CN115894891A - 一种基于低聚物交联剂制备脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物的方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物领域，本发明提供了一种基于低聚物交联剂制备脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物的方法和用途，本发明通过该低聚物交联剂与蛋白药物发生交联，并采用脑靶向多肽进行封端，得到脑靶向的纳米蛋白药物。通过纳米化的制备和靶向肽修饰，能够增加蛋白药物的稳定性，延长蛋白药物的半衰期；通过靶向肽进行封端进一步增加了该纳米蛋白药物穿越血脑屏障到达脑疾病部位的能力；最终在病变部位微酸性环境(pH<6.8)的作用下，纳米蛋白药物之间的交联剂酸响应断裂，释放出具有生物活性的蛋白药物，实现靶向递送与药物控释治疗。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及一种基于低聚物交联剂制备脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物的方法和用途。
背景技术
蛋白质药物如疫苗、多肽、抗体等，多用于治疗肿瘤、免疫性疾病、炎性疾病等重大疾病。与以往的小分子药物相比，蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确等特点，在治疗重大疾病中具有明显优势，己被全球公认是21世纪药物研发中最具前景的高端领域之一。白细胞介素是一类重要的蛋白质药物，简称白介素，是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。目前至少发现了38个白细胞介素，分别命名为IL-1～IL38，功能复杂，成网络，复杂重叠；在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用，此外它们还参与机体的多种生理及病理反应。
由于难以有效跨越血脑屏障等问题，蛋白质药物难以适用于脑部疾病的治疗，以阿尔茨海默病(AD)为例，AD是一种患病几率随年龄增加的神经退行性疾病。目前临床上并没有良好的治愈手段，其主要的临床特征是认知功能逐渐恶化、社会和职业功能障碍，并逐渐导致身心衰退，最终死亡。AD目前已经超越心血管疾病成为人类第四大死因，因此，如何缓解和治疗AD成为临床治疗上的一个重大难题。目前多想研究证明了IL-3,IL-10等蛋白药物治疗AD的可能性(Cameron S.McAlpine et al.Astrocytic interleukin-3programsmicroglia and limits Alzheimer’s disease.Nature(2021).Kiyota,T.；Ingraham,K.L.；Swan,R.J.；Jacobsen,M.T.；Andrews,S.J.；Ikezu,T.AAV serotype 2/1-mediatedgene delivery of anti-inflammatory interleukin-10enhances neurogenesis andcognitive function in APP+PS1 mice.Gene Ther.(2012))。然而未经修饰改造的蛋白质药物尽管有许多优势，但在应用方面优于难以有效跨越体内生物屏障，导致难以充分发挥疗效，生物利用度低，且容易引起免疫应激反应。因此如何改善蛋白质药物的这些缺点，使其达到更好的治疗效果便是蛋白质药物临床转化的关键问题。
交联法是制备纳米蛋白药物的重要方法之一。交联剂的选择是该制备方法的关键因素。交联剂决定了纳米蛋白药物粒子的稳定性、生物降解性、药物递送效率及药物可控释放性能。戊二醛是广泛用于制备纳米蛋白药物的交联剂，但戊二醛具有较强的细胞毒性，导致其制得的纳米蛋白药物产品因生物安全性考虑而无法实现临床应用。因此，开发安全、高效及可生物降解的交联剂实现纳米蛋白药物的制备和临床应用具有迫切的研发需求。
发明内容
为此，本发明提出了一种新型的低聚物交联剂，并提出了一种基于低聚物交联剂制备脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物的方法和用途。
本发明提供了一种低聚交联剂，其具有式(I)所示的结构：
其中，k为13-15，优选为14。
本发明还提供了一种低聚交联剂的制备方法，包括如下步骤：
