KR102574572B1 - 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 제조방법, 이로부터 제조된 알긴산-엽산 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

알긴산-엽산 컨쥬게이트의 제조방법, 이로부터 제조된 알긴산-엽산 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 제조방법, 이로부터 제조된 알긴산-엽산 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 알긴산-엽산 컨쥬게이트는 카복실기 보호기 및 이탈기를 이용한 제조방법을 통해 알긴산의 히드록시기와 엽산의 카복실기가 에스터 결합을 형성함으로써 종래 엽산의 아민기와 알긴산의 카복실기가 공유결합한 알긴산-결합 엽산에 비해 효과적으로 암세포를 표적화하여 정상 조직과 명확하게 구분할 수 있어, 암의 병변 부위에 대한 정밀 진단 및 효율적인 외과 절제술에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

알긴산-엽산 컨쥬게이트의 제조방법, 이로부터 제조된 알긴산-엽산 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 약학 조성물{Method of preparing alginic acid-folic acid conjugate, the conjugate prepared thereby and pharmaceutical composition comprising the same}
본 발명은 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 제조방법, 이로부터 제조된 알긴산-엽산 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid, 5-ALA)은 1979년부터 종양수술을 위한 형광발광물질로 사용되어왔으며 임상 사용 시 부작용이 적은 물질로 알려져 있다. 환자가 5-ALA를 복용하게 되면, 5-ALA는 암세포 내 미토콘드리아에서 헴(heme) 생합성 과정의 중간 물질인 프로토포르피린(protoporphyrin IX, PpIX)로 전환되며, 5-ALA 물질 자체는 형광 성질이 없으나 암세포와 반응하여 생성되는 PpIX는 약 400 nm의 여기 파장(excitation wavelength)에서 635 nm의 형광을 방출(emission)함으로써 정상 조직과 암세포를 구분할 수 있다.
하지만 5-ALA를 비롯한 대부분의 광학적 진단 및 수술 시 사용되는 조영제는 병변부에 대해 비특이적 성질을 가지고 있어 정확한 진단 내지 수술이 어렵다. 따라서, 조영제에 병변부에 대한 표적 특이성을 부여하기 위해 병변부에 대해 특이성이 있는 펩타이드, 항체 또는 다당체 등의 종양 특이적 리간드를 조영제에 공유결합을 통해 가교를 형성하는 방법을 적극 활용하고 있다. 그러나, 공유결합에 의해 가교 시 그 복합체의 화학적 구조 안정성, 표적지향력 감소 및 인체 내 부작용 등과 같은 새로운 문제점이 발생하여, 암의 정확한 진단과 외과적인 절제술을 어렵게 한다.
이를 해결하기 위해, 본 발명자들은 종양 특이적 리간드와의 공유결합을 이용하지 않고 암세포를 타켓팅할 수 있는 약물 전달체로서 5-ALA와 같은 암세포 형광유도물질과 암세포 타겟팅 다당체를 포함하는 수상성분을 내상으로 포함하는 미셀 구조의 나노전달체를 개발하였다 (대한민국 등록특허 제10-1901986호). 이러한 나노전달체는 암세포 표면에서 특이적으로 과발현하는 엽산 수용체와 결합 가능하도록 엽산이 결합된 알긴산 (엽산-결합 알긴산)을 암세포 타겟팅 다당체로 포함할 수 있다. 그러나, 암세포의 엽산 수용체는 엽산의 dihydropteridin 모이어티의 NH2를 인식하는데, 일반적인 제조방법에 의해 제조된 엽산-결합 알긴산은 상기 아민기(NH2)와 알긴산의 카복실기(-COOH)가 연결되어 암세포와의 결합능이 저하되는 문제가 발생하였다.
이에, 본 발명자들은 엽산의 아민기가 노출됨으로써 암세포에 대한 타겟팅 효율이 증가된 신규한 알긴산-엽산 컨쥬게이트 및 이의 제조방법을 개발하였다.
대한민국 등록특허 제10-1901986호
본 발명은 카복실기 보호기 및 이탈기를 이용한 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 알긴산의 히드록시기와 엽산의 카복실기가 결합한 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 이용한 암 진단용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 a) 알긴산의 카복실기에 보호기를 부착하는 단계; b) 엽산의 카복실기에 이탈기를 부착하는 단계; 및 c) 상기 a) 단계의 보호기가 부착된 알긴산과 상기 b) 단계의 이탈기가 부착된 엽산의 반응 생성물을 얻는 단계를 포함하는 알긴산-엽산 컨쥬케이트의 제조방법을 제공한다.
상기 알긴산은 갈조류에서 추출한 천연 음이온성 다당류로서 마누론산(mannuronic acid) 및 글루론산(gluronic acid)으로 구성된 블록공중합체이다. 사람을 포함한 포유류는 알긴산을 분해하는 효소가 없기 때문에 체내에서 안정적으로 존재할 수 있으나 리소좀 내 산성 환경에서 산 촉매를 통해 가수분해된다. 상기 알긴산은 카복실기(carboxy group, -COOH)와 히드록시기(hydroxyl group, -OH)를 포함한다.
