KR101493168B1 - 나노핀 형태의 피에이치 민감성 광역학 치료용 접합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

나노핀 형태의 피에이치 민감성 광역학 치료용 접합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노핀 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 광민감성 약물인 클로린 Ce6, CKKKKKK 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산 무수물(2,3-dimethylmaleic anhydride)이 접합된 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체 및 이의 제조방법과 상기 접합체를 포함하는 광역학 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체는 암과 같은 산성 환경을 가지는 질병부위에 반응하여 분자의 구조를 변화시킬 수 있으며 질병부위로의 표적화 능력 및 약물 축적능력을 극대화시킬 수 있고, 생체 적합한 고분자 및 펩티드를 이용하므로 생체 내의 다양한 면역 기작을 회피할 수 있어, 면역반응의 비조절에 따른 부작용을 유발시키지 않는 효과가 있다.

Description

나노핀 형태의 피에이치 민감성 광역학 치료용 접합체 및 이의 제조방법{pH sensitive conjugates for photodynamic therapy having nano-pin structure and method thereof}
본 발명은 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
현대 사회에서 암은 사망원인 중 매우 큰 비중을 차지하고 있다. 또한 고령화 시대로 진행되면서 관절염과 같은 노인성 질환도 증가하고 있는 추세이다. 이러한 질병의 치료와 예방을 위해 사용되는 약물들은 질병부위에서 직접적으로 작용하여 질병 유발 세포를 제거할 수 있지만, 정상 부위에도 작용할 수 있는 부작용을 가지고 있으며 약물 내성을 가지는 세포에는 약물의 효과가 크게 줄어들어 효과적인 치료에 어려움이 있다.
종양 화학요법이 당면한 문제 중의 하나는 저분자량 화학치료제의 단점을 극복할 수 있는 확실한 대체물질을 개발하는 것이다. 낮은 종양 표적능력과 제한된 기능성과 같은 문제점들이 임상에서는 약물로서의 가능성을 감소시킨다. 커팅-엣지(cutting-edge) 기술과 같은 분자 디자인은 약물 표적화와 치료에 존재하는 문제점을 극복하였고, 이와 같은 기술들은 높은 적용 가능성 때문에 약물 전달 분야에서 활발한 연구가 이루어지고 있다. 효과적인 약물 표적화와 치료에 있어서 분자 디자인 기술은 구조생물학, 화학생물학, 컴퓨터 모델링, 화학적 합성 그리고 펩티드 또는 고분자 혼합 접근법들을 통해 개발되어져 왔다.
이러한 기술들 중에서도 특히, 펩티드 또는 고분자 혼합 디자인은 기능성을 가지고 있는 펩티드 또는 고분자의 결합을 이용하여 개선된 표적화 능력을 지니고 있는 나노 단위의 플랫폼을 개발할 수 있는 잠재적인 가능성을 가지고 있으며, 많은 연구진들은 혼합 디자인 방법의 성공 가능성을 높이기 위해 노력해왔다.
주목할 만한 접근방법으로, 내부 또는 외부 자극에 반응하여 분자의 구조적 변화 또는 동역학적 움직임에 영향을 줄 수 있는 자극-민감성 펩티드 또는 고분자 약물 분자 디자인 기술의 개발에 관심이 증대되고 있고 이러한 연구방법들이 효과적인 종양 화학요법 개발을 위한 새로운 기회를 제공할 수 있는 중요한 수단이 될 수 있다고 예상된다.
한편, 대부분의 고형암에서 암세포는 빠른 증식과 분화가 진행되기 때문에 저산소 상태를 유지하게 되어 혐기성 대사와 해당과정을 통해 락틱산 등과 같은 산성 물질을 생산하여 정상 조직의 pH(pH 7.4)와는 다르게 암세포의 외부환경은 약산성(pH ~ 6.8)을 나타낸다. 이러한 암세포의 특성을 이용한 pH 변화에 반응하는 프로드러그의 개발은 치료효과를 높임과 동시에 정상조직에서의 약물 작용을 막아 부작용의 감소를 유도하는 매우 효과적인 전략이다.
이에 본 발명에서는 생체 적합성이 뛰어난 PEG(polyethylene glycol)에 pH 민감성을 가지는 물질 및 광민감성 약물의 화학적 접합을 이용하여 새로운 형태의 나노핀 형태의 프로드러그를 개발하였으며, 이는 약산성 환경을 가지는 질병부위를 효과적으로 표적화하고 축적능력을 증가시켜 기존 프로드러그들에 비해 높은 약물 효율성과 치료 효과를 가질 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국등록특허 10-0396983
본 발명의 목적은 광민감성 약물인 클로린 e6(chlorin e6; Ce6), CKKKKKK 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산 무수물(2,3-dimethylmaleic anhydride)이 접합된 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 접합체를 유효성분으로 포함하는 pH가 6.0~7.0 미만인 약산성을 띄는 질병부위를 갖는 질환 치료를 위한 광역학 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 광민감성 약물인 클로린 e6(chlorin e6; Ce6), CKKKKKK 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산 무수물(2,3-dimethylmaleic anhydride)이 접합된 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 광민감성 약물인 클로린 e6(chlorin e6; Ce6), CKKKKKK 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산 무수물(2,3-dimethylmaleic anhydride)이 접합된 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 접합체는 pH가 7.0~8.0의 중성 조건에서는 나노핀 형태를 유지하다가 pH가 5~7 미만인 약산성 조건에서는 도그본(dog-bone)의 형태로 구조적 변화를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 접합체는 pH가 6.0~7.0 미만인 약산성을 띄는 질병 부위로 선택적으로 표적화 되고 축적되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 접합체를 유효성분으로 포함하는 pH가 6.0~7.0 미만인 약산성을 띄는 질병부위를 갖는 질환 치료를 위한 광역학 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질환은 폐암, 췌장암, 난소암, 식도암, 자궁경부암, 폐쇄성폐질환, 근신경계질환 및 류마티스 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 질환일 수 있다.