S1步骤：取双端氨基聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)与二甲基马来酸酐(DMA)反应；
S2步骤：S1步骤所得反应产物经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化，制得低聚物交联剂。
进一步地，双端氨基聚乙二醇与二甲基马来酸酐的质量比为1:0.4-1；和/或，S1步骤所得反应产物、EDCI和NHS的质量比为1:0.15-0.3:0.15-0.2；和/或，S2步骤中，避光条件下活化，活化时间为1.5-5h；和/或，所述双端氨基聚乙二醇的重均分子量为600。
进一步地，S1步骤的反应中还加入氧化钠水溶液。
本发明还提供了一种脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物的制备方法，将所述的低聚物交联剂或者所述的制备方法制得的低聚物交联剂与蛋白药物在溶剂中混合，加入脑靶向多肽搅拌，制得脑靶向的纳米蛋白药物，其中，低聚物交联剂的质量与蛋白药物和脑靶向多肽的摩尔比为10mg：1-2nmol：2-3nmol。
进一步地，所述蛋白药物选自IL-4，IL-10，IL-15，IL-21中的至少一种；和/或，所述脑靶向多肽选自angiopep-2肽和/或RVG29肽。
进一步地，所述低聚物交联剂将蛋白药物包裹在内形成100-120nm的纳米颗粒，脑靶向多肽位于所述纳米颗粒的外侧。
进一步地，溶剂为磷酸盐缓冲液；和/或，低聚物交联剂与蛋白药物混合时间为5-15min；和/或，搅拌时间为30-360min。
本发明还提供了上述任一所述的制备方法所制得的脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物。
本发明还提供了所述的所述的脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物在制备预防或治疗脑部疾病的药物中的用途。
进一步地，所述脑部疾病为帕金森综合征和/或肿瘤。
与现有技术相比，本发明的上述技术方案具有以下优点：
1、本发明提供的低聚物交联剂，其中双端氨基聚乙二醇为交联剂本体，通过二甲基马来酸酐(DMA)对其两端进行修饰，然后用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对其进行活化得到了式(I)所示结构的酸响应断裂的低聚物交联剂。
本发明通过该低聚物交联剂与蛋白药物发生交联，并采用脑靶向多肽进行封端，得到脑靶向的纳米蛋白药物，蛋白药物被包裹在内形成纳米颗粒，脑靶向多肽位于所述纳米颗粒的外侧。通过纳米化的制备和靶向肽修饰，能够增加蛋白药物的稳定性，延长蛋白药物的半衰期；通过靶向肽进行封端进一步增加了该纳米蛋白药物穿越血脑屏障到达脑疾病部位的能力；最终在病变部位微酸性环境(pH<6.8)的作用下，纳米蛋白药物之间的交联剂酸响应断裂，释放出具有生物活性的蛋白药物，实现靶向递送与药物控释治疗。该体系未引入具有生物毒性的交联剂及特殊佐剂，从而提高纳米药物制剂的生物安全性，有望实现临床应用。
2.本发明提供的基于低聚物交联剂制备脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物的方法，本发明通过特定的低聚物交联剂与蛋白药物发生交联，并采用脑靶向多肽进行封端，得到脑靶向及酸响应释放的纳米蛋白药物。通过控制低聚物交联剂的质量与蛋白药物与脑靶向多肽的摩尔比为10mg：1-2nmol：2-3nmol，使得低聚物交联剂将蛋白药物包裹在内形成100-120nm纳米颗粒，且能够透过血脑屏障，纳米蛋白药物颗粒稳定性最佳，多肽封端达到饱和，酸响应裂解性能灵敏。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1是本发明实施例2制备的纳米蛋白药物的TEM图；
图2是本发明实施例2制备的纳米蛋白药物的粒径分布图；
图3是酸性条件下纳米蛋白药物(Ncs IL-3)的粒径变化；
图4是纳米蛋白药物(Ncs IL-3)和蛋白药物(IL-3)注射后小动物活体成像图；
图5是纳米蛋白药物(Ncs IL-3)和蛋白药物(IL-3)注射后不同时间下小鼠脑部的荧光强度；
图6是纳米蛋白药物(Ncs IL-3)和蛋白药物(IL-3)静脉注射24h后不同器官的荧光分布对比图；
图7是纳米蛋白药物(Ncs IL-3)和蛋白药物(IL-3)静脉注射24h后不同器官的荧光强度。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1式(I)所示的低聚物交联剂的制备
