子筛的500 mL rb烧瓶中加入(S)-(1,4-二羟基丁-2-基)氨基甲酸苄酯(2.7 g, 11.28 mmol)和三氯乙酰亚氨酸-2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃型甘露糖酯(17.35 g, 23.42 mmol，根据Organic Letters, 2003, 第5卷, 第22期, 4041制备)在无水二氯甲烷(200 mL)中的溶液。将混合物冷却至-30℃并加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(0.4 mL, 2.214 mmol)。在氮气下在-30至环境温度搅拌4h以后，将反应混合物用TEA(3.15 mL, 22.57 mmol)淬灭，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(0- 60%EtOAc/己烷类)纯化残余物，得到标题化合物。(TLC: 硅胶, 己烷/乙酸乙酯:3/2，产物Rf=0.4)。1H NMR(氯仿-d, 500 MHz): δ 8.15-8.10 (4H, m), 8.10-8.05 (4H, m), 8.00-7.95 (4H, m),7.80-7.75 (4H, m), 7.65-7.55 (4H, m), 7.45-7.20 (15H, m), 6.15-6.10 (2H, m),5.95-5.85 (2H, m), 5.80-5.75 (2H, m), 5.15-5.10 (4H, m), 4.75-4.65 (2H, m),4.55-4.40 (4H, m), 4.25-4.20 (1H, m), 4.10-4.00 (2H, m), 3.75-3.65 (2H, m),2.15-2.05 (2H, m)。
步骤B: (1[α-D-吡喃型甘露糖基],4[α-D-吡喃型甘露糖基]-二羟基丁-2-基)氨 基甲酸苄酯
向(1[2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基],4[2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基]-二羟基丁-2-基)氨基甲酸苄酯(9.72 g, 6.96 mmol)在甲醇(30mL)中的溶液中加入0.5M甲醇钠(1.5 mL, 0.750 mmol)在甲醇中的溶液。在室温搅拌48小时以后，将amberlite IR 120 (H)离子交换树脂(用3x30ml甲醇预洗涤过)加入反应混合物中，并搅拌另外15分钟。将离子交换树脂滤出，并用甲醇(2x5 mL)洗涤。将滤液浓缩，并在86 g C18反相柱上纯化残余物，用5%CH3CN在水中的溶液(3柱体积)洗脱，然后用5%至50%CH3CN在水中的溶液(20柱体积)洗脱，得到作为白色固体的标题化合物。UPLC-MS：C24H37NO14的计算值563.22，观察到的m/e: 564.24 (M+H)+ (Rt: 2.31/5.00 min)。
步骤C: 1(α-D-吡喃型甘露糖基),4(α-D-吡喃型甘露糖基)-二羟基丁-2-胺
将(1[α-D-吡喃型甘露糖基],4[α-D-吡喃型甘露糖基]-二羟基丁-2-基)氨基甲酸苄酯(3.73 g, 6.62 mmol)和Pd/C (0.300 g, 0.282 mmol)在水(60 mL)中的混合物在H2气球下在室温搅拌2 h。将催化剂滤出，并用H2O (3x10 mL)洗涤。将滤液浓缩，得到标题化合物。UPLC-MS：C16H31NO12的计算值429.18，观察到的m/e: 430.21 (M+H)+ (Rt: 1.37/5.00min)。
步骤D: 2-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧 代乙基][2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-N-(2-{1 [α-D-吡喃型甘露糖基],4[α-D-吡喃型甘露糖基]-氧基}丁基)乙酰胺
使用与关于ML-29描述的那些规程类似的规程，用1(α-D-吡喃型甘露糖基),4(α-D-吡喃型甘露糖基)-二羟基丁-2-胺替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B：C40H67N5O24的计算值1001.42，观察到的m/e: 1002.48 [M+1]; Rt = 2.05min。
实施例51
描述了具有以下结构的寡糖接头2-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基][2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-β-D-吡喃型甘露糖基]氧基}乙基)乙酰胺(ML-51)的合成。
步骤A:(2-((3,6-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)氧基)氯乙基)
向含有4Å分子筛的500 mL Rb烧瓶中，加入2-氯乙基-β-D-吡喃半乳糖苷(6.58 g,27.1 mmol，根据Carbohydr. Res. 1992, 223, 303制备)、二丁基锡烷酮 (14.5 g, 58.2mmol)和无水甲苯(150 mL)。将混合物回流搅拌3h。3h以后，将反应混合物冷却至室温，然后冷却至0℃。在0℃向反应粗制物的冷溶液中加入苯甲酰氯(6.7 ml, 57.7 mmol)，并将得到的混合物在0℃至环境温度搅拌。24小时以后，将反应混合物滤出并将滤液在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(0-75%EtOAc/己烷类)纯化残余物，得到标题化合物。UPLC-MS：C22H23ClO8的计算值450.11，观察到的m/e: 473.11 (M+Na)+ (Rt: 1.82/5.00 min)。1H NMR (氯仿-d,500 MHz): δ 8.10-8.05 (2H, m), 8.05-8.00 (2H, m), 7.60-7.55 (2H, m), 7.50-7.40 (4H, m), 5.20-5.10 (1H, m), 4.70-4.60 (1H, m), 4.55-4.50 (1H, m), 4.50-4.45 (1H, m), 4.25-4.20 (1H, m), 4.20-4.15 (1H, m), 4.12-4.08 (1H, m), 4.00-3.95 (1H, m), 3.90-3.85 (1H, m), 3.72-3.68 (2H, m)。通过1H-13C一键关联(HSQC)、1H-13C多键关联(HMBC)和1H-1H NOE (NOESY) 2D NMR实验证实区域化学。
步骤B:(2-((3,6-O-苯甲酰基-β-D-吡喃型甘露糖基)氧基)氯乙基)
在-20℃向(2-((3,6-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)氧基)氯乙基) (1 g,2.218 mmol)在DCM (28 mL)中的溶液中加入吡啶(2.5 mL, 30.9 mmol)。搅拌5分钟以后，逐滴加入三氟甲磺酸酐(1.2 mL, 7.10 mmol)，并在搅拌混合物的同时将其历时2小时从-20℃温热至0℃。将得到的混合物用75 ml DCM稀释，并用冷1 M HCl(1x100 mL)、冷NaHCO3水溶液(1x100 mL)、冷水(1x100 mL)和100ml冷盐水洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并在真空中在低温浓缩。将残余物不经进一步纯化直接用在下一步中。将四丁基亚硝酸铵(3.3 g,11.44 mmol)在5 ml无水乙腈中的溶液加入三氟甲基磺酸酯化的中间体在无水乙腈(22mL)中的溶液中，然后使其在50℃反应5小时。将得到的混合物在减压下浓缩，并通过硅胶色谱法(0-75%EtOAc/己烷类)直接纯化，得到标题化合物。UPLC-MS：C22H23ClO8的计算值450.11，观察到的m/e: 451.13 (M+H)+ (Rt: 1.80/5.00 min)。1H NMR (氯仿-d, 500 MHz): δ8.15-8.05 (4 H, m), 7.65-7.60 (2H, m), 7.50-7.40 (4H, m), 5.12-5.08 (1H, m),4.77-4.72 (2H, m), 4.68-4.65 (1H, m), 4.34-4.32 (1H, m), 4.24- 4.14 (2H, m),3.90-3.84 (1H, m), 3.71-3.66 (3H, m), 2.98-2.96 (1H, b), 2.41-2.39 (1H, b)。通过1H-13C一键关联(HSQC)、1H-13C多键关联(HMBC)和1H-1H NOE (NOESY) 2D NMR实验证实立体化学。
步骤C:(2-((2,4-O-苄基,3,6-O-苯甲酰基-β-D-吡喃型甘露糖基)氧基)氯乙基)
在250 mL rb烧瓶中，加入2-(苄氧基)-1-甲基吡啶-1-鎓三氟甲磺酸盐(5 g,14.31 mmol)、氧化镁(0.085 g, 2.118 mmol)、三氟甲苯(40 mL),和(2-((3,6-O-苯甲酰基-β-D-吡喃型甘露糖基)氧基)氯乙基) (1.91 g, 4.24 mmol)。然后将异质反应混合物在82℃搅拌48h。反应结束后，将反应混合物过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(0-75%EtOAc/己烷类)纯化残余物，得到标题化合物。UPLC-MS：C36H35ClO8的计算值630.20，观察到的m/e: 631.21 (M+H)+ (Rt: 3.97/5.00 min)。
步骤D:(2-((2,4-O-苄基-β-D-吡喃型甘露糖基)氧基)氯乙基)
向(2-((2,4-O-苄基,3,6-O-苯甲酰基-β-D-吡喃型甘露糖基)氧基)氯乙基)(1.6g, 2.54 mmol)在甲醇(25 mL)和DCM (5 mL)中的溶液中加入0.5M甲醇钠(0.5 mL, 0.25mmol)在甲醇中的溶液。在室温搅拌4小时以后，将amberlite IR 120 (H)离子交换树脂(用3x5 mL甲醇预洗涤过)加入反应混合物中，并搅拌另外15分钟。将离子交换树脂滤出，并用甲醇(3x5 mL)洗涤。将滤液在减压下浓缩，并通过硅胶色谱法(0-75%EtOAc/己烷类)纯化残余物，得到标题化合物。UPLC-MS：C22H27ClO6的计算值422.15，观察到的m/e: 423.14 (M+H)+(Rt: 1.90/5.00 min)。
步骤E:(2-((2,4-O-苄基-β-D-吡喃型甘露糖基)氧基)叠氮基乙基)
在室温向(2-((2,4-O-苄基-β-D-吡喃型甘露糖基)氧基)氯乙基) (800 mg,1.892 mmol)在无水DMF (25 mL)中的溶液中加入叠氮化钠(140 mg, 2.154 mmol)。然后将反应混合物加热至70℃并在氮气下搅拌16h。反应结束后，将粗制的反应混合物冷却至室温并倒在冰水(200 mL)上，并用乙醚(3x100 mL)萃取。将有机层合并，并用盐水(2x100 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(0-100%EtOAc/己烷类)纯化残余物，得到标题化合物。UPLC-MS：C22H27N3O6的计算值429.19，观察到的m/e: 430.19 (M+H)+(Rt: 1.87/5.00 min)。
步骤F: (2-((2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6- 四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]- (2,4-O-苄基-β-D-吡喃型甘露糖基)氧 基)叠氮基乙基)
向含有4Å分子筛的250 mL Rb烧瓶中加入(2-((2,4-O-苄基-β-D-吡喃型甘露糖基)氧基)叠氮基乙基) (710 mg, 1.653 mmol)和三氯乙酰亚氨酸-2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃型甘露糖酯(2.6 g, 3.51 mmol，根据Organic Letters, 2003, 第5卷, 第22期, 4041制备)在无水二氯甲烷(30 mL)中的溶液。将混合物冷却至-30℃并加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(0.03 mL, 0.166 mmol)。在氮气下在-30至环境温度搅拌4 h以后，将反应混合物用TEA (0.1 mL, 0.717 mmol)淬灭，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(0-75%EtOAc/己烷类)纯化残余物，得到标题化合物。(TLC: 硅胶, 己烷/乙酸乙酯:3/2，产物Rf=0.6)。1H NMR (氯仿-d, 500 MHz): δ 8.15-7.80 (16H, m), 7.62-7.49 (8H, m),7.47-7.32 (20H, m), 7.30-7.15 (6H, m), 6.13-6.05 (2H, m), 6.01-5.91 (2H, m),5.87-5.85 (1H, m), 5.71-5.69 (1H, m), 5.43-5.42 (1H, m), 5.26-5.23 (1H, m),5.13-5.12 (1H, m), 5.03-5.00 (1H, m), 4.84-4.81 (1H, m), 4.68-4.63 (2H, m),4.60-4.55 (2H, m), 4.54-4.48 (2H, m), 4.31-4.25 (2H, m), 4.20-4.15 (1H, m),4.08-4.07 (1H, m), 3.98-3.88 (3H, m), 3.84-3.80 (1H, m), 3.78-3.73 (1H, m),3.62-3.54 (2H, m), 3.38-3.33 (1H, m)。
步骤G: (2-((α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]- (2,4-O-苄基, β-D-吡喃型甘露糖基)氧基)叠氮基乙基)
向2-((2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]- (2,4-O-苄基-β-D-吡喃型甘露糖基)氧基)叠氮基乙基(2.52 g, 1.588 mmol)在甲醇(20 mL)和DCM (4 mL)中的溶液中加入0.5M甲醇钠(0.32 mL, 0.16 mmol)在甲醇中的溶液。在室温搅拌24小时以后，将amberlite IR 120(H)离子交换树脂(用3x30mL甲醇预洗涤过)加入反应混合物中，并将其搅拌另外15分钟。将离子交换树脂滤出，并用甲醇(3x5mL)洗涤。将滤液在减压下浓缩，并通过反相色谱法(C18柱) (不含改性剂的ACN/H2O)纯化残余物，得到标题产物。UPLC-MS：C34H47N3O16的计算值753.30，观察到的m/e: 754.29 (M+H)+ (Rt: 2.93/5.00 min)。
步骤H: 2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→ 6)]-β-D-吡喃甘露糖苷
将2-((α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]- (2,4-O-苄基, β-D-吡喃型甘露糖基)氧基)叠氮基乙基(1.05 g, 1.393 mmol)、和Pd/C (0.148g,0.139 mmol)在水(25 mL)中的混合物在H2气球下在室温搅拌16 h。将催化剂滤出，并用H2O(3x5 mL)洗涤。将滤液在减压下浓缩，得到标题化合物。UPLC-MS：C20H37NO16的计算值547.21，观察到的m/e: 548.23 (M+H)+ (Rt: 1.07/5.00 min)。1H NMR (D2O, 500 MHz): δ5.06-5.05 (1H, m), 4.86-4.85 (1H, m), 4.655-4.65 (1H, m), 4.13-4.12 (1H, m),4.02-4.01 (1H, m), 3.95-3.82 (6H, m), 3.80-3.67 (8H, m), 3.66-3.57 (3H, m),3.53-3.49 (1H, m), 2.90-2.85(2H, m)。
步骤I: 2-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧 代乙基][2-({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-N-(2-{[α- D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-β-D-吡喃型甘露糖基]氧基} 乙基)乙酰胺
使用与关于ML-29描述的那些规程类似的规程，用2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-β-D-吡喃甘露糖苷替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B：C44H73N5O28的计算值1119.44，观察到的m/e: 1120.46 [M+1]; Rt = 2.09min。
实施例52
描述了具有以下结构的寡糖接头6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-{2-[(β-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}-6-氧代己酰胺(ML-52)的合成。
使用与关于ML-1所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用2-氨基乙基β-D-吡喃甘露糖苷替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC-MS：C18H28N2O11的计算值448.17，观察到的m/e:449.19 (M+H)+ (Rt: 1.96/5.00 min)。
实施例53
描述了具有以下结构的寡糖接头4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]- N-{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}4-氧代丁酰胺(ML-53)的合成。
使用与关于ML-4所述的那些规程类似的规程，在步骤A中用4-(苄氧基)-4-氧代丁酸替换6-(苄氧基)-6-氧代己酸，制备标题化合物。UPLC-MS：C16H24N2O10的计算值404.14，观察到的m/e: 405.14 (M+H)+ (Rt: 1.87/5.00 min)。
实施例54
描述了具有以下结构的寡糖接头2,2'-{[2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)-2-氧代乙基]亚氨基}双[N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基}乙基)乙酰胺] (ML-54)的合成。
使用与关于ML-15所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷替换2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B：C56H93N5O39的计算值1459.54，观察到的m/e: m/e = 1460.62 [M+1];Rt = 0.92 min。
实施例55
描述了具有以下结构的寡糖接头2-(2-{([α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基)乙基}{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)乙基α-L-吡喃岩藻糖苷(ML-55)的合成。
步骤A:2-氨基乙基2,3,4,6-戊-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4, 6-戊-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2,4-二苯甲酰基-α-D-吡喃甘露糖苷。
向氮气冲洗的2-叠氮基乙基2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6-O-戊-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2,4-二-O-苯甲酰基-α-D-吡喃甘露糖苷(25 g, 15.5 mmol WO 2010/088294 A1)在EtOAc (300 mL)中的溶液中加入10%炭载钯(1.65 g)，并将得到的混合物在氢气球下在室温搅拌过夜。将混合物穿过硅藻土过滤并将滤液蒸发，通过硅胶柱色谱法(Teledyne Isco: 330g)纯化残余物，洗脱液: 2-5%MeOH在DCM中的梯度，经历8柱体积，得到作为灰白色泡沫的标题化合物(18 g, 73%)。UPLC方法C：C90H77NO26的计算值1587.47，观察到的m/e: 1588.6636 [M+1]; Rt = 4.17 min。
步骤B: 6-(2-{2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4, 6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2,4-二-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖 基]-2-氧基乙基}氨基)己酸苄酯.