본 발명에서는 암세포 타켓팅 다당체인 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 제조하기 위해, 암세포와의 특이적 결합능이 없으나 독성이 없고 생체적합성 및 생분해성이 뛰어나며 비용이 저렴하다는 장점을 가지는 알긴산을 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 “보호기”는 특정 반응 부위를 선택적으로 차단하여 비보호된 다른 반응성 부위에서 선택적으로 화학 반응이 일어날 수 있도록 도입하는 작용기를 의미한다.
본 발명에서의 카복실기 보호기는 원하지 않은 반응으로부터 알긴산의 카복실기를 보호하는 작용기로, 에스테르기 및 헤테로시클로알킬기를 포함한다. 이러한 카복실기 보호기의 일례로는 치환된 아릴알킬 에스테르 (예컨대, 치환된 벤질, 4-니트로벤질, 4-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, 2,4-디메톡시벤질, 2,4,6-트리메톡시벤질, 2,4,6-트리메틸벤질, 펜타메틸벤질, 3,4-메틸렌디옥시벤질, 벤즈히드릴, 4,4'-디메톡시벤즈히드릴, 2,2',4,4'-테트라메톡시벤즈히드릴 등을 갖는 에스테르), 알킬 또는 치환된 알킬 에스테르 (예컨대, 메틸, 에틸, t-부틸 알릴 또는 t-아밀, 트리페닐메틸, 4-메톡시트리틸, 4,4'-디메톡시트리틸, 4,4',4"-트리메톡시트리틸, 2-페닐프로프-2-일 등을 갖는 에스테르), 티오에스테르 (예컨대, t-부틸 티오에스테르 등), 실릴 에스테르 (예컨대, 트리메틸실릴, t-부틸디메틸실릴 등을 갖는 에스테르), 1,3-옥사졸리닐 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 보호기는 테트라부틸암모늄(tetrabutylammonium, TBA)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계는 알긴산과 테트라부틸암모늄 히드록사이드(tetrabutylammonium hydroxide, TBAOH)를 반응하여 알긴산의 카복실기에 테트라부틸암모늄을 부착하는 것일 수 있으며, 하기 반응식 1로 나타낼 수 있다,
[반응식 1]
상기 반응식 1에서,
상기 m은 10 ~ 60개 (바람직하게는, 30 ~ 55개)이고,
상기 n은 10 ~ 60개 (바람직하게는, 30 ~ 55개)인 것이다.
보다 구체적으로, 소듐 알지네이트(sodium alginate)를 소정의 산성용매 (HCl)에 용해하여 알긴산을 생성한 후 pH 9가 될 때까지 TBAOH와 반응함으로써 알긴산-TBA를 수득할 수 있다.
상기 엽산은 암세포 상피에서 과발현되는 것으로 공지되어 있는 엽산 수용체 알파(folate receptor-alpha)에 특이적으로 결합하기 때문에 표적 약물 전달용 제제로 이용되고 있다. 상기 엽산 수용체 알파의 경우 난소암의 90 ~ 95%에서 과발현되는 것으로 알려져 있다. 이러한 엽산은 아민기(amine group, -NH2)와 카복실기를 포함한다.
본 발명에서는 엽산 수용체에 대한 높은 친화성, 비면역원성 및 안정성을 가지는 엽산을 암세포 표적화에 유용하게 이용함으로써 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 포함하는 나노전달체의 암세포 내 이입을 촉진할 수 있다.
본 발명에서 사용된 “이탈기”는 치환 반응에서 다른 작용기 또는 원자에 의해 치환될 수 있는 작용기 또는 원자를 의미한다.
본 발명에서의 카복실기에 대한 이탈기는 엽산의 글루탐산 모이어티의 카복실기에 결합하고, 알긴산과의 반응하면 알긴산의 히드록시기로 치환되는 작용기로, 엽산의 아민기와 알긴산의 카복실기의 결합을 저해할 수 있다. 이러한 카복실기에 대한 이탈기의 일례로는 유기설포닐기, 아실옥시기, 알콕시기, 알콕시 카보닐기 (예컨대, 에톡시 카보닐 등), 할로겐 (예컨대, 요오드, 브롬, 염소, 불소), 아미도, 아지도, 이소시아네이토, 치환되거나 비치환된 티올레이트 (예컨대, 티오메틸, 티오페닐 등) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 이탈기는 카보닐디이미다졸(carbonyldiimidazole, CDI)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 b) 단계는 CDI와 엽산을 반응하여 엽산의 카복실기에 이미다졸을 부착하는 것일 수 있으며, 하기 반응식 2로 나타낼 수 있다.
