JPS6359891A - 物質の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は物質の固定化方法に関する。詳しくは物質と担
体とを１分子内に２つ以上のマレイミド基もしくは１分
子内にマレイミド基とスクシンイミドエステル基の両方
を持つ多価性架橋化合物で架橋することを特徴とする物
質の固定化方法である。

本発明によれば、低分子物質、高分子物質、生理活性物
質、蛋白質、酵素、リガンド、抗原、抗体、微生物菌体
、細胞等各種物質を自由に担体に固定することができる
ので、物質の精製、製造、生合成、分析、測定といった
技術分野で広く本発明は利用できるものである。

例えば、固定化される物質がアフィニティークロマトグ
ラフィーのリガンドである場合、本発明は物質の精製に
用いることができ、また、固定化される物質が触媒作用
を持つ酵素である様な場合は、バイオリアクターとして
有用であって、特に本発明はバイオテクノロジーの技術
分野において重要な意義を有するものである。

（従来の技術） 共有結合法による物質の固定化方法については、多数の
報告がある。総説としては（大沢利昭、寺尾光男編、ア
フィニティークロマトとアフィニティーラベル、蛋白質
核酸酵素、別冊２２号、１９８０゜共立出版）などがあ
る。

最も多用される方法にＣＮＢｒ活性化担体を用いて固定
化したい物質の一級アミノ基と結合させる方法がある（
Ａｘｅｎ、　Ｒ，ｌ　Ｐｏｒａｔｈ、　Ｊ、、　＆　Ｅ
ｒｎｂａｃｋ、　Ｓ。

（１９６７）　：　Ｎａｔｕｒｅ　２１４．　１３０２
．　：　Ｐｏｒａｔｈ＋　Ｊ、、　　Ａｘｅｎ。

Ｒ，、＆　Ｅｒｎｂａｃｋ、Ｓ、（１９６７）：　Ｎａ
ｔｕｒｅ　　２１５．１９４１）。

これはＯＨ基を持つ担体をＣＮＢｒで処理し、活性型の
イミドカルボネート体とし、物質のプロトン化していな
い一級アミノ基と結合し固定化する方法であるが、物質
が酵素等の生理活性物質の場合、物質の表面にある多数
の一級アミノ基が担体と結合するために、結合が強固で
はある反面、立体構造に重大な影響を及ぼし、生理活性
が大きく低下する。この方法で酵素を固定化する場合、
固定化後の活性残存率は１０％以上にはなりにくい。

担体のアミノ基と固定化したい物質のカルボキシル基、
もしくはこの逆の、担体のカルボキシル基と固定化した
い物質のアミノ基を水溶性カルボジイミド（例えば、　
Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉ
ｎｏｐｒｏｐｙｌ）　ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　ｈｙ
ｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、　Ｎ−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ
−Ｎ’−２−（４’−ｍｅｔｈｙｌ−ｍｏｒｐｈｏｌｉ
ｎｉｕｍ）ｅｔｈｙｌ　ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ−ｐ
−ｔｏｌｕｅｎｅ　５ｕｌｐｈｏｎａｔｅ）の存在下に
結合させ、担体に物質を固定化する方法も多用される。

しかしこの方法も、固定化された物質の活性が大きく低
下する場合が多い。

本発明は、１分子内に２つ以上のマレイミド基を持つ化
合物もしくは、１分子内にマレイド基とスクシンイミド
エステル基の両方を有する化合物で、固定化したい物質
と担体とを結合させる方法により物質を固定化するもの
である。１分子内に２つ以上のマレイミド基を持つ化合
物もしくは、１分子内にマレイミド基とスクシンイミド
エステル基の両方を持つ化合物は、蛋白質同志の架橋形
成に用いられている。

石川らは酵素と抗体との架橋形成に用いており。

多数の報告がなされている。

総説としては（石川栄治、河井忠、宮井潔編、酵素免疫
測定法、第２版、１９８２、医学書院）があり、酵素と
抗体との結合法について詳細に述べられている。しかし
、これらの方法は全て、可溶性の蛋白質同志の架橋形成
に用いられたものであり、このような方法で、物質の活
性を低下せしめることなく且つ強固に担体に固定化する
技術は従来全く知られておらず、新規である。