本实施例低聚物交联剂的结构式如下：
上述低聚物交联剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)取1g双端氨基聚乙二醇(Mw:600)加入圆底烧瓶中，并向其中加入10mL的氢氧化钠水溶液(pH＝8.0)，随后通过恒压滴定滴入0.45g二甲基马来酸酐，边滴加边搅拌。最后将得到的产物旋干。通过流动相为体积比为5:1的二氯甲烷与甲醇的层析柱分离提纯，得到二甲基马来酸酐-聚乙二醇-二甲基马来酸酐(DMA-PEG-DMA)；
(2)取1g上述得到的DMA-PEG-DMA加入圆底烧瓶中，向其中加入10mL的二氯甲烷、0.2g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和0.18g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，避光活化2h后，旋干，通过流动相为体积比为10:1的二氯甲烷与甲醇的层析柱分离后得到低聚物交联剂。
实施例2脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物制备
本实施例脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物的制备方法，具体包括以下步骤：
将10mg实施例1制得的低聚物交联剂和含1nmol白介素-3的溶液500μL(鼠源IL-3蛋白，购自MedChemExpress，货号规格：HY-P7062-500μg，分子量为15.2kDa，采用pH7.4的PBS溶液为溶剂配置)加入到0.5mL的PBS溶液(pH7.4)中，室温下搅拌10min，随后向其中加入2nmol的脑靶向肽RVG29(序列为：H2N-YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG-OH,分子量:3264,吉尔生物订制的)搅拌1h进行封端，最终制得脑靶向的纳米蛋白药物的分散液。
检测：(1)采用透射电子显微镜(TEM)和马尔文粒度仪测试了脑靶向的纳米蛋白药物的尺寸，TEM测试结果见图1，马尔文粒度仪测试粒径结果见图2。结果表明，纳米蛋白药物为球形结构，粒径分布均匀，平均粒径为103nm，PDI为0.2。
(2)取300μL上述纳米蛋白药物的分散液，然后向其中加入0.1mM稀盐酸溶液，使溶液pH为6.5，混合均匀静置60min，随后利用马尔文粒度仪测试了脑靶向的纳米蛋白药物的尺寸的变化，并测试含1nmol白介素-3(IL-3)的500μL的PBS溶液(pH7.4)的粒径，结果如图3所示。
结果显示，脑靶向的纳米蛋白药物Ncs IL-3在酸性条件(pH＝6.5)下，粒径从约100nm(pH＝7.4)降低至约10nm(pH＝6.5)。表明脑靶向的纳米蛋白药物在酸性条件下发生裂解并释放出游离的IL-3，能够实现纳米蛋白药物在具有微酸环境的病灶部位释放药物。
(3)纳米蛋白药物的脑靶向能力的探究
取300μL上述含脑靶向的纳米蛋白药物的分散液(含IL-3的摩尔量为0.6nmol)向其中加入1μg的活化的cy7染料(cy7-NHS)，混合均匀静置30min，完成纳米蛋白药物的近红外荧光标记(制得cy7标记的纳米蛋白药物)。随后通过尾静脉注射的方式将cy7标记的纳米蛋白药物注射到小鼠体内(100μL/只)。并用同样的方式以1μg的cy7-NHS标记300μL的白介素-3(IL-3)(含IL-3的摩尔量为0.6nmol，溶剂为pH7.4的PBS溶液)，以同样方式将cy7标记的蛋白药物注射到小鼠体内(100μL/只)作为对照组(游离IL-3组)。
注射完成后，通过小动物成像仪观察小鼠脑部荧光情况，结果如图4和图5所示；并在24h后取出小鼠的主要脏器和脑部，通过小动物成像仪测试各脏器中cy7的荧光强度，结果如图6和图7所示。小动物活体成像结果显示，随着时间增加，与游离IL-3组相比，纳米蛋白药物Ncs IL-3组在小鼠脑区域中始终检测到更强烈的cy7荧光信号。离体脏器的荧光成像结果显示，在心、肝、脾、肺中，两个处理组中荧光信号没有显著性差异，而在肾中，NcsIL-3组显示更低的荧光，而且在脑中，Ncs IL-3组荧光信号是游离IL-3组的两倍。上述结果验证了Ncs IL-3较游离IL-3具有更佳的血液循环性性能，更强的脑肿瘤靶向性以及更低的肾蓄集量，展示了纳米蛋白药物良好的药物靶向递送能力。
实验例1
1、实验目的
考察不同摩尔比的低聚物交联剂和RVG29肽对蛋白颗粒稳定性的影响以及多脑部靶向能力的影响。