[반응식 2]
상기 반응식 2의 반응에 의해, 엽산의 글루탐산 모이어티의 카복실산은 이탈기가 부착되어 OH기와의 반응성이 증가할 수 있다.
보다 구체적으로, 엽산을 소정의 용매 (예컨대, DMSO)에 용해한 후 CDI를 첨가하여 암실(dark place)에서 N2 가스가 있는 상태로 12 내지 28시간 반응함으로써 카복실기의 반응성이 증가한 엽산(엽산/CDI 화합물)을 수득할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 c) 단계의 반응 생성물은 알긴산의 히드록실기와 엽산의 카복실기가 에스터 결합으로 결합된 것일 수 있다. 예를 들면 상기 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 합성은 카복실 보호기가 부착된 알긴산의 히드록시기, 및 이탈기가 부착된 엽산의 카복실기가 화학적으로 반응하여 에스터 결합(ester bond)을 형성하는 것일 수 있으며, 하기 반응식 3으로 나타낼 수 있다.
[반응식 3]
보다 구체적으로, 알긴산-TBA을 1 wt%을 포함하는 소정의 용매 (예컨대, DMSO)에 용해한 후 활성화된 엽산/CDI 화합물을 첨가하여 40℃의 암소에서 4 내지 18시간 반응함으로써 알긴산과 엽산의 에스터 결합을 유도하며, 이후 통상의 정제 등의 공정을 통해 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 수득할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 알긴산의 히드록시기에 엽산의 카복실기가 에스터 결합으로 연결된 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 제공한다. 상기 알긴산-엽산 컨쥬게이트는 엽산의 디하이드로프테리딘(dihydropteridin) 모이어티의 NH2기가 알긴산과 결합을 이루지 않는 것일 수 있다. 상기 알긴산-엽산 컨쥬게이트는 엽산의 글루탐산 모이어티의 카복실기가 알긴산의 히드록실기와 결합을 이루는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 알긴산-엽산 컨쥬게이트는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서 R은 알긴산 단위체 또는 알긴산 중합체일 수 있다.
상기 화학식 1의 알긴산-엽산 컨쥬게이트는 알긴산의 히드록시기와 엽산의 카복실기가 에스터 결합을 형성함으로써 암세포가 과발현하는 엽산 수용체와 결합하는데 작용하는 엽산의 아민기가 노출되어 종래 엽산의 아민기와 알긴산의 카복실기가 공유결합한 알긴산-결합 엽산에 비해 효과적으로 암세포를 표적화할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 포함하는 암 진단용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학 조성물은 암세포 형광유도물질을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 암세포 형광유도물질은 생체 내 암세포에 유입되어 형광물질을 발생시킬 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 상기 암세포 형광유도물질은 당해 기술분야에서 암세포에 유입되어 형광을 발생시킬 수 있는 것으로 공지되어 있거나 미래에 발견될 수 있는 임의의 물질일 수 있으며, 예를 들어 형광물질인 PpIX를 발생시키는 물질은, 헴(heme), 헤민(hemin), 아연 프로토포르피린(zincprotoporphyrin), 마그네슘 프로토포피린(magnesium protoporphyrin), 헤마토포르피린(hematoporphyrin), 벤조포르피린 (benzoporphyrin), 메탈로포르피린(metalloporphyrin), 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid), 텍사피린(texaphyrins), 크로린(chlorins), 퍼퓨린(purpurins), 박테리오크로린(bacteriochlorins), 프탈로사이아닌(pthalocyanine), 나프탈로사이아닌(napthalocyanine) 및 이들의 유도체, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 암세포 형광유도물질일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서의 암세포 형광유도물질은 5-아미노레불린산(5-ALA)인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학 조성물은 암세포 타겟팅 다당체로서 알긴산-엽산 컨쥬게이트 및 암세포 형광유도물질을 포함하는 수상성분을 내상으로 포함하는 미셀 구조의 나노전달체를 포함하는 것일 수 있다.
상기 나노전달체는 유상성분; 계면활성제; 및 암세포 형광유도물질 및 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 포함하는 수상성분을 함께 혼합하여 유중수(water in oil, W/O) 나노에멀젼을 제조한 후 그 나노에멀젼을 수중 분산시켜 유상성분을 제거하여 수득되어, 상기 수상성분을 내상으로서 포함하는 미셀 구조를 가질 수 있다.
여기서, 유상성분은 지용성으로서 오일에 녹는 물질의 의미하며, 당해 기술분야에서 나노에멀젼의 제조에 사용될 수 있는 오일을 제한 없이 사용할 수 있다. 수상성분은 수용성으로 물에 녹는 물질을 의미하며, 물을 매질로 하여 암세포 형광유도물질 및 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 포함하는 수용액이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 알긴산-엽산 컨쥬케이트 및 암세포 형광유도물질로서 5-ALA를 포함하는 미셀 구조의 나노전달체는 상호 침투 고분자 망상 구조(interpenetrating polymernetwork, IPN)의 나노입자로서 정상적인 세포 및 암세포에 대해 독성이 없으며, 엽산 수용체를 과발현하는 암세포 (예컨대, 유선암, 폐암, 난소선암)에 대해 선택적으로 유입되어 PpIX를 생성하고 405 nm의 파장에서 형광을 확인하였다 (도 1 참조).