向2-氨基乙基2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2,4-二-O-苯甲酰基-α-D-吡喃甘露糖苷(18 g, 11.35 mmol)和6-氧代己酸苄酯(1 g, 4.54 mmol)在DCM (150 mL)中的溶液中加入乙酸(0.26 mL, 4.54 mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(2.41 g, 11.35 mmol)，并将得到的混合物在室温搅拌过夜。将混合物蒸发并将残余物溶解在EtOAc (300 mL)中，并用饱和NaHCO3 (2 x 300 mL)、饱和NaCl (200 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶柱色谱法(Teledyne Isco: 2 x 330g)纯化残余物，洗脱液: 2-5%MeOH在DCM中的梯度，经历8柱体积，得到作为白色泡沫的标题化合物(4.8 g, 59%)。1H NMR (CDCl3) δ 8.33 (2H, m),8.18 (2H, m), 8.13 (2H, dd, J = 8.0和1.4 Hz), 8.10 (2H, dd, J = 8.0和1.4 Hz),8.06 (2H, m), 8.05 (2H, dd, J 4.8和1.6 Hz), 7.84 (4H, m), 7.78 (2H, dd, J =8.0和1.4 Hz), 7.74 (2H, dd, J = 8.0和1.4 Hz), 7.67-7.48 (8H, m), 7.47-7.30(23H, m), 7.25 (2H, t, J = 7.8Hz), 6.14 (1H, t, J = 10.1 Hz), 6.10 (1H, t, J= 10.0 Hz), 6.03 (1H, dd, J = 10.1和3.3 Hz), 5.93 (1H, t, J = 10.0 Hz), 5.80(2H, m), 5.75 (1H, dd, J = 10.1和3.3 Hz), 5.42 (1H, d, J = 1.9 Hz), 5.38 (1H,dd, J = 3.3和1.9 Hz), 5.20 (1H, s), 5.18 (1H, d, J = 1.8 Hz), 5.11 (2H, s),4.69 (1H, dd, J = 9.7和3.5 Hz), 4.67 (1H, dd, J = 12.4和2.6 Hz), 4.62 (1H,dd, J = 12.2和2.4 Hz), 4.57 (1H, m), 4.48 (1H, dt, J = 10.1和2.8 Hz), 4.42-4.31 (3H, m), 4.22 (1H, dd, J = 10.8和6.3 Hz), 4.09 (1H, dt, J = 10.0和5.4Hz), 3.83 (1H, d, J = 10.6 Hz), 3.78 (1H, m), 3.02 (2H, m), 2.73 (2H, t, J =7.3 Hz), 2.37 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.71 (2H, m), 1.59 (2H, m), 1.40 (2H, m)。
步骤C: 2-氧代乙基2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷
向丙-2-烯-1-基2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷(1.34 g, 4.06 mmol)在丙酮(30 mL)和水(7.5 mL)中的溶液中加入4-甲基吗啉4-氧化物(950 mg, 8.11 mmol)，随后加入2.5%OsO4在叔丁醇中的溶液(2.04 mL, 0.162 mmol)。将混合物在室温搅拌16小时。然后向得到的混合物中加入NaIO4 (1.74 g, 8.11 mmol)在水(15 mL)中的溶液。搅拌另外4小时以后，将沉淀物过滤，并用丙酮(50 mL)洗涤。将滤液的体积减小至最初体积的大约1/3，然后用饱和NaHCO3 (100 mL)稀释。用EtOAc (3x50 mL)萃取混合物。将有机相合并，并用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并浓缩。通过硅胶柱色谱法(Teledyne Isco: 120 g)纯化残余物，用0-80%EtOAc在己烷类中的溶液洗脱，得到标题化合物(660 mg, 49%)。1H NMR (CDCl3) δ9.72 (1H, s), 5.44 (1H, dd, J = 10.9和3.3 Hz), 5.35 (1H, dd, J = 3.4和1.8Hz), 5.19 (1H, dd, J = 10.9和3.8 Hz), 5.13 (1H, d, J = 3.8 Hz), 4.26 (3H, m),2.19 (3H, s), 2.15 (3H, s), 2.02 (3H, s), 1.17 (3H, d, J = 6.6 Hz)。
步骤D: 6-{[{2-(2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)-氧基}乙基](2- {(2-{2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基- α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2,4-二-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基]-氧基}乙基)氨 基}己酸苄酯
向6-(2-{2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2,4-二-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基]-2-氧基乙基}氨基)己酸苄酯(1.3 g, 0.725 mmol)和2-氧代乙基2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷(651 mg, 1.96 mmol)在DCM (20 mL)中的溶液中加入乙酸(0.042 mL,0.725 mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(307 mg, 1.45 mmol)，并将得到的混合物在室温搅拌过夜。将混合物蒸发并将残余物在EtOAc (60 mL)和饱和NaHCO3 (80 mL)之间分配；将有机层用另一部分饱和NaHCO3 (80 mL)、饱和NaCl (50 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶柱色谱法(Teledyne Isco: 80g)纯化残余物，洗脱液: 20-100%EtOAc在己烷类中的溶液梯度，经历10柱体积，得到作为白色泡沫的标题化合物(1.5 g, 99%)。1H NMR (CDCl3)δ 8.34 (2H, dd, J 6.7和3.2 Hz), 8.15 (2H, m), 8.10 (4H, m), 8.07 (2H, dd, J =8.0和1.4 Hz), 8.05 (2H, dd, J 8.1和1.5 Hz), 7.88 (4H, m), 7.78 (2H, dd, J =8.0和1.4 Hz), 7.72 (2H, dd, J = 7.8和1.5 Hz), 7.62-7.55 (6H, m), 7.54-7.36(14H, m), 7.34-7.29 (11H, m), 7.25 (2H, t, J = 7.7Hz), 6.14 (1H, t, J = 10.0Hz), 6.07 (1H, m), 6.03 (2H, m), 5.83 (1H, dd, J = 3.3和1.8 Hz), 5.75 (2H,m), 5.41 (1H, m), 5.39 (2H, m), 5.35 (1H, d, J = 3.8 Hz), 5.33 (2H, m), 5.59(1H, d, J = 3.7 Hz), 5.18 (3H, m), 5.16 (1H, d, J = 3.8 Hz), 5.13 (1H, t, J =4.2 Hz), 5.10 (1H, d, J = 3.7 Hz), 5.06 (2H, s), 4.62 (2H, m), 4.54 (1H, m),4.50 (2H, m), 4.57 (1H, m), 4.33 (3H, m), 4.25 (2H, m), 4.19 (2H, m), 3.80(2H, m), 2.82 (2H, m), 2.60 (1H, t, J = 7.3 Hz), 2.32 (2H, t, J = 7.5 Hz),2.20 (3H, s) 2.11 (3H, s) 2.02 (3H, s), 1.63 (2H, m), 1.51 (1H, m) 1.34 (1H,m) 1.18 (3H, d, J = 6.6 Hz)。
步骤E: 6-{[{2-(-α-L-吡喃型岩藻糖基)-氧基}乙基](2-{(2-{-α-D-吡喃型甘露 糖基-(1→3)-[-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]-氧基}乙基)氨基} 己酸甲酯
向6-{[{2-(2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)-氧基}乙基](2-{(2-{2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2,4-二-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基]-氧基}乙基)氨基}己酸苄酯(1.5 g, 0.71 mmol)在DCM (5 mL)和MeOH (15 mL)的混合物中的溶液中加入甲醇钠(0.284 mL的0.5M在MeOH中的溶液，0.142 mmol)，并将混合物在室温搅拌4天。将混合物蒸发至~ 4 mL的体积，并逐滴加入搅拌的乙腈(80 mL)中，得到白色沉淀物。将混合物在3500rpm离心20分钟，将上清液倾析并将固体再悬浮于乙腈(80 mL)中和在3500 rpm离心另外20分钟，将上清液倾析并将固体在干燥的氮气流下干燥，得到作为白色固体的标题化合物(580 mg, 94%)。UPLC方法B：C35H63NO23的计算值865.38，观察到的m/e: 866.48 [M+1]; Rt= 1.71 min。
步骤F: 6-{[{2-(-α-L-吡喃型岩藻糖基)-氧基}乙基](2-{(2-{-α-D-吡喃型甘露 糖基-(1→3)-[-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]-氧基}乙基)氨基} 己酸
向6-{[{2-(-α-L-吡喃型岩藻糖基)-氧基}乙基](2-{(2-{-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]-氧基}乙基)氨基}己酸甲酯(580 mg, 0.67 mL)在水(3 mL)中的溶液中加入5N NaOH (0.161 mL, 0.804 mmol)，并将得到的混合物在室温搅拌6小时。加入乙酸(0.039 mL, 0.683 mmol)，并将混合物低压冻干，得到标题化合物(620 mg, 100%)。UPLC方法B：C34H61NO23的计算值851.36，观察到的m/e:852.48 [M+1]; Rt = 1.74 min。
步骤G: 2-(2-{([α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]- α-D-吡喃型甘露糖基]氧基)乙基}{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨 基)乙基α-L-吡喃岩藻糖苷
向6-{[{2-(-α-L-吡喃型岩藻糖基)-氧基}乙基](2-{(2-{-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]-氧基}乙基)氨基}己酸(100 mg, 0.117 mmol)在无水DMF (2 mL)中的混悬液中加入Hunig氏碱(0.082 mL, 0.47mmol)和1-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)(吡咯烷-1-基)亚甲基)吡咯烷-1-鎓六氟磷酸盐(V) (58 mg, 0.141 mmol)，并将得到的混合物在室温搅拌30分钟。加入TFA (0.036mL, 0.47 mmol)，并将得到的混合物逐滴加入无水乙腈(40 mL)中以形成白色沉淀物。将混合物在3500 rpm离心20分钟，倾析溶剂，并将固体再悬浮于乙腈(40 mL)中并在3500 rpm离心20分钟。倾析溶剂，并将固体在干燥的氮气流下干燥，得到标题化合物(84 mg, 75%)。UPLC方法B：C38H64N2O25的计算值948.38，观察到的m/e: 949.48 [M+1]; Rt = 3.64 min。
实施例56
描述了具有以下结构的寡糖接头2-(2-{([α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基)乙基}{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基)乙基β-L-吡喃岩藻糖苷(ML-56)的合成。
使用与关于ML-55所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用丙-2-烯-1-基2,3,4-三-O-乙酰基-β-L-吡喃岩藻糖苷替换丙-2-烯-1-基2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 949.48 [M+1]; Rt = 3.70 min。
实施例57
描述了具有以下结构的寡糖接头3-(2-{([α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基)乙基}{6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-6-氧代己基}氨基)丙基α-L-吡喃岩藻糖苷(ML-57)的合成。
步骤A: 6-{[3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基](2-[2-{2,3,4,6- 戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露 糖基-(1→6)]-2,4-二-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基}-氧基]乙基)氨基}己酸苄酯
根据关于ML-XX步骤D描述的规程，从6-(2-{2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2,4-二-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基]-2-氧基乙基}氨基)己酸苄酯[ML-XX步骤B]和3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙醛[ML-36步骤E]制备。1H NMR (CDCl3) δ 8.35 (2H, dd,J = 6.4和2.9 Hz), 8.17 (2H, d, J = 7.7 Hz), 8.10 (4H, m), 8.06 (2H, dd, J =7.1和1.5 Hz), 8.04 (2H, dd, J = 7.7和1.5 Hz), 7.89 (2H, m), 7.87 (2H, m),7.80 (2H, dd, J = 7.9和1.4 Hz), 7.74 (2H, m), 7.61 (2H, m), 7.59-7.55 (4H,m), 7.49 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.45-7.35 (12H, m), 7.35-7.27 (26H, m), 7.23(2H, m), 6.18 (1H, t, J = 9.9 Hz), 6.11-6.02 (3H, m), 5.85 (1H, dd, J = 3.3和1.8 Hz), 5.75 (2H, m), 5.37 (2H, m), 5.17 (2H, m), 5.06 (2H, s), 4.77 (1H, d,J = 12.0 Hz), 4.70 (2H, d, J = 8.3 Hz), 4.67-4.60 (5H, m), 4.56 (2H, d, J =8.6 Hz), 4.55-4.47 (4H, m), 4.33 (3H, m), 4.19 (1H, dd, J = 11.0和4.8 Hz),4.01 (1H, dd, J = 10.5和4.7 Hz), 3.86 (1H, m), 3.79 (1H, d, J = 11.2 Hz),3.75 (2H, m), 3.62 (1H, m), 2.79 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.52 (4H, m), 2.32 (2H,t, J = 7.6 Hz), 1.65 (4H, m), 1.48 (2H, m), 1.30 (3H, m), 1.25 (3H, d, J =6.6Hz)。
步骤B: 6-{[3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基](2-[2-{-α-D-吡 喃型甘露糖基-(1→3)-[-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基}-氧基]乙 基)氨基}己酸甲酯
向6-{[3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基](2-[2-{2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[2,3,4,6-戊-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-2,4-二-O-苯甲酰基-α-D-吡喃型甘露糖基}-氧基]乙基)氨基}己酸苄酯(1.3 g,0.577 mmol)在无水DCM (5 mL)和无水MeOH (15 mL)的混合物中的溶液中加入甲醇钠(1.16 mL的0.5M在MeOH中的溶液，0.577 mmol)，并将得到的混合物在室温搅拌3天。将混合物蒸发至~5 mL的体积并逐滴加入搅拌的无水乙腈(80 mL)中。将混合物在3500 rpm离心30分钟，倾析溶剂并将固体再悬浮于乙腈(80 mL)中。将混合物在3500 rpm离心30分钟，倾析溶剂并将固体在干燥的氮气流下风干，得到标题化合物(650 mg, 100%)。UPLC方法B：C57H83NO22的计算值1133.54，观察到的m/e: 1134.64 [M+1]; Rt = 2.08 min。
步骤C: 6-{[3-(-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基](2-[2-{-α-D-吡喃型甘露糖基-(1 →3)-[-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基}-氧基]乙基)氨基}己酸甲酯 盐酸盐
向6-{[3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基](2-[2-{-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基}-氧基]乙基)氨基}己酸甲酯(650 mg, 0.577 mmol)在甲醇(5 mL)中的溶液中加入浓HCl (0.142 mL,1.73 mmol)，用氮气冲洗，并加入10%炭载钯(61 mg)和在氢气球下搅拌3小时。穿过0.4微米注射器尖过滤器过滤，并蒸发滤液。将残余物溶解在水(4 mL)中并低压冻干，得到标题化合物(531 mg, 100%)。UPLC方法B：C39H66N2O24的计算值863.40，观察到的m/e: 864.43 [M+1];Rt = 1.64 min。
步骤D: 3-(2-{([α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]- α-D-吡喃型甘露糖基]氧基)乙基}{6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-6-氧代己基}氨基)丙基 α-L-吡喃岩藻糖苷