2、实验方法
2.1制备方法
将10mg实施例1制得的低聚物交联剂和1nmol白介素-3加入到0.5mL的PBS溶液中，并搅拌10min，随后分别向其中加入不同摩尔量的RVG29肽(0.2nmol、0.5nmol、1nmol、2nmol和5nmol)搅拌1h进行封端，制得脑靶向的纳米蛋白药物。
2.2测试方法
采用马尔文粒度仪测试新鲜制备和静置24h之后的脑靶向的纳米蛋白药物的尺寸，以观察其尺寸分布变化情况。
3、实验结果
结果显示，在低聚物交联剂的质量和RVG29肽的摩尔比为5mg:1nmol和2mg:1nmol时，蛋白纳米颗粒稳定性好，多肽封端达到饱和，因此，最佳选择为5mg:1nmol。
实验例2
1、实验目的
考察不同摩尔比的低聚物交联剂和蛋白药物的影响。
2、实验方法
2.1制备方法
将10mg实施例1制得的低聚物交联剂与不同摩尔量的白介素-3(0.2nmol、0.5nmol、1nmol、2nmol和5nmol)加入到0.5mL的PBS溶液中，并搅拌10min，随后分别向其中加入2nmol的RVG29肽搅拌1h进行封端，制得脑靶向的纳米蛋白药物。
2.2测试方法
采用马尔文粒度仪测试新鲜制备和静置24h之后的脑靶向的纳米蛋白药物的尺寸，以观察其分布变化情况。
3、实验结果
结果显示，在低聚物交联剂的质量与白介素-3的摩尔比为10mg:1nmol时，聚合物载体将蛋白药物包裹在内形成100 -120nm左右的的纳米颗粒，稳定性好，且能够透过血脑屏障。而质量摩尔比为10mg:2-5nmol时，纳米蛋白颗粒不稳定，质量摩尔比为10mg:0.2-0.5nmol时平均粒径过小，导致不具备纳米效应的，很容易被体内代谢出去，无法有效提高生物利用度。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种低聚物交联剂，其具有式(Ⅰ)所示结构：
其中，k为13-15，优选为14。
2.一种低聚物交联剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1步骤：取双端氨基聚乙二醇与二甲基马来酸酐反应；
S2步骤：S1步骤所得反应产物经EDCI和NHS活化，制得低聚物交联剂。
3.根据权利要求2所述的低聚物交联剂的制备方法，其特征在于，双端氨基聚乙二醇与二甲基马来酸酐的质量比为1:0.4-1；和/或，S1步骤所得反应产物、EDCI和NHS的质量比为1:0.15-0.3:0.15-0.2；和/或，S2步骤中，避光条件下活化，活化时间为1.5-5h；和/或，所述双端氨基聚乙二醇的重均分子量为600。
4.一种脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的低聚物交联剂或者权利要求2或3所述的制备方法制得的低聚物交联剂与蛋白药物在溶剂中混合，加入脑靶向多肽搅拌，制得脑靶向的纳米蛋白药物，其中，低聚物交联剂的质量与蛋白药物和脑靶向多肽的摩尔比为10mg：1-2nmol：2-5nmol。
5.根据权利要求4所述的脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物的制备方法，其特征在于，所述蛋白药物选自IL-4，IL-10，IL-15，IL-21中的至少一种；和/或，所述脑靶向多肽选自angiopep-2肽和/或RVG29肽。
6.根据权利要求4或5所述的脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物的制备方法，其特征在于，所述低聚物交联剂将蛋白药物包裹在内形成100-120nm的纳米颗粒，脑靶向多肽位于所述纳米颗粒的外侧。
7.根据权利要求4所述的脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物的制备方法，其特征在于，溶剂为磷酸盐缓冲液；和/或，低聚物交联剂与蛋白药物混合时间为5-15min；和/或，搅拌时间为30-360min。
8.权利要求4-7中任一所述的制备方法所制得的脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物。
9.权利要求8所述的脑靶向及酸响应裂解的纳米蛋白药物在制备预防或治疗脑部疾病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述脑部疾病为帕金森综合征和/或肿瘤。
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