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 나노전달체는 상호 침투 고분자 망상 구조를 가짐으로써 수상성분에 포함된 알긴산-엽산 컨쥬게이트 및 암세포 형광유도물질이 물리적으로 캡슐화되어, 기계적 강도를 높이고 열역학적 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기 나노전달체는 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 양이온성 또는 음이온성에 의해 표면에 높은 절대값의 제타전위를 가질 수 있으며, 이러한 높은 제타전위로 인한 입자간 반발력에 의해 오스트발트 라이프닝(Ostwald ripening) 현상이 방지되어 나노전달체의 안정성이 증가될 수 있다. 시험 결과, 본 발명의 일 실시예에 따른 나노전달체를 냉장 보관 시 시간의 경과에 따라 동적산란광 분석장치를 통해 제조한 나노전달체를 3개월간 크기 변화를 측정하였으며, 나노전달체의 직경의 변화가 거의 없는 것으로 나타나, 열역학적으로 매우 안정한 것을 확인하였다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 나노전달체는 평균 입자크기가 약 200 nm 이하, 보다 구체적으로는 30 내지 150 nm일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 나노전달체 제타전위는 -10 내지 -50 mV 또는 10 내지 50 mV, 보다 구체적으로는 -10 내지 -30 mV 또는 10 내지 30 mV 일 수 있다. 상기 제타전위 값은 알긴산-엽산 컨쥬게이트가 수상에서 음전하 값을 갖게 되어 나타나는 값으로, 나노전달체의 내부 봉입되는 물질들의 상호작용에 의한 이온성 결합에 의해 표면 제타전위 값이 바뀐다. 상기 범위의 낮은 제타 전위를 갖는 경우에는 입자들의 반발력의 증가로 인해 오스트발트 라이프닝과 같은 현상이 방지될 수 있어 안정한 나노입자를 유지할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 나노전달체를 제조하기 위한 나노에멀젼은 나노에멀젼 전체 중량을 기준으로 유상성분 70 ~ 80 중량%, 수상성분 10 ~ 20 중량% 및 상기 계면활성제 5 ~ 15 중량%를 포함하는 것일 수 있다.
상기 나노에멀젼은 상기 성분의 비율의 범위에서 유중수 나노에멀젼의 수상 나노입자의 크기를 조절할 수 있으며, 수상 나노입자의 안정성을 유지할 수도 있다. 특히 나노에멀젼 전체 중량을 기준으로 수상성분의 중량비가 계면활성제의 중량비보다 큼으로 인해 나노 크기의 입자가 형성될 수 있고, 입자의 안정성도 우수하다.
본 발명에 따른 나노전달체는 암세포 형광유도물질을 정상세포가 아닌 암세포에 선택적으로 전달할 수 있으므로, 암세포에 유입된 형광유도물질에 의해 유도된 형광물질로 인해 암세포를 정상 조직에 대해 형광에 의해 명확히 구분시키는 암진단용 약학 조성물, 특히 조영제로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 "암 진단용"은 암의 존재 여부를 진단하는 것뿐만 아니라, 암 치료 시 치료경과 혹은 암의 악화 정도를 확인하기 위해 조영제로서 사용하는 것을 모두 포함한다. 또한, 암 조직의 외과적 절제과정에서 암 조직을 정상 조직과 명확히 구별하기 위한 조영제로서의 사용을 포함하는 개념이다. 이외에도, 암 조직을 정상 조직과 구별하여 형광을 나타냄으로써 얻어질 수 있는 임의의 유익한 용도를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
상기 암은 알긴산-엽산 컨쥬게이트가 타겟팅할 수 있음과 동시에 암세포 내에서 상기 암세포 형광유도물질로부터 형광물질이 유도될 수 있는 임의의 암일 수 있으며, 상기 암세포 형광유도물질 및/또는 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 구체적인 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상기 암은 뇌종양, 폐암, 위암, 유선암 및 난소암을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 암 진단용 약학 조성물은 암의 진단을 위해 나노전달체를 암 조직 부위에 전달할 수 있는 임의의 제형으로 제제화될 수 있으며, 예를 들어 주사제로서 제제화 될 수 있다.　주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다.　상기 약학 조성물은 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다.　이러한 주사제에 부가될 수 있는 부형 제 및 첨가제는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 하기 문헌을 참조하면 알 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995); Dr. H.P. Fiedler "Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete" [Encyclopaedia of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related fields]).