또한, 본 발명은, (i)클로린 e6(Ce6)와 CKKKKKK의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 접합시켜 클로린 e6(Ce6)와 CKKKKKK의 접합체를 제조하는 단계; (ii)클로린 e6(Ce6)와 CKKKKKK가 접합된 접합체의 티올기에 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 디-말레이미드기를 접합시키는 단계; (iii) 상기 (ii) 단계에서 제조된 접합체에서 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 디-히드록실기를 숙신무수물(succinic anhydride)과 DMAP(4-dimethylaminopyridine)을 처리하여 카르복실기로 치환시킨 후 AEM(N-(2-aminoethyl)maleimide), DCC(N,N′-dicyclohexylcarbodiimide) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 반응시켜 말레이미드(maleimide)기를 부여하는 단계; 및 (iv) 촉매인 TEA(triethylamine)를 상기 (iii)의 반응물과 반응시키는 단계를 포함하는, 광민감성 약물인 클로린 e6(Ce6), CKKKKKK 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산 무수물(2,3-dimethylmaleic anhydride)이 접합된 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 광민감성 약물인 클로린 e6(Ce6), CKKKKKK 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산 무수물(2,3-dimethylmaleic anhydride)이 접합된 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체 및 이의 제조방법과 상기 접합체를 포함하는 광역학 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체는 암과 같은 산성 환경을 가지는 질병부위에 반응하여 분자의 구조를 변화시킬 수 있으며 질병부위로의 표적화 능력 및 약물 축적능력을 극대화시킬 수 있고, 생체 적합한 고분자 및 펩티드를 이용하므로 생체 내의 다양한 면역 기작을 회피할 수 있어, 면역반응의 비조절에 따른 부작용을 유발시키지 않는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 종양세포 표적을 위한 나노핀 형태의 프로드러그의 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 종양세포 표적을 위한 대조군 프로드러그의 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 제조한 종양세포 표적을 위한 나노핀 형태의 프로드러그의 물리화학적 특징을 나타낸 것으로서, 3a는 제타전위 변화 측정 결과를 나타낸 것이고, 3b는 pH 7.4 또는 6.8에서 나노핀(0.1 ㎎/㎖)의 원편광 이색성(CD) 스펙트럼 결과를 나타낸 것이고, 3c는 PBS(pH 7.4 또는 6.8) 상에서 Ce6 농도에 따른 나노핀 또는 대조군의 근적외선(NIR) 형광 이미지를 나타낸 것이며, 3d는 형광 이미지의 형광 세기를 그래프로 정량화하여 나타낸 것이고, 3e는 pH 7.4와 6.8에서 나노핀, 대조군 및 Ce6의 일항산소 발생정도를 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 나노핀 형태의 프로드러그에 대한 항암효과를 in vitro 실험을 통해 확인한 결과로서, 4a는 pH 7.4와 6.8에서 나노핀 또는 대조군(Ce6 기준 1 ㎍/㎖)을 처리한(4시간 배양) 종양 세포들(KB, SK-OV3, MCF-7, MDA-MB-231)의 형광사진을 나타낸 것이고, 4b는 유세포 분석기를 이용하여 pH 7.4와 6.8에서 KB 세포에 대한 나노핀(Ce6 기준 1 ㎍/㎖)의 세포 흡수 측정 결과를 나타낸 것이며, 4c는 나노핀을 처리하고 빛을 조사하지 않은 조건에서 24시간 동안 배양시킨 KB 종양 세포의 세포 생존율을 분석한 결과이고, 4d는 pH 7.4, 6.8, 6.0에서 종양 세포들(KB, SK-OV3, MCF-7, MDA-MB-231)에 나노핀, 대조군, Ce6을 처리하고 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)을 이용하여 측정한 광독성 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 나노핀 형태의 프로드러그에 대한 항암효과를 in vivo 실험을 통해 확인한 결과로서, 5a는 나노핀 또는 Ce6(주입량: Ce6 기준 2.5 ㎎/kg)를 KB 종양 세포가 이식된 누드마우스에 정맥주사하고 촬영한 in vivo 비침습 형광 사진을 나타낸 것으로, 종양 위치는 하얀색 화살표로 표시하였고, 5b는 주사 후 24시간 후 적출된 각각의 장기에서 나노핀, 대조군, Ce6의 흡수를 나타낸 결과이며, 5c는 KB 종양 세포가 이식된 누드마우스에 정맥주사로 주입된 나노핀, 대조군, Ce6(주입량: Ce6 기준 2.5 ㎎/kg)의 종양 성장 억제 효과를 나타낸 것이며, 5d는 나노핀, 대조군, Ce6(주입량: Ce6 기준 3 ㎎/kg)를 KB 종양 세포가 이식된 누드마우스의 종양에 직접 주사하고 촬영한 in vivo 비침습 형광 사진으로 종양 위치는 Ce6 형광에 의해 나타난 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 나노핀 형태의 프로드러그가 중성 pH 조건에서는 나노핀의 형태로 유지되어 있다가 pH가 낮아지면 도그본(dog bone) 형태로의 구조적 변화가 유발됨을 개념도로 나타낸 것이다.