根据关于ML-XX步骤F和G描述的规程，从6-{[3-(-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基](2-[2-{-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[-α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基}-氧基]乙基)氨基}己酸甲酯盐酸盐制备。UPLC方法B：C39H66N2O24的计算值946.40，观察到的m/e: 947.51 [M+1]; Rt = 3.55 min。
实施例58
描述了具有以下结构的寡糖接头4-(2-{([α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基]氧基)乙基}{6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-6-氧代己基}氨基)丁基α-L-吡喃岩藻糖苷(ML-58)的合成。
步骤A: 甲磺酸-3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙酯
向在冰浴中冷却的3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙醇[ML-36步骤D] (10.6 g, 22.2 mmol)和Hunig氏碱(4.66 mL, 26.7 mmol)在无水DCM (100 mL)中的溶液中逐滴加入甲磺酰氯(1.9 mL, 24.5 mmol)。完全加入后，将混合物在冰浴温度搅拌1小时。将混合物用水(100 mL)、饱和NaCl (50 mL)洗涤；经Na2SO4干燥，过滤和蒸发，得到标题化合物(12.6 g, 100%)。1H NMR (CDCl3) δ 7.37 (15H, m), 4.80 (2H, m), 4.68 (2H,m), 4.63 (1H, d, J = 11.8 Hz), 4.53 (1H, J = 11.8 Hz), 4.22 (2H, m), 4.00(1H, d, J = 9.8 Hz), 3.94 (1H, m), 2.99 (3H, s), 1.88 (1H, m), 1.75 (2H, m),1.62 (1H, m), 1.31 (3H, d, J = 6.6 Hz)。
步骤B: 3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丁腈
向甲磺酸-3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丙酯(3 g, 5.4 mmol)在无水DMF (30 mL)中的溶液中加入叠氮化钠(422 mg, 6.49 mmol)，并将得到的混合物在60℃加热过夜。将混合物冷却，并用水(100 mL)稀释，并用Et2O (3 x 30 mL)萃取；将合并的Et2O层用饱和NaCl (30 mL)洗涤；经Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶柱色谱法(TeledyneIsco; 120 g)纯化残余物，洗脱液: 0-70%EtOAc在己烷类中的溶液梯度，得到标题化合物(6 g, 76%)。1H NMR (CDCl3) δ 7.29 (15H, m), 4.80 (2H, m), 4.71 (1H, d, J = 11.8Hz), 4.69 (1H, d, J = 11.8 Hz), 4.65 (1H, d, J = 11.8 Hz), 4.54 (1H, d, J =11.8 Hz), 3.95 (2H, m), 3.79 (3H, m), 2.37 (2H, m), 1.80 (2H, m), 1.62 (2H,m), 1.31 (3H, d, J = 6.6 Hz)。
步骤C: 3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丁酸
将3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丁腈(6 g, 12.36 mmol)在乙醇(100 mL)中的混合物用水(100 mL)和5N NaOH (25 mL, 124 mmol)处理，并将得到的混合物回流加热3天。将混合物冷却并通过蒸发除去乙醇，将剩余的水相通过加入浓HCl进行酸化，并用EtOAc (3 x 100 mL)萃取；将合并的EtOAc层用饱和NaCl (100 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到作为浅黄色油的标题化合物(5.2 g, 83%)。1H NMR (CDCl3) δ7.40-7.30 (15H, m), 4.79 (2H, m), 4.71 (1H, d, J = 12.0 Hz), 4.65 (2 H, m),4.53 (1H, d, J = 11.8 Hz), 4.01 (1H, m), 3.92 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.78(2H, m), 2.39 (2H, m), 1.75 (2H, m), 1.59 (2H, m), 1.30 (3H, d, J = 6.6 Hz)。
步骤D: 4-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丁-1-醇
向3-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丁酸(5.2 g, 10.3 mmol)在无水THF (100 mL)中的冰浴冷却溶液中缓慢地加入硼烷-四氢呋喃络合物(12.3 mL的1M在THF中的溶液，12.3 mmol)，并将得到的混合物温热至室温和搅拌3天。将混合物通过加入甲醇(5 mL)进行淬灭，并用饱和NaCl (200 mL)稀释，并用EtOAc (2 x 150 mL)萃取；将合并的EtOAc层经Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶柱色谱法(Teledyne Isco: 120g)纯化残余物，洗脱液: 0-100%EtOAc在己烷类中的溶液梯度，得到作为澄清油的标题化合物(1.73 g,34%)。1H NMR (CDCl3) δ 7.40-7.28 (15H, m), 4.79 (2H, m), 4.71 (1H, d, J = 12.1Hz), 4.66 (2 H, m), 4.54 (1H, d, J = 11.9 Hz), 3.99 (1H, m), 3.93 (1H, m),3.80 (3H, m), 3.65 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1.67 (2H, m), 1.60-1.41 (4H, m), 1.30(3H, d, J = 6.6 Hz)。
步骤E: 4-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丁醛
向4-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丁-1-醇(1.73 g, 3.53 mmol)在DCM (50 mL)中的溶液中加入Dess-Martin试剂(2.24 g, 5.29 mmol)，并将得到的混合物在室温搅拌3小时。将混合物用饱和NaHCO3 (100 mL)洗涤；经Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶柱色谱法(Teledyne Isco: 80g)纯化残余物，洗脱液: 0-80%EtOAc在己烷类中的溶液梯度，得到标题化合物(1.24 g, 72%)。1H NMR (CDCl3) δ 9.77 (1H, s), 7.40-7.28(15H, m), 4.80 (1H, d, J = 12.0 Hz), 4.78 (1H, J = 12.0 Hz), 4.71 (1H, d, J =12.0 Hz), 4.66 (2H, m), 4.54 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.98 (1H, m), 3.92 (1H,m), 3.83-3.76 (3H, m), 2.43 (2H, m), 1.80-1.63 (2H, m), 1.62-1.48 (2H, m),1.30 (3H, d, J = 6.6 Hz)。
步骤F:4-(2-{([α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]- α-D-吡喃型甘露糖基]氧基)乙基}{6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-6-氧代己基}氨基)丁基 α-L-吡喃岩藻糖苷
根据关于ML-57描述的规程，从4-(2,3,4-三-O-苄基-α-L-吡喃型岩藻糖基)丁醛制备。UPLC方法B：C40H68N2O24的计算值960.42，观察到的m/e: 961.48 [M+1]; Rt = 3.46min。
实施例59
描述了具有以下结构的寡糖接头2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}[3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基]氨基)乙基α-D-吡喃甘露糖苷(ML-59)的合成。
使用与关于ML-36所述的那些规程类似的规程，在步骤F中用2-氨基乙基2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖苷替换2-氨基乙基3,4,6-三-O-乙酰基-2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B：C27H46N2O14的计算值622.29，观察到的m/e = 623.3231 [M+1]; Rt = 1.16 min。
实施例60
描述了具有以下结构的寡糖接头2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}[3-(α-L-吡喃型岩藻糖基)丙基]氨基)乙基β-D-吡喃甘露糖苷(ML-60)的合成。
步骤A: (2-((4,6-二-O-苯甲酰基-β-D吡喃半乳糖基)氧基)乙基)氨基甲酸苄酯
向(2-((4,6-二-O-苯甲酰基-β-D吡喃半乳糖基)氧基)乙基)氨基甲酸苄酯(9.4g, 26.3 mmol)中加入3 g 4Å粉末状分子筛，并将混合物悬浮于无水甲苯(100 mL)中。向该混合物中加入二丁基氧化锡(IV) (14.21 g, 57.1 mmol)，并将得到的混合物在95℃加热5小时。将混合物冷却至室温，然后在冰浴中冷却，并逐滴加入苯甲酰氯(6.66 mL, 57.3mmol)。形成细白色沉淀物，加入无水乙腈(15 mL)，并在室温搅拌48小时。将混合物蒸发，并通过硅胶(Teledyne Isco: 330 g)上的柱色谱法纯化残余物，洗脱液: 0-50%EtOAc在己烷类中的溶液(8柱体积)；和50%EtOAc在己烷类中的溶液(10柱体积)，得到作为白色固体的标题化合物(11.56 g, 78%)。
1H NMR (CDCl3) δ 8.11 (2H, d, J = 7.7 Hz), 8.04 (2H, dd, J = 7.9和1.4Hz), 7.58 (2H, m), 7.45 (4H, m), 7.36-7.29 (5H, m), 5.53 (1H, m), 5.14 (1H,dd, J = 10.1和3.3 Hz), 5.06 (2H, s), 4.64 (1H, dd, J = 11.5和6.3 Hz), 4.55(1H, dd, J = 11.5和6.6 Hz), 4.4 (1H, d, J = 7.7 Hz), 4.24 (1H, t, J = 4.2Hz), 4.08 (1H, t, J = 8.8 Hz), 3.93 (2H, m), 3.76 (1H, m), 3.48 (1H, m), 3.37(1H, m), 3.28 (1H, d, J = 3.3 Hz), 2.80 (1H, d, J = 5.3 Hz)。
步骤B: (2-((((3,5-双(三氟甲基)磺酰基)氧基)-4,6-二-O-苯甲酰基-β-D吡喃 半乳糖基)氧基)乙基)氨基甲酸苄酯
向冷却至-15℃的(2-((4,6-二-O-苯甲酰基-β-D吡喃半乳糖基)氧基)乙基)氨基甲酸苄酯(11.56 g, 20.44 mmol)溶解在DCM (200 mL)中的溶液中加入吡啶(21.5 mL,266 mmol)，随后缓慢地加入三氟甲基磺酸酐(10.36 mL, 61.3 mmol)，并将得到的混合物历时3小时温热至0℃。将混合物用另外DCM (200 mL)稀释，并用冰冷的1N HCl (500 mL)、冰冷的饱和NaHCO3 (500 mL)和冰冷的饱和NaCl (500 mL)洗涤；经Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到作为黄色泡沫的标题化合物(16.9 g, 100%)。1H NMR (CDCl3) δ 8.16 (2H, dd, J= 8.0和1.4 Hz), 8.04 (2H, dd, J = 8.1和1.4 Hz), 7.65 (2H, m),7.52 (2H, m),7.50 (2H, m), 7.39 (4H, m), 7.33 (1H, m), 5.55 (1H, dd, J = 10.4和3.1 Hz),5.50 (1H, d, J = 3.1 Hz), 5.35 (1H, t, J = 6.4 Hz), 5.14 (2H, s), 5.12 (1H,m), 4.77 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.73 (1H, m), 4.28 (2H, m), 4.06 (1H, m), 3.80(1H, m), 3.55 (1H, m), 3.47 (1H, m)。
步骤C: (2-((3,5-二-O-乙酰基-4,6-二-O-苯甲酰基-β-D吡喃型甘露糖基)氧基) 乙基)氨基甲酸苄酯
向(2-((((3,5-双(三氟甲基)磺酰基)氧基)-4,6-二-O-苯甲酰基-β-D吡喃半乳糖基)氧基)乙基)氨基甲酸苄酯(16.9 g, 20.37 mmol)在无水甲苯(100 mL)中的溶液中，加入四丁基乙酸铵(25 g, 82.9 mmol)在甲苯(150 mL)和DMF (4 mL)的混合物中的溶液，并将得到的混合物在室温搅拌过夜。用CH2Cl2 (30 mL)稀释，并用饱和NaCl (2 x 100mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶柱色谱法(Teledyne Isco: 330g)纯化残余物，洗脱液: 0-50%EtOAc/己烷(10柱体积)，然后50%EtOAc/己烷(5柱体积)，得到标题化合物(8g, 60.5%)。1H NMR (CDCl3) δ 8.10 (2H, m), 7.98 (2H, dd, J = 8.1和1.4 Hz), 7.61(2H, m), 7.48 (2H, t, J = 7.8 Hz), 7.46 (2H, t, J = 7.7 Hz), 7.37 (4H, m),7.33 (1H, m), 5.70 (1H, d, J = 3.3 Hz), 5.61 (1H, t, J = 10.0 Hz), 5.29 (1H,dd, J = 10.0和3.3 Hz), 5.26 (1H, m), 5.10 (2H, s), 4.79 (1H, s), 4.64 (1H,dd, J = 12.1和2.7 Hz), 4.47 (1H, dd, J = 12.1和5.8 Hz), 3.94 (2H, m), 3.74(1H, m), 3.48 (1H, m), 3.37 (1H, m), 2.15 (3H, s), 2.00 (3H, s)。
步骤D:2-氨基乙基3,5-二-O-乙酰基-4,6-二-O-苯甲酰基-β-D吡喃甘露糖苷
向氮气冲洗的(2-((3,5-二-O-乙酰基-4,6-二-O-苯甲酰基-b-D吡喃型甘露糖基)氧基)乙基)氨基甲酸苄酯(8 g, 12.31 mmol)在EtOAc (100 ml)中的溶液中加入10%炭载钯(1.31 g)，并将得到的混合物在氢气球下搅拌过夜。将混合物穿过硅藻土过滤，并将滤液蒸发，得到作为浅黄色泡沫的标题化合物(6.3 g, 99%)。1H NMR (CDCl3) δ 8.11 (2H, m),7.90 (2H, m), 7.60 (2H, m), 7.47 (4H, m), 5.72 (1H, ddd, J = 9.2, 3.2和1.1Hz), 5.59 (1H, t, J = 9.7 Hz), 5.33 (1H, ddd, J = 10.1, 4.8和3.3 Hz), 4.85(1H, dd, J 16.0和1.1 Hz), 4.65 (1H, m), 4.45 (1H, ddd, J = 12.1, 5.7和2.0Hz), 3.95 (2H, m), 3.73 (1H, m), 3.09 (2H, bs), 2.90 (1H, m), 2.15 (3H, s),1.99 (3H, s)。
步骤E: 2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}[3-(α-L-吡喃型 岩藻糖基)丙基]氨基)乙基a-D-吡喃甘露糖苷
使用与关于ML-36所述的那些规程类似的规程，在步骤F中用2-氨基乙基3,5-二-O-乙酰基-4,6-二-O-苯甲酰基-β-D吡喃甘露糖苷替换2-氨基乙基3,4,6-三-O-乙酰基-2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B：C27H46N2O14的计算值622.29，观察到的m/e = 623.3536 [M+1]; Rt = 1.13 min。
实施例61
描述了具有以下结构的寡糖接头2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基)-α-D-吡喃甘露糖苷(ML-61)的合成。
步骤A: 2-{[2-(2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基}乙基-2, 3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖苷
向2-氧代乙基2,3,4,6四-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖苷(1.3g, 3.33 mmol)和2-氨基乙基2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷(2.22 g, 6.7 mmol)在无水DCM (20 mL)中的混合物中加入TFA (0.257 mL, 3.3 mmol)，并将混合物在室温搅拌10分钟，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.41 g, 6.66 mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。将混合物蒸发，并将残余物在EtOAc (50mL)和饱和NaHCO3 (100 mL)之间分配；将有机层用饱和NaCl (50mL)洗涤；经Na2SO4干燥；过滤并蒸发。通过反相硅胶柱色谱法(Teledyne Isco: C18 275g)纯化残余物，洗脱液: 10-100%CH3CN在水中的梯度，得到标题化合物(667 mg, 28%)。1H NMR(CDCl3) δ 5.37 (1H, dd, J = 10.0和3.5 Hz), 5.32 (1H, d, J = 9.8 Hz), 5.29(1H, dd, J = 3.4和1.9 Hz), 5.26 (1H, dd, J = 3.5和1.1 Hz), 5.20 (1H, dd J =10.5和7.9 Hz), 5.04 (1H, dd, J 10.5和3.4 Hz), 4.87 (1H, d, J = 1.8 Hz), 4.50(1H, d, J = 7.9 Hz), 4.32 (1H, dd, J = 12.3和2.5 Hz), 4.13 (1H, dd, J = 12.2和2.5 Hz), 4.04 (1H, m), 4.00 (1H, m), 3.86-3.79 (2H, m), 3.69 (1H, m), 3.59(1H, m), 2.91-2.85 (4H, m), 2.19 (3H, s), 2.18 (3H, s), 2.13 (3H, s), 2.09(3H, s), 2.07 (3H, s), 2.02 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.25 (3H, d, J = 6.4 Hz)。