상기 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수 혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요 소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 0.01 ㎎ 내지 100 ㎎, 또는 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 알긴산-엽산 컨쥬게이트는 카복실기 보호기 및 이탈기를 이용한 제조방법을 통해 알긴산의 히드록시기와 엽산의 카복실기가 에스터 결합을 형성함으로써 종래 엽산의 아민기와 알긴산의 카복실기가 공유결합한 알긴산-결합 엽산에 비해 효과적으로 암세포를 표적화하여 정상 조직과 명확하게 구분할 수 있어, 암의 병변 부위에 대한 정밀 진단 및 효율적인 외과 절제술에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산-엽산 컨쥬게이트 및 5-ALA를 포함하는 나노전달체의 암세포 내 5-ALA 전달 및 방출을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산-엽산 컨쥬게이트, 엽산 및 알긴산의 1H NMR 스펙트럼 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산-엽산 컨쥬게이트, 엽산 및 알긴산의 (A) FT-IR 그래프 및 (B)는 UV-vis 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 물리화학적 특성을 확인한 것으로, (A)는 NP4의 형태를 보여주는 TEM 이미지이며, (B)는 NP 230개의 지름을 측정한 크기 분포도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 물리화학적 특성을 확인한 것으로, NP1 ~ NP4의 시간 경과에 따른 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 세포내 누적 5-ALA 방출률을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 세포독성 결과를 나타낸 것으로, (A)는 정상 세포인 HFB이며, (B) 내지 (C)는 암세포주인 MCF-7, A549 및 SKOV-3 이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 포함하는 NP1 ~ NP4의 형광을 정량 측정한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 세포내 PpIX 생성을 확인한 형광 이미지로, (A)는 정상 세포인 HFB이며, (B) ~ (D)는 암세포주인 A549, MCF-7 및 SKOV-3 이다. 세포핵은 DAPI로 염색되어 파란색으로 표시되고, PpIX는 빨간색으로 표시된다. 축적바(scale bar)는 50 μm를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 세포내 PpIX 생성을 형광으로 정량 측정한 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 포함하는 나노전달체의 제조
1-1. 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 제조
알긴산-엽산 컨쥬게이트 (alginic acid-folic acid conjugate, AF)를 제조하기 위하여, 에탄올/0.6 M HCl 혼합액 30 mL에 소듐 알지네이트 (Wako Pure Chemical Industries, 11 kDa, 일본) (1 g, 4.632 mmol)를 첨가하여 4℃에서 18시간 교반하였다. 알긴산(alginic acid)을 생성하여 정성(qualitative) 여과지 (Whatman™)를 이용하여 진공에서 여과하였고, 알코올과 아세톤으로 여러 번 세척한 후 바이알(vial)로 옮겨 밤새 진공 상태에서 건조하였다. 건조된 알긴산을 물 (30 mL)에 용해하고 그 용액이 pH 9에 도달할 때까지 연속적으로 교반하면서 4% TBAOH (Sigma-Aldrich, 미국)를 첨가하였다. 불투명 용액을 감압 조건으로 동결 건조하여 백색 TBA-알긴산을 수득하였다 (반응식 1 참조).
엽산(folic acid) (Sigma-Aldrich, 미국) (0.408 g, 0.9264 mmol)을 DMSO (10 mL)과 혼합하고 CDI(1,10-carbonyldiimidazole) (Sigma-Aldrich, 미국) (0.1502 g, 0.9264 mmol)를 첨가하였다. 생성된 화합물을 24시간 동안 어두운 곳의 25℃에서 N2 가스 조건에서 교반하였다 (반응식 2 참조).
이후, TBA-알긴산을 1 wt% TBAF(tetrabutylammonium fluoride hydrate) (Sigma-Aldrich, 미국)를 포함하는 DMSO 50 mL에 용해하였다. 연속적인 교반 조건에서, TBA-알긴산 용액에 엽산/CDI 화합물을 첨가하고 40℃의 어두운 곳에서 밤새 반응하도록 놓아두었다. 생성물을 0.01 M HCl을 포함하는 차가운 에탄올/메탄올 (1:1)에 침전시켜 여과하고 알코올로 세척하였다. 생성물을 소듐 카보네이트(sodium carbonate) 용액에 용해하여 중화시키고, AF를 감압 조건으로 동결 건조하여 수득하였다 (반응식 3 및 화학식 1 참조).
1-2. 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 포함하는 나노전달체의 제조
종래 유중수(W/O) 에멀젼 제조방법 (Jeong, Y. et al., Biomacromolecules 2019, 20, 1068-1076.)을 참고하여 AF를 포함하는 나노전달체 (NP)를 제조하였다.
