ES2287728T3

ES2287728T3 - Complejos de quelatos metalicos inmovilizados sobre soportes solidos para la preparacion de peptidos.

Info

Publication number: ES2287728T3
Application number: ES04734508T
Authority: ES
Inventors: Andreas Rybka; Hans-Georg Frank; Franz-Peter Bracht; Udo Haberl
Original assignee: AplaGen GmbH
Current assignee: AplaGen GmbH
Priority date: 2003-05-23
Filing date: 2004-05-24
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2024-05-24
Also published as: SI1626982T1; DE602004006254T2; CA2524693A1; EP1810977A3; EA200501852A1; AU2004240766A1; WO2004104023A3; JP2007528870A; WO2004104023A2; EP1810977A2; EA008305B1; ATE361311T1; EP1626982A2; DK1626982T3; MXPA05012072A; EP1626982B1; US20070027303A1; DE602004006254D1; CN1795202B; CN1795202A

Abstract

El uso de una fase sólida activada que comprende un soporte sólido, ligandos quelantes metálicos unidos covalentemente al soporte sólido, iones metálicos Mn+ con n = 1 a 3 unidos coordinativamente a dichos ligandos quelantes metálicos, proporcionando dicha fase sólida activada sitios de coordinación para el anclaje coordinativo y reversible de una porción de anclaje de un péptido para la síntesis peptídica en fase sólida sobre dicha fase sólida activada, donde el péptido es un "péptido en crecimiento" y sometido a procedimientos de elongación del péptido.

Description

Complejos de quelatos metálicos inmovilizados sobre soportes sólidos para la preparación de péptidos.

La síntesis química de péptidos está bien establecida. En principio, se pueden distinguir dos métodos diferentes. La síntesis en solución conlleva a menudo mucho tiempo y por lo tanto no es útil para la investigación científica, mientras que la síntesis sobre un soporte sólido permite una rápida optimización de los ciclos de reacción. Los protocolos disponibles para la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) se basan en la técnica de Merrifield (Merrifield, R.B., J. Amer. Chem. Soc. 85, 1963, 2149), para sintetizar péptidos con secuencias definidas sobre un soporte sólido insoluble que tiene la ventaja de que la separación de los reactivos solubles se puede manipular fácilmente mediante simple filtración. La SPPS se ha desarrollado extremadamente rápido hasta algunas variantes (resumidas en la presente memoria como síntesis de Merrifield) y consiste en las siguientes etapas:

1. En una primera etapa, se selecciona una matriz adecuada para el soporte sólido (resina), a la cual se fija covalentemente un primer aminoácido C-terminal a través de su extremo C. Normalmente el primer aminoácido C-terminal de la secuencia que se va a sintetizar está anclado al soporte sólido con la ayuda de un conector. Las funciones amino y de la cadena lateral de este primer aminoácido se protegen por medio de grupos protectores conforme al estado de la técnica, normalmente compatibles con la química de F-moc o Boc.

2. En una segunda etapa, el grupo que protege el extremo N del primer aminoácido se separa selectivamente.

3. En una 3ª etapa, el siguiente derivado aminoácido correspondiente al 2º aminoácido de la secuencia que se va a sintetizar se acopla al grupo amino terminal libre del primer aminoácido, que tiene a su vez la función amino y la cadena lateral protegidas por los grupos protectores apropiados.

4. En la 4ª etapa, el grupo protector del extremo N se separa del derivado aminoácido recién acoplado y se repite la etapa 3 para el siguiente aminoácido. De este modo, la síntesis de péptidos en fase sólida incluye un procedimiento cíclico por medio del cual se puede construir una secuencia definida de aminoácidos sobre un soporte en fase sólida. Al final del procedimiento, el péptido es liberado del soporte sólido p. ej. mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (incluyendo diferentes captadores). Simultáneamente, los grupos protectores que debían haber estado presentes en las cadenas laterales de los aminoácidos, protegiendo de ese modo los grupos imidazol-, mercapto-, carboxi-, amino-, alcohol- u otros grupos funcionalmente relevantes, deberían ser separados. Esto conduce al péptido final, que a menudo necesita ser purificado en un equipo cromatográfico adecuado, normalmente un Sistema LC/MS, que es capaz de separar y analizar simultáneamente los componentes. Estas etapas y etapas adicionales se consideran en profundidad en los libros de texto normalizados sobre la síntesis de péptidos.

Si bien la síntesis de péptidos pequeños (hasta 30 meros) normalmente no es un problema con las técnicas de SPPS, existen limitaciones con los péptidos de un tamaño de 40 a 120 (o incluso más) aminoácidos. Sus propiedades corresponden mucho mejor al término "proteína pequeña" que al término "péptido grande":

a) Los péptidos de este tamaño no tienen normalmente sólo una estructura primaria (secuencia), sino también una estructura secundaria (p. ej., hélice, lámina beta) y una estructura terciaria (p. ej. cremallera de leucina, puentes disulfuro de los dominios) a construir. Si bien las diferentes variantes de la técnica de SPPS pretenden solamente construir la estructura primaria, no proporcionan herramienta alguna para controlar la formación intramolecular de las estructuras secundaria y terciaria de un modo adecuado. La carencia de mecanismos de control sobre el plegamiento de péptidos más grandes se agrava incluso por el hecho de que el desanclaje simultáneo de todos los productos de la resina y eliminación de los grupos protectores conducen a concentraciones locales de producto muy elevadas. En estas condiciones no solamente se produce un plegamiento intramolecular. En muchos casos, las proteínas pequeñas liberadas de la resina tienden a interaccionar entre sí en lugar de plegarse intramolecularmente. Se producen problemas similares, cuando las fracciones liofilizadas que contienen el producto purificado eluido del sistema LC son reconstituidas con disolvente. De este modo, el plegamiento intramolecular y las interacciones intermoleculares compiten y no hay técnicas disponibles para controlar este procedimiento adecuadamente. A menudo esto da como resultado agregados multimoleculares inútiles, que no muestran ninguna actividad biológica
deseada.

b) En el caso de la síntesis de grandes péptidos, se prefiere utilizar fragmentos peptídicos apropiadamente modificados (protegidos, parcialmente protegidos o desprotegidos) en lugar de restos aminoácido individuales para cada ciclo de la síntesis. Normalmente, los fragmentos pequeños o bien se conectan mediante ligación o bien mediante técnicas de condensación de fragmentos con el fin de minimizar el número de etapas sintéticas. Esto es debido al hecho de que los ciclos normalmente no tienen rendimientos cuantitativos y demasiados ciclos a menudo terminan en un descenso inaceptable del rendimiento. Por otra parte se pueden evitar acoplamientos problemáticos de aminoácidos individuales acoplando simplemente un fragmento completo en lugar de un único aminoácido. En el caso de la condensación de fragmentos surge el problema de tener que utilizar tiempos de acoplamiento bastante largos durante cada ciclo de acoplamiento. La baja velocidad de reacción está limitada por la difusión y se debe a la no difusión de las cadenas de péptidos fijadas y al comportamiento por debajo de la difusión óptima de los fragmentos en los poros de la resina circundante. Los tiempos de reacción prolongados a menudo conducen a un grado considerable de racemización en el aminoácido C-terminal de los fragmentos que se van a acoplar, que define la necesidad de mantener tiempos de reacción tan cortos como sea posible. El mejor modo de superar este problema es el acoplamiento en solución. La SPPS clásica no proporciona un enfoque para poner en solución ambos miembros de la pareja de reacción y re-anclarlos durante la siguiente etapa del ciclo, a la vez que se repite este procedimiento en cada etapa de la síntesis.

c) A menudo es difícil controlar la densidad deseada de restos de partida sobre un soporte polimérico y la carga de la resina con el primer aminoácido a menudo se acompaña de racemización. Aunque muchas resinas pre-cargadas se encuentran disponibles en el mercado, estas no abarcan todas las cargas y el mejor valor para un problema dado en la síntesis peptídica a menudo es difícil de encontrar.

La afinidad metálica tenía solamente un aplicación rudimentaria en la síntesis de péptidos, que está documentada en la publicación de Comely et al., (Journal of the Chemical Society, 2001, 2526-2531). Estos autores formaron complejos de un aminoácido con cromo utilizando sistemas aromáticos del electrón del pi p. ej. presentes en la cadena lateral de la fenilalanina transformada. Estos complejos se produjeron en solución y el complejo de cromo pre-existente se ancló después a una fase sólida y se realizó con éxito un ciclo de síntesis. Si bien se demostró la aplicabilidad principal del anclaje de un complejo metálico a una fase sólida, el procedimiento difiere en los siguientes aspectos de la invención presentada en la presente memoria.

Comely et al. anclan el ión metálico a la porción soluble del sistema primero y después anclan el complejo a una fase sólida en la segunda etapa, mientras la invención presentada en la presente memoria se basa en el anclaje de iones metálicos a una fase sólida primero y después ancla la cadena peptídica en crecimiento a la fase sólida. Esto anula una de las desventajas del sistema presentado por Comely, que es que el complejo que contiene cromo resultante en la fase sólida, el enlace coordinativo entre las cadenas laterales de los aminoácidos y el cromo es más fuerte que el enlace entre el cromo y el soporte sólido. De este modo, la elución del complejo con competidores hace eluir el complejo peptídico siempre con cromo en cantidades estequiométricas ancladas al péptido. Esto no es adecuado ni para el análisis y la separación ni para el uso farmacéutico pretendido de un péptido. El complejo formado por la invención presentada en la presente memoria se caracteriza por una fuerte quelación del ión metálico a la fase sólida y una quelación fácilmente reversible con la cadena peptídica. Esto acaba en la elución del péptido sin cantidades sustanciales de iones metálicos anclados a él.

Comely et al., utilizan complejos muy inusuales formados por sistemas aromáticos, mientras la invención presentada en la presente memoria utiliza radicales de quelación, que unen coordinativamente el ión metálico por medio de átomos de N, P, S u O. Estos átomos pueden ser parte de grupos orgánicos normalizados. Tales grupos pueden ser diseñados y optimizados para la quelación y la resistencia de la unión utilizando todo el repertorio de la química orgánica y no están restringidos a los sistemas aromáticos. El principio de la invención presentada en la presente memoria ofrece de este modo una flexibilidad y adaptabilidad mucho mayores que el sistema de
Comely.

El sistema presentado por Comely es profundamente desventajoso ya que necesita una atmósfera inerte para proteger algunos de los reactivos utilizados. Incluso en estas condiciones el rendimiento no excede del 90% para cada etapa, lo que significa que no se puede esperar que los péptidos más largos que decámeros, como máximo, muestren rendimientos apropiados. La invención presentada en la presente memoria y la química de complejos utilizada para ello son compatibles con la química de f-moc normalizada y no necesitan una atmósfera o instrumental especiales. Comely emplea un procedimiento violento que es lento y destructivo para la resina para liberar el péptido (48 horas de oxidación del polímero triturado con aire en luz blanca en DCM).

Si bien hasta ese punto no se hizo otro uso de complejos metálicos en el campo de la síntesis química de péptidos, la afinidad metálica es conocida en el área de la producción recombinante de biomoléculas. No obstante, ésta se utiliza solamente en un entorno cromatográfico como herramienta para la purificación de moléculas biológicas a partir de mezclas biológicas brutas o fluidos biológicos en una única etapa. Existen patentes sobre tales estrategias en las que se utilizan derivados de Agarosa que contienen Iminodiacetato y Nitrilotriacetato (EP-A-253303; US-A-4877830). La agarosa en cuentas adecuada para la purificación cromatográfica de productos recombinantes está disponible comercialmente. Por otra parte, se construyeron péptidos que contenían cadenas laterales con afinidad metálica con la intención de utilizar los complejos metálicos de transición fijados a la cadena lateral como reactivos de marcaje luminiscente para un péptido dado (p. ej. WO-A-9603651A1; EPA-A-0178450). Todas estas descripciones documentan la aplicabilidad de las técnicas de quelatos metálicos en el análisis y/o purificación de biomoléculas. Sin embargo, no implican la naturaleza de la invención y sus aplicaciones descritas más
abajo.

Kaplan B.E. et Al. (Journal of Peptide Research (1.998) Vol. 52, Núm. 4, Páginas 249-260) describen la síntesis en fase sólida de un péptido antigénico que comprende una etiqueta de His y la purificación sucesiva de este péptido mediante cromatografía de afinidad con iones metálicos sobre una columna de quelato de Ni-NTA, en la cual los radicales quelantes metálicos están unidos covalentemente al soporte sólido.

Comely A.C. et Al. (Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1 (2.001) Páginas 2526-2531) describen un método de síntesis de péptidos en fase sólida que implica complejos metálicos de transición (esto es, complejos de coordinación) como radicales conectores entre el péptido en crecimiento y la fase sólida. En particular, los complejos metálicos implican ligandos monodentados anclados covalentemente al soporte sólido y orbitales \pi de las funcionalidades insaturadas de los péptidos.