본 발명은 산성 환경을 가지는 질병의 치료를 효과적으로 치료하기 위한 새로운 치료제의 형태로서, 생체적합성이 우수한 고분자에 광민감 약물이 접합된 펩티드와 pH 민감 물질을 화학적 반응시켜 제조한 나노핀 프로드러그를 제조하는 방법을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서 제공하는 나노핀 형태의 프로드러그는 구체적으로 광민감성 약물인 Ce6가 접합된 CK6 펩티드(CKKKKKK 아미노산으로 이루어진 펩티드)와 기능성 PEG 및 pH 민감성 물질인 2,3-dimethylmaleic anhydride가 화학적으로 접합시킨 하이브리드 분자이다.
특히 본 발명에 따른 나노핀 형태의 프로드러그는 Ce6가 접합된 CK6 펩티드와 di-hydroxyl그룹 및 di-maleimide그룹이 부여된 기능성 PEG의 유기합성 반응으로 제조할 수 있다. PEG의 di-maleimide그룹을 Ce6가 접합된 CK6 펩티드의 thiol그룹에 접합시키고, 화합물의 di-hydroxyl그룹을 succinic anhydride 와 4-dimethylaminopyridine(DMAP)을 이용하여 carboxyl그룹으로 치환시킨 후, N-(2-aminoethyl)maleimide(AEM), N,N′-dicyclohexylcarbodiimide(DCC), N-hydroxysuccinimide(NHS)를 이용하여 maleimide 그룹을 부여하였다. 이후 촉매로 triethylamine(TEA)를 이용하여 2,3-dimethylmaleic anhydride와 반응시키고 maleimide그룹과 thiol그룹의 결합을 이용하여 Ce6가 접합된 CK6 펩티드를 접합시킨다.
이렇게 제조된 본 발명에 따른 나노핀 형태의 프로드러그는 PEG(중심 고분자), CK6 펩티드(곁가지 펩티드), 2,3-dimethylmaleic acid(DMA, pH 민감 기능기)로 이루어져 있으며, 정전기적 작용( CK6 펩티드의 (+)전하와 DMA의 ()전하)으로 인해 프로드러그 말단의 펩티드가 핀모양의 분자 구조로 변하게 된다. 즉, 낮은 pH 환경에서는 DMA의 분리 때문에 핀모양의 분자형태(광민감 약물이 quenching상태)가 도그본 모양(광민감 약물로부터 일항 산소가 다량 발생된 dequenching상태)으로 변하고 프로드러그는 (+)전하를 띠게 된다.
이러한 pH 변화에 따른 본 발명의 프로드러그의 구조적 변화에 대한 개념도는 도 6에 나타내었다.
또한 약산성 하에서 (+)전하를 띠는 본 발명의 프로드러그는 종양세포에 대한 선택성이 뛰어나며 종양 세포내에서 약물의 효과를 증가시킬 수 있는데, 이는 일반적으로 암세포는 빠른 증식과 분화 때문에 저산소 상태를 유지하게 되어 혐기성 대사와 해당과정을 통해 락틱산 등과 같은 산성 물질을 생산하여 정상 조직의 pH(pH 7.4)와는 다르게 암세포의 외부환경은 약산성(pH ~ 6.8)을 나타낸다. 따라서 이러한 암세포의 특성을 이용한 pH 변화에 반응하는 프로드러그의 개발은 치료효과를 높임과 동시에 정상조직에서의 약물 작용을 막아 부작용의 감소를 유도하는 매우 효과적이다.
이러한 점에서 본 발명에서 제조한 광민감성 약물인 클로린 e6, CKKKKKK 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산 무수물(2,3-dimethylmaleic anhydride)이 접합된 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체는 pH가 7.0~8.0의 중성 조건에서는 나노핀 형태를 유지하다가 pH가 5~7 미만인 약산성 조건에서는 도그본(dog-bone)의 형태로 구조적 변화를 가지는 특징이 있고, 특히 pH가 6.0~7.0 미만인 약산성을 띄는 질병 부위로 선택적으로 타겟팅 되고 축적되는 특징을 갖는다.
이러한 효과는 본 발명의 일실시예에서 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 입증하였는데. pH 7.4인 조건에 비해 pH 6.8인 약산성 조건 하에서 암세포로의 전달과 축적이 월등이 높아지는 것을 확인할 수 있었고, 암세포에서의 일항산소 발생 측정 결과를 보더라도 pH 7.4인 조건에서는 나노핀 형태의 구조로 인한 광민감성 물질의 형광세기는 감소되는 것으로 나타난 반면, pH 6.8인 약산성 조건에서는 형광이 다시 나타나고 일항산소가 많이 발생하여 암세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 항암활성을 나타내었다.
따라서 본 발명에서 제조한 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체는 암과 같은 산성 환경을 가지는 질병부위에 반응하여 분자의 구조를 변화시킬 수 있으며 이는 질병부위로의 표적화 능력 및 약물 축적능력을 극대화시킬 수 있다.
또한, 본 발명에서 제조한 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체는 생체 적합한 고분자 및 펩티드를 이용하므로 생체 내의 다양한 면역 기작을 회피할 수 있어, 면역반응의 비조절에 따른 부작용을 유발시키지 않을 수 있다.
그러므로 본 발명은 상기 본 발명의 접합체를 유효성분으로 포함하는 pH가 6.0~7.0 미만인 약산성을 띄는 질병부위를 갖는 질환 치료를 위한 광역학 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 질환은 폐암, 췌장암, 난소암, 식도암, 자궁경부암, 폐쇄성폐질환, 근신경계질환 및 류마티스 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 질환일 수 있다.