（発明が解決しようとする問題点） 上記の様な既知の固定方法においては、固定化したい物
質のアミノ基と担体とを化学的に結合するものが多い。

固定化したい物質が蛋白質の場合には、アミノ末端にあ
るαアミノ基、リジンのεアミノ基が多くの場合結合に
使われる。これらは反応性の高い求核性の残基であるが
、１分子の蛋白質中に多数存在するため、担体との間で
多点で結合する。しかも、αアミノ基、εアミノ基のも
つ正の電荷は、蛋白質の立体構造を保持するために重要
な働きをしており、固定化することによるこの正の荷電
が失なわれる事による立体構造の変化は無視できない。

さらに、物質が生理活性物質の場合は失活の原因となる
。

また、固定化したい物質のカルボキシル基と担体とを化
学的に結合する場合にもほぼ同様の問題が生じる。蛋白
質を固定化する場合、アスパラギン酸のβ−カルボキシ
ル基、グルタミン酸のγ−力ルボキシル基、さらにＣ末
端のカルボキシル基があり、−分子の蛋白質分子中に多
数存在する。このカルボキシル基を用いて担体と結合さ
せると多くのカルボキシル基が担体との結合に使われる
ために、アミノ基の場合と同様の問題が生じる。

又、これ以外の方法に、担体にニポキシ活性化し、これ
に固定化したい物質を作用させる場合は、物質のアミノ
基、Ｓ１］基、Ｏ１ｌ基が結合するが、これも物質と担
体とが多点で結合するために物質の立体構造に影響を与
え、生理活性を大巾に低下させることが多い。

この様に従来の方法は、固定化したい物質と担体とを、
固定化したい物質のどの部分で結合させるかを考えずに
、単に、固定化したい物質に多数存在する反応基と担体
とを結合させているものということができる。

もともと、物質を担体に強固に結合固定すれば、その分
、活性が低下するものである。換言すれば、結合固定と
活性維持とは本来両立し得ないものである。上記した既
知の方法においてもこの解は例外ではなく、いずれの方
法によっても、物質を強固に結合するとその活性の低下
ないしは消滅は避けられず、特に、酵素、蛋白質、各種
生理活性物質、免疫関連物質等の固定にはこれらの方法
は利用できないといっても過言ではない。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記した欠点を一挙に解決するためになされ
たも、のであって、担体結合法（共有結合法、イオン結
合法、物理的吸着法）、架橋法、包括法（格子型、マイ
クロカプセル型）その他既知の固定化法についてそれぞ
れ検討した結果、本発明の目的を達成するには架橋法が
最適であるとの結論を得た。そして、更に各方面から深
く且つ広範に研究した結果、本発明者らは、１分子内に
２つ以上のマレイミド基を持つ化合物もしくは、１分子
内にマレイミド基とスクシンイミドエステル基の両方を
有する化合物で、固定化したい物質と担体とを結合させ
る方法により物質を固定化した時、物質の活性の低下が
あまり生じない事を見い出し、本発見を完成させるに至
った。

本発明の最大の特徴は、マレイミド基をもつ化合物を物
質の固定化に用いることにある６本発明は、マレイミド
基がＳＨ基と特異的に反応する点に着目し、これを利用
したものである。蛋白質の場合、シスチーｒン残基にの
みＳＨ基が存在するが、多くは、蛋白質内のペプチド鎖
の架橋のために、シスチンとして存在し１分子内に存在
する遊離のＳＲ基は少ない。例えばウシ血清アルブミン
の場合、１分子存在するのみである。その他の酵素等に
ついても、アミノ基やカルボキシル基に比べてＳＨ基の
存在量は少ない。そのために、担体に固定化された物質
は、立体構造に与える影響が少ないために、物質の活性
の低下が生じにくいものと考えられる。

当然のことながら、ＳＨ基を活性中心位置にもつような
生理活性物質（たとえば、Ｓ１１プロテアーゼ）などの
固定化に本発明による方法は向かない。

しかし、その他の多くの生理活性物質の場合、上記の理
由のために、有用な固定化方法である。

従来、ＳＨ基を有する物質の固定化法としては、次の反
応式で示されるように、活性化チオール担体とＳｌｌ基
含有ペプチドとの結合が知られている。

（Ｃａｒｌｓｓｏｎ、　Ｊ、、　Ａｘｅｎ、　Ｒ，ｙ　
ａｎｄ　Ｕｎｇｅ、　Ｔ、（１９７５）Ｅｕｒ、　Ｊ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　５９．５６７）しか
しながら、この方法で得られる結合はジスルフィド結合
（−３−３−）であるので、生体中の還元剤（グルタチ
オン等）によって結合が解離しやすいという欠点は避け
ら九ない。