步骤B: 6-{[2-(2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基](2-{[-2,3,4, 6-四-O-乙酰基-a-D-吡喃甘露糖基(mannoopyran)]氧基}乙基)氨基}己酸苄酯
向2-{[2-(2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基}乙基-2,3,4,6-四-O-乙酰基-a-D-吡喃甘露糖苷(667 mg, 0.943 mmol)和6-氧代己酸苄酯(311 mg, 1.41mmol)在DCM (6 mL)中的溶液中加入乙酸(0.054 mL, 0.943 mmol)，将混合物在室温搅拌10分钟，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(400 mg, 1.89 mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。UPLC-MS显示完全转化。将混合物蒸发，并将残余物在EtOAc (30 mL)和饱和NaHCO3 (40mL)之间分配；将有机层用饱和NaCl (20 mL)洗涤；经Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过反相硅胶柱色谱法(Teledyne Isco: C18 40g)纯化残余物，洗脱液: 5-100%CH3CN在水中的溶液梯度，得到标题化合物(434 mg, 50%)。1H NMR (CDCl3) δ 7.37 (5H, m), 5.35 (1H, dd,J = 9.9和3.1 Hz), 5.32 (1H, d, J = 9.2 Hz), 5.25 (2H, dd, J = 3.2和1.7 Hz),5.19 (1H, dd, J = 10.5和7.9 Hz), 5.14 (2H, s), 5.04 (1H, dd, J = 10.4和3.5Hz), 4.85 (1H, d, J = 1.7 Hz), 4.51 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.32 (1H, dd, J =12.2和5.1 Hz), 4.12 (1H, dd, J = 12.2和2.5 Hz), 4.04 (1H, m), 3.93 (1H, dt, J= 9.9和5.9Hz), 3.85 (1H, m), 3.72 (1H, dt, J = 10.1和6.0 Hz), 3.59 (1H, dt, J= 9.9和6.6 Hz), 3.51 (1H, m), 2.74-2.71 (4H, m), 2.50 (2H, t, J = 7.4 Hz),2.39 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.19 (3H, s), 2.18 (3H, s), 2.13 (3H, s), 2.07 (3H,s), 2.06 (3H, s), 2.01 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.70-1.66 (4H, m), 1.44 (2H,m), 1.32 (2H, m), 1.24 (3H, d, J = 6.4 Hz)。
步骤C: 2-({6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-2-[(α-L-吡喃型 岩藻糖基)氧基]乙基)-α-D-吡喃甘露糖苷
使用与关于ML-35所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用6-{[2-(2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基](2-{[-2,3,4,6-四-O-乙酰基-a-D-吡喃甘露糖基(mannoopyran)]氧基}乙基)氨基}己酸苄酯替换6-(双{2-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨基)己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B：C26H44N2O15的计算值624.27，观察到的m/e = 625.2990 [M+1]; Rt = 1.12。
实施例62
描述了具有以下结构的寡糖接头N,N'-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰基}吡咯烷-(2R,5R)--2,5-二甲酰胺(ML-62)的合成。
使用与关于ML-6所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用(2R,5R)-吡咯烷-2,5-二甲酸替换2,2'-{[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]亚氨基}二乙酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 736.36 [M+1]; Rt = 2.22 min。
实施例63
描述了具有以下结构的寡糖接头N,N'-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}-1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰基}(哌啶-4,4-二基)二乙酰胺(ML-63)的合成。
使用与关于ML-6所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用2,2'-(哌啶-4,4-二基)二乙酸替换2,2'-{[6-(苄氧基)-6-氧代己酰基]亚氨基}二乙酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 805.38 [M+1]; Rt = 2.35 min。
实施例64
描述了具有以下结构的寡糖接头1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己酰基}-N,N’-双{2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}哌啶-顺式-3,4-二甲酰胺(ML-64)的合成。
使用与关于ML-17所述的那些规程类似的规程，在步骤A中用3,4-吡啶二甲酸替换3,5-吡啶二甲酸作为起始原料，制备标题化合物。UPLC方法F: m/e = 777.3660 [M+1]; Rt= 2.15 min。
实施例65
描述了具有以下结构的寡糖接头6-((3R,4R)-3,4-双((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)氨甲酰基)哌啶-1-基)己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-65)的合成。
步骤A: (3R,4R)-N3,N4-双(2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-甲基四氢- 2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)哌啶-3,4-二甲酰胺
使用与关于ML-17步骤A和B所述的规程类似的规程，在步骤A中用3,4-吡啶二甲酸替换3,5-吡啶二甲酸作为起始原料，制备标题化合物。UPLC方法F: m/e = 552.2733 [M+1]; Rt = 1.37 min。
步骤B: 6-((3R,4R)-3,4-双((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-甲基四 氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)氨甲酰基)哌啶-1-基)己酸苄酯
将(3R,4R)-N3,N4-双(2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)哌啶-3,4-二甲酰胺(118 mg, 0.214 mmol)溶解在THF (2 mL)中，向其中加入6-氧代己酸苄酯(70.7 mg, 0.321 mmol)在THF (0.5 mL)中的溶液，随后加入三乙酰氧基硼氢化钠(136 mg, 0.642 mmol)和乙酸(3.67µL, 0.064 mmol)，并将混合物在室温搅拌3 h。通过C-18柱上的制备型反相色谱法分离产物，使用0-30%的AcN在水中的梯度洗脱。UPLC方法F: m/e = 756.4241 [M+1]; Rt = 3.05 min。
步骤C：寡糖接头6-((3R,4R)-3,4-双((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6- 甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)氨甲酰基)哌啶-1-基)己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基 酯的合成
使用与关于ML-1步骤C和D描述的那些规程类似的规程，在步骤C中用6-((3R,4R)-3,4-双((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)氨甲酰基)哌啶-1-基)己酸苄酯替换6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸苄酯和在步骤D中用6-((3R,4R)-3,4-双((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)氨甲酰基)哌啶-1-基)己酸替换6-({2-[(α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)氧基]乙基}氨基)-6-氧代己酸，制备标题化合物: UPLC方法F: m/e = 763.7796 [M+1]; Rt = 2.15 min。
实施例66
描述了具有以下结构的寡糖接头6-((2R,5R)-2,5-双((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)氨甲酰基)哌啶-1-基)-6-氧代己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-66)的合成。
使用与关于ML-17所述的那些规程类似的规程，在步骤A中用2,5-吡啶二甲酸替换3,5-吡啶二甲酸作为起始原料，制备标题化合物。UPLC方法A: UPLC m/e = 777.0 [M+1];Rt = 0.5 min。
实施例67
描述了具有以下结构的寡糖接头6-(((R)-1,4-二氧代-1-((2-(((2S,3S,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)氨基)-4-((2-(((2R,3S,4R,5S,6S)-3,4,5-三羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)氨基)丁-2-基)氨基)-6-氧代己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-67)的合成。
使用与关于ML-20所述的那些规程类似的规程，在步骤A中用Z-Glu-γ-Bn替换Z-ASP(OBZL)-OH和用2-氨基乙基α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃甘露糖苷替换2-氨基乙基α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B:m/e = 753.26 [M+1]; Rt = 1.59 min。
实施例68
描述了具有以下结构的寡糖接头(ML-68)的合成。
使用与关于ML-20所述的那些规程类似的规程，在步骤A中用Z-Glu-γ-Bn替换Z-ASP(OBZL)-OH，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 1077.52 [M+1]; Rt = 2.93 min。
实施例69
描述了具有以下结构的寡糖接头6-(2-(双(-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-69)的合成。
步骤A: 1,2,3,4-四(氧基)四(三甲基硅烷) L-岩藻糖
在0℃向L-岩藻糖(4.0g, 24.37 mmol, 1.0当量)在DMF (25 mL)中的溶液中加入TEA (17.32 mL, 124 mmol, 5.1当量)。向以上混合物中逐滴加入TMS-Cl (15.88 mL, 125mmol, 5.1当量)。然后将反应物温热至室温并在室温搅拌4小时。将反应混合物倒入冰和己烷混合物(100 mL, 1:1)中。将混合物用己烷(100mL x 3)萃取。将有机相用水(10 ml x 3)洗涤，经MgSO4干燥，过滤。将过滤浓缩并用高真空泵干燥，得到作为无色油的标题化合物(8.7 g, 19.2 mmol, 79%)。13C NMR (CDCl3, 125MHz) δ 94.5 (1C), 70.6 (1C), 69.6(1C), 66.6 (1C), 39.6 (4C), 16.7 (Me), 0.67 (3Me), 0.43 (3Me), 0.29 (3Me),0.16 (3Me)；1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 5.0 (s, 1H), 4.0 (m, 1H), 3.8 (1H), 3.6(1H), 1.0 (d, 3H), 0-0.2 (m, 36H)。
步骤B: 6-(2-(双(2-羟基乙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯
在0℃向2-(双(2-羟基乙基)氨基)乙酸(500 mg, 3.06 mmol, 1.0当量)在DMF(10 mL)中的溶液中加入TSTU (1107 mg, 3.68 mmol, 1.2当量)，随后加入TEA (0.512mL, 3.68 mmol, 1.2当量)。将反应物温热至室温并在该温度搅拌2h。向以上混合物中加入与TEA (0.512 ml, 3.66 mmol)预混合的L-000503048-001W001 (1447 mg, 3.68 mmol,1.2当量)。将反应物在室温搅拌18小时。UPLC指示期望的产物的形成。在减压下除去DMF。将粗制物通过C18反相色谱法(用0-30%ACN/水洗脱，16柱体积)纯化。将含有期望的产物的级分合并，浓缩并低压冻干，得到作为无色浆的标题化合物。UPLC方法B: m/e = 367.2356 [M+1]; Rt = 3.54 min。
步骤C: 6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄 酯
在0℃向6-(2-(双(2-羟基乙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯(210 mg, 0.573 mmo,1.0当量)在DCM (10 mL)中的溶液中加入TBAI (1820 mg, 4.93 mmol, 8.6当量)、DIPEA(0.500 ml, 2.87 mmol, 5.0当量)。将混合物温热至室温并在室温搅拌30 min。向以上溶液中逐滴加入1,2,3,4-四(氧基)四(三甲基硅烷) L-岩藻糖(1557 mg, 3.44 mmol, 6.0当量)和碘代三甲基硅烷(0.390 ml, 2.87 mmol, 5.0当量)在DCM (10 ml)中的溶液。将混合物在室温搅拌18小时。UPLC指示期望的产物的形成。除去DCM并加入MeOH (10 ml)和DowexH+树脂直到pH ~2。在室温搅拌1h。穿过硅藻土垫过滤。将滤液浓缩并通过C18反相色谱法(用0-30%ACN/水洗脱，16柱体积)纯化。将含有期望的产物的级分合并，浓缩并低压冻干，得到作为无色浆的标题化合物(40 mg, 0.061 mmol, 10.6%)。UPLC方法B: m/e = 659.3745[M+1]; Rt = 3.36 min。
步骤D: 6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸
向6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯(40mg, 0.061 mmol)在水(5 ml)中的溶液中，加入Pd/C (30.5 mg, 0.029 mmol)。将反应物在H2气球下搅拌18小时。UPLC指示期望的产物的形成。将以上溶液用MeOH (5 mL)稀释，穿过硅藻土垫过滤，浓缩并低压冻干，得到作为无色浆的标题化合物(20 mg, 6.1%)。UPLC方法B: m/e = 569.3191 [M+1]; Rt = 1.93 min。
步骤E: 6-(2-(双(-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸-2, 5-二氧代吡咯烷-1-基酯
向6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸(20 mg,0.037 mmol, 1.0当量)在DMF (1 mL)中的溶液中加入TSTU (16.68 mg, 0.055 mmol, 1.5当量)，随后加入Hunig氏碱(7.74µl, 0.044 mmol, 1.2当量)。将反应物在室温搅拌1h。TLC(4/1/1/1 EtOAc/MeOH/ACN/水)指示没有剩余起始原料。UPLC指示产物的形成。在减压下除去DMF。将粗产物不经纯化地使用。UPLC方法B: m/e = 666.3351 [M+1]; Rt = 2.28 min。
实施例70
描述了具有以下结构的寡糖接头6-(2-(双(-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丙基)氨基)乙酰氨基)己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-70)的合成。
步骤A: 6-(双(3-羟丙基)氨基)-6-氧代己酸苄酯
向3,3'-氮烷二基双(丙烷-1-醇) (1000 mg, 7.51 mmol, 1.0当量)在DMF (10ml)中的溶液中加入(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己二酸苄酯(2503 mg, 7.51 mmol, 1.0当量)，随后加入TEA (1.046 ml, 7.51 mmol, 1.0当量)。将反应物在25℃搅拌18小时。UPLC指示期望的产物的形成。在减压下除去DMF。将粗制物通过C18反相色谱仪(用0-40%ACN/水洗脱，16柱体积)进行纯化。将含有期望的产物的级分合并和浓缩，得到作为无色油的标题化合物(1.55 g, 4.41 mmol, 58.7%)。UPLC方法B: m/e = 352.2171 [M+1]; Rt = 3.47min。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 7.3-7.5 (m, 5H), 5.15 (m, 2H), 3.65 (m, 2H),3.40 (m, 5H), 2.66 (s, 3H), 2.45 (m, 3H), 2.29 (s, 1H), 1.84 (s, 1H), 1.70(m, 7H)。
步骤B：6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄 酯
使用与关于ML-YZ-1所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用6-(双(3-羟丙基)氨基)-6-氧代己酸苄酯替换6-(2-(双(2-羟基乙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 644.3454 [M+1]; Rt = 3.28 min。