Ueda E.K.M. et Al. (Journal of Chromatography A (2.003) Vol. 988, Núm. 1, Páginas 1-23) describen soportes sólidos que comprenden complejos de quelatos metálicos para la inmovilización de proteína/péptido, donde los ligandos quelantes están unidos covalentemente al soporte sólido. Además, Ueda et Al. describen el uso de estos soportes sólidos para la purificación de péptidos mediante cromatografía de afinidad con iones metálicos y para el replegamiento de polipéptidos inmovilizados. Varios ligandos quelantes son adecuados para el diseño de soportes de afinidad con iones metálicos. Adicionalmente, Ueda et Al. describen el uso de ligandos competitivos de iones metálicos para desanclar las proteínas unidas del soporte sólido.

El problema técnico a resolver era establecer un método adecuado para la síntesis en fase sólida, incluyendo finalmente además etapas de purificación y replegado/desagregación, de péptidos pequeños y grandes incluyendo los que tienen más de 120 aminoácidos. Para evitar los problemas de la SPPS para péptidos grandes, los péptidos deben ser anclados reversiblemente al soporte sólido. La invención también es útil para replegar y separar los péptidos sintetizados que tienen estructuras plegadas erróneamente y/o agregados moleculares no deseados.

Este problema se pudo resolver mediante el método de la reivindicación 1.

Se proporciona el uso de una fase sólida activada que comprende un soporte sólido, ligandos quelantes metálicos unidos covalentemente al soporte sólido, iones metálicos M^{n+} con n=1 a 3 unidos coordinativamente a dichos ligandos metálicos, proporcionando dicha fase sólida activada sitios de coordinación para el anclaje coordinativo y reversible de una parte del ancla de un péptido para la síntesis peptídica en fase sólida sobre dicha fase sólida
activada.

La fase sólida activada es referida también como "resina de afinidad metálica".

En particular, el péptido es un "péptido en crecimiento" y está sometido a procedimientos de elongación pep-
tídica.

Preferiblemente el péptido en crecimiento consiste en al menos un aminoácido. En otra realización preferida se añaden aminoácidos mono- u oligoméricos al extremo carboxi o amino (extremo C o N) del "péptido en crecimiento" en un programa de reacciones sucesivas de tipo Merrifield, basado preferiblemente en la química de f-moc. En una realización preferida adicional los aminoácidos mono- u oligoméricos son/o contienen aminoácidos naturales y/o no naturales. Además, los derivados aminoácido apropiadamente protegidos o los fragmentos oligoméricos de los mismos que son anclados en cada ciclo del programa de reacciones sucesivas de tipo Merrifield se pueden seleccionar libremente.

Preferiblemente el soporte sólido tiene una base de sílice, vidrio o celulosa o un polímero seleccionado del grupo que consiste en resinas de poliestireno, resinas de melamina y resinas con una base de poli(alcohol vinílico).

Otros soportes adecuados de la presente invención son por ejemplo poliestirenos que tienen entidades funcionales, donde dichas entidades funcionales pueden ser transformadas covalentemente con ligandos quelantes metálicos adecuados. Los ejemplos de tales entidades funcionales son los grupos clorotritilo, amino, nitrógeno heterocíclico, carboxi, hidroxi, mercapto y vinilo. Para la síntesis peptídica en fase sólida los grupos carboxilo libres u otros grupos reactivos del soporte sólido tienen que ser protegidos de manera que no puedan interferir en los procedimientos de elongación peptídica. En una realización preferida el soporte sólido contiene partículas ferromagnéticas. En una realización preferida adicional la separación del líquido y la fase sólida activada durante los ciclos de síntesis se logra por ejemplo mediante tamizado, separación basada en el tamaño, centrifugación o tecnología de separación con partículas magnéticas. Los grupos funcionales reactivos se pueden introducir en el soporte sólido por medio de la reacción con radicales pre-existentes del soporte sólido o - en el caso de los polímeros - también mediante copolimerización con copolímeros adecuadamente transformados.

En una realización preferida cada ligando quelante metálico contiene al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno, fósforo o azufre que es capaz de establecer un enlace ligando-metal coordinativo.

En una realización preferida adicional cada ligando quelante metálico contiene al menos un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en amino, nitrógeno heterocíclico, carboxi, hidroxilo y mercapto.

Los ligandos quelantes metálicos están unidos covalentemente o bien directamente o bien por medio de grupos conectores al soporte sólido. Los grupos conectores adecuados son por ejemplo los grupos amino, carboxi, metileno, oxi, metilendioxi, polimetilendioxi, etilendioxi y polietilendioxi. Para la síntesis peptídica en fase sólida los grupos carboxilo libres de los ligandos quelantes metálicos tienen que ser protegidos de manera que no interfieran en los procedimientos de elongación peptídica.

La Figura 1a representa un ejemplo de un soporte sólido transformado con 5-amino-1,10-fenantrolina.

Para la persona experta, es fácilmente posible identificar numerosos radicales orgánicos, que son capaces de unirse covalentemente a iones metálicos p. ej. de bases de datos que se pueden utilizar para encontrar radicales quelantes metálicos apropiados para los ligandos quelantes metálicos según esta invención. En el marco de esta invención, se puede utilizar este conocimiento existente para identificar radicales adecuados, que están dentro del alcance de la invención. Un ejemplo de una base de datos que contiene los datos respectivos se da con los datos ilustrativos para los grupos adecuados para realizar esta invención descrita en la presente memoria, dada en la Tabla 1, más
abajo:

TABLA 1 Constantes de asociación de complejos de combinaciones ilustrativas ligando/ión metálico

1

2

3

Valores de pK a 25ºC, El valor de pK definido como el logaritmo decádico negativo de la constante de asociación K del complejo. En cada columna se muestra el pK para cada etapa de asociación consecutiva del ión metálico o su complejo ML_{m-1} con una molécula de ligando adicional (MeL_{m-1} + L \rightleftharpoons ML_{m}, K=c(ML_{m})/(c(ML_{m-1})^{*}c(L)). Tomado de ^{1} .

De este modo, se conocen los datos de la formación de complejos de los diferentes iones metálicos con moléculas de ligando y se pueden encontrar en la literatura primaria y en las bases de datos. Los datos de la tabla 1 se toman de la base de datos de Martell y colaboradores (2.003) y proporcionan una visión de conjunto ilustrativa sobre las interacciones de iones metálicos-ligando relevantes. Tales bases de datos pueden ser explotadas para unir el ión metálico a la fase sólida. Estos ligandos también pueden funcionar en la cadena lateral de aminoácidos naturales o no naturales individuales u oligoméricos como un grupo

\hbox{quelante que se
une al ión  metálico insaturado como se describe más
abajo.}

En una realización preferida adicional, cada ligando quelante metálico unido covalentemente al soporte sólido contiene al menos un radical seleccionado del grupo que consiste en radicales trifenilfosfina, radicales aminopurina, preferiblemente radicales 6-aminopurina, radicales ftalocianina, radicales 1,10-fenantrolina, preferiblemente radicales 5-amino-1,10-fenantrolina, radicales terpiridina, preferiblemente radicales 4'-amino-[2,2';6',2'']-terpiridina, radicales triazaciclononano, preferiblemente radicales [1,4,7]triazaciclononano y radicales tetraazaciclododecanilo, preferiblemente radicales [1,4,7,10]tetraazaciclododecano.

Preferiblemente el M^{n+} metálico se selecciona del grupo que consiste en Mn^{2+}, Cu^{2+}, Ni^{2+}, Co^{2+}, Zn^{2+}, Mg^{2+}, Ca^{2+}, Fe^{2+}, Fe^{3+} e iones lantánidos, el M^{n+} particularmente preferido es Cu^{2+}, Ni^{2+}, Co^{2+} y Zn^{2+}.

La Figura 1b representa un ejemplo de una fase sólida activada, que comprende un soporte sólido, unido covalentemente al ligando quelante metálico de 5-amino-1,10-fenantrolina e iones metálicos Cu^{2+} quelados.

La Figura 1c representa un ejemplo de un péptido anclado, que comprende un resto peptídico y una porción de anclaje del radical de oligohistidina, donde dicha porción de anclaje está anclada covalentemente a una fase sólida activada, que comprende un soporte sólido, ligando quelante metálico de 5-amino-1,10-fenantrolina e iones metálicos de Cu^{2+} quelados unidos covalentemente.

El espacio cubierto de los péptidos anclados y los aminoácidos anclados (mono- u oligoméricos), referido el último como punto de partida para la síntesis peptídica en fase sólida, sobre la superficie del soporte sólido activado se puede controlar muy fácilmente. Siempre que los sitios de coordinación de la fase sólida activada estén uniformemente diseminados sobre la superficie, la densidad de los péptidos anclados y los puntos de partida (espacio cubierto) se pueden ajustar a las necesidades específicas de la síntesis, la purificación o el replegamiento de los péptidos y se determina por medio de la cantidad de puntos de partida añadidos a la resina durante la 1ª etapa de anclaje. El espacio cubierto de la superficie se puede calcular a partir de los valores del área de superficie y números de péptidos (medidos en moles) y/o diámetros conocidos.

Puesto que las reacciones de complejación son normalmente rápidas, el anclaje se puede completar en presencia de un disolvente orgánico o acuoso en unos pocos minutos.

Se proporciona un procedimiento, en el que una porción de anclaje de un péptido, dicha porción de anclaje está unida coordinativamente a los sitios de coordinación de una fase sólida activada que comprende un soporte sólido, ligandos quelantes metálicos unidos covalentemente al soporte sólido, iones metálicos M^{n+} con n = 1 a 3 para dichos ligandos quelantes metálicos, se separa de dicha fase sólida activada después de la elongación del péptido inmovilizado mediante la adición de un ligando competitivo.

Según la invención se puede añadir un agente competitivo a los péptidos anclados con el fin de separar competitivamente la porción anclada del péptido de la fase sólida activada. Preferiblemente el agente competitivo se añade a la mezcla de reactivos de la etapa de acoplamiento de un programa de reacción de tipo Merrifield. Un agente quelante competitivo adecuado tiene aproximadamente la misma afinidad o más débil por los sitios de coordinación libres de la fase sólida activada que cada radical quelante de iones metálicos individual de la porción de anclaje de un péptido a dichos sitios de coordinación.

\newpage

En una realización preferida el agente competitivo es soluble en la mezcla de reactivos de la etapa de acoplamiento y no reacciona con los ingredientes de las mezclas de reactivos.

En la figura 2a se representa el principio de desanclaje con un ejemplo en el que la porción de anclaje del péptido es un resto oligohistidina.

En contraste con el desanclaje, el re-anclaje de la porción de anclaje del péptido a una fase sólida activada es posible diluyendo la mezcla que contiene una fase sólida activada, un agente competitivo y un péptido no anclado.

En una realización preferida en el programa de reacción de tipo Merrifield, el re-anclaje se lleva a cabo antes de las siguientes etapas de enjuagado.

En la figura 2b se representa el principio de re-anclaje con un ejemplo en el que la porción de anclaje del péptido es un resto oligohistidina.

Se muestra un ejemplo del efecto de las concentraciones de competidor sobre la unión de un péptido a una fase sólida activada en la Figura 3a, donde se utiliza el desanclaje con concentraciones crecientes de competidor para la elución de un péptido unido coordinativamente. Este procedimiento es reversible.

En un procedimiento proporcionado adicionalmente, el ligando competitivo contiene al menos un radical capaz de quelar iones metálicos, preferiblemente un radical que contiene nitrógeno, seleccionado del grupo que consiste en imidazol, N-metilimidazol, aminopurina, fenantrolina, bipiridina, terpiridina, triazaciclononano y tetraazaciclododecano, radicales ácido iminodiacético, radicales ácido nitrilotriacético y radicales ácido etilendiamino-tetraacético.

En otra realización preferida, los ligandos competitivos contienen radicales estructurales que tienen pares de electrones para enlaces coordinativos tales como radicales trifenilfosfina, radicales 6-aminopurina o radicales ftalocianina.

Los ejemplos específicos para el ligando competitivo son glutatión, ácido etilendiaminotetraacético, imidazol, N-metilimidazol, fenantrolinas, preferiblemente 5-amino-1,10-fenantrolinas, aminopteridinas, triazaciclononanos o tetraazaciclododecanos.

En una realización preferida de dicho procedimiento, el péptido es un "péptido en crecimiento" unido a través de una porción de anclaje a un ión metálico, que está unido a un ligando quelante metálico unido a un soporte sólido y sujeto a procedimientos de elongación peptídica.

El término péptido en "crecimiento" hace referencia a la construcción sucesiva de un esqueleto peptídico, utilizando normalmente aminoácidos protegidos n-terminalmente y en la cadena lateral, como es por ej. el caso de todos los protocolos de síntesis peptídica basados en fmoc.

Preferiblemente se añaden aminoácidos mono- u oligoméricos al extremo C o N del "péptido en crecimiento" en un programa de reacción sucesivo de tipo Merrifield.

Como se ha mencionado antes, un péptido en crecimiento que comprende uno o más aminoácidos mono- u oligoméricos unidos covalentemente a un ión metálico de una porción de anclaje es considerado como un punto de partida para la síntesis peptídica en fase sólida. Los ejemplos para tal punto de partida son un resto glicina individual unido covalentemente por medio de su grupo carboxilo a un radical complejante de ión metálico.