これに対して、チオエーテル結合（−３−）で結合した
固定物質は、生体中の還元剤に対しても解離しにくいと
考えられている。

この様に、生理活性に悪影響を与えにくい固定化方法は
、高性能のバイオリアクターとして活用しうるちのであ
る。

また、固定化したい物質が、免疫源であるハプテンのキ
ャリアーである様な場合、特によく用いられるウシ血清
アルブミンの場合、アルブミンは、１分子内に６０以上
のアミノ基を有し、１分子のＳｌ基をもつ。ハプテンは
キャリアーにできるだけ多く結合したいために、アルブ
ミンのアミノ基もしくはカルボキシル基と結合させるこ
とが多い。

この様にして作製したハプテン−キャリヤー複合体には
、結合にアミノ基を用いた場合には、はとんど遊離のア
ミノ基は存在しないために、担体との結合に、アミノ基
は使用できない。

そこで、ハプテンとの結合に関係しないＳｌ基で担体と
結合する事により固定化しうる。本発明方法が有効な所
以である。

この様にして固定化されたハプテン−キャリアー複合体
は、ＥＩＡ　（酵素免疫分析）あるいはＲＩＡ　（放射
免疫分析）の固相化抗原として用いることができる。又
、抗体精製用のアフィニティーリガンドとしても用いる
ことができる。

また、アフィニティークロマトグラフィーに用いるリガ
ンドを固定化する場合、アルブミン等の蛋白質に一担リ
ガントを多数結合させ、このリガンド−蛋白質複合体を
担体に結合させる事によって、一定量の担体に多くのリ
ガンドを導入することができる。

の式で示される通り、　（Ｌ、）リガンド濃度が高くな
ればなるほどＫｌ）が高くなり、アフィニティークロマ
トグラフィーに適した担体となる。

また、アルブミン等の効果によって非特異的な吸着も減
少するものと考えられる。

また、本発明方法において使用することができる。１分
子内にマレイミド基を２つ以上有する化合物としては、
Ｎ、Ｎ’−（１，２−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）ｂｉｓｍａ
ｌｅｉｍｉｄｅ。

Ｎ、Ｎ’−（１，３−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）ｂｉｓｍａ
ｌｅｉｍｉｄｅ、　Ｎ、Ｎ’−（１，４−Ｐｈｅｎｙｌ
ｓｎｅ）ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｅ、　Ａｚｏｐｈｅｎ
ｙｌｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅ。

Ｎ、Ｎ’−Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓｍａｌｅ
ｉｍｉｄｅ、　Ｂｉｓ（Ｎ−ｍａｌｅ−ｉｍｉｄｏｍｅ
ｔｈｙｌ）ｅｔｈｅｒなどが挙げられる。

また、同じく本発明方法において使用することができる
、１分子内にマレイミド基とスクシニルイミドエステル
基の両方を有する化合物としては、Ｎ−５ｕｃｃｉｎｉ
ｍｉｄｙｌ−Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉＮ−５ｕｃｃｉｎｉ。

Ｎ−５ｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉ
ｍｉｄｏＮ−５ｕｃｃｉｎｉ。

Ｎ−３ｕｃｃｉｍｉｄｙｌ−６−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉ
ｄｏ）ｈｅＮ−３ｕｃｃｉ。

Ｎ−３ｕｃｃｉｎ　１ｍ１ｄｙ　ｌ−４−（Ｎ−ｍａ　
ｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔ　ｌ＋　ｙ　ｌ　）ｃｙｃｌｏ−
ｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、　　Ｎ−
５ｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｍ−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉ
ｄｏＮ−５ｕｃｃｉｎｉ、　　Ｎ−３ｕｃｃｉｎｉｍｉ
ｄｙｌ−ｐ−（Ｎ−ｍａｌｅ−ｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ
）−４Ｎ−３ｕｃｃｉｎｉ、Ｎ−ｓｕｌｆｏｓＮ−５ｕ
ｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉ　（Ｎ−［Ｉｌａ　ｌｅｉｍｉｄ
ｏｍｅ　ｔｈｙ　１　）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−
ｃａｒｂｏｘｙ　１−ａｔｅ、　　Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉ
ｍｉｄｙｌ−ｍ−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏＮ−５ｕｃ
ｃｉｎｉ。