나아가 본 발명은 광민감성 약물인 클로린 e6 e6, CKKKKKK 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산 무수물(2,3-dimethylmaleic anhydride)이 접합된 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체의 제조방법을 제공할 수 있는데 상기 방법은 바람직하게, (i)클로린 e6(Ce6)와 CKKKKKK의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 접합시켜 클로린 e6(Ce6)와 CKKKKKK의 접합체를 제조하는 단계; (ii)클로린 e6(Ce6)와 CKKKKKK가 접합된 접합체의 티올기에 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 디-말레이미드기를 접합시키는 단계; (iii) 상기 (ii) 단계에서 제조된 접합체에서 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 디-히드록실기를 숙신무수물(succinic anhydride)과 DMAP(4-dimethylaminopyridine)을 처리하여 카르복실기로 치환시킨 후 AEM(N-(2-aminoethyl)maleimide), DCC(N,N′-dicyclohexylcarbodiimide) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 반응시켜 말레이미드(maleimide)기를 부여하는 단계; 및 (iv) 촉매인 TEA(triethylamine)를 상기 (iii)의 반응물과 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
또한, 본 명세서에서, 용어‘광역학치료(photodynamic therapy)’는 피부에 빛에 반응하는 광감작제를 바른 뒤 특정 파장의 빛을 쏘이면 질병세포에만 선택적으로 빛이 축적되어 치료적 효과를 나타내는 치료요법을 의미한다. 광역학치료는 암의 진단과 치료, 자가 골수이식, 항생제, AIDS 치료, 피부이식 수술이나 관절염 등의 치료에 사용되고 있으며, 이에 제한되지 않는다.
용어 ‘광감작제(photosensitizer)’는 특정 파장의 빛을 조사하면 산소분자(Ｏ2)를 일항산소(singlet oxygen, 1Ｏ2)와 같은 활성산소종으로 변화시키거나, 새로운 라디칼을 만들거나 또는 새로운 화학종을 만들어내는 물질을 의미한다.
용어 ‘생체적합성 고분자’는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성 및 항-응혈성을 가지고 있는 고분자를 의미한다.
용어 ‘암 세포’는 비정상적으로 성장, 분열 또는 증식하는 세포를 의미하는 것으로, 여기서는‘종양 세포’와 혼용된다. 용어 ‘암’은 형질 전환된 세포의 억제되지 않는 분열 또는 증식과 무질서한 성장 결과로 빚어지는 복합적인 질환을 일컬으며, 본 발명에서는 광역학 치료를 위해 고형암을 의미한다. 고형암이란 혈액암을 제외한 모든 덩어리로 이루어진 암을 의미한다. 고형암의 종류로는 뇌종양(Brain Tumor), 양성성상세포종 (Low-grade astrocytoma), 악성성상세포종 (High-grade astrocytoma), 뇌하수체 선종 (Pituitary adenoma), 뇌수막종 (Meningioma), 뇌림프종 (CNS lymphoma), 핍지교종 (Oligodendroglioma), 두개내인종 (Craniopharyngioma), 상의세포종 (Ependymoma), 뇌간종양 (Brain stem tumor), 두경부 종양(Head & Neck Tumor), 후두암 (Larygeal cancer), 구인두암 (Oropgaryngeal cancer), 비강/부비동암 (Nasal cavity/PNS tumor), 비인두암 (Nasopharyngeal tumor), 침샘암 (Salivary gland tumor), 하인두암 (Hypopharyngeal cancer), 갑상선암 (thyroid cancer), 구강암 (Oral cavity tumor), 흉부종양(Chest Tumor), 소세포성 폐암 (Small cell lung cancer), 비소세포성 폐암 (NSCLC), 흉선암 (Thymoma), 종격동 종양 (Mediastinal tumor), 식도암 (Esophageal cancer), 유방암 (Breast cancer), 남성유방암 (Male breast cancer), 복부종양 (Abdomen-pelvis Tumor), 위암 (Stomach cancer), 간암 (Hepatoma), 담낭암 (Gall bladder cancer), 담도암 (Billiary tract tumor), 췌장암 (pancreatic cancer), 소장암 (Small intestinal tumor), 대장(직장)암 (Large intestinal tumor), 항문암 (Anal cancer), 방광암 (Bladder cancer), 신장암 (Renal cell carcinoma), 전립선암 (Prostatic cancer), 자궁경부암 (Cervix cancer), 자궁내막암 (Endometrial cancer), 난소암 (Ovarian cancer), 자궁육종 (Uterine sarcoma), 피부암(Skin Cancer) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 ‘약’이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, ‘포함하다’ 및 ‘포함하는’이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
또한 본 발명의 접합체를 포함하는 광역학 치료용 조성물은 하기와 같은 조건들을 갖추고 있는데, 첫째, 활성산소종(Reactive Oxygen Species; ROS)을 생산하는 양자 수율이 높고, 둘째, 흡수하는 광의 파장이 길어야 하며, 셋째, 조사하지 않는 상태에서 독성이 낮아야 하고, 넷째, 특정 표적에 선택적으로 바인딩 되는 한편, 비특정 조직과는 결합하지 않는다.
상기 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시킬 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
나아가 본 발명은 상술한 본 발명의 광민감성 약물인 클로린 e6, CKKKKKK 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산 무수물(2,3-dimethylmaleic anhydride)이 접합된 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체를 이용한 광역학 치료방법을 제공할 수 있으며, 본 발명의 치료방법은 하기 단계를 포함한다.
1) 피험체에 상술한 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체 또는 상기 접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; 및
2) 580 내지 700nm 파장의 광을 경피적으로 조사하는 단계;
상기 단계 1)에서 본 발명의 접합체는 바람직하게는 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 종양내 주입 또는 병변내(intralesional) 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 광역학 치료용 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 1일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.