Preferiblemente el punto de partida comprende al menos una cadena lateral y/o modificación C-terminal, que es capaz de coordinarse con los iones metálicos de una fase sólida activada. Dichos aminoácidos pueden ser naturales o no naturales. Cada aminoácido mono- u oligomérico anclado utilizado en un punto de partida para la síntesis peptídica en fase sólida, tiene que ser compatible con los protocolos de síntesis peptídica.

Preferiblemente la porción de anclaje del péptido contiene al menos un radical complejante de ión metálico, comprendiendo cada uno de dichos radicales al menos un grupo que contiene nitrógeno, oxígeno, fósforo o azufre que es capaz de coordinarse con los iones metálicos de la fase sólida activada.

En una realización preferida cada radical complejante de ión metálico contiene de 1 a 10 de dichos grupos que contienen nitrógeno, oxígeno, fósforo o azufre. Más preferiblemente cada radical complejante de ión metálico contiene de 1 a 10 grupos que contienen amino, nitrógeno heterocíclico, aza, carboxi, azufre y fósforo.

Los radicales complejantes de iones metálicos de la porción de anclaje pueden ser transformados, siempre que el derivado obtenido sea compatible con los protocolos de síntesis peptídica. Las Figuras 1c, 2a y 2b representan un radical oligohistidina, cuyo extremo amino está protegido mediante la química de Fmoc.

En otra realización preferida de la invención el enlace coordinativo de los ligandos quelantes metálicos con los iones metálicos de la fase sólida activada es más fuerte que el enlace coordinativo de la porción de anclaje del péptido a dichos iones metálicos.

Más preferiblemente el grupo que contiene nitrógeno, capaz de coordinarse con los iones metálicos de la fase sólida activada, se selecciona del grupo que consiste en amino, hidroxilo, carboxilo, mercapto, imidazolilo, N-metilimidazolilo, radicales aminopurinilo, radicales fenantrolilo, radicales piridilo, radicales bipiridilo, radicales terpiridinilo, radicales triazaciclononanonilo, radicales tetraazaciclododecanilo, radicales ácido iminodiacético, radicales ácido nitrilotriacético y radicales ácido etilendiaminotetraacético.

Dicho radical particularmente preferido comprende de 2 a 10 aminoácidos naturales o no naturales. Las cadenas laterales adecuadas para dicho aminoácido que contiene radicales complejantes de iones metálicos se pueden seleccionar preferiblemente entre los radicales imidazol, amino, hidroxilo, carboxilo, mercapto, fenantrolina, piridina, bipiridina, terpiridina, triazaciclononano, tetraazaciclododecano o purina y derivados de los mismos, que todavía son capaces de formar complejos metálicos. Los radicales orgánicos adecuados que son capaces de formar enlaces coordinativos con iones metálicos se pueden buscar en las bases de datos como la ilustrativa mostrada en la Tabla 1. Con el fin de asegurar los procedimientos de elongación peptídica los grupos carboxilo libres tienen que ser protegidos adecuadamente.

Preferiblemente los aminoácidos mono- u oligoméricos de la porción de anclaje contienen, opcionalmente protegidas N-terminalmente, cadenas laterales de imidazol. En otra realización preferida dichos aminoácidos mono- u oligoméricos son oligohistidina o secuencias cortas (1-6 restos) de aminoácidos no naturales que albergan radicales fenantrolina en sus cadenas laterales con al menos un aminoácido adicional, donde el aminoácido adicional no interfiere en el soporte sólido tal como glicina.

Preferiblemente dichos radicales oligohistidina contienen al menos 2 restos histidina; más preferiblemente 6-10 restos histidina.

En otra realización preferida, dichos radicales oligohistidina comprenden una secuencia de al menos 2 restos L- o D-histidina seriados, más preferiblemente 6 restos L- o D-histidina.

En una realización preferida adicional dichos aminoácidos mono- u oligoméricos de la porción de anclaje contienen al menos un radical 5-amino-1,10-fenantrolina. Es posible desanclar y re-anclar repetitivamente la cadena peptídica en crecimiento de la fase sólida activada. En una realización preferida el desanclaje se logra durante la etapa de acoplamiento de la síntesis peptídica, mientras el re-anclaje es inducido por la dilución de la mezcla de reacción antes de las etapas de enjuagado que preceden a la desprotección siguiente. Utilizando estas etapas, es posible utilizar la síntesis en fase líquida "transitoria" y sus ventajas, especialmente para la síntesis de péptidos grandes mediante los enfoques de condensación de fragmentos.

Preferiblemente dicha porción de anclaje de la cadena peptídica está localizada en el extremo C y/o al menos en una cadena lateral de los aminoácidos del péptido.

En una realización preferida adicional, dicha porción de anclaje del péptido puede ser prolongada por grupos específicos y/o secuencias de aminoácidos naturales y/o no naturales lo que permite un procesamiento y detección adicional de los péptidos.

En una realización preferida al menos un aminoácido de la porción de anclaje en el extremo C del péptido es prolongado por uno o más aminoácidos, lo que permite la detección por medio de sistemas de detección.

En una realización preferida se añade una secuencia al péptido en crecimiento, lo que permite un simple reconocimiento de la cadena peptídica final por un anticuerpo. Un ejemplo de semejante secuencia-etiqueta es la etiqueta myc. Por otra parte, la adición de un aminoácido biotinilado (p. ej. D-, L-lisina biotinilada), preferiblemente en el extremo C de un punto de partida oligomérico, permitiría establecer una cuantificación simple del producto final basada en las interacciones específicas entre las moléculas de biotina y de tipo avidina.

En una realización preferida adicional la porción de anclaje del péptido se prolonga en su extremo N con una secuencia de aminoácidos que proporciona un sitio de reconocimiento para una proteasa específica.

En una realización preferida adicional el punto de partida se prolonga con secuencias cortas de aminoácidos, que codifican sitios de reconocimiento de proteasas. Esto permite la separación selectiva del punto de partida después del procedimiento de síntesis y el protocolo de plegamiento.

En una realización preferida, el péptido es re-anclado a la fase sólida activada diluyendo la mezcla de reacción del programa de reacción sucesivo de tipo Merrifield que contiene el ligando competitivo.

Los ligandos competitivos adecuados tienen una afinidad similar hacia la fase sólida activada (resina de afinidad metálica) en comparación con la afinidad de los restos individuales, preferiblemente de los grupos nitrogenados oligoméricos, de los radicales complejantes de iones metálicos de la porción de anclaje del péptido (punto de partida) que se va a desanclar. En el caso de la oligohistidina como porción de anclaje del péptido, los ligandos competitivos adecuados son imidazol (en disolventes acuosos) o N-metilimidazol (en disolventes orgánicos). El desanclaje se logra añadiendo un gran exceso (típicamente un exceso molar de 10^{2} - 10^{6} de ligando competitivo con respecto al ligando anclado) de ligando competitivo en comparación con el péptido anclado al disolvente. Por ejemplo en disolventes acuosos son adecuados de 100 a 250 mM de imidazol (ligando competitivo) para lograr un desanclaje completo. En las mismas condiciones se puede lograr el desanclaje mediante dilución del disolvente que contiene el ligando competitivo, preferiblemente por un factor de 10 a 20. Esto conduce a una caída de la concentración de ligando competitivo y proporciona el re-anclaje de la porción de anclaje multidentada del péptido al soporte. La razón molar del ligando competitivo con respecto a las porciones de anclaje se puede determinar fácilmente para pares de la porción de anclaje y la fase sólida activada en el respectivo disolvente mediante procedimientos cromatográficos eluyendo la porción de anclaje a partir de una resina de afinidad metálica.

En una realización preferida adicional el anclaje de la porción de anclaje para la síntesis peptídica (p. ej. una oligohistidina) se logra en presencia de una solución alcalina o neutra diluida del punto de partida para una fase sólida activada.

La invención representa la purificación de los péptidos opcionalmente protegidos, que han sido elongados a la vez que se inmovilizan sobre la fase sólida activada, lavando los contaminantes tales como los remanentes de los grupos protectores y los captadores o los productos secundarios no deseados de la síntesis peptídica.

En una realización preferida, la purificación del producto bruto de los productos secundarios contaminantes se logra mediante un procedimiento cromatográfico haciendo uso del anclaje coordinativo de un péptido a una fase sólida activada. Este principio se puede aplicar utilizando la protección terminal regular de los grupos aminoácido no acoplados libres en cada ciclo de síntesis. Al aplicar este principio, se puede lograr la purificación de un producto bruto en una sola ronda cromatográfica.

Se puede lograr el desanclaje mediante la adición de un agente competitivo adecuado como se ha descrito antes o aumentando la acidez del disolvente hasta un grado crítico, preferiblemente al menos a un pH por debajo de 6, más preferiblemente a pH 5 o menor, especialmente en solución acuosa, lo que ofrece otro modo elegante de desanclar un péptido anclado de una resina de afinidad metálica.

La invención también representa el replegamiento de estructuras plegadas erróneamente y/o la desagregación de agregados intermoleculares del péptido opcionalmente protegido, que ha sido elongado a la vez que se inmoviliza sobre la fase sólida activada. El restablecimiento de la estructura peptídica plegada correctamente comprende las etapas de

(a): exposición del péptido a al menos un agente caotrópico o desnaturalizante, y

(b): posterior exposición a una secuencia de disolventes para reducir gradualmente la caotropía y proporcionar condiciones reproducibles de replegado y restablecimiento de la estructura secundaria y terciaria.

En una realización preferida el agente caotrópico o desnaturalizante se selecciona del grupo que consiste en urea, detergentes tales como dodecilsulfato de sodio, elevadas concentraciones de sal y mercaptoetanol o mezclas de los mismos en un disolvente adecuado.

En lugar del anclaje covalente a una resina adecuada la presente invención proporciona la posibilidad de desanclar la cadena peptídica en crecimiento durante la etapa de acoplamiento, a la vez que puede ser anclada de nuevo antes de las siguientes etapas. Por otra parte, se puede utilizar el mismo principio de anclaje reversible de un péptido a una fase sólida activada para controlar el plegamiento de un producto purificado. Para este fin, el producto se purifica y se re-ancla a una fase sólida activada, donde la razón de moléculas peptídicas ancladas (medidas en moles) con respecto al área de superficie de la resina de afinidad metálica se selecciona de tal manera que no sea probable que los péptidos anclados interaccionen entre sí. Esto prefiere un plegamiento intramolecular en lugar de interacciones intermoleculares (agregación). Habiendo sido purificado y anclado, el producto se trata después con numerosos disolventes que permiten un plegamiento gradual de la molécula y apoyan la correcta configuración intramolecular de las cadenas peptídicas. Las etapas de plegamiento se pueden sellar mediante la formación p. ej. de enlaces disulfuro en la posición correcta. Al final de este procedimiento el producto estabilizado es liberado de la fase sólida activada mediante la adición de un ligando competitivo o mediante un incremento de la acidez del
disolvente.

El replegamiento del péptido anclado se lleva a cabo en un protocolo de replegamiento. Para este protocolo, se tiene que disolver el producto en un disolvente adecuado. Normalmente, el disolvente más preferido es el disolvente de elución de un sistema de cromatografía LC, aunque el producto puede ser liofilizado y reconstituido en un disolvente adecuado. A partir de esta solución el producto es reanclado coordinativamente a una fase sólida activada. Esto se puede realizar incluyendo el uso de resinas con una base de ácido iminodiacético no protegido o ácidos trinitriloacéticos. Esto es posible puesto que en el replegamiento no se utilizan normalmente reactivos, que activan los ácidos carboxílicos libres. La densidad del anclaje (espacio cubierto de la superficie) se selecciona en un orden muy bajo para evitar que las moléculas producto entren en íntimo contacto entre sí. Una vez completado el anclaje se hacen pasar gradualmente una serie de disolventes por resina. En principio los primeros disolventes son muy desnaturalizantes y/o caotrópicos para llevar todas las moléculas de producto a un estado comparable de plegamiento. Gradualmente, las siguientes etapas y disolventes se aproximarán a las condiciones fisiológicas de tal manera que se apoye el plegamiento molecular. Al final del protocolo, las moléculas de producto están en el disolvente final, preferiblemente acuoso, deseado, opcionalmente sellado p. ej. con un enlace disulfuro y pueden ser liberadas de la fase sólida
activada.

En una realización preferida adicional, la estructura secundaria y terciaria de un péptido es mantenida mediante uniones covalentes entre las cadenas laterales reactivas de dicho péptido tratando el péptido con agentes adecuados, que comprende la formación de dichas uniones covalentes antes del desanclaje del péptido de la fase sólida activada.

Preferiblemente las uniones covalentes formadas entre las cadenas laterales reactivas de los péptidos replegados son enlaces disulfuro, enlaces amida o hidrazonas aromáticas o alifáticas estables.

Los agentes adecuados para el cierre, p. ej. puentes disulfuro se pueden seleccionar entre los diferentes reactivos rédox tales como yodo, ferrocianatos, oxígeno y peróxidos. También se pueden seleccionar otros reactivos, que están establecidos para el cierre de enlaces covalentes en reacciones en fase de solución convencionales.