Ｎ−ｓｕ　１ｆｏｓｕｃｃｉｎｉ［ｌ１ｉｄｙｌ−ｐ−
（Ｎ−ｍａ　ｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）−４−ｂｕ
ｔｙｒａｔｅなどが挙げられる。

担体としては、多糖体を骨格としたもの（例。

アガロース；　５ｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシアファ
インケミカルズ社ｉ）、デキストラン；　３ｅｐｈａｄ
ｅｘ（同社製）、セルロース；（ワラ１へマン社製））
、合成樹脂を骨格としたもの（例、ポリスチレン、ポリ
アクリルアミド；バイオゲルＰ（バイオランド社製）、
ポリビニルニド−ヨーパール（東洋ソーダ社製））、ガ
ラスもしくはシリカを骨格としたもの（例、多孔性ガラ
ス、シリカゲル、多孔性ガラスのアミ゛ノシラン誘導体
）、天然物（例、コロジオン、カオリン、アルミナ、炭
素、ベントナイト、毛糸、木材）。さらには微生物の菌
体、種々の動物の赤血球等があり、これらの担体は、必
要に応じてＳｌ基もしくはアミノ基を導入しうる。

例えば、ＯＨ基を有する担体には１次の反応式で示すよ
うにして容易にＳｌ基を導入することができる。

また、アミノ基を導入したい場合には、次の反応式で示
すように、上記Ｂ工程においてアンモニアを作用させれ
ばよい。

この他にも担体にアミノ基もしくはＳＨ基を導入する方
法は多種類有り、必要に応じて適当な方法が選択しつる
。

以下実施例を挙げ、本発明を説明する。

実施例−１担体の作製 ａ）　　ＳＨ基を持つ担体の作製 湿重量９０ｇのトーヨーパールＩＩＷ−６５に、９０ｍ
Ｑの１゜４−ブタンジオールグリシジルエーテルと、９
０−の１８０＋ｎｇのＮａＢＨ４を含む０．６Ｍ　Ｎａ
ＯＨを加え、８時間２５℃のインキュベーター中で振ど
うする。反応後、担体を純水でよく洗い、２７０ａ＋Ｑ
の１．３Ｍ　Ｎａ、Ｓ２０．を加え、２５℃で一夜振と
うする。振どう後、　０．ＩＮ塩酸でｐｌ＋を７．０に
調整する。再度担体を純水でよく洗い、２７０ａ＋Ｑの
２５ｍＭジチオスレイトールを加え、３７’Ｃ９０分間
還元する。次いで３Ｑの１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，０でよく洗浄し、
　ＳＨ基をもつトーヨーパールＨ１ｔｌ−６５を得た。

生成物は、１ｇのトーヨーバールに約６０μｍｏｌのＳ
ｌ＋基をもつ。

ｂ）　アミノ基を持つ担体の作製 湿重１９０ｇのトーヨーバールｌ１ｌｄ−６５ニ、９０
ｍＱの１゜４−ブタンジオールグリシジルエーテルと、
９０ｍＱの１８０ｍｇのＮａＢＨ４を含む０．６Ｍ　Ｎ
ａ０ＩＩを加え、８時間２５℃のインキュベーター中で
振とうする。反応後、担体を純水でよく洗い、　１３５
ｍＱの濃アンモニア水を加え、４０℃で９０分間振とう
する。振どう後、純水でよく洗浄し、アミノ基をもつト
ーヨーパール１（リー６５を得た。

実施例−２ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の固定化１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐｌ＋６．
０の５＋＋＋Ｑに溶解した２５ｍｇのＢＳＡに、Ｎ、Ｎ
’−０−ｐｈｅｎｙｌａｎｅｄｉ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ
　２．５Ｂと５０ｐＱのジメチルスルフオキシドを含む
上記緩衝液５ｍＱを加え、３０℃で２０分間反応する。