상기 단계2)에서 광 파장은 580 내지 700nm 범위인 것이 바람직하다. 파장이 580nm 미만이면 레이저 파장이 짧아서 생체 조직에 깊이 침투하지 못하므로 피부 근처에서의 광역학 치료만이 가능하게 되며, 흡광 파장이 700nm 보다 길면 생체 내에 과량으로 존재하는 물의 흡수에 의한 간섭이 증가하므로 바람직하지 못하다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[ 실시예 ]
이하에서, 본 발명을 하기의 실시예 및 첨부된 도면을 통하여 구체적으로 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 의도일 뿐, 본 발명의 보호범위가 하기의 실시예에 기재된 예만으로 국한되는 것은 결코 아니다. 또한, 하기의 실시예 뿐만 아니라, 당업자에 의해서 이로부터 용이하게 추론될 수 있는 사항까지도 본 발명의 보호범위에 속함은 자명하다.
< 실시예 1>
종양세포 표적을 위한 나노핀 형태의 프로드러그 제조
본 발명자들은 광민감 항암 약물의 성질을 가지는 새로운 하이브리드 분자를 제조하였는데, 제조된 분자는 핀(pin) 모양의 배열에서 도그본(dog-bone) 모양의 배열로 분자의 구조가 변화 가능한 것으로서 chlorin e6(Ce6)가 접합된 CK6(CKKKKKK) 펩티드와 di-hydroxyl그룹 및 di-maleimide그룹이 부여된 기능성 poly(ethylene glycol) (PEG, 2K)를 이용하여 새로운 광역학 치료용 나노핀을 하기와 같은 방법을 통해 제조하였다.
구체적으로 먼저 Dicarboxylated PEG(4 mM)를 DCC(10 mM), NHS(10 mM)로 전처리하고, L-serine의 carboxyl 그룹과 AEM의 자유 amine 그룹을 DCC 및 NHS와 반응시켜 얻은 과량의 L-serine 유도체와 tetrahydrofuran(THF, 50 ㎖) 용매에서 TEA와 함께 상온에서 24 시간동안 반응시켜, di-maleimide그룹과 di-hydroxyl그룹이 부여된 기능성 PEG를 제조하였다. 이후 반응물을 필터하고 과량의 diethyl ether로 재침전시켜 di-maleimide그룹과 di-hydroxyl 그룹이 부여된 기능성 PEG을 수득하였다. 이후 기능성이 부여된 PEG(2 mM)의 di-maleimide 그룹은 Ce6가 접합된 CK6 펩티드(5 mM)와 함께 dimethylformamide(DMF,20 ㎖)에서 24시간 동안 상온으로 반응시킨 다음, 반응물의 di-carboxyl 그룹은 succinic anhydride(5 mM), pyridine(1 ㎖), DMAP(5 mM)로 전처리하고, AEM(5 mM)을 DMF(20 ㎖)에서 DCC(5 mM), NHS(5 mM)와 함께 상온으로 24시간 동안 반응시켜 도 1에 기재된 화합물 (1)을 수득하였다. 이후 반응 용액은 필터링하고 DMF에 녹인 후, 접합되지 않은 물질의 제거를 위해 용액을 순수한 DMF에서 투석(Spectra/Por MWCO 5 K 투석막)하여 정제하였다.
이후 정제된 화합물 (1) (1 mM)을 DMF(20 ㎖)에 녹이고 2,3-dimethylmaleic anhydride(8 mM)를 TEA와 함께 상온에서 24시간 동안 다시 한 번 반응시킨 다음, 반응 용액을 Ce6가 접합된 CK6 펩티드(3 mM)와 함께 상온에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 최종 반응 용액을 투석막(Spectra/Por MWCO 10 K)에 옮기고 sodium tetraborate 용액(pH 8.0, 5 mM)에서 투석하여 반응하지 않은 물질들을 제거하였다. 이후 투석막 내에 있는 용액을 2일 동안 동결건조시켜 새로운 광역학 치료용 나노핀 프로드럭인 chlorin e6(Ce6)가 접합된 CK6(CKKKKKK) 펩티드와 di-hydroxyl그룹 및 di-maleimide그룹이 부여된 기능성 polyethylene glycol(PEG, 2K)의 하이브리드 분자를 제조하였으며, 이러한 하이브리드 분자는 PEG(중심 고분자), CK6펩티드(곁가지 펩티드) 및 2,3-dimethylmaleic acid(DMA, pH 민감 기능기)으로 구성되어 있고, 상기와 같은 제조방법에 대한 모식도는 도 1에 나타내었다.
또한, 본 발명자들은 상기 기술된 방법에 따라 제조된 본 발명의 하이브리드 분자와 비교하기 위한 대조군 분자를 제조하였는데, 대조군은 도 1의 화합물 (1) (1 mM)을 Ce6가 접합된 CK6펩티드(3 mM)와 함께 상온에서 24시간 동안 반응시킨 후, 반응 용액은 반응 용액은 증류수에서 투석(Spectra/Por MWCO 8 K)을 통해 정제되었고, 2일 동안 동결건조시켜 제조하였으며, 제조과정은 도 2에 나타내었다.
< 실시예 2>
본 발명의 나노핀 형태의 프로드러그에 대한 특성 물리화학적 특징분석
<2-1> 제타전위 및 원평광 이색성 분광 분석
상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 광역학 치료용 나노핀 형태의 프로드러그와 대조군 시료를 대상으로 각 시료(0.1 mg/ml, PBS 150 mM)의 제타 전위 변화와 원편광 이색성(CD) 변화를 서로 다른 pH(pH 7.4-5.0)에서 Zetasizer 3000 (Malvern Instruments, USA)과 J-815 원편광 이색성 분광기(Jasco International, UK)로 측정하여 분석하였다. 분석 결과는 도3a 및 3b에 나타내었다.