Se proporciona un procedimiento, en el que las estructuras secundaria y terciaria de los péptidos correctamente plegados están fijadas por la formación de uniones covalentes entre las cadenas laterales de los aminoácidos, preferiblemente por el cierre de los enlaces disulfuro a partir de los grupos mercapto libres, la formación de enlaces amida, o la formación de hidrazonas aromáticas o alifáticas estables se logra haciendo pasar las mezclas de reactivos por el producto replegado, que está anclado a la fase sólida activada.

Se proporciona además un procedimiento específico, para la síntesis de una secuencia peptídica

100

con, X = d-alanina y \beta-Ala = beta-alanina, que comprende la formación de un enlace disulfuro entre los restos cisteína, formando de este modo

101

donde X y \betaAla se definen como antes.

El procedimiento específico para la síntesis del péptido de la secuencia (I) que se sintetiza sobre la fase sólida activada utilizando el procedimiento descrito antes en el programa de reacciones sucesivas de tipo Merrifield, comprende al menos una etapa de purificación y replegamiento y formación de un enlace disulfuro entre los restos cisteína. Lo mismo se aplica a los derivados peptídicos de los mismos con deleciones de aminoácidos o reposiciones de aminoácidos, puesto que todavía están presentes dos restos cisteína a una distancia que permite la formación de un enlace disulfuro.

Además se proporcionan péptidos que contienen una porción de anclaje que consiste preferiblemente en aminoácidos no naturales para el anclaje coordinativo y reversible del péptido a la superficie de una fase sólida activada, cuya porción de anclaje está localizada en el extremo N o C y/o en una cadena lateral del péptido, contiene al menos un radical complejante de iones metálicos, comprendiendo cada radical mencionado al menos un grupo que contiene nitrógeno, con la excepción de los péptidos, donde dicho radical complejante de iones metálicos es una secuencia de aminoácidos de 2 a 5 restos histidina.

Preferiblemente los grupos complejantes de iones metálicos, preferiblemente grupos que contienen nitrógeno de los péptidos proporcionados, se fijan al extremo N o C o a una porción de la cadena lateral de al menos un aminoácido y se seleccionan del grupo que consiste en amino, hidroxilo, carboxilo, mercapto, imidazolilo, N-metilimidazolilo, radicales aminopurinilo, radicales fenantrolilo, radicales piridilo, radicales bipiridilo, radicales terpiridinilo, radicales triazaciclononanonilo y radicales tetraazaciclododecanilo, o combinaciones de los mismos.

En otra realización preferida el radical aminoácido comprende aminoácidos naturales o no naturales individuales u oligoméricos.

En una realización preferida, la porción de anclaje contiene al menos un radical imidazolilo. Más preferiblemente, la porción de anclaje del péptido contiene de 1 a 10 radicales imidazolilo.

En otra realización preferida el aminoácido contiene al menos dos, más preferiblemente de 6 a 10 radicales histidinilo. En una realización preferida el radical aminoácido contiene al menos un radical imidazolilo. Más preferiblemente, la porción de anclaje contiene de 1 a 10 radicales imidazolilo.

Otra ventaja asociada con la invención es que las resinas de afinidad con metales pueden ser re-utilizadas después de la síntesis peptídica. Esto se puede lograr separando el catión y recargando la resina con el mismo u otro catión apropiado. Puesto que las fuerza de la unión de los diversos cationes son diferentes entre sí, un método de modificación de los procedimientos de anclaje y re-anclaje y la estabilidad de los complejos resultantes es seleccionar otro catión como ligando de unión entre la superficie de la resina y el punto de partida de la síntesis.

Descripción de los dibujos

Figura 1a: La Figura 1a representa un ejemplo de un soporte sólido transformado con 5-amino-1,10-fenantrolina

Figura 1b: La Figura 1b representa un ejemplo de una fase sólida activada, que comprende un soporte sólido, unido covalentemente a un ligando quelante metálico con 5-amino-1,10-fenantrolina e iones metálicos Cu^{2+} quelados.

Figura 1c: La Figura 1c representa un ejemplo de un péptido anclado, que comprende un resto peptídico y una porción de anclaje del radical oligohistidina, donde dicha porción de anclaje está anclada covalentemente a una fase sólida activada, que comprende un soporte sólido, unido covalentemente a un ligando quelante metálico con 5-amino-1,10-fenantrolina e iones metálicos Cu^{2+} quelados.

Figura 2a: En la Figura 2a se representa el principio de desanclaje con un ejemplo en el que la porción de anclaje del péptido es un resto oligohistidina.

Figura 2b: En la Figura 2b se representa el principio de reanclaje con un ejemplo en el que la porción de anclaje del péptido es un resto oligohistidina. En la Figura 3a se representa un ejemplo del efecto de las concentraciones de competidor sobre la unión de un péptido dado a una fase sólida activada, donde se utiliza el desanclaje con concentraciones crecientes de competidor para la elución de un péptido unido coordinativamente. Este procedimiento es reversible.

Figura 3a: Purificación de producto bruto de una síntesis de inmunómero de IL-2 sobre la columna de afinidad metálica. La curva muestra 5 inyecciones repetitivas y la elución del producto unido durante el gradiente de N-metilimidazol.

Figura 3b: Cromatograma que muestra los vestigios de UV del producto bruto del Inmunómero de IL-2 antes de la purificación. Esto documenta el comportamiento cromatográfico del producto inyectado 5 veces en la Figura 3a. El producto es fuertemente agregante y mancha todo el gradiente de la columna. Este perfil no permite una caracterización adecuada mediante espectrometría de masas.

Figura 3c: Cromatograma que muestra el comportamiento cromatográfico de la sustancia eluida en la Figura 3a. Este material muestra un comportamiento cromatográfico claro, se hizo eluir como una única sustancia sin agregación. La espectrometría de masas confirma la identidad del producto deseado.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Abreviaturas: Sustancia

DMF: N,N-dimetilformamida (calidad síntesis peptídica)

DCM: Diclorometano (calidad síntesis peptídica)

HOBT: 1-Hidroxibenzotriazol (anhidro)

DBU: 1,8-Diazabiciclo[5,4,0]undec-7-eno 98%

PyBOP: Benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio-hexafluorofosfato

DIPEA, DIEA: N-Etildiisopropilamina 98+%

TIS: Triisopropilsilano 99%

MeOH: Metanol HPLC (calidad gradiente)

TFE: 2,2,2-Trifluoroetanol 99,8%

EDT: 1,2-Etanoditiol

HCl: Ácido clorhídrico

NaOH: Solución de hidróxido de sodio

THF: Tetrahidrofurano

DMSO-d_{6}: Dimetilsulfóxido, deuterado

ancho: ancho (señal)

s: singlete

d: doblete

t: triplete

c: cuartete

p: quintete

m: multiplete

TFA: Ácido trifluoroacético

NMI: N-Metilimidazol

Ni-NTA: Superflow Resin (Novagen)

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Ejemplo Preparativo 1

Síntesis de Fmoc-Gly-His_{4}-Gly-OMe [TAG1]

Se disuelven 2 mmoles del primer aminoácido y 4 mmoles de DIPEA en 10 ml de DCM seco. Esta solución se añade a 1,0 g de resina de cloruro de 2-clorotritilo seca (malla 200-400) y la mezcla se deja reaccionar durante 60 minutos en un Vortexer. Al final de la reacción se deja que la resina reaccione dos veces con 20 ml de DCM/MeOH/DIPEA durante 3 minutos, se lava dos veces con 20 ml de DCM y dos veces con DMF. Después la resina se trata dos veces con 20 ml de piperidina/DMF (1:3) durante 3/20 minutos y se lava 6 veces con 20 ml de DMF.

Se disuelven 5 mmoles del aminoácido, 7,5 mmoles de HOBT y 10 mmoles de DIPEA en 15 ml de DMF. Después de 5 minutos se añaden 5 mmoles de PyBOP y 10 mmoles de DIPEA y esta solución se vierte sobre la resina. Después de 60 minutos en un Vortexer la resina se lava 6 veces con 20 ml de DMF, se trata dos veces con 20 ml de piperidina/DMF (1:3) durante 20/20 minutos y se lava 6 veces con 20 ml de DMF. En el caso del aminoácido N-terminal la resina no se trata con piperidina/DMF.

Después del anclaje del último aminoácido la resina se lava 6 veces con 20 ml de DMF, dos veces con 20 ml de DCM y después se deja reaccionar con 50 ml de TFE/DCM (2/8) durante 60 minutos. La resina se separa por filtración, los disolventes se separan a vacío y el fragmento peptídico bruto se utiliza sin purificación.

El péptido bruto, 10 mmoles de Cl-HOBT, 10 mmoles de DIEA y 20 mmoles de DIC se disuelven en un mínimo de DCM seco. La solución se deja reaccionar durante 10 minutos y se añade una solución de 10 mmoles de DIEA y 10 mmoles de Gly-Ome. Después de 2 horas de vórtice se añaden 100 ml de DCM y la solución se extrae 3 veces con porciones de 200 ml de hidrogenosulfato de sodio (1-2 moles/litro), 3 veces con porciones de 200 ml de cloruro de sodio concentrado y 3 veces con porciones de 200 ml de hidrogenocarbonato de sodio (1-2 moles/litro). La capa orgánica se seca sobre sulfato de sodio, el disolvente se separa y el péptido bruto se utiliza sin purificación adicional.

El péptido bruto se disuelve en 50 ml de TFA/TIS/H_{2}O (95/2,5/2,5) y se deja reaccionar durante 60 minutos en un Vortexer. Se separa el TFA mediante co-evaporación con DCM. El péptido bruto se disuelve en DMSO y se purifican 1000 \mul en un Gilson Nebula LCMS System utilizando una columna Kromasil RP C18. El gradiente lineal se extiende desde TFA acuoso al 5% (0,1%) a acetonitrilo al 50% (que contiene 0,085% de TFA) a lo largo de 30 minutos. La velocidad de flujo es de 20 ml/min y la absorbancia se verifica a 214 nm.

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Ejemplo Preparativo 2

Síntesis de Fmoc-Gly-His_{6}-Gly-OMe [TAG3]

El péptido bruto, 10 mmoles de Cl-HOBT,10 mmoles de DIEA y 20 mmoles de DIC se disuelven en un mínimo de DCM seco. La solución se deja reaccionar durante 10 minutos y se añade una solución de 10 mmoles de DIEA y 10 mmoles de Gly-Ome. Después de 2 horas de vórtice se añaden 100 ml de DCM y la solución se extrae 3 veces con porciones de 200 ml de hidrogenosulfato de sodio (1-2 moles/litro), 3 veces con porciones de 200 ml de cloruro de sodio concentrado y 3 veces con porciones de 200 ml de hidrogenocarbonato de sodio (1-2 moles/litro). La capa orgánica se seca sobre sulfato de sodio, el disolvente se separa y el péptido bruto se utiliza sin purificación adicional.

El péptido bruto se disuelve en 50 ml de TFA/TIS/H_{2}O (95/2,5/2,5) y se deja reaccionar durante 60 minutos en un Vortexer. Se separa el TFA mediante co-evaporación con DCM. El péptido bruto se disuelve en MeOH y se purifican 1000 \mul en un Gilson Nebula LCMS System utilizando una columna Kromasil RP C18. El gradiente lineal se extiende desde TFA acuoso al 5% (0,1%) a acetonitrilo al 80% (que contiene 0,085% de TFA) a lo largo de 50 minutos. La velocidad de flujo es de 20 ml/min y la absorbancia se verifica a 214 nm.

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Ejemplo Preparativo 3

Síntesis de Fmoc-Gly-His_{3}-Gly-His_{3}-Gly-OMe [TAG4]

El péptido bruto se disuelve en 50 ml de TFA/TIS/H_{2}O (95/2,5/2,5) y se deja reaccionar durante 60 minutos en un Vortexer. Se separa el TFA mediante co-evaporación con DCM. El péptido bruto se disuelve en DMSO y se purifican 1000 \mul en un Gilson Nebula LCMS System utilizando una columna Kromasil RP C18. El gradiente lineal se extiende desde TFA acuoso al5% (0,1%) a acetonitrilo al 50% (que contiene 0,085% de TFA) a lo largo de 30 minutos. La velocidad de flujo es de 20 ml/min y la absorbancia se verifica a 214 nm.

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Ejemplo Preparativo 4

Síntesis de Fmoc-Gly-5-Amino-1,10-fenantrolina [TAG5]

Se añaden 2 ml de DIEA, 6 mmoles de Cl-HOBt y 12 mmoles de DIC a una solución de 2,56 mmoles de Fmoc-Gly-OH en un mínimo de DMF. Esta solución se somete a vórtice durante 5 minutos y se añade una solución de 0,5 g de 5-amino-1,10-fenantrolina en un mínimo de DMF. La mezcla se incuba durante 12 horas y se diluye con 5 veces el volumen de acetato de etilo. La solución se lava tres veces con hidrogenocarbonato de sodio. El producto bruto precipita, se separa por filtración y se purifica mediante cromatografía en columna o LCMS. El péptido bruto se disuelve en DMSO y se purifican 1000 \mul en un Gilson Nebula LCMS System utilizando una columna Kromasil RP C18. El gradiente lineal se extiende desde TFA acuoso al 5% (0,1%) a acetonitrilo al 50% (que contiene 0,085% de TFA) a lo largo de 50 minutos. La velocidad de flujo es de 20 ml/min y la absorbancia se verifica a 214 nm.