反応後、２００１ｎ＋２のセファデックスＧ−２５のカ
ラムにて、余剰のＮ、Ｎ’−０−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄ
ｉ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅを除く。得られたマレイミド化
ＢＳＡの２０ｍｇと、実施例−１のａ）で得たＳＨ基を
もつトーヨーバールＩｎ−６５の２ｇ（湿重量）とを上
記緩衝液中で混合し、４℃で４０時時間上うする。反応
液をヌッチェで濾過し、トーヨーパールＨＷ−６５に固
定化されたＢＳＡを得た。濾過され、結合しなかったＢ
ＳＡ量と添加ＢＳＡ量との差から、担体２ｇ当り１２ｍ
ｇのＢＳＡが固定化できた。

実施例−３ホスホリルコリン−ＢＳＡの固定化ホスホリ
ルコリンは、Ｃ反応性蛋白質に特異的な親和リガンドで
あり、ホスホリルコリンを、還元アミノ化反応により、
ＢＳＡに結合させたものがホスホリルコリン−ＢＳＡで
ある。ＢＳＡの代りにホスホリルコリン−ＢＳＡを用い
、他は実施例−１と同様に行った。担体２ｇ当り８Ｂの
ホスホリルコリン−ＢＳＡが固定化できた。

実施例−４β−ガラクトシダーゼの固定化β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ（大腸菌由来）５ｍｇと１ｍＭＥＤＴＡを
含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ＰＨ６，０の１ｍＱに、０
．５ｇのＮ、Ｎ’−０−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉｍａｌ
ｅｉｍｉｄｅと１０μｇのジメチルホルムアミドを含む
上記緩衝液１社加え３０℃で２０分間反応する。反応後
４０ｍＱのセファデックスＧ−２５カラムにて余剰のＮ
、Ｎ’−０−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉｍａｌｅ−ｉｍｉ
ｄｅを除去する。得られたマレイミド化β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ４　、２ｍｇと、実施例−１のａ）で得たＳ
Ｈ基を持つトーヨーパールＨリー６５の２ｇ（湿重量）
とを　　゛上記緩衝液中で混合し、４℃で１８時時間上
うする。

反応液をヌッチェで濾過し、トーヨーパールＨ１ｉｌ−
６５に固定化されたβ−ガラクトシダーゼを得た。

濾過され、結合しなかったβ−ガラクトシダーゼと添加
β−ガラクトシダーゼとの差から、担体２ｇに３．８ｍ
ｇ固定化できた。活性は８２％保持されていた。

実施例−５ペルオキシダーゼの固定化 ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ）　６　ｍｇを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０１ａ＋Ｑに、５０　ＰＨの
ＧＭＢＳ　（Ｎ−（γ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｌ
ｏｘｙ　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を含むＮ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミドの１００μΩを添加し、３０℃で３０
分間反応する。反応後４０ｍＱのセファデックスＧ−２
５カラムにて余剰のＧＭＢＳを除去する。得られたマレ
イミド化ペルオキシダーゼ５．１Ｂと、実施例−１のａ
）で得たＳＨ基を持つトーヨーパールＨトロ５の２ｇ（
湿重量）とを１ｍＨのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩
衝液ｐ）！　６．０５ｎ＋Ｑ中で混合し、４℃で２０時
間振とつする。反応液をヌノチェで濾過し、トーヨーパ
ールＨ１ｊ−６５に固定化されたペルオキシダーゼを得
た。濾過され、結合しなかったペルオキシダーゼと添加
したペルオキシダーゼとの差から、担体２ｇに４．１ｍ
ｇ固定化できた。固定化されたペルオキシダーゼは、９
１％活性を保持していた。