<2-2> NIR 형광분석
<2-1>에서 사용한 시료를 대상으로 PBS(pH 7.4 또는 6.8)에 각 시료를 용해한 후, 각 시료의 근적외선(near infra-red; NIR) 형광 사진을 KODAK image station(λexcitation= 635 nm, λemission = 720 nm)을 통해 촬영하여 수득하였고, PBS(pH 7.4 또는 6.8)에 녹아있는 각 시료(Ce6 기준 0.25 mg/ml)의 Ce6 형광 세기를 측정한 후, 각 시료의 상대적인 형광 세기(%)는 특정 pH와 dimethyl sulfoxide(DMSO)에서의 Ce6(0.25 mg/ml) 형광 세기를 비교하여 계산하였고, 분석 결과는 도 3c 및 3d에 나타내었다.
<2-3> 일항산소 생성 측정분석
<2-1>에서 사용한 시료를 대상으로 각 시료의 일항 산소 발생은 9,10-dimethylanthracene을 이용하여 확인하였는데, 우선, pH 7.4와 6.8에서 각 시료(Ce6 기준 0.1 mg/ml)를 상온에서 4시간 동안 안정화시킨 후, 시료들을9,10-dimethylanthracene(20 mM)가 녹아있는 PBS(pH 7.4)와 혼합하고 670nm 레이저를 5.2 mW/cm2세기로 5분 동안 조사하여 수행하였다. 또한, 9,10-dimethylanthracene은 일항산소에 선택적으로 반응하기 때문에 감소된 형광 세기를 보여주며, 각 시료에서 9,10-dimethylanthracene 형광 세기의 변화는 Shimadzu RF-5301PC 분광형광계를 이용하여 λex = 360 nm, λem = 380-550 nm 조건에서 측정하였다. 9,10-dimethylanthracene의 형광 세기가 최고점에 도달하면, 9,10-dimethylanthracene의 형광 세기 변화(Ff Fs)를 전체 9,10-dimethylanthracene 형광 세기에서 각 샘플의 형광 세기(Fs)를 뺀 후 그래프로 나타내었고(Ff는 전체 9,10-dimethylanthracene 형광 세기를 나타냄), 분석 결과는 도 3e에 나타내었다.
<2-4> 분석결과
<2-1> 내지 <2-3>의 분석을 통해 확인한 실험 결과들은 도 3에 나타나 있는데, 먼저 도 3a는 pH에 따른 나노핀의 제타 전위 변화를 보여준 것으로서, pH가 7.4에서 6.8로 감소하면 나노핀의 제타 전위는 0.5 ㎷에서 5.0 ㎷로 변화하는 것으로 나타났고, pH가 6.8에서 5.0으로 감소하면 나노핀의 제타 전위는 5.0 ㎷에서 +10.5 ㎷로 더욱 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 pH 7.4에서 정전기적 전하가 중성이기 때문에 나타나는 0.5 ㎷의 제타 전위가 산성 pH에서는 DMA의 탈락(CK6 펩티드에 자유 amine을 제공)에 의해 상쇄됨을 나타낸다.
또한, 도 3b는 pH가 7.4에서 6.8로 감소할 때 나노핀의 원편광 이색성(CD) 분광을 나타낸 것으로서, 근자외선 영역(250-350 nm)에서 나노핀의 positive CD 신호는 pH 7.4에서 DMA가 존재하기 때문에 나타나지만, pH 6.8에서 CD 분광이 negative로 변화는 것은 DMA의 탈락을 잘 나타내는 것이고, 이는 나노핀의 분자 구조 배열이 변화했음을 보여주는 것이다. 또한, 대조군의 제타 전위는 모든 pH에서 (+)값을 유지하였고, pH에 따른 CD 분광의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 나노핀 형태의 프로드러그는 pH 7.4(일반 조직 pH) 또는 pH 6.8(종양 pH) 에서 나노핀이 다른 반응을 보이므로 이러한 다른 반응은 광민감 약물에 기능성을 부여할 수 있는 새로운 방법을 제시하고 있다고 할 수 있다.
또한, 도 3c는 PBS(pH 7.4 또는 6.8)에 녹아있는 나노핀의 근적외선(near infra-red; NIR) 형광 사진을 나타낸 것으로서, 핀 모양의 분자 구조 때문에 나타나는 나노핀의 quenching 효과는 형광을 감소시키는 것으로 나타났고, 도 3d에서 pH 7.4에서 Ce6의 형광 세기는 감소되었으며 pH 6.8에서 형광이 다시 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 나아가 도 3e에 나타낸 바와 같이, pH 7.4에서는 일항산소 발생이 감소되는 것으로 나타났고, pH 6.8에서 일항 산소 발생이 증가되는 것은 대조군이 pH와 관계없이 일항산소를 발생시키거나 Ce6가 낮은 용해도 때문에 소량의 일항 산소를 발생시키는 것과 비교되는 결과를 보여준다.
< 실시예 3>
본 발명의 나노핀 형태의 프로드러그에 대한 in votro 항암 효능 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 나노핀 형태의 프로드러그가 우수한 항암 활성을 갖는지 확인하기 위해 다음과 같이 in vitro 실험을 수행하였다.
이를 위해 먼저 비인두 상피 종양 세포종인 KB 세포, 난소 종양 세포종인 SK-OV3 세포, 유방 종양 세포종인 MCF-7, MDA-MB-231 세포들을 2 mM L-글루타민, 1 % 페니실린-스트렙토마이신, 10% FBS가 포함된 RPMI-1640 세포 배양액을 사용하여 습식 배양기로 37℃, 5% CO2 에서 배양하였다. 이후 상기 세포들을(1x105 cells/ml) 단일층으로 배양시키고, 0.25 % (w/v) 트립신/0.03 % (w/v) EDTA 용액으로 트립신 처리하여 수득한 뒤, RPMI-1640 세포 배양액에 존재하는 상기 종양 세포들을 각각의 플레이트에 분주하고 in vitro 세포 테스트 전에 24시간 동안 배양하였다. 이후 본 발명의 나노핀 형태의 프로드러그와 대조군 시료(Ce6 기준 1 ㎍/㎖, 4시간 처리)를 종양세포에 각각 처리하고 종양 세포에 대한 이들의 흡수는 pH 7.4, 6.8, 6.0에서 Axio Imager D2 fluorescence microscope (Carl Zeiss, USA) 및 FACSCalibur™ Flow Cytometer (Becton Dickinson, USA)로 관찰하였다.