步骤C: 6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丙基)氨基)乙酰氨基)己酸
使用与关于ML-YZ-1所述的那些规程类似的规程，在步骤D中用6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯替换6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e =554.3076 [M+1]; Rt = 2.13 min。
步骤E: 6-(2-(双(-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丙基)氨基)乙酰氨基)己酸-2, 5-二氧代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-YZ-1所述的那些规程类似的规程，在步骤E中用6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丙基)氨基)乙酰氨基)己酸替换6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 651.3166 [M+1]; Rt = 2.41 min。
实施例71
描述了具有以下结构的寡糖接头6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丁基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯(ML-71)的合成。
步骤A: 4-(苄氧基)-N-(4-(苄氧基)丁基)丁酰胺
在0℃向4-(苄氧基)丁酸(1 g, 5.15 mmol, 1.0当量)在DMF (5 ml)中的溶液中，加入TSTU (1.627 g, 5.41 mmol, 1.05当量)，随后加入TEA (0.718 ml, 5.15 mmol, 1.0当量)。将反应物温热至室温并在室温搅拌2小时。向以上反应物中加入4-(苄氧基)丁-1-胺(0.969 g, 5.41 mmol, 1.05当量)，随后加入TEA (0.718 ml, 5.15 mmol, 1.0当量)。将反应物在室温搅拌18小时。LC-MS显示期望的产物的形成。在减压下除去DMF。将粗制物通过硅胶柱(120 g，用0-15%MeOH/DCM洗脱，16柱体积)进行纯化。将含有期望的产物的级分合并和浓缩，得到标题化合物(1.65 g, 4.64 mmol, 90%收率)。LC-MS方法A: m/e = 356.70 [M+1]; Rt = 1.22 min。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 7.2-7.4 (m, 10H), 5.98 (s, 1H),4.51 (m, 4H), 3.53 (m, 4H), 3.24 (m, 2H), 2.28 (m, 2H), 1.96 (m, 2H), 1.5-1.7(m, 4H)。
步骤B: 双(4-(苄氧基)丁基)胺
在200 mL圆底烧瓶中，在0℃向4-(苄氧基)-N-(4-(苄氧基)丁基)丁酰胺(1.65 g,4.64 mmol)在THF (5 ml)中的溶液中逐滴加入BH3.THF (13.93 ml, 13.93 mmol)。将反应物温热至室温并在室温搅拌18小时。TLC显示产物的形成和起始原料的消失。用饱和NH4Cl水溶液淬灭反应。将混合物浓缩，用EtOAc稀释，与1 N HCl一起摇动，也用碳酸氢盐、盐水和水洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将粗制物不经纯化用于下一步。LC-MS方法A:m/e = 341.00 [M+1]; Rt = 1.06 min。
步骤C: 4,4’-氮烷二基双(丁-1-醇)
向双(4-(苄氧基)丁基)胺(300 mg, 0.879 mmol)在二氧杂环己烷(5 ml)/水(5mL)的混合溶剂中的溶液中，加入PdOH2 (30.8 mg, 0.044 mmol)。将反应物在40 PSI的H2下搅拌18 h。LC-MS显示没有起始原料和期望的产物的形成。将混合物穿过硅藻土垫过滤，用二氧杂环己烷/水(10 mL, 1/1)洗涤。将滤液浓缩，并经高真空泵干燥，得到标题化合物(130 mg, 0.806 mmol, 92%收率)。LC-MS方法A: m/e = 162.01 [M+1]; Rt = 0.18 min。
步骤D：6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丁基)氨基)乙酰氨基)己酸苄 酯
使用与关于ML-69所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用6-(双(3-羟基丁基)氨基)-6-氧代己酸苄酯替换6-(2-(双(2-羟基乙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 644.3454 [M+1]; Rt = 3.28 min。
步骤E: 6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丙基)氨基)乙酰氨基)己酸
使用与关于ML-69所述的那些规程类似的规程，在步骤D中用6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丁基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯替换6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e =554.3076 [M+1]; Rt = 2.13 min。
步骤F: 6-(2-(双(-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丁基)氨基)乙酰氨基)己酸-2, 5-二氧代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-69所述的那些规程类似的规程，在步骤E中用6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丁基)氨基)乙酰氨基)己酸替换6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 651.3166 [M+1]; Rt = 2.41 min。
步骤G: 6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)丁基)氨基)乙酰氨基)己酸苄 酯
使用与关于ML-69所述的那些规程类似的规程，在步骤C中用6-(双(3-羟基丁基)氨基)-6-氧代己酸苄酯替换6-(2-(双(2-羟基乙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 644.3454 [M+1]; Rt = 3.28 min。
实施例72
描述了具有以下结构的寡糖接头6-(2,3-二-2[2-(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基乙基)氨甲酰基)环丙烷羧基(carboxylic))氨基)乙酰氨基))己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-72)的合成。
步骤A: 2,3-双-2[2-(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基乙基)氨甲酰基)环丙烷甲酸
向L-000719504-000X003 (353 mg, 2.027 mmol)在DMF (10ml)中的溶液中加入EDC (816 mg, 4.26 mmol)和HOBT (93 mg, 0.608 mmol)。将混合物在25℃搅拌30 min。向以上混合物中加入AEF (882 mg, 4.26 mmol)。将混合物在25℃搅拌18小时。UPLC指示期望的产物的形成。在减压下除去DMF。将粗制物通过C18反相色谱仪(用含有0.05%TFA的0-30%ACN/水洗脱，37 min)进行纯化。将含有期望的产物的级分合并和低压冻干，得到标题化合物(80 mg, 0.145 mmol, 7.14%收率)。UPLC方法B: m/e = 553.2539 [M+1]; Rt = 2.63min。
步骤B：6-(2,3-双-2[2-(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基乙基)氨甲酰基)环丙烷羧基 (carboxylic))氨基)乙酰氨基)己酸苄酯
使用与关于ML-69所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用2,3-双-2[2-(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基乙基)氨甲酰基)环丙烷甲酸替换2-(双(2-羟基乙基)氨基)乙酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 756.3689 [M+1]; Rt = 3.15 min。
步骤C: 6-(2,3-双-2[2-(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基乙基)氨甲酰基)环丙烷羧基 (carboxylic))氨基)乙酰氨基)己酸
使用与关于ML-69所述的那些规程类似的规程，在步骤D中用6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯替换6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e =666.3151 [M+1]; Rt = 1.23 min。
步骤D: 2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,3-双-2[2-(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基乙 基)氨甲酰基)环丙烷羧基(carboxylic))氨基)乙酰氨基))己酸酯
使用与关于ML-69所述的那些规程类似的规程，在步骤E中用6-(2,3-双-2[2-(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基乙基)氨甲酰基)环丙烷羧基(carboxylic))氨基)乙酰氨基)己酸替换6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 763.3411 [M+1]; Rt = 1.99 min。
实施例73
描述了具有以下结构的寡糖接头6-氧代-(6-((3-α-D-吡喃型甘露糖基)丙基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基)己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-73)的合成。
步骤A: 全-TMS D-甘露糖
使用与关于ML-69所述的那些规程类似的规程，在步骤A中用D-甘露糖替换L-岩藻糖，制备标题化合物。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 4.9 (s, 1H), 3.5-3.9 (m, 6H), 0-0.3 (m, 45H)。
步骤B: 2,3,4,6-四-O-三甲基硅烷D-吡喃型甘露糖基
在0度向全-TMS D-甘露糖(5.4 g, 9.98 mmol)在DCM (25 ml)中的溶液中加入碘代三甲基硅烷(1.426 ml, 10.48 mmol)。将反应物温热至室温并在室温搅拌1小时。通过减压除去DCM。将中间体不经纯化地用于下一步。
步骤C: 3-碘丙氧基α-D-吡喃甘露糖苷和3-碘丙氧基β-D-吡喃甘露糖苷
在0℃向2,3,4,6-四(三甲基硅烷) D-吡喃型甘露糖基(2.89 g, 4.99 mmol)在DCM (10 ml)中的溶液中，加入氧杂环丁烷(0.488 ml, 7.49 mmol)。将反应物温热至室温并在室温搅拌5小时。通过旋转蒸发除去DCM。将混合物溶解在MeOH (10 mL)中。向以上溶液中加入Dowex H+树脂直到pH ~2。将混合物在室温搅拌1小时。LC-MS指示期望的产物的形成。将混合物穿过硅藻土垫过滤，浓缩，并通过C8反相色谱法(用含有0.05%TFA的5-25%ACN/水洗脱，25 min)纯化。将含有期望的产物的级分收集并低压冻干，得到3-碘丙氧基α-D-吡喃甘露糖苷(710 mg, 2.04 mmol, 40.8%)和3-碘丙氧基β-D-吡喃甘露糖苷(420 mg, 1.21mmol, 24.2%)。LC-MS方法A: m/e = 696.96 [M+1]; Rt = 0.46 min和Rt = 0.53 min。1HNMR (CD3OD, 500 MHz) 3-碘丙氧基β-D-吡喃甘露糖苷: δ4.54 (d, J = 0.95 Hz, 1H),3.95 (m, 1H), 3.88-3.92 (m, 2H), 3.75 (m, 1H), 3.65 (m, 1H), 3.50 (m, 1H),3.45 (m, 1H), 3.3-3.4 (m, 2H), 3.23 (m, 1H), 2.1 (m, 2H)。1H NMR (CD3OD, 500MHz) 3-碘丙氧基α-D-吡喃甘露糖苷: δ4.81 (m, 1H), 3.8-3.9 (m, 3H), 3.6-3.8 (m,3H), 3.5-3.6 (m, 2H), 3.3-3.4 (m, 2H), 2.1(m, 2H)。
步骤D:α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基}丙基α-D-吡喃甘露糖苷
向3-碘丙氧基α-D-吡喃甘露糖苷(220 mg, 0.632 mmol)在DMF (5 mL)中的溶液中，加入AEF (131 mg, 0.632 mmol)和LiOH (15.13 mg, 0.632 mmol)。将混合物在室温搅拌24小时。UPLC指示产物的形成。在减压下除去DMF。将粗制物不经纯化用于下一步。UPLC方法B: m/e = 428.2252 [M+1]; Rt = 1.02 min。
步骤E:6-氧代-(6-((3-α-D-吡喃型甘露糖基)丙基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基] 氨基)己酸苄酯
使用与关于ML-69所述的那些规程类似的规程，在步骤A中用α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基}丙基α-D-吡喃甘露糖苷替换α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基}丙基α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 646.3233 [M+1]; Rt = 3.13 min。
步骤F: 6-氧代-(6-((3-α-D-吡喃型甘露糖基)丙基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基] 氨基)己酸
使用与关于ML-69所述的那些规程类似的规程，在步骤D中用6-氧代-(6-((3-α-D-吡喃型甘露糖基)丙基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基)己酸苄酯替换6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B:m/e = 556.2731 [M+1]; Rt = 1.77 min。
步骤G: 6-氧代-(6-((3-α-D-吡喃型甘露糖基)丙基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基] 氨基)己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
使用与关于ML-69所述的那些规程类似的规程，在步骤E中用6-氧代-(6-((3-α-D-吡喃型甘露糖基)丙基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基)己酸替换6-(2-(双(2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基)乙基)氨基)乙酰氨基)己酸，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e =653.3008 [M+1]; Rt = 2.09 min。
实施例74
描述了具有以下结构的寡糖接头6-氧代-(6-((3-β-D-吡喃型甘露糖基)丙基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基)己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-74)的合成。
使用与关于ML-73所述的那些规程类似的规程，在步骤A-F中用β-D-吡喃型甘露糖替换α-D-甘露糖，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 653.3167 [M+1]; Rt = 2.07 min。
实施例75
描述了具有以下结构的寡糖接头8-氧代-(6-((3-β-D-吡喃型甘露糖基)丙基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基)辛烷二酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-75)的合成。
使用与关于ML-73所述的那些规程类似的规程，在步骤A-F中用β-D-吡喃型甘露糖替换α-D-甘露糖和用8-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)辛烷二酸苄酯替换(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己二酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 681.3568 [M+1]; Rt = 2.44min。
实施例76
描述了具有以下结构的寡糖接头8-氧代-(6-((3-α-D-吡喃型甘露糖基)丙基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基)辛烷二酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-76)的合成。
使用与关于ML-73所述的那些规程类似的规程，用8-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)辛烷二酸苄酯替换(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己二酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e= 681.3456 [M+1]; Rt = 2.21 min。
实施例77
描述了具有以下结构的寡糖接头9-氧代-(6-((3-α-D-吡喃型甘露糖基)丙基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基)壬烷二酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-77)的合成。
使用与关于ML-73所述的那些规程类似的规程，用9-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)壬烷二酸苄酯替换(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己二酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e= 695.3532 [M+1]; Rt = 2.55 min。
实施例78