実施例−６ホスホリルコリン−ＢＳＡの固定化実施例−
１のｂ）で得たアミノ基を持つトーヨーパールｆｌｕ−
６５２ｇ（湿重量）を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，
０で充分に平衡化する。５０μＨのＥＭＣ３（Ｎ−（ε
−ｍａｌｅｉｒｎｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃ
ｃｉｎｉｍｉｄｏ）を含むＮ、Ｎ’−ジメチルホルムア
ミド２＋ａＱを添加し、３０℃で３０分間反応する。得
られたマレイミド化上−ヨーパールＨＷ−６５を１ｍＨ
のＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，０で洗
浄し、平衡化する。１０ｍｇのホスホリルコリン−ＢＳ
Ａを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ＰＨ６，０４ａＩ（ｌを
加え４℃で４８時時間上うする。反応液をヌツチェで濾
過し、トーヨーバールＨ１ｔｌ−６５に固定化されたホ
スホリルコリン−ＢＳＡを得た。濾過され、結合しなか
ったホスホリルコリン−ＢＳＡの量と添加したホスホリ
ルコリン−ＢＳＡとの差から担体２ｇ当り３．１ｍｇの
ホスホリルコリン−ＢＳＡが固定化された。

実施例−７グルコースオキシダーゼの固定化グルコース
オキシダーゼ（Ａ、　ｎｉｇｅｒ）１０ｍｇを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液、　ｐＨ７，０１ｍＮに、５０μＨの
ＧＭＢＳ（Ｎ−（’Ｉ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙＬ
ｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を含むＮ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミドの１００μＱを添加し、３０℃で３０
沓間反応する。反応後、４０ｍＱのセファデックスＧ−
２５カラムにて余剰のＧＭＢＳを除去する。得られたマ
レイミド化グルコースオキシダーゼ８．２ｍｇと、実施
例−１のａ）で得たＳＨ基をもつトーヨーパール＋１１
−６５の３ｇ（湿重量）とを、１鱈のＥＤＴＡを含む０
．１Ｍリン酸緩衝液、　ｐｌ（６，０中で混合し、４℃
で４０時間振とうする。反応液をヌッチェで濾過し、ト
ーヨーパールＨトロ５に固定化されたグルコースオキシ
ダーゼを得た。担体３ｇに６．１ｍｇのグルコースオキ
シダーゼが固定化できた。固定化されたグルコースオキ
シダーゼは、７３％活性を保持していた。

（発明の効果） 本発明は、１分子内に２つ以上のマレイミド基を持つ化
合物もしくは、１分子内にマレイミド基とスクシンイミ
ドエステル基の両方を有する化合物で、固定化したい物
質と担体とを結合させるという全く新規な構成を採用し
たことによって、各種の物質を担体に強固に固定するこ
とができ、その際物質が本来有している活性その他の有
用な性質は全くそこなうことがないという著効を奏する
のである。

したがって１本発明は、特に１強固に固定すると活性が
強く低下するような物質、例えば、各種蛋白質、酵素、
生理活性物質、ペプチド系医薬、抗原、抗体、ハプテン
、菌体、細胞等の固定化に特に有効である。

本発明によれば、これらの物質は担体に強固に結合して
いて容易に離脱することがなく、しかも活性の低下や材
滅がないという著効が奏されるので、例えば次のような
用途に広く利用することができる：物質の精製、化学的
製造、生合成１分析、測定、クロマトグラフィー、透析
、人工臓器、プラズマフェレーシス等。

とりわけ、本発明は、バイオテクノロジーの各技術分野
において非常に重要な役割を果すものであって、その効
果の顕著性ははかり知れないものがある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、物質と、担体とを、１分子内に２つ以上のマレイミ
   ド基を持つ化合物で架橋することを特徴とする物質の固
   定化方法。 ２、物質と、担体とを、１分子内にマレイミド基とスク
   シンイミドエステル基の両方を有する化合物で架橋する
   ことを特徴とする物質の固定化方法。 ３、担体に不溶性担体を用いる事を特徴とする特許請求
   の範囲第１又は第２項記載の方法。 ４、物質が特定化合物により修飾された又は修飾されな
   い蛋白質である事を特徴とする特許請求の範囲第１又は
   第２項記載の方法。 ５、蛋白質が酵素である事を特徴とする特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 ６、蛋白質がアルブミンである事を特徴とする特許請求
   の範囲第４項記載の方法。 ７、特定化合物が親和性リガンド又はホスホリルコリン
   であることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の方
   法。 ８、酵素がβ−ガラクトシダーゼであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第５項又は第６項記載の方法。 ９、酵素がグルコースオキシダーゼであることを特徴と
   する特許請求の範囲第５項記載の方法。 １０、酵素がペルオキシダーゼであることを特徴とする
   特許請求の範囲第５項記載の方法。