또한, 각 종양 세포들에 대한 Ce6의 세포독성은 670nm 레이저를 이용한 빛 조사를 통해 실험하였는데, 각 시료들로 4시간 동안 처리된 종양 세포들을 새로운 세포 배양액으로 3번 워싱하고, 670nm 레이저를 5.2 mW/cm2 세기로 10분간 조사한 후 12시간 동안 배양하였고 세포 생존율은 Cell Counting Kit-8(CCK-8)을 이용하여 측정하였다. 빛을 조사하지 않은 조건에서 나노핀 자체의 세포독성은 처리 후 24시간이 지나고 측정하였다.
분석 결과, 그림 4a는 각 샘플이 처리된 네 가지 종양 세포(비인두 상피 종양 세포종인 KB 세포, 난소 종양 세포종인 SK-OV3 세포, 유방 종양 세포종인 MCF-7, MDA-MB-231 세포)의 형광 사진을 보여준 것이며, pH 7.4와 6.8과 같은 조절된 pH 조건에서 세포 흡수를 관찰한 결과로서 나노핀은 pH 7.4와는 다르게 pH 6.8에서 가장 높은 세포 흡수를 보여주었으며, 이를 유세포 분석기를 이용하여 정량화한 결과를 도 4b에 나타내었다. 즉 이러한 결과를 통해, 본 발명의 나노핀은 산성 환경에서 정전기적 전하 전환을 일으켜 종양 세포 위치를 용이하게 인지할 수 있는 반면, 대조군은 pH 7.4와 pH 6.8에서 종양 세포 흡수에 대한 명확한 차이가 나타나지 않다는 것을 알 수 있었다.
또한 도 4c의 결과와 같이, 본 발명의 나노핀을 세포와 함께 빛을 조사하지 않고 24시간 동안 배양하면 500 ㎍/㎖까지 세포독성이 나타나지 않았음을 확인하였고 이는 본 발명의 나노핀 자체가 독성이 없다는 것을 입증한 결과이다.
또한, 빛을 조사한 경우(670nm 레이저를 5.2 mW/cm2 세기로 5분 동안 조사), 본 발명의 나노핀은 pH 7.4보다 pH 6.8에서 상대적으로 높은 종양 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났는데, pH 6.8에서 나노핀의 향상된 세포내 흡수(도 4a)와 대량의 일항산소 발생(도 3e)은 모든 종양 세포에 대한 광독성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 하지만, pH 7.4에서 나노핀의 감소된 세포내 흡수와 일항산소 발생은 낮은 광독성을 나타내며, 대조군과 Ce6는 pH 7.4와 6.8에서 차이를 보이지 않고 있는 것으로 나타났다(도 4d).
< 실시예 4>
본 발명의 나노핀 형태의 프로드러그에 대한 in vivo 항암 효능 분석
실시예 3을 통해 in vitro 실험에서 본 발명의 나노핀 형태의 프로드러그가 pH 특이적으로 항암 효과를 보인다는 사실을 확인함에 따라 다음과 같이 이러한 결과를 in vivo실험을 통해서도 확인하였다.
먼저 in vivo 실험을 위한 동물로서 4-6 주령의 암컷 누드마우스를 사용하였는데. 하기 동물실험은 가톨릭대학교 동물 실험 윤리 위원회로부터 입증된 실험 가이드라인에 따라 수행하였다. in vivo 실험을 수행하기 위해 KB 종양 세포를 PBS 7.4(이온강도: 0.15)에 1 x 105개로 부유시켜 누드마우스에 피하주사로 주입하였고, 종양의 부피가 175-200 mm3에 도달하면 각 시료(Ce6 기준 2.5 3.0 ㎎/kg)를 종양이 이식된 누드마우스의 꼬리에 정맥주사 또는 종양에 직접 주사하였다. 누드마우스의 형광 이미지를 촬영하기 위해 C마운트 렌즈와 장파장 방출 필터가 장착된 12-비트 CCD 카메라(Image Station 4000MM; Kodak, New Haven, CT)를 이용하였고, 각 시료 주입 후 24 시간이 지나면 누드마우스의 장기들(종양, 간, 비장, 폐, 신장, 심장)을 적출하여 분석하였다.
In vivo 종양 세포외 pH의 분석은 누드마우스를 졸레틸/럼푼(6.25/8.75 ㎎/kg)으로 마취시키고 16-게이지 바늘이 장착된 Orion98-63 micro-pH electrode(Thermo Electron Corp., USA)를 종양의 경피에 삽입하여 in vivo 종양 세포외 pH를 확인하였으며, in vivo 종양 성장 저해 효과를 위한 실험은 각 시료를 주입하고 24시간이 지난 후, 누드마우스의 종양 부위에 670nm 레이저를 5.2 mW/cm2 세기로 40분간 조사하였고 종양 부피의 변화를 경과시간에 따라 관찰하였으며, 종양 부피는 다음 공식을 이용하여 계산하였다.
종양부피 = 길이 x (폭)2/2
모든 결과는 Student’s t-test 또는 ANOVA 분석법을 통해 p<0.05 (*로 표시) 또는 p<0.01 (**로 표시)의 유의수준에서 분석하였으며, MINITAB release 14 통계 소프트웨어를 사용하였다.