Ejemplo Preparativo 5

Síntesis de Ácido (bis-t-butoxicarbonilmetil-amino)-acético [TAG8b] a) Síntesis de Éster bencílico de ácido (bis-t-butoxicarbonilmetil-amino)-acético [TAG8a]

Se disuelven 20 mmoles de p-tosilato de éster bencílico de glicina, 40 ml de éster t-butílico de ácido bromoacético y 60 mmoles de DIEA en 35 ml de DMF seca. La mezcla de reacción se somete a vórtice 4 días. Las sales precipitadas se separan por filtración y la solución se disuelve en 250 de acetato de etilo. La capa orgánica se extrae con las siguientes soluciones: 2 x 200 ml de NaOH 1 N, 3 x NaOH 1 N/salmuera 1:1. La solución se seca con Na_{2}SO_{4}, el disolvente se separa mediante destilación a vacío y el producto bruto se purifica mediante cromatografía en columna instantánea (acetato de etilo/hexano 1:4).

RMN-H^{1} (400 MHz, DMSO-d_{6}) ppm 7,42-7,29 (m, 5H), 5,10 (s, 2H), 3,60 (s, 2H), 3,50 (s, 4H), 1,38 (s, 18H); LC-MS (ESI): (M+H)^{+} = 394

b) Síntesis de Ácido (bis-t-butoxicarbonilmetil-amino)-acético [TAG8b]

Se disuelven 17,5 mmoles de éster bencílico de ácido (bis-t-butoxicarbonilmetil-amino)-acético en 75 ml de THF y se añade el catalizador de paladio, 10% sobre carbón, 0,70 g. El recipiente de reacción se limpia varias veces con hidrógeno y la mezcla de reacción se agita en hidrógeno hasta que se detiene el consumo de hidrógeno. El catalizador se separa por filtración sobre celite y el disolvente se separa a vacío.

RMN-H^{1} (400 MHz, DMSO-d_{6}) ppm 12,2 (s ancho, 1H), 3,46 (s, 2H), 3,44 (s, 4H), 1,40 (s, 18H); LC-MS (ESI): (M+H)^{+} = 304

Ejemplo Preparativo 6

Síntesis de Ácido 4-(bis-t-butoxicarbonilmetil-carbamoil)-butírico [TAG10b] a) Éster bencílico de ácido 4-(bis-t-butoxicarbonilmetil-carbamoil)-butírico [TAG10a]

Se disuelven 24 mmoles de éster monobencílico de ácido pentanodioico, 30 ml de cloruro de oxalilo, y dos gotas de DMF en 20 ml de DCM seco. La mezcla de reacción se somete a reflujo hasta que se detiene la evolución de gas. La solución se co-evapora con 10 ml de tolueno. El producto bruto se disuelve en DCM y se añade gota a gota a una solución de 12,0 mmoles de éster t-butílico de ácido (t-butoxicarbonilmetil-amino)-acético y 26,4 mmoles de DIEA en DCM a 0ºC. La mezcla de reacción se agita durante 1 hora a 0ºC y a la temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se separa a vacío y el residuo se disuelve en 150 ml de éter dietílico. La capa orgánica se extrae con las siguientes soluciones: 100 ml de HCl 1N, 100 ml de solución de hidrogenocarbonato de sodio semi-concentrado, y 100 ml de salmuera. La solución se seca sobre sulfato de sodio y el disolvente se separa a vacío. El producto bruto se purifica mediante cromatografía en columna de sílice (acetato de etilo/hexano
1:1).

RMN-H^{1} (400 MHz, DMSO-d_{6}) ppm 7,4-7,2 (m, 5H), 5,08 (s, 2H), 4,11 (s, 2H), 3,91 (s, 2H), 2,38 (t, J=7,4 Hz, 2H), 2,28 (t, J=7,3 Hz, 2H), 1,75 (p, J=7,4 Hz, 2H), 1,41 (s, 9H), 1,39 (s, 9H); LC-MS (ESI): (M+H)^{+} = 450

b) Síntesis de Ácido 4-(bis-t-butoxicarbonilmetil-carbamoil)-butírico [TAG10b]

Se disuelven 2 mmoles de éster bencílico de ácido 4-(bis-t-butoxicarbonilmetil-carbamoil)-butírico en 20 ml de THF y se añade el catalizador de paladio, 10% sobre carbón, 0,09 g. El recipiente de reacción se limpia varias veces con hidrógeno y la mezcla de reacción se agita en hidrógeno hasta que se detiene el consumo de hidrógeno.

El catalizador se separa por filtración sobre celite y el disolvente se separa a vacío.

RMN-H^{1} (400 MHz, DMSO-d_{6}) ppm 12,1 (s ancho, 1H), 4,11 (s, 2H), 3,91 (s, 2H), 2,30-2,17 (m, 4H), 1,68 (p, J=7,2 Hz, 2H), 1,42 (s, 9H), 1,39 (s, 9H); LC-MS (ESI): (M+Na)^{+} = 382

Ejemplo Preparativo 7

Síntesis de Ácido 4-([1,10]-Fenantrolin-5-ilcarbamoil)-butírico [TAG12b] a) Síntesis de Éster metílico de ácido 4-([1,10]fenantrolin-5-ilcarbamoil)-butírico [TAG12a]

En atmósfera de argón se disuelven 5 mmoles de 5-amino-[1,10]-fenantrolina en 25 ml de DMF seca. Se añaden gota a gota 6,5 mmoles de DIEA y 5,5 mmoles de éster metílico de ácido 4-clorocarbonil-butírico. Después de agitar durante 1 hora el disolvente y la base en exceso se separan mediante destilación a vacío. El producto bruto se purifica mediante cromatografía en columna en fase reversa (columna Merck Lobar RP18, eluyente: acetonitrilo/ hidrogenocarbonato de amonio, 5% en peso, gradiente: 20% a 40%)

RMN-H^{1} (400 MHz, DMSO-d_{6}) ppm 10,11 (s, 1H), 9,13 (dd, J=1,6, 4,3 Hz, 1H), 9,03 (dd, J=1,7, 4,3 Hz, 1H), 8,60 (dd, J=1,6, 8,4 Hz, 1H), 8,44 (dd, J=1,7, 8,2 Hz, 1H), 8,17 (s, 1H), 7,82 (dd, J=4,2, 8,4 Hz, 1H), 7,74 (dd, J=4,3, 8,1 Hz, 1H), 3,63 (s, 3H), 2,59 (t, J=7,2 Hz, 2H), 2,46 (t, J=7,4 Hz, 2H), 1,95 (p, J=7,3 Hz, 2H); LC-MS (ESI): (M+H)^{+}
= 324

b) Síntesis de Ácido 4-([1,10]Fenantrolin-5-ilcarbamoil)-butírico [TAG12b]

Se disuelven 1,5 mmoles de éster metílico de ácido 4-(1,10]fenantrolin-5-ilcarbamoil)-butírico en 15 ml de 1,4 dioxano y 15 ml de agua destilada. Se añaden 1,5 ml de solución 1 N de hidróxido de potasio y la solución se somete a reflujo durante 1 hora. El disolvente se separa mediante destilación a vacío y el producto bruto se purifica mediante cromatografía en columna en fase reversa (columna Merck Lobar RP18, eluyente: acetonitrilo/ácido trifluoroacético, 1% en peso, gradiente: 10% a 20%)

RMN-H^{1} (400 MHz, CD_{3}OD) en forma de una sal de K ppm 9,11 (dd, J=1,6, 4,3 Hz, 1H), 9,04 (dd, J=1,6, 4,4 Hz, 1H), 8,65 (dd, J=1,5, 8,4 Hz, 1H), 8,41 (dd, J=1,6, 8,1 Hz, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,82 (dd, J=4,4, 8,4 Hz, 1H), 7,74 (dd, J=4,4, 8,1 Hz, 1H), 2,64 (t, J=7,6 Hz, 2H), 2,36 (t, J=7,2 Hz, 2H), 2,10 (q, J=7,5 Hz, 2H); LC-MS (ESI): (M+H)^{+} = 310

Además se pueden preparar análogamente a los protocolos descritos aquí etiquetas que contienen otros derivados de ácido carboxílico distintos del ácido glutárico

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Ejemplo Preparativo 8

Síntesis de Ácido [5-([1,10]-Fenantrolin-5-ilcarbamoil)-pentanoilamino]-acético [TAG15]

En atmósfera de argón se suspende 1 mmol de resina Wang que está cargada con Fmoc-Gly-OH (0,7 mmoles/g) en piperidina/DMF 1:3 y se irradia en un horno microondas (sistema "Discover" por CEM) tres veces durante 30 segundos. La resina se lava tres veces con DMF y tres veces con DCM. La resina se suspende en 15 ml de DCM y se añaden 9 mmoles de DIEA y 10 mmoles de cloruro de adipoilo. Después de someter a vórtice la suspensión durante 30 minutos, la solución de reacción se separa por filtración y la resina se lava dos veces con DCM y una vez con DMF. La resina se suspende en 15 ml de DMF y se añade una solución de 3 mmoles de 5-amino-1,10-fenantrolina y 5 mmoles de DIEA en 20 ml de DMF. Después de someter a vórtice la suspensión durante la noche la resina se lava seis veces con DMF y el producto se escinde de la resina suspendiéndolo en TFA/TIS/H_{2}O 95:2,5:2,5. La resina se separa por filtración y el producto filtrado se co-evapora varias veces con cloroformo para proporcionar el
producto.

Este procedimiento también se puede aplicar análogamente a otros péptidos unidos a resinas y otros derivados activados de ácidos dicarboxílicos.

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Ejemplo Preparativo 9

Resina con 5-Amino-1,10-fenantrolina/Cloruro de 2-clorotritilo

Se suspenden 2 mmoles de 5-amino-1,10-fenantrolina en atmósfera inerte en 50 ml de DMF seca. A la mezcla resultante se le añaden 5 g de resina con cloruro de 2-clorotritilo (malla 200-400) y la resina se incuba a la temperatura ambiente durante 2 horas. La resina se separa por filtración y se lava con DMF hasta que se elimina el exceso de Fenantrolina. Para bloquear los grupos que no han reaccionado de la resina, ésta se incuba tres veces con 10 ml de DCM/MeOH/DIEA (80:15:5) durante 10 minutos y después se lava 3 veces con 10 ml de DMF. La resina se puede almacenar en DMF a la temperatura ambiente. Para cargar la resina con iones Ni^{2+}, se incuba la resina durante 30 minutos con una solución saturada de NiCl_{2} en DMF. La resina se lava con DMF hasta que no se puede observar más NiCl_{2}. Después de 5 lavados más con DMF se aplica el siguiente procedimiento:

4x5' DMF/N-Metilimidazol (0,25 moles/litro)

4x15' DMF/N-Metilimidazol (0,25 moles/litro)

1x12 h DMF/N-Metilimidazol (0,25 moles/litro)

2x5' DMF

1x1' Isopropanol

1x15' Isopropanol

1x5' DMF

1x30' DMF

1x1' Isopropanol

1x15' Isopropanol

1x5' DMF

1x30' DMF

1x1' Isopropanol

1x15' Isopropanol

1x5' DMF

1x30' DMF

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Ejemplo Preparativo 10

Resina con 5-Amino-1,10-fenantrolina/Novasyn TG carboxi

Se equilibran 5 g de Resina Novasyn TG con 50 ml de DMF seca durante 30 minutos. Se añaden 10 mmoles de DIEA y 10 mmoles de HOBt. Después de 5 minutos de incubación se añaden 2 g de 5-amino-1,10-fenantrolina y 10 mmoles de Pybop así como 10 mmoles de DIEA y la mezcla se somete a vórtice durante la noche. A la mañana siguiente la resina se lava 6 veces con 50 ml de DMF cada una. Para cargar la resina con Níquel se añaden 10 ml de una solución saturada de cloruro de níquel en DMF y se someten a vórtice durante 30 minutos. Después de esta etapa el sobrenadante se separa y la resina se lava con lotes de 50 ml de DMF hasta que no se puede observar color visible en el sobrenadante. El exceso adsorbido de iones Níquel se separa mediante el siguiente procedimiento de
lavado:

4x5' DMF/N-Metilimidazol (0,25 moles/litro)

4x15' DMF/N-Metilimidazol (0,25 moles/litro)

1x12 h DMF/N-Metilimidazol (0,25 moles/litro)

2x5' DMF

1x1' Isopropanol

1x15' Isopropanol

1x5' DMF

1x30' DMF

1x1' Isopropanol

1x15' Isopropanol

1x5' DMF

1x30' DMF

1x1' Isopropanol

1x15' Isopropanol

1x5' DMF

1x30' DMF

Ejemplo Preparativo 11

Síntesis de Resina con 1,4,7-Triazaciclononano/Cloruro de 2-clorotritilo

Se suspenden 2,5 g de resina con cloruro de 2-clorotritilo (malla 200-400) en 40 ml de DMF seca. Se añaden 500 mg de tricloruro de 1,4,7-triazaciclononano y 2 ml de diisopropiletilamina. La resina se incuba a la temperatura ambiente durante 8 horas. La resina se separa por filtración y se lava con DMF seis veces. Para bloquear los grupos que no han reaccionado de la resina, ésta se incuba con 20 ml de DCM/MeOH/DIEA (80:15:5) durante 30 minutos y después se lava 3 veces con 20 ml de DMF. La carga de la resina con Níquel se puede realizar según el ejemplo 10. La resina se almacena en DMF en el refrigerador.