描述了具有以下结构的寡糖接头10-氧代-(6-((3-α-D-吡喃型甘露糖基)丙基-α-L-吡喃型岩藻糖基)乙基]氨基)癸烷二酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(ML-78)的合成。
使用与关于ML-73所述的那些规程类似的规程，用10-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)癸烷二酸苄酯替换(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己二酸苄酯，制备标题化合物。UPLC方法B:m/e = 709.3766 [M+1]; Rt = 2.79 min。
实施例79
描述了具有以下结构的寡糖接头6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-β-D-吡喃型甘露糖基]氧基}丙基)-6-氧代己酰胺(ML-79)的合成。
步骤A: 3-叠氮基丙氧基β-D-吡喃甘露糖苷
向3-碘丙氧基β-D-吡喃甘露糖苷(2.0 g, 5.74 mmol)在DMF (10 ml)中的溶液中，加入叠氮化钠(448 mg, 0.448 mmol)。将反应物温热至60℃并在该温度在N2下搅拌12小时。LC-MS指示期望的产物的形成。在减压下除去DMF。将粗制物通过C18反相色谱法(用16柱体积的0-20%ACN/水洗脱，然后用2柱体积的100%ACN、2柱体积的0%ACN洗脱)进行纯化。将含有期望的产物的级分合并和低压冻干，得到标题化合物(1.27 g, 4.82 mmol, 84%收率)。LC-MS方法A: m/e = 264.16 [M+1]; Rt = 0.21。1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ4.53(m, 1H), 4.02 (m, 1H), 3.97 (m, 2H), 3.65 (m, 2H), 3.56 (m, 1H), 3.48 (m,3H), 3.22 (m, 1H), 1.92 (m, 2H)。
步骤B: 2.4-苯甲酰基3-叠氮基丙氧基β-D-吡喃甘露糖苷
向3-叠氮基丙氧基β-D-吡喃甘露糖苷(1030 mg, 3.91 mmol)在乙腈(15 ml)中的溶液中加入邻苯甲酸三乙酯(2.352 ml, 10.17 mmol)，随后加入TFA (0.030 ml, 0.391mmol)和ACN (0.5 mL)。将混合物在室温搅拌1小时。旋转蒸发以除去ACN。加入TFA (10%在水中) (4.28 ml, 5.55 mmol)。将混合物在室温搅拌2小时。通过硅胶上的柱色谱法纯化残余物，用乙醚/CH2Cl2洗脱，得到作为白色固体的以上产物。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ7.0 - 8.2 (m, 10H), 5.72 (dd, 1H, J = 3.4 Hz, J = 1.1 Hz), 5.44 (t, 1H, J =9.6 Hz), 4.79 (d, 1H, J=1.1 Hz), 4.16 (dd, 1H, J = 3.4 Hz, J = 1.1 Hz), 4.00(m, 1H), 3.88 (m, 1H), 3.82 (m, 1H), 3.66 (m, 2H), 3.31 (m, 2H), 1.82 (m,2H)。
步骤C: 2-叠氮基丙氧基2,4-二-O-苯甲酰基-3,6-O-(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基- α-D-吡喃型甘露糖基) -β-D-吡喃甘露糖苷
使用与关于ML-2所述的那些规程类似的规程，在步骤B中用2.4-苯甲酰基3-叠氮基丙氧基β-D-吡喃甘露糖苷替换2-叠氮基乙基2,4-双-O-苯甲酰基-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃甘露糖苷，制备标题化合物。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ7.0- 8.3 (m, 50H), 6.2(m, 2H), 5.95 (m, 2H), 5.85 (m, 2H), 5.70 (m, 1H), 5.35 (m, 2H), 5.22 (s,1H), 3.0-5.0 (m, 15H), 1.90 (m, 2H)。
步骤D: 6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-N-(2-{[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→ 3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-β-D-吡喃型甘露糖基]氧基}丙基)-6-氧代己酰胺
使用与关于ML-2在步骤D-F中所述的那些规程类似的规程，制备标题化合物。UPLC方法B: m/e = 787.3816 [M+1]; Rt = 3.39 min。
实施例80
描述了A1保护的胰岛素的合成。
在适当大小的容器中，在有碱（例如，TEA）存在下将胰岛素在室温悬浮于有机溶剂（例如，DMSO）中。将混合物轻轻搅拌直到胰岛素完全溶解。向得到的溶液中加入保护试剂（例如，三氟乙酸乙酯或9-芴基甲基五氟苯基碳酸酯），所述保护试剂是纯的或在有机溶剂（诸如DMSO或DMF）的溶液中。UPLC色谱图表明大部分反应混合物已经转化成A1-保护的胰岛素以后，可以对反应混合物直接进行反相HPLC纯化(Waters C4 250x50 mm柱, 10 μm,1000Å柱或Kromasil C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在去离子水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)，或可以通过在0℃用冷的酸性H2O(20x, pH约3.0)小心地稀释将反应物淬灭，并使用1 N HCl (和0.1 N NaOH，如果需要的话)将它的pH调至2.5的最终pH。可以将溶液首先通过超滤进行浓缩，所述超滤是通过切向流过滤(TFF)系统或使用Amicorn Ultra-15 Centrifugal Units（具有1K、3K或10K MWCO膜）。然后对经浓缩的溶液进行反相HPLC纯化(Waters C4 250x50 mm柱, 10 μm, 1000Å柱或Kromasil C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在去离子水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)。将含有标题缀合物的级分合并和冷冻干燥或使用TFF系统和/或Amicorn Ultra-15进行缓冲液更换以得到N A1保护的胰岛素。
实施例81
描述了N A1-三氟乙酰基胰岛素的合成。
在100圆底烧瓶中装入胰岛素(300 mg, 0.052 mmol)，向其中加入8 mL DMSO，然后加入TEA (43.4 mg, 0.429 mmol)。将混合物轻轻地在室温搅拌约30分钟，直到得到澄清溶液。向得到的溶液中加入三氟乙酸乙酯(35.2 mg, 0.248 mml)。在室温搅拌4小时以后，将混合物用H2O (100 mL, pH=3.00)小心地稀释。使用10 MWCO Amicon Ultra-15离心试管将它的体积减小至20 mL以后，通过HPLC (Kromasil®C8 10 μm, 100Å, 50x250 mm柱，210nm, 流速为85 mL/min, 0.05%TFA在AcCN/H2O中的溶液, 26%AcCN至37%AcCN在H2O中的溶液, 20 min渐变)纯化得到的溶液。将期望的级分合并和冷冻干燥，得到N A1-三氟乙酰基胰岛素。UPLC方法A: m/e = 1476.55 [(M+4)/4]; Rt = 3.62 min。
实施例82
本实施例显示了IOC-143的合成。
在室温向N A1-三氟乙酰基人胰岛素(77.7 mg, 0.013 mmol)在DMSO (1.2 mL)中的溶液中加入TEA (18 μL, 0.132 mmol)和ML-11 (30.2 mg, 0.039 mmol)在DMSO (300 μL)中的溶液。在室温搅拌4小时以后，将混合物加入AcCN (40 mL)中。通过离心收集沉淀物。将收集的固体溶解在水(5 mL, pH = 3.00)中，并将混合物冷却至0℃，向其中加入NH4OH溶液(5 mL, 28%在水中)。将混合物在0℃搅拌2小时，然后用水(20 mL, pH = 3.00)稀释。使用10K MWCO Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units将得到的溶液的体积减小至5mL，并用水(100 mL, pH = 3.00)进一步渗滤至约7.5 mL的终体积，将其通过HPLC纯化，得到IOC-143。UPLC方法A: Rt = 3.58 min; m/e = 1801.906。
实施例83
描述了N A1-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]人胰岛素(N1-Fmoc胰岛素)的合成。
在20 ml闪烁瓶中将胰岛素(1.5g, 0.258 mmol)溶解在DMSO (6 mL)中。向胰岛素溶液中加入在DMSO (1 mL)中的9-芴基甲基五氟苯基碳酸酯(0.105 g, 0.258 mmol)。将混合物搅拌15分钟。
通过C-4反相柱上的Gilson HPLC色谱法纯化产物。将期望的级分(首先洗脱的单体)收集和低压冻干，得到期望的NαA1-Fmoc胰岛素产物。UPLC MS (C4, 5分钟): 1508.37(M+4/4)在4.47分钟。
实施例84
描述了A1, B29保护的胰岛素或A1,B28保护的赖脯胰岛素的合成。
在适当大小的容器中，在有碱（例如，TEA）存在下将胰岛素在室温悬浮于有机溶剂或混合的水性/有机溶剂（例如，DMSO）中。将混合物轻轻搅拌直到胰岛素完全溶解。向得到的溶液中加入保护试剂（例如，三氟乙酸乙酯或9-芴基甲基五氟苯基碳酸酯），所述保护试剂是纯的或在有机溶剂（诸如DMSO或DMF）的溶液中。UPLC色谱图表明大部分反应混合物已经转化成A1,B29-保护的胰岛素(A1,B28-保护的赖脯胰岛素)以后，可以对反应混合物直接进行反相HPLC纯化(Waters C4 250x50 mm柱, 10 μm, 1000Å柱或Kromasil C8 250x50mm, 10 μm, 100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在去离子水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)，或可以通过在0℃用冷的酸性H2O (20x, pH ~ 3.0)小心地稀释将反应物淬灭，并使用1 N HCl (和0.1 N NaOH，如果需要的话)将它的pH调至2.5的最终pH。可以将溶液首先通过超滤进行浓缩，所述超滤是通过切向流过滤(TFF)系统或使用AmicornUltra-15 Centrifugal Units（具有1K、3K或10K MWCO膜）。然后对经浓缩的溶液进行反相HPLC纯化(Waters C4 250x50 mm柱, 10 μm, 1000Å柱或Kromasil C8 250x50 mm, 10 μm,100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在去离子水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)。将含有标题缀合物的级分合并和冷冻干燥或使用TFF系统和/或Amicon Ultra-15进行缓冲液更换，得到标题产物。
实施例85
描述了N A1, N εB29-双(三氟乙酰基)人胰岛素的合成。
在100圆底烧瓶中装入人胰岛素(300 mg, 0.052 mmol)，向其中加入AcCN (6.0mL)、水(6.0 mL)和DIPEA (1.5 mL, 8.59 mmol)。在0℃向得到的混合物中加入三氟乙酸乙酯(0.9 mL, 7.54 mml)。在0℃搅拌2小时以后，通过HPLC (Kromasil®C8 10 μm, 100Å,50x250 mm柱，210 nm，流速为85 mL/min, 0.05%TFA在AcCN/H2O中的溶液, 27%AcCN至37%的AcCN在H2O中的溶液, 20 min渐变)纯化混合物。将期望的级分合并和冷冻干燥，得到N A1,N εB29-双(三氟乙酰基)人胰岛素。UPLC方法A: m/e = 1500.677 [(M+4)/4]; Rt = 3.87min。
实施例86
描述了N A1, N εB29-双[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]人胰岛素的合成。
在20 mL闪烁瓶中，将人胰岛素(1.19 g, 0.205 mmol)和TEA (257 μL, 1.844mmol)溶解在DMSO (10 mL)中。向该胰岛素溶液中加入在DMSO (2 mL)中的1-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮(207 mg, 0.615 mmol)。在室温搅拌30 min以后，通过加入HCl (1.84 mL, 1.844 mmol, 1.0 M)淬灭反应。通过反相HPLC色谱法纯化得到的混合物。将期望的级分收集和低压冻干，得到N A1, N εB29-双[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]人胰岛素。UPLC方法A: m/e = 1564.04 [(M+4/4)]; Rt = 4.41 min。
实施例87
在胰岛素的N A1 和N εB29 上具有相同接头-寡糖的缀合物的合成.
在适当大小的容器中，在有碱（例如，TEA）存在下将胰岛素在室温悬浮于有机溶剂（例如，DMSO）中。将混合物轻轻搅拌直到胰岛素完全溶解。在一个单独的瓶中，在室温将活化的酯中间体溶解在有机溶剂（例如，DMSO）中。将活化的酯溶液的等分试样经历一段时间加入含有胰岛素的溶液中，直到UPLC色谱图表明所有未修饰的胰岛素已经反应，并且大部分反应混合物已经转化成A1,B29-缀合的胰岛素。通过加入胺亲核体（例如，2-氨基乙醇）淬灭反应。将反应溶液在室温搅拌30 min。将得到的溶液在0℃用冷H2O (20x)小心地稀释，并使用1 N HCl (和0.1 N NaOH，如果需要的话)将它的pH调至2.5的最终pH。可以将溶液首先通过超滤进行浓缩，所述超滤是通过切向流过滤(TFF)系统或使用Amicon Ultra-15Centrifugal Units（具有1K、3K或10K MWCO膜）。经常将经浓缩的溶液首先进行离子交换色谱法(PolySULFOETHYL A柱, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 m, 1000Å；缓冲液A: 0.1%v/vH3PO4/25%AcCN；缓冲液B: 0.1%v/v H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)。将含有期望纯度的A1,B29-缀合物的级分合并，并使用TFF系统或Amicon Ultra-15浓缩。然后将得到的溶液通过反相HPLC (Waters C4 250x50 mm柱, 10 μm, 1000Å柱或Kromasil C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在去离子水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)进一步纯化。将含有标题缀合物的级分合并和冷冻干燥或使用TFF系统和/或Amicon Ultra-15进行缓冲液更换，得到标题产物。
实施例88
在胰岛素的N A1 上具有接头-寡糖的缀合物的合成
在适当大小的容器中，在有碱（例如，TEA）存在下将胰岛素在室温悬浮于有机溶剂（例如，DMSO）中。将混合物轻轻搅拌直到胰岛素完全溶解。在一个单独的瓶中，在室温将活化的酯中间体溶解在有机溶剂（例如，DMSO）中。将活化的酯溶液的等分试样经历一段时间加入含有胰岛素的溶液中，直到UPLC色谱图表明大部分未修饰的胰岛素已经反应，并且大部分反应混合物已经转化成A1-缀合的胰岛素。通过加入胺亲核体（例如，2-氨基乙醇）淬灭反应。将反应溶液在室温搅拌30 min。将得到的溶液在0℃用冷H2O (20x)小心地稀释，并使用1 N HCl (和0.1 N NaOH，如果需要的话)将它的pH调至2.5的最终pH。可以将溶液首先通过超滤进行浓缩，所述超滤是通过切向流过滤(TFF)系统或使用Amicon Ultra-15Centrifugal Units（具有1K、3K或10K MWCO膜）。经常将经浓缩的溶液首先进行离子交换色谱法(PolySULFOETHYL A柱, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000Å；缓冲液A: 0.1%v/vH3PO4/25%AcCN；缓冲液B: 0.1%v/v H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)。将含有期望纯度的A1-缀合物的级分合并，并使用TFF系统或Amicon Ultra-15浓缩。然后将得到的溶液通过反相HPLC (Waters C4 250x50 mm柱, 10 μm, 1000Å柱或Kromasil C8 250x50 mm, 10 μm,100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在去离子水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)进一步纯化。将含有标题缀合物的级分合并和冷冻干燥或使用TFF系统和/或Amicon Ultra-15进行缓冲液更换，得到标题产物。
实施例89
在胰岛素的N B1 上具有接头-寡糖的缀合物的合成
根据实施例50，可以制备N B1胰岛素缀合物。或者，它可以使用保护的胰岛素作为底物进行制备：
在适当大小的容器中，在有碱（例如，TEA）存在下将保护的胰岛素（例如，N A1,N εB29-双[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-或N A1,N εB29-双(三氟乙酰基)人胰岛素）在室温悬浮于有机溶剂（例如，DMSO）中。将混合物轻轻搅拌直到保护的胰岛素完全溶解。在一个单独的瓶中，在室温将活化的酯中间体溶解在有机溶剂（例如，DMSO）中。将活化的酯溶液的等分试样经历一段时间加入含有胰岛素的溶液中，直到UPLC色谱图表明所有未修饰的胰岛素已经反应，并且大部分反应混合物已经转化成B1-缀合的保护的胰岛素。通过加入过量的胺亲核体（例如，2-氨基乙醇）或氨，在低温淬灭反应。将反应溶液在低温搅拌，直到UPLC色谱图指示保护基的完全除去。将得到的溶液在0℃用冷H2O (20x)小心地稀释，并使用1 N HCl (和0.1 N NaOH，如果需要的话)将它的pH调至2.5的最终pH。可以将溶液首先通过超滤进行浓缩，所述超滤是通过切向流过滤(TFF)系统或使用Amicon Ultra-15 Centrifugal Units（具有1K、3K或10K MWCO膜）。经常将经浓缩的溶液首先进行离子交换色谱法(PolySULFOETHYL A柱, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000Å；缓冲液A: 0.1%v/vH3PO4/25%AcCN；缓冲液B: 0.1%v/v H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)。将含有期望纯度的B1-缀合物的级分合并，并使用TFF系统或Amicon Ultra-15浓缩。然后将得到的溶液通过反相HPLC (Waters C4 250x50 mm柱, 10 μm, 1000Å柱或Kromasil C8 250x50 mm, 10 μm,100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在去离子水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)进一步纯化。将含有标题缀合物的级分合并和冷冻干燥或使用TFF系统和/或Amicon Ultra-15进行缓冲液更换，得到标题产物。
实施例90