분석 결과, 나노핀이 주입된 누드마우스의 몸무게 변화는 거의 없었고, 전신에서 독성이 나타나지 않는 것으로 확인되었다. 도 5a는 KB 종양 세포가 이식된 누드마우스의 in vivo 형광 이미지를 보여준 것으로서 이 실험을 수행하기 전에, 본 발명자는 KB 종양 세포가 이식된 누드마우스의 in vivo 종양 세포외 pH가 6.75 근처인 것을 확인하였다. 이후, 나노핀(주입량: Ce6 기준 2.5 ㎎/kg)을 누드마우스의 꼬리에 정맥주사로 주입하였는데, 실험결과는 나노핀이 종양 부위에서 높은 형광을 나타내는 것으로 나타났다. 반면, 대조군은 종양 부위에서 형광을 나타내지 않았는데, 이는 혈류에서 (+)전하를 가지고 있는 대조군과 일반 조직 사이의 복잡한 상호작용 때문이라고 보인다. 또한 주사 후 24 시간이 경과되었을 때, 누드마우스의 장기들(종양, 간, 심장, 폐, 비장, 신장)을 적출하여 분석하였고 대조군과 Ce6를 주입한 결과와 비교하여, 본 발명의 나노핀은 종양 축적은 매우 높은 것으로 나타났다(도 5b). 도 5c는 나노핀, 대조군, Ce6를 처리한 KB 종양 세포가 이식된 누드마우스의 종양 성장 억제 결과를 보여준 것으로, 각 시료를 주입한 후, 누드마우스를 암실에서 24시간 동안 사육하고 종양 부위에 670 nm 레이저를 5.2 mW/cm2의 세기로 40분간 조사한 결과, 본 발명의 나노핀이 종양 성장 억제에 대해 더욱 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
나아가 본 발명자는 본 발명의 나노핀, 대조군 및 Ce6를 KB 종양 세포가 이식된 누드마우스의 종양에 직접 주입한 결과, Ce6를 주입한 결과와는 다르게, 나노핀과 대조군은 종양 조직과의 상호작용으로 인해 종양 부위에서 더 오랜 시간 동안 지속되고 있는 것을 알 수 있었다(도 5d). 이러한 결과는 종양에 직접 주입한 경우, pH와 관계없이 (+)전하를 가지는 대조군과 유사하게 종양 세포외 pH에서 (+)전하로 변한 나노핀은 높은 세포 상호작용을 유발할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
종합적으로 상기와 같은 실험 결과를 통해 본 발명자들은 기능성이 부여된 고분자에 pH 민감성 물질과 광민감성 약물을 화학적으로 접합시켜 제조한 새로운 형태의 나노핀 프로드럭이 낮은 pH 환경에서는 DMA의 분리에 의해 핀모양의 분자형태가 도그본 모양으로 변할 수 있는 효과가 있으며, 생체적합성이 뛰어나며 종양 부위로의 표적화 및 축적성을 높여 질병부위로의 표적화 능력 및 약물 축적 능력을 극대화시킬 수 있으며, 특히 약산성의 질병부위에 대해 높은 축적성을 가지며 생체 적합한 고분자 및 펩티드를 이용하기 때문에 생체 내의 다양한 면역 기작을 회피할 수 있고. 또한 폐암, 췌장암, 식도암, 자궁경부암 등의 고형 암과 폐쇄성폐질환, 근신경계질환, 류마티스 관절염 등 산성을 띠는 질병부위를 선택적으로 치료하기 위한 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

  1. 광민감성 약물인 클로린 e6, CKKKKKK 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산 무수물(2,3-dimethylmaleic anhydride)이 접합된 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 접합체는 pH가 7.0~8.0의 중성 조건에서는 나노핀 형태를 유지하다가 pH가 5~7 미만인 약산성 조건에서는 도그본(dog-bone)의 형태로 구조적 변화를 갖는 것을 특징으로 하는 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 접합체는 pH가 6.0~7.0 미만인 약산성을 띄는 질병 부위로 선택적 타겟팅 되고 축적되는 것을 특징으로 하는 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 접합체를 유효성분으로 포함하는 pH가 6.0~7.0 미만인 약산성을 띄는 질병부위를 갖는 질환인 폐암, 췌장암, 난소암, 식도암, 자궁경부암, 폐쇄성폐질환, 근신경계질환 또는 류마티스 관절염의 치료를 위한 광역학 치료용 약학적 조성물.
  5. 삭제
  6. (i)클로린 e6(Ce6)와 CKKKKKK의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 접합시켜 클로린 e6(Ce6)와 CKKKKKK의 접합체를 제조하는 단계;
    (ii)클로린 e6(Ce6)와 CKKKKKK가 접합된 접합체의 티올기에 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 디-말레이미드기를 접합시키는 단계;
    (iii) 상기 (ii) 단계에서 제조된 접합체에서 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 디-히드록실기를 숙신무수물(succinic anhydride)과 DMAP(4-dimethylaminopyridine)을 처리하여 카르복실기로 치환시킨 후 AEM(N-(2-aminoethyl)maleimide), DCC(N,N′-dicyclohexylcarbodiimide) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 반응시켜 말레이미드(maleimide)기를 부여하는 단계; 및
    (iv) 촉매인 TEA(triethylamine)를 상기 (iii)의 반응물과 반응시키는 단계를 포함하는, 광민감성 약물인 클로린 Ce6, CKKKKKK 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 pH 민감성 물질인 2,3-디메틸말레산 무수물(2,3-dimethylmaleic anhydride)이 접합된 나노핀(nano-pin) 형태의 pH 민감성 광역학 치료용 접합체의 제조방법.
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