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Ejemplo Preparativo 12

Carga de etiquetas sobre las resinas (experimentos por lotes)

Se lava 1 ml de la respectiva resina 3 veces con DMF (calidad síntesis peptídica). Se disuelve 1 mg de la etiqueta en 1 ml de DMF y se añade 1 gota de DIEA. Se diluyen 50 \mul de esta solución con 950 \mul de agua y se analizan mediante HPLC. El resto de la mezcla se añade a la resina lavada y se incuba durante 30 minutos. Para verificar el anclaje de la etiqueta a la resina se diluyen 50 \mul de la solución con 950 \mul de agua y se analizan mediante HPLC.

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Ejemplo Preparativo 12a

Carga de TAG1 en Resina con Ni-Fenantrolina-2Cl-Trt

La HPLC del líquido sobrenadante no muestra más TAG1 detectable.

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Ejemplo Preparativo 12b

Carga de TAG3 en Resina con Ni-Fenantrolina-2Cl-Trt

La HPLC del líquido sobrenadante no muestra más TAG3 detectable. Los vestigios restantes con un tiempo de retención similar son impurezas minoritarias que no se unieron. Este ejemplo también muestra el potencial del método para la purificación de los productos de los contaminantes.

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Ejemplo Preparativo 12c

Carga de TAG4 en Resina con Ni-Fenantrolina-2Cl-Trt

La HPLC del líquido sobrenadante no muestra más TAG3 detectable.

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Ejemplo Preparativo 12d

Carga de TAG3 en Resina con Ni-Fenantrolina-Novasyn-Tg

La HPLC del líquido sobrenadante no muestra más TAG3 detectable.

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Ejemplo Preparativo 13

Elución de TAG3 de las resinas (experimentos por lotes)

Se lavan 10 ml de la resina cargada 3 veces con 20 ml de la mezcla 1 y la resina se divide en 10 porciones. El líquido sobrenadante se separa y las resinas se incuban durante 5 minutos con las siguientes soluciones:

(TAG3-01) 6 mg de glutatión (oxidado) en 2 ml de mezcla 1 (5 mmoles/litro)

(TAG3-02) 3 mg de glutatión (reducido) en 2 ml de mezcla 1 (5 mmoles/litro)

(TAG3-03) 2 ml de HCl 1 N

(TAG3-04) 2 ml de HCl 0,1 N

(TAG3-05) 0,68 mg de imidazol en 2 ml de mezcla 1 (5 mmoles/litro)

(TAG3-06) 1,36 mg de imidazol en 2 ml de mezcla 1 (10 mmoles/litro)

(TAG3-07) 2,72 mg de imidazol en 2 ml de mezcla 1 (20 mmoles/litro)

(TAG3-08) 0,82 mg de N-metilimidazol en 2 ml de mezcla 1 (5 mmoles/litro)

(TAG3-09) 1,64 mg de N-metilimidazol en 2 ml de mezcla 1 (10 mmoles/litro)

(TAG3-10) 3,28 mg de N-metilimidazol en 2 ml de mezcla 1 (20 mmoles/litro)

Para los experimentos sobre la elución con concentraciones superiores de imidazol y N-metilimidazol los experimentos se llevan a cabo utilizando las resinas de los tubos (TAG3-07) y (TAG3-10). Estas resinas se incuban con concentraciones crecientes de los reactivos de elución (100 mmoles, 200 mmoles, 500 mmoles), el líquido sobrenadante se analiza y la resina se incuba durante 5 minutos con la siguiente concentración de reactivo de
elución.

Resultados

La elución de las etiquetas se puede obtener fácilmente con ácido clorhídrico. Las concentraciones por encima de 100 mmoles/litro de imidazol o N-metilimidazol también eluyen eficazmente.

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Ejemplo Preparativo 14

Unión y Elución de TAG3 de la Resina Ni-NTA (Experimentos FPLC)

Péptido: TAG3 (Fmoc-(HIS)_{6}-OMe, M = 1191, 25 g/moles), calidad HPLC

Resina: Ni-NTA SuperFlow (Capacidad aproximadamente 5 \mumoles/ml)

Columna: Biorad 2,0 ml

Equipo FPLC: Äkta Pharmacia

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a) Elución con N-Metilimidazol

Se inyectaron 1,1 mg (0,92 \mumoles) de TAG3 en 0,75 ml de Eluyente A

Eluyente A: 2,2,2-Trifluoroetanol/H_{2}O/Diisopropiletilamina/N-Metilimidazol 1:1:+1%;+5 mM

Eluyente B: TFE:H_{2}O/DIEA/NMI 1:1:+1%:+500 mM

Flujo: 1 ml/minuto

Programa: Inyectar (5 ml A) \rightarrow Lavar (10 ml A) \rightarrow Gradiente: Elución (0% B \rightarrow 100% B para 10 ml) \rightarrow Mantener (5 ml B) \rightarrow Regeneración (8 ml A)

La TAG 3 se une cuantitativamente y eluye a concentraciones de N-metilimidazol de 100-125 mM. Semejante procedimiento FPLC también se puede utilizar para determinar las concentraciones umbral, por encima de las cuales la molécula de anclaje compite eficazmente por el agente quelante. Por debajo de la concentración umbral, la molécula de anclaje todavía está unida a la resina. En un procedimiento por lotes, la dilución de la mezcla hasta un punto por debajo de la concentración umbral volvería a fijar la molécula de anclaje disuelta a la resina.

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b) Elución con ácido clorhídrico

Se inyectan 2,4 mg de TAG3 (2,0 \mumoles) en 0,75 ml de Eluyente A en una máquina Äkta FPLC. Se ejecuta el siguiente programa:

Eluyente A1: TFE/H_{2}O/DIEA/NMI 1:1:+1%:+ 5 mM

Eluyente B: TFE/H_{2}O/NMI 1:1:+ 5 mM

Eluyente A2: TFE/H_{2}O/HCl 1:1:+ 10 mM

Flujo: 0,5-1 ml/minuto

Programa: Inyectar (2,5 ml A1) \rightarrow Lavar (10 ml A1) \rightarrow Gradiente: Separar DIEA (0% B \rightarrow 100% B para 10 ml) \rightarrow Después "Gradiente por Etapas" para el Eluyente A2 (HCl 10 mM:20%, 40%, 60%, 70%)

TAG3 eluye al 60% Eluyente A2.

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Ejemplo 15

Ciclo de Síntesis con Fmoc-Gly Acoplamiento de TAG3 y Fmoc-Gly sobre resina TG

Un mililitro de resina TG que está cargada con TAG3 se lava 3 veces con 5 ml de DMF. Para desproteger el extremo N se añaden 5 ml de Piperidina al 20% y la resina se incuba durante 30 minutos. La resina se lava después 6 veces con DMF y se añade una solución preactivada de 1 mmol de Fmoc-Gly-OH, 2 mmoles de DIEA, 2 mmoles de HOBt y 2 mmoles de DIC en un mínimo de DMF. Después de 60 minutos la resina se lava 6 veces con porciones de 5 ml de DMF y 6 veces con porciones de 2 ml de agua. Para escindir el péptido de la resina, se añade 1 ml de HCl 1 N y la resina se incuba durante 30 minutos.

Resultado: El péptido escindido se analizó mediante LCMS sobre una columna Vydac C18 mass spec
(218MS5415). Se aplica un gradiente del 5 al 95% a lo largo de un período de 30 minutos y a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto (A=agua, TFA 0,1%; B=acetonitrilo, TFA 0,085%).

No se pudieron detectar Eductos. El único péptido presente en la mezcla mostró la masa esperada (M = 1247, M2+ = 625). Además de HOBt no se pudieron detectar otras impurezas significativas.

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Ejemplo 16

Síntesis de TAG5-G-A-Fmoc sobre Resina Ni-NTA

Se unen 2,65 mg de TAG5 a 1,7 ml de Omnifit Column sobre una resina Ni-NTA. La resina se transfiere a un recipiente de reacción de microondas y se lava 6 veces con 5 ml de DMF cada una. Los sobrenadantes se descartan y la resina se incuba con 5 ml de Piperidina al 25% en DMF mientras se expone a 3 pulsos de microondas de 30 segundos a 50 w cada uno en un horno microondas Discovery (CEM GmbH). La resina se lava 6 veces con DMF. Se prepara una solución 1 mM del aminoácido deseado (apropiadamente protegido) en un mínimo de disolvente (DMF). A esta solución se le añaden 2 mmoles de DIEA, 2 mmoles de HOBt y 2 mmoles de DIC. Después de 5 minutos de tiempo de incubación, esta solución se añade a la resina desprotegida y se introduce en el microondas durante 3 x 30 segundos con 50 W cada una. Después del acoplamiento del último aminoácido, no se separa el grupo fmoc terminal. La resina se lava 5 veces con agua (pH por encima de 7). Finalmente, se añaden 2 ml de HCl 1 N a la resina. La resina se incuba durante 30 minutos, el sobrenadante se separa y se conserva. El sobrenadante se utiliza directamente para LC/MS analítica. La resina se recoge para la recirculación. La LC/MS revela la correcta masa del péptido en el único pico de péptido detectable. Las contaminaciones no peptídicas fueron HOBt y
HOBt-H2O.

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Ejemplo Comparativo 17

Purificación de un Inmunómero de IL-2

Purificación de Inmunómero de IL-2 (DIM03A) sobre Ni-NTA en 2,2,2-Trifluoroetanol/H_{2}O/diisopropiletilamina/
N-Metilimidazol

Péptido: especificado en el ejemplo 19 (M = 6237 g/mol), producto bruto de la escisión de la resina;

resina: Ni-NTA SuperFlow

76,7 mg (12,2 \mumoles), en 5 ml de eluyente A, inyectados en 5 fracciones, véase la documentación de las Figuras 3a-c.

columna: biorad 2,0 ml

Eluyente A: TFE/H_{2}O/DIEA/NMI 1:1:+1%;+5 mM

Eluyente B: TFE/H_{2}O/DIEA/NMI 1:1:+1%:+500 mM

Flujo: 1 ml/minuto

Programa: Inyectar (5 ml A) \rightarrow Lavar (10 ml A) \rightarrow Gradiente: Elución (0% B \rightarrow 100% B a lo largo de 10 ml) \rightarrow mantener (5 ml B) \rightarrow regenerar (8 ml A)

El producto deseado eluye en un solo pico a NMI de aproximadamente 125 mM. La identidad se confirma mediante LC-MS analítica.

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Ejemplo Comparativo 18

Modificación Post-sintética de un Péptido

Cierre del puente disulfuro en el péptido

H_{2}N - HHHHGC_{(Acm)}GNGGGC_{(Trt)}GSGN - COOH

Acm y Trt son grupos protectores normalizados para el radical SH en los restos cisteína. El péptido se sintetizó mediante síntesis peptídica rutinaria y se pre-purificó en un Sistema LC/MS hasta una pureza mayor del 95%.

Un mililitro de resina Ni-NTA que está cargada con el péptido se lava 3 veces con 2 ml de MeOH. Durante 2 h se añaden 50 \mul de solución de yodo (0,5 moles/litro) y la mezcla se incuba durante 2 horas más a la temperatura ambiente. La resina se lava 6 veces con MeOH, 3 veces con agua (pH>7) y después se incuba con 2 ml de HCl (1 N). La resina se separa por filtración y la solución se analiza mediante LCMS. Se obtiene un único pico de producto, que muestra la masa correcta.

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Ejemplo Comparativo 19

Síntesis de Inmunómero de Interleucina-2 utilizando las etapas de replegamiento del procedimiento proporcionado en la presente memoria

Fórmula Química de la sustancia que se va a sintetizar:

4

X = D-Alanina

\betaAla = beta-Alanina

otras letras = código de aminoácidos normalizado

Estrategia general

La síntesis se lleva a cabo sobre una resina de cloruro de 2-clorotritilo (malla 200-400) con una tasa de sustitución de 0,2 mmoles/g. Los primeros siete aminoácidos se acoplan en forma de un fragmento. El anclaje de los siguientes aminoácidos se obtiene mediante acoplamiento individual doble o triple con un exceso de aminoácidos de 10 veces y PyBOP/HOBT/DIPEA como aditivos de acoplamiento. La desprotección N-terminal de la cadena peptídica en crecimiento se obtiene mediante un tratamiento doble con piperidina/DMF (1/3). En los casos difíciles se realiza un tercer tratamiento con DBU/piperidina/DMF (2/2/96). El número de ciclos de acoplamiento y desprotección utilizado se muestra en el siguiente esquema (Información sobre acoplamientos/desprotecciones difíciles conseguidos vigilando cada elongación mediante HPLC-MS).