간단히 설명하면, 유리 바이알에 소이빈 오일(soybean oil), 계면활성제 혼합물 (Span80 및 Tween80 혼합), 및 AF과 5-ALA (98%) (Sigma-Aldrich, 미국)를 포함하는 수상성분을 각각 7:2:1의 중량비로 넣고 혼합하였다. 입자 최적화를 위해, 5-ALA의 농도를 1 wt%로 고정하고 친수성-친유성 밸런스(hydrophilic-lipophilic balance, HLB) 수치 및 AF 농도 (0.5 ~ 1 wt%)를 조정하여 다양한 나노전달체를 제조하였다. 용액을 혼합한 후 40% 진폭(amplitude)에서 10분간 프로브형 소니케이터 (VC-750, Sonics and Materials, 미국)를 사용하여 온-오프(on-off) 펄스 없이 초음파를 가하였다. 이후, 황색 불투명 용액의 혼합물을 수득하여 DI(deionized water) 또는 PBS(phosphate buffer saline)로 재분배(redisperse)하고 원심분리하였다. 액체 상태로 회수된 NP를 실린지 멤브레인 필터 (DISIC-25, Advantec, 일본)를 사용하여 여과하였다. 마지막으로 NP 용액의 불순물을 제거하기 위하여 투석막(dialysis membrane) (Cellu-Sep MWCO 25 kDa)을 이용하여 24시간 투석한 후 최종 NP 1 ~ 4를 수득하였다.
비교예 1. 알긴산을 포함하는 나노전달체의 제조
AF 대신 알긴산을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 포함하는 나노전달체를 제조하였다.
실험예 1. 알긴산-엽산 컨쥬케이트, 및 이를 포함하는 나노전달체의 물리화학적 특성 분석
AF 및 NP의 구조를 1H NMR(Proton nuclear magnetic resonance), FT-IR(Fourier transform infrared) 및 UV-vis로 분석하였다. 1H NMR 측정기 (JNM-LA400, JEOL, 일본)는 알긴산과 AF을 80℃에서, 그 외 다른 화합물을 25℃에서 400 MHz로 측정하였다 (도 2 참조). FT-IR 측정기 (ALPA, Bruker, 미국)는 주파수 범위 4,000 ~ 400 cm-1로 사용하여 AF를 분석하였다 (도 2의 A 참조). UV-vis 스펙트럼 분석은 Nanodrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher, 미국)을 사용하여 수행하였다 (도 2의 B 참조).
또한, AF 농도 및 계면활성제 혼합물 비율에 따라 다양하게 제조된 NP 1 ~ 4의 특성을 분석하였다. NP의 형태는 투과전자현미경(transmission electron microscopy) (TEM JEM-3010, JEOL, 일본)으로 관찰하였다. 그리고 NP를 4℃에 저장하면서 3개월간 그 크기를 측정하여 안정성(stability)을 평가하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, NP는 원형으로 응집 없이 단순 분산(monodisperse)되어 존재하며, NP 230개의 평균 입자크기가 약 25 nm인 것을 확인하였다. 또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 3개월간 크기 분포에서 큰 변화 없이 안정적으로 유지된 것을 확인하였다.
또한, Zetasizer (Malvern, 영국)를 이용하여 NP의 평균 크기, 제타전위(ζ poteintial), 5-ALA 적재능(loading capacity, LC) 및 캡슐화 효율(encapsulation efficiency, EE)을 측정하였다.
NP의 평균 크기는 동적산란광(dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 25℃에서 173°의 각도로 평균 입자크기를 측정하였다.
NP에 포함된 5-ALA의 농도를 측정하기 위하여, NP (1 mL)를 1.5% 과산화수소 (1.5 mL)에 분산시키고 37℃의 초음파 항온 수조에서 10분간 초음파 처리한 후 2시간 강하게 교반하였다. 이후, Microsep device (MWCO 1 kDa)를 이용하여 NP 분해물을 12,300 xg로 원심분리하고 5-ALA을 포함하는 상층액을 회수하여 감압 조건에서 동결건조하였다. 그리고서 제조사의 지침에 따라 TNBSA(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid) (5% w/v) (Thermo Fisher, 미국)를 이용하여 5-ALA를 정량하였다. 5-ALA 적재능 및 캡슐화 효율은 하기 수학식으로 계산되었다.
[수학식 1]
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, NP4가 가장 작으며, 그 평균 입자크기는 약 45 nm로 나타나, 효율적으로 암세포에 침투할 것으로 예상할 수 있다. 제타전위는 나노전달체의 안정성을 나타내는 표지로, 모든 NP가 알긴산의 카복실기 때문에 음성의 표면 전하를 가지는 것을 확인하였으며, 이를 통해 NP가 안정적으로 현탁된 상태로 형성된 것을 알 수 있었다. 5-ALA 적재능은 AF 농도에 따라 증가하며, 캡슐화 효율은 AF 농도가 1 wt%일 때 가장 높은 것으로 나타났는데, 이는 알긴산과 양쪽성 이온을 갖는 5-ALA 간의 이온결합 수가 증가하여 영향을 미친 것으로 예상할 수 있다. 따라서, AF 농도가 증가할수록 고농도의 5-ALA가 캡슐화되며, 캡슐화 효율 또한 증가하기 때문에 이후 실험에서는 NP4를 사용하여 5-ALA 방출 프로파일, 세포 독성 및 PpIX 정량 분석을 수행하였다.