在胰岛素的N εB29 上具有接头-寡糖的缀合物的合成
在适当大小的容器中，将胰岛素在轻轻搅拌下在室温溶解在混合溶剂（2:3 v/v0.1 M Na2CO3:AcCN）中。混合物澄清以后，使用碱性溶液（例如，0.1 N NaOH）将pH调至10.5-10.8的值。在一个单独的瓶中，在室温将活化的酯中间体溶解在有机溶剂（例如，DMSO）中。将活化的酯溶液的等分试样经历一段时间加入含有胰岛素的溶液中，直到UPLC色谱图表明大部分未修饰的胰岛素已经反应，并且大部分反应混合物已经转化成B29-缀合的胰岛素。通过加入胺亲核体（例如，2-氨基乙醇）淬灭反应。将反应溶液在室温搅拌30 min。将得到的溶液在0℃用冷H2O (20x)小心地稀释，并使用1 N HCl (和0.1 N NaOH，如果需要的话)将它的pH调至2.5的最终pH。可以将溶液首先通过超滤进行浓缩，所述超滤是通过切向流过滤(TFF)系统或使用Amicon Ultra-15 Centrifugal Units（具有1K、3K或10K MWCO膜）。经常将经浓缩的溶液首先进行离子交换色谱法(PolySULFOETHYL A柱, PolyLC Inc., 250x21mm, 5 μm, 1000Å；缓冲液A: 0.1%v/v H3PO4/25%AcCN；缓冲液B: 0.1%v/v H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)。将含有期望纯度的B29-缀合物的级分合并，并使用TFF系统或Amicon Ultra-15浓缩。然后将得到的溶液通过反相HPLC (Waters C4 250x50 mm柱, 10 μm, 1000Å柱或Kromasil C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)进一步纯化。将含有标题缀合物的级分合并和冷冻干燥或使用TFF系统和/或Amicon Ultra-15进行缓冲液更换，得到标题产物。
实施例91
在胰岛素的N B1 和N εB29 上具有相同接头-寡糖的缀合物的合成
在适当大小的容器中，在有碱（例如，TEA）存在下将保护的胰岛素（例如，N A1-(9H-芴-9-基甲氧基)羰基-或N A1-(三氟乙酰基)人胰岛素）在室温悬浮于有机溶剂（例如，DMSO）中。将混合物轻轻搅拌直到保护的胰岛素完全溶解。在一个单独的瓶中，在室温将活化的酯中间体溶解在有机溶剂（例如，DMSO）中。将活化的酯溶液的等分试样经历一段时间加入含有胰岛素的溶液中，直到UPLC色谱图表明所有未修饰的保护的胰岛素已经反应，并且大部分反应混合物已经转化成B1,B29-缀合的保护的胰岛素。通过加入过量的胺亲核体（例如，2-氨基乙醇）或氨，在低温淬灭反应。将反应溶液在低温搅拌，直到UPLC色谱图指示保护基的完全除去。将得到的溶液在0℃用冷H2O (20x)小心地稀释，并使用1 N HCl (和0.1 NNaOH，如果需要的话)将它的pH调至2.5的最终pH。可以将溶液首先通过超滤进行浓缩，所述超滤是通过切向流过滤(TFF)系统或使用Amicon Ultra-15 Centrifugal Units（具有1K、3K或10K MWCO膜）。经常将经浓缩的溶液首先进行离子交换色谱法(PolySULFOETHYL A柱,PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000Å；缓冲液A: 0.1%v/v H3PO4/25%AcCN；缓冲液B:0.1%v/v H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)。将含有期望纯度的B1,B29-缀合物的级分合并，并使用TFF系统或Amicon Ultra-15浓缩。然后将得到的溶液通过反相HPLC (Waters C4 250x50mm柱, 10 μm, 1000Å柱或Kromasil C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在去离子水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)进一步纯化。将含有标题缀合物的级分合并和冷冻干燥或使用TFF系统和/或Amicon Ultra-15进行缓冲液更换，得到标题产物。
实施例92
在胰岛素的N A1 、N B1 和N εB29 上具有相同接头-寡糖的缀合物的合成
在适当大小的容器中，在有碱（例如，TEA）存在下将胰岛素在室温悬浮于有机溶剂（例如，DMSO）中。将混合物轻轻搅拌直到胰岛素完全溶解。在一个单独的瓶中，在室温将活化的酯中间体溶解在有机溶剂（例如，DMSO）中。将活化的酯溶液的等分试样经历一段时间加入含有胰岛素的溶液中，直到UPLC色谱图表明所有未修饰的胰岛素已经反应，并且大部分反应混合物已经转化成A1-、B1-、和B29-缀合的胰岛素。通过加入胺亲核体（例如，2-氨基乙醇）淬灭反应。将反应溶液在室温搅拌30 min。将得到的溶液在0℃用冷H2O (20x)小心地稀释，并使用1 N HCl (和0.1 N NaOH，如果需要的话)将它的pH调至2.5的最终pH。可以将溶液首先通过超滤进行浓缩，所述超滤是通过切向流过滤(TFF)系统或使用Amicon Ultra-15 Centrifugal Units（具有1K、3K或10K MWCO膜）。经常将经浓缩的溶液首先进行离子交换色谱法(PolySULFOETHYL A柱, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000Å；缓冲液A:0.1%v/v H3PO4/25%AcCN；缓冲液B: 0.1%v/v H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)。
将含有期望纯度的A1, B1, B29-缀合物的级分合并，并使用TFF系统或AmiconUltra-15浓缩。然后将得到的溶液通过反相HPLC (Waters C4 250x50 mm柱, 10 μm, 1000Å柱或Kromasil C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在去离子水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)进一步纯化。将含有标题缀合物的级分合并和冷冻干燥或使用TFF系统和/或Amicon Ultra-15进行缓冲液更换，得到标题产物。
实施例93
在胰岛素的N A1 和N εB29 上具有不同接头-寡糖的缀合物的合成
在适当大小的容器中，在有碱（例如，TEA）存在下将N εB29-缀合的胰岛素在室温悬浮于有机溶剂（例如，DMSO）中。将混合物轻轻搅拌直到胰岛素完全溶解。在一个单独的瓶中，在室温将活化的酯中间体溶解在有机溶剂（例如，DMSO）中。将活化的酯溶液的等分试样经历一段时间加入含有胰岛素的溶液中，直到UPLC色谱图表明所有未修饰的胰岛素已经反应，并且大部分反应混合物已经转化成A1,B29-缀合的胰岛素。通过加入胺亲核体（例如，2-氨基乙醇）淬灭反应。将反应溶液在室温搅拌30 min。将得到的溶液在0℃用冷H2O (20x)小心地稀释，并使用1 N HCl (和0.1 N NaOH，如果需要的话)将它的pH调至2.5的最终pH。可以将溶液首先通过超滤进行浓缩，所述超滤是通过切向流过滤(TFF)系统或使用AmiconUltra-15 Centrifugal Units（具有1K、3K或10K MWCO膜）。可以对经浓缩的溶液首先进行离子交换色谱法(PolySULFOETHYL A柱, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000Å；缓冲液A: 0.1%v/v H3PO4/25%AcCN；缓冲液B: 0.1%v/v H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)。将含有期望纯度的A1,B29-缀合物的级分合并，并使用TFF系统或Amicon Ultra-15浓缩。然后将得到的溶液通过反相HPLC (Waters C4 250x50 mm柱, 10 μm, 1000Å柱或Kromasil C8 250x50mm, 10 μm, 100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在去离子水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)进一步纯化。将含有标题缀合物的级分合并和冷冻干燥或使用TFF系统和/或Amicon Ultra-15进行缓冲液更换，得到标题产物。
实施例94
在胰岛素的N B1 和N εB29 上具有相同接头-寡糖的缀合物的合成
在适当大小的容器中，在有碱（例如，TEA）存在下将保护的胰岛素（例如，N εB29-(9H-芴-9-基甲氧基)羰基-或N A1-(三氟乙酰基)人胰岛素）在室温悬浮于有机溶剂（例如，DMSO）中。将混合物轻轻搅拌直到保护的胰岛素完全溶解。在一个单独的瓶中，在室温将活化的酯中间体溶解在有机溶剂（例如，DMSO）中。将活化的酯溶液的等分试样经历一段时间加入含有胰岛素的溶液中，直到UPLC色谱图表明所有未修饰的保护的胰岛素已经反应，并且大部分反应混合物已经转化成A1,B1-缀合的保护的胰岛素。通过加入过量的胺亲核体（例如，2-氨基乙醇）或氨，在低温淬灭反应。将反应溶液在低温搅拌，直到UPLC色谱图指示保护基的完全除去。将得到的溶液在0℃用冷H2O (20x)小心地稀释，并使用1 N HCl (和0.1 N NaOH，如果需要的话)将它的pH调至2.5的最终pH。可以将溶液首先通过超滤进行浓缩，所述超滤是通过切向流过滤(TFF)系统或使用Amicon Ultra-15 Centrifugal Units（具有1K、3K或10K MWCO膜）。经常将经浓缩的溶液首先进行离子交换色谱法(PolySULFOETHYL A柱, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000Å；缓冲液A: 0.1%v/vH3PO4/25%AcCN；缓冲液B: 0.1%v/v H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)。将含有期望纯度的B1,B29-缀合物的级分合并，并使用TFF系统或Amicon Ultra-15浓缩。然后将得到的溶液通过反相HPLC (Waters C4 250x50 mm柱, 10 μm, 1000Å柱或Kromasil C8 250x50 mm, 10 μm, 100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在去离子水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)进一步纯化。将含有标题缀合物的级分合并和冷冻干燥或使用TFF系统和/或Amicon Ultra-15进行缓冲液更换，得到标题产物。
实施例95
描述了N εB29-(三氟乙酰基)人胰岛素的合成。
在100圆底烧瓶中装入人胰岛素(200 mg, 0.034 mmol)，向其中加入AcCN (4.0mL)、水(4.0 mL)和TEA (0.5 mL, 3.44 mmol)。在0℃向得到的混合物中加入三氟乙酸乙酯(0.41 mL, 3.44mml)。在0℃搅拌30 min以后，将混合物用水(20 mL, pH ~ 3.0)稀释。将得到的溶液小心地酸化直到pH ~ 2.5以后，通过HPLC (Delta Pak C4 15 μm, 300Å, 50x250mm柱，210 nm，流速为85 mL/min, 0.05%TFA在AcCN/H2O中的溶液, 27%AcCN至37%的AcCN在H2O中的溶液, 20 min渐变)纯化混合物。将期望的级分合并和冷冻干燥，得到标题化合物。UPLC方法A: m/e = 1476.5012 [(M+4)/4]; Rt = 3.71 min。
实施例96
IOC-3（在B1和B29处缀合至接头ML-7的人胰岛素）的合成。
在室温将N αA1-Tfa- 胰岛素(60 mg, 0.01 mmol)溶解在1 ml DMSO中，向该溶液中加入三乙胺(10.3 mg, 0.102 mmol)，将ML-7 (18.2 mg, 0.023 mmol)溶解在100 uL DMSO中并加入反应混合物中。在室温搅拌4小时以后，将混合物加入40 ml AcCN中。形成沉淀物并通过离心收集。将收集的固体溶解在5 mL PH=3.00去离子水中并冷却至0℃，然后将5 mLNH4OH (28%在水中)加入所述水溶液中，将混合物在0℃搅拌2小时，然后用20 mL去离子水PH=3.00稀释。将混合物用10K膜Amicon离心管浓缩至5 mL，并用100 mL PH=3.00去离子水进一步渗滤至约7.5 mL的终体积和通过制备型HPLC纯化。HPLC条件如下: Kromasil®C8 10μm, 100Å, 50x250 mm柱，210 nm，流速为85 mL/min, 0.05%TFA在AcCN/H2O中的溶液, 26%AcCN至32%AcCN在H2O中的溶液, 25 min渐变, 收集所述级分并低压冻干成粉末(38.8 mg，收率52.4%) 1784.76[M+4]/4, tR=3.435。
实施例97
本实施例显示了胰岛素寡糖缀合物(IOC-123)的制备，其中寡糖接头ML-11连接至在人胰岛素的位置B1和B29处的NH2基团。
将N αA1-Fmoc胰岛素(80 mg, 0.014 mmol)和接头ML-11 (100 mg, 0.068 mmol)温热至室温保持30分钟。向在20 mL瓶内的N αA1-Fmoc胰岛素(80 mg, 0.014 mmol)在DMSO(1.00 mL)中的溶液中加入三乙胺(18.95µL, 0.136 mmol)。将ML-11 (100 mg, 0.068mmol)在DMSO (0.90 mL)中的溶液以三等份和50分钟间隔加入反应瓶中。通过加入2-氨基乙醇(103µL, 1.700 mmol)淬灭反应，并将混合物在室温搅拌20 min。将混合物在0℃稀释进H2O (10 mL)中。使用1 N HCl将反应混合物的pH调至约2.5。
首先通过离子交换色谱法纯化粗产物。将期望的级分使用Amicon UltraCentrifugel Filters浓缩或低压冻干过夜，然后通过反相制备型HPLC (Gilson C-4柱)进一步纯化。将合并的期望的级分低压冻干以产生固体。然后将固体溶解在水中，并使用0.1NNaOH溶液将pH调至7以得到IOC-123的溶液。
实施例98
本实施例解释了IOC-113 (N A1, N βB29-双{6-[顺式-3,5-双({2-[(α-L-吡喃型岩藻糖基)氧基]乙基}氨甲酰基)哌啶-1-基]-6-氧代己酰基}人胰岛素)的合成，其中人胰岛素的A1和B1位置缀合至ML-17。
在室温向含有人胰岛素(105 mg, 0.018 mmol)的20 mL闪烁瓶中加入DMSO (1mL)和DIPEA (35.1 mg, 0.271 mmol)。将混合物轻轻搅拌直到胰岛素溶解。在一个单独的瓶中，在室温将接头ML-17 (35.1 mg, 0.045 mmol)溶解在DMSO (0.9 mL)中。向含有人胰岛素的溶液中以三等份以50分钟间隔加入ML-17的溶液。通过加入2-氨基乙醇(34µL, 0.42mmol)淬灭反应。在室温搅拌20分钟以后，将得到的混合物在0℃用冷H2O (4 mL)小心地稀释。使用1 N HCl (或0.1 N NaOH)将得到的混合物的pH调至2.5的最终pH。首先对混合物进行离子交换色谱法(PolySULFOETHYL A柱, PolyLC Inc., 250x21 mm, 5 μm, 1000Å；缓冲液A: 0.1%v/v H3PO4/25%AcCN；缓冲液B: 0.1%v/v H3PO4/25%AcCN/0.5 M NaCl)。将含有标题缀合物作为主要产物的级分合并，并使用Amicon-15 MWCO 3k或10k Ultra CentrifugelFilters浓缩或在中和至约7.0的pH以后冷冻干燥。然后将得到的溶液或重构的缀合物溶液通过反相制备型HPLC (Waters C4 250x50 mm柱, 10 μm, 1000Å柱或Kromasil C8 250x50mm, 10 μm, 100Å柱；缓冲液A: 0.05-0.1%TFA在去离子水中的溶液；缓冲液B: 0.05-0.1%TFA在AcCN中的溶液)进一步纯化。将含有> 95%标题缀合物的级分合并和冷冻干燥，得到标题产物。UPLCMS (C4, 5分钟): 1948.66 (M+4/4)在3.48 min。
实施例99
本实施例显示了IOC-52 (N A1-6-氧代-6-((2-(α-L-吡喃型岩藻糖基氧基)乙基)氨基)己酰基-N εB29-6-((((2-氧代-2-((α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)-2-氧基乙基)氨基)(2-氧代-2-((α-L-吡喃型岩藻糖基氧基)-2-氧代乙基)氨基)乙基)氨基)乙酰氨基)-6-氧代己酰基人胰岛素)的构建，其中人胰岛素的A1和B1残基分别缀合至接头ML-4和ML-29。
N εB29 -6-((((2-氧代-2-((α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基- (1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)-2-氧基乙基)氨基)(2-氧代-2-((α-L-吡喃型岩藻糖基氧 基)-2-氧代乙基)氨基)乙基)氨基)乙酰氨基)-6-氧代己酰基人胰岛素(IOC-58)的合成
将人胰岛素(1000 mg, 0.172 mmol)溶解在Na2CO3水溶液(8.6 mL, 0.1 M)和AcCN(5.7 mL)中。将得到的溶液的pH调至10.5，向其中逐份加入ML-29 (6-((((2-氧代-2-((α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)-2-氧基乙基)氨基)(2-氧代-2-((α-L-吡喃型岩藻糖基氧基)-2-氧代乙基)氨基)乙基)氨基)乙酰氨基)-6-氧代己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯) (289 mg, 0.258 mmol)在DMF (2.9mL)中的溶液。通过UPLC-MS监测反应进程，并通过加入乙醇胺(52.1µL, 0.861 mmol)淬灭反应。将反应混合物用H2O (15 mL)稀释，并使用1.0 N HCl溶液将pH调至约2.5。将得到的混合物通过HPLC (离子色谱法, PolySULFOEthyl A, 9.4 x 250 mm, 梯度10-45%) (流动相A: 0.1%v/v H3PO4/25%乙腈在水中的溶液, 流动相B: 0.1%v/v H3PO4/25%乙腈/0.5MNaCl在水中的溶液)，历时30分钟，流速15 mL/分钟)纯化。将期望的级分合并，使用6Amicon Ultra Centrifugel Filters（具有Utracel 10K）在3500 RPM在4℃浓缩，并冷冻干燥，得到作为白色粉末的标题化合物(600 mg, 51%收率)。UPLC方法A: tR = 3.58分钟。[M+4H/4]+ = 1703.99。
N A1 -6-氧代-6-((2-(α-L-吡喃型岩藻糖基氧基)乙基)氨基)己酰基-N εB29 - 6- ((((2-氧代-2-((α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃 型甘露糖基)-2-氧基乙基)氨基)(2-氧代-2-((α-L-吡喃型岩藻糖基氧基)-2-氧代乙基)氨 基)乙基)氨基)乙酰氨基)-6-氧代己酰基人胰岛素的合成