5

1, 2, 3 = número de ciclos de acoplamiento o desprotección

X = D-Alanina

B = \beta-Alanina

Protocolo 1

Síntesis del primer fragmento peptídico

Se disuelven 2 mmoles del primer aminoácido y 4 mmoles de DIPEA en 10 ml de DCM seco. Esta solución se añade a 1,0 g de resina de cloruro de 2-clorotritilo seca (malla 200-400) y la mezcla se deja reaccionar durante 60 minutos en un Vortexer. Al final de la reacción se deja que la resina reaccione dos veces con 20 ml de DCM/MeOH/DIPEA durante 3 minutos, se lava dos veces con 20 ml de DCM y dos veces con DMF. La resina se trata después dos veces con 20 ml de piperidina/DMF (1:3) durante 3/20 minutos y se lava 6 veces con 20 ml de DMF. El anclaje de los aminoácidos 2-7 se obtiene mediante el siguiente procedimiento: Se disuelven 5 mmoles del aminoácido, 7,5 mmoles de HOBT y 10 mmoles de DIPEA en 15 ml de DMF. Después de 5 minutos se añaden 5 mmoles de PyBOP y 10 mmoles de DIPEA y esta solución se vierte sobre la resina. Después de 60 minutos sobre un Vortexer se lava la resina 6 veces con 20 ml de DMF, se trata dos veces con 20 ml de piperidina/DMF (1:3) durante 20/20 minutos y se lava 6 veces con 20 ml de DMF. En el caso del aminoácido N-terminal la resina no se trata con piperidina/DMF.

Protocolo 2

Escisión del fragmento peptídico

Protocolo 3

Re-anclaje del fragmento peptídico

Se disuelven 1 mmol del fragmento y 2 mmoles de DIPEA en 50 ml de DCM seco. Esta solución se añade a 5,0 g de resina de cloruro de 2-clorotritilo seca (malla 200-400) y la mezcla se deja reaccionar durante 12 horas en un Vortexer. Al final de la reacción la resina se deja reaccionar dos veces con 50 ml de DCM/MeOH/DIPEA durante 3 minutos, se lava dos veces con 50 ml de DCM y dos veces con 50 ml de DMF.

Protocolo 4

Acoplamiento de los aminoácidos 8-57

Se deja que la resina seca se hinche en 50 ml de piperidina/DMF (1/3) durante 30 minutos, se trata con 30 ml de piperidina/DMF (1/3) durante 20 minutos, se trata con 30 ml de DBU/piperidina/DMF (2/2/96) durante 20 minutos y se lava 6 veces con 30 ml de DMF. Se disuelven 10 mmoles del aminoácido, 15 mmoles de HOBT y 20 mmoles de DIPEA en 30 ml de DMF. Después de 5 minutos se añaden 10 mmoles de PyBOP y 20 mmoles de DIPEA y esta solución se vierte sobre la resina. Después de 60 minutos en un Vortexer la resina se lava dos veces con 30 ml de DMF y el acoplamiento se repite una vez o (en los casos difíciles) dos veces durante 60 minutos. Después la resina se lava 6 veces con 30 ml de DMF. La resina se puede utilizar directamente para acoplar el siguiente aminoácido o - después de 2 lavados con 30 ml de DCM - secar a vacío y almacenar a -80ºC.

Protocolo 5

Escisión y desprotección

Después del acoplamiento del último aminoácido se separa el grupo protector N-terminal mediante un doble tratamiento con 30 ml de piperidina/DMF (1/3) durante 20 minutos y tratamiento con DBU/piperidina/DMF (2/2/96) durante 20 minutos. La resina se lava 6 veces con 30 ml de DMF, dos veces con 30 ml de DCM y se trata con 50 ml de TFE/DCM (2/8) durante 180 minutos. Después de la filtración el disolvente se separa a vacío y los grupos protectores se separan mediante tratamiento con 30 ml de TFA/TIS/EDT/agua (94/1/2,5/2,5) durante 180 minutos en una atmósfera inerte. Esta solución se vierte en 300 ml de éter frío, el producto precipitado se disuelve en acetonitrilo y el péptido se purifica mediante RP-HPLC (Kromasil 100 C4 10 \mum, 250x4,6 mm) y las fracciones recogidas se utilizan directamente para el procedimiento de replegamiento.

Alternativamente, el producto bruto del Inmunómero de IL-2 se puede purificar eficazmente en una columna de afinidad metálica:

producto bruto IL-2, 76,7 mg (12,2 \mumoles), en aproximadamente 5 ml de Eluyente A, inyectado en 5 rondas (véanse también las Figuras 3a-c)

Columna: Omnifit 1,7 ml

Eluyente A: TFE/H_{2}O/DIEA/NMI 1:1:+1%:+5 mM

Eluyente B: TFE/H_{2}O/DIEA/NMI 1:1:+1%:+500 mM

Flujo: 1 ml/minuto

Programa: Inyectar (5 ml A) \rightarrow Lavar (16,5 ml A) \rightarrow Gradiente: Eluir (0% B \rightarrow 100% B a lo largo de 10 ml) \rightarrow Mantener (5 ml B) \rightarrow Regenerar (8 ml A)

Protocolo 6

Procedimiento de Replegamiento

Se diluyeron las respectivas fracciones de elución hasta un volumen final de 20 ml utilizando exactamente el mismo volumen que estaba presente en la fracción de elución. Esta solución del producto purificado se incubó durante 30 minutos a la temperatura ambiente con 10 ml de Ni-NTA-Superflow (Qiagen) con una ligera agitación en un vaso de precipitados. Las partículas Superflow se empaquetaron en una Columna FPLC vacía y se anclaron a una máquina de FPLC. Utilizando el programa de cromatografía de esta máquina, se cambió el disolvente en un gradiente de 10 minutos por Agua, después se utilizó otro gradiente de 10 minutos para cambiar el disolvente por una mezcla de agua/trifluoroetanol (1/1). Durante un período de 24 horas, este disolvente se oxigenó haciendo burbujear oxígeno a través de la botella del reservorio y utilizando oxígeno como atmósfera en la botella para cerrar el puente disulfuro. Durante la oxigenación, se hizo pasar un flujo constante de 0,1 ml/minuto durante la noche a lo largo de la columna, mientras el producto eluido se hacía recircular constantemente en la botella del
reservorio.

Al final del período de 24 horas, se hizo eluir el producto final, que estaba siendo replegado y sellado mediante la formación de puentes disulfuro mediante el uso de Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS, pH 7,2) que contenía imidazol 150 mM o utilizando tampón Acetato 0,1 M (pH 4,5).

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Ejemplo Comparativo 20

Acoplamiento de Ácido (Bis-t-butoxicarbonil-metil-amino)acético [TAG8b] al extremo N de un péptido

Se ha preparado 1 mmol de un péptido con la secuencia WETGLRLAPL sobre una resina de cloruro de 2-clorotritilo (malla 200-400) siguiendo los procedimientos normalizados descritos en el Ejemplo 19, protocolo 1.

Con el fin de acoplar Tag8b al extremo N del péptido se aplica análogamente el procedimiento para acoplar los aminoácidos. Se disuelven 5 mmoles de Tag8b, 7,5 mmoles de HOBT y 10 mmoles de DIPEA en 15 ml de DMF. Después de 5 minutos se añaden 5 mmoles de PyBOP y 10 mmoles de DIPEA y esta solución se vierte sobre la resina. Después de 60 minutos en un Vortexer la resina se lava 6 veces con 20 ml de DMF, dos veces con 30 ml de
DCM.

La escisión y desprotección del péptido son efectuadas siguiendo procedimientos normalizados: La resina se trata con 50 ml de TFE/DCM (2/8) durante 180 minutos. Después de la filtración el disolvente se separa a vacío y los grupos protectores se separan mediante tratamiento con 30 ml de TFA/TIS/agua (95/2,5/2,5) durante 180 minutos en una atmósfera inerte. Esta solución se vierte en 300 ml de éter frío, el producto precipitado se disuelve en acetonitrilo y el péptido se purifica mediante RP-HPLC (Kromasil 100 C4 10 \mum, 250x4,6 mm).

Durante la etapa de desprotección los grupos éster t-butílico de Tag se escinden también para producir el péptido Tag8-WETGLRLAPL.

LC-MS (ESI): (M+H)^{+}: 1331

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Ejemplo Comparativo 21

Acoplamiento de Ácido 4-(Bis-t-butoxicarbonil-metil-carbamoil)-butírico [TAG10b] al extremo N de un péptido

Se ha preparado 1 mmol de un péptido con la secuencia GDQYIQQAHRSHI sobre una resina de cloruro de 2-clorotritilo (malla 200-400) siguiendo los procedimientos normalizados descritos en el Ejemplo 19, protocolo 1.

Con el fin de acoplar Tag10b al extremo N del péptido se aplica análogamente el procedimiento para acoplar los aminoácidos. Se disuelven 5 mmoles de Tag10b, 7,5 mmoles de HOBT y 10 mmoles de DIPEA en 15 ml de DMF. Después de 5 minutos se añaden 5 mmoles de PyBOP y 10 mmoles de DIPEA y esta solución se vierte sobre la resina. Después de 60 minutos en un Vortexer la resina se lava 6 veces con 20 ml de DMF, dos veces con 30 ml de
DCM.

\newpage

Durante la etapa de desprotección los grupos éster t-butílico de Tag se escinden también para producir el péptido Tag10-GDQYIQQAHRSHI.

LC-MS (ESI): (M+H)^{+}: 1783

Claims

1. El uso de una fase sólida activada que comprende un soporte sólido, ligandos quelantes metálicos unidos covalentemente al soporte sólido, iones metálicos M^{n+} con n = 1 a 3 unidos coordinativamente a dichos ligandos quelantes metálicos, proporcionando dicha fase sólida activada sitios de coordinación para el anclaje coordinativo y reversible de una porción de anclaje de un péptido para la síntesis peptídica en fase sólida sobre dicha fase sólida activada, donde el péptido es un "péptido en crecimiento" y sometido a procedimientos de elongación del péptido.

2. El uso de la reivindicación 1, donde el soporte sólido tiene una base de sílice, vidrio o celulosa o un polímero seleccionado del grupo que consiste en resinas de poliestireno, resinas de melamina y poli(alcoholes vinílicos).

3. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde cada ligando quelante metálico contiene al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno, fósforo o azufre que es capaz de establecer un enlace ligando-metal coordinativo.

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde cada ligando quelante metálico contiene al menos un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en amino, nitrógeno heterocíclico, carboxi, hidroxilo y
mercapto.

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde cada ligando quelante metálico unido covalentemente al soporte sólido contiene al menos un radical seleccionado del grupo que consiste en radicales trifenilfosfina, radicales aminopurina, preferiblemente radicales 6-aminopurina, radicales ftalocianina, radicales 1,10-fenantrolina, preferiblemente radicales 5-amino-1,10-fenantrolina, radicales terpiridina, preferiblemente radicales 4'-amino-[2,2';6',2'']terpiridina, radicales triazaciclononano, preferiblemente radicales [1,4,7]triazaciclononano y radicales tetraazaciclododecanilo, preferiblemente radicales [1,4,7,10]tetraazaciclododecano.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el metal M^{n+} se selecciona del grupo que consiste en Mn^{2+}, Cu^{2+}, Ni^{2+}, Co^{2+}, Zn^{2+}, Mg^{2+}, Ca^{2+}, Fe2+, Fe3+ e iones de lantánidos, el M^{n+} particularmente preferido es Cu^{2+}, Ni^{2+}, Co^{2+}, Zn^{2+}, Mg^{2+}.

7. El uso de la reivindicación 1, donde la porción de anclaje de un péptido es desanclada de dicha fase sólida activada mediante la adición de un ligando competitivo.

8. El uso de la reivindicación 7, donde el ligando competitivo contiene al menos un radical capaz de quelar iones metálicos, preferiblemente un radical que contiene nitrógeno, seleccionado del grupo que consiste en imidazol, N-metilimidazol, aminopurina, fenantrolina, bipiridina, terpiridina, triazaciclononano, tetraazaciclododecano, radicales ácido iminodiacético, radicales ácido nitrilotriacético y radicales ácido etilendiaminotetraacético.

9. El uso de la reivindicación 8, donde se añaden aminoácidos mono- u oligoméricos en el extremo C o N al péptido en crecimiento en un programa de reacciones sucesivas de tipo Merrifield.

10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde la porción de anclaje del péptido contiene al menos un radical complejante de iones metálicos, comprendiendo cada uno de dichos radicales al menos un grupo que contiene nitrógeno, oxígeno, fósforo o azufre que es capaz de coordinarse con los iones metálicos de la fase sólida
activada.