NP 알긴산-엽산 (wt%) HLB Day 0 제타전위 (mV) LC% EE%
크기 (nm) PDI
NP1 0.5 7 117.9±0.65 0.389 -27.4±2.1 1.2% 6.33%
NP2 0.5 8 53.56±1.52 0.496 -23.3±0.7 0.4% 8.8%
NP3 1 7 83.45±3.47 0.584 -22.8±2 2.8% 27.14%
NP4 1 8 45.89±1.56 0.454 -29.3±0.1 1.8% 31.6%
실험예 2. 알긴산-엽산 컨쥬케이트를 포함하는 나노전달체의 5-ALA 방출 프로파일
5-ALA 방출 프로파일은 37℃에서 두 가지 다른 pH 환경 조건 (pH 5.0 및 pH 7.4)으로 평가하였다. 먼저, NP4 (2 mL)를 pH 5.0 또는 pH 7.4의 PBS 8 mL에 있는 투석막 (MWCO 1 kDa) 안에 위치시키고 37℃에서 교반하였다. 일정 시간 후, 방출액을 회수하고 신선한 PBS를 첨가하였다. 투석액 내 5-ALA의 농도는 마이크로플레이트 측정기 (Synergy H1, BioTek, 미국)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 TNBSA 용액을 사용하여 분석하였다. NP에서 방출된 누적 5-ALA 농도 (cumulative release)는 하기 수학식 2로 계산되었다.
[수학식 2]
여기서, TALA는 NP 내 총 5-ALA 함량을 의미하며, V0는 방출액의 총 부피 (10 mL)를 의미하고, Vr은 첨가된 PBS의 부피 (1 mL)를 의미하고, Cs는 시료 내 5-ALA의 농도를 의미한다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, pH 7.4 조건에서 5-ALA는 실험 기간 동안 30% 이상 방출되지 않았는데, 이는 생리활성 조건에서 5-ALA 함유 NP가 안정적인 것을 의미한다. 반면, pH 5 조건에서 5-ALA는 12 ~ 24시간부터 방출되면서 80시간 이후에 80% 이상 방출되었는데, 이는 산성 pH에서 알긴산의 카복실기의 탈양성자화 및 분해 때문인 것으로, 알긴산의 산 분해 가수화가 산성조건에서 발생하며 NP는 전달체 내 약물을 방출하기 위해 탈양성자화되는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 결과는 위장관암을 조영하는데 NP를 포함하는 조영제를 이용할 수 있음을 시사한다.
실험예 4. 알긴산-엽산 컨쥬케이트를 포함하는 나노전달체의 세포 독성 측정
인간 섬유아세포 세포주(human fibroblast cell line, HFB)는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)으로 배양하였다. MCF-7 (유선암), A549 (폐암) 및 SKOV-3 (난소선암) 세포주는 10% FBS 및 1% PS을 포함하는 RPMI 1640로 배양하였다. 모든 세포주는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank)에서 입수하였으며, 5% CO2로 설정된 37℃의 가습 항온 세포배양기에서 배양하였다.
세포독성 측정을 위하여, HFB, MCF-7, A549 및 SKOV-3 세포주를 이용하였다. 먼저, 96웰 플레이트에 세포를 5x103 cell/well씩 분주하고 37℃에서 24시간 사전배양 하였다. 그리고 각 웰에 NP4를 12.5, 25, 50, 100 또는 200 μg/mL씩 처리하여 37℃에서 6, 12 또는 24시간 배양하였다. NP 함유 배지를 제거한 후 배지에 CCK-8 용액을 처리하여 37℃ 세포배양기에서 2시간 반응하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 측정기를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.
엽산과 5-ALA는 체내에서 정상적으로 존재하는 물질이며, 알긴산은 자연에서 생산되어 임상적으로 승인된 물질이다. 따라서, 도 7에 나타낸 바와 같이, NP는 농도 및 배양 시간과 관계없이 세포독성이 없으므로, 우수한 생체적합성(biocompatibility)을 가지는 것을 확인하였다.