在室温向N εB29 -6-((((2-氧代-2-((α-D-吡喃型甘露糖基-(1→3)-[α-D-吡喃型甘露糖基-(1→6)]-α-D-吡喃型甘露糖基)-2-氧基乙基)氨基)(2-氧代-2-((α-L-吡喃型岩藻糖基氧基)-2-氧代乙基)氨基)乙基)氨基)乙酰氨基)-6-氧代己酰基人胰岛素(150 mg,0.022 mmol)和TEA (30.7µL, 0.22 mmol)在DMSO (1.5 mL)中的溶液中分份加入6-氧代-6-((2-(α-L-吡喃型岩藻糖基氧基)乙基)氨基)己酸-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(17 mg,0.040 mmol) (ML-4)在DMSO (1.0 mL)中的溶液。通过加入乙醇胺(13.32µL, 0.22 mmol)淬灭反应。在室温搅拌15分钟以后，将反应混合物用H2O (15 mL)稀释，并使用1.0 N HCl溶液将pH调至约2.5。将得到的混合物通过HPLC (离子色谱法, PolySULFOEthyl A, 9.4 x250 mm, 梯度10-40%) (流动相A: 0.1%v/v H3PO4/25%乙腈在水中的溶液, 流动相B: 0.1%v/v H3PO4/25%乙腈/0.5MNaCl在水中的溶液)，历时30分钟，流速15 mL/分钟)纯化。将期望的级分合并，使用2 Amicon Ultra Centrifugel Filters（具有Utracel 10K）在3500 RPM在4℃浓缩。将得到的混合物在HPLC (C4, 50x250 mm, 含有0.1%TFA的25-30%的AcCN在H2O中的溶液梯度，历时30分钟, 流速85 mL/分钟)上纯化。将期望的级分合并和冷冻干燥，得到作为白色粉末的标题化合物(31mg, 19%收率)。UPLC方法A: tR = 3.79 min。[M+4H/4]+ =1783.3。
实施例100
IOC-10（在B1和B29处缀合至接头ML-6的人胰岛素）的合成。
将A1 Fmoc胰岛素(80 mg, 0.014 mmol)和接头ML-6 (100 mg, 0.068 mmol)温热至室温保持30分钟；向在20 mL瓶内的A1 Fmoc胰岛素(80 mg, 0.014 mmol)在DMSO (1.00mL)中的溶液中加入三乙胺(18.95µL, 0.136 mmol)。将接头ML-6 (100 mg, 0.068 mmol)在DMSO (0.90 ml)中的溶液以三等份和50分钟间隔加入反应瓶中。通过加入2-氨基乙醇(103µl, 1.700 mmol)淬灭反应，并将混合物在室温搅拌20分钟。将混合物在0℃稀释进H2O(10 mL)中。使用1 N HCl将反应混合物的pH调至约2.5。
首先通过离子交换色谱法纯化粗产物。将期望的级分使用Amicon UltraCentrifugel Filters浓缩或低压冻干过夜，然后通过反相制备型HPLC (Gilson C-4柱)进一步纯化。将合并的希望的级分低压冻干。然后将固体溶解在水中，并使用0.1N NaOH溶液将pH调至7。通过Lambda Bio+UV\Vis波谱仪在λ276测量样品的浓度。UPLCMS (C4, 5分钟):在3.72分钟为1763.3 (M+4/4)。
实施例101
IOC-226（分别在B1和B29处缀合至接头ML-31和ML-54的人胰岛素）的合成。
在室温将N αA1-Tfa- 胰岛素(40 mg, 0.0067 mmol)溶解在1 ml DMSO中，向该溶液中加入DIPEA (0.038ml, 0.215 mmol)，将ML-54 (11.5 mg, 0.0078 mmol)溶解在115 uLDMSO中并加入反应混合物中。将反应混合物在室温搅拌2h或直到UPLC色谱图显示大部分反应混合物已经转化成B29-缀合的胰岛素。然后，将第二种活化的酯ML-31 (16 mg, 0.014mmol)溶解在160 uL DMSO中并加入反应混合物中。将反应混合物在室温搅拌16h或直到UPLC色谱图显示大部分反应混合物已经转化成B1, B29-缀合的胰岛素。将混合物加入40ml AcCN中。形成沉淀物并通过离心收集。将收集的固体溶解在5 mL PH=3.00去离子水中并冷却至0℃，然后将5 mL NH4OH (28%在水中)加入水溶液中，将混合物在0℃搅拌2小时，然后用20 mL去离子水PH=3.00稀释。将混合物用10K膜Amicon离心管浓缩至3 mL，并用60 mLPH=3.00去离子水进一步渗滤至约5 ml的终体积。首先通过离子交换色谱法纯化粗产物。将期望的级分使用Amicon Ultra Centrifugel Filters浓缩，并然后通过反相制备型HPLC进一步纯化。HPLC条件如下: Kromasil®C8 10 μm, 100Å, 50x250 mm柱，210 nm，流速为85mL/min, 0.05%TFA在AcCN/H2O中的溶液, 27%AcCN至33%AcCN在H2O中的溶液, 25 min渐变，收集级分并低压冻干成粉末。然后将固体溶解在水中，并使用0.1N NaOH溶液将pH调至7。通过Lambda Bio+UV\Vis波谱仪在λ276测量样品的浓度(16.53 mg，收率29.2%) 1632.54[M+5]/5, tR=3.35。
实施例101
如下执行胰岛素受体结合测定。
利用两个竞争性结合测定来确定IOC对人胰岛素受体B型(IR(B))相对于用125[I]标记的内源性配体胰岛素的亲和力。
方法E：IR结合测定是使用过表达人IR(B)的CHO细胞的全细胞结合方法。将细胞在含有10%FBS和抗生素(G418, 青霉素/链霉抗生物素蛋白)的F12培养基中培养，以40,000个细胞/孔铺板在96-孔组织培养板中至少8小时。然后通过转换至含有1%BSA (无胰岛素)的DMEM培养基过夜，使细胞饥饿血清。将细胞用含有1%BSA (无胰岛素)的冷DMEM培养基洗涤2次，随后以适当的浓度在90 μL相同培养基中加入IOC分子。将细胞在冰上温育60 min。以0.015 nM终浓度加入125[I]-胰岛素(10 μL)，并在冰上温育4小时。将细胞用冷培养基轻轻洗涤3次，并在室温在摇动下用30 μL Cell Signaling裂解缓冲液(目录号9803)裂解10min。将裂解物加入闪烁液中并计数以确定与IR结合的125[I]-胰岛素和IOC分子对该相互作用的滴定作用。
方法D：使用从过表达人IR(B)的CHO细胞制备的细胞膜，以384-孔形式在闪烁迫近测定(SPA)中运行IR结合测定，所述CHO细胞培养在含有10%FBS和抗生素(G418, 青霉素/链霉抗生物素蛋白)的F12培养基中。在含有5 mM MgCl2的50 mM Tris缓冲液（pH 7.8）中制备细胞膜。测定缓冲液含有50 mM Tris缓冲液（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM CaCl2、5 mMMgCl2、0.1%BSA和蛋白酶抑制剂(Complete-Mini-Roche)。将细胞膜加入WGA PVT PEI SPA珠子(5 mg/ml终浓度)，随后以适当的浓度加入IOC分子。在室温温育5-15 min以后，以0.015 nM终浓度加入125[I]-胰岛素，达到50 μL的最终总体积。将混合物在室温在摇动下温育1-12小时，随后闪烁计数以确定与IR结合的125[I]-胰岛素和IOC分子对该相互作用的滴定作用。
实施例102
如下执行胰岛素受体磷酸化测定。
使用商购可得的Meso Scale Discovery (MSD) pIR测定(参见Meso ScaleDiscovery, 9238 Gaithers Road, Gaitherburg, MD)，执行胰岛素受体磷酸化测定。将稳定地表达人IR(B)的CHO细胞在含有10%FBS和抗生素(G418, 青霉素/链霉抗生物素蛋白)的F12细胞培养基中培养至少8小时，然后通过转换至含有0.5%BSA (无胰岛素)以替代FBS的F12培养基过夜生长进行血清饥饿。将细胞收获并以等分试样冷冻用于MSD pIR测定中。简而言之，将冷冻的细胞铺板在96-孔(40,000个细胞/孔, 方法A和B)或384-孔(10,000个细胞/孔, 方法C)透明组织培养板中并允许恢复。加入适当浓度的IOC分子，并将细胞在37℃温育8 min。将培养基抽吸，并按照MSD试剂盒说明书加入冷的MSD细胞裂解缓冲液。将细胞在冰上裂解40 min，然后将裂解物在室温混合10分钟。将裂解物转移至MSD试剂盒pIR检测平板。按照MSD试剂盒推荐的方案，进行所述测定的剩余内容。
实施例103
如下执行人巨噬细胞甘露糖受体1 (MRC1)结合测定。
如在文献中报道的，关于MRC1的竞争性结合测定利用配体，即用DELFIA Eu-N1-ITC试剂标记的甘露糖基化-BSA。将抗-MRC1抗体(25µl，2 ng/µl)加入已经用100µl 50 mMTris缓冲液（pH 7.5）洗涤3次的蛋白G平板，所述50 mM Tris缓冲液含有100 mM NaCl、5 mMCaCl2、1 mM MgCl2和0.1%吐温-20 (洗涤缓冲液)。将抗体在室温在摇动下在平板中温育1小时。将平板用洗涤缓冲液洗涤3-5次，随后加入在25µl含有1%稳定剂BSA的PBS中的MRC1 (2ng/µl终浓度)。将平板在室温在轻轻摇动下温育1小时。将平板用洗涤缓冲液洗涤3次。加入在12.5µl缓冲液中的适当浓度的IOC分子，随后加入12.5µl在含有100 mM NaCl、5 mMCaCl2、1 mM MgCl2和0.2%稳定剂BSA的50 mM Tris（pH 7.5）中的Eu-甘露糖基化-BSA (0.1nM终浓度)。将平板在室温在摇动下温育2小时，随后用洗涤缓冲液洗涤3次。加入PerkinElmer Eu-诱导物试剂(25µl)并在室温温育30 min，然后检测Eu信号(激发= 340 nm: 发射= 615 nm)。在96-孔板中用手工液体分配(方法F)或使用自动化液体分配(方法G)或在384-孔板中用自动化分配(方法H)执行测定。
实施例104
下表列出了按照上述一般方法之一使用适当的中间体制备的缀合物。使用UPLC方法A或UPLC方法D（用星号标记）或UPLC方法G（用#标记）表征这些缀合物，从而在某个保留时间(Rt)表现出带4个电荷的（即[(M+4)/4]）(或带5个电荷的，即[(M+5)/5])母体化合物物质。通过配体竞争测定或功能性磷酸化测定，测量它们对胰岛素受体(IR)的体外生物活性，所述测定如上所述进行下述标记：方法A: 基于96-孔用手工液体分配的IR磷酸化测定；方法B: 基于96-孔用自动化液体分配的IR磷酸化测定；方法C: 基于384-孔用自动化液体分配的IR磷酸化测定；方法D: IR结合测定方法D；方法E: IR结合测定方法E；方法F: 在96-孔板中用手工液体分配执行MRC1测定；方法G: 在96-孔板中用自动化液体分配执行MRC1测定；方法H: 在384-孔板中用自动化分配执行MRC1测定。结果显示在表1中。
实施例105
评价了甲基α-D-吡喃甘露糖苷(αMM)对IOC在非糖尿病的迷你猪中的PK和PD的影响。
在这些研究中使用非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪，其配备两个颈静脉血管接近端口(VAP)。在研究之前，将动物禁食过夜。在研究当天，将动物限制在吊索中，并接近VAP用于输注和取样。在t=-60分钟时，开始以2.67 mL/kg/小时的速率恒定输注PBS (n=3)或21.2%α-甲基甘露糖(αMM) (n=3)。该输注将在研究的持续期间维持。在t=0 min和收集用于血糖测量的基线血液样品以后，给动物施用作为单次静脉内快速推注的IOC。继续取样90分钟，最终读出血糖和化合物水平。
以17-69 nmol/mL在氯化钠(87 mM)、苯酚(21 mM)、磷酸氢二钠(26.5 mM)中配制IOC，渗透压= 275 mOsm，pH = 7.4；用注射用水定容。
样品收集的时间点：-60 min、0 min、1 min、2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、45 min、60 min和90 min。
将血液收集在K3-EDTA试管中，补充10 μg/ml抑肽酶，并在收集的30分钟内保持在冰浴上直到处理。在3000 rpm、4℃离心8 min以后，收集血浆并制备等分试样用于使用Beckman Coulter AU480 Chemistry分析仪测量葡萄糖和用于通过LC-MS测量化合物水平。
将葡萄糖结果表示为相对于t=0分钟时的基线值的变化百分比，且在图1-14中分别显示了IOC-2、IOC-3、IOC-8、IOC-9、IOC-16、IOC-22、IOC-23、IOC-46、IOC-48、IOC-52、IOC-56、IOC-60、IOC-75、IOC-75和IOC-76的葡萄糖结果。
图1显示了0.69 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-2的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图2显示了0.17 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-3的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图3显示了0.17 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-8的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图4显示了0.17 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-9的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图5显示了0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-16的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图6显示了0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-22的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图7显示了0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-23的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图8显示了0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-46的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图9显示了0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-48的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图10显示了0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-52的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图11显示了0.69 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-56的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图12显示了0.35 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-60的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图13显示了0.69 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-75的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
图14显示了0.17 nmol/kg静脉内(i.v.)注射进配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)以后，IOC-76的血清浓度图，所述迷你猪被输注静脉内α甲基甘露糖(aMM)溶液(以2.67 mL/kg/h的恒定速率输注的21.2%w/v)或PBS。
分别在图15-22中显示了IOC-2、IOC-3、IOC-16、IOC-22、IOC-23、IOC-52、IOC-56和IOC-60的PK结果。
图15显示了在PBS输注或静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注的条件下，在以0.69nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-2以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图16显示了在PBS输注或静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注的条件下，在以0.17nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-3以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图17显示了在PBS输注或静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注的条件下，在以0.35nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-16以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图18显示了在PBS输注或静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注的条件下，在以0.35nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-22以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图19显示了在PBS输注或静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注的条件下，在以0.35nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-23以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图20显示了在PBS输注或静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注的条件下，在以0.35nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-52以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图21显示了在PBS输注或静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注的条件下，在以0.69nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-56以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
图22显示了在PBS输注或静脉内α甲基甘露糖(aMM)输注的条件下，在以0.35nmol/kg静脉内注射缀合物IOC-60以后，配备双血管接近端口的非糖尿病的雄性Yucatan迷你猪(n = 3/研究)中的血糖降落曲线。
尽管在本文中参考说明性实施方案描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于此。具有本领域普通技术且有权使用本文教导的人员将认识到在其范围内的另外改变和实施方案。因此，本发明仅由本文所附的权利要求书限制。

Claims (6)

1.一种缀合物，其具有以下如关于IOC-22或IOC-60所阐述的式：
。
2.根据权利要求1所述的缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗糖尿病。
3.根据权利要求1所述的缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗1型糖尿病、2型糖尿病或妊娠糖尿病。
4.一种组合物，其包含具有以下如关于IOC-22或IOC-60所阐述的式的缀合物和药学上可接受的载体：
。
5.根据权利要求4所述的组合物用于制备用于治疗糖尿病的药物的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述糖尿病是I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病。
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