11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, donde el grupo que contiene nitrógeno que es capaz de coordinarse con los iones metálicos de la fase sólida activada, se selecciona del grupo que consiste en amino, hidroxilo, carboxilo, mercapto, imidazolilo, N-metilimidazolilo, radicales aminopurinilo, radicales fenantrolilo, radicales piridilo, radicales bipiridilo, radicales terpiridinilo, radicales triazaciclononanonilo, radicales tetraazaciclododecanilo, radicales ácido iminodiacético, radicales ácido nitrilotriacético y radicales ácido etilendiaminotetraacético.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, donde la porción de anclaje de la cadena peptídica se localiza en el extremo C y/o en al menos una cadena lateral de los aminoácidos del péptido.

13. El uso de la reivindicación 12, donde al menos un aminoácido de la porción de anclaje en el extremo C del péptido es ampliado por uno o más aminoácidos, lo que permite la detección por medio de sistemas de detección.

14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, donde la porción de anclaje del péptido es ampliada en su extremo N por una secuencia de aminoácidos que proporciona un sitio de reconocimiento para una proteasa
específica.

15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, donde, después del desanclaje, el péptido es re-anclado a la fase sólida activada diluyendo la mezcla de reacción del programa de reacciones sucesivas de tipo Merrifield que contiene el ligando competitivo.

16. El uso de la reivindicación 1, que comprende una etapa de replegamiento de las estructuras plegadas erróneamente y/o la desagregación los agregados intermoleculares del, péptido opcionalmente protegido, donde la porción de anclaje del péptido está anclada coordinativamente y reversiblemente a una fase sólida activada, y el restablecimiento de una estructura peptídica correctamente plegada, que comprende las etapas de

(a): exponer el péptido a al menos un agente caotrópico o desnaturalizante, y

(b): exponer con posterioridad a una secuencia de disolventes para reducir gradualmente la caotropía y para proporcionar condiciones reproducibles de replegamiento y restablecimiento de la estructura secundaria y terciaria.

17. El uso de la reivindicación 16, donde la estructura secundaria y terciaria del péptido se mantienen mediante uniones covalentes entre las cadenas laterales reactivas de dicho péptido tratando el péptido con agentes adecuados, que comprende la formación de dichas uniones covalentes antes del desanclaje del péptido de la fase sólida activada.

18. El uso de la reivindicación 17, donde las uniones covalentes son enlaces disulfuro, enlaces amida o hidrazonas aromáticas o alifáticas estables.

19. El uso de las reivindicaciones 7, 16 y 17 para la síntesis de un péptido de secuencia

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con, X = D-Alanina y \betaAla = beta-Alanina, que comprende la formación de un enlace disulfuro entre los restos cisteína, formando de este modo

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donde X y \betaAla se definen como antes.

20. Un método para la síntesis de péptidos en fase sólida por medio del anclaje no covalente de una cadena peptídica en crecimiento a una fase sólida activada, donde el componente activo de la respectiva fase sólida se forma mediante complejos de quelatos metálicos con sitios de coordinación libres para el anclaje no covalente de una cadena peptídica en crecimiento a la fase sólida activada por medio de grupos quelantes que están presentes en una porción de anclaje de la cadena peptídica en crecimiento, donde los complejos de quelatos metálicos están formados por complejos entre un ión metálico y un ligando quelante-metal, cuyo ligando está - directamente o por medio de una molécula conectora - unido covalentemente a la fase sólida.

21. El método según la reivindicación 20, donde un complejo metálico completamente establecido para los ciclos de síntesis repetitiva durante la síntesis de péptidos comprende la fase sólida, el ligando quelante-metal, el ión metálico - estando el ión metálico interpuesto entre el ligando quelante-metal y los grupos quelantes de la porción de anclaje de la cadena peptídica - y estando presentes los grupos quelantes en una posición N- o C-terminal y/o en las cadenas laterales de aminoácidos mono- u oligoméricos, que forman la porción de anclaje de la cadena peptídica que está creciendo por etapas debido a los ciclos sintéticos repetitivos.

22. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21, donde el anclaje no covalente y coordinativo del ión metálico al ligando quelante-metal tiene una fuerza mayor que la fuerza de anclaje a los grupos quelantes.

23. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, donde la estructura del complejo metálico consiste en

a): ligandos quelantes-metal que están fijados covalentemente a la fase sólida y son capaces de quelar iones metálicos por medio de átomos de N, O, P y/o S,

b): iones metálicos (Me[n+]; n entre 1 y 3, preferiblemente 2, que están complejados por ligandos quelantes-metal, mientras los sitios de coordinación libres todavía permanecen disponibles,

c): aminoácidos naturales o no naturales individuales u oligoméricos que contienen - cadenas laterales o modificaciones N- o C-terminales - de origen natural o modificadas químicamente, que albergan grupos quelantes y de este modo son capaces de complejar con los sitios de coordinación libres ofrecidos por los complejos parcialmente saturados de los ligandos quelantes-metal con iones Me^{n+} en la fase sólida activada descrita en a) y b) y en las reivindicaciones 1-4, por medio de lo cual los grupos quelantes son capaces de quelar iones metálicos por medio de átomos de N, O, P y/o S, y por medio de lo cual al menos uno, preferiblemente 1-3 grupos quelantes pueden estar presentes en una cadena lateral con el fin de formar una porción de anclaje estable para el anclaje de la cadena peptídica en crecimiento.

24. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, donde la fase sólida se caracteriza por la presencia de grupos químicos funcionales que se seleccionan entre grupos amino, nitrógeno heterocíclico, carboxi, hidroxilo, tiol u otras entidades funcionales para las cuales existen reacciones de acoplamiento conocidas per se, por medio de las cuales estos grupos químicos funcionales y las reacciones de acoplamiento se utilizan para transformar covalentemente la fase sólida con un ligando quelante-metal según las reivindicaciones 20-23.

25. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, donde los ligandos quelantes-metal contienen un grupo funcional que permite el acoplamiento químico a los grupos químicos funcionales en la superficie de la fase sólida según la reivindicación 24, y donde los mismos ligandos quelantes-metal así como los grupos quelantes de las cadenas laterales de los aminoácidos según la reivindicación 23 contienen uno o más, preferiblemente 1-3 grupos funcionales que son capaces de complejar iones metálicos según la reivindicación 5 (Me^{n+}), estando seleccionados entre amino, nitrógeno heterocíclico, grupos aza, grupos carboxi, radicales que contienen azufre o fósforo.

26. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, donde los iones metálicos (Me^{n+}) son complejados con ligandos quelantes-metal sobre una fase sólida; estando seleccionados estos iones metálicos entre Mn^{2+}, Ni^{2+}, Cu^{2+}, Co^{2+} o Zn^{2+}, Ca^{2+}, Fe^{2+}, Fe^{3+} o iones de lantánidos.

27. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, donde se utiliza una reacción sucesiva para anclar aminoácidos mono u oligoméricos adicionales al extremo C o N de un complejo metálico completamente establecido según la reivindicación 21; los derivados aminoácido apropiadamente protegidos o los fragmentos oligoméricos que son anclados en cada ciclo se pueden seleccionar o componer libremente a partir de cualquier aminoácido natural o no natural.

28. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, donde se añade un agente quelante competitivo a la mezcla de reacción de la etapa de acoplamiento del programa de reacciones de tipo Merrifield con el fin de desanclar competitivamente la cadena peptídica en crecimiento de la fase sólida durante esa etapa; los agentes quelantes competitivos adecuados tienen aproximadamente la misma afinidad por los sitios de coordinación libres en la fase sólida activada que los grupos quelantes individuales de las cadenas laterales de los aminoácidos mono- u oligoméricos utilizados para anclar la cadena peptídica en crecimiento a la fase sólida, los agentes quelantes competitivos son solubles en la mezcla de reactivos de la etapa de acoplamiento y no reaccionan o interfieren de otro modo con los ingredientes de la mezcla de reactivos de la etapa de acoplamiento.

29. El método según la reivindicación 28, donde la mezcla de reacción de la etapa de acoplamiento que contiene el agente quelante competitivo se diluye antes de las siguientes etapas de lavado con el fin de re-anclar los aminoácidos mono- u oligoméricos que forman la porción de anclaje de la cadena peptídica a una fase sólida activada antes de las siguientes etapas tales el enjuagado o el lavado.

30. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 29, donde un producto bruto desanclado y desprotegido de una síntesis peptídica que alberga aminoácidos mono- u oligoméricos con cadenas laterales o radicales N- o C-terminales con grupos quelantes según la reivindicación 23 es capaz de formar un complejo metálico con una fase sólida según una cualquiera de las reivindicaciones 20-26 y puede ser procesado adicionalmente al ser

a): purificado exponiendo una solución del producto bruto a una fase sólida activada según las reivindicaciones 20-26, en condiciones que re-anclan el producto deseado a la fase sólida y lavando los contaminantes tales como los remanentes de los grupos protectores y captadores o productos secundarios no deseados, con exceso de disolvente, a la vez que se mantiene selectivamente el producto complejado sobre la fase sólida activada, y adicionalmente al

b): eliminar las posibles estructuras plegadas erróneamente del producto y los agregados intermoleculares de las moléculas de producto exponiendo el producto unido a agentes caotrópicos o desnaturalizantes, p. ej. urea, detergentes tales como dodecilsulfato de sodio, elevadas concentraciones de sal, mercaptoetanol, u otros, por medio de lo cual el producto unido se transfiere a un estado desnaturalizado, que se caracteriza por la destrucción de la estructura secundaria y terciaria, a la vez que se mantiene la unión a la fase sólida.

31. El método según la reivindicación 30, donde el producto purificado, unido y desnaturalizado se expone a una secuencia de disolventes, estando diseñada la secuencia de disolventes y optimizada para el respectivo producto para reducir gradualmente la caotropía y conducir a condiciones reproducibles de replegamiento de las moléculas de producto unido así como una reaparición controlada de la estructura secundaria y terciaria, a la vez que se mantienen las moléculas de producto unidas a la fase sólida.

32. El método de la reivindicación 30 y/o 31, donde las uniones covalentes entre las cadenas laterales de los aminoácidos, preferiblemente el cierre de los enlaces disulfuro de los grupos sulfhidrilo libres, la formación de enlaces amida, o la formación de hidrazonas aromáticas o alifáticas estables se logran haciendo pasar mezclas de reactivos a lo largo del producto replegado, que está unido a la fase sólida.

33. El método según la reivindicación 24, donde la fase sólida se selecciona entre sílice, celulosa o entre polímeros, preferiblemente entre resina de poliestireno entrecruzada con divinilbenceno, resina de clorotritilo, entre partículas de melamina transformadas - preferiblemente carboxiladas, o entre soportes poliméricos de poli(alcohol vinílico) transformados - preferiblemente carboxilados.

34. El método según la reivindicación 24 y/o 33, donde la matriz de resina contiene partículas ferromagnéticas y permite la aplicación de la tecnología de separación de partículas magnéticas.

35. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, donde los aminoácidos mono- u oligoméricos contienen cadenas laterales de imidazol, preferiblemente no menos de 6 restos histidina, dos o más restos histidina; más preferiblemente, 6-10 restos histidina.

36. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35, donde los aminoácidos mono- u oligoméricos utilizados están ampliados en el extremo N por una corta secuencia de aminoácidos que proporciona un sitio de reconocimiento de proteasa específico.

37. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 23, 35 y/o 36, donde los aminoácidos mono- u oligoméricos modificados o no modificados (según la reivindicación 35) están ampliados en el extremo C por uno o más aminoácidos, que permiten la detección por sistemas de detección tales como aminoácidos biotinilados que están anclados para permitir la detección por interacciones de tipo avidina.

38. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 28 y/o 29, y/o 35-37, donde el agente quelante competitivo contiene radicales estructurales que comprenden radicales quelantes de metales que tienen pares de electrones para radicales derivados de imidazolilo, N-metilimidazolilo, ácido iminodiacético, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiaminotetraacético, aminopurina, fenantrolina, bipiridilo, terpiridinilo, triazaciclononano o tetraazaciclododecano coordinativos.

39. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, donde el ligando quelante contiene radicales estructurales que tienen pares de electrones para enlaces coordinativos tales como trifenilfosfina, 6-aminopurina, una ftalocianina.

40. El método según la reivindicación 39, donde el ligando es 5-amino-1,10-fenantrolina o amino-terpiridina o triazaciclononano o tetraazaciclododecano o derivados de los mismos.

41. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 40, donde los grupos quelantes de las cadenas laterales de los aminoácidos se seleccionan entre los radicales imidazol, amino-, hidroxilo-, carboxi-, tiol-, ácido nitrilotriacético-, ácido iminodiacético-, fenantrolina-, piridina-, bipiridina-, terpiridina-, triazaciclononano, tetraazaciclododecano o purina- o derivados de estos radicales, que todavía son capaces de formar complejos metálicos según una cualquiera de las reivindicaciones 20-26.

42. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 41, donde el método está completamente automatizado, es compatible con los robots de síntesis y donde la separación de la fase líquida y la fase sólida durante los ciclos de síntesis se logra mediante métodos conocidos per se preferiblemente mediante tamizado, separación basada en tamaños, centrifugación o tecnología de separación de partículas magnéticas.