실험예 3. 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 포함하는 나노전달체의 PpIX 정량 분석
PpIX의 세포내 축적을 정량하기 위하여, 24웰-플레이트에 세포를 0.5x106 cell/well씩 분주하였다. 48시간 배양 후 NP (0.1 mg/mL)를 포함하는 신선한 FBS-free 배지로 교체하고 24시간 더 배양하였다. NP가 세포 안으로 들어가 5-ALA가 PpIX로 변환된 후, NP를 포함하는 배양 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하였다. 이후, 차가운 RIPA 세포용해 완충액 100 μL를 각 웰에 첨가하여 잘 섞은 후 얼음 위에서 30분간 배양하고 4 ~ 6회 볼텍싱(vortexing)을 실시하였다. 세포용해액을 4℃에서 20분간 14,000 xg로 원심분리하였다. 상층액을 검은색 96웰 플레이트에 분주하고 635 nm의 방출 파장 (405 nm의 여기 파장)에서 형광 강도를 마이크로플레이트 측정기로 측정하였다. BSA(bicinchoninic acid) (Thermo Fisher, 미국) 분석은 세포용해물의 총 단백질 농도로 형광 강도를 표준화함으로써 세포 수에 따른 정량적 형광 값을 얻기 위해 사용하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 4종의 NP를 PBS에 분산하여 암세포에 처리한 경우가 DI에 NP를 분산한 경우에 비해 형광 강도가 더 강한 것으로 나타났다. 특히, NP4는 가장 강한 형광 강도를 보여, 이후 세포 내재화 시험에 사용하였다.
실험예 4. 알긴산-엽산 컨쥬케이트를 포함하는 나노전달체의 세포 내재화 측정
NP의 세포 흡수를 분석하기 위하여, 정상 세포주 및 3종의 암세포주를 사용하여 48웰 플레이트에 세포를 0.05x106 cell/well에 분주하고 37℃에서 48시간 사전배양 하였다. 기존 배지를 NP4 (0.1 mg/mL)를 포함하는 신선한 FBS-free 배지로 교체하고 12시간 또는 24시간 배양하였다. 이후, 세포를 PBS로 세척하고 각 웰에 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액 100 μL을 첨가하여 15분간 고정시켰다. 세포 핵(nuclei)을 염색하기 위해 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하여 실온에서 20분간 반응하였다. 염색 후, 세포를 DPBS(Dulbecco's PBS)로 세척하고 공초점형광형미경(confocal fluorescence microscope) (Zeiss Z1 Axio Observer, Carl Zeiss, 독일)을 이용하여 형광 이미지를 촬영하였다. PpIX의 형광은 AT560/40 nm의 여기 필터 및 635/60 nm의 방출 필터 조건에서 촬영하였다.
그 결과, 도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, 알긴산을 포함하는 나노전달체 (Alg)는 암세포에서 형광을 발현하지 못하는 반면, 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 포함하는 나노전달체 (NP)는 형광을 발현하였다. 또한, 정상 세포인 HFB 세포주에서는 형광이 관찰되지 않은 반면, 3종의 암세포주에서는 NP를 흡수한 후 알긴산을 분해하는 12시간부터 형광이 관찰되었다. 따라서, NP는 암세포에만 선택적으로 흡수되는 것을 알 수 있었다. 그리고 형광 강도는 암세포에서 최대 12시간까지 점차 증가하고 24시간까지 급격히 증가하는 것으로 확인되었다. A549 및 MCF-7 세포주의 형광 강도는 24시간까지 유사한 수준을 보이며, SKOV3 세포주는 MCF7 및 A549 세포주에 비해 강한 형광 강도를 나타냈다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. a) 알긴산의 카복실기에 보호기를 부착하는 단계;
    b) 엽산의 카복실기에 이탈기를 부착하는 단계; 및
    c) 상기 a) 단계의 보호기가 부착된 알긴산과 상기 b) 단계의 이탈기가 부착된 엽산의 반응 생성물을 얻는 단계를 포함하는 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 제조방법으로서;
    상기 a) 단계의 보호기는 테트라부틸암모늄(tetrabutylammonium)인 것이며,
    상기 b) 단계의 이탈기는 이미다졸(imidazole)인 것이고,
    상기 c) 단계의 반응 생성물은 알긴산의 히드록실기와 엽산의 카복실기가 에스터 결합으로 결합된 것인,
    상기 알긴산-엽산 컨쥬게이트는 하기의 화학식 1로 표시되어지는 것인,
    [화학식 1]

    상기 화학식 1에서 R은 알긴산 단위체 또는 알긴산 중합체인 것인, 알긴산-엽산 컨쥬게이트의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 알긴산의 히드록시기와 엽산의 카복실기가 에스터 결합으로 연결된 알긴산-엽산 컨쥬게이트.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 알긴산-엽산 컨쥬게이트는 하기 화학식 1로 표시되는 것인 알긴산-엽산 컨쥬게이트.
    [화학식 1]

    상기 화학식 1에서 R은 알긴산 단위체 또는 알긴산 중합체이다.
  7. 청구항 5의 알긴산-엽산 컨쥬게이트를 포함하는 암 진단용 약학 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 약학 조성물은 형광유도물질을 더 포함하는 것인 암 진단용 약학 조성물.
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이사라, Study on Fluorescence Inducing pH-Sensitive Nanoparticle based on Folate Conjugated Alginate for Cancer Diagnosis. 서울대학교 대학원, 융합과학부 나노융합전공, 학위논문, 2020.08.